CA2316269A1 - Peptide epitopes recognised by antifilaggrin autoantibodies in serum from rheumatoid arthritis patients - Google Patents

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CA2316269A1
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Guy Serre
Elisabeth Girbal-Neuhauser
Christian Vincent
Michel Simon
Mireille Sebbag
Pascal Dalbon
Colette Jolivet-Reynaud
Michel Arnaud
Michel Jolivet
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Abstract

The invention concerns peptides comprising epitopes recognised by antifilaggrin in serum from rheumatoid arthritis patients. Said epitopes comprising a tripeptide motif centred on a citrulline residue. The invention also concerns artificial antigens comprising said epitopes, and their use for diagnosing rheumatoid arthritis.

Description

ÉPITOPES PEPTIDi~UES RECONNUS PAR DES A;.'TO-ANTICORPS
ANTIFILAGGRINE PRÉSENTS DANS LE SÉRUM CES PATIENTS
ATTEINTS DE POLYARTHRITE RHUMATOIDE.
La présente Invention est relative à de nouvelles préparations d'antigènes spécifiquement reconnus par des auto-anticorps spécifiques de la polyarthrite rhumatoïde.
La polyarthrite rhumatoïde (ci après abrégée en " PR ") est le plus fréquent des rhumatismes inflammatoires chroniques. I1 s'agit d'une maladie auto immune, et le sérum des patients atteints contient des auto-anticorps dont certains sont spécifiques, et peuvent constituer un marqueur de cette maladie, permettant son diagnostic même à des stades précoces. Des recherches ont donc été effectuées en vue d'identifier des antigènes reconnus par ces anticorps, afin d'en obtenir des préparations purifiées utilisables dans des techniques classiques de diagnostic immunologique.
Des auto-anticorps spécifiquement présents chez les malades atteints de PR et réagissant avec un antigène épithélial oesophagien de rat ont été décrits pour la première fois par B. J. J. YOUNG et al. dans Br.
Med. J. 2:97-99, (1979). Ces auto-anticorps ont été à
l'époque dénommés "anticorps antikératines".
Lors de précédents travaux, l'équipe des Inventeurs a obtenu, à partir d'épithéliums malpighiens humain et murin, des préparations d'antigènes apparentés à la filaggrine et à la profilaggrine, reconnus spécifiquement par les anticorps présents dans le sérum de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, et montré que les " anticorps antikératines " étaient en fait des auto-anticorps anti-filaggrine (ci-après dénommés " AAF "). La Demande EP 0 511 116 décrit ces préparations antigéniques, et leur utilisation pour le diagnostic de la polyarthrite rhumatoïde.

WO 99/35167 1'CT/FR98/02899
PEPTIDIC EPITOPES RECOGNIZED BY A. TO-ANTIBODIES
ANTIFILAGGRIN PRESENT IN SERUM THESE PATIENTS
HAZARDS OF RHUMATOID POLYARTHRITIS.
The present invention relates to new preparations of antigens specifically recognized by specific autoantibodies of the rheumatoid arthritis.
Rheumatoid arthritis (hereinafter abbreviated in "PR") is the most common rheumatism chronic inflammatory. It is an auto disease immune, and the serum of affected patients contains autoantibodies, some of which are specific, and may constitute a marker of this disease, allowing its diagnosis even at early stages. Research has therefore were carried out in order to identify antigens recognized by these antibodies, in order to obtain purified preparations usable in techniques immunological diagnostic classics.
Auto-antibodies specifically present in RA patients who react with esophageal epithelial rat antigen have been described for the first time by BJJ YOUNG et al. in Br.
Med. J. 2: 97-99, (1979). These autoantibodies have been then called "anti-keratin antibodies".
During previous work, the team of Inventors obtained, from squamous epithelia human and murine preparations of related antigens with recognized filaggrin and profilaggrin specifically by the antibodies present in the serum patients with rheumatoid arthritis, and showed that the "anti-keratin antibodies" were in makes anti-filaggrin autoantibodies (below referred to as "AAF"). Application EP 0 511 116 describes these antigenic preparations, and their use for diagnosis of rheumatoid arthritis.

WO 99/35167 1'CT / FR98 / 02899

2 Les filaggrines sont une famille de protéines qui a été identifiée chez diverses espèces, entre autres chez l' homme, le rat, la souris, le cobaye, au niveau des épithéliums malpighiens kératinisants [pour revue sur les filaggrines, cf. DALE et al. [The Keratinocyte Handbook, Cambridge University Press, pp 323-350, (1994)]. Elles dérivent de la déphosphorylation et de la protéolyse d'un précurseur, la profilaggrine, qui est constituée essentiellement de domaines répétés de filaggrine séparés par des segments peptidiques interdomaines.
Le gène codant pour la profilaggrine se compose de sous-unités répétées dont chacune code pour une molécule de filaggrine, séparées par des portions codant pour les segments peptidiques interdomaines.
Toutes les unités de répétition codant pour chacune des filaggrines humaines ont la même longueur (972 paires de base chez l' homme) ; cependant, chez l' homme, on observe des variations importantes (10-15°s) de séquence d'une sous-unité à l'autre. Si la plupart sont conservatives, certaines de ces variations induisent des changements d'acides aminés et dans certains cas des changements de la charge électrique de la protéine. Ainsi les filaggrines humaines forment, indépendamment des modifications post-transcriptionnelles, une population hétérogène de molécules de taille similaire mais de séquences et de charges (pHi égal à 8,3 t 1,1) différentes [GAN et al., Biochem. 29, p. 9432-9440 (1990) j .
La profilaggrine est une protéine de poids moléculaire élevé (environ 400 000 chez l'homme) soluble en présence de fortes concentrations de sels ou d'urée.
Elle possède une forte teneur en acides aminés basiques (arginine et histidine), ainsi qu'en glycine, sérine et acide glutamique. Elle est pauvre en acides aminés non polaires et ne contient ni méthionine, ni cystéine, ni tryptophane. Elle est fortement phosphorylée sur des
2 Filaggrins are a family of proteins which has been identified in various species, among others in humans, rats, mice, guinea pigs, at the level of squamous keratinizing epithelia [for review on filaggrines, cf. DALE et al. [The Keratinocyte Handbook, Cambridge University Press, pp 323-350, (1994)]. They are derived from dephosphorylation and proteolysis of a precursor, profilaggrine, which is made up essentially from separate repeats of filaggrin by interdomain peptide segments.
The gene coding for profilaggrin is consists of repeated subunits each of which codes for a filaggrin molecule, separated by portions coding for the interdomain peptide segments.
All repeat units coding for each of the human filaggrins are the same length (972 pairs of base in humans); however, in humans, significant variations (10-15 ° s) in the sequence of a subunit to another. If most are conservative, some of these variations induce changes amino acids and in some cases changes in the electrical charge of the protein. So the human filaggrins form, independently of post-transcriptional modifications, a population heterogeneous molecules of similar size but of sequences and charges (pHi equal to 8.3 t 1.1) different [GAN et al., Biochem. 29, p. 9432-9440 (1990) j.
Profilaggrin is a weighty protein high molecular (around 400,000 in humans) soluble in the presence of high concentrations of salts or urea.
It has a high content of basic amino acids (arginine and histidine), as well as glycine, serine and glutamic acid. It is poor in amino acids not polar and does not contain methionine, cysteine, or tryptophan. It is strongly phosphorylated on

3 résidus sérine, ce qui lui confère un point isoélectrique proche de la neutralité.
La profilaggrine est clivée en unités filaggrine au cours d'un processus complexe de maturation, impliquant une déphosphorylation, suivie d'un clivage par des protéases au niveau des segments interdomaines. Ce clivage génère d'abord des fragments de taille intermédiaire, puis les molécules fonctionnelles de filaggrine.
Les filaggrines issues de la déphosphorylation et du clivage de la profilaggrine sont des protéines basiques dont le contenu en acides aminés est similaire à
celui des profilaggrines. Elles participent à
l'organisation des filaments de kératine, et subissent une maturation progressive au cours de laquelle les résidus arginine, basiques, sont convertis en résidus citrulline, neutres, sous l'action de la peptidylarginine déiminase [HARDING C.R. et SCOTT I.R., J. Mol. Biol. 170, p. 651-673 (1983)]. Ceci entraîne une réduction de leur affinité pour les kératines dont elles se détachent ;
elles sont alors totalement dégradées sous l'action de diverses protéases.
Les propriétés des filaggrines et des profilaggrines ont été particulièrement bien étudiées chez le rat, chez la souris et chez l'homme. La taille de la profilaggrine varie, selon les espèces, de 300 à
400 kD et celle des filaggrines de 27 à 64 kD.
Le polymorphisme observé chez l'homme entre les séquences des unités filaggrine à l'intérieur d'un même gène de profilaggrine n'apparaît pas chez le rat et la souris. Les filaggrines présentent en outre une grande variabilité inter et intra-spécifique au niveau de leur séquence. Cette variabilité n'affecte toutefois pas leurs propriétés fonctionnelles, ni leur composition globale en acides aminés, et leurs propriétés biochimiques. De même, les localisations tissulaires de la profilaggrine et des
3 serine residues, which gives it an isoelectric point close to neutrality.
Profilaggrine is cleaved into units filaggrin during a complex process of maturation, involving dephosphorylation, followed by protease cleavage at the segment level interdomains. This cleavage first generates fragments of intermediate size, then the functional molecules of filaggrin.
Filaggrins from dephosphorylation and the cleavage of profilaggrin are proteins bases with an amino acid content similar to that of profilaggrines. They participate in the organization of the keratin filaments, and undergo a progressive maturation during which the arginine residues, basic, are converted to residues citrulline, neutral, under the action of peptidylarginine deiminase [HARDING CR and SCOTT IR, J. Mol. Biol. 170, p. 651-673 (1983)]. This results in a reduction in their affinity for keratins from which they are detached;
they are then completely degraded under the action of various proteases.
The properties of filaggrins and profilaggrines have been particularly well studied in rats, mice and humans. The size of profilaggrin varies, depending on the species, from 300 to 400 kD and that of the filaggrines from 27 to 64 kD.
The polymorphism observed in humans between the sequences of filaggrine units inside a same profilaggrin gene does not appear in rats and the mouse. Filaggrins also have a large inter and intra-specific variability in their sequence. However, this variability does not affect their functional properties, nor their overall composition in amino acids, and their biochemical properties. Likewise, tissue localizations of profilaggrin and

4 fi.laggrines sont identiques chez les différents mammifères étudiés.
En poursuivant leurs travaux, les Inventeurs ont constaté que la profilaggrine présente dans les granules de kératohyaline de l'épiderme humain n'était contrairement aux filaggrines, pas reconnue par les AAF[SIMON et al. Clin. Exp. Immunol. 100, 90-98 (1995)).
Ils ont alors testé la réactivité des AAF avec de la filaggrine recombinante, et ont constaté que celle-ci non plus n'était pas reconnue. D'autre part, il avait été
précédemment observé que les formes des filaggrines épidermiques humaines principalement reconnues par les AAF étaient les formes acido-neutres décrites par SIMON
et al. [J. Clin. Invest., 92, 1387, (1993)] et dans la demande EP 0 511 116. Le tait que ces formes acido-neutres correspondent à un stade tardif de maturation de la filaggrine, permettait de supposer que tout ou partie des modifications post-traductionnelles intervenant jusqu'à ce stade étaient impliquées dans la formation des épitoges reconnus par les AAF.
Pour vérifier cette hypothèse, les Inventeurs ont cherché à reproduire in vitro, à partir de filaggrine recombinante, ces modifications post-traductionnelles, afin de déterminer lesquelles étaient susceptibles d'influer sur l'antigénicité de la filaggrine.
Ils ont ainsi constaté qu'en fait, la citrullination de la filaggrine suffisait à générer des épitoges reconnus par les AAF. En effet, ils ont observé, en procédant à la déimination in vitro de filaggrine recombinante que le remplacement d'au moins une partie des arginines par des citrullines permet l'obtention d'un antigène reconnu spécifiquement par les AAF présents dans le sérum des patients atteints de PR. Ils ont en outre localisé des régions qui étaient après citrullination, fortement immunoréactives vis-à-vis des auto-anticorps anti-filaggrine. I1 s'agit en particulier de la région S
correspondant à la portion C-terminale (acides aminés 144 à 324) et en particulier aux acides aminés 144 à 314, ainsi que de la région correspondant aux aciàes aminés 76 à 144, et de la région correspondant aux acides aminés 71 à 119 d'une unité de filaggrine humaine. Ces travaux ont abouti à l'obtention d'antigènes artificiels reconnus spécifiquement par les AAF présents dans le sérum des patients atteints de PR, et constitués par des polypeptides recombinants ou de synthèse, dérivés de la séquence de la filaggrine, ou de portions de celle-ci, par substitution d'au moins un résidu arginine par un résidu citrulline. Ces antigènes, ainsi que leur utilisation, font l'objet de la Demande FR FR 96 10651, déposée le 30 août 1996 au nom de BIOMÉRIEUX.
En poursuivant leur travaux, les Inventeurs sont parvenus à sélectionner à partir de la séquence d'une unité filaggrine, des peptides dans lesquels la substitution d'au moins un résidu arginine par un résidu citrulline donnait naissance à des épitopes reconnus spécifiquement par les AAF présents dans le sérum des patients atteints de PR.
Les séquences de ces peptides sont identifiées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 3, SEQ ID N0: 5, SEQ ID N0: 6.
On entend par . '~ unité filaggrine ", un polypeptide dont la séquence est celle du produit de traduction de l'une quelconque des sous-unités codant pour un domaine filaggrine du gène de la profilaggrine humaine ou d'une autre espèce, ou bien est une séquence consensus, séquence théorique obtenue à partir des séquences des domaines filaggrine.
Les Inventeurs ont maintenant identifié des épitoges reconnus par les auto-anticorps anti-filaggrine . ces épitoges comprennent un motif tripeptidique centré sur un résidu citrulline, spécifiquement présent sur les peptides citrullinés dérivés des séquences SEQ ID N0: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID N0: 6, et absent de la séquence SEQ ID N0: 4.
I1 s'agit en particulier du motif tripeptidique Ser-Cit-His, dans lequel Cit représente un résidu citrulline.
La présente Invention a pour objet un peptide constituant un épitope reconnu par des autoanticorps anti-filaggrine présents dans le sérum des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, caractérisé en ce l0 que ledit épitope comprend un motif tripeptidique centré
sur un résidu citrulline, spécifiquement présent sur au moins un des peptides citrullinés dérivés des séquences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit peptide comprend au moins un motif pentapeptidique centré sur un résidu citrulline, présent sur au moins un des peptides citrullinés dérivés des séquences SEQ ID N0: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID N0: 6.
Avantageusement, ledit peptide comprend le motif tripeptidique Ser-Cit-His, dans lequel Cit représente un résidu citrulline.
A titre .d'exemple, on citera des peptides dérivés, par citrullination, de peptides qui comprennent ie motif pentapeptidique, Xl-Ser-Arg-His-X2 dans lequel X1=Ser ou Gly, et X2=Ser ou Pro, et parmi ceux-ci, des peptides qui comprennent le motif hexapeptidique XO-X1-Ser-Arg-His-X2, ou le motif heptapeptidique XO-X1-Ser-Arg-His-X2-X3, dans lesquels X1 et X2 sont tels que définis ci-dessus, XO=Asp, et X3=Gly ou Arg.
Les peptides conformes à l'invention permettent la préparation d'antigènes artificiels reconnus spécifiquement par les auto-anticorps anti-filaggrine présents dans le sérum de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde. Ces antigènes artificiels font également partie de l'objet de la présente invention.

Des antigènes artificiels conformes à
l'invention comprennent au moins un épitope peptidique centré sur un résidu citrulline, tel que défini ci-dessus. Ils sont par exemple constitués par des peptides d'au moins 5 acides aminés, de préférence au moins 10 acides aminés, et avantageusement au moins 14 acides aminés. I1 peut s'agir de peptides constitués par au moins un fragment d'au moins un des peptides citrullinés dérivés des séquence s SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, ou contenant au moins un tel fragment. Ces peptides peuvent comprendre plusieurs épitopes citrullinés spécifiquement reconnûs par les AAF, de séquences identiques ou différentes.
Le terme "peptide" tel qu'utilisé dans la présente Demande signifie notamment protéine ou fragment de protéine, oligopeptide, extrait, séparé ou substantiellement isolé ou synthétisé, notamment ceux obtenus par synthèse chimique ou par expression dans un organisme recombinant ; tout peptide dans la séquence duquel un ou plusieurs acides aminés de la série L sont remplacés par un acide aminé de la série D, et vice-versa ; tout peptide dont l'une au moins des liaisons CO-NH, et avantageusement toutes les liaisons CO-NH de la chaîne peptidique est (sont) remplacées) par une (des) liaisons NH-CO ; tout peptide dont l'une au moins des liaisons CO-NH et avantageusement toutes les liaisons CO-NH est ou sont remplacées) par une ou des liaisons) NH-C0, la chiralité de chaque résidu aminoacyle, qu'il soit impliqué ou non dans une ou plusieurs liaisons CO-NH sus-mentionnées, étant soit conservée, soit inversée par rapport aux résidus aminoacyles constituant un peptide de référence, ces composés étant encore désignés immunorétroïdes, un mimotope, etc.
Des antigènes conformes à l'invention peuvent par exemple étre obtenus par action de la PAD (peptidyl arginine déiminase) sur des protéines ou des peptides S
naturels, recombinants, ou de synthèse, comportant des résidus arginine, et en particulier comprenant au moins un résidu arginine constituant le centre d'un motif tripeptidique identique à ceux présents dans les S séquences SEQ ID N0: 3, SEQ ID N0: 5, SEQ ID N0: 6 ; ils peuvent également être obtenus par synthèse peptidique, en incorporant directement un ou plusieurs résidus citrulline, et de préférence, un ou plusieurs épitoges comprenant un résidu citrulline, tels que définis ci-l0 dessus, dans le peptide synthétisé.
La présente Invention a également pour objet l'utilisation des antigènes conformes à l'invention, tels que définis ci-dessus, pour le diagnostic in vitro de la PR.
15 La présente invention englobe en particulier des compositions antigéniques pour le diagnostic de la présence d'auto-anticorps spécifiques de la PR dans un échantillon biologique, lesquelles compositions sont caractérisées en ce qu'elles contiennent au moins un 20 antigène conforme à l'invention, éventuellement marqué
et/cu conjugué avec une molécule porteuse.
La présente Invention a également pour objet un procédé de détection des auto-anticorps de classe G
spécifiques de la PR dans un échantillon biologique, 25 lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend .
- la mise en contact dudit échantillon biologique avec au moins un antigène conforme à l'Invention, tel que défini ci-dessus, dans des conditions permettant la formation d'un complexe antigène/anticorps avec les auto-anticorps 30 spécifiques de la PR éventuellement présents ;
- la détection, par tous moyens appropriés, du complexe antigène/anticorps éventuellement formé.
Ce procédé de détection peut être mis en oeuvre grâce à un nécessaire comprenant au moins un 35 antigène selon l'Invention, ainsi que des tampons et réactifs appropriés pour la constitution d'un milieu réactionnel permettant la formation d'un complexe antigène/anticorps, et/ou des moyens de détection dudit complexe antigène/anticorps.
Ledit nécessaire peut également comprendre, le cas échéant, des échantillons de référence, tels qu'un ou plusieurs sérums) négatifs) et un ou plusieurs sérums) positif(s).
La présente invention sera mieux comprise à
l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation et de mise en ceuvre d'antigènes conformes à l'invention.
EXEMPLE 1 . DEIMINATION IN VITRO DE FILAGGRINE
RECOMBINANTE PAR LA PEPTIDYL ARGININE DEIMINASE (P.A.D.).
De la filaggrine recombinante est produite selon le protocole suivant .
Un fragment d'ADN codant pour une unité
filaggrine est amplifié par PCR, à partir d'ADN génomique humain (cellules RAJI . ATCC CCL86) à l'aide des 2 amorces suivantes .
Amorce 5' .
4 fi.laggrines are identical in the different mammals studied.
By continuing their work, the Inventors found that profilaggrin in keratohyaline granules of the human epidermis were unlike filaggrins, not recognized by AAF [SIMON et al. Clin. Exp. Immunol. 100, 90-98 (1995)).
They then tested the responsiveness of the AAFs with recombinant filaggrin, and found that it does not more was not recognized. On the other hand, he had been previously observed that the forms of filaggrins human epidermis mainly recognized by AAF were the acid-neutral forms described by SIMON
et al. [J. Clin. Invest., 92, 1387, (1993)] and in the EP 0 511 116. The fact that these acidic forms neutral correspond to a late stage of maturation of filaggrin, allowed us to suppose that all or part post-translational modifications occurring up to this point were involved in training epitoges recognized by the AAF.
To verify this hypothesis, the Inventors have sought to reproduce in vitro, from filaggrin recombinant, these post-translational modifications, to determine which ones were likely influence the antigenicity of filaggrin.
They thus found that, in fact, the citrullination of filaggrin was enough to generate epitoges recognized by the AAF. Indeed, they observed, by in vitro elimination of filaggrin recombinant as the replacement of at least part arginines by citrullines allows obtaining a antigen specifically recognized by AAF present in the serum of RA patients. They also located regions that were after citrullination, strongly immunoreactive towards autoantibodies anti-filaggrin. This is particularly the region S
corresponding to the C-terminal portion (amino acids 144 to 324) and in particular to amino acids 144 to 314, as well as the region corresponding to amino acids 76 at 144, and the region corresponding to amino acids 71 at 119 from a unit of human filaggrin. These works have resulted in the obtaining of recognized artificial antigens specifically by the FAAs present in the serum of RA patients, and consisting of recombinant or synthetic polypeptides derived from filaggrin sequence, or portions thereof, by substitution of at least one arginine residue by a citrulline residue. These antigens, as well as their use, are the subject of Application FR FR 96 10651, filed on August 30, 1996 in the name of BIOMÉRIEUX.
By continuing their work, the Inventors managed to select from the sequence a filaggrin unit, peptides in which the substitution of at least one arginine residue with a residue citrulline gave birth to recognized epitopes specifically by the FAAs present in the serum of RA patients.
The sequences of these peptides are identified in the sequence list in the appendix under the numbers SEQ ID NO: 3, SEQ ID N0: 5, SEQ ID N0: 6.
We hear by . '~ filaggrin unit ", a polypeptide whose sequence is that of the product of translation of any of the coding subunits for a filaggrin domain of the profilaggrin gene human or another species, or is a sequence consensus, theoretical sequence obtained from filaggrin domain sequences.
The inventors have now identified epitoges recognized by anti-autoantibodies filaggrine. these epitoges include a motif tripeptide centered on a citrulline residue, specifically present on citrullinated peptides derived from the sequences SEQ ID N0: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID N0: 6, and absent from the sequence SEQ ID N0: 4.
This is in particular the reason tripeptide Ser-Cit-His, in which Cit represents a citrulline residue.
The present invention relates to a peptide constituting an epitope recognized by autoantibodies anti-filaggrin present in patient serum with rheumatoid arthritis, characterized in l0 that said epitope comprises a centered tripeptide motif on a citrulline residue, specifically present on at minus one of the citrullinated peptides derived from the sequences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6.
According to a preferred embodiment of the present invention, said peptide comprises at least one pentapeptide motif centered on a citrulline residue, present on at least one of the citrullinated peptides derived sequences SEQ ID N0: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID N0: 6.
Advantageously, said peptide comprises the tripeptide motif Ser-Cit-His, in which Cit represents a citrulline residue.
By way of example, mention will be made of peptides derived, by citrullination, from peptides which include ie pentapeptide motif, Xl-Ser-Arg-His-X2 in which X1 = Ser or Gly, and X2 = Ser or Pro, and among these, peptides which include the hexapeptide motif XO-X1-Ser-Arg-His-X2, or the heptapeptide motif XO-X1-Ser-Arg-His-X2-X3, in which X1 and X2 are such that defined above, XO = Asp, and X3 = Gly or Arg.
The peptides according to the invention allow the preparation of artificial antigens specifically recognized by anti-autoantibodies filaggrin in the serum of patients with rheumatoid arthritis. These artificial antigens make also part of the object of the present invention.

Artificial antigens conforming to the invention include at least one peptide epitope centered on a citrulline residue, as defined above above. They are for example constituted by peptides at least 5 amino acids, preferably at least 10 amino acids, and advantageously at least 14 acids amines. I1 can be peptides constituted by at at least a fragment of at least one of the citrullinated peptides derived from the sequences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, or containing at least one such fragment. These peptides can include multiple epitopes citrullines specifically recognized by the AAF, from identical or different sequences.
The term "peptide" as used in the present Application means in particular protein or fragment protein, oligopeptide, extract, separate or substantially isolated or synthesized, especially those obtained by chemical synthesis or by expression in a recombinant organism; any peptide in the sequence of which one or more L-series amino acids are replaced by a D-series amino acid, and vice vice versa; any peptide with at least one of the CO- bonds NH, and advantageously all the CO-NH bonds of the peptide chain is (are) replaced) by one (of) NH-CO bonds; any peptide of which at least one of CO-NH bonds and advantageously all CO- bonds NH is or are replaced) by one or more bonds) NH-C0, the chirality of each aminoacyl residue, whether involved or not in one or more CO-NH bonds mentioned above mentioned, being either retained or reversed by relation to the aminoacyl residues constituting a peptide of reference, these compounds still being designated immunoretroids, a mimotope, etc.
Antigens according to the invention can for example be obtained by action of PAD (peptidyl arginine deiminase) on proteins or peptides S
natural, recombinant, or synthetic, containing arginine residues, and in particular comprising at least an arginine residue constituting the center of a motif identical to those present in the S sequences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6; they can also be obtained by peptide synthesis, by directly incorporating one or more residues citrulline, and preferably one or more epitoges comprising a citrulline residue, as defined above 10 above, in the synthesized peptide.
The present invention also relates to the use of antigens according to the invention, such as as defined above, for the in vitro diagnosis of PR.
The present invention particularly encompasses antigenic compositions for the diagnosis of presence of RA specific autoantibodies in a biological sample, which compositions are characterized in that they contain at least one 20 antigen according to the invention, optionally labeled and / cu conjugated with a carrier molecule.
The present invention also relates to a method for detecting class G autoantibodies specific for RA in a biological sample, 25 which method is characterized in that it comprises.
- bringing said biological sample into contact with at minus an antigen in accordance with the invention, as defined above, under conditions allowing training of an antigen / antibody complex with autoantibodies Specific for RA which may be present;
- detection, by any appropriate means, of the complex antigen / antibody possibly formed.
This detection method can be implemented work thanks to a kit comprising at least one 35 antigen according to the invention, as well as buffers and reagents suitable for building up a medium reaction allowing the formation of a complex antigen / antibody, and / or means for detecting said antigen / antibody complex.
Said kit may also include, where appropriate, reference samples, such as one or more several sera) negative) and one or more sera) positive.
The present invention will be better understood from using the additional description which follows, which is refers to examples of preparation and implementation antigens according to the invention.
EXAMPLE 1. IN VITRO DEIMINATION OF FILAGGRIN
RECOMBINANT BY PEPTIDYL ARGININE DEIMINASE (PAD).
Recombinant filaggrin is produced according to the following protocol.
A DNA fragment coding for a unit filaggrine is amplified by PCR, from genomic DNA
human (RAJI cells. ATCC CCL86) using the 2 following primers.
5 'primer.

5' TTCCTATACCAGGTGAGCACTCAT 3' Amorce 3' .
5' AGACCCTGAACGTCCAGACCGTCCC 3' Le produit d'amplification est cloné dans le site SmaI du vecteur pUCl9. On procède à la sélection des clones recombinants, en vérifiant la présence d'un insert de 972 pb obtenu après digestion avec SacI et XbaI. Cet insert est ensuite sous-cloné dans pUCl9. L'insert résultant de ce sous-clonage est ensuite transféré dans le vecteur pGEX (commercialisé par la société PHARMACIA), entre les sites EcoRI et HindIII. Le vecteur d'expression ainsi obtenu exprime, dans E. coli, la filaggrine en fusion avec la glutathion-S-transférase (GST), sous contrôle du promoteur procaryote Tac. La synthèse de la protéine recombinante est induite par addition d'isopropyl-(3-D-galactoside (IPTG) à la culture.

La filaggrine recombinante ainsi obtenue sera dénommée ci-après . " fil-gst ".
On constate après électrophorëse, l'existence de 9 fragments qui résultent d'une protéolyse post 5 traductionnelle de la filaggrine entière.
Le mélange des 9 fragments est soumis à une déimination in vitro par la peptidyl arginine déiminase.
On utilise une préparation de peptidyl arginine déiminase de muscle de lapin (681 U/ml) l0 commercialisée par TAKARA BIOMED EUROPE, selon le protocole préconisé par le fabricant.
Les conditions opératoires sont les suivantes .
- Milieu réactionnel . Tris-HC1 0,1 M, CaCl2 10 mM, DTT 5 mM, pH 7,4 ;
- Rapport enzyme/substrat . 140 mU/~mole de filaggrine contenant 10% d'arginine soit 4 mU/~mole d'arginine ;
- Incubation . entre 0 et 60 mn à 50°C ;
Arrêt de la réaction . chauffage 3 mn en tampon de LAEMMLI
On effectue en parallèle les 8 réactions suivantes.
(1) BSA (sérum albumine bovine) incubée dans milieu réactionnel (lh, 50°C) sans P.A.D.
(2) BSA incubée dans milieu réactionnel (lh, 50°C) avec 60 mU de P.A.D.
(3) fil-gst incubée dans milieu réactionnel (lh, 50°C) sans P.A.D.
(4) fil-gst incubée dans milieu réactionnel (5 minutes à 50°C) avec 60 mU de P.A.D.
(5) fil-gst incubée dans milieu réactionnel (15 minutes à 50°C) avec 60 mU de P.A.D.
5 'TTCCTATACCAGGTGAGCACTCAT 3' 3 'primer.
5 'AGACCCTGAACGTCCAGACCGTCCC 3' The amplification product is cloned into the SmaI site of the vector pUCl9. We proceed to the selection of recombinant clones, checking the presence of an insert of 972 bp obtained after digestion with SacI and XbaI. This insert is then subcloned into pUCl9. The insert resulting from this subcloning is then transferred to the vector pGEX (sold by the company PHARMACIA), between the EcoRI and HindIII sites. The expression vector thus obtained expresses, in E. coli, filaggrin in glutathione-S-transferase (GST) fusion, under control of the prokaryotic promoter Tac. The synthesis of recombinant protein is induced by addition isopropyl- (3-D-galactoside (IPTG) to the culture.

The recombinant filaggrin thus obtained will be hereinafter referred to as. "fil-gst".
We see after electrophoresis, the existence of 9 fragments that result from post proteolysis 5 translational of the whole filaggrin.
The mixture of the 9 fragments is subjected to a in vitro elimination by peptidyl arginine deiminase.
We use a peptidyl preparation rabbit muscle arginine deiminase (681 U / ml) l0 marketed by TAKARA BIOMED EUROPE, according to protocol recommended by the manufacturer.
The operating conditions are following.
- Reaction medium . 0.1 M Tris-HC1, CaCl2 10 mM, 5 mM DTT, pH 7.4;
- Enzyme / substrate ratio. 140 mU / ~ mole of filaggrin containing 10% arginine or 4 mU / ~ mole arginine;
- Incubation. between 0 and 60 min at 50 ° C;
Stop the reaction. heating 3 min in LAEMMLI stamp The 8 reactions are carried out in parallel following.
(1) BSA (bovine serum albumin) incubated in reaction medium (lh, 50 ° C) without PAD
(2) BSA incubated in reaction medium (lh, 50 ° C) with 60 mU PAD
(3) fil-gst incubated in reaction medium (lh, 50 ° C) without PAD
(4) fil-gst incubated in reaction medium (5 minutes at 50 ° C) with 60 mU PAD
(5) fil-gst incubated in reaction medium (15 minutes at 50 ° C) with 60 mU PAD

(6) fil-gst incubée dans milieu réactionnel (30 minutes à 50°C) avec 60 mU de P.A.D.

WO 99/3516
(6) fil-gst incubated in reaction medium (30 minutes at 50 ° C) with 60 mU PAD

WO 99/3516

7 PCT/FR98/02899 (7) fil-gst incubée dans milieu réactionnel (lh à 50°C) avec 60 mU de P.A.D. 7 PCT / FR98 / 02899 (7) fil-gst incubated in reaction medium (lh at 50 ° C) with 60 mU PAD

(8) fil-gst incubée dans milieu réactionnel (lh à 50°C) avec 60 mU de P.A.D. et en présence de 10 mM
de N-éthylmaléimide (inhibiteur de la P.A.D.).
On dépose 1 ~1 de chaque échantillon sur un gel d'électrophorèse (gel PHAST°-SDS 12,5ô, PHARMACIA), et on réalise l'électrophorèse avec l'appareil PHAST-SYSTEM°
(PHARMACIA), dans les conditions préconisées par le l0 fabricant. Après transfert sur nitrocellulose, on révèle soit avec un pool de 5 sérums de patients atteints de PR , dilué au 1/2000 soit avec l'anticorps monoclonal anti-filaggrine AHF2 [SIMON et al. J. Invest. Dermatol.
105, 432, (1995)] à la concentration de 0,2 ~g/ml.
Le complexe antigène/anticorps est révélé à
l'aide d'un anticorps secondaire couplé à la peroxydase, par la technique ECL.
Les résultats montrent qu'en l'absence de réaction de citrullination, la fil-gst n'est pas reconnue par les sérums de patients atteints de PR, alors que dès 5 minutes de citrullination, elle est détectée par ces sérums. Or. constate une augmentation de la réactivité
avec le pool de sérums quand on fait agir la P.A.D.
pendant 60 minutes à 50°C.
En outre, ces résultats permettent de supposer qu'il existe un ou plusieurs épitopes de forte affinité
dans la moitié COOH-terminale de la filaggrine (positions 144 à 324), cet ou ces épitope(s) étant répétés) entre les positions 76 et 149.
E~I,E 2 . CITRULLINATION DES PEPTIDES S-47-S ET S-35-R
PAR LA P.A.D, ET ESSAI DE LA RÉACTIVITÉ DES PEPTIDES
CITRULLINÉS.
Le peptide de 49 acides aminés S-47-S de séquence (code 1 lettre) .

correspondant aux acides aminés 71 à 119 de la séquence d'une unité àe filaggrine humaine, et comportant 6 résidus arginine, et le peptide de 37 acides aminés S-35-R de séquence (code 1 lettre) .
NH~-SQDP,DSQAQSEDSERRSASASRNHRGSAQEQSRDGSR-COOH
correspondant aux acides aminés 155 à 191 de la séquence d'une unité de filaggrine humaine, et comportant 7 résidus arginine, ont été préparés par l0 synthèse peptidique. Les peptides S-47-S et S-35-R sont représentés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros respectifs SEQ ID N0: 3 et SEQ ID N0: 4.
Ces 2 peptides, ainsi que la fil-gst, ont été
citrullinés par action de la P.A.D., pendant 30 minutes à
50°C, dans le même milieu réactionnel que celui indiqué à
l'exemple 1. Les conditions spécifiques pour chaque peptide, et pour la fil-gst sont les suivantes .
- peptide S-97-S . 4 mU/~mole arginine - peptide S-35-R . 2,7 mU/~.mole arginine - fil-gst . comme indiqué à l'exemple 2.
On compare, par " dot-blot ", la réactivité de chaque peptide et celle de la fil-gst, avant et après action de l'enzyme, vis-à-vis de l'anticorps monocîonal AHF4, et du sérum d'un patient atteint de PR.
Les conditions opératoires sont les suivantes .
- 0,5 ~g par dépôt de chaque antigène (peptides, fil-gst, variants acido-neutres de la filaggrine (VAF)) - Traitement de la nitrocellulose 45 minutes à
80°C, avant immunodétection.
- sérum PR utilisé à la dilution de 1/2000 ;
anticorps monoclonal AHF4 utilisé à une concentration de 0,2 ~g/ml Les résultats montrent que .

- AHF4 reconnaît le peptide S-47-~ et la fil-gst citrullinés ou non, mais ne reconnaît pas S-35-R, citrulliné ou non.
- S-47-S est reconnu, après ci~rullination, par le sérum du patient atteint de PR, alors que S-35-R, citrulliné ou non, n'est pas reconnu. Le même sérum reconnaît par ailleurs les VAF et la fil-gst citrullinée, mais ne reconnaît pas la fil-gst non-citrullinée.
E7~LE 3 . SYNTHESE DES PEPTIDES E-12-H ET E-12-D
CITRULLINES ET NON CITRULLINES ET ESSAI DE LA REACTIVITE
DES PEPTIDES.
Les peptides E-12-H et E-12-D ont été
déterminés par référence aux séquences nucléotidiques du gène de la profilaggrine humaine décrites pa= GAN S.Q et al. [Biochemistry, 29 . 9432-9440, (1990)].
Le peptide de 14 acides aminés E-12-H de séquence (code 1 lettre) .

comprend 1 résidu arginine, et le peptide de 14 acides aminés E-12-D de séquence (code 1 lettre) .
NHZ-ESSRDGSRHPRSHD-COOH
comprend 3 résidus arginine.
Les peptides E-12-H et E-12-D sont représentés dans la liste de séquences en annexe sous les numéros respectifs SEQ ID N0: 5 et SEQ ID N0: 6.
Ces peptides ont été préparés par synthèse peptidique en phase solide.
Les peptides E-12-H et E-12-D citrullinés ont été synthétisés directement par incorporation d'une citrulline en remplacement d'une arginine.
Pour le peptide E-12-D, seul le résidu arginine correspondant au Home acide aminé de la séquence a été remplacé par une citrulline lors de la synthèse peptidique.

La réactivité de chaque peptide citrulliné et non citrulliné a été testée respectivement vis-à-vis d'ur.
sérum normal, de deux sérums de patients PR, d'anticorps anti-filaggrine (AFAs) purifiés à partir d'un pool de 45 sérums de patients PR et d'anticorps anti-filaggrine purifiés à partir de 12 sérums de patients PR.
PROTOCOLE EXPERIMENTAL .
Les puits de plaques de microtitration NUNC
MAXISORP ont été revêtus respectivement à l'aide des peptides E-î2-D et E-12-H non-citrullinés et citrullinés, dilués à une concentration de 5 ~.g/ml dans un tampon PBS
(pH: 7,4) et incubés pendant une nuit à 4°C (volume final . 100 ~g/puits). Les puits ont été saturés pendant 30 minutes à 37°C en PBS-Tween 20, 0,05% gélatine 2,5%, 200 ~.1/puits. Le sérum de contrôle négatif (sérum normal) a été dilué au 1/120. Les anticorps anti-filaggrine ont été dilués en PBS-Tween 20, 0,05%-gélatine 0,5% (PBS TG) de sorte que les concentrations finales en auto-anticorps anti-filaggrine soient celles indiquées dans le tableau I
annexé. Le sérum de contrôle négatif, les sérums PR et les anticorps anti-filaggrine ont été ajoutés (volume final . 100 ~1/puits) et soumis à incubation pendant 1 heure à 37°C et une nuit à 4°C. Des anticorps de chèvre anti-chaînes lourdes gamma des immunoglobulines humaines, marqués à la peroxydase (commercialisés par la société
SOUTHERN BIOTECHNOLOGIES) ont été ajoutés dans chaque puits (dilution en PBSTG . 1/2000, volume final 100 ~1/puits) et soumis à incubation pendant 1 heure à
37°C. La révélation a été effectuée par addition d'ortho-3o phénylènediamine (2mg/ml, pendant 10 minutes).
Les résultats présentés dans le tableau I
annexé sont donnés en rapport de DO à 492 nm . signal peptide citrulliné/signal peptide non-citrulliné.
Ces résultats montent que, dans la majorité
des cas, le rapport en DO peptide citrulliné/peptide non citrulliné est supérieur à 1, et illustrent donc la bonne 1~
sensibilité des peptides citrullinés par rapport aux peptides non-citrullinés pour leur réactivité vis-à-vis des autoanticorps anti-filaggrine.

LISTE DE SQUENCES

<110> BIOMERIEUX

SERRE, Guy GIRBAL-NEUHAUSER, lisabeth VINCENT, Christian SIMON, Michel SEBBAG, Mireille DALBON, Pascal JOLIVET-REYNAUD, Colette ARNAUD, Michel JOLIVET, Michel <120> EPITOPES PEPTIDIQUES RECONNUS PAR DES AUTO-ANTICORPS

ANTIFILAGGRINE PRSENTS DANS LE SRUM DES PATIENTS

ATTEINTS DE POLYARTHRT_TE RHUMATOIDE

<130> MJPcb1067/la <140>

<141>

<150> FR9716673 <151> 1997-12-30 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 29 <212> ADN

<213> Homo sapiens <400> 1 ttcctatacc aggtgagcac tcat <210> 2 <211> 25 <212> ADN

<213> Homo sapiens <400> 2 agaccctgaa cgtccagacc gtccc <210> 3 <211> 99 <212>

<213> Homo sapiens <400> 3 stghsgsqhs htttqgrsda srgssgsrst sretrdqeqs gdgsrhsgs49 <210> 9 <211> 37 <212>

<213> Homo sapiens <400> 9 sqdrdsqaqs edserrsasa srnhrgsaqe qsrdgsr <210> 5 <2I1> 14 <212>

<213> Homo sapiens <400> 5 eqsadssrhs gsgh 1q <210> 6 <211> 19 <212>
<213> Homo sapiens <400> 6 essrdgsrhp rshd 14
(8) fil-gst incubated in reaction medium (lh at 50 ° C) with 60 mU of PAD and in the presence of 10 mM
N-ethylmaleimide (PAD inhibitor).
1 ~ 1 of each sample is placed on a electrophoresis gel (PHAST ° -SDS 12.56 gel, PHARMACIA), and electrophoresis is carried out with the PHAST-SYSTEM ° device (PHARMACIA), under the conditions recommended by the l0 manufacturer. After transfer to nitrocellulose, it is revealed either with a pool of 5 sera from patients with PR, diluted to 1/2000 with either the monoclonal antibody anti-filaggrin AHF2 [SIMON et al. J. Invest. Dermatol.
105, 432, (1995)] at the concentration of 0.2 ~ g / ml.
The antigen / antibody complex is revealed at using a secondary antibody coupled to peroxidase, by the ECL technique.
The results show that in the absence of citrullination reaction, fil-gst is not recognized by sera from RA patients, as soon as 5 minutes of citrullination, it is detected by these will be. Or. Notes an increase in reactivity with the serum pool when the PAD is activated for 60 minutes at 50 ° C.
Furthermore, these results allow us to suppose that there are one or more epitopes of high affinity in the COOH-terminal half of filaggrin (positions 144 to 324), this or these epitope (s) being repeated) between positions 76 and 149.
E ~ I, E 2. CITRULLINATION OF S-47-S AND S-35-R PEPTIDES
BY THE PAD, AND TEST OF THE REACTIVITY OF THE PEPTIDES
CITRULLINATED.
The peptide of 49 amino acids S-47-S from sequence (code 1 letter).

corresponding to amino acids 71 to 119 of the sequence of a human filaggrin unit, and comprising 6 arginine residues, and the peptide of 37 amino acids S-35-R from sequence (code 1 letter).
NH ~ -SQDP, DSQAQSEDSERRSASASRNHRGSAQEQSRDGSR-COOH
corresponding to amino acids 155 to 191 of the sequence of a unit of human filaggrin, and containing 7 arginine residues, were prepared by l0 peptide synthesis. The peptides S-47-S and S-35-R are represented in the attached sequence list under the respective numbers SEQ ID N0: 3 and SEQ ID N0: 4.
These 2 peptides, as well as the fil-gst, were citrullines per action of PAD, for 30 minutes at 50 ° C, in the same reaction medium as that indicated at Example 1. The specific conditions for each peptide, and for the fil-gst are as follows.
- peptide S-97-S. 4 mU / ~ mole arginine - peptide S-35-R. 2.7 mU / ~ .mole arginine - fil-gst. as shown in Example 2.
We compare, by "dot-blot", the reactivity of each peptide and that of fil-gst, before and after action of the enzyme vis-à-vis the monoclonal antibody AHF4, and serum from a patient with RA.
The operating conditions are following.
- 0.5 ~ g per deposit of each antigen (peptides, fil-gst, acid-neutral variants of the filaggrin (VAF)) - Treatment of nitrocellulose 45 minutes at 80 ° C, before immunodetection.
- PR serum used at a dilution of 1/2000;
monoclonal antibody AHF4 used at a concentration of 0.2 ~ g / ml The results show that.

- AHF4 recognizes the peptide S-47- ~ and the fil-gst citrullinated or not, but does not recognize S-35-R, citrullinated or not.
- S-47-S is recognized, after ci ~ rullination, by the serum of the RA patient, while S-35-R, citrullinated or not, is not recognized. The same serum also recognizes VAF and citrullinated fil-gst, but does not recognize non-citrullinated fil-gst.
E7 ~ LE 3. SYNTHESIS OF E-12-H AND E-12-D PEPTIDES
CITRULLINES AND NON-CITRULLINES AND REACTIVITY TEST
PEPTIDES.
The peptides E-12-H and E-12-D have been determined by reference to the nucleotide sequences of the human profilaggrin gene described pa = GAN SQ and al. [Biochemistry, 29. 9432-9440, (1990)].
The peptide of 14 amino acids E-12-H from sequence (code 1 letter).

includes 1 arginine residue, and the peptide of 14 amino acids E-12-D from sequence (code 1 letter).
NHZ-ESSRDGSRHPRSHD-COOH
includes 3 arginine residues.
The peptides E-12-H and E-12-D are shown in the sequence list in the appendix under the numbers SEQ ID N0: 5 and SEQ ID N0: 6 respectively.
These peptides were prepared by synthesis solid phase peptide.
Citrullinated peptides E-12-H and E-12-D have been synthesized directly by incorporating a citrulline to replace an arginine.
For the peptide E-12-D, only the residue arginine corresponding to the Home amino acid of the sequence has been replaced by a citrulline during synthesis peptide.

The reactivity of each citrullinated peptide and non citrulliné was tested respectively against ur.
normal serum, two PR patient sera, antibody anti-filaggrin (AFAs) purified from a pool of 45 sera from RA patients and anti-filaggrin antibodies purified from 12 sera from RA patients.
EXPERIMENTAL PROTOCOL .
NUNC microtiter plate wells MAXISORP have been coated respectively with non-citrullinated and citrullinated peptides E-12-D and E-12-H, diluted to a concentration of 5 ~ .g / ml in PBS buffer (pH: 7.4) and incubated overnight at 4 ° C (volume final. 100 ~ g / well). Wells were saturated for 30 minutes at 37 ° C in PBS-Tween 20, 0.05% gelatin 2.5%, 200 ~ .1 / well. Negative control serum (normal serum) has been diluted 1/120. Anti-filaggrin antibodies have been diluted in PBS-Tween 20, 0.05% - gelatin 0.5% (PBS TG) so the final autoantibody concentrations anti-filaggrin are those indicated in table I
Annex. Negative control serum, PR sera and anti-filaggrin antibodies have been added (volume final. 100 ~ 1 / well) and incubated for 1 hour at 37 ° C and overnight at 4 ° C. Goat antibodies anti-gamma heavy chains of human immunoglobulins, labeled with peroxidase (sold by the company SOUTHERN BIOTECHNOLOGIES) have been added to each well (dilution in PBSTG. 1/2000, final volume 100 ~ 1 / well) and incubated for 1 hour at 37 ° C. The revelation was carried out by adding ortho-3o phenylenediamine (2mg / ml, for 10 minutes).
The results presented in Table I
annexed are given in OD ratio at 492 nm. signal citrullinated peptide / non-citrullinated peptide signal.
These results show that, in the majority cases, the ratio of citrullinated peptide OD to non-peptide citrulliné is greater than 1, and therefore illustrates the correct 1 ~
sensitivity of citrullinated peptides to non-citrullinated peptides for their reactivity towards anti-filaggrin autoantibodies.

LIST OF SEQUENCES

<110> BIOMERIOUS

SERRE, Guy GIRBAL-NEUHAUSER, lisabeth VINCENT, Christian SIMON, Michel SEBBAG, Mireille DALBON, Pascal JOLIVET-REYNAUD, Colette ARNAUD, Michel JOLIVET, Michel <120> PEPTIDE EPITOPES RECOGNIZED BY AUTO-ANTIBODIES

ANTIFILAGGRIN PRESENT IN PATIENT SRUM

POLYARTHRT_TE RHUMATOIDE ATTACKS

<130> MJPcb1067 / la <140>

<141>

<150> FR9716673 <151> 1997-12-30 <160> 6 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 29 <212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 1 ttcctatacc aggtgagcac tcat <210> 2 <211> 25 <212> DNA

<213> Homo sapiens <400> 2 agaccctgaa cgtccagacc gtccc <210> 3 <211> 99 <212>

<213> Homo sapiens <400> 3 stghsgsqhs htttqgrsda srgssgsrst sretrdqeqs gdgsrhsgs49 <210> 9 <211> 37 <212>

<213> Homo sapiens <400> 9 sqdrdsqaqs edserrsasa srnhrgsaqe qsrdgsr <210> 5 <2I1> 14 <212>

<213> Homo sapiens <400> 5 eqsadssrhs gsgh 1q <210> 6 <211> 19 <212>
<213> Homo sapiens <400> 6 essrdgsrhp rshd 14

Claims (7)

REVENDICATIONS 1) Peptide comprenant un épitope reconnu par des autoanticorps anti-filaggrine présents dans le sérum des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, caractérisé en ce que ledit épitope comprend un motif tripeptidique centré sur un résidu citrulline, spécifiquement présent sur au moins un des peptides citrullinés dérivés des séquences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6. 1) Peptide comprising an epitope recognized by anti-filaggrin autoantibodies present in the serum patients with rheumatoid arthritis, characterized in that said epitope comprises a motif tripeptide centered on a citrulline residue, specifically present on at least one of the peptides citrullines derived from the sequences SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6. 2) Peptide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend le motif tripeptidigue Ser-Cit-His, dans lequel Cit représente un résidu citrulline. 2) Peptide according to claim 1, characterized by comprising the tripeptidal motif Ser-Cit-His, in which Cit represents a residue citrulline. 3) Antigène artificiel reconnu spécifiquement par les auto-anticorps anti-filaggrine présents dans le sérum de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué par au moins un peptide selon une quelconque des revendications 1 ou 2. 3) Specifically recognized artificial antigen by the anti-filaggrin autoantibodies present in the serum from patients with rheumatoid arthritis, characterized in that it comprises or consists of at least one peptide according to any of the claims 1 or 2. 4) Utilisation d'un antigène selon une quelconque des revendications 1 à 3, pour le diagnostic in vitro de la polyarthrite rhumatoïde. 4) Use of an antigen according to a any of claims 1 to 3, for the diagnosis in vitro of rheumatoid arthritis. 5) Composition antigénique pour le diagnostic de la présence d'auto-anticorps spécifiques de la polyarthrite rhumatoïde dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu'elle contient au moins un antigène selon une quelconque des revendications 1 à 3, éventuellement marqué et/ou conjugué avec une molécule porteuse. 5) Antigenic composition for diagnosis the presence of specific autoantibodies of the rheumatoid arthritis in a biological sample, characterized in that it contains at least one antigen according to any one of claims 1 to 3, optionally labeled and/or conjugated with a molecule carrier. 6) Procédé de détection des auto-anticorps spécifiques de la polyarthrite rhumatoïde dans un échantillon biologique, lequel procédé est caractérisé en ce qu'il comprend .
- la mise en contact dudit échantillon biologique avec au moins un antigène selon une quelconque des revendications 1 à 3, dans des conditions permettant la formation d'un complexe antigène/anticorps avec les auto-anticorps spécifiques de la polyarthrite rhumatoïde éventuellement présents;
- la détection, par tous moyens appropriés, du complexe antigène/anticorps éventuellement formé.
6) Autoantibody detection method specific for rheumatoid arthritis in a biological sample, which method is characterized by what he understands.
- bringing said biological sample into contact with at least at least one antigen according to any of the claims 1 to 3, under conditions allowing the formation of a antigen/antibody complex with autoantibodies specific for rheumatoid arthritis possibly present;
- the detection, by any appropriate means, of the complex antigen/antibody possibly formed.
7) Nécessaire pour la détection des auto-anticorps spécifiques de la polyarthrite rhumatoïde dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins un antigène selon quelconque des revendications 1 à 3, ainsi que des tampons et réactifs appropriés pour la constitution d'un milieu réactionnel permettant la formation d'un complexe antigène/anticorps, et/ou des moyens de détection dudit complexe antigène/anticorps. 7) Necessary for the detection of autoantibodies specific for rheumatoid arthritis in a biological sample, characterized in that it comprises at least one antigen according to any of claims 1 to 3, as well as buffers and reagents suitable for forming a reaction medium allowing the formation of an antigen/antibody complex, and/or means for detecting said complex antigen/antibody.
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