EP1434797A2 - Insulinmimetische aminosäuresequenzen - Google Patents

Insulinmimetische aminosäuresequenzen

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Publication number
EP1434797A2
EP1434797A2 EP02777293A EP02777293A EP1434797A2 EP 1434797 A2 EP1434797 A2 EP 1434797A2 EP 02777293 A EP02777293 A EP 02777293A EP 02777293 A EP02777293 A EP 02777293A EP 1434797 A2 EP1434797 A2 EP 1434797A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
exsulins
amino acid
insulin
basic unit
basic units
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02777293A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Josef H. Wissler
Gilda Georgi
Günther Boehm
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nutricia NV
Original Assignee
Nutricia NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nutricia NV filed Critical Nutricia NV
Publication of EP1434797A2 publication Critical patent/EP1434797A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/48—Drugs for disorders of the endocrine system of the pancreatic hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4732—Casein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to insulin mimetic amino acid sequences, which according to the invention are also referred to as exsulins, pharmaceutical and dietetic agents containing these exsulins, the use of these exsulins as insulin mimetics and a method for producing these exsulins.
  • Insulin and IGFs have long been known endogenous protein hormones and protein mediators.
  • the numerous family members of the well-known metal ion-regulated insulin protohormones / mediators are characterized by a wide variety of relationships with regard to structure, action and the mechanisms of biological message transmission.
  • the most well-known effect of the insulin per se is the anabolic hormone effect for regulating the level of glucose in the blood.
  • the IGFs which are homologous to the structure, are mainly known as hyperplastic growth factors with a proliferation effect on various cells.
  • the hypertrophic growth factors for nerve cells ("Nerve Growth Factors", NGF) for this family of insulin-like proteomediators etc.
  • Insulin or IGFs are of great practical and socio-economic importance in a large number of medical and biotechnical areas of application and as active substances in the body as pharmaceuticals for the prevention and treatment of many degenerative diseases (e.g. various forms of diabetes mellitus and secondary diseases). After their synthesis from mother molecules, they are physiologically endogenously stored mainly in finished, functionally independent form in certain cells endogenously and thus secreted endogenously in biological fluids, from where they can endogenously develop their biological activity (endocrine or paracrine and autocrine intercellular signal transmission).
  • the compounds according to the invention are insulin-mimetic amino acid sequences or substance structures, which according to the invention are also referred to as exsulins.
  • the exsulins according to the invention have a molecular weight of up to 55,000 daltons and have 1 to 50 basic units of the following general formula I:
  • [L, V, I, A], [D, E], [N, Q, M], [C, H] and X mean 1 to peptidically linked amino acids, [L, V, I, A] for leucine ( L), valine (V), isoleucine (I) or alanine (A) [D, E] stands for aspartic acid (D) or glutamic acid (E), [N, Q, M] stands for asparagine (N), glutamine ( Q) or methionine (M), [C, H] stands for cysteine (C) or histidine (H), the two groups [L, V, I, A] can be identical or different in one basic unit,
  • X 1 , X 2 , X 3 and X 4 represent any amino acid and the four Amino acids X 1 to 4 can be the same or different in a basic unit, the basic unit of the general formula (I) can be middle or terminal, in the case of a terminal basic unit only one of the radicals [-] is present, provided that several basic units of the general formula (I ) in one
  • Molecule are present, these basic units can be the same or different, and the residues [-], if present, each for any, with a peptide
  • Linking of two neighboring basic units There may also be material structures with insertions, deletions and conservative exchanges of amino acids.
  • the phosphorylated, acetylated, farnesylated, oxidized, conjugated with carbohydrates and / or lipids and / or immobilized on a solid or liquid carrier of these exsulins are also included.
  • exsulins according to the invention thus have 4 amino acids X in the basic unit, which can be of any nature. There are therefore no particular restrictions with regard to these amino acids X 1 to 4 . Any amino acid can be present.
  • the basic unit of the exsulins according to the invention also has 5 amino acid groups which are enclosed in square brackets in the general formula I and which can have only certain meanings.
  • the amino acid groups [L, V, I, A] can only represent leucine (L), valine (V), isoleucine (I) or alanine (A).
  • the amino acid groups [D, E], [N, Q, M] and [C, H] can have the meanings given above in an analogous manner.
  • amino acids are represented in the one-letter alphabet according to the international nomenclature according to the prior art.
  • X stands for a freely selectable amino acid or derivatization.
  • valine represents a conservative exchange of, for example, leucine, isoleucine or alanine, etc.
  • the hyphens [-] shown in parentheses at the two ends of the basic unit of the general formula (I) indicate that the basic unit of the general formula (I) can also be part of a larger molecule.
  • the hyphens [-] therefore do not per se belong to the basic unit of the general formula (I), but stand for other amino acid residues and / or linkages, which will be discussed in more detail below.
  • 1 to 50 basic units or basic structures can thus be present in the exsulins according to the invention.
  • Range 1 to 50 encompasses all integer values between the range limits. In order to meet the requirements for sufficient disclosure, this means that the exsulins 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1, 12, 13, 14, 15, 16 , 17, 18, 19,20,21, 22,23,24,25,26,27, 28,29,30,31, 32,33,34,35,36,37,38,39,40,41 , 42,43,44,45,46,47,48,49 and 50 basic units. If there are two or more basic units, they can be the same or different. In addition, the basic units can be medium-sized or terminal.
  • the order of the amino acid groups [L, V, I, A], [D, E], [N, Q, M] and [C, H] as well as the amino acids X 1 , X 2 , X 3 and X 4 can also be found in the basic unit of the general formula I can be any.
  • the order of the amino acid groups and amino acids X 1 to X 4 mentioned can be arbitrary. However, the order evident from the formula (I) is preferred.
  • exsulins according to the invention can be obtained from organisms, tissues, cells and biological fluids, their cultures and culture supernatant solutions, preferably from food and feed, Dietary and luxury foods as well as substitutes and additives, in particular from milk and / or proteins, for example caseins, can be obtained. If, for example, caseins are used as starting materials, the exsulins according to the invention are also referred to as casoinsulins in the context of the present documents.
  • exsulins according to the invention are therefore not present in the starting materials as functionally independent substance structures, but they only occur functionally and structurally cryptically, i.e. they are only formed in subsequent reactions and processes and / or derived from independent mother molecules that do not
  • exsulins according to the invention are therefore preferably obtainable from the starting materials described.
  • exsulins according to the invention have metallo-regulated properties and interactions with other substances, which are brought about in particular by transition metal ions, for example Cu and Zn ions.
  • exsulins according to the invention have mimetic properties and functional relationships and relationships to insulins and members of the family of insulin-like growth factors ("insulin-like growth factors, IGF"). However, they are structurally different from the family of endogenous insulin and insulin-related (IGF) proteohormones and proteomediators.
  • IGF insulin-like growth factors
  • Preferred exsulins according to the invention are the following: LTDLENLHLPLPLLQPSMQQVPQPIPQTLALPPQPLWSVPEPK and
  • the insertions, deletions and / or conservative replacements of amino acids available exsulins or substance structures are also included.
  • IGF insulin-like Growth Factors
  • Insulin-mimetic effects through interaction with various cells, cell systems and organs of vertebrates, including mammals and humans.
  • Insulin-mimetic effects through selective interaction and complex formation in vivo and in vitro with antibodies against insulin from vertebrates, including mammals and humans.
  • the exsulins according to the invention can be used to mimic the properties and functions of members of the family of endogenous insulin and IGF proteohormones / mediators (as set out above) and also as a substitute for these.
  • the invention also relates to pharmaceutical and dietetic agents which contain at least one exsulin according to the invention. These agents can be used in particular for the prevention and specific treatment or influencing of hormonal states and disorders and of various degenerative diseases, for example various forms of hormone metabolism disorders, resistance, deficiencies, hyperinsulinemia, diabetes mellitus and autoimmune and neurodegenerative diseases and their complications are used.
  • Another possible use is the production of inhibitors and regulators of the effects of members of the family of endogenous insulin and IGF proteohormones / mediators, as well as of molecular biological structures of equivalence and of antibodies.
  • exsulins according to the invention can be administered systemically or locally, parenterally, intravenously, individually or as a mixture in the form of customary medicaments and according to the usual safety, testing and prescription guidelines, in mammals in an amount of 1 fg / kg to 10 g / kg.
  • these medicaments can also contain at least one anti-exsulin immunoglobulin and / or molecular biological equivalence structures.
  • the substances of the invention can be used as dietetic agents or additives.
  • the medicaments according to the invention can also contain at least one other carrier, auxiliary or additive.
  • one or more additional active ingredient (s) can be present.
  • the exsulins according to the invention can also be incorporated into dietetic agents. These include food, dietary products, food supplements and luxury foods as well as substitutes and additives.
  • the exsulins according to the invention can be produced or obtained by recovering all or part of organisms, tissues, cells and biological fluids, their cultures and culture supernatant solutions, preferably food and feed, diet and luxury foods, and substitutes and additives , in particular from milk and / or milk proteins, for example caseins, treated with physical, chemical and / or biological methods in vivo and / or in vitro in such a way that parts of them are removed, added, selected and / or modified, for example in order to obtain properties similar to those of breast milk To get funds, or to remove such properties from it.
  • food and feed technology medical technology, molecular biotechnology, membrane technology, pharmaceutical technology, cell biology, cell culture technology, immunobiology, enzyme technology, chromatographic and known conventional methods can be used alone or in combination, based on manageability, medium quality, quantity, yield, economy and other common norms and standards can be optimized.
  • known structures of food, feed, diet and luxury foods to manufacture and obtain the substances and agents as well as substitutes and additives as well as using them as well as chemically and / or molecularly synthesized sequences of molecular components and / or parts and homologous sequences thereof.
  • the changes in the starting materials can be brought about by various processes of the introduction of substances and energy.
  • the energy input can take place by heating and / or pH changes.
  • enzyme engineering processes are preferably used today.
  • hydrolases E.C. 3.-.-.-
  • proteases E.C. 3.1.4.-
  • phosphatases E.C.3.1.3.-
  • trypsin EC 3.4.21.4
  • / or chymptrypsin EC 3.4.21.1
  • acid phosphatase EC3.1.3.2
  • Potatoes used.
  • Plant and fungal organisms, parts, derivatives and food and feed technology products made therefrom can also be changed by the introduction of substances or energy so that exsulins according to the invention are formed.
  • Vegetable phosphate-containing substances, vegetable high-phosphorylated carbohydrates and phosphate-containing proteins can also preferably be treated with phytases (E.C. 3.1.3.-, for example inositol hexakisphosphate phosphohydrolases, E.C. 3.1.3.8) alone or in combination with phosphatases.
  • the products obtained are expediently treated further in such a way that the free phosphate thereby formed is removed therefrom by suitable processes before using the products.
  • milk, parts and derivatives thereof as well as food and feed technical products as well as diet and luxury foods, substitutes and additives are produced using enzymes changed so that the exsulins according to the invention are formed.
  • cow's milk or the casein and / or its cleavage products are used as part of the cow's milk.
  • Substance components in the form of the phosphoproteins and their phosphorylated cleavage products (“phosphopeptides”) for example those of bovine casein and its cleavage peptides, can also be treated preferably with the aforementioned, particularly preferred form of phosphatase for dephosphorylation.
  • the casein of cow's milk can be treated or take up its proteolytic cleavage products in neutralized water and separate them into two batch portions, one of which is subjected to the treatment mentioned for dephosphorylation, in particular with the particularly preferred form of phosphatase.
  • the preparation which has been subjected to the dephosphorylation reaction contains the substances according to the invention of phosphate groups liberated or impoverished therein; the other preparation, which has not been treated in this respect, contains the exsulins according to the invention as naturally phosphorylated compounds.
  • food, feed, diet or luxury foods substitutes and additives with an epidemiologically justified risk of developing and developing degenerative diseases in connection with nutritional factors
  • the energy input can be done by heating and / or pH changes, followed by chemical, physico-chemical and / or physical or mechanical
  • the individual exsulins according to the invention can also be produced as such in isolated form.
  • the exsulins (casoinsulins) formed are treated with conventional enrichment, cleaning and isolation processes ("downstream processing") with physical, physical-chemical, chemical and / or (also genetic and / or immune) biological methods according to the state of the art Technology separated from other substances and isolated and / or concentrated and / or converted into a liquid (dissolved) or solid state.
  • the solutions containing exsulin (casoinsulin) are concentrated to a dry matter content of 35-40% according to the prior art.
  • downstream processings can be designed as single-stage or multi-stage batch (one-pot) and / or column processes alone or in combination with other processes.
  • customary methods of preparative preparation of biological substances can first be used, preferably chromatographic, electrophoretic, membrane technology and sedimentation methods, for example precipitation methods, and methods of phase extraction.
  • methods of liquid phase extraction in the form of countercurrent distribution in particular in the form of the thin-film countercurrent distribution customary in the prior art, can advantageously be used.
  • ion exchange, gel, zone precipitation, affinity, hydrophobic chromatography and / or filtration are used as chromatographic processes.
  • Solid phases can be, for example, membranes, gels, hydroxyapatite, ceramics, glass particles, composite materials and / or combinations thereof. They can also be used freely, for example in so-called hybrid and / or hollow fiber module processes.
  • concentration is carried out by customary methods, for example by precipitation, countercurrent distribution, complex formation, membrane permeation processes, in particular dialysis and / or ultrafiltration on suitable membranes, evaporation and / or drying, preferably spray drying, for example in the form of lyophilization.
  • both batches are then transferred to a medium which does not damage the exsulins; an aqueous liquid with physiological, neutral conditions and component concentrations in the range from 1 fMol / l to 5 mol / I is preferably transferred as such medium;
  • a physiological, aqueous medium of 0.15 mol / l NaCl, controlled pH range 6.8 - 7.4 and a buffer of 1 mmol / l imidazole-HCI, in which all reactants for reaction equivalence in the concentration range of 1 to 20 mmol / l are set.
  • copper ions are added to isolate the exsulins according to the invention.
  • zinc ions are added to isolate the exsulins according to the invention. After a reaction time of 0.01 to 100 hours at 1-60 ° C., preferably 0.1 to 10 hours at 10-40 ° C., for example at least half an hour and normal ambient conditions, the two batches are worked up separately.
  • the preparation with the exsulins according to the invention contains these as copper or zinc complexes.
  • the copper complexes are recognizable in a concentrated form and at normal temperature in a bluish color.
  • the colorless zinc complexes are partly present in dissolved, colorless and insoluble, white form in the preparation and are in equilibrium with one another in the solubility product.
  • the insoluble form can after centrifugation under usual conditions (10,000xg) as Precipitate can be separated from the soluble form and used separately after washing with water or buffer.
  • Different UV spectra and thus also a concentration measurement, based on dry weight in absolute concentration by means of the extinction coefficients according to the Lambert-Beer law, can be obtained from both preparations of the metal ion-complexed substances according to the invention.
  • the batches are preferably worked up using membrane technology for dialysis or ultrafiltration.
  • membranes are used which have a so-called exclusion limit of the hydrodynamic equivalent of the molecular mass
  • Molecular weight from 100 to 30,000 Daltons are embossed and tested.
  • membranes are preferred which have such an exclusion limit of 500 Daltons.
  • the ultrafiltration is carried out under the particularly preferred conditions mentioned and the buffer used therefor, for example, until an exchange of the medium in a volume ratio of at least 1: 1000 (batch volume: ultrafiltrate) has taken place, and thus all non-reacting components the ultrafiltrate has been removed.
  • Both approaches are collected separately and can be carried out in the usual way by filtration on a membrane of 0.01-5 ⁇ m, in particular for example, 0.2 ⁇ m pore size and kept stable until further use, for example frozen.
  • the solutions obtained of the bioactive substances of the invention can be concentrated for subsequent processes or separation of other substances, for example also salts.
  • This concentration can be carried out in various ways.
  • the substances of the invention can be processed by lyophilization and / or ultrafiltration or dewatering dialysis on one of the membranes described, in particular those with an exclusion limit of 500 daltons.
  • the exsulins are preferably isolated using at least one of the steps mentioned.
  • An embodiment is preferred which frees the substances of the invention from the main part of foreign substances by a combination of at least two of the steps mentioned.
  • exsulins according to the invention can also be prepared synthetically or "artificially" using the currently known methods of chemical synthesis of peptides.
  • the temperature and pH conditions are not particularly critical in performing the recovery, manufacturing, use and storage steps. If it is intended to maintain the native, bioactive form of the substances / exsulins according to the invention, it is advisable to maintain a temperature in the range from approximately -80 to 70 ° C., in particular 0 to 40 ° C., preferably 4-20 ° C. Furthermore, the separation and purification steps must be carried out under essentially physiological pH and salt conditions. A major advantage of the method according to the invention is that it is easily possible to comply with these conditions for the first time.
  • the substance solution can be used to prevent oxidation effects
  • Antioxidants are added, for example adapted to or, depending on the condition and use of the substances of the invention, with inosenols, L-ascorbic acid (vitamin C), L-cysteine.
  • vitamin C L-ascorbic acid
  • L-cysteine L-cysteine
  • an unfrozen solution of the exsulins according to the invention is stored and used between 0 to 50 ° C.
  • additives are 0.5 to 3 mol / l NaCl, salting ammonium sulfate, NaN 3 , organic solvents (for example ethanol additives), antibiotics.
  • exsulins can be kept, stored and used in a medium which does not damage these substances.
  • Water or an aqueous liquid including those complemented with salts and / or cell culture media, is preferably used as such medium, a controlled pH range of 3-1 1, in particular 5-9 being set.
  • a specific example of this with physiological, neutral conditions is a salt solution of 0.15 mol / l NaCl and a buffer of 1 mmol / l, for example phosphate or imidazole, pH 6.8-7.4.
  • exsulins according to the invention can be stored, after conventional sterilization, for example methods of filtration and filtering, with a pore size of 0.2 .mu.m native and bioactive at room temperature, preferably frozen (at ⁇ -25 ° C.).
  • ASTM D-1 193-70 Standard Specification for Reagent Water, Annual Book of ASTM Standards, Easton Maryland, ASTM 1970. It was also filter sterilized on surfactant-free membranes with a pore size of 0.2 ⁇ m and possible endotoxin contamination by ultrafiltration on surfactant-free Membranes with an exclusion limit of 1,000 daltons exempt (sterile, pyrogen-free water of ASTM-1 quality); see.
  • JH Wissler Large scale and biotechniques for the production and isolation of leucocytic effector substances of regenerative tissue morphogenesis by culturing cells in serum-free, synthetic fluids: Design, preparation and use of a novel medium.
  • insulin-mimetic casopeptides as a food supplement or as a capsule or sachet supplement:
  • Caseinate obtained from bovine milk, is dissolved in a concentration of 10% in 60 ° C warm water and the solution pasteurized. After the solution has cooled to 40 ° C., the pH is adjusted to 7.0 with dilute sodium hydroxide solution. Trypsin is then added (enzyme: substrate ratio of 1: 250) and the solution is incubated at 40 ° C. for 120 minutes. The same amount of chymotrypsin is then added and the solution is incubated for a further 30 min at the same temperature. The pH value is checked in the meantime and adjusted to 7.0 if necessary. After the hydrolysis has ended, the solution for inactivating the enzymes is kept at 85-90 ° C. for 10 minutes.
  • the casoinsulins are by means of affinity ultrafiltration or
  • casein 90% protein
  • water 120 kg casein (90% protein) are dissolved in water at 60 ° C.
  • the mixture is cooled to 40 ° C. and a mixture consisting of the proteases trypsin and chymotrypsin is added in a ratio of 1: 1 (enzyme: substrate ratio of 1: 250).
  • the mixture is incubated for 3 hours at 40 ° C.
  • 100 g to 5 kg of the casoinsulins prepared in Example 1 265 kg of carbohydrates (fructose and starch) and 100 kg of fat (animal and vegetable), minerals, trace elements and vitamins are added. After all components have been completely dissolved, the solution is homogenized and terminally sterilized.
  • casein which had been 60% dephosphorylated with acid phosphatase (90% protein), are dissolved in 60 ° C warm water. After a pasteurization step, the mixture is cooled to 40 ° C. and trypsin (enzyme: substrate ratio of 1: 300) is added. The solution is incubated at 40 ° C for 2.5 hours. After inactivating the enzyme at 85-90 ° C for 10 minutes, a two-stage ultrafiltration takes place. 1st stage: ultrafiltration of the hydrolyzate solution with a cut-off limit of 50,000 daltons (Da); 2nd stage: Ultrafiltration of the permeate from the first stage with a cut-off limit of 1000-3000 Da.
  • the casoinsulins now enriched in the retentate are successively added to 290 kg of whey powder (13% protein), 67 kg of whey protein concentrate (76% protein), 154 kg of lactose, 49 kg of maltodextrins, 285 kg of a suitable lipid mixture and the amounts recommended for baby foods Mineral substances, trace elements and vitamins added. After all components have been completely dissolved, the solution is homogenized, pasteurized and evaporated to a dry matter content of 35-45%. The last step is spray drying.
  • Soy and wheat proteins are mixed in a ratio of 60 to 40. Then this mixture is dissolved in a protein concentration of 6-10% in 45 ° C warm water and the solution pasteurized. After the solution has cooled to 40 ° C., the pH is adjusted to 7.0 with dilute sodium hydroxide solution and a mixture of trypsin and chymotrypsin (1: 1) with an enzyme: substrate ratio of 1: 150 is added, and the solution is 150 minutes at 40 ° C incubated. The pH is checked at intervals of approx. 20 min and, if necessary, reset to 7.0. After the hydrolysis has ended, the solution for inactivating the enzymes is heated to 85-90 ° C. for 10 minutes.
  • the insulin-mimetic peptides are enriched or isolated in the form of zinc complexes by means of ultrafiltration (see Examples 7 and 8) and in the sense of the invention as a mixture together with other substances or as isolated substances in e.g. Capsule or sachet form used.
  • glycomacropeptide hydrolyzate 100 kg glycomacropeptide (isolated from bovine sweet whey proteins) consisting of 75-100% GMP and 0-25% whey proteins are dissolved in water at 60 ° C (5-15% protein solution). After a pasteurization step, the batch is cooled to 40 ° C. and trypsin is added in an enzyme: substrate ratio of 1: 150. The mixture is incubated at 40 ° C for at least 2 hours. After concentration of the insulin-mimetic peptides with affinity ultrafiltration or after complexing with zinc salts (Examples 7 and 8), these are dried (spray or freeze-dried) and can thus be used in sachet, tablet or capsule form.
  • GMP glycomacropeptide
  • whey protein concentrate (76% protein) 60 kg are dissolved in water at 55 ° C. After a pasteurization step, the mixture is cooled to 40 ° C. and trypsin is added in an enzyme: substrate ratio of 1: 250. The mixture is incubated at 40 ° C. for 2.5 hours. After a first ultrafiltration of the hydrolyzate solution at a cut-off limit of 50,000 Da, the permeate is concentrated in a second step at a cut-off limit of 1000-3000 Da. The insulin-mimetic peptides contained in the retentate are then isolated using affinity chromatography in a batch process. The insulin-mimetic peptides are then added to a 10% casein solution in a protein ratio of 1: 2 to 1:20.
  • the remaining ingredients such as whey powder or whey protein concentrate, lactose, lipids, vitamins, minerals and are mixed in the amounts recommended for baby foods. After all components have been completely dissolved, the mixture is homogenized, pasteurized and to a dry matter content of 35-45% evaporated. The last step is spray drying according to Example 1.
  • the batches are transferred into a solution of 0.15 mol / l NaCl and 1 mmol / l imidazole-HCl buffer with controlled pH 7.0 and adjusted to peptide concentrations of 2-5 mmol / l.
  • dephosphorylated cleavage products such as, for example, human and dephosphorylated bovine caseins or casopeptides, preferably treated with phosphatase
  • an amount of 2-5 mmol / l CuCI2 equivalent to the peptide concentration is checked in a batch to isolate the substance components, under control of the pH Value (7.0) added.
  • the insoluble fraction of the zinc compounds of the components can be obtained from the dissolved fraction by centrifugation at 10,000xg as a white precipitate separately from the soluble or, respectively, solution fraction of the components. Washing with water or buffer completes the separation of soluble and insoluble fractions.
  • concentrations of the substances of both preparations of the components are determined by measuring the UV spectra in accordance with the Lambert-Beer law.
  • the dissolved substances can be obtained salt-free by ultrafiltration with water under the same general conditions and after lyophilization as a dry substance for further use.
  • the neutral to weakly acetic acid (pH 5.0) solution of the transition metal ion complexes obtained according to Example 7 are from
  • Transition metal ions freed by extraction with a freshly prepared solution of at least 100 mg / l dithizone in chloroform (green).
  • the reaction with transition metal ions Zn ++ or Cu ++ ions colors the solution red to brown-violet.
  • the aqueous (upper) phase is separated and the extractions (countercurrent distribution cycles) are repeated (about 5 times) until the reagent chloroform phase remains green, i.e. is free of transition metal ions.
  • the aqueous phase can be concentrated in a conventional manner and purified (to remove traces of the reagents and to separate components). The substances of the invention can then be fed to the applications relating to them.

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Abstract

Bereitgestellt werden Exsuline bzw. insulinmimetische Aminosäuresequenzen mit einem Molekulargewicht von bis zu 55 000 Dalton und mit 1 bis 50 Grundeinheiten der folgenden allgemeinen Formel I [-] [L,V,I,A]-X1-X2-[L,V,I,A]-[D,E]-[N,Q,M]-X¿3?-[C,H]-X4 [-]wobei [L,V,I,A], [D,E], [N,Q,M], [C,H] und X?1 bis 4¿ peptidisch verknüpfte Aminosäuren bedeuten,[L,V,I,A] für Leucin (L), Valin (V), Isoleucin (I) oder Alanin (A) steht, [D,E] für Asparaginsäure (D) oder Glutaminsäure (E) steht, [N,Q,M] für Asparagin (N), Glutamin (Q) oder Methionin (M) steht, [C,H] für Cystein (C) oder Histidin (H) steht, die beiden Gruppen [L,V,I,A] in einer Grundeinheit gleich oder verschieden sein können, X?1, X2, X3 und X4¿ eine beliebige Aminosäure bedeuten und die vier Aminosäuren X 1 bis 4 in einer Grundeinheit gleich oder verschieden sein können. Die erfindungsgemässen Exsuline können in diätetischen und pharmazeutischen Mitteln eingesetzt werden, und zwar zur Mimese der Eigenschaften und Funktionen von Angehörigen der Familie der endogenen Insulin- und IGF Proteohormonen/-mediatoren sowie zur Vorbeugung gegen und zur Behandlung und Beeinflussung von hormonalen Zuständen und Störungen sowie von verschiedenen degenerativen Erkrankungen des Körpers von Säugern, einschliesslich verschiedener Formen von Hormon-Stoffwechselstörungen, -Resistenzen, -Mängel, Hyperinsulinämie, Diabetes mellitus und Autoimmun- sowie von neurodegenerativen und Folgeerkrankungen.

Description

Insulinmimetische Aminosäuresequenzen
BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft insulinmimetische Aminosäuresequenzen, die erfindungsgemäß auch als Exsuline bezeichnet werden, diese Exsuline enthaltende pharmazeutische und diätetische Mittel, die Verwendung dieser Exsuline als Insulinmimetika und ein Verfahren zur Herstellung dieser Exsuline.
Insulin bzw. IGFs sind schon lange bekannte körpereigene ("endogene") Protein-Hormone bzw. Protein-Mediatoren. Die zahlreichen Familienangehörigen der bekannten metallionenregulierten Insulinpro- teohormone / -mediatoren sind gekennzeichnet durch die verschiedensten Beziehungen hinsichtlich Struktur, Wirkung und den Mechanismen der biologischen Nachrichtenübertragung. Die bekannteste Wirkung der Insuline an sich ist die anabole Hormonwirkung zur Regulation des Glukosespiegels im Blut. Dagegen sind die dazu strukturhomologen IGFs hauptsächlich als hyperplastische Wachstumsfaktoren mit Proliferationswirkung auf verschiedene Zellen bekannt. Wiederum andererseits gehören u.a. auch die hypertrophen Wachstumsfaktoren für Nervenzellen ("Nerve Growth Factors", NGF) zu dieser Familie der insulinähnlichen Proteomediatoren u.a.m.
Insulin bzw. IGFs haben große praktische und sozio-ökonomische Bedeutung in einer Vielzahl von medizin- und biotechnischen Anwendungsgebieten sowie als körpereigene Wirkstoffe als Pharmaka zur Vorbeugung gegen und Behandlung von vielen degenerativen Erkrankungen (beispielsweise verschiedene Formen des Diabetes mellitus und Folgeerkrankungen). Sie werden physiologisch als solche auch endogen nach ihrer Synthese aus Muttermolekülen hauptsächlich in fertiger, funktionell eigenständiger Form in bestimmten Zellen endogen gespeichert und so in biologische Flüssigkeiten endogen sezerniert, von wo aus sie endogen ihre biologische Aktivität entfalten können (endokrine bzw. parakrine und autokrine interzelluläre Signalübertragung). Stellvertretend für die außerordentlich vielseitigen und vielfachen Aspekte der qualitativen und quantitativen Testsysteme und Messmethoden sowie der Bedeutung von Insulin und der Familie der insulinverwandeten Proteohormone / -mediatoren kann z.B. die folgende Auswahl an Literatur nähere Einsichten geben: Raizada, M.K., & LeRoith, D. (eds.): The Role of Insulin-Like Growth Factors in the Nervous System, Ann. New York Acad. Sei. 692, 1 -334 (1993); Flier, J.S.: Big Deal About Little Insulin, Nature Med. 5, 614-615 (1999).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Verbindungen bereitzustellen, die mimetische Eigenschafts- und Funktionsverwandtschaften und -Beziehungen zu Insulin und den Angehörigen der Familie der insulinähnlichen Wachstumsfaktoren besitzen.
Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen handelt es sich um insulinmimetische Aminosäuresequenzen bzw. Stoffstrukturen, die erfindungsgemäß auch als Exsuline bezeichnet werden. Die erfindungsgemäßen Exsuline besitzen eine Molekulargewicht von bis zu 55 000 Dalton und weisen 1 bis 50 Grundeinheiten der folgenden allgemeinen Formel I auf:
[-] [L,V,I,A]-X1-X2-[ ,V,I,AHD,E]-[N,Q,M]-X3-[C,H]-X4 [-] (I)
wobei
[L,V, I,A], [D,E], [N,Q,M], [C,H] und X1 bis peptidisch verknüpfte Aminosäuren bedeuten, [L,V,I,A] für Leucin (L), Valin (V), Isoleucin (I) oder Alanin (A) steht [D,E] für Asparaginsaure (D) oder Glutaminsäure (E) steht, [N,Q,M] für Asparagin (N), Glutamin (Q) oder Methionin (M) steht, [C,H] für Cystein (C) oder Histidin (H) steht, die beiden Gruppen [L,V,I,A] in einer Grundeinheit gleich oder verschieden sein können,
X1 , X2, X3 und X4 eine beliebige Aminosäure bedeuten und die vier Aminosäuren X 1 bιs 4 in einer Grundeinheit gleich oder verschieden sein können, die Grundeinheit der allgemeinen Formel (I) mittelständig oder endständig sein kann, bei einer endständigen Grundeinheit nur einer der Reste [-] vorhanden ist, sofern mehrere Grundeinheiten der allgemeinen Formel (I) in einem
Molekül vorhanden sind, diese Grundeinheiten gleich oder verschieden sein können, und die Reste [-], sofern vorhanden, jeweils für eine beliebige, peptidisch mit
[L,V,I,A] oder X4 verknüpfte Aminosäure oder für eine aus mehreren beliebigen Aminosäuren aufgebaute Aminosäuresequenz, die peptidisch mit [L,V,I,A] oder X4 verknüpft ist, stehen, und
[-], falls mehrere Grundeinheiten der allgemeinen Formel (I) vorhanden sind, für eine indirekte Verknüpfung aus einer beliebigen Aminosäure oder einer oben beschriebenen Aminosäuresequenz oder für eine direkte
Verknüpfung von zwei benachbarten Grundeinheiten stehen. Es können ferner davon Stoffstrukturen mit Insertionen, Deletionen und konservativen Austauschen von Aminosäuren vorkommen.
Erfindungsgemäß umfasst sind auch die phosphorylierten, acetylierten, farnesylierten, oxidierten, mit Kohlenhydraten und/oder Lipide konjugierten und/oder an einen festen oder flüssigen Träger immobilisierten Derivate dieser Exsuline.
Die erfindungsgemäßen Exsuline weisen in der Grundeinheit somit 4 Aminosäuren X auf, die beliebiger Natur sein können. Hinsichtlich dieser Aminosäuren X 1 bιs 4 bestehen somit keine besonderen Beschränkungen. Jede beliebige Aminosäure kann vorhanden sein.
Die Grundeinheit der erfindungsgemäßen Exsuline weist ferner 5 Aminosäuregruppen auf, die in der allgemeinen Formel I in eckige Klammern gesetzt sind und die nur bestimmte Bedeutungen besitzen können. So können beispielsweise die Aminosäuregruppen [L,V,I,A] nur für Leucin (L), Valin (V), Isoleucin (I) oder Alanin (A) stehen. In analoger Weise können die Aminosäuregruppen [D,E], [N,Q,M] und [C,H] die oben angegebenen Bedeutungen besitzen.
Im Rahmen der vorliegenden Beschreibung werden übrigens die Aminosäuren gemäß der internationalen Nomenklatur nach dem Stand der Technik im Ein-Buchstaben-Alphabet dargestellt. X steht für eine frei wählbare Aminosäure oder Derivatisierung.
Durch die Schreibweise der oben genannten Aminosäuregruppen in [Klammern] soll zum Ausdruck gebracht werden, dass es sich hier um sogenannte erlaubte konservative Austausche oder Derivatisierung von Strukturbestandteilen handelt. Mit anderen Worten, Valin stellt einen konservativen Austausch von beispielsweise Leucin, Isoleucin oder Alanin dar usw. Gleiches gilt analog für die anderen Aminosäuren.
Durch die in Klammern an den beiden Enden der Grundeinheit der allgemeinen Formel (I) dargestellten Bindestriche [-] wird zum Ausdruck gebracht, dass die Grundeinheit der allgemeinen Formel (I) auch Teil eines größeren Moleküls sein kann. Die Bindestriche [-] zählen somit an sich nicht zur Grundeinheit der allgemeinen Formel (I), sondern stehen für andere Aminosäurereste und/oder Verknüpfungen, worauf nachstehend noch näher eingegangen wird.
Erfindungsgemäß können somit 1 bis 50 Grundeinheiten bzw. Grundstrukturen in den erfindungsgemäßen Exsulinen vorhanden sein. Mit der Bereichsangabe 1 bis 50 werden alle zwischen den Bereichsgrenzen liegenden ganzzahligen Werte umfasst. Um den Anforderungen an eine ausreichende Offenbarung gerecht zu werden, bedeutet dies, dass die erfindungsgemäßen Exsuline 1 ,2,3,4,5,6,7,8,9, 10,1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,20,21 ,22,23,24,25,26,27, 28,29,30,31 ,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41 ,42,43,44,45,46,47,48,49 und 50 Grundeinheiten aufweisen können. Sollten zwei oder mehr Grundeinheiten vorhanden sein, dann können diese gleich oder verschieden sein. Zudem können die Grundeinheiten mittelständig oder endständig sein. Bei einer endständigen Grundeinheit bedeutet dies, dass einer der mit [-] angegebenen Reste bzw. Gruppen nicht vorhanden ist. Der andere Rest [-] bedeutet dann eine beliebige andere Aminosäuresequenz, die auch eine oder mehrere Grundeinheit(en) der allgemeinen Formel (I) aufweisen kann. Handelt es sich bei der Grundeinheit um eine mittelständige Grundeinheit, dann stehen beide Reste bzw. Gruppen [-] für eine beliebige Aminosäure oder für beliebige Aminosäuresequenzen, die in der Kette jeweils auch eine oder mehrere Grundeinheiten aufweisen können. Im Falle von zwei benachbarten bzw. aufeinanderfolgenden Grundeinheiten stehen die beiden zueinander zeigenden Reste bzw. Gruppen [-] zusammen für die diese Grundeinheiten verbindende Aminosäuresequenz, die aus beliebigen peptidisch verknüpften Aminosäuren aufgebaut ist. Dabei handelt es sich somit um eine indirekte Verknüpfung der benachbarten Grundeinheiten. Allerdings können die zueinander zeigenden Reste bzw. Gruppen [-] von zwei benachbarten Grundeinheiten auch eine direkte peptidische Verknüpfung und somit eine direkte Aufeinanderfolge von zwei Grundeinheiten bedeuten.
Auch die Reihenfolge der Aminosäuregruppen [L,V,I,A], [D,E], [N,Q,M] und [C,H] sowie der Aminosäuren X1 , X2, X3 und X4 können in der Grundeinheit der allgemeinen Formel I beliebig sein. Mit anderen Worten, die Reihenfolge der genannten Aminosäuregruppen und Aminosäuren X1 bis X4 kann beliebig sein. Bevorzugt ist jedoch die aus der Formel (I) ersichtliche Reihenfolge.
Bei der nachfolgenden Beschreibung konkreter Exsuline werden die die Grundeinheit ausmachenden Aminosäuren im übrigen fett geschrieben sowie unterstrichen.
Die erfindungsgemäßen Exsuline können aus Organismen, Geweben, Zellen und biologischen Flüssigkeiten, deren Kulturen und Kulturüberstandslösungen, vorzugsweise aus Lebens- und Futtermitteln, Diät- und Genussmitteln sowie Ersatz- und Zusatzstoffen, insbesondere aus Milch und/oder Proteinen, beispielsweise Caseinen, gewonnen werden. Werden beispielsweise Caseine als Ausgangsstoffe eingesetzt, dann werden die erfindungsgemäßen Exsuline im Rahmen der vorliegenden Unterlagen auch als Casoinsuline bezeichnet.
Die erfindungsgemäßen Exsuline sind somit in den Ausgangsstoffen als funktionell eigenständige Stoffstrukturen nicht vorhanden, sondern sie kommen funktioneil und strukturell nur kryptisch vor, d.h. sie werden erst in nachträglichen Reaktionen und Prozessen gebildet und/oder aus eigenständigen Muttermolekülen abgeleitet, die keine
Funktionseigenschaften und Funktionsverwandtschaften im erfindungsgemäßen Sinne haben.
Die erfindungsgemäßen Exsuline sind daher vorzugsweise aus den beschriebenen Ausgangsstoffen erhältlich.
Die erfindungsgemäßen Exsuline verfügen über Metallo-regulierte Eigenschaften und Interaktionen mit anderen Stoffen, die insbesondere durch Übergangsmetallionen, beispielsweise Cu- und Zn-Ionen bewirkt werden.
Die erfindungsgemäßen Exsuline besitzen mimetische Eigenschafts- und Funktionsverwandtschaften und -beziehungen zu Insulinen und Angehörigen der Familie der Insulin ähnlichen Wachstumsfaktoren ("Insulin-like Growth Factors, IGF"). Sie sind aber strukturell verschieden von der Familie der endogenen Insulin- und Insulinverwandten (IGF) Proteohormonen und Proteomediatoren.
Es wird angenommen, dass die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Exsuline durch die oben beschriebene Grundeinheit der allgemeinen Formel (I) geprägt wird, ohne jedoch an diese Erklärung gebunden zu sein.
Bevorzugte erfindungsgemäße Exsuline sind dabei die folgenden: LTDLENLHLPLPLLQPSMQQVPQPIPQTLALPPQPLWSVPEPK und
YPVQPFTESQSLTLTDVENLHLPPLLLQSWMHQPHQPLPPTVMFPPQSVL
SLSQSK
Erfindungsgemäß umfasst sind auch die Insertionen, Deletionen und/oder konservativen Austauchen von Aminosäuren erhältlichen Exsuline bzw. Stoffstrukturen.
Die erfindungsgemäßen Exsuline besitzen folgende Wirkungen und Eigenschaften:
A) Selektive Wirkungen:
• Mimetische Eigenschafts- und Funktionsverwandtschaften und -beziehungen zu Insulin und zu Angehörigen der Familie der insulinähnlichen Wachstumsfaktoren ("Insulin-like Growth Factors, IGF").
• Insulinmimetische Wirkungen durch Interaktion mit verschiedenen Zellen, Zellsystemen und Organen von Vertebraten, einschließlich der Säuger und Menschen.
• Insulinmimetische Wirkungen durch selektive Interaktion mit insulinproduzierenden (Langerhansschen Insel-) ß-Zellen.
• Insulinmimetische Wirkungen durch selektive Interaktion und Komplexbildung in vivo und in vitro mit Antikörper gegen Insuline von Vertebraten, einschließlich der Säuger und Menschen.
• LD50 nicht bestimmbar, da keine lethalen Wirkungen.
• Keine Endotoxin-gleichen oder ähnlichen Wirkungen.
• Keine Lysewirkungen auf Erythrozyten und Leukozyten in vitro.
B) Physikalisch-chemische und chemische Eigenschaften: • Typische Eigenschaften metalloregulierter Stoffe, insbesondere durch Übergangsmetallionen, beispielsweise durch Cu- oder Zn-ionen.
• Sie interaktieren mit anderen metalloregulierten Stoffen unter Bildung von Homo- und / oder Heterokomplexen.
• Sie können, müssen aber nicht Protein- bzw. Peptideigenschaften haben.
• Sie haben hydrophobe, ionische und metallionenkomplexbindende funktionelle Gruppen.
• Sie sind löslich in wassrigen Medien einschließlich 20% Äthanol bei einem pH-Wert von mindestens 4,0 bis 10,0.
• Sie sind löslich in einer wassrigen Ammoniumsulfatlösung bei einer Sättigung von 20% (0,8 Mol/I) bei einem pH-Wert von mindestens 4,0 bis 10,0.
• Sie sind unlöslich in Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff und ähnlichen apolaren, nichtwässrigen Medien.
• Sie verhalten sich hydrodynamisch anormal, so dass das hydrodynamische Äquivalent der Molekularmasse kleiner erscheint als die wirkliche Molekularmasse, soweit bestimmbar durch gelchromatographische, elektrophoretische und Membranpermeationsmethoden.
• Sie adsorbieren reversibel in Struktur und Bioaktivität an Anionenaustauschern, hydrophoben Gelen, Calciumphosphatgel und Hydroxylapatit und können nativ der Volumenverteilungschromatographie unterworfen werden.
Aufgrund ihrer Eigenschaften können die erfindungsgemäßen Exsuline zur Mimese der Eigenschaften und Funktionen von Angehörigen der Familie der endogenen Insulin- und IGF-Proteohormone/-Mediatoren (wie oben dargelegt) und auch als Ersatzmittel für diese verwendet werden. Gegenstand der Erfindung sind auch pharmazeutische und diätetische Mittel, die mindestens ein erfindungsgemäßes Exsulin enthalten. Diese Mittel können insbesondere zur Vorbeugung gegen sowie zur spezifischen Behandlung bzw. Beeinflussung von hormonalen Zuständen und Störungen sowie von verschiedenen degenerativen Erkrankungen, beispielsweise von verschiedenen Formen von Hormon- Stoffwechselstörungen, -Resistenzen, -Mängel, Hyperinsulinämie, Diabetes mellitus und Autoimmun- sowie neurodegenerative Erkrankungen und deren Folgeerkrankungen eingesetzt werden.
Eine weitere Verwendungsmöglichkeit ist die Herstellung von Hemm- und Regulatorstoffen der Wirkungen der Angehörigen der Familie der endogenen Insulin- und IGF-Proteohormone/-mediatoren sowie von molekularbiologischen Äquivalenzstrukturen und von Antikörpern.
Die erfindungsgemäßen Exsuline können einzeln oder als Gemisch in Form üblicher Arzneimittel und nach üblichen Sicherheits-, Prüfungs- und Verordnungsrichtlinien systemisch oder lokal, parenteral, intravenös, bei Säugern in einer Menge von 1 fg/kg bis 10 g/kg gegeben werden. Diese Arzneimittel können zur Erfüllung der Aufgaben auch mindestens ein anti- Exsulin-Immunoglobulin und / oder molekularbiologische Äquivalenz- Strukturen enthalten. In entsprechender Weise können die Stoffe der Erfindung als diätetische Mittel oder Zusatzstoffe angewendet werden.
Die erfindungsgemäßen Arzneimittel können neben mindestens einem erfindungsgemäßen Exsulin auch mindestens einen übrigen Träger-, Hilfs- oder Zusatzstoff enthalten. Zudem kann ein weiterer oder können mehrere weitere Wirkstoff(e) zugegen sein.
Die erfindungsgemäßen Exsuline können auch diätetischen Mitteln einverleibt werden. Dazu zählen Lebensmittel, Diätmittel, Nahrungsergänzungsmittel und Genussmittel sowie Ersatz- und Zusatzstoffe. Die erfindungsgemäßen Exsuline können dadurch hergestellt bzw. erhalten/gewonnen werden, dass man das Ganze oder Teile von Organismen, Geweben, Zellen und biologischen Flüssigkeiten, deren Kulturen und Kulturüberstandslösungen, vorzugsweise von Lebens- und Futtermitteln, Diät- und Genussmitteln sowie Ersatz- und Zusatzstoffen, insbesondere aus Milch und / oder Milchproteinen, beispielsweise Caseinen, mit physikalischen, chemischen und / oder biologischen Verfahren in vivo und / oder in vitro so behandelt, dass Teile davon entfernt, hinzufügt, selektiert und / oder modifiziert werden, beispielsweise um muttermilchähnliche Eigenschaften der Mittel zu erhalten, bzw. um solche Eigenschaften daraus zu entfernen. Dazu kann man lebens- und futtermitteltechnische, medizintechnische, molekularbiotechnische, membrantechnische, pharmatechnische, zellbiologische, zellkulturtechnische, immunbiotechnische, enzymtechnische, chromatographische sowie bekannte konventionelle Verfahren allein oder in Kombination verwenden, die auf Handhabbarkeit, Mittelqualität, Quantität, Ausbeute, Wirtschaftlichkeit und andere übliche Normen und Standards optimiert sein können. Bei Bedarf und Zulässigkeit (beispielsweise unter Berücksichtung ethischer Grundsätze und / oder der Lebensmittel-, Arzneimittel- und anderer Gesetze und Verordnungen) kann man zur Herstellung und Gewinnung der Stoffe und Mittel dabei von bekannten Strukturen von Lebens-, Futter-, Diät- und Genussmitteln sowie Ersatz- und Zusatzstoffen ebenso ausgehen und diese einsetzen wie auch von chemisch und / oder molekularbiologisch synthetisierten Sequenzen von Molekülkomponenten und/ oder von Teilen und homologen Sequenzen davon.
Dabei können insbesondere Tiere, Pflanzen, Pilze, Samen, Mikroorganismen, Hybridome, genbiologische, gentherapeutische und transgene Rekombinanten davon sowie daraus abgeleitete Organismen, Organe, Gewebe, Zellen, biologische Flüssigkeiten, Exsudate, Eier, Blut, Lymphe, Milch, Weizen, Hafer, Bohnen, Algen als Ganzes oder Teile davon allein oder in Kombination in ihren eigenen Phasen als solche, deren Extrakte oder solche an Grenzflächen immobilisiert einzeln, vermischt, mit und ohne Zusätze als solche, homogenisiert allein oder in Kombination behandelt und in Anwendung gebracht werden.
Prinzipiell kann man die Veränderungen der Ausgangsstoffe, die zu den erfindungsgemäßen Exsulinen mit den beschrieben Eigenschaften führen, durch verschiedene Vorgänge des Stoff- und Energieeintrages hervorbringen. Beispielsweise kann zur chemischen Aufspaltung von Muttermolekülen bzw. Abspaltung von funktioneilen Gruppen der Energieeintrag durch Erhitzen und / oder pH-Veränderungen erfolgen. Vorzugsweise verwendet man dazu aber heute enzymtechnische Verfahren. Insbesondere kann man als Biokatalysator Hydrolasen (E.C. 3.-.-.-), beispielsweise Proteasen (E.C. 3.1.4.-) und Phosphatasen (E.C.3.1.3.-) allein oder in Kombination mit anderen Mitteln verwenden. Besonders vorteilhaft hat sich z.B. gezeigt, wenn man als Proteasen Trypsin (E.C. 3.4.21.4) und / oder Chymptrypsin (E.C. 3.4.21.1 ) jeweils alleine oder in Kombination und als Phosphatase eine saure Phosphatase (E.C.3.1.3.2) verwendet und dabei in besonders bevorzugter Weise letztgenanntes Enzym aus Kartoffeln verwendet.
Auch pflanzliche und pilzliche Organismen, Teile, Derivate und daraus hergestellte lebens- und futtermitteltechnische Produkte können durch Stoff- bzw. Energieeintrag so verändert werden, dass erfindungsgemäße Exsuline gebildet werden. Pflanzliche phosphathaltige Stoffe, pflanzliche hochphosphorylierte Kohlenhydrate und phosphathaltige Proteine können auch vorzugsweise mit Phytasen (E.C. 3.1.3.-, beispielsweise Inositol- hexakisphosphat-phosphohydrolasen, E.C. 3.1.3.8) allein oder in Kombination mit Phosphatasen behandelt werden. In diesen Fällen werden zweckmäßigerweise die gewonnenen Produkte insbesondere so weiter behandelt, dass das dadurch darin gebildete freie Phosphat durch geeignete Verfahren vor Verwendung der Produkte daraus entfernt wird.
Nach einem bevorzugten Verfahren zur Herstellung und Gewinnung der erfindungsgemäßen Exsuline werden Milch, Teile und Derivate davon sowie daraus hergestellte lebens- und futtermitteltechnische Produkte sowie Diät- oder Genussmittel, Ersatz- und Zusatzstoffe enzymtechnisch so verändert, dass die erfindungsgemäßen Exsuline gebildet werden. In einem besonders bevorzugten Verfahren verwendet man als Milch Kuhmilch bzw. das Casein und / oder seine Spaltprodukte (Casopepti- de) als Teil der Kuhmilch. Stoff-Komponenten in Form der Phosphoproteine und ihrer phosphorylierten Spaltprodukte („Phosphopeptide"), z.B. diejenigen des bovinen Casein und seiner Spaltpeptide, kann man dazu auch noch zur Dephosphorylierung vorzugsweise mit der erwähnten, besonders bevorzugten Phosphataseform behandeln. Beispielsweise kann man das Casein der Kuhmilch bzw. seine proteolytischen Spaltprodukte in neutralisiertem Wasser aufnehmen und in zwei Ansatzportionen auftrennen; davon wird die eine zur Dephosphorylierung der erwähnten Behandlung, insbesondere mit der besonders bevorzugten Phosphataseform, unterzogen. Das Präparat, das der Dephosphorylierungsreaktion unterzogen worden war, enthält die erfindungsgemäßen Stoffe von Phosphatgruppen befreit bzw. darin verarmt; das andere, dahingehend nicht behandelte Präparat, enthält die erfindungsgemäßen Exsuline als natürlicherweise phosphorylierte Verbindungen.
Nach einem insbesondere bevorzugten Verfahren werden Lebens-, Futter-, Diät- oder Genussmittel, Ersatz- und Zusatzstoffe mit einem epidemiologisch begründeten Risiko der Entwicklung und Entstehung von degenerativen Erkrankungen im Zusammenhang mit Ernährungsfaktoren,
Ernährungsformen und Diäten so verändert, dass man die erfindungsgemäßen Exsuline in kryptischer oder eigenständiger Form, d.h. vor oder nach Bildung bzw. Herstellung der erfindungsgemäßen
Stoffe, daraus entfernt. Prinzipiell kann man diese Veränderungen oder die Selektion der Mittel, die zu den erwünschten Eigenschaften führen, durch verschiedene Vorgänge des Stoff- und Energieeintrages hervorbringen. Beispielsweise kann dazu der Energieeintrag durch Erhitzen und / oder pH-Veränderungen erfolgen, gefolgt von chemischen, physikalisch-chemischen und / oder physikalischen bzw. mechanischen
Abtrennverfahren. Vorzugsweise verwendet man dazu aber Adsorptions- und Komplexierungsverfahren im Sinne der bereits beschriebenen Prozesse.
Die einzelnen erfindungsgemäßen Exsuline können auch als solche in isolierter Form hergestellt werden. Dazu werden die gebildeten Exsuline (Casoinsuline) mit üblichen Anreicherungs-, Reinigungs- und Isolierungsverfahren ("Downstream Prozessierung") mit physikalischen, physikalisch- chemischen, chemischen und / oder (auch gen- und / oder immun-) biologischen Methoden nach dem Stand der Technik von anderen Stoffen abgetrennt und isoliert und / oder aufkonzentriert und / oder in einen flüssigen (gelösten) oder Feststoffzustand überführt. Vorzugsweise werden die Exsulin- (Casoinsulin-) enthaltenden Lösungen auf einen Trockenmassegehalt von 35-40% nach dem Stand der Technik konzentriert.
Diese Downstream-Prozessierungen können gestaltet sein als einstufige oder mehrstufige Batch- (Eintopf-) und / oder Säulenverfahren allein oder kombiniert mit anderen Verfahren. Dazu kann man zunächst übliche Verfahren der präparativen Darstellung von biologischen Stoffen verwenden, vorzugsweise chromatographische, elektrophoretische, membrantechnische und Sedimentationsverfahren, beispielsweise Ausfällungsverfahren, sowie Verfahren der Phasenextraktion. Beispielsweise können Verfahren der Flüssigphasenextraktion in Form der Gegenstromverteilung, insbesondere in Form der nach dem Stand der Technik üblichen Dünnschichtgegenstromverteilung, vorteilhaft eingesetzt werden. Als chromatographische Verfahren werden insbesondere Ionenaustauscher-, Gel-, Zonenpräzipitations-, Affinitäts-, hydrophobe Chromatographie und / oder -Filtration in Anwendung gebracht. Bei letzteren werden immunbiologische, hybridisierende, komplexierende oder metallionenaffine und andere affine Verbindungen gebunden an Feststoff-, Flüssig- und / oder Gasphasen verwendet. Feststoffphasen können beispielsweise Membranen, Gele, Hydroxylapatit, Keramik, Glaspartikel, Verbundwerkstoffe und / oder Kombinationen davon sein. Sie können auch ungebunden verwendet werden, beispielsweise in sogenannten Hybrid- und / oder Hohlfasermodulverfahren. Die Konzentration erfolgt nach üblichen Methoden, beispielsweise durch Ausfällung, Gegenstromverteilung, Komplexbildung, Membranpermea- tionsverfahren, insbesondere Dialyse und / oder Ultrafiltration an geeigneten Membranen, Eindampfen und / oder Trocknung, vorzugsweise Sprühtrocknung, beispielsweise in Form von Lyophilisierung.
Zur Herstellung der isolierten erfindungsgemäßen Exsuline werden beide Ansätze dann in ein die Exsuline nicht schädigendes Medium überführt; vorzugsweise wird als solches Medium eine wässrige Flüssigkeit mit physiologischen, neutralen Bedingungen und Komponenten- Konzentrationen im Bereich von 1 fMol/l bis 5 Mol/I überführt; ein spezielles Beispiel dazu ist eine physiologisches, wässriges Medium von 0.15 mol/l NaCI, kontrolliertem pH-Bereich 6,8 - 7,4 und einem Puffer von 1 mMol/l Imidazol-HCI, worin alle Reaktionspartner auf Reaktions- äquivalenz im Konzentrationsbereich von 1 bis 20 mMol/l eingestellt sind. In dem einen Ansatz (enthaltend z.B. dephosphorylierte Spaltprodukte der bovinen Caseine) werden zur Isolierung der erfindungsgemäßen Exsuline Kupferionen hinzugefügt. In einem anderen Ansatz (enthaltend z.B. phosphorylierte Spaltprodukte der bovinen Caseine) werden zur Isolierung der erfindungsgemäßen Exsuline Zinkionen hinzugefügt. Nach einer Reaktionszeit von 0,01 bis 100 Stunden bei 1 -60°C, vorzugsweise 0, 1 bis 10 Stunden bei 10-40°C, beispielweise mindestens einer halben Stunde und normalen Umgebungsbedingungen, werden beide Ansätze getrennt aufgearbeitet.
Bei Verwendung von Übergangsmetallionen, beispielsweise Cu- und / oder Zn-Ionen, enthält das Präparat mit den erfindungsgemäßen Exsulinen diese als Kupfer- bzw. Zinkkomplexe. Die Kupferkomplexe sind in konzentrierter Form und bei normaler Temperatur in bläulicher Farbe erkennbar. Die farblosen Zinkkomplexe liegen teilweise in gelöster farbloser und unlöslicher, weißer Form im Präparat vor und befinden sich miteinander im Löslichkeitsproduktgleichgewicht. Die unlösliche Form kann nach Zentrifugation unter üblichen Bedingungen (10'000xg) als Niederschlag von der löslichen Form abgetrennt werden und nach einem Waschvorgang mit Wasser oder Puffer separat verwendet werden. Von beiden Präparaten der metallionenkomplexierten erfindungsgemäßen Stoffe können verschiedene UV-Spektren und damit auch eine Konzentrationsmessung, auf Trockengewichtsbasis in absoluter Konzentration mittels der Extinktionskoeffizienten nach dem Lambert- Beerschen Gesetz, erhalten werden.
Die Aufarbeitung der Ansätze erfolgt vorzugsweise unter Anwendung von Membrantechnik zur Dialyse bzw. Ultrafiltration. Dazu werden Membranen verwendet, die durch eine sogenannte Ausschlussgrenze des hydrodynamischen Äquivalentes der Molekularmasse
(„Molekulargewicht") von 100 bis 30O00 Dalton geprägt und geprüft sind. Vorzugsweise werden in einem speziellen Beispiel Membranen verwendet, die eine solche Ausschlussgrenze von 500 Dalton haben.
Beispiele für solche Membranen, ihre Handhabung, Bearbeitung, Vorbereitung, Behandlung für Sterilarbeiten und Pyrogenfreiheit, sowie Gerätschaften dazu, u.a.m., kennt der Fachmann nach dem Stand der Technik aus der üblichen Literatur; siehe dazu: J.H. Wissler: Large scale and biotechniques for the production and isolation of leucocytic effector substances of regenerative tissue morphogenesis by culturing cells in serum-free, synthetic fluids: Design, preparation and use of a novel medium. Cox, P.H., Ed. Developments in Nuclear Medicine Series, Vol 7: Fueger, G.F., Ed. Blood Cells in Nuclear Medicine, Part 2: Migratory Blood Cells. Martinus Nijhoff Publishers, Boston, 1984, p. 393-471 . Nach einem besonders bevorzugten Verfahren wird die Ultrafiltration unter den erwähnten, besonders bevorzugten Bedingungen und dem dafür eingesetzten Puffer beispielsweise solange durchgeführt, bis ein Austausch des Mediums im Volumenverhältnis von mindestens 1 : 1000 (Ansatzvolumen : Ultrafiltrat) stattgefunden hat und damit alle nicht reagierenden Komponenten mit dem Ultrafiltrat entfernt wurden. Beide Ansätze werden getrennt gesammelt und können in üblicher Weise über eine Filtration an einer Membran von 0,01 - 5 μm, insbesondere beispielsweise 0,2 um Porenweite sterilisiert und bis zur weiteren Verwendung stabil gehalten, beispielsweise eingefroren werden.
Zwischen den vorstehend dargestellten Herstellungs- und Isolierungsverfahren können die erhaltenen Lösungen der bioaktiven Stoffe der Erfindung zu nachfolgenden Prozessen bzw. Abtrennung anderer Stoffe, beispielsweise auch Salzen, konzentriert werden. Diese Konzentrierung (Abtrennung eines Grossteiles des Lösungsmediums) kann auf verschiedene Weise erfolgen. Beispielsweise können dazu die Stoffe der Erfindung bearbeitet werden durch Lyophilisieren und / oder Ultrafiltration oder Entwässerungsdialyse an einer der beschriebenen Membranen, insbesondere solcher mit einer Ausschlussgrenze von 500 Dalton.
Für die therapeutische und diätetische Verwendung werden die Exsuline (Casoinsuline) vorzugsweise mit mindestens einem der genannten Schritte isoliert. Bevorzugt ist eine Ausführungsform, die durch eine Kombination von mindestens zwei der genannten Schritte die Stoffe der Erfindung vom Hauptteil von Fremdstoffen befreit.
Die erfindungsgemäßen Exsuline können ferner auch nach den derzeit bekannten Methoden der chemischen Synthetisierung von Peptiden synthetisch bzw. "künstlich" hergestellt werden.
Die Temperatur und pH-Bedingungen sind bei der Durchführung der Gewinnungs- Herstellungs-, Verwendungs- und Lagerungsschritte nicht besonders kritisch. Wenn die Erhaltung der nativen, bioaktiven Form der erfindungsgemäßen Stoffe/Exsuline beabsichtigt ist, empfiehlt sich die Einhaltung einer Temperatur im Bereich von etwa -80 bis 70°C, insbesondere 0 bis 40°C, vorzugsweise 4-20 °C. Ferner müssen die Trenn- und Reinigungsschritte unter im wesentlichen physiologischen pH- und Salzbedingungen durchgeführt werden. Ein wesentlicher Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass die Einhaltung dieser Bedingungen erstmals leicht möglich ist. Bei Bedarf kann die Substanzlösung zur Verhinderung von Oxidationseffekten mit Antioxidantien versetzt werden, beispielsweise angepasst an die oder je nach Zustandsformen und Verwendungszwecken der Stoffe der Erfindung mit Inosenolen, L-Ascorbinsäure (Vitamin C), L-Cystein. Bei Lagerung und Verwendung einer nicht eingefrorenen Lösung der erfindungsgemäßen Exsuline zwischen 0 bis 50°C kann es vorteilhaft sein, der Lösung Zusätze zu zufügen, die die erfindungsgemäßen Exsuline nicht schädigen und auch in Lösung halten, sowie solche die das Wachstum möglicher mikrobieller Kontaminationen behindern oder verhindern. Beispiele für solche Zusätze sind 0.5 bis 3 mol/l NaCI, einsalzendes Ammoniumsulfat, NaN3, organische Lösungsmittel (beispielsweise Äthanolzusätze), Antibiotika.
Die erfindungsgemäßen Exsuline (Casoinsuline) können in einem diese Stoffe nicht schädigendem Medium gehalten, aufbewahrt und verwendet werden. In bevorzugter Weise wird als solches Medium Wasser oder eine wässrige Flüssigkeit, auch solche komplementiert mit Salzen und / oder Zellkulturmedien verwendet, wobei ein kontrollierter pH-Bereich von 3-1 1 , insbesondere 5-9 eingestellt wird. Ein spezielles Beispiel dazu mit physiologischen, neutralen Bedingungen ist eine Salzlösung von 0.15 mol/l NaCI und einem Puffer von 1 mMol/l, beispielsweise Phosphat oder Imidazol, pH 6,8 - 7,4. Die erfindungsgemäßen Exsuline können nach üblicher Sterilisation, beispielsweise Methoden der Filtration and Filtern mit einer Porenweite von 0,2 um nativ und bioaktiv bei Raumtemperatur, vorzugsweise eingefroren (bei <-25°C) aufbewahrt werden.
Wasser wird für alle Verfahrensschritte in der ASTM-1 Qualität nach dem Stand der Technik verwendet; vgl. ASTM D-1 193-70: Standard Specification for Reagent Water, Annual Book of ASTM Standards, Easton Maryland, ASTM 1970. Es wurde darüber hinaus filtersterilisiert an tensidfreien Membranen mit 0,2 μm Porengröße und von möglichen Endotoxin-Kontaminationen durch Ultrafiltration an tensidfreien Membranen mit einer Ausschlussgrenze von 1 '000 Daltons befreit (steriles, pyrogenfreies Wasser der ASTM-1 -Qualität); vgl. dazu die oben angegebene Veröffentlichung von J.H. Wissler: Large scale and biotechniques for the production and isolation of leucocytic effector substances of regenerative tissue morphogenesis by culturing cells in serum-free, synthetic fluids: Design, preparation and use of a novel medium.
Die Erfindung wird im folgenden an Hand bevorzugte Ausführungsformen beschreibenden Beispielen näher erläutert.
BEISPIEL 1
Herstellung von insulinmimetischen Casopeptiden (Casoinsuline) als Supplement für Lebensmittel oder als Supplement in Kapsel- oder Sachetform:
Caseinat, gewonnen aus boviner Milch, wird in einer Konzentration von 10% in 60 °C warmem Wasser gelöst und die Lösung pasteurisiert. Nach Abkühlung der Lösung auf 40 °C wird der pH-Wert mit verdünnter Natronlauge auf 7.0 eingestellt. Es wird dann Trypsin hinzugefügt (Enzym : Substrat-Verhältnis von 1 :250) und die Lösung 120 Minuten bei 40 °C inkubiert. Anschließend wird die gleiche Menge Chymotrypsin hinzugefügt und die Lösung für weitere 30 min bei gleicher Temperatur inkubiert. Der pH-Wert wird zwischenzeitlich kontrolliert und gegebenenfalls wieder auf 7,0 eingestellt. Nach Beendigung der Hydrolyse wird die Lösung zur Inaktivierung der Enzyme für 10 Minuten bei 85-90°C gehalten. Die Casoinsuline werden mittels Affinitätsultrafiltration bzw.
Affinitätschromatographie oder nach Komplexierung mittels Zinkchlorid (2-5 mMol/l) isoliert (Beispiel 7 und 8) und anschließend getrocknet (Sprüh- oder Gefriertrocknung). In dieser Form können die Casoinsuline als Supplemente anderen Lebensmitteln zugesetzt oder in Kapsel- bzw. Sachetform verabreicht werden. BEISPIEL 2
Herstellung einer Trink- oder Sondennahrung für Patienten mit Diabetes Typ II [NIDDM] auf Basis eines Caseinhydrolysates:
120 kg Casein (90% Protein) werden in 60 °C warmen Wasser gelöst. Nach einem Pasteurisierungsschritt wird der Ansatz auf 40 °C abgekühlt und ein Gemisch bestehend aus den Proteasen Trypsin und Chymotrypsin im Verhältnis 1 : 1 hinzugefügt (Enzym:Substrat-Verhältnis von 1 :250). Der Ansatz wird 3 Stunden bei 40°C inkubiert. Danach werden noch 100 g bis 5 kg der in Beispiel 1 hergestellten Casoinsuline, 265 kg Kohlenhydrate (Fructose und Stärke) und 100 kg Fett (tierisch und pflanzlich) Minaralstoffe, Spurenelemente und Vitamine hinzugegeben. Nach dem vollständigen Lösen aller Bestandteile wird die Lösung homogenisiert und terminalsterilisiert.
BEISPIEL 3
Herstellung einer Säuglingsfolgenahrung mit tryptisch hydrolysiertem dephosphoryliertem Casein:
140 kg Casein, das mit saurer Phosphatase zu 60 % dephosphoryliert worden war (90% Protein), werden in 60 °C warmen Wasser gelöst. Nach einem Pasteurisierungsschritt wird der Ansatz auf 40°C abgekühlt und Trypsin (Enzym:Substrat-Verhältnis von 1 :300) zugegeben. Die Lösung wird für 2,5 Stunden bei 40°C inkubiert. Nach Inaktivierung des Enzyms bei 85-90°C für 10 Minuten erfolgt eine zweistufige Ultrafiltration. 1. Stufe: Ultrafiltration der Hydrolysatlösung mit einer Abtrenngrenze von 50 000 Dalton (Da); 2. Stufe: Ultrafiltration des Permeates aus der ersten Stufe mit einer Abtrenngrenze von 1000-3000 Da. Zu den nun im Retentat angereicherten Casoinsulinen werden nacheinander 290 kg Molkenpulver (13% Protein), 67 kg Molkenproteinkonzentrat (76% Protein), 154 kg Lactose, 49 kg Maltodextrine, 285 kg einer geeigneten Lipidmischung und die für Säuglingsnahrungen empfohlenen Mengen Minaralstoffe, Spurenelemente und Vitamine zugegeben. Nach dem vollständigen Lösen aller Bestandteile wird die Lösung homogenisiert, pasteurisiert und auf einen Trockenmassegehalt von 35-45% eingedampft. Als letzter Schritt erfolgt eine Sprühtrocknung.
BEISPIEL 4
Herstellung von insulinmimetischen Peptiden aus einer Mischung von Soja- und Weizenproteinen als Supplement für Lebensmittel oder als Supplement in Kapsel- oder Sachetform:
Soja- und Weizenproteine werden in einem Verhältnis von 60 zu 40 gemischt. Anschließend wird diese Mischung in einer Proteinkonzentration von 6-10% in 45 °C warmem Wasser gelöst und die Lösung pasteurisiert. Nach Abkühlung der Lösung auf 40 °C wird der pH- Wert mit verdünnter Natronlauge auf 7.0 eingestellt und eine Mischung von Trypsin und Chymotrypsin (1 : 1 ) mit einem Enzym:Substrat-Verhältnis von 1 : 150 hinzugegeben und die Lösung 150 min bei 40 °C inkubiert. Der pH-Wert wird in Abständen von ca. 20 min kontrolliert und gegebenenfalls wieder auf 7,0 eingestellt. Nach Beendigung der Hydrolyse wird die Lösung zur Inaktivierung der Enzyme für 10 Minuten auf 85-90°C erhitzt. Die insulinmimetischen Peptide werden in Form von Zinkkomplexen mittels Ultrafiltration angereichert bzw. isoliert (siehe Beispiel 7 und 8) und im Sinne der Erfindung als Mischung zusammen mit anderen Stoffen oder als isolierte Stoffe in z.B. Kapsel- oder Sachetform verwendet.
BEISPIEL 5
Herstellung eines Nahrungsergänzungsmittels zur therapeutischen Unterstützung von Patienten mit Diabetes Typ I auf Basis eines Glycomakropeptid(GMP)hydrolysates: 100 kg Glycomacropeptid (isoliert aus bovinen Süßmolkenproteinen) bestehend aus 75-100 % GMP und 0-25% Molkenproteinen werden in 60 °C warmen Wasser gelöst (5-15%ige Proteinlösung). Nach einem Pasteurisierungsschritt wird der Ansatz auf 40 °C abgekühlt und Trypsin in einem Enzym:Substrat-Verhältnis von 1 : 150 zugegeben. Der Ansatz wird mind. 2 Stunden bei 40°C inkubiert. Nach einer Aufkonzentrierung der insulinmimetischen Peptide mit der Affinitätsultrafiltration oder nach Komplexierung mit Zinksalzen (Beispiel 7 und 8) werden diese getrocknet (Sprüh- oder Gefriertrocknung) und können so in Sachet-, Tabletten oder Kapselform zur Anwendung kommen.
BEISPIEL 6
Herstellung einer Säuglingsfolgenahrung unter Verwendung von insulinmimetischen Peptiden, gewonnen aus bovinen Molkenproteinen:
60 kg Molkenproteinkonzentrat (76% Protein) werden in 55 °C warmen Wasser gelöst. Nach einem Pasteurisierungsschritt wird der Ansatz auf 40 °C abgekühlt und Trypsin in einem Enzym:Substrat-Verhältnis von 1 :250 zugegeben. Der Ansatz wird 2,5 Stunden bei 40°C inkubiert. Nach einer ersten Ultrafiltration der Hydrolysatlösung bei einer Abtrenngrenze von 50.000 Da wird das Permeat in einem zweiten Schritt bei einer Abtrenngrenze von 1000-3000 Da aufkonzentriert. Die im Retentat enthaltenen insulinmimetischen Peptide werden anschließend mit der Affinitätschromatographie im Batchverfahren isoliert. Die insulinmimetischen Peptide werden dann einer 10%igen Caseinlösung in einem Proteinverhältnis von 1 :2 bis 1 :20 zugegeben. Die restlichen Bestandteile wie Molkenpulver oder Molkenproteinkonzentrat, Lactose, Lipide, Vitamine, Mineralstoffe und werden in den für Säuglingsnahrungen empfohlenen Mengen zugemischt. Nach dem vollständigen Lösen aller Bestandteile wird der Ansatz homogenisiert, pasteurisiert und auf einen Trockenmassegehalt von 35-45% eingedampft. Als letzter Schritt erfolgt eine Sprühtrocknung gemäss Beispiel 1.
BEISPIEL 7
Herstellung isolierter und Anreicherung erfindungsgemäßer Stoffe über Komplexierungsmethoden:
Dazu werden die Ansätze in eine Lösung von 0.15 mol/l NaCI und 1 mMol/l Imidazol-HCI-Puffer mit kontrolliertem pH 7,0 überführt und auf Peptidkonzentrationen von 2 - 5 mMol/l eingestellt. Bei dephosphorylierten Spaltprodukten, wie beispielsweise der humanen und der dephosphorylierten, vorzugsweise mit Phosphatase behandelten bovinen Caseine bzw. Casopeptiden, werden in einem Ansatz zur Isolierung der Stoff-Komponenten eine der Peptidkonzentration äquivalente Menge von 2-5 mMol/l CuCI2 unter Kontrolle des pH-Wertes (7,0) hinzugefügt. Bei Phosphopeptiden, beispielsweise der natürlichen, nicht vorbehandelten bovinen Caseine, wird in einem anderen Ansatz zur Isolierung der Stoff-Komponenten entsprechend verfahren durch Zusatz von 2-5 mMol/l ZnCI2. Nach einer Reaktionszeit von mindestens einer halben Stunde und normalen Umgebungsbedingungen werden beide Ansätze getrennt gegen Wasser (je nach Bedarf gegen eine gepufferte Salzlösung) ultrafiltriert an einer Membran mit der Ausschlussgrenze des hydrodynamischen Äquivalentes der Molekularmasse
(„Molekulargewicht") von 500 Dalton, solange, bis ein Austausch des Mediums im Volumenverhältnis von mindestens 1 : 1000 (Ansatzvolumen: Ultrafiltrat) stattgefunden hat. Beide Ansätze werden mit Ultrafiltration durch Einstellung auf das ursprüngliche Ansatzvolumen wieder konzentriert, getrennt gesammelt, in üblicher Weise über eine Filtration an einer Membran von 0,2 μm Porenweite sterilisiert und gegebenenfalls bis zur weiteren Verwendung eingefroren. Die gelösten Kupferkomplexe der Komponenten sind in konzentrierter Form als bläuliche Lösung bei normaler Temperatur sichtbar. Die farblosen Zinkkomplexe stehen im Löslichkeitsgleichgewicht zwischen unlöslichen (schwerlöslichen) und löslichen Anteilen. Die unlösliche Fraktion der Zinkverbindungen der Komponenten kann von der gelösten Fraktion durch Zentrifugation bei 10'000xg als weißer Niederschlag separat von der löslichen, bzw. sich noch in Lösung befindlichen Fraktion der Komponenten erhalten werden. Ein Waschvorgang mit Wasser oder Puffer vervollständigt die Trennung von löslicher und unlöslicher Fraktion. Von beiden Präparaten der Komponenten werden die Konzentrationen der Stoffe durch Messung der UV-Spektren nach dem Lambert-Beerschen Gesetz bestimmt. Die gelösten Stoffe können durch Ultrafiltration mit Wasser unter den gleichen Rahmenbedingungen salzfrei und nach Lyophilisieren als Trockensubstanz zur weiteren Verwendung erhalten werden.
BEISPIEL 8
Übergangsmetallionen-freie Exsuline (Casoinsuline):
Die neutrale bis schwach essigsaure (pH 5.0) Lösung der nach Beispiel 7 erhaltenen Übergangsmetallionenkomplexe werden von
Ubergangsmetallionen befreit durch Extraktion (Gegenstromverteilung) mit einer frisch hergestellten Lösung von mindestens 100 mg/l Dithizon in Chloroform (grün). Die Reaktion mit Ubergangsmetallionen Zn++- bzw. Cu++-ionen färbt die Lösung rot bis braunviolett. Nach Phasentrennung wird die wässrige (obere) Phase abgetrennt und die Extraktionen (Gegenstromverteilungszyklen) so oft (etwa 5 Mal) wiederholt, bis die Reagenz-Chloroformphase grün bleibt, d.h. frei von Ubergangsmetallionen ist. Die wässrige Phase kann in üblicher Weise nach dem Stand der Technik konzentriert und (zur Befreiung von Spuren der Reagentien sowie zur Auftrennung von Komponenten) aufgereinigt werden. Die Stoffe der Erfindung können dann den sie betreffenden Anwendungen zugeführt werden.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Exsuline bzw. insulinmimetische Aminosäuresequenzen mit einem Molekulargewicht von bis zu 55 000 Dalton und mit 1 bis 50 Grundeinheiten der folgenden allgemeinen Formel I
[-] [L,V,I,A]-X1-X2-[L,V,I,A]-[D,E]-[N,Q,M]-X3-[C,H]-X4 [-] (I)
wobei
[L,V,I,A], [D,E], [N,Q,M], [C,H] und X1 bis peptidisch verknüpfte Amino- säuren bedeuten,
[L,V,I,A] für Leucin (L), Valin (V), Isoleucin (I) oder Alanin (A) steht
[D,E] für Asparaginsaure (D) oder Glutaminsäure (E) steht,
[N,Q,M] für Asparagin (N), Glutamin (Q) oder Methionin (M) steht,
[C,H] für Cystein (C) oder Histidin (H) steht, die beiden Gruppen [L,V,I,A] in einer Grundeinheit gleich oder verschieden sein können,
X1 , X2, X3 und X4 eine beliebige Aminosäure bedeuten und die vier
Aminosäuren X 1 bιs 4 in einer Grundeinheit gleich oder verschieden sein können, die Grundeinheit der allgemeinen Formel (I) mittelständig oder endständig sein kann, bei einer endständigen Grundeinheit nur einer der Reste [-] vorhanden ist, sofern mehrere Grundeinheiten der allgemeinen Formel (I) in einem Molekül vorhanden sind, diese Grundeinheiten gleich oder verschieden sein können, und die Reste [-], sofern vorhanden, jeweils für eine beliebige, peptidisch mit [L,V,I,A] oder X4 verknüpfte Aminosäure oder für eine aus mehreren beliebigen Aminosäuren aufgebaute Aminosäuresequenz, die peptidisch mit [L,V,I,A] oder X4 verknüpft ist, stehen, und
[-], falls mehrere Grundeinheiten der allgemeinen Formel (I) vorhanden sind, für eine indirekte Verknüpfung aus einer beliebigen Aminosäure oder einer oben beschriebenen Aminosäuresequenz oder für eine direkte Verknüpfung von zwei benachbarten Grundeinheiten stehen, und die durch Insertionen, Deletionen und konservative Austausche von Aminosäuren erhaltenen Aminosäurensequenzen sowie deren phosphorylierte, acetylierte, farnesylierte, oxidierte, mit
Kohlenhydraten und/oder Lipiden konjugierte und/oder an einen festen oder flüssigen Träger immobilisierte Derivate.
2. Exsuline nach Anspruch 1, dadurch g eke n nze ich n et, dass die Grundeinheiten der allgemeinen Formel (I) folgende sind:
[-] LTDLENLHL [-] und [-] LTDVENLHL [-] .
3. Exsuline nach Anspruch 2, dadurch g eke n nze ich n et , dass sie folgender Fromel entsprechen:
LTDLENLHLPLPLLQPSMQQVPQPIPQTLALPPQPLWSVPEPK oder
YPVQPFTESQSLTLTDVENLHLPPLLLQSWMHQPHQPLPPTVMFPPQ SVLSLSQSK.
4. Exsuline nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch g eke n nze i ch n et, dass sie aus folgenden Ausgangsstoffen oder deren Teilen erhältlich sind: Organismen, Geweben, Zellen und biologische Flüssigkeiten und Exsudate, deren Kulturen und Kulturüberstandslösungen, Lebens- und Futtermittel, Diät- und Genussmittel sowie Ersatz- und Zusatzstoffe,
Milch und / oder Milchproteine.
5. Exsuline nach Anspruch 4, dadurch g eke n nze ich n et, dass sie aus Caseinen erhältlich sind.
6. Diätetisches oder pharmazeutisches Mittel enthaltend mindestens ein Exsulin nach einem der vorhergehenden Ansprüche sowie gegebenenfalls mindestens einen üblichen Hilfs-, Träger- oder Zusatzstoff.
7. Diätetisches oder pharmazeutisches Mittel nach Anspruch 6 zur Mimese der Eigenschaften und Funktionen und Ersatzmittel von Angehörigen der Familie der endogenen Insulin- und IGF- Proteohormonen / -mediatoren sowie zur Vorbeugung gegen und zur Behandlung und Beeinflussung von hormonalen Zuständen und Störungen sowie von verschiedenen degenerativen Erkrankungen des
Körpers von Säugern, einschließlich verschiedener Formen von Hormon-Stoffwechselstörungen, -Resistenzen, -Mängel,
Hyperinsulinämie, Diabetes mellitus und Autoimmun- sowie von neurodegenerativen und Folgeerkrankungen.
8. Verwendung der Exsuline nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Mimese der Eigenschaften und Funktionen und Ersatzmittel von Angehörigen der Familie der endogenen Insulin- und IGF- Proteohormone / -mediatoren sowie zur Vorbeugung gegen und zur Behandlung und Beeinflussung von hormonalen Zuständen und Störungen sowie von verschiedenen degenerativen Erkrankungen des
Körpers von Säugern, einschließlich verschiedener Formen von Hormon-Stoffwechselstörungen, -Resistenzen, -Mängel,
Hyperinsulinämie, Diabetes mellitus und Autoimmun- sowie von neurodegenerativen und Folgeerkrankungen bzw. zur Herstellung entsprechender diätetischer und pharmazeutischer Mittel sowie zur
Herstellung von Hemmstoffen und Regulatoren der Wirkungen der Angehörigen der Familie der endogenen Insulin- und IGF- Proteohormone / -mediatoren sowie von molekularbiologischen Äquivalenzstrukturen dafür.
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