EP1407041A1 - Procede d'obtention d'une preparation titree d'algues et les preparations titrees en resultant - Google Patents

Procede d'obtention d'une preparation titree d'algues et les preparations titrees en resultant

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Publication number
EP1407041A1
EP1407041A1 EP02767558A EP02767558A EP1407041A1 EP 1407041 A1 EP1407041 A1 EP 1407041A1 EP 02767558 A EP02767558 A EP 02767558A EP 02767558 A EP02767558 A EP 02767558A EP 1407041 A1 EP1407041 A1 EP 1407041A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
calcium
cells
estradiol
titrated
fixation
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02767558A
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German (de)
English (en)
Inventor
Gilles Gutierrez
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
PATRINOVE CIVILE Ste
Texinfine SA
Original Assignee
PATRINOVE CIVILE Ste
Texinfine SA
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Filing date
Publication date
Application filed by PATRINOVE CIVILE Ste, Texinfine SA filed Critical PATRINOVE CIVILE Ste
Publication of EP1407041A1 publication Critical patent/EP1407041A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K36/00—Medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicines
    • A61K36/02—Algae
    • A61K36/03—Phaeophycota or phaeophyta (brown algae), e.g. Fucus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/946—Microorganisms using algae

Definitions

  • the present invention relates to the field of chemistry and more particularly to that of plant chemistry.
  • the method according to the invention consists in preparing a suspension of a human or animal bone cell line by adjusting the cell density determined by turbidimetry or by counting to a reference value, to be incubated for one to three days at 37 °. C in the presence of carbon dioxide and complete culture medium (MCC), to add wells of an agent which inhibits calcium fixation or of a calciotropic hormone, and of the extract to be titrated, to remove the supernatants from culture, rinse the wells with a rinsing medium without calcium or magnesium (PBS for example) so as to remove from the culture medium, the non-fixed calcium, to eliminate the supernatants, and to adjust the volume of the dispersion with a determined volume of mineral acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid or perchloric acid or any other product capable of destroying the extra cellul matrix area developed by cells in culture.
  • MCC carbon dioxide and complete culture medium
  • PBS rinsing medium without calcium or magnesium
  • the calcium dosage is an easy to determine activity indicator.
  • Calcium fixation by osteoblasts or cells of a cell line is dependent on calciotropic agents activating calcium fixation (estradiol, vitamins D3, calcitonin) or deleterious agents on calcium fixation such as inhibitors of calcium channels (verapamil, cinchonine or diltiazem), pro-inflammatory cytokines: prostaglandins, interleukins, PAF ...
  • the extracts or powders of the alga Padina pavonica have an activity of stimulation of the biological activity (synthesis of proteins and glycoaminoglycans) but also intervene to restore physiological functions like the fixing of calcium by the osteogenic cells.
  • the fixed calcium is measured by a determined cell line, such as for example the UMR 106 cell line or the G 292 line, in the presence or not of deleterious agents such as calcium channel blockers and pro-inflammatory agents such as IL 1.
  • deleterious agents such as calcium channel blockers and pro-inflammatory agents such as IL 1.
  • Normal osteoblasts give good results, their availability poses a problem.
  • the preparation to be analyzed is tested in parallel on the same cell line, whether or not these same deleterious agents are present.
  • the quantity of calcium fixed is compared with that obtained with the calciotropic agent and with those obtained in the presence of agents which inhibit calcium fixation.
  • the active molecules of the alga Padina pavonica retain their property of improving the fixation of calcium by bone cells, even in the presence of a calcium channel blocker or an inflammatory agent such as interleukin LL-1.
  • the extract of Padina pavonica has one or more active ingredients, the mode of action of which is different from that of known substances which are not capable of improving the fixation of calcium in the presence of a calcium channel blocker.
  • the difficulty of the situation comes from the fact that the alga presents a very variable activity according to the season, the growth, the stage of development of the plant, the depth, the luminosity and that the technician or the final consumer wishes to have a constant activity product. It is therefore necessary to produce an extract under conditions such that it is possible to overcome variations in active principles in the plant, and the problems which arise are: what should be the activity of the extract and how to obtain a title product still constant?
  • the object of the present invention is to solve the technical problem set out above.
  • the harvesting of plants, their treatment and the manufacture of stabilized extract require the dosage of the activity in the treated materials.
  • the collection of the plant must be done while the content of active ingredient is optimal and it is necessary to determine the moment.
  • the conservation of plants before their treatment, the extraction of crude oil, the manufacture of the extract require an analytical method to quantify the activity of the material.
  • the isomerism is supported by functional groups, it is possible to assay the functional groups and these support all and the exclusivity of the activity of the active ingredients.
  • the subject will be illustrated by citing the dosage of senna anthraquinones, alkaloids, etc.
  • anomalies in correlation between chemical analysis and biological activity have been observed many times, due to the multiplicity of active principles of unequal level of activity.
  • the analysis will be more delicate and will have to call on the development of characteristic structural elements by spectrophotometry, or call on characteristic reactions such as the coloring of the functions likely to be representative of the molecular family sought.
  • characteristic reactions such as the coloring of the functions likely to be representative of the molecular family sought.
  • the double bond must be functionalized by fixing a reaction function. On this function, it will be possible to fix a chromophore group, by a coupling reaction (fluorescein isothiocyanate for example). It is also possible to use mass spectrometry but it should be remembered that this technique is destructive. It is therefore not possible to recheck the activity of the isolated fraction.
  • vitamins such as vitamin A, vitamin E, antibodies, antigens, certain hormones such as insulin, FSH, GH, cytokines like interferon, TNF ...
  • This technique is mainly applied to dosages that would be impossible chemically.
  • vitamins A and E illustrates this point well since they exist in the form of numerous isomers.
  • the assay of biological activity poses the problem of the stability of normal cells or cell lines.
  • the signal analyzed can vary according to operational criteria which are impossible to specify in many cases.
  • the authors are confronted with the variability of the cell response. It is therefore necessary to calibrate the response of the strain against a reference system.
  • This system does not give a good answer in the important case, because it turns out that Padina is the only known plant capable of inducing a response on calcium fixation in the presence of a calcium channel blocker (Inh-Ca) and in the presence of an inflammatory agent such as IL-1. All the other substances tested to date cannot restore calcium fixation in the presence of a calcium channel blocker (Inh-Ca).
  • the material to be tested is dosed on cell culture.
  • the calcium fixed by the bone cells is analyzed.
  • the fixed calcium is measured by an osteoblastic cell line.
  • UMR 106, G292 may be cited, in the presence or absence of deleterious agents such as Inh-Ca and IL-1.
  • the preparation to be analyzed will also be tested, on the same cell line in the presence or absence of agents such as Inh-Ca and IL-1.
  • the fixed calcium is measured by the same cell line in the presence of estradiol and a calibration scale is established, expressed by weight of estradiol.
  • This calibration scale ranges from 10 "3 to 10 " 10 mol of estradiol or more frequently between 10 "7 and 10 " 9 mol of estradiol.
  • a correlation can be established between the activity of the extract of Padina and an active amount of estradiol. It should be emphasized that this comparison is made between the activity of estradiol directly on cell culture with the active ingredient extracted from Padina in the presence of deleterious agents such as Inh-Ca or IL-1. So it is not really a weight comparison and we propose to express the result in Unit of Activity (AU).
  • AU Unit of Activity
  • a unit of activity is defined as the quantity of extract capable of increasing by 50% the quantity of calcium fixed by 400,000 cells cultured for 48 hours in the presence of ingestion of interleukin 1 per well of 1 ml.
  • IL-1 can be replaced by another agent that inhibits calcium fixation at an equiactive dose.
  • Padine extracts have been described, in particular in European patent application EP 0.655.250.
  • the algae is exhausted after drying, with a hydrocarbon solvent such as cyclohexane or acetone, separation of the plant material, filtration then evaporation to dryness of the extraction product. An exactly weighed amount of dry extract is then dissolved in ethanol. The determination of its activity is the subject of the present invention.
  • the method according to the invention consists in preparing a culture suspension of the human cell line G292 (ECAC n ° 901-1 10522) by adjusting the cell density to 400,000 cells per ml of complete culture medium (MCC), supplemented with 10% fetal calf serum.
  • MCC complete culture medium
  • the cell suspension is distributed at a rate of 1 ml per well on 24-well plates. It is left to incubate under a CO 2 atmosphere overnight at 37 ° C. The supernatants are separated and then diluted with a new addition of MCC.
  • An aliquot of IL-1 is prepared and 5 ⁇ l of interleukin IL-1 solution are added, ie 1 ng per well in the wells for the cells which receive only an inhibitor treatment with IL-1.
  • FIG 1 shows schematically the results obtained under these conditions.
  • Cells treated only with interleukin IL-1 exhibit a level of activity which is much lower than that of control cells.
  • the cells treated with IL-1 and the padin extract have an activity close to that of the control.
  • FIG. 2 shows schematically the results obtained.
  • 240 ng of extract have a title of one unit EXAMPLE III
  • FIG. 4 shows schematically the results obtained.
  • Activity data are compared using statistical tests to compare two means and two standard deviations (Student's test). The results are all statistically significant. Examples 1 to 5 show the agreement of the results obtained by the process according to the invention with the results obtained by biological means and the tests in human clinic. The few differences observed (240 ng for 272 ng / ml of estradiol) are mainly due to the uncertainty of the measurements necessary for the evaluation of a biological process.

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Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé d'obtention de poudres ou d'extraits de l'algue Padina pavonica, titrés en principes actifs par l'intermédiaire d'un coefficient d'équivalence avec l'estradiol, qui consiste à doser l'extrait ou la poudre de Padina pavonica à l'aide d'une méthode dans laquelle on cultive des ostéoblastes dans un milieu de culture riche en ions calcium, on analyse le calcium fixé par les cellules de la matrice extracellulaire en présence ou en l'absence d'agents antagonistes de la fixation du calcium et on exprime les résultats soit en unités arbitraires ou intemationales par rapport à un étalon de référence, soit par référence avec l'activité connue de doses déterminées d'estradiol ou de tout autre agent favorisant la fixation du calcium.

Description

PROCEDE D'OBTENTION D'UNE PREPARATION TITREE D'ALGUES ET LES PREPARATIONS TITREES EN RESULTANT
La présente invention se rapporte au domaine de la chimie et plus particulièrement à celui de la chimie végétale.
Elle a plus précisément pour objet un nouveau procédé d'obtention d'une préparation à base d'algues titrée en principes actifs assurant la fixation du calcium par les cellules osseuses.
Elle a spécifiquement pour objet un procédé d'obtention de poudres ou d'extraits de l'algue Padina pavonica, titrés en principes actifs par l'intermédiaire d'un coefficient d'équivalence avec î'estradiol, qui consiste à doser l'extrait ou la poudre de Padina pavonica à l'aide d'une méthode dans laquelle on cultive des ostéoblastes dans un milieu de culture riche en ions calcium, on analyse le calcium fixé par les cellules de la matrice extracellulaire en présence ou en l'absence d'agents antagonistes de la fixation du calcium et on exprime les résultats soit en unités arbitraires ou internationales par rapport à un étalon de référence, soit par référence avec l'activité connue de doses déterminées d' estradiol ou de tout autre agent favorisant la fixation du calcium.
Plus précisément le procédé selon l'invention consiste à préparer une suspension d'une lignée cellulaire osseuse humaine ou animale en ajustant la densité cellulaire déterminée par turbidimétrie ou par comptage à une valeur de référence, à laisser incuber pendant un à trois jours à 37° C en présence de gaz carbonique et de milieu de culture complet (MCC), à additionner des puits d'un agent inhibiteur de la fixation du calcium ou d'une hormone calciotrope, et de l'extrait à titrer, à éliminer les surnageants de culture, à rincer les puits avec un milieu de rinçage sans calcium ni magnésium (P.B.S. par exemple) de façon à éliminer du milieu de culture, le calcium non fixé, à éliminer les fractions surnageantes, et à ajuster le volume de la dispersion avec un volume déterminé d'acide minéral comme l'acide chlorhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique ou l'acide perchlorique ou de tout autre produit susceptible de détruire la matrice extra cellulaire élaborée par les cellules en culture. Pour finir on ajuste le mélange et on dose le calcium, par exemple selon la norme AFNOR n° NT-690.005. Le dosage du calcium constitue un indicateur d'activité facile à déterminer. La fixation du calcium par les ostéoblastes ou les cellules d'une lignée cellulaire est sous la dépendance d'agents calciotropes activant la fixation du calcium (estradiol, vitamines D3, calcitonine) ou d'agents délétères sur la fixation du calcium comme les inhibiteurs des canaux calciques (vérapamil, cinchonine ou diltiazem), les cytokines pro-inflammatoires : prostaglandines, interleukines, PAF...
Les extraits ou les poudres de l'algue Padina pavonica présentent une activité de stimulation de l'activité biologique (synthèse des protéines et des glycoaminoglycanes) mais aussi interviennent pour restaurer des fonctions physiologiques comme la fixation du calcium par les cellules ostéogéniques. Pour cela, on dose le calcium fixé par une lignée cellulaire déterminée, comme par exemple la lignée cellulaire UMR 106 ou la lignée G 292, en présence ou non d'agents délétères comme les inhibiteurs des canaux calciques et les agents pro- inflammatoires comme IL 1. Les ostéoblastes normaux donnent de bons résultats, leur disponibilité pose problème. La préparation à analyser est testée en parallèle sur la même lignée cellulaire, en présence ou non de ces mêmes agents délétères. On compare la quantité de calcium fixée par rapport à celle obtenue avec l'agent calciotrope et avec celles obtenues en présence d'agents inhibiteurs de la fixation du calcium.
En effet, on a constaté que les molécules actives de l'algue Padina pavonica (MAPP) conservaient leur propriété d'amélioration de la fixation du calcium par les cellules osseuses, même en présence d'inhibiteur des canaux calciques ou d'agent inflammatoire comme l'interleukine LL-1. Ceci indique que l'extrait de Padina pavonica possède un ou plusieurs principes actifs dont le mode d'action est différent de celui des substances connues qui ne sont pas susceptibles d'améliorer la fixation du calcium en présence d'inhibiteur calcique.
La difficulté de la situation vient du fait que l'algue présente une activité très variable selon la saison, la croissance, le stade de développement de la plante, la profondeur, la luminosité et que le technicien ou le consommateur final désire disposer d'un produit à activité constante. Il faut donc produire un extrait dans des conditions telles qu'il soit possible de s'affranchir des variations en principes actifs chez le végétal, et les problèmes qui se posent sont : quelle doit être l'activité de l'extrait et comment obtenir un produit de titre toujours constant ? La présente invention a pour but de résoudre le problème technique exposé ci-dessus. La récolte de plantes, leur traitement et la fabrication d'extrait stabilisé requièrent le dosage de l'activité dans les matières traitées. La collecte de la plante doit se faire alors que la teneur en principe actif est optimale et il faut en déterminer le moment. La conservation des plantes avant leur traitement, l'extraction du brut, la fabrication de l'extrait nécessitent de disposer d'une méthode analytique permettant de quantifier l'activité de la matière.
Habituellement la production d'un extrait fait appel au dosage chimique de la molécule active.
Quand l'activité est apportée par une famille de molécules, il devient difficile ou impossible de se rapporter à un dosage chimique. La difficulté du problème vient du fait que les molécules peuvent exister sous forme d'isomères ou de tautomères, les uns actifs, les autres inactifs.
Si l'isomérie est supportée par des groupements fonctionnels, il est possible de doser les groupements fonctionnels et ceux-ci supportent la totalité et l'exclusivité de l'activité des principes actifs. On illustrera le propos en citant le dosage des anthraquinones du séné, des alcaloïdes, etc. Dans le cas des hétérosides cardiotoniques de la digitale, il a été observé maintes fois des anomalies de corrélation entre l'analyse chimique et l'activité biologique, du fait de la multiplicité des principes actifs de niveau d'activité inégal.
Si l'isomérie est supportée essentiellement par des élément structuraux, l'analyse sera plus délicate et devra faire appel à la mise en valeur d'éléments structuraux caractéristiques par spectrophotométrie, ou faire appel à des réactions caractéristiques comme la coloration des fonctions susceptibles d'être représentatives de la famille moléculaire recherchée. Par exemple, dans le cas d'une isomérie cis-trans, il faut fonctionnaliser la double liaison en fixant une fonction réactionnelle. Sur cette fonction, il sera possible de fixer un groupement chromophore, par une réaction de couplage (isothiocyanate de fluorescéine par exemple). Il est aussi possible de faire usage de la spectrométrie de masse mais il faut rappeler que cette technique est destructive. Il n'est donc pas possible de vérifier à nouveau l'activité de la fraction isolée.
Pour de nombreuses substances, on a pour habitude de doser l'activité par voie biologique, par exemple pour la pénicilline, de nombreuses vitamines comme la vitamine A, la vitamine E, les anticorps, les antigènes, certaines hormones comme l'insuline, le FSH, les GH, les cytokines comme l'interféron, le TNF... Cette technique s'applique essentiellement aux dosages qui seraient impossibles par voie chimique. Le cas des vitamines A et E illustre bien le propos puisqu'elles existent sous forme de nombreux isomères.
Le problème devient encore plus complexe quand on s'adresse à des substances sans groupement chromophore facilement détectable et dont la structure n'est pas connue. Dans ce cas, le dosage de l'activité biologique semble la méthode exclusive ou en tout cas la méthode de choix.
Parmi les méthodes de dosage d'activité, on trouve des méthodes s'appliquant aux substances modifiant une activité biologique des cellules procaryotes ou eucaryotes. Le dosage de l'activité biologique pose le problème de la stabilité des cellules normales ou des lignées cellulaires. En outre, le signal analysé peut varier selon des critères opératoires impossibles à préciser dans bien des cas. Lors de l'usage de ces méthodologies, les auteurs sont confrontés à la variabilité de la réponse des cellules. Il faut donc étalonner la réponse de la souche par rapport à un système de référence. Ce système ne donne pas de bonne réponse dans le cas qui importe, car il se trouve que la Padine est la seule plante connue susceptible d'induire une réponse sur la fixation du calcium en présence d'un inhibiteur calcique (Inh-Ca) et en présence d'un agent inflammatoire comme l'IL-1. Toutes les autres substances testées à ce jour ne peuvent restaurer la fixation du calcium en présence d'inhibiteur calcique (Inh-Ca).
Après de nombreuses difficultés techniques, les Demandeurs sont parvenus à mettre au point une méthode de dosage efficace et reproductible.
La matière à tester est dosée sur culture cellulaire. On analyse le calcium fixé par les cellules osseuses. Pour ce faire, on dose le calcium fixé par une lignée cellulaire ostéoblastique. A titre non limitatif, on citera UMR 106, G292, en présence ou non d'agents délétères comme les Inh-Ca et l'IL-1. La préparation à analyser sera testée elle aussi, sur la même lignée cellulaire en présence ou non d'agents comme Inh-Ca et IL-1.
Dans les mêmes conditions, on dose le calcium fixé par la même lignée cellulaire en présence d'estradiol et on constitue un barème d'étalonnage exprimé en poids d'estradiol. Ce barème d'étalonnage s'échelonne de 10"3 à 10"10 mol d'estradiol ou plus fréquemment entre 10"7 et 10" 9 mol d'estradiol. De cette façon, on peut établir une corrélation entre l'activité de l'extrait de Padine et une quantité active d'estradiol. On doit souligner que cette comparaison se fait entre l'activité de l'estradiol directement sur la culture cellulaire avec l'actif extrait de la Padine en présence d'agents délétères comme un Inh-Ca ou l'IL-1. Donc il ne s'agit pas vraiment d'une comparaison pondérale et on propose d'exprimer le résultat en Unité d'Activité (UA). Une unité d'activité est définie comme la quantité d'extrait susceptible d'accroître de 50% la quantité de calcium fixé par 400 000 cellules cultivées 48 H en présence d' ing d'interleukine 1 par puits de 1 ml. L'IL-1 peut être remplacée par un autre agent inhibiteur de la fixation du calcium à une dose équiactive. Les extraits de Padine ont été décrits, notamment dans la demande de brevet européen EP 0.655.250. On procède à l'épuisement de l'algue après séchage, par un solvant hydrocarboné tel que le cyclohexane ou l'acétone, séparation de la matière végétale, filtration puis évaporation à sec du produit d'extraction. Une quantité exactement pesée d'extrait sec est ensuite dissoute dans l'éthanol. La détermination de son activité fait l'objet de la présente invention. Concrètement, le procédé selon l'invention consiste à préparer une suspension de culture de la lignée cellulaire humaine G292 (ECAC n°901-l 10522) en ajustant la densité cellulaire à 400 000 cellules par ml de milieu de culture complet (MCC), supplémenté par 10 % de sérum de veau fœtal. On répartit la suspension cellulaire à raison de 1 ml par puits sur des plaques de 24 puits. On laisse incuber sous atmosphère de CO2 pendant une nuit à 37°C. On sépare les surnageants puis on dilue par une nouvelle addition de MCC. On prépare une fraction aliquote d'IL-1 et on ajoute 5 μl de solution d'interleukine IL-1, soit 1 ng par puits dans les puits pour les cellules qui reçoivent seulement un traitement inhibiteur par IL- 1.
Pour chaque essai de solution à titrer, on ajoute 5 μl de solution d'extrait de Padina. On laisse ensuite incuber pendant le temps nécessaire pour la réalisation de l'essai, habituellement de 24 à 72 h, et de préférence pendant 48 h. On élimine ensuite les surnageants et on rince les culots cellulaires à trois reprises avec du tampon PBS sans calcium et sans magnésium, préalablement chauffé à la température de 37°C, de manière à éliminer tout le calcium en solution apporté par le milieu de culture. Après les purifications habituelles, on mélange avec un acide et on dose le calcium selon la méthode définie par la norme AFNOR n° NF-T- 90.005. Les dosages de calcium sont seulement des indicateurs d'activité et peuvent s'exprimer en unités arbitraires. Ils n'ont de valeur absolue que si les valeurs obtenues sont comparées avec celles provenant de cellules non traitées ou subissant un traitement de référence (IL-1 estradiol, inhibiteur calcique par exemple). EXEMPLE I
Fixation du calcium par la lignée d'ostéoblastes G 292 comparée avec l'estradiol, la vitamine D3 et l'extrait de Padina (EPP) en présence ou non d'interleukine 1
La figure 1 schématise les résultats obtenus dans ces conditions.
Les cellules traitées uniquement par de l'interleukine IL-1 présentent un niveau d'activité largement inférieur à celui des cellules témoins. Les cellules traitées par IL-1 et l'extrait de padine ont une activité voisine de celle du témoin.
EXEMPLE II
Etalonnage de l'extrait de Padine avec l'estradiol en présence d'IL-1
La figure 2 schématise les résultats obtenus.
240 ng EPP =10"9 M Estradiol = 272 μg /L soit 272 ng /ml. La dose de 240 ng d'extrait de Padine correspond à l'activité de 10" M d'estradiol sur la fixation du calcium (240 ng d'extrait de Padine = 272 μg/1 d'estradiol, soit 272 ng /ml). On peut aussi dire que 240 ng d'extrait ont un titre d'une unité EXEMPLE III
Etalonnage de l'extrait de Padine (EPP) et de l'estradiol sur la fixation du calcium par rapport à l'effet d'un inhibiteur calcique comme le Verapamil
La figure 3 schématise les résultats obtenus. Verap. = Verapamil et Est. = Estradiol
EXEMPLE IV
Etalonnage de l'extrait de Padine par rapport à l'estradiol et à un inhibiteur calcique la cinchonine
EXEMPLE V
Variation de densité osseuse de la colonne lombaire au cours d'une année
La figure 4 schématise les résultats obtenus.
Les données sur l'activité sont comparées en utilisant des tests statistiques de comparaison de deux moyennes et de deux écarts-type (test de Student). Les résultats sont tous statistiquement significatifs. Les exemples 1 à 5 montrent la concordance des résultats obtenus par le procédé selon l'invention avec les résultats obtenus par voie biologique et les essais en clinique humaine. Les quelques différences constatées (240 ng pour 272 ng/ml d'estradiol) sont principalement dues à l'incertitude des mesures nécessaires pour l'évaluation d'un procédé biologique.
On peut donc considérer que les extraits biologiques de Padina pavonica ont une activité comparable à celle de l'estradiol, mais qu'en aucun cas elle n'est affectée par la présence d'interleukine ou d'inhibiteur des canaux calciques comme le Verapamil ou le Diltiazem à la différence des agents de fixation du calcium déjà connus comme l'estradiol, la vitamine D et la calcitonine.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'étalormage d'un extrait d'algue ou d'une poudre d'algue titré en principes actifs assurant la fixation du calcium par les cellules osseuses par référence avec l'activité connue de doses déterminées d'un agent favorisant la fixation du calcium, caractérisé en ce qu'on met en culture dans une plaque à puits une lignée de cellules osseuses humaines ou animales dans un milieu de culture complet, on assure le développement complet de cette culture en présence d'un extrait ou de poudre de l'algue Padina pavonica, on analyse la quantité de calcium fixée par les cellules dans la matrice extra cellulaire, en présence ou en l'absence d'agents antagonistes de la fixation du calcium et on exprime les résultats soit en unités arbitraires soit en quantité d'estradiol, contenues dans l'extrait ou la poudre d'algue Padina pavonica.
2. Procédé d'étalonnage selon la revendication 1 dans lequel on met en culture une suspension d'une lignée cellulaire humaine ou animale et on ajuste la densité cellulaire déterminée par turbidimétrie ou par comptage à une valeur de référence.
3. Procédé d'étalonnage selon la revendication 1 ou la revendication 2 dans lequel on ajoute dans chaque puits du milieu de culture complet (MCC) puis une dispersion d'agent inhibiteur de la fixation du calcium, on additionne le milieu d'un volume déterminé de solution d'extrait d'algues à tester et laisse incuber à 37° C le milieu sous atmosphère de gaz carbonique pendant un à trois jours.
4. Procédé d'étalonnage selon l'une des revendications 1 à 3 dans lequel on sépare du milieu incubé les fractions surnageantes, rince les cellules avec un milieu dépourvu de calcium et de magnésium, ajuste le volume avec un volume déterminé d'un agent susceptible de détruire la matrice extracellulaire élaborée par les cellules, et notamment d'un acide minéral, et on dose le calcium fixé par les cellules.
5. Procédé d'étalormage selon d'une des revendications 1 à 4 dans lequel on utilise comme principe actif de référence une hormone calciotrope comme par exemple l'estradiol.
6. Procédé d'étalonnage selon l'une des revendications 1 à 4 dans lequel l'agent antagoniste de la fixation du calcium est un agent pro-inflammatoire comme l'interleukine IL -1.
7. Procédé d'étalonnage selon l'une des revendications 1 à 4 dans lequel l'inhibiteur de la fixation du calcium est un agent qui bloque les canaux calciques comme le Verapamil ou la Cinchonine.
8. Les extraits titrés ou les poudres titrées d'algue Padina pavonica, étalonnés selon le procédé de la revendication 1.
9. Les extraits ou les poudres d'algue Padina pavonica selon la revendication 8, titrant environ 240 ng de principe actif et manifestant une activité de fixation du calcium sensiblement comparable à celle d'une préparation d'un agent calciotrope comme
'estradiol à la dose de 272 ng/ml.
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