EP1416952A1 - Regulation des apj-rezeptors zur behandlung oder prophylaxe von herzkrankheiten - Google Patents

Regulation des apj-rezeptors zur behandlung oder prophylaxe von herzkrankheiten

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Publication number
EP1416952A1
EP1416952A1 EP02764774A EP02764774A EP1416952A1 EP 1416952 A1 EP1416952 A1 EP 1416952A1 EP 02764774 A EP02764774 A EP 02764774A EP 02764774 A EP02764774 A EP 02764774A EP 1416952 A1 EP1416952 A1 EP 1416952A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
apj receptor
prophylaxis
expression
apelin
receptor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02764774A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Barbara Albrecht
Horst-Peter Antonicek
Peter Ellinghaus
Erwin Bischoff
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Original Assignee
Bayer Healthcare AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Healthcare AG filed Critical Bayer Healthcare AG
Publication of EP1416952A1 publication Critical patent/EP1416952A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives

Definitions

  • the invention relates to the use of APJ receptor agonists for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of coronary heart diseases, in particular stable and unstable angina pectoris, acute myocardial infarction,
  • Myocardial infarction prophylaxis sudden cardiac death, heart failure, as well as high blood pressure and the consequences of atherosclerosis.
  • the heart as an incessantly working hollow muscle, needs a particularly intensive supply of oxygen to cover its energy requirements.
  • Supply disorders therefore primarily concern oxygen transport, which can be inadequate with reduced adaptability to the blood flow.
  • An increase in oxygen consumption can only be covered by an increase in cardiac blood flow.
  • G protein-coupled receptors are 7-transmembrane domain proteins, the activation of which leads to the activation of various G proteins. These activated G proteins can in turn activate or deactivate various other signal systems and thus lead to the induction of the mechanisms described above. With the G proteins, a distinction is made between gas (activating adenylyl cyclase), G ⁇ i (inhibiting adenylyl cyclase) and G ⁇ q (increase in IP3).
  • the DNA sequence coding for the human APJ receptor is shown in the sequence listing in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of the human APJ receptor is shown in SEQ ID NO: 2 of the sequence listing.
  • the APJ receptor is a G ⁇ i-coupled receptor (O'Dowd et al., Gene, 136 (1993) 355-360), which inter alia by its natural ligand Apelin (Tatemoto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. , 251 (1998) 471-476) is activated.
  • the receptor shows one
  • the APJ receptor of the rat (described in WO0068250) and the mouse (described in WO0068244) becomes ubiquitous in many regions of the brain and in others
  • Cardiomyopathy occurs ( Figure 2). Since the expression of the human APJ receptor in the diseased heart is a condition for the use of active substances for stimulating the receptor in patients with coronary heart diseases, this result creates the prerequisites for a new therapeutic approach. A decrease in receptor expression, e.g. Known for the ⁇ 1 adrenoreceptor in heart failure (Chakraborti et al., Cellular Signaling, 12 (2000) 499-513) would mean that therapeutic stimulation is excluded.
  • Receptor to be triggered in vessels.
  • Coronary flow for the treatment and / or prophylaxis of stable and unstable Angina pectoris, acute myocardial infarction, myocardial infarction prophylaxis, heart failure, sudden cardiac death, as well as hypertension and the consequences of atherosclerosis can be used in humans.
  • the present invention therefore relates to the use of APJ receptor agonists for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prophylaxis of the abovementioned diseases.
  • agonists are all substances which stimulate the biological activity of the receptor.
  • Particularly preferred agonists are nucleic acids including “locked nucleic acids”, “peptide nucleic acids” and “Spiegelmere”, proteins including antibodies and low-molecular substances, very particularly preferred agonists are low-molecular substances.
  • the stimulation can e.g. measured in the APJ stimulation test described below.
  • the APJ receptor is stimulated if the test measures an at least 10% decrease in an increased cAMP level by stimulation of the adenylate cyclase, the stimulation being able to take place, inter alia, by forskolin or via adrenergic receptors.
  • APJ receptor agonists can be tested on recombinant cell lines that contain the human APJ receptor.
  • APJ agonists which activate in the APJ stimulation test given below with an EC 5 Q of 1 ⁇ M, preferably less than 0.1 ⁇ M, are preferred.
  • the APJ receptor agonists according to the invention are preferably unable to cross the blood / brain barrier and act systemically and not centrally. Brief description of the pictures:
  • Apelin and other possible APJ agonists is tested on a CHO cell line that stably expresses the complete open reading frame of the human receptor gene as a recombinant protein.
  • this cell line is activated with forskolin, the internal cAMP level increases. This increase can be prevented by simultaneous or prior administration of Apelin by stimulating the recombinantly expressed APJ receptor and the resulting inhibition of adenylyl cyclase.
  • CHO cells / hole are sown on 384-hole plates (Greiner) in DMEM medium (Gibco) with 10% FCS (fetal calf serum, Gibco) and cultivated for 2 days at 37 ° C. and 5% CO 2 .
  • the cells are incubated with Apelin dilutions (dilution series typically of 10 "13 -10 " 7 M) and then stimulated with 10 "5 M forskolin.
  • the cAMP level is determined using the" cAMP Screen Kit “[Tropix (PE Biosystems) ] determined according to the instructions and the effect of Apelin as a percentage inhibition of the maximum cAMP increase after stimulation represented with forskolin.
  • the EC 50 value of the effect of Apelin is the value at which 50% of the forskolin signal are inhibited.
  • the relative expression of the APJ receptor in human tissues is determined by quantifying the mRNA using the real-time polymerase chain reaction (so-called TaqMan-PCR, Heid et al., Genome Res 6 (10), 986-994).
  • TaqMan-PCR the real-time polymerase chain reaction
  • real-time PCR offers the advantage of more precise quantification by introducing an additional, fluorescence-labeled oligonucleotide.
  • This so-called probe contains the fluorescent dye FAM (6-carboy-fluorescein) at the 5 'end and the fluorescent quencher TAMRA (6-carboxy-tetra-methylrhodamine) at the 3' end.
  • the 5'-exonuclease activity of the Taq polymerase cleaves the fluorescent dye FAM from the probe, thereby obtaining the previously quenched fluorescence signal.
  • the number of cycles at which the fluorescence intensity is approximately 10 standard deviations above the background fluorescence is recorded as the so-called threshold value (Ct value).
  • RNA from Clontech
  • small pieces approximately (approx. 0.5 g) of explanted hearts from patients with dilated cardiomyopathy (obtained from the German Heart Center Berlin) and the total RNA from them are extracted using RNaesy
  • RNA per tissue is used to remove contaminations of genomic DNA with 1 unit DNase I (Gibco) for 15 min at room temperature. Dnase I is inactivated by adding 1 ⁇ l EDTA (25 mM) and then heating to 65 ° C. (10 min). The cDNA synthesis is then carried out in the same reaction mixture in accordance with the instructions for the “SUPERSCR ⁇ PT-II RT cDNA synthesis kit” (Gibco) and the reaction volume is made up to 200 ⁇ l with distilled water. For the PCR, 5 ⁇ l of the diluted cDNA is used Solution 7.5 ⁇ l mixture of primer and probe and 12.5 ⁇ l TaqMan reaction solution [Universal Master Mix (Applied
  • the final concentration of each primer is 300 nM, that of the probe 150 nM.
  • the sequence of the "forward” and “reverse” primer for the APJ receptor is: 5'-TCCCAGGAGTAAAAGCCAAGC-3 'or 5'- CCTTCAAGGGTCCTGTCAGC-3', the sequence of the fluorescent probe 5'- 6FAM-AGAGGTTGTTTTTGCCAAMATATC -3 '.
  • PCR is carried out on an ABI-Prism-SDS-7700 device (from Applied Biosystems) according to the manufacturer's instructions. 40 cycles are carried out.
  • the Ct value (see above) that is obtained for the APJ receptor for each tissue corresponds to the cycle in which the fluorescence intensity of the released probe reaches 10 times the background signal. The lower the Ct value, the earlier the duplication begins, ie the more mRNA is contained in the original sample.
  • the expression of a so-called “household gene” is also analyzed in all examined tissues. This should be expressed approximately equally strongly in all tissues.
  • ⁇ -actin For the normalization of the APJ receptor expression, ⁇ -actin is used for this
  • the sequence of the “forward” or “reverse” primer for ⁇ -actin is 5'-TCCACCTTCCAGCAGATGTG-3 ', and 5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3' the sequence of the probe 5'-6FAM-ATCAGCAAGCAGGCAGTATGACGRATCCG-TAG
  • the data are evaluated by the so-called dCt method in accordance with the instructions for the ABI Prism SDS 7700 (from Applied Biosystems).
  • the tissue with the lowest relative expression is arbitrarily equal to 1 ( Figure 1) and all other tissues normalized to this, except for the illustration are tissues with a Ct value> 35.
  • the expression data of the APJ receptor in humans show that the receptor in the heart has a Ct value of 31.64, which corresponds to an average expression of the receptor in the heart.
  • the comparison of the amount of mRNA in healthy and DCM tissue shows that there is no significant decrease in receptor expression in DCM hearts, so that stimulation of the receptor by agonists can also be used therapeutically in patients with coronary heart diseases.
  • Ventilated 18-24 ml / kg The exact setting of the ventilation is carried out after the arterial CO 2 partial pressure, whereby an average pCO 2 of 35 - 45 mmHg is maintained.
  • the maintenance anesthesia is made with isoflurane (Baxter) 1.5 -3%.
  • the body temperature is kept at 38 ° C ⁇ 0.1 ° C.
  • Arterial blood pressure is measured via a catheter in the femoral artery. A thoracotomy is performed on the left side of the fifth intercostal space. The lungs are replaced, fixed and the pericard is incised.
  • a proximal section of the LAD (left coronary artery) distal to the first diagonal branch is dissected and a calibrated, electromagnetic flow measuring head (Gould Statham, model SP7515) is placed around the vessel and connected to a flow measuring device (Statham, model SP-2202) , A mechanical occluder is attached distal to the flow measuring head so that there are no branches between the flow measuring head and the occluder.
  • a calibrated, electromagnetic flow measuring head (Gould Statham, model SP7515) is placed around the vessel and connected to a flow measuring device (Statham, model SP-2202)
  • a mechanical occluder is attached distal to the flow measuring head so that there are no branches between the flow measuring head and the occluder.
  • Blood sampling and substance administration are carried out through a catheter in the femoral vein.
  • a peripheral ECG is derived with needles anchored subcutaneously.
  • a microtip pressure gauge (Millarmodel PC-350) is pushed through the left atrium to measure left ventricular pressure. The measurement of the heart rate is controlled via the R wave of the EKG. The hemodynamic parameters and the coronary flow are recorded over the entire test using a multiple recorder.
  • the experiment is started after a stabilization time of one hour. Either 10 ⁇ g / kg apelin in physiological saline is administered as i.v. Bolus injected or various Apelin concentrations (1, 3, 5, 10 ⁇ g / kg / min) infused over 10 min. Heart rate, blood pressure and coronary flow are registered and evaluated.
  • the APJ receptor agonists can be converted in a known manner into the customary formulations, such as tablets, dragées, pills, granules, aerosols, syrups, emulsions, suspensions and solutions, using inert, non-toxic, pharmaceutically suitable excipients or solvents.
  • the therapeutically active compound should in each case be present in a concentration of 0.5 to 90% by weight of the total mixture, i.e. in amounts sufficient to achieve the dosage range indicated.
  • the formulations are prepared, for example, by stretching the active ingredients with solvents and / or carriers, optionally using emulsifiers and / or dispersants, for example if Water as a diluent, if appropriate organic solvents can be used as auxiliary solvents.
  • the application is carried out in the usual way, preferably orally, transdermally, intravenously or parenterally, in particular orally or intravenously. However, it can also be done by inhalation via the mouth or nose, for example with the aid of a spray, or topically via the skin.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von APJ-Rezeptor-Agonisten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von koronaren Herzkrankheiten, insbesondere stabile und instabile Angina pectoris, akuter Myokardinfarkt, Myokardinfarktprophylaxe, plötzlicher Herztod, Herzinsuffiziens, sowie Bluthochdruck und den Folgen der Atherosklerose.

Description

REGULATION DES APJ-REZEPTORS ZUR BEHANDLUNG ODER PROPHYLAXE VON HERZKARNKHEITEN
Die Erfindung betrifft die Verwendung von APJ-Rezeptor-Agonisten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von koronaren Herzkrank- 5 heiten, insbesondere stabiler und instabiler Angina pectoris, akutem Myokardinfarkt,
Myokardinfarktprophylaxe, plötzlichem Herztod, Herzinsuffizienz, sowie Bluthochdruck und den Folgen der Atherosklerose.
Das Herz benötigt als unablässig arbeitender Hohlmuskel zur Deckung seines Ener- 10 giebedarfs eine besonders intensive Versorgung mit Sauerstoff. Versorgungsstörungen betreffen daher in erster Linie den Sauerstofftransport, der bei verminderter Anpassungsfähigkeit der Durchblutung unzureichend sein kann. Eine Steigerung des Sauerstoffverbrauchs kann nur durch eine Zunahme der Herzdurchblutung abgedeckt werden. 15
Bei koronaren Herzkrankheiten wie stabile und instabile Angina pectoris, Herzinsuffizienz, Myokardinfarkt, plötzlichem Herztod, sowie den Folgen der Atherosklerose ist eine ausreichende Durchblutung von Teilen des Herzgewebes nicht mehr gewährleistet und es kommt zu Gewebsischämien, die zu Nekrose und Apoptose in den 20 betroffenen Arealen fuhren. Dadurch kommt es zu einer myokardialen Dysfunktion, die sich bis zur Herzinsuffizienz hin entwickeln kann.
Therapieverfahren und Wirkstoffe, die die koronare Durchblutung und somit das Sauerstoffangebot verbessern, aber auch solche, die den Sauerstoffverbrauch senken, 25 sind zur Behandlung von Symptomen der oben genannten Erkrankungen geeignet.
Dazu gehören die Dilatation größerer Koronargefäße, die Senkung der extravasalen Komponente des Koronarwiederstandes, die Senkung der intramyokardialen Wandspannung und die Dilatation der arteriolären Widerstandsgefäße in der systemischen 30 Zirkulation. Substanzen und Verfahren, die zu einer Erhöhung des Koronarflusses im Herzen und/oder zu einer Blutdrucksenkung führen, können therapeutisch genutzt werden (Forth, Henschler, Rummel; Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie; Urban & Fischer Verlag (2001), München).
Die oben beschriebenen Wirkungen können über die Stimulation von G-Protein-ge- koppelte Rezeptoren gesteuert werden. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind 7- transmembran-Domänen Proteine, deren Aktivierung zur Aktivierung verschiedener G-Proteine führen. Diese aktivierten G-Proteine wiederum können verschiedene weitere Signalsysteme aktivieren oder inaktivieren und somit zur Induktion der oben beschriebenen Mechanismen führen. Bei den G-Proteinen unterscheidet man zwischen Gas (Adenylylcyclase aktivierend), Gαi (Adenylylcyclase inhibierend) und Gαq (Zunahme IP3).
Die DNA-Sequenz, die für den humanen APJ-Rezeptor kodiert, wird im Sequenzprotokoll in der SEQ ID NO: 1 gezeigt. Die Aminosäuresequenz des humanen APJ- Rezeptor wird in der SEQ ID NO:2 des Sequenzprotokolls gezeigt. Der APJ-Rezeptor ist ein Gαi gekoppelter Rezeptor (O'Dowd et al., Gene, 136 (1993) 355-360), der unter anderem durch seinen natürlichen Liganden Apelin (Tatemoto et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 251 (1998) 471-476) aktiviert wird. Der Rezeptor zeigt eine
Homologie von 30% zum ATl-(Angiotensin) Rezeptor, wird aber nicht durch Angio- tensin aktiviert.
Der APJ-Rezeptor der Ratte (beschrieben in WO0068250) und der Maus (beschrie- ben in WO0068244) wird ubiquitär in vielen Regionen des Gehirns und in anderen
Geweben exprimiert (Hosoya et al., The Journal of Biological Chemistry, 275 (2000) 21061-21067; O'Carroll et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1492 (2000) 72-80). Im Menschen ist die Expression des Rezeptors in Milz, Thymus, Prostata, Testis und im Verdauungstrakt beschrieben (Edinger et al., Journal of Virology, 72 (1998) 7934-7940). Überraschenderweise wurde nun in der quantitativen Analyse der APJ-Rezeptor- mRNA-Expression im Menschen gefunden, dass die Expression des Rezeptors auf wenige Gewebe beschränkt ist und eine deutliche Expression des Rezeptors im humanen Herzen vorhanden ist (Abbildung 1). Es wurde außerdem gefunden, dass der APJ-Rezeptor sowohl in gesundem als auch in DCM-Herzen (DCM=dilative
Kardiomyopathie) vorkommt (Abbildung 2). Da die Expression des humanen APJ- Rezeptors im erkrankten Herzen eine Bedingung für den Einsatz von Wirkstoffen zur Stimulation des Rezeptors in Patienten mit koronaren Herzkrankheiten ist, schafft dieses Ergebnis die Voraussetzung für einen neuen Therapieansatz. Eine Abnahme der Rezeptor-Expression, wie sie z.B. für den ßl-Adrenorezeptor bei Herzinsuffizienz bekannt ist (Chakraborti et al., Cellular Signaling, 12 (2000) 499-513), würde bedeuten, dass eine therapeutische Stimulation ausgeschlossen ist.
Bekannt ist, dass die systemische Gabe des natürliche Liganden Apelin in der Ratte zu einer Blutdrucksenkung ohne Änderung der Herzfrequenz fuhrt (Lee eta al., Journal of Neurochemistry, 74 (2000) 34-41; Tatemoto et al., Regulatory Peptides 99 (2001) 87-92). Die direkte Applikation des Liganden ins Gehirn der Ratte bewirkt eine Inhibition der Wasseraufnahme bei dehydrierten Ratten ohne einen Effekt auf den Blutdruck zu haben (Reaux et al., Journal of Neurochemistry, 77 (2001) 1085- 1096). Demnach scheint die Blutdrucksenkung durch eine direkte Stimulation des
Rezeptors in Gefäßen ausgelöst zu werden.
Überraschenderweise bewirkt die systemische Gabe von Apelin, sowohl als Bolus, als auch als permanente Infusion, im Hund eine konzentrationsabhängige, sehr deut- liehe Koronarflusserhöhung ohne Änderung der Herzfrequenz (Abbbildung 3, 4).
Diese Koronarflusserhöhung geht weit über das reflektorische Maß der ebenfalls beobachteten Blutdrucksenkung hinaus.
Aufgrund dieses neuen Ergebnis kamen wir zu dem Schluss, dass Substanzen, die den APJ-Rezeptors stimulieren, wegen der daraus resultierenden Erhöhung des
Koronarflusses, zur Behandlung und/oder Prophylaxe von stabiler und instabiler Angina pectoris, akutem Myokardinfarkt, Myokardinfarktprophylaxe, Herzinsuffizienz, plötzlichem Herztod, sowie Bluthochdruck und den Folgen der Atherosklerose beim Menschen eingesetzt werden können.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher die Verwendung von APJ-Rezeptor-Agonisten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder der Prophylaxe der oben genannten Krankheiten.
Agonisten im Sinne der Erfindung sind alle Substanzen, die eine Stimulation der biologischen Aktivität des Rezeptors bewirken. Besonders bevorzugte Agonisten sind Nukleinsäuren inklusive „locked nucleic acids", „peptide nucleic acids" und „Spiegelmere", Proteine inklusive Antikörper und niedermolekulare Substanzen, ganz besonders bevorzugte Agonisten sind niedermolekulare Substanzen.
Die Stimulation kann z.B. im unten beschriebenen APJ-Stimulationstest gemessen werden. Dabei liegt eine Stimulation des APJ-Rezeptors vor, wenn in dem Test eine mindestens 10 %ige Abnahme eines, durch Stimulation der Adenylatzyklase, erhöhten cAMP-Spiegels gemessen wird, wobei die Stimulation unter anderem durch Forskolin oder über adrenerge Rezeptoren erfolgen kann.
APJ-Rezeptor-Agonisten können an rekombinanten Zelllinien, die den humanen APJ-Rezeptor enthalten getestet werden.
Dabei werden solche APJ- Agonisten bevorzugt, die im unten angegebenen APJ-Sti- mulationstest mit einem EC5Q von 1 μM, bevorzugt weniger als 0,1 μM aktivieren.
Vorzugsweise können die erfindungsgemäßen APJ-Rezeptor-Agonisten die Blut/Hirn Schranke nicht passieren und wirken systemisch und nicht zentral. Kurzbeschreibung der Abbildungen:
1.) Relative Expression des humanen APJ-Rezeptors in humanem Gewebe
2.) Vergleich der relativen Expression des humanen APJ-Rezeptors in gesundem und DCM- (dilative Kardiomyopathie) Herzgewebe
3.) Wirkung der in vivo Gabe von Apelin als Bolus auf Blutdruck (BD), Herzfrequenz (HF) und Koronarfluss am Hund
4.) Wirkung der Infusion verschiedener Apelin-Konzentrationen über 10 Minuten auf Blutdruck (BD), Herzfrequenz (HF) und Koronarfluss am Hund
APJ-Stimulationstest
Die Wirkung des Apelins und anderer möglicher APJ- Agonisten wird an einer CHO Zelllinie getestet, die den kompletten offenen Leserahmen des humanen Rezeptorgens als rekombinantes Protein stabil exprimiert. Bei Aktivierung dieser Zelllinie mit Forskolin erhöht sich der interne cAMP-Spiegel. Dieser Anstieg kann durch gleich- zeitige oder vorherige Gabe von Apelin über die Stimulation des rekombinant exprimierten APJ-Rezeptors und die daraus resultierende Inhibition der Adenylylcyclase verhindert werden.
1500 CHO Zellen/Loch werden auf 384-Loch Platten (Greiner) in DMEM Medium (Gibco) mit 10 % FCS (fötales Kälberserum, Gibco) ausgesät und 2 Tage bei 37°C und 5 % CO2 kultiviert. Die Zellen werden mit Apelin- Verdünnungen (Verdünnungsreihen typischerweise von 10"13-10"7 M) inkubiert und anschließend mit 10"5 M Forskolin stimuliert. Der cAMP-Spiegel wird mit Hilfe des „cAMP Screen Kits" [Tropix (PE Biosystems)] gemäß der Anleitung bestimmt und die Wirkung von Apelin als prozentuale Inhibition der maximalen cAMP-Erhöhung nach Stimulation mit Forskolin dargestellt. Der ECso-Wert der Wirkung von Apelin ist der Wert bei dem 50 % des Forskolinsignals inhibiert werden.
Für Apelin wird ein EC50-Wert von 10"n M bestimmt.
Untersuchungen der APJ-Rezeptor-Expression beim Menschen
Die relative Expression des APJ-Rezeptors in humanen Geweben wird durch die Quantifizierung der mRNA mittels der Echtzeit-Polymerasekettenreaktion ermittelt (sog. TaqMan-PCR, Heid et al., Genome Res 6 (10), 986-994). Gegenüber der klassischen PCR bietet die Echtzeit-PCR den Vorteil einer genaueren Quantifizierung durch Einführung eines zusätzlichen, fluoreszenzmarkierten Oligonucleotides. Diese sogenannte Sonde enthält am 5 '-Ende den Fluoreszenzfarbstoff FAM (6-Carboy- Fluorescein) und am 3 '-Ende den Fluoreszenzquencher TAMRA (6-Carboxy-tetra- methylrhodamin). Während der Polymerasekettenreaktion wird in der TaqMan-PCR durch die 5'-Exonukleaseaktivtät der Taq-Polymerase der Fluoreszenzfarbstoff FAM von der Sonde abgespalten und dadurch das vorher gequenchte Fluoreszenzsignal erhalten. Als sog. Schwellenwert [treshold cyle (Ct-Wert)] wird die Zyklenzahl aufgezeichnet, bei der die Fluoreszenzintensität ca. 10 Standardabweichungen über der Hintergrund-Fluoreszenz liegt.
Als Ausgangsmaterial für die PCR wird käuflich erworbene zelluläre Gesamt-RNA verwendet (Fa. Clontech). Im Falle der humanen Herzen werden kleine Stücke (ca. 0,5 g) explantierter Herzen von Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie (erhalten vom Deutschen Herzzentrum Berlin) und die Gesamt-RNA hieraus mittels RNaesy-
Säulen (Fa. Qiagen) gemäß der Anleitung isoliert. Je 1 μg Gesamt-RNA je Gewebe wird zur Entfernung von Kontaminationen genomischer DNA mit 1 Einheit DNase I (Fa. Gibco) für 15 min bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Inaktivierung der Dnase I erfolgt durch Zugabe von 1 μl EDTA (25 mM) und nachfolgendes Erhitzen auf 65°C (10 min). Anschließend wird im selben Reaktionsansatz die cDNA-Synthese gemäß der Anleitung zum „SUPERSCRΓPT-II RT cDNA synthesis kit" (Fa. Gibco) durchgeführt und das Reaktionsvolumen mit destilliertem Wasser auf 200 μl aufgefüllt. Für die PCR wird zu je 5 μl der verdünnten cDNA-Lösung 7,5 μl Gemisch von Primer und Sonde sowie 12,5 μl TaqMan-Reaktionslösung [Universal Master Mix (Fa. Applied
Biosytems] gegeben. Die Endkonzentration der Primer ist jeweils 300 nM, die der Sonde 150 nM. Die Sequenz des „forward"- und „reverse"-Primers für den APJ- Rezeptor lautet: 5'-TCCCAGGAGTAAAAGCCAAGC-3' bzw. 5'- CCTTCAAGGGTCCTGTCAGC-3', die Sequenz der fluoreszierenden Sonde 5'- 6FAM-AGAGGTTGTTTTTGCCAAGAATCACAGAATGTTA-TAMRA-3'. Die
PCR erfolgt auf einem ABI-Prism-SDS-7700-Gerät (Fa. Applied Biosystems) gemäß der Anleitung des Herstellers. Dabei werden 40 Zyklen durchgeführt. Der Ct-Wert (s. o.) der für den APJ-Rezeptor für jedes Gewebe erhalten wird, entspricht dem Zyklus, in dem die Fluoreszenzintensität der freigesetzten Sonde das lOfache des Hinter- grundsignals erreicht. Je niedriger der Ct-Wert, umso früher beginnt also die Vervielfältigung, d. h. je mehr mRNA ist in der ursprünglichen Probe enthalten. Zum Ausgleich eventueller Schwankungen bei der cDNA-Synthese wird in allen untersuchten Geweben auch die Expression eines sog. „Haushaltsgenes" analysiert. Dieses sollte in allen Geweben ungefähr gleich stark exprimiert werden. Für die Normierung der APJ-Rezeptor-Expression wird hierfür ß-Actin verwendet. Die Sequenz des „forward"- bzw. „reverse" Primers für ß-Actin ist 5'-TCCACCTTCCAGCAGATGTG- 3' , und 5'-CTAGAAGCATTTGCGGTGGAC-3' die Sequenz der Sonde 5'-6FAM- ATCAGCAAGCAGGCAGTATGACGAGTCCG-TAMRA-3'. Die Auswertung der Daten erfolgt durch die sog. dCt-Methode entsprechend der Anleitung zum ABI Prism SDS 7700 (Fa. Applied Biosystems). Für die graphische Darstellung der Gewebeverteilung des APJ-Rezeptors wird das Gewebe mit der niedrigsten relativen Expression willkürlich gleich 1 gesetzt (Abbildung 1) und alle anderen Gewebe hierauf normiert. Ausgenommen aus der Darstellung sind Gewebe mit einem Ct-Wert >35. Für die Analyse der Expression des APJ-Rezeptors in den Herzen wird der Mit- telwert der relativen Expression aus den gesunden Kontrollherzen = 1 gesetzt und mit dem Mittelwert aus den DCM-Herzen verglichen (Abbildung 2). Die Expressionsdaten des APJ-Rezeptors im Menschen zeigen, dass der Rezeptor im Herzen einen Ct-Wert von 31,64 aufweist, was einer mittleren Expression des Rezeptors im Herzen entspricht. Der Vergleich der mRNA Menge in gesundem und DCM-Gewebe zeigt, dass es keine signifikante Abnahme der Rezeptorexpression in DCM-Herzen gibt, somit eine Stimulation des Rezeptors durch Agonisten auch bei Patienten mit koronaren Herzkrankheiten therapeutisch genutzt werden kann.
In vivo Untersuchungen der Stimulation des APJ-Rezeptors durch Apelin
Erwachsene FBI- (Foxhound-Beagle-Irish-Setter) Hunde (20-30kg) werden initial mit Thiopental-Na (Trapanal, Byk-Gulden) 20-30 mg/kg i.v. narkotisiert. Zur Muskelrelaxation wird Alcuroniumchlorid (Alloferin, Röche) initial 0,1 mg/kg i.v. gegeben. Die Tiere werden inhibiert und mit einem Gemisch aus O2/N2O 1/3 mit einer Engström- Atempumpe mit 15-18 Atemzügen pro min und einem Volumen von
18-24 ml/kg beatmet. Die genaue Einstellung der Beatmung wird nach dem arteriellen CO2-Partialdruck durchgeführt, wobei ein mittlerer pCO2 von 35 - 45 mmHg eingehalten wird. Die Erhaltungsanästhesie wird mit Isofluran (Baxter) 1,5 -3 % gemacht. Die Körpertemperatur wird bei 38°C ± 0,1°C gehalten. Der arterielle Blutdruck wird über einen Katheder in der Femoralarterie gemessen. Es wird eine Thorakotomie auf der linken Seite am fünften Intercostalraum durchgeführt. Die Lunge wird zurückgelegt, fixiert und das Pericard eingeschnitten. Ein proximaler Abschnitt der LAD (linke Koronararterie) distal zur ersten diagonalen Verzweigung wird freipräpariert und ein kalibrierter, elektromagnetischer Flussmess- köpf (Gould Statham, Modell SP7515) um das Gefäß gelegt und mit einem Fluss- messgerät (Statham, Modell SP-2202) verbunden. Ein mechanischer Okkluder wird distal zum Flussmesskopf so angebracht, dass keine Verzweigungen zwischen Fluss- messkopf und Okkluder liegen.
Blutentnahmen und Substanzgaben werden durch einen Katheder in der Femoralvene durchgeführt. Ein peripheres EKG wird mit subcutan verankerten Nadeln abgeleitet. Ein Mikrotip-Druckmanometer (Millarmodel PC-350) wird durch den linken Vorhof geschoben um den linksventrikulären Druck zu messen. Die Messung der Herzfrequenz wird über die R-Zacke des EKGs gesteuert. Die hämodynamischen Parameter und der Koronarfluss werden während des gesamten Versuchs über einen Vielfach- Schreiber aufgezeichnet.
Nach einer Stabilisierungszeit von einer Stunde wird das Experiment begonnen. Es werden entweder 10 μg/kg Apelin in physiologischer Kochsalzlösung als i.v. Bolus injiziert oder verschiedene Apelin Konzentrationen (1, 3, 5, 10 μg/kg/min) über 10 min infundiert. Herzfrequenz, Blutdruck und Koronarfluss werden registriert und ausgewertet.
Sowohl die Gabe als Bolus, als auch die Infusion von Apelin bewirkt eine signifikante Steigerung des Koronarflusses am Hund, trotz einer Senkung des Blutdrucks (Abbildung 3). Die Infusion von Apelin zeigt eine dosisabhängige Zunahme des
Koronarflusses, wobei das Maximum bei 3 μg/kg/min erreicht ist (Abbildung 4).
AP J-Rezeptor-Agonist Formulierungen
Die APJ-Rezeptor-Agonisten können in bekannter Weise in die üblichen Formulierungen überführt werden, wie Tabletten, Dragees, Pillen, Granulate, Aerosole, Sirupe, Emulsionen, Suspensionen und Lösungen, unter Verwendung inerter, nicht toxischer, pharmazeutisch geeigneter Trägerstoffe oder Lösungsmittel. Hierbei soll die therapeutisch wirksame Verbindung jeweils in einer Konzentration von 0,5 bis 90 Gew.-% der Gesamtmischung vorhanden sein, d.h. in Mengen, die ausreichend sind, um den angegebenen Dosierungsspielraum zu erreichen.
Die Formulierungen werden beispielsweise hergestellt durch Strecken der Wirkstoffe mit Lösungsmitteln und/oder Trägerstoffen, gegebenenfalls unter Verwendung von Emulgiermitteln und/oder Dispergiermitteln, wobei z.B. im Fall der Benutzung von Wasser als Verdünnungsmittel gegebenenfalls organische Lösungsmittel als Hilfslösungsmittel verwendet werden können.
Die Applikation erfolgt in üblicher Weise, vorzugsweise oral, transdermal, intrave- nös oder parenteral, insbesondere oral oder intravenös. Sie kann aber auch durch Inhalation über Mund oder Nase, beispielsweise mit Hilfe eines Sprays erfolgen, oder topisch über die Haut.
Im Allgemeinen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, Mengen von etwas 0,001 bis 10 mg/kg, bei oraler Anwendung vorzugsweise etwa 0,005 bis 3 mg/kg Körpergewicht zur Erzielen wirksamer Ergebnisse zu verabreichen.
Trotzdem kann es gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen abzuweichen, und zwar in Abhängigkeit vom Körpergewicht bzw. der Art des Applikati- onsweges, vom individuellen Verhalten gegenüber dem Medikament, der Art von dessen Formulierung und dem Zeitpunkt bzw. Intervall, zu welchen die Verabreichung erfolgt. So kann es in einigen Fällen ausreichend sein, mit weniger als der vorgenannten Mindestmenge auszukommen, während in anderen Fällen die genannte obere Grenze überschritten werden muss. Im Falle der Applikation größerer Mengen kann es empfehlenswert sein, diese in mehreren Einzelgaben über den Tag zu verteilen.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von APJ-Rezeptor-Agonisten zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung und/oder Prophylaxe von koronaren Herzkrankheiten, Bluthochdruck und den Folgen der Atherosklerose.
2. Verwendung von Anspruch 1, wobei die koronaren Herzkrankheiten, stabile und instabile Angina pectoris, akuter Myokardinfarkt, Myokardinfarktpro- phylaxe, plötzlicher Herztod und Herzinsuffiziens sind.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der APJ-Rezeptor-Agonist einen ECso-Wert von weniger als 1 μM hat.
4. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der humane APJ-Rezeptor-Ago- nist einen ECso-Wert von weniger als 100 nM hat.
- 1/5
Abbildung 1
Expression des APJ-Rezeptors in humanen Geweben
(normiert auf ß-Actin, niedrigste Expression willkürlich = 1 gesetzt)
0,00 20,00 40,00 60,00 80,00 100,00 120,00
Relative Expression -2/5
Abbildung 1 (fortgesetzt)
3/5
Abbildung 2
Expression des APJ Rezeptors in gesunden
4/5
Abbildung 3
Effekte der APJ Rezeptor Aktivierung durch Apelin am Hund
Bolusinfusion von 10 μg/kg i.v. Apelin im Hund
10 20 30 mm.
10 20 30 min.
10 20 30 min. 5/5 -
Abbildung 4
Effekte der APJ-Rezeptor Aktivierung durch
Apelin im Hund
8 12 16 20
8 12 16 20
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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7947280B2 (en) * 2003-05-22 2011-05-24 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Apelin and uses thereof
EP1520861A1 (de) * 2003-09-11 2005-04-06 Aventis Pharma Deutschland GmbH Testsystem zur Identifikation von APJ Rezeptorliganden
US20050112701A1 (en) * 2003-09-11 2005-05-26 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Test system for the identification of APJ receptor ligands
WO2005106493A1 (en) * 2004-04-30 2005-11-10 Bayer Healthcare Ag Diagnostics and therapeutics for diseases associated with g protein-coupled apelin receptor (apj)
WO2006019193A1 (ja) * 2004-08-20 2006-02-23 Takeda Pharmaceutical Company Limited 阻害剤・促進剤の用途
US20090324610A1 (en) * 2006-04-25 2009-12-31 Kyushu Univeristy, National University Corporation Gene associated with arteriosclerotic disease, and use thereof
US9381229B2 (en) 2011-11-28 2016-07-05 Inserm (Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale) Pharmaceutical composition for use in the treatment of dysfunction associated with aging
US9353163B2 (en) 2013-03-14 2016-05-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Apelin fusion proteins and uses thereof
WO2015077491A1 (en) 2013-11-20 2015-05-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Aplnr modulators and uses thereof
HUE050317T2 (hu) 2015-05-20 2020-11-30 Amgen Inc APJ receptor triazol agonistái
US9988369B2 (en) 2016-05-03 2018-06-05 Amgen Inc. Heterocyclic triazole compounds as agonists of the APJ receptor
WO2018093576A1 (en) 2016-11-16 2018-05-24 Amgen Inc. Alkyl substituted triazole compounds as agonists of the apj receptor
US10736883B2 (en) 2016-11-16 2020-08-11 Amgen Inc. Triazole furan compounds as agonists of the APJ receptor
US11046680B1 (en) 2016-11-16 2021-06-29 Amgen Inc. Heteroaryl-substituted triazoles as APJ receptor agonists
WO2018093577A1 (en) 2016-11-16 2018-05-24 Amgen Inc. Cycloalkyl substituted triazole compounds as agonists of the apj receptor
EP3541803B1 (de) 2016-11-16 2020-12-23 Amgen Inc. Triazolpyridylverbindungen als agonisten des apj-rezeptors
WO2018093579A1 (en) 2016-11-16 2018-05-24 Amgen Inc. Triazole phenyl compounds as agonists of the apj receptor
MA50509A (fr) 2017-11-03 2021-06-02 Amgen Inc Agonistes de triazole fusionnés du récepteur apj
US11807624B2 (en) 2018-05-01 2023-11-07 Amgen Inc. Substituted pyrimidinones as agonists of the APJ receptor
CN110655577A (zh) * 2018-06-13 2020-01-07 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 APJ抗体及其与Elabela的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20010033601A (ko) * 1997-12-24 2001-04-25 다케다 야쿠힌 고교 가부시키가이샤 폴리펩티드, 그의 제법 및 용도
AU1797100A (en) * 1998-12-11 2000-07-03 Takeda Chemical Industries Ltd. Process for producing apelin

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
None *
See also references of WO03013576A1 *

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Publication number Publication date
DE10138569A1 (de) 2003-04-30
US20050075275A1 (en) 2005-04-07
CA2456223A1 (en) 2003-02-20
WO2003013576A1 (de) 2003-02-20
JP2004537582A (ja) 2004-12-16

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