Изобретение OTHOcifrcH к биологическим (биохимическим) методам исспедобани и предназначено дп определени активности ферментов моноаминоксидаз (МАО) в биологическом материале с использованием .в качестве субстратов индольных биогенр.1Х аминов.. Известен способ определени активности моноаминоксидаз в биологическом материале путем обработки тирамина в слабоосновной среде инкубации избытком се- микарбазида в присутствии моноаминокси- дазы с последующей обработкой полученной смеси раствором трихлоруксусной кис лоты, избытком 2,4-динитрофенилгидразина ,экстракцией образовавшегос 2,4динитрофенилгидразона бензолом, обработкой щелочью бензольного экстракта и спектрофотометрированием полученного соединени ij. Недостатком известного способа вл етс его недостаточно высока чувствительность . Цель изобретени - повыщение точности способа. Указанна цель достигаетс тем, что серотонин или триптамин, используемые в качестве амина, обрабатывают в слабоосновной среде инкубации избытком семйкарбазида в присутствии моноамино- ксйдазы с .последующей обработкой полученной смеси раствором трихлоруксусной кислоты, избытком 2,4-диш1ТрофенилГИдразина и измерением оптической плотности полученного раствора. Из серотонина (или триптамина) в среде инкубации, содержащей фосфатный буфер с рН 7,4 и избыток семйкарб азида, в при-, сутствии МАО получает. 5-оке ни идо ли лацетальдегид (или индолилацетальдегид) п / rnr V 2- «2HOИ VVА ЛО-о .и . -ИЧН,;Ш,0, который, взаимодейству с семикарбазидом , дрет семнкарбазон (что предохран ет альдегид от дальнейшего окислени ) zN- -C-NH И О f «l-C-N-C-NH., ° tH,0 Пссле удалени блоков с помощью трихлоруксусной кислоты в пробу вноситс избыток 2,4-динитрофенш1Гидразина, которьтй взаимодействует с семикарбазином , образу гидрофобный гидразон , «4-9- -V КИ - Н„1Ч-1 1-С-МЦ., Н. о Гидрофобный гидразон 5-оксииндопилацетальдегида уже через несколько минут об разует мелкодисперсную суспензию, концентраци которой, а вместе с этим светопоглсхцение и светорассе ние, постепенно возрастает, достига максимального ус тойчивого значени в течение 20-30 мин Интенсивность светопоглсчцени (или светорассе ни ) мутного раствора определ ю турбидиметрически (или нефелометрически использу любой доступный йолориметр ( нефелометр), микрокалорнметр, ФЭК или спектрофотометр. Разница кежду экстинкцией опытной и контрольной (инкубаци проводитс в от., сутствие субстрата биогенногй аштнй или в отсутствие источника фермента) проб с жит мерой активности фермента в условны единицах после пересчета на 1 г свежей ткани или 1 мг белка за 1 ч .инкубации. Дл пересчета активности МАО из условных в абсолютные единицы более доотупным вл етс построение калибровочно го графика с определением образующегос инкубационной среде под действием МАО аммиака, так как получение весьма нестабильных альдегидов биогенных аминов и последующа работа с ними весьма затруднитепьна .: Инкубационна смесь состоит из ком- ; понентов, мл: раствор фосфатного буфера с рН 7,4; 1,0 0,1 М; нейтрализованный : раствор семикарбазида сол нок ислого 0,2 0,5%-ного; нейтрализованный раствор серотонин-креатининсульфата 0,25 1%-ного (6,25 мкмоль); (или раствор триптамина сол нокислого; 0,25 0,2%-ного 2,5 мкмоль;); источник фермента (10%ные гомогенаты тканей, субклеточное фракции и др. 0,2-0,5). После 1 ч инкубации прш 37 С в пробы добавл ют по 1,0 мл 1О%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, после чего их центрифугируют. В контрольные пробы после трихлоруксусной кислоты добавл ют субстрат. К прозрачному безбелковому центрифутату добавл ют по 0,2 мл О,1%г-н го розтвора 2,4-динитрофенилгидразина, , приготовленного на 2н. растворе сол ной кислоты , и, образовавша с Суспензи гидразона индолилацет альдегида, через 2О-ЗОмин турбодиметрируетс (на спектрофотометре или фотоэлектроколориметре с зеленым фильтром) или нефелометриру«тс . При измерении на ФЭК-М экстинкци опытных проб, содержащих в качестве источника МАО 10-25 мг свежей ткани мозга или мг белка, превышает экстинкцию контрольных проб, инкубируемых без субстрата , в 20-30 раз, что позвол ет надежно работать уже с малыми активност ми фермента и неочищенными препаратами (источниками) МАО. Прирост продукта ерментативной реакции и величины экстинкции в пробах пр мо пропорциональjn ,, продолжительности инкубации (от 15 мин до 2 ч) и количеству источника .фермента МАО в инкубационной среде ( 1-100 мг ткани). Митохондриальна фракци из ткани мозга и печени обладает максиквльной удельной активностью МАО. Метод высокоспецифичен дл определени МАО, так как при введений в организмили добавлении в инкубационную среду больших доз ингибиторов МАО активность фермента полностью угнетаетс . Точность .метода ± 3% (из 5 параллельных определений). Чувствительность метода достаточно высока дл того, чтобы измерить активность МАО с. небольшими количествами различных тканей. 1 мкмо ь продукта реакции, образующегос из серотонина , дает 0,5 единиц и ил триптами- 57 на 0,55 единиц прироста эксти1жщга в у лови х предлагаемого метода (фЭК-М, проба объемом 2,5. мл- кювета с толщиной сло раствора 0,5 см). Мал рный коэффициент экстинкиии { гидраэона в суспензии равен 2000 МСМ дл серотонина и 2200 трйптамина. Выход конечного продукта в форме гидраэона альдегида, обрв« зующего суспензию, составл ет 55% дл серотонина и 60% дл трипгами1 на от всего количества эквиваленtOB образук цегос в инкубационной среде в ходе ферментаггивной реакции альдегида (или аммиака). В табл. 1 представлена активность МАО с субстраггом серотонином в мозге крыс после введени различных доз транс амина. В табл. 2 представлена активность МАО с субстратом триптам ном в мозге крыс после введени транс амина.
11 73938112
формула изобретени что, с цепью повышени чувствительносСпособ определени активности моно-ти способа, в качестве амина используют
аминоксидаз в биологическом материалесеротонин или трйптамин. путем обработки амина в слабоосновной
среде инкубации избытком семикарбазида Источники информации, в присутствии моноаминокеидазы с после-прин$ггые во внимание при экспер изе дующей обработкой полученной смеси раствором трихлоруксусной кислоты, избыт-i.Gfeen A-U.and Hauffiiton Т lA-Aco ком 2,4 инитрЬф1енипгидразина и изме-toHrnetv-f6 method lorestimition о рением оптической плотности полученного Q monoowne oMdase.Biocliewicat Jour раствора, о т л и ч а ю щи и с тем,,Па&,19б1 Л&.l,.(пpoтoтип).