EP1419262A2 - Verfahren zur enzymatischen reduktion von substraten mit molekularem wasserstoff - Google Patents

Verfahren zur enzymatischen reduktion von substraten mit molekularem wasserstoff

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EP1419262A2
EP1419262A2 EP02767065A EP02767065A EP1419262A2 EP 1419262 A2 EP1419262 A2 EP 1419262A2 EP 02767065 A EP02767065 A EP 02767065A EP 02767065 A EP02767065 A EP 02767065A EP 1419262 A2 EP1419262 A2 EP 1419262A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
reaction
hydrogenase
hydrogen
nadph
enzyme
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02767065A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Andreas Liese
Rita Mertens
Lasse Greiner
Eyke Van Den Ban
Huub Haaker
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Forschungszentrum Juelich GmbH
Original Assignee
Forschungszentrum Juelich GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Forschungszentrum Juelich GmbH filed Critical Forschungszentrum Juelich GmbH
Publication of EP1419262A2 publication Critical patent/EP1419262A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/36—Dinucleotides, e.g. nicotineamide-adenine dinucleotide phosphate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic

Definitions

  • the invention relates to a method for the enzymatic reduction of substrates with molecular hydrogen.
  • oxidoreductases have found their way into the production of fine chemicals and pharmaceuticals. If these are enzymatic, stereoselective reductions, a cofactor (hydrogen donor) in the form of NADH or NADPH is usually required. Since these cofactors are also now very high price, especially NADPH, s there is a need for a method by which it is possible to produce NADPH especially particularly inexpensive. Furthermore, a process that enables the regeneration of NADPH is of the highest interest, whereby the individual NADPH molecule should be able to go through as many cycles as possible (high total turn-over number). The latter is particularly important since these cofactors are far too expensive to be used stoichiometrically.
  • the glucose dehydrogenase from Gl conobacter suboxidans (Izumi Y, Nath PK, Yamamoto H, Yamada H. NADPH production from NADP + with a glucose dehydrogenase system involving whole cells and immobilized cells of Gluconobacter suboxydans were used here.
  • the process is particularly inexpensive because of the inexpensive hydrogen as an agent.
  • the removal of the reducing agent is not difficult since hydrogen is gaseous.
  • the enzymes used according to the invention are less labile and go through more reaction cycles. Quantitative conversions can be achieved with the method according to the invention.
  • the process can preferably be carried out in situ.
  • a mediator is implemented with molecular hydrogen by means of a hydrogenesis.
  • the hydrogenase is preferably from the hyperthermophilic strain of the archaebacterium Pyrococcus furiosus (DSM 3638).
  • the hydrogenases can be used in situ.
  • a mediator is a substance that can transfer hydride ions or electrons to substances. These compounds, when naturally occurring in organisms, are called cofactors. Other substances that are functionally equivalent to these natural cofactors are called mediators.
  • mediators is intended to mean all known mediators, including the natural cofactors, so that both types of action having the same effect should be included in the term. Examples of mediators are flavin mononucleotide (FMN), phenazine methosulfate (PMS), 2,6 dichlorophenolinophenol (DCPIP), Janus Grün, methylene blue, flavin adenine dinucleotide (FAD) but especially NADP + . However, NAD + is excluded from the invention.
  • the mediators are converted into their reduced form by means of the hydrogenase in the presence of hydrogen. The products are known to the person skilled in the art.
  • the reaction preferably takes place in an aqueous medium.
  • the reaction can be carried out in a pH range from 6-10, but preferably takes place in a pH range from 7 to 9, preferably from 7.5 to 8.5, since the enzyme activity and the stability of NADPH are greatest here is.
  • the reaction can be carried out in a temperature range from -10 ° C. to 150 ° C., preferably in a range from 0 ° C. to 100 ° C., particularly preferably from 20 ° C. to 80 ° C.
  • the pressure range in which the reaction can be carried out is preferably between 0 to 300 bar, particularly preferably between 0 and 20 bar.
  • the solubility of hydrogen is higher, so that more molecules are available for the hydrogenation in the solution.
  • the pressure ranges below 20 bar reactors are required which cannot withstand such high pressures, so that the technical outlay here is lower.
  • the boundaries of the specified areas are fluid.
  • the gas phase can be composed differently over the reaction solution. There should be no oxygen in the gas phase or at least so little that there is no explosive mixture.
  • the hydrogen can be present in pure form or in a mixture of a gas inert to the process, for example with at least one component from the group consisting of N 2 , CO 2 , Ar, He and Kr.
  • the hydrogen content can be between> 0 to 100%.
  • a hydrogen content of between 50 and 100% is preferred.
  • a further enzyme is added to the reaction solution, which converts a substrate.
  • the mediator converted by the hydrogenase can serve as a cofactor or more generally as a mediator, which is regenerated by the subsequent repeated reaction with the hydrogenase by being hydrogenated with hydrogen.
  • the enzyme 2 can be, for example, an alcohol dehydrogenase, which converts a ketone to an alcohol.
  • NADP + is converted by means of the hydrogenase to NADPH, which serves as an H - donor for the reduction of the ketone to an alcohol. This in turn produces NADP + , which is regenerated again by the hydrogenase.
  • acetophenone or acetone can be mentioned as substrates for the second reduction.
  • Further enzymes E2 are available, for example, from Thermoanaerobium brockii (ADH), (Pyrococcus furiosus (GDH).
  • ADH Thermoanaerobium brockii
  • GDH Panococcus furiosus
  • the process of mediator regeneration according to the invention can be carried out with any further enzyme reaction tion that the regenerated mediator needs.
  • the hydrogenase reaction is thus coupled with a further enzymatic reaction.
  • Typical examples of reactions of enzyme 2, which can be coupled with the regeneration of the mediator are described in “Wong, C.-H .; Whitesides, G.M. ; 1994 Enzymes in synthetic organic chemistry "Baldwin, J.E.; Magnus, P.D .; Tetrahedron organic chemistry series; Oxford; Elsevier Science Ltd.; Vol 12; 370 pages”.
  • the method according to the invention can therefore be used both for the production of mediators and for their in situ regeneration in coupled systems.
  • the coupled enzyme reaction with enzyme 2 is not disturbed by the hydrogen, rather the hydrogen even represents an inert atmosphere for the reaction.
  • the process control can take place in a batch reactor. Furthermore, the reaction according to the invention can be carried out in a membrane reactor, as described, for example, in German Patent 44 36 149, which is equipped with an ultrafiltration membrane which enables the retention of the hydrogenase.
  • the membrane reactor can be used as a repetitive batch or as a continuous reactor. The process control in the continuously operated membrane reactor is particularly preferred.
  • the hydrogenase from Pyrococcus furiosus is used repeatedly in a 'repetitive batch' process to obtain NADPH to produce. This results in low catalyst consumption rates and high productivity.
  • a maximum space-time yield of 10 gL "1 d " 1 was achieved.
  • a catalyst consumption of less than 0.1 mg protein / gNADPH and a maximum space-time yield of 74 g / L "1 d ⁇ 1 is achieved.
  • the hydrogenase from Pyrococcus furiosus for the cofactor regeneration of NADPH in the asymmetrical reduction of prochiral ketones by means of a dehydrogenase In the experiment shown in example 6, a cycle number of 100, in example 1 of 320, is achieved.
  • the hydrogenase from Pyrococcus furiosus used here is a particularly stable enzyme which, as shown by the repetitive batch experiments, can be reused many times.
  • the catalyst can be used both in coupled and alone.
  • the implementation of the pyrodine nucleotides according to the invention is not subject to any thermodynamic limitation. This is surprising and particularly advantageous since higher sales are achieved than in the case of regeneration systems coupled with cosubstrates.
  • Fig.l Sales-time curve for the reaction acetophenone - phenylethanol examples
  • Fig. 2 Repetitive batch tests for the reaction from Fig. 1 (Example 6).
  • Fig. 3 Yield of NADPH for repetitive batch tests according to Example 7.
  • Fig. 4 Dependence of the NADPH formation on the temperature.
  • bio-moisturizer 100 g of bio-moisturizer were added 400 mL 50 mM Tris-HCl pH 8.0 suspended, and 10 ⁇ g / mL DNase and RNase added. After 4 h at room temperature, the cell extract was centrifuged for 1 h at 30,000 g. 3 different preparations were prepared from the cell supernatant obtained in this way (diluted, cell-free extract, 5 - 10 mg protein / mL):
  • the hydrogenase activity (H 2 formation) is measured at 40 ° C (Silva PJ; Van den Ban ECD; Wassink H.; Haaker H .; De Castro B .; Robb FT; Hagen WR Enzymes of hydrogen metabolism in Pyrococcus furiosus, Eur. J. Biochem., 2000, 267, 6541-6551). If one of the enzyme preparations described above is to be used for the preparation or the cofactor regeneration of NADPH, any phosphatase activity still present which catalyzes the dephosphorilation of NADP + to NAD + must first be removed. The corresponding activities on hydrogenase and phosphatase are given in Table 1 for the three enzyme preparations described above.
  • the rate of dephosphorilation of NADP + was determined under the following conditions: 50 mM EPPS pH 8.0, 0.5 mM NADPH, protein sample, 40 ° C., total volume 1.5 ml. No phosphodiesterase activity could be detected.
  • Table 1 Specific activities of hydrogenase and phosphatase. All activities were determined at 40 ° C.
  • the hydrogenase is only highly stable if anaerobic conditions are present.
  • the reduction of NADP + is only carried out in the presence of hydrogen. Appropriate precautions have been taken to exclude disruptive components.
  • the reaction stability was tested using a fed-batch experiment. 1.6 units of hydrogenase are incubated in 3 ml of 200 mM EPPS, pH 8.0 at 80 ° C. for 5 minutes. After the addition of 8 mM (24 ⁇ mol), the solution was incubated at 40 ° C. under a hydrogen atmosphere for 24 h. After each addition of NADP + , quantitative conversion with respect to the fresh substrate was achieved after one hour. However, it was found that the NADPH produced was more unstable than the metered te NADP + is. The decay of NADPH is not enzyme-catalyzed. The half-life of NADPH in the different experiments was on average 20 h. Similar half-lives for NADPH at 41 ° C are described in the literature. An HPLC analysis after a reaction time of 2 and 48 h showed no decay products which could be caused by phosphatase or by phosphodiesterase activity.
  • the standard oxidation and reduction potentials of H + -H 2 and a NADP + -NADPH at pH 8 differ by 133 mV. Assuming that there is no inhibition of the hydrogenase by one of its starting materials or products, the enzyme must be capable of completely reducing the pyrodine nucleotide cofactors. A potential difference of 133 mV at pH 8.0 and a hydrogen atmosphere shifts the balance from NADPH / NADP + to 24,000 / 1 (Clark, WM, etc.). This means that there is no thermodynamic limitation for the reduction of pyrodine nucleotides by H 2 .
  • GDH glutamate dehydrogenase
  • the hydrogenase from Pyrococcus furiosus was used for regeneration.
  • the reaction solution consisted of 50 mM Tris / HCL buffer, pH 7.5, 50 mM NH 4 CL, 0.2 units GDH and 0.06 units hydrogenase from a cell-free extract.
  • Purified Pyrococcus furiosus glutamate dehydrogenase was used as a test system for reductive cofactor regeneration. As can be seen in Table 2, sufficient NADPH could be regenerated at 50 C within 16 h in order to achieve 100% conversion of 2-keto-gluterate to glutamate, which had a cycle number (TTN) of 100 under the aforementioned reaction conditions equivalent.
  • TTN cycle number
  • Table 2 Conversion of 50 mM 2-ketoglutarate to glutamate by P. furiosus GDH with NADPH regeneration by hydrogenase in a cell-free extract from P. furiosus.
  • a solution of 10 mM acetophenone in 50 mM aqueous potassium phosphate buffer (pH8) with 0.5 mM oxidized cofactor NADP + and a NADP + -dependent alcohol dehydrogenase (ADHM) is degassed by flowing the solution through with water-saturated helium.
  • 20 ⁇ L of an activated enzyme preparation (5 minutes at 80 ° C. under a hydrogen atmosphere) from Pyrococcus furiosus are added to this solution, so that the protein concentration corresponds to 0. lmg / mL. It is added through a gas-tight septum using a suitable syringe.
  • the solution is kept at 40 ° C.
  • the inert argon atmosphere is replaced by hydrogen.
  • GC gas chromatography
  • the substrate was changed from acetophenone to (S) -2-hydroxy-l-phenyl-propanone. 1, 2-Dihydroxyphenylpropanon with high enantiomeric excess was obtained as product.
  • a modified ultrafiltration cell (Amicon, Germany), which is equipped with an ultrafiltration membrane (YM10, Amicon), 3 ml of 200 mM EPPS, pH 8.0, 12 mM NADP + are filled in under an argon atmosphere.
  • the cell outlet is opened periodically and the permeate of the ultrafiltration cell is analyzed for conversion and yield by capillary electrophoresis. The outlet was checked for protein content with a negative result. After more than 95% of the conversion had been achieved (with respect to NADP + ), the cell contents were filtered to a minimal residual volume (approx. 0.2 ml) and again filled with the same solution.
  • Various hydrogen pressures were applied.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Reduktion von Substraten mit molekularem Wasserstoff. Erfindungsgemäss wird ein Mediator mittels einer Hydrogenase mit Wasserstoff umgesetzt. Im besonderen kann dieses Verfahren angewandt werden, um chemische Mediatoren oder auch Cofactoren von Enzymen zu reduzieren. Haupteinsatzpunkt dieses Verfahrens liegt in der Reduktion von NADP<+> zu NADPH bzw. Einsatz des im Patent beschriebenen Enzyms zur Cofaktorregenerierung von NADPH mit molekularem Wasserstoff. Vorteil dieses Verfahrens, gegenüber allen etablierten Verfahren zur Regenerierung von NADPH, liegt in der Verwendung des sehr kostengünstigen molekularen Wasserstoffs zur Generierung bzw. Regenerierung des Cofaktors und damit nicht der Bildung eines noch weiter abzutrennenden Nebenproduktes. In diesem Fall wird Wasser als Nebenprodukt gebildet. Als Katalysator Können verschiedene Aufreinigungen und Präparationen des Enzyms Pyrococcus furiosus eingesetzt werden.

Description

B e s c h r e i b u n g
Verfahren zur enzymatischen Reduktion von Substraten mit molekularem Wasserstoff
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Reduktion von Substraten mit molekularem Wasserstoff .
In neuerer Zeit finden immer mehr Oxidoreduktasen den Eingang in die Produktion von Feinchemikalien und Pharmazeutika. Wenn es sich hierbei um enzymatische, ste- reoselektive Reduktionen handelt, wird zumeist ein Co- faktor (Wasserstoffdonor) in Form von NADH oder NADPH benötigt. Da diese Cofaktoren auch heutzutage sehr hochpreisig sind, insbesondere NADPH, sbesteht der Bedarf für ein Verfahren, mit dem es möglich ist, NADPH im speziellen besonders preiswert zu produzieren. Des Weiteren ist vom höchsten Interesse auch ein Verfahren, welches es ermöglicht, NADPH zu regenerieren, wobei das einzelne NADPH-Molekül möglichst viele Zyklen durchlaufen können sollte (hohe total turn-over number) . Letz- teres ist besonders wichtig, da diese Cofaktoren deutlich zu teuer sind, um sie stöchiometrisch einzusetzen. Die derzeitige Methode der chemischen Reduktion von NADP+ benutzt zwar kostengünstige und kommerziell erhältliche Reagenzien, wie z.B. Natriumdithionit (Peters J. Dehydrogenases - characteristics, design of reaction conditions, and applications . In: Biotechnology, biotransformations I. Kelly Dr, Editor, ed. 8a, Weinheim: Wiley-VCH, 1998. p. 391-473), jedoch sind hier insbesondere die aufwendige Produktaufarbeitung, die Bildung von Nebenprodukten und geringe Ausbeuten die großen Nachteile (Chenault H, Whitesides G. Regeneration of nicotinamide cofactors for use in organic synthe- sis. Appl Biochem Biotech 1987, 14: 147-197). Die enzy- matische Produktion von NADPH ist ebenfalls in verschiedenen Veröffentlichungen bereits beschrieben worden. Zum Einsatz kamen hier die Glucosedehydrogenase aus Gl conobacter suboxidans (Izumi Y, Nath PK, Yamamoto H, Yamada H. NADPH production from NADP+ with a glucose dehydrogenase System involving whole cells and immobilized cells of Gluconobacter suboxydans .
Appl. Microbiol. Biotechnol . 1989, 30: 337-342), die
Alkoholdehydrogenase aus Thermoanaerobium brockii
(Lamed RJ, Keinan E, Zeikus JG. Potential applications of an alcohol-aldehyde/ketone oxidoreductase from ther- mophilic bacteria. Enzyme Microb. Technol . 1981, 3: 144-148) und die Malatdehydrogenase aus Äcromobacter parvulus (Suye S, Yokohama S. NADPH production from NADP+ using malic enzyme of Achromobacter parvulus IFO- 13182. Enz. Microbiol. Technol. 1985, 7: 418-424). In der wissenschaftlichen Literatur findet sich ebenfalls bereits der Einsatz verschiedener Hydrogenasen: So zum Beispiel die Hydrogenase aus Alkanigines eutrophus (Klibanov A, Puglisi A. The regeneration of coenzymes using immobilized hydrogenase. Biotech. Lett . 1980, 2: 445-450) und die Hydrogenase aus Methanobacterium ther- moautotrophicum (Wong C-H, Daniels L, Orme-Johnson WH, Whitesides GM. Enzyme-catalyzed organic synthesis: NAD(P)H regeneration using dihydrogen and the hydroge- nase from Methanobacterium thermoautotrophicu . J . Am. Chem. Soc. 1981, 103: 6227-6228). Alle Veröffentlichungen die bisher Hydrogenasen zum Einsatz der Cofaktorre- generierung beschreiben, tun dieses entweder auf die direkte Reduktion von NAD+ bezogen, oder auf die indirekte Reduktion von NADP+ mittels eines weiteren Mediators. Die nach dem Stand der Technik eingesetzten Enzy- me sind relativ labil, durchlaufen wenige Zyklen und haben für die Reaktionen eine geringe thermodynamische Triebkraft .
Es ist die Aufgabe der Erfindung, ein einfaches Verfah- ren zur direkten Reduktion von Mediatoren, insbesondere von NADP+ ohne die Benutzung eines zusätzlichen, anderen Mediators zu schaffen, welche für die Produktion von NADPH bzw. der hydrierten Form der Mediatoren und die Cofaktorregenerierung von NADPH, sowie die Regene- rierung von weiteren Mediatoren eingesetzt werden kann.
Ausgehend vom Oberbegriff des Anspruchs 1 wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst mit dem im kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 angegebenen Merkmalen.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es nunmehr möglich, Mediatoren, insbesondere NADP+ zu hydrieren und somit zu regenerieren. Das Verfahren ist wegen des preiswerten Wasserstoffes als Agens besonders kosten- günstig. Die Abtrennung des Reduktionsmittels bereitet keine Schwierigkeiten, da Wasserstoff gasförmig ist. Die erfindungemäß eingesetzten Enzyme sind weniger labil und durchlaufen mehr Reaktionszyklen. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können quantitative Umsätze erzielt werden. Der Prozeß kann vorzugsweise in situ durchgeführt werden.
Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.
Im Folgenden soll die Erfindung erläutert werden.
Erfindungsgemäß wird ein Mediator mittels einer Hydro- genäse mit molekularem Wasserstoff umgesetzt.
Vorzugsweise ist die Hydrogenase aus dem hyperther- mophilen Stamm des Archaebakteriums Pyrococcus furiosus (DSM 3638) .
Die Hydrogenasen können in situ eingesetzt werden.
Als Mediator wird erfindungsgemäß eine Substanz bezeichnet, die Hydridionen oder Elektronen auf Substan- zen übertragen kann. Diese Verbindungen werden, wenn sie in Organismen natürlich vorkommen, als Cofaktoren bezeichnet. Andere Substanzen, die funktioneil mit diesen natürlichen Cofaktoren gleichwirkend sind, werden als Mediatoren bezeichnet. Im Sinne der Erfindung soll der Begriff Mediatoren alle bekannten Mediatoren einschließlich der natürlichen Cofaktoren bedeuten, so daß beide gleichwirkenden Arten von dem Begriff umfaßt sein sollen. Beispielhaft können als Mediatoren Flavin mononukleotid (FMN) , Phenazin methosulfat (PMS) , 2,6 Dichlorphenolin- dophenol (DCPIP) , Janus Grün, Methylenblau, Flavin adenin dinukleotid (FAD) aber insbesondere NADP+ genannt werden. NAD+ ist jedoch von der Erfindung ausgenommen. Die Mediatoren werden erfindungemäß mittels der Hydrogenase in Anwesenheit von Wasserstoff in ihre reduzierte Form überführt. Die Produkte sind dem Fachmann bekannt .
Die Reaktion findet vorzugsweise in wäßrigem Medium statt .
Die Reaktion kann in einem pH-Bereich von 6-10 durchgeführt werden, findet aber vorzugsweise in einem pH- Bereich von 7 bis 9, vorzugsweise von 7,5 bis 8,5 statt, da die Enzymaktivität und die Stabilität von NADPH hier am größten ist.
Die Umsetzung kann in einem Temperaturbereich von -10°C bis 150 °C, vorzugsweise in einem Bereich von 0°C bis 100°C besonders bevorzugt von 20°C bis 80°C durchge- führt werden.
Der Druckbereich, in dem die Reaktion durchgeführt werden kann liegt vorzugsweise zwischen 0 bis 300 bar, besonders bevorzugt zwischen 0 und 20 bar. In den hohen Druckbereichen > 20 bar ist die Löslichkeit von Wasserstoff höher, so daß in der Lösung mehr Moleküle für die Hydrierung zur Verfügung stehen. In den Druckbereichen unterhalb 20 bar werden Reaktoren benötigt, welche nicht so hohen Drucken standhalten können müssen, so daß der technische Aufwand hier geringer ist. Die Grenzen der angegeben Bereiche sind jedoch fließend. Bei den genannten Drucken kann sich die Gasphase über der Reaktionslδsung verschieden zusammensetzen. Es sollte kein Sauerstoff in der Gasphase sein oder jedenfalls so wenig, daß kein explosives Gemisch vorliegt. Der Wasserstoff kann in reiner Form, oder in einem Gemisch eines für den Prozeß inerten Gases beispielsweise mit mindestens einer Komponente aus der Gruppe von N2, C02, Ar, He und Kr vorliegen. Der Wasserstoffanteil kann dabei zwischen >0 bis 100 % liegen. Bevorzugt wird ein Wasserstoffanteil zwischen 50 und 100%.
In einer Weiterbildung der Erfindung ist der Reaktionslösung ein weiteres Enzym zugegeben, welches ein Substrat umsetzt. Für diese zweite Umsetzung mit diesem Enzym 2 kann der, durch die Hydrogenase umgesetzte, Mediator als Cofaktor oder allgemeiner als Mediator dienen, der durch die anschließende wiederholte Umsetzung mit der Hydrogenase, wieder regeneriert wird, indem er mit Wasserstoff hydriert wird. Das Enzym 2 kann beispielsweise eine Alkoholdehydroge- nase sein, welche ein Keton zu einem Alkohol umsetzt. In einem derartigen Cyclus wird beispielsweise NADP+ mittels der Hydrogenase zu NADPH umgesetzt, welches als H~-Donor für die Reduktion des Ketons zu einem Alkohol dient. Hierbei entsteht wiederum NADP+, welches durch die Hydrogenase erneut regeneriert wird. Als Substrate für die zweite Reduktion können in diesem Beispiel Ace- tophenon oder Aceton genannt werden. Weitere Enzyme E2 sind beispielsweise aus Thermoanaero- bium brockii (ADH) , (Pyrococcus furiosus (GDH) erhältlich. Grundsätzlich kann der erfindungsgemäße Prozeß der Mediatorregenerierung mit jeder weiteren Enzymreak- tion gekoppelt werden, die den regenerierten Mediator benötigt .
Somit wird die Hydrogenasereaktion mit einer weiteren enzymatischen Reaktion gekoppelt. Typische Beispiele für Reaktionen des Enzyms 2, welche mit der Regenerierung des Mediators gekoppelt werden können, sind in „ Wong, C.-H.; Whitesides, G.M. ; 1994 Enzymes in synthe- tic organic chemistry" Baldwin, J.E . ; Magnus, P.D.; Tetrahedron organic chemistry series; Oxford; Elsevier Science Ltd. ; Vol 12; 370 Seiten" beschrieben.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann also sowohl zur Produktion von Mediatoren, als auch zu deren in situ Regenerierung in gekoppelten Systemen eingesetzt werden. Die angekoppelte Enzymreaktion mit dem Enzym 2 wird durch den Wasserstoff nicht gestört, vielmehr stellt der Wasserstoff sogar eine Inertatmosphäre für die Reaktion dar.
■ Die Prozessführung kann in einem Satzreaktor erfolgen. Weiterhin kann die erfindungsgemäße Reaktion in einem Membranreaktor, wie er beispielhaft im deutschen Patent 44 36 149 beschrieben ist, durchgeführt werden, welcher mit einer Ultrafiltrationsmembran ausgestattet ist, die die Retention der Hydrogenase ermöglicht. Der Membran- reaktor kann als repetitiv batch oder als kontinuierlicher Reaktor eingesetzt werden. Die Prozeßführung im kontinuierlich betriebenen Membranreaktor ist besonders bevorzugt .
In einer vorteilhaften Ausgestaltung der Methode wird die Hydrogenase aus Pyrococcus furiosus wiederholt in einem 'repetitiv batch' Verfahren eingesetzt, um NADPH zu produzieren. Hierdurch ergeben sich geringe Katalysatorverbrauchsraten und hohe Produktivitäten. Bei dem in Beispiel 6 dargestellten Experiment wurde eine maximale Raum-Zeit-Ausbeute von 10gL"1d"1 erreicht. Bei dem in Beispiel 7 angeführten Experiment wird ein Katalysatorverbrauch von weniger als 0,1 mg Protein/gNADPH und eine maximale Raum-Zeitausbeute von 74g/L"1d^1 erzielt. In einer weiteren vorteilhaften Ausgestaltung der Methode wird die Hydrogenase aus Pyrococcus furiosus zur Cofaktorregenerierung von NADPH bei der asymmetrischen Reduktion von prochiralen Ketone mittels einer Dehydro- genäse eingesetzt. Bei dem in Beispiel 6 angeführten Experiment wird eine Zyklenzahl von 100, bei Beispiel 1 von 320 erreicht.
Folgende Vorteile ergeben sich aus dem hier vorgestellten Verfahren:
• Bei der hier verwendeten Hydrogenase aus Pyrococcus furiosus handelt es sich um ein besonders stabiles Enzym, welches wie durch die repetitiv batch Experimente gezeigt, vielfach wiederverwendet werden kann. • Der Katalysator kann sowohl in gekoppelten als auch alleinig eingesetzt werden. • Da die Hydrogenase aus einem thermophilen Stamm kommt, kann sie wie in den Ansprüchen beschrieben, über einen weiten Temperaturbereich eingesetzt werden. Die erfindungsgemäße Umsetzung der Pyrodinnucleotide unterliegt keiner thermodynamisehen Limitierung. Dies ist überraschend und besonders vorteilhaft, da höhere Umsätze als bei mit Cosubstraten gekoppelten Regene- riersystemen erreicht werden.
Die Figuren zeigen Versuchsergebnisse: Es zeigt :
Fig.l: Umsatz-Zeit-Verlauf für die Reaktion Acetophenon — Phenylethanol Beispiele
4 und 5. Fig.2: Repetitive Batch-Versuche für die Reaktion aus Fig. 1 (Beispiel 6) . Fig.3: Ausbeute von NADPH für Repetitive Batch-Versuche gemäß Beispiel 7.
Fig.4: Abhängigkeit der NADPH-Bildung von der Temperatur .
Beschreibung der Katalysatorpräparation
In der hier dargestellten Erfindung wird eine in vi tro Methode beschrieben, welche molekularen Wasserstoff als reduzierendes Agens für die Darstellung von Pyridin- Nukleotiden und Farbstoffen mittels einer löslichen Hydrogenase ermöglicht. Pyrococcus furiosus (DSM 3638) wurde entsprechend der in der Literatur angegebenen Vorschrift kultiviert, unter Zusatz von Tafelsalz und Kartoffelstärke (Hagedoorn, P-L. , M. C. P. F. Driessen, M. van den Bosch, I. Landa, and W. R. Hagen. 1998. Hy- perthermophilic redox chemistry: a re-evaluation. FEBS Lett. 440: 311-314). Die Zellen wurden durch Autolyse aufgeschlossen. Hierzu wurden 100 g Biofeuchtmasse in 400 mL 50 mM Tris-HCl pH 8,0 suspendiert, und 10 μg/mL DNase und RNase zugegeben. Nach 4 h bei Raumtemperatur wurde das Zellextrakt für 1 h bei 30.000 g abzentrifu- giert . Aus dem so gewonnenen Zeilüberstand (verdünntes, zellfreies Extrakt, 5 - 10 mg Protein/mL) wurden 3 verschiedene Präparationen hergestellt:
1) Zellfreies Extrakt wurde mittels Ultrafiltration (Amicon YM 10 Membran) auf 30 mg/mL aufkonzentriert und über Nacht mit 50 mM Tris-HCl pH 8,0 Puffer dialysiert.
2) Zu dem zellfreien Extrakt wurde Ammoniumsulfat hinzugesetzt, bis zu 10%iger Sättigung. Die so erhaltene Suspension wird für 15 min. bei 30.000 g und 4°C zentrifugiert und der Überstand mit Ammo- niumsulfat bis zu 60% gesättigt. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt , wird das Pellet resuspendiert und gegen 50 mM Tris-HCl-Puffer pH 8 dialysiert. Die Proteinkonzentration beträgt 30 mg/mL. 3) Das zellfreie Extrakt wird auf eine Source 15Q- Säule (Pharmacia) aufgetragen und mit 250 mM NaCl eluiert . Die Fraktionen, welche Hydrogenase- aktivität enthalten, werden mittels Ultrafiltration (Amicon YM 30 Membran) bis 30 - 50 mg Pro- tein/mL aufkonzentriert .
In der löslichen zellfreien Fraktion des hypother- mophilen Archae-Bakteriums Pyrococcus furiosus liegen zwei verschiedene Hydrogenasen vor (Ma, K. , Weiss, R. and Adams, M.W.W. Characterization of hy- drogenase II from the hyperthermophilc archaeon Pyrococcus furiosus and assessment of its role in sulfur reduction. J. Bacteriol . , 2000, 1864-1871). Die Hydrogenase 1 (90% der Gesamtaktivität) eluiert bei 0,25 M NaCl von der Ionenaustausc chroma- tographiesäule und die Hydrogenase 2 bei 0,4 M NaCl (10% der Gesamtaktivität) . Die Fraktionierung erfolgte unter einer Argonatmosphäre und die Fraktionen werden bei -80°C gelagert. Die Hydrogenaseakti- vität (H2-Bil-dung) wird bei 40°C gemessen (Silva P.J.; Van den Ban E.C.D.; Wassink H. ; Haaker H.; De Castro B.; Robb F.T.; Hagen W.R. Enzymes of hydrogen metabolism in Pyrococcus furiosus . Eur. J. Biochem. , 2000. 267, 6541-6551) . Wenn eine der zuvor beschriebenen Enzympräparationen für die Darstellung oder die Kofaktorregenerierung von NADPH benutzt werden soll, uss zuvor eine noch anwesende Phosphataseak- tivität, welche die Dephosphorilierung von NADP+ zu NAD+ katalysiert, entfernt werden. Für die drei zuvor beschriebenen Enzympräparationen sind in Tabelle 1 die entsprechenden Aktivitäten an Hydrogenase und Phosphatase angegeben. Hierbei wurde die Geschwindigkeit der Dephosphorilierung von NADP+ unter folgenden Bedingungen bestimmt: 50 mM EPPS pH 8,0, 0,5 mM NADPH, Proteinprobe, 40°C, Gesamtvolumen 1,5 ml. Es konnte keine Phophodiesteraseaktivität detektiert werden . Tabelle 1 : Spezifische Aktivitäten der Hydrogenase und Phosphatase . Alle Aktivitäten wurden bei 40°C bestimmt.
Eine hohe Stabilität der Hydrogenase ist nur gegeben, wenn anaerobe Bedingungen vorliegen. Die Reduktion von NADP+ wird nur in Gegenwart von Wasserstoff durchgeführt. Entsprechende Vorkehrungen zum Ausschluss von störenden Komponenten wurden getroffen.
Beispiel 1
Die Reaktionsstabilität wurde mittels eines fed-batch Experimentes getestet. 1,6 Units Hydrogenase werden in 3 ml 200 mM EPPS, pH 8,0 bei 80°C für 5 Minuten inkubiert. Nach der Zugabe von 8 mM (24μmol) wurde die Lösung bei 40°C unter Wasserstoffatmosphäre für 24 h in- kubiert. Nach jeder NADP+-Zugabe wurde quantitativer Umsatz bezüglich des frischen Substrats nach einer Stunde erzielt. Allerdings wurde hierbei festgestellt, dass das produzierte NADPH instabiler als das zudosier- te NADP+ ist. Der Zerfall von NADPH ist nicht enzymka- talysiert. Die Halbwertszeit von NADPH in den verschiedenen Experimenten war durchschnittlich 20 h. Ähnliche Halbwertszeiten für NADPH bei 41°C sind in der Literatur beschrieben. Eine HPLC-Analyse nach Reaktionszeit von 2 und 48 h zeigte keine Zerfallsprodukte, die durch Phosphatase oder durch Phospordiesteraseaktivität hervorgerufen sein könnten.
Beispiel 2 :
Die Standardoxidations- und Reduktionspotentiale von H+-H2 und einer NADP+-NADPH bei pH 8 unterscheiden sich um 133 mV. Unter der Annahme, dass keine Inhibierung der Hydrogenase durch eines ihrer Edukte oder Produkte vorliegt, muß das Enzym befähigt sein, die Pyrodin- nukleotidcofaktoren komplett zu reduzieren. Eine Potentialdifferenz von 133 mV bei pH 8.0 und einer Wasser- stoff-Atmosphäre verschiebt das Gleichgewicht von NADPH/NADP+ zu 24.000/1 (Clark, W.M. usw.). Dieses heißt, das es keine thermodynamisehe Limitierung für die Reduktion von Pyrodinnukleotiden durch H2 gibt. Dieses wurde nachgewiesen, in dem der folgende Testan- satz durchgeführt wurde: 3,9 Units Hydrogenase wurden unter Wasserstoffatmosphäre in einem Volumen von 3mL 1 M EPPS-Puffer, pH 8.0, 110 mM NADP+ inkubiert. Nach 240 Minuten war quantitativer Umsatz erreicht. Beispiel 3 :
Die reduktive Aminierung von zwei Ketogluterat zu Glutamat wird durch die Glutamatdehydrogenase (GDH) kata- lysiert, welche NADPH abhängig ist. Zur Regenerierung wurde hier die Hydrogenase aus Pyrococcus furiosus eingesetzt. Die Reaktionslösung bestand aus 50 mM Tris/HCL-Puffer, pH 7,5, 50 mM NH4CL, 0,2 Units GDH und 0,06 Units Hydrogenase aus einem zellfreien Extrakt. Aufgereinigte Glutamatdehydrogenase von Pyrococcus furiosus wurde als Testsystem der reduktiven Kofaktorre- generierung benutzt. Wie der Tabelle 2 zu entnehmen ist, konnte bei 50 C innerhalb von 16 h genügend NADPH regeneriert werden, um zu 100 % Umsatz von 2-Keto- gluterat zu Glutamat zu gelangen, welches unter den zuvor genannten Reaktionsbedingungen einer Zyklenzahl (TTN) von 100 entspricht.
Tabelle 2: Umsetzung von 50 mM 2-Ketoglutarat zu Glutamat durch P. furiosus GDH mit NADPH Regenerierung durch Hydrogenase in einem zellfreien Extrakt aus P. furiosus .
Beispiel 4 :
Eine Lösung von lOmM Acetophenon in 50mM wäßrigem Kaliumphosphatpuffer (pH8) mit 0,5mM oxidiertem Kofaktor NADP+ und eine NADP+-abhängige Alkoholdehydrogenase (ADHM) wird mit Durchströmen der Lösung mit wassergesättigtem Helium entgast. Zu dieser Lösung werden 20μL einer aktivierten Enzympräparation (5 Minuten bei 80°C unter Wasserstoffatmosphäre) aus Pyrococcus furiosus gegeben, so daß die Proteinkonzentration 0. lmg/mL entspricht . Die Zugabe erfolgt durch ein gasdichtes Septum mittels einer geeigneten Spritze. Die Lösung wird bei 40°C gehalten. Die inerte Argonatmosphäre wird durch Wasserstoff ersetzt. Von der gerührten Reaktionslösung werden Proben genommen und ohne weitere Aufarbeitung per Gaschromatographie (GC) hinsichtlich Umsatz und Enantiomerenüberschuß bzw. -Verhältnis analysiert. Es wurde quantitativer Umsatz nach 3 Stunden bei einem Enantiomerenüberschuß größer als 99.5% erreicht. GC: Agilent 6890GC mit einer Kapillarsäule Chirasil-Dex (Chrompack-Varian, Deutschland) Umsatz-Zeit-Kurve zeigt die Figur 1 (Kreise) . Die Zyklenzahl (TTN) bezüglich NADP+ entspricht 20.
Beispiel 5
Konzentrationen wie in Beispiel 4, die Kofaktorkon- zentration wurde auf 0,lmM erniedrigt. Die Umsatz-Zeitkurven sind für beide Kofaktorkonzentra- tionen in der Figur 1 gezeigt (Dreiecke) . Es wurde quantitativer Umsatz nach 3.5 Stunden bei einem Enantiomerenüberschuß größer als 99.5% erreicht. Die Zyklenzahl (TTN) bezüglich NADP+ entspricht 100.
Beispiel 6:
In einer modifizierten Ultrafiltrationszelle (Amicon, Deutschland) , die mit einer Ultrafiltrationsmembran (YM10, Amicon) ausgestattet ist, werden die oben beschriebenen Lösungen unter Argonatmosphäre eingefüllt. Der Auslauf der Zelle wird periodisch geöffnet und das Permeat der Ultrafiltrationszelle mittels GC auf Umsatz und Ausbeute analysiert. Der Auslauf wurde mit negati- vem Ergebnis auf Proteingehalt überprüft. Nachdem mehr als 95% des Umsatzes erreicht wurden, wurde der Zelleninhalt bis auf ein minimales Restvolumen filtriert, und wieder mit der gleichen Lösung befüllt. Bei der Befül- lung wurde nur Alkoholdehydrogenase (ADHM) zu den Zeit- punkten nachdosiert, die in der Figur 2 kenntlich gemacht wurden.
Beginnend mit dem sechsten Zyklus wurde das Substrat von Acetophenon auf (S) -2-Hydroxy-l-phenhyl-propanon gewechselt. Als Produkt wurde 1 , 2-Dihydroxyphenylpro- panon mit hohem Enantiomerenüberschuß erhalten.
Der Zyklus wurde achtmal wiederholt . Die Ergebnisse der ersten sechs Zyklen sind in Figur 2 gezeigt . Beispiel 7 :
In einer modifizierten Ultrafiltrationszelle (Amicon, Deutschland) , die mit einer Ultrafiltrationsmembran (YM10, Amicon) ausgestattet ist, werden 3 ml 200 mM EPPS, pH 8,0, 12mM NADP+ unter Argonatmosphäre eingefüllt . Der Auslauf der Zelle wird periodisch geöffnet und das Permeat der Ultrafiltrationszelle mittels Ca- pillarelectrophorese auf Umsatz und Ausbeute analy- siert. Der Auslauf wurde mit negativem Ergebnis auf Proteingehalt überprüft. Nachdem mehr als 95% des Umsatzes erreicht wurden (bzgl . NADP+) , wurde der Zelleninhalt bis auf ein minimales Restvolumen (ca. 0.2mL) filtriert, und wieder mit der gleichen Lösung befüllt. Dabei wurden verschiedene Wasserstoffdrücke beaufschlagt .
Der Zyklus wurde achtmal wiederholt . Dabei wurde ab dem 7. Zyklus der Druck auf 7.5bar Wasserstoff erhöht. Es wurde keine Hydrogenasepräparation zudosiert. Das Per- meat wurde mittels Kapillarelektrophrese untersucht. (Beckmann PACE MDQ, Kapillare: fused silica, 24°C, U=20 kV, c (Total) =100 mM, 50\% Kaliumphosphat (50 mM Kaliumphosphat + 50 mM Borat) , pH=6) Die Ergebnisse sind in Figur 3 dargestellt .

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur enzymatischen Reduktion von Substraten mit molekularem Wasserstoff, dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym eine Hydrogenase und als Substrat ein Mediator ausgenommen NAD+ ohne Zugabe eines zweiten
Mediators eingesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrogenase aus Pyrococcus furiosus einge- setzt wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Mediator eine Komponente aus der Gruppe NADP+, FMN, PMS, DCPIP, Janus Grün, Methylenblau und FAD ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in wäßrigem Medium durchgeführt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in einem pH-Bereich zwischen 6 und 10 stattfindet.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Umsetzung in einem Temperaturbereich zwischen -10°C und 150°C durchgeführt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in einem Druckbereich zwischen 0 und 300 bar durchgeführt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7 , dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in einem Druckbereich zwischen 0 und 20 bar durchgeführt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Wasserstoff in reiner Form oder in einem
Gemisch mit einem für den Prozeß inerten Gas vorliegt und dabei die flüssige Phase überschichtet.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Inertgas mindestens eine Komponente aus der
Gruppe bestehend aus C02, He, Ar, Kr oder N2 ist.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oderlO, dadurch gekennzeichnet, daß die Wasserstoffkonzentration in der Gasphase 50 bis 100 % beträgt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß dem Reaktionsgemisch ein zweites Enzym und ein zweites Substrat zugesetzt wird, welche zu einem Produkt umgesetzt wird, so daß eine Kopplung mit einem weiteren chemischen Prozeß stattfindet.
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß als zweites Enzym eine Alkoholdehydrogenase zu- gefügt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 12 oder 13 , dadurch gekennzeichnet, daß als zweites Substrat ein Keton eingesetzt wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion in einem Membranreaktor durchgeführt wird, welcher mit einer Ultrafiltrationsmembran ausgestattet ist, welche die Retention von Enzymen bewirkt .
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