EP1393059A1 - Dispositif d'analyse d'echantillon chimique ou biochimique, ensemble d'analyse comparative, et procede d'analyse associe - Google Patents

Dispositif d'analyse d'echantillon chimique ou biochimique, ensemble d'analyse comparative, et procede d'analyse associe

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EP1393059A1
EP1393059A1 EP02745510A EP02745510A EP1393059A1 EP 1393059 A1 EP1393059 A1 EP 1393059A1 EP 02745510 A EP02745510 A EP 02745510A EP 02745510 A EP02745510 A EP 02745510A EP 1393059 A1 EP1393059 A1 EP 1393059A1
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Abstract

Un tel dispositif d'analyse chimique ou biochimique d'échantillons biologique ou chimique, notamment pour une analyse comparative d'au moins deux échantillons, comprend une pluralité de micro-colonnes de fractionnement (2) de constituants d'un échantillon, chaque micro-colonne de fractionnement (2) comprenant au moins une portion d'un micro-canal (3) munie de moyens de séparation intermédiaires, la portion de micro-canal (3) comprenant un orifice d'introduction (3a) d'une phase mobile enrichie en échantillon et un orifice d'évacuation (3b) situé à une extrémité terminale. Le dispositif comprend en outre des moyens fluidiques de capture (7) de produits de fractionnement au niveau d'un élément terminal (9) de chaque micro-colonne de fractionnement (2) situé en amont de son orifice d'évacuation (3b), des micro-canaux de capture (8) destinés à récupérer les produits de fractionnement capturés, et des ensembles de micro-leviers sélectifs (13) associés aux micro-colonnes de fractionnement (2) et situés en aval des micro-canaux de capture (8), un micro-levier (13) comportant des moyens de détection reliés à des moyens d'analyse.

Description

Dispositif d'analyse d'échantillon chimique ou biochimique, ensemble d'analyse comparative, et procédé d'analyse associé.
La présente invention concerne un dispositif d'analyse chimique ou biochimique d'échantillons chimiques ou biologiques, notamment pour une analyse comparative d'au moins deux échantillons. L'invention concerne également un ensemble d'analyse comparative, ainsi qu'un procédé d'analyse.
L'analyse et la comparaison d'échantillons chimiques et biochimiques, et notamment l'analyse des protéines contenues dans des échantillons, complètent l'étude des gênes par l'étude de l'expression fonctionnelle de ces gênes sous forme de protéines.
Chez les Eucaryotes, la génomique fonctionnelle (étude de la fonction des gènes déchiffrés) et la protéomique (étude de la fonction des protéines) font apparaître une diversité bien plus grande que celle du strict déchiffrage du code génétique. Ainsi, chez l'Homme, certaines estimations conduisent à penser que 25 000 gènes sont potentiellement capables d'exprimer un million de protéines différentes. Ces approches fonctionnelles se déclinent tant sur une recherche de voies intracellulaires et intercellulaires comprenant la notion de cascades d'interactions cellulaires que sur une recherche des combinaisons d'expression de gènes intervenant dans les cascades d'interactions. Que l'on considère les cascades d'interaction cellulaire ou un mode combiné d'expression de plusieurs gènes, l'état des modifications post-traductionnelles des protéines exprimées est essentiel à leur fonction et doit donc être connu.
Il existe un besoin de bénéficier d'outils d'analyse et de comparaison d'échantillons chimiques et biochimiques permettant une séparation des constituants d'un échantillons en vue de leur analyse et éventuellement de la comparaison des constituants de deux échantillons. Notamment, on désire souvent comparer les protéines exprimées par plusieurs groupes de cellules différents dans des états physiologiques ou pathologiques sensiblement différents. On connaît une méthode consistant à séparer les constituants d'un échantillon par migration dans un gel. Cependant, ses limites sont un manque d'exhaustivité, un manque de discrimination, une reproductibilité insuffisante et une inaptitude à l'étude des protéines hydrophobes.
La présente invention a pour objet un dispositif d'analyse chimique ou biochimique d'échantillons permettant d'obvier ces inconvénients.
L'invention a pour objet un dispositif d'analyse chimique ou biochimique d'échantillons permettant une séparation rapide des constituants d'un échantillon et une analyse rapide des constituants séparés, ainsi que la comparaison d'analyses de différents échantillons.
L'invention a également pour objet un dispositif d'analyse chimique ou biochimique d'échantillons permettant une séparation améliorée des constituants d'un échantillon, et notamment des séparations des constituants d'un échantillon selon différents critères de sélectivité.
Un tel dispositif d'analyse chimique ou biochimique d'échantillons biologique ou chimique, notamment pour une analyse comparative d'au moins deux échantillons, comprend une pluralité de micro-colonnes de fractionnement de constituants d'un échantillon, chaque micro-colonne de fractionnement comprenant au moins une portion d'un micro-canal munie de moyens de séparation intermédiaires, la portion de micro-canal comprenant un orifice d'introduction d'une phase mobile enrichie en échantillon et un orifice d'évacuation situé à une extrémité terminale. Selon un aspect de l'invention, le dispositif comprend des moyens fluidiques de capture de produits de fractionnement au niveau d'un élément terminal de chaque micro-colonne de fractionnement situé en amont de son orifice d'évacuation, des micro-canaux de ' capture destinés à récupérer les produits de fractionnement capturés, et des ensembles de micro-leviers sélectifs associés aux micro-colonnes de fractionnement et situés en aval des micro-canaux de capture, un micro-levier comportant des moyens de détection reliés à des moyens d'analyse.
On désigne par micro-colonne de fractionnement une portion de micro-canal munie de moyens de séparation. La portion de micro-canal formant la micro-colonne de fractionnement peut être précédée de portions de micro-canal aval ou amont dénuées de moyens de séparation. Dans la suite, on désigne par orifice d'introduction et d'évacuation de la micro-colonne de fractionnement les extrémités de la portion de micro-canal configurée en micro-colonne de fractionnement. Des moyens de séparations peuvent être une phase appelée phase stationnaire, du type utilisée en chromatographie, ou électrochromatographie, ou un gel d'électrophorèse, ou des moyens électriques.
En chromatographie, on parle de phase stationnaire par opposition à la phase mobile circulant dans la portion de micro-canal. Une phase mobile peut être de façon avantageuse un éluant présentant selon sa composition une affinité plus ou moins importante avec des constituants de l'échantillon, du type molécules ou protéines, et par conséquent plus ou moins apte à entraîner les constituants, une phase stationnaire ayant tendance à freiner la migration des constituants, plus ou moins selon leurs caractéristiques.
Une phase mobile circule dans un micro-canal en entraînant un échantillon. Les moyens de séparation prévus dans la portion de micro-canal formant une micro- colonne de fractionnement provoquent un fractionnement ou une séparation des constituants de l'échantillon.
La séparation est effectuée par migrations différentielles de chaque constituant de l'échantillon dans la micro-colonne, en fonction d'une sélectivité de la micro-colonne et de la phase mobile. La phase mobile entraîne les constituants de l'échantillon vers l'orifice d'évacuation du micro-canal.
Les moyens fluidiques de capture permettent de prélever des constituants séparés de l'échantillon se situant à l'instant du prélèvement dans une portion terminale déterminée de faible longueur de la micro-colonne de fractionnement, ladite portion terminale étant située en amont de l'orifice d'évacuation du micro-canal.
Les constituants capturés sont entraînés dans des micro-canaux de capture vers des micro-leviers sélectifs, en vue de leur détection et de leur analyse.
L' association de moyens fluidiques de capture et de micro-leviers permet une analyse rapide des constituants capturés pour déterminer la composition de l'échantillon. Les moyens d' analyse reliés aux micro-leviers permettent l' obtention rapide de résultats.
Pour une séparation rapide et améliorée des constituants d'un échantillon, on peut prévoir que chaque micro-colonne de fractionnement ou un groupe de microcolonnes de fractionnement de même longueur diffère par sa longueur des autres microcolonnes de fractionnement ou groupes de micro-colonnes de fractionnement, les éléments terminaux étant situés sur chaque micro-colonne de fractionnement à une distance donnée de l'extrémité terminale de la micro-colonne de fractionnement. La phase mobile enrichie en échantillon circule de l'orifice d'introduction des microcanaux vers l'orifice d'évacuation. Les éléments terminaux, où s' effectuent les captures, sont situés à des distances différentes de l'entrée des micro-colonnes. Les vitesses de migration des constituants sont différentes. Dès lors, à un instant donné après le début de la migration, on retrouvera dans les éléments terminaux des micro-colonnes ou de groupes de micro-colonne des constituants différents. Dans les éléments terminaux des micro-colonnes les plus longues, on retrouvera les molécules migrant le plus rapidement. Dans les éléments terminaux des micro-colonnes les plus courtes, on retrouvera les molécules migrant lentement, les molécules migrant rapidement ayant alors été entraînées vers l'orifice d'évacuation de la micro-colonne grâce à la circulation de la phase mobile enrichie.
De préférence, chaque micro-colonne de fractionnement diffère d'une micro-colonne de fractionnement immédiatement plus longue par un élément de longueur donné. On obtient ainsi un gradient de micro-colonnes permettant une séparation différentielle des échantillons. Pour améliorer une discrimination des constituants capturés, le dispositif comprend des micro-colonnes de fractionnement secondaire situées en aval des moyens fluidiques de capture et en amont de l'ensemble de micro-leviers associé à une microcolonne de fractionnement, et destinées au fractionnement secondaire des produits de fractionnement capturés. Ainsi, les constituants capturés dans un élément terminal, ou portion de longueur d'une micro-colonne, sont à nouveau séparés avant d'être analysés à l'aide des micro-leviers, pour une détection plus précise.
Dans un mode de réalisation, le dispositif comprend plusieurs lots de micro- colonnes de fractionnement, chaque lot de micro-colonnes de fractionnement possédant une sélectivité déterminée par les moyens de séparation de ses micro-colonnes de fractionnement comprenant une phase stationnaire revêtue ou non et/ou des moyens électriques de séparation. Une séparation d'un échantillon dans des lots de microcolonnes de sélectivités différentes permet de mettre en évidence, dans chaque lot, des constituants différents de l'échantillon. L'exhaustivité de l'analyse de l'échantillon est améliorée.
Dans un mode de réalisation, le dispositif comprend un support portant plusieurs lots de micro-colonnes de fractionnement, des moyens de captures et des ensembles de micro-leviers associés, et un canal d'alimentation de l'ensemble des lots de micro-colonnes de fractionnement. Les micro-leviers sélectifs comprennent des moyens de détection en fonction de leur état de surface ou de l'état de surface d'un revêtement, de leur nature chimique ou de la nature chimique d'un revêtement. Des constituants séparés, tels que des protéines, pourront réagir ou non avec un ou plusieurs mico-leviers spécifiques, ce qui indiquera leur présence dans l'échantillon. De préférence, les micro-leviers comprennent des moyens de détection par adsorption de molécules.
Les micro-leviers sont prévus pour la détection de molécules qui y sont fix ées. Des anticorps greffés sur des microleviers permettront de détecter la présence d'une molécule spécifique, telle qu'une protéine spécifique, dont on connaît déjà la nature. Des micro-leviers prévus pour détecter des molécules qui y sont adsorbees permettent une détection de molécules et notamment de protéines dont on ne connaît pas la nature à priori.
La comparaison des empreintes d' adsorption sur les micro-leviers de protéines de plusieurs échantillons pourra permettre de mettre en évidence les protéines exprimées différentiellement
De préférence, les micro-colonnes présentent un diamètre compris entre 1 micron (μm) et 100 microns (μ ). Dans un mode de réalisation, le dispositif comprend un support de fractionnement portant les micro-colonnes de fractionnement et un support de détection portant les micro-leviers, les supports étant sensiblement plans, et les supports étant sensiblement parallèles ou perpendiculaires entre eux. Afin d'améliorer une discrimination de constituants d'un échantillon, on peut prévoir en amont des micro-colonnes de fractionnement au moins un étage de fractionnement préalable comprenant au moins une micro-colonne de fractionnement préalable, des moyens de capture fluidiques au niveau d'un élément terminal de la micro-colonne de fractionnement préalable, et un canal de récupération des extraits préalables prévu pour amener les extraits préalables vers les micro-colonnes de fractionnement. L'étage d'extraction préalable permet une analyse d'une portion de l'échantillon comprenant un nombre réduit de constituants à détecter.
De préférence, la sélectivité de micro-colonnes de fractionnement préalable est adaptée en fonction de la sélectivité de micro-colonnes de fractionnement pour favoriser l'extraction préalable d'extraits contenant des constituants qui seront bien séparés dans les micro-colonnes de fractionnement associées, compte tenu de leur propre sélectivité.
On prévoira éventuellement une pluralité d'étages d'extraction préalable de sélectivités différentes, chacun associé à des lots de micro-colonnes de fractionnement. Dans un étage d'extraction préalable, on peut prévoir des captures successives régulières.
Dans un mode de réalisation, un étage de fractionnement préalable comprend une pluralité de micro-colonnes de fractionnement préalable, chacune intersectée par un micro-canal de capture, les micro-canaux de capture étant reliés à un canal de récupération.
Dans un mode de réalisation, un étage de fractionnement préalable comprend une pluralité de micro-colonnes de fractionnement préalable, et un microcanal de capture intersectant successivement les micro-colonnes de fractionnement préalable, et débouchant dans un canal de récupération. Pour améliorer une séparation de constituant d'un échantillon dans une micro-colonne de fractionnement principal, secondaire ou préalable, on peut prévoir qu'une portion terminale de la micro-colonne de fractionnement comprend des moyens de séparation terminaux différents des moyens de séparation intermédiaires. Les constituants parvenant sensiblement à un même instant en aval d'une micro-colonne de fractionnement présentent les mêmes caractéristiques en rapport avec la sélectivité des moyens de séparation intermédiaires. Un changement de sélectivité d'une portion terminale permet de séparer ces constituants. Dans un mode de réalisation, des moyens fluidiques de capture associés à une micro-colonne de fractionnement comprennent un micro-canal de capture comprenant une portion amont débouchant à une extrémité aval d'un segment de capture de la micro-colonne de fractionnement et une portion aval débouchant à une extrémité amont du segment de capture. Le décalage des portions amont et aval d'un micro-canal de capture permet une capture de constituants d'un échantillon se situant sur un segment de longueur d'une micro-colonne de fractionnement.
De tels ico-canaux de capture avec portions décalées peuvent être prévus pour une micro-colonne de fractionnement principal ou une micro-colonne de fractionnement préalable. Lors d'une capture sur une micro-colonne de fractionnement préalable, une plus grande variété de constituants est capturée. Lors d'une capture sur une micro-colonne d'extraction préalable. Lors d'une capture sur une micro-colonne de fractionnement, la circulation à contre-courant dans le segment de capture d'un éluant de capture, différent d'une phase mobile circulant dans la micro-colonne, peut permettre un fractionnement secondaire du produit de fractionnement présent dans le segment de capture à l'instant de la capture.
Dans un mode de réalisation, le dispositif d'analyse comprend un microconduit de lavage de micro-leviers sélectifs débouchant dans des micro-canaux de capture directement en amont de micro-leviers sélectifs. Un micro-conduit de lavage permet d' amener un tampon de lavage ou un éluant directement sur les micro-leviers. Les micro-leviers retiennent certaines molécules selon leurs propriétés de surfaces. L' éluant de lavage est choisi pour son affinité avec les molécules retenues sur certains micro-leviers, afin d'entraîner les molécules préalablement retenues par ces microleviers. Un tampon de lavage permet d'enlever toute molécule fixée sur les microleviers.
L'invention concerne également un ensemble d'analyse comparative chimique ou biochimique d'au moins deux échantillons biologiques ou chimiques comprenant au moins deux dispositifs comprenant une pluralité de micro-colonnes de fractionnement de constituants d'un échantillon, chaque micro-colonne de fractionnement comprenant un micro-canal muni d'un orifice d'introduction d'une phase mobile enrichie en échantillon, un orifice d'évacuation situé à une extrémité terminale et de moyens de séparation intermédiaires. Un dispositif comprend en outre des moyens fluidiques de capture de produits de fractionnement au niveau d'un élément terminal de chaque micro-colonne de fractionnement situé en amont de son orifice d'évacuation, des micro-canaux de capture destinés à récupérer les produits de fractionnement capturés, et des ensembles de micro-leviers sélectifs associés aux microcolonnes de fractionnement et situés en aval des micro-canaux de capture, un micro- levier comportant des moyens de détection reliés à des moyens d'analyse. Un ensemble comprenant des dispositifs de séparation et d'analyse permet une comparaison rapide des échantillons pour déterminer les différences de composition, par exemple en fonction de différences d'état physiologique ou pathologique de cellules composant les échantillons.
L'invention concerne également un procédé d'analyse chimique ou biochimique d'échantillons biologique ou chimique, dans lequel on réalise des fractionnements différentiels d'une phase mobile enrichie en échantillon, on capture simultanément différents produits de fractionnement obtenus, et on analyse chacun des produits de fractionnement à l'aide d'un ensemble de micro-leviers sélectifs. Le fractionnement différentiel permet une séparation rapide des constituants de l'échantillon, et une capture simultanée des produits de fractionnement.
Pour améliorer une différenciation de constituants lors de l'analyse, on fractionne un produit de fractionnement capturé avant de l'analyser. Le produit de fractionnement comprend certains constituants fractionnés de l'échantillon. Une séparation ou un fractionnement supplémentaire permet d'obtenir des constituants plus séparés, qui pourront être analysés successivement avec plus de précision.
Dans un mode de mise en œuvre, on détecte des constituants d'un produit de fractionnement à l'aide de micro-leviers, selon des caractéristiques de polarité, solvophobicité ou porosité du matériau qui les constitue ou d'un revêtement des microleviers, ou selon des caractéristiques de polarité, solvophobicité, échange d'ion ou affinité avec des groupements fonctionnels greffés sur les micro-leviers.
On peut fractionner l'échantillon par chromatographie, par micro- électrophorèse, ou par interaction avec des nano-électrodes. Dans un mode de mise en œuvre, on analyse la déviation ou la fréquence de vibration des micro-leviers. Une molécule telle qu'une protéine ou un peptide peut se fixer sur un micro-levier, selon une sélectivité due par exemple à un état de surface ou un revêtement.
On peut mesurer une déviation du micro-levier provoquée par la fixation d'une molécule. On peut également exciter en vibration le micro-levier à une certaine fréquence, par exemple sa fréquence de résonance. Lorsqu'une protéine se fixe sur le micro-levier, on mesure une modification de fréquence de vibration.
Dans un mode de mise en œuvre, on analyse les éléments de fractionnement par spectrométrie de masse, avant ou après l'analyse à l'aide des micro-leviers. Pour comparer un échantillon à un échantillon de référence, on analyse un premier échantillon, on analyse un second échantillon, et on compare les résultats d'analyse des deux échantillons. Dans ce cas, on analyse les premier et second échantillons en vue de la comparaison d'empreintes de protéines des échantillons, à l'aide de micro-leviers sélectifs aptes à montrer une empreinte de protéines différentielle. En d'autres termes, on analyse les échantillons à l'aide de micro-leviers adaptés, qui pourront détecter des différences de composition des échantillons, compte tenu de la différence d'état de ce dernier, et de la différence de composition que l'on présuppose.
Avantageusement, on effectue une extraction préalable sur un échantillon avant un fractionnement différentiel de l'échantillon.
La présente invention et ses avantages seront mieux compris à l'étude de la description détaillée de modes de réalisation pris à titre d'exemple nullement limitatif et illustrée par les dessins annexés sur lesquels :
La figure 1 est une vue schématique partielle d'un dispositif d'analyse comprenant des micro-colonnes selon un aspect de l'invention ;
La figure 2 est une vue schématique d'une première variante du dispositif d'analyse selon la figure 1 ;
La figure 3 est une vue schématique d'une seconde variante du dispositif selon la figure 1, où des moyens fluidiques de capture sont représentés, selon un aspect de l'invention ;
Les figures 4 et 5 sont des vues schématiques partielles d'un dispositif d'analyse montrant un agencement particulier de supports ;
Les figures 6 et 7 sont des vues schématiques partielles d'un dispositif d'analyse montrant un autre agencement de supports ;
La figure 8 est une vue schématique d'ensemble d'un dispositif d'analyse selon un aspect de l'invention ; La figure 9 est une vue schématique partielle d'un étage d'extraction préalable d'un support ;
Les figures 10 et 11 sont des vues schématiques partielles de variantes d'étages d'extraction préalable selon la figure 9 ;
La figure 12 est une vue d'un circuit de lavage de micro-leviers sélectifs ; La figure 13 est une vue partielle d'un support d'analyse à alimentation en phase mobile et alimentation en échantillon séparées ; et
La figure 14 est une variante d'un dispositif selon la figure 3. Sur la figure 1, un support 1 comprend une pluralité de micro-colonnes 2 arrangées en parallèle et présentant un gradient de longueur. Les micro-colonnes 2 sont représentées en traits épais.
Chaque micro-colonne 2 comprend une portion de micro-canal 3 munie d'un orifice d'introduction 3a et d'un orifice d'évacuation 3b. Chaque portion de micro- canal 3 est pourvu de moyens de séparation intermédiaires. Un canal d'alimentation 4 relie l'ensemble des orifices d'introduction 3a des micro-colonnes fractionnement 2. Le canal d'alimentation 4 est relié aux orifices d'introduction 3a des micro-colonnes de fractionnement 2 par des mico-canaux intermédiaires 5 représentés en traits fins pour les différencier des micro-colonnes de fractionnement 2. Les micro-canaux intermédiaires 5 sont en fait des portions de micro-canaux dénuées de moyens de séparation et situées en amont des portions de micro-canaux 3 formant les micro-colonnes de fractionnemnet 2. Un canal d'évacuation 6 relie l'ensemble des orifices d'évacuation 3b des microcolonnes 2. Les portions de micro-canaux 3 formant les micro-colonnes de fractionnement 2 possèdent des longueurs différentes, chaque micro-canal 3 différant du micro-canal suivant 3 par un élément de longueur déterminée delta 1. Les micro-canaux 3 présentent donc un gradient de longueur. La micro-colonne de fractionnement 2 la plus courte possède une longueur Ll. La micro-colonne de fractionnement 2 la plus longue possède une longueur L2.
La longueur L2 des micro-colonnes de fractionnement 2 les plus courtes varie à titre d'exemple nullement limitatif dans une fourchette 1 à 20 centimètres. La longueur Ll des micro-colonnes de fractionnement 2 les plus longues varie à titre d'exemple nullement limitatif dans une fourchette 5 à 40 centimètres. Lesdites micro- colonnes de fractionnement 2 présentent un diamètre avoisinant 1 à 100 microns, et notamment 10 à 100 microns. La différence de longueur entre une micro-colonne fractionnement 2 et une micro-colonne fractionnement 2 immédiatement plus longue est comprise, à titre d'exemple nullement limitatif entre 1 à 100 microns.
Sur la figure 2, les références aux éléments semblables à ceux de la figure 1 ont été reprises. Un support intégré 1 est pourvu de groupes de micro-colonnes de fractionnement 2. Les micro-colonnes de fractionnement 2 d'un même groupe possèdent la même longueur. Les micro-colonnes de fractionnement 2 d'un groupe diffèrent des micro-colonnes de fractionnement 2 d'un autre groupe par leur longueur. Plus précisément, les micro-colonnes de fractionnement 2 d'un groupe diffèrent des micro-colonnes de fractionnement 2 du groupe suivant par un très petit élément de longueur. En d'autres termes, on retrouve un gradient de longueur entre les groupes de micro-colonnes de fractionnement 2.
Tel que représenté sur la figure 2, un canal d'alimentation 4 relie directement les orifices d'introduction 3a des micro-colonnes de fractionnement 2, en étant dépourvu de micro-canaux intermédiaires.
Les micro-canaux 3 sont entièrement configurés en micro-colonnes de fractionnement 2 en étant pourvus sur toute leur longueur de moyens de séparation. Sur la figure 3, où les références aux éléments semblables à ceux de la figure 1 ont été reprises, un support 1 comprend des micro-colonnes de fractionnement
2 et des moyens de capture fluidique 7. Les orifices d'introduction 3a sont reliés directement au canal d'alimentation 4. Les micro-colonnes de fractionnement 2 présentent un gradient de longueur.
Les moyens de capture fluidiques 7 comprennent des micro-canaux de capture 8 intersectant les micro-canaux de fractionnement 3 au niveau d'un élément terminal ou portion terminale 9 de chaque micro-canal de fractionnement 3, à une distance déterminée de l'extrémité terminale du micro-canal de fractionnement 3, c'est- à-dire à une distance déterminée de son orifice d'évacuation 3b. Chaque micro-canal de fractionnement 3 est associé a un micro-canal de capture 8. Les extrémités d'entrée des micro-canaux de capture 8, situées en amont de l'intersection avec les micro-canaux 3, sont reliées à un canal d'alimentation secondaire 15, prévu pour l'alimentation en éluant secondaire. Le support 1 comprend également des micro-colonnes de fractionnement secondaire 10 situées dans des portions avals des micro-canaux de capture 8, en se situant en amont de zones de détection 11. Une micro-colonne de fractionnement secondaire 10 est associée à un micro-canal de capture 8 et une zone de détection 11. Une micro-colonne de fractionnement secondaire 10 comprend des moyens de fractionnement similaires à ceux de la micro-colonne de fractionnement 2 à laquelle elle est associée. Une zone de détection 11 comprend un canal de circulation 12 passant par un ou plusieurs micro-leviers sélectifs 13.
Pour une analyse d'un échantillon, une phase mobile, de préférence sous la forme d'un éluant, enrichie en échantillon est amenée par le canal d'alimentation 4 et entre dans les micro-colonnes de fractionnement 2 par les orifices d'introduction 3a. La phase mobile enrichie en échantillon circule de l'orifice d'introduction 3a vers l'orifice d'évacuation 3b en étant séparé dans le micro-canal 3. Les éléments terminaux 9, où s'effectuent les captures, sont situés à des distances différentes des orifices d'introduction 3a des micro-colonnes de fractionnement 2. Les vitesses de migration des constituants d'un échantillon sont différentes. Dès lors, à un instant donné après le début de la migration, on retrouvera dans les différents éléments terminaux 9 des microcolonnes de fractionnement 2 des ensembles de constituants différents. Dans les éléments terminaux 9 des micro-colonnes les plus longues, on retrouvera les constituants migrant rapidement. Au même instant, dans les éléments terminaux des micro-colonnes les plus courtes, on retrouvera des constituants migrant plus lentement. Les molécules dépassant les éléments terminaux 9 sont évacuées par les orifices d'évacuation 3b et le canal d'évacuation 6. On notera que les vitesses de migration des constituants et donc les séparations, dépendent de la sélectivité des moyens de séparation d'une micro-colonne et de la nature de la phase mobile ou éluant entraînant les constituants. Les moyens de séparation tendent à retenir les constituants, plus ou moins selon leurs caractéristiques, alors que l'éluant tend à entraîner les constituants, également selon leurs caractéristiques.
Pour capturer les constituants séparés de l' échantillon, un micro ou nano- flux d' éluant secondaire est mis en circulation simultanément dans tous les microcanaux de capture 8. Un nano-flux d' éluant secondaire circulant dans un micro-canal de capture 8 traverse l'élément terminal de longueur Delta L contenu dans le micro-canal 3 associé.
Le nano-flux d'éluant secondaire est récupéré par une portion aval du micro-canal de capture 8 après son passage à travers l'élément terminal. Les constituants de l'échantillon présents dans l'élément terminal à l'instant de la capture sont entraînés dans le micro-canal de capture 8. On choisit de préférence un éluant secondaire apte à entraîner les constituants retenus dans la micro-colonne de fractionnement 2.
Les constituants capturés seront désignés par la suite par produit de fractionnement. Un produit de fractionnement comprend une pluralité de constituants de l'échantillon. Les produits de fractionnement sont notamment des molécules séparées, des complexes moléculaires non séparés et des agrégats moléculaires non désagrégés.
Les produits de fractionnement sont amenés par les micro-canaux de capture 8 vers les micro-colonnes de fractionnement secondaire 10. En traversant ces microcolonnes de fractionnement secondaire 10, les produits de fractionnement subissent une nouvelle séparation. Dans les micro-colonnes de fractionnement secondaires 10 les produits de fractionnement peuvent subir des micro- ou nano-extractions ou séparations secondaires, terminales, parallèles, simultanées, ou/et de micro- ou nano- digestions secondaires, enzymatiques, terminales, parallèles, simultanées.
Les produits de micro ou nano-élution secondaire, de micro ou nano- digestion secondaire et de micro ou nano-extraction secondaire, appelés par la suite produits de fractionnement secondaire, circulent dans les micro-canaux de capture 8 en aval des micro-colonnes de fractionnement secondaire 10, vers les zones de détection 11. La détection des constituants présents dans les produits de fractionnement secondaire s'effectue sur les micro-leviers sélectifs 13. La rétention des constituants présents dans les produits de fractionnement secondaire sur les micro-leviers 13 est mesurée par l'intermédiaire d'une mesure de la déviation des micro-leviers 13 ou par la mesure de variation de fréquence de vibration des micro-leviers 13.
Les moyens de séparation des micro-colonnes de fractionnement secondaire 10 sont similaires à ceux des micro-colonnes de fractionnement 2. Cependant, on peut prévoir que les moyens de séparation d'une micro-colonne de fractionnement secondaire 10 soient différents de ceux de la micro-colonne de fractionnement 2 associée. Notamment, la sélectivité des moyens de séparation peut être différente, pour favoriser une séparation des constituants présents dans les produits de fractionnement. Ces constituants, qui ont été capturés au même instant dans un produit de fractionnement après une première séparation, possèdent des caractéristiques de migration similaires en rapport la sélectivité de la micro-colonne de fractionnement 2 dont ils sont issus. Une seconde séparation avec une sélectivité différente permet une séparation supplémentaire efficace. Bien entendu, l' éluant secondaire est choisi pour favoriser cette séparation secondaire. On peut prévoir un lot de micro-colonnes de fractionnement 2 comprenant des moyens de séparation identiques. On peut également prévoir différents lots de micro-colonnes de fractionnement 2, chaque lot comprenant des micro-colonnes de fractionnement munies de moyens de fractionnement particuliers, présentant par exemple une sélectivité différente. Ainsi, selon la sélectivité d'un lot, un constituant particulier est mieux séparé dans ce lot et peut être détecté plus facilement en aval de ce lots.
Dans le cas d'une pluralité de lots de micro-colonnes fractionnement 2, les micro-colonnes de fractionnement 2 peuvent être alimentées à partir d'une colonne d'enrichissement collective, c'est-à-dire un canal d'alimentation en phase mobile enrichie, ou à partir d'une pluralité de colonnes d'enrichissement, un lot spécifique étant associé à une colonne d'enrichissement spécifique, où circule par exemple un éluant spécifique, correspondant aux moyens de séparation particuliers des micro-colonnes de fractionnement 2 du lot. En effet, selon la sélectivité des micro-colonnes de fractionnement et la nature de l' éluant, les vitesses de migration des molécules pourront être différentes.
Bien entendu, les micro-colonnes de fractionnement de chaque lot peuvent présenter des gradients de longueur entre micro-colonnes ou groupes de microcolonnes.
Un fractionnement d'un échantillon suivi d'une capture de produits de fractionnement, et de la détection de leurs constituants permet de récupérer une "empreinte" de l'échantillon. On peut réaliser des séries d'empreintes. Pour permettre des captures et des détections successives à l'aide des mêmes micro-leviers de détection, on peut prévoir des étapes de lavages successifs des micro-leviers 13, notamment par passage d'un éluant particulier apte à entraîner des molécules retenues dans sur les micro-leviers.
On peut effectuer une séparation des constituants d'un échantillon en mode isocratique, en mode d'élution pas à pas, ou encore par gradient d'élution, c'est-à-dire par variation continue progressive de la composition d'un éluant.
Les molécules entraînées par une phase mobile dans les micro-colonnes de fractionnement 2 sont retenues, selon la sélectivité des moyens de séparation des microcolonnes de fractionnement 2. Le passage d'un éluant présentant une composition particulière et donc une affinité particulière avec certaines molécules, permet d'entraîner préférentiellement ces molécules, les autres étant retenues par une phase stationnaire des moyens de séparation.
Les constituants de l'échantillon sont séparés en fonction de leur vitesse de migration, fonction de leur caractéristique, de la sélectivité des moyens de séparation, et de leur affinité avec une phase mobile du type éluant.
Une variation de la composition d'un éluant permet en entraînement différents des constituants et une séparation améliorée. La variation de composition peut être réalisée par pas successifs, ou de façon continue. Dans ce cas, on parle de gradient d' éluant. La capture des produits de fractionnement est effectuée en mode pas à pas, chaque pas de capture s' appuyant sur une condition physique ou chimique ou hydrodynamique précise régnant à l'intersection d'une micro-colonne de fractionnement 2 avec ledit micro-canal de capture 10.
On peut comparer des séries d'empreintes de deux échantillons. La série d'empreintes successives d'un premier échantillon est comparée à la série d'empreintes successives d'un deuxième échantillon à l'aide de moyens d'analyse du type informatique, les séries d'empreintes de détection étant ensuite archivées dans une base de données informatiques.
Considérons un dispositif d'analyse selon un aspect de l'invention, comprenant deux ensembles de (x) supports chacun muni de (z) lots de (t) microcolonnes de fractionnement.
Pour chaque échantillon, on peut procéder à une élution pas à pas à (n) pas d'élution primaire, dans (t) micro-colonnes de fractionnement 2. Pour chaque pas d'élution primaire, on peut procéder à des micro ou nano-élutions secondaires pas à pas comportant (m) pas d'élutions. Au total, le procédé d'analyse de l'échantillon donne lieu, pour chaque ensemble de supports à un passage de (n.m.Lz.x) produits de fractionnement différents sur des zones de détection.
À titre d'exemple nullement limitatif, (n) est un nombre compris entre 1 et 5, (m) est un nombre compris entre 1 et 5, (x) est un nombre compris entre 5 et 50 (z) est un nombre compris entre 1 et 5, et (t) est un nombre compris entre 10 et 10 000, notamment entre 10 et 1000.
Un ensemble de supports est utilisé pour l'analyse d'un échantillon, un autre ensemble de support étant utilisé pour l'analyse d'un autre échantillon. L'empreinte constituée des (n.mΛ.z.x) détections du premier échantillon est comparée à l'empreinte constituée de (n.m.t.z.x) détections du deuxième échantillon.
Alternativement, les élutions primaires et secondaires se font par gradient d'élution. Dans ce cas, plusieurs empreintes sur micro-leviers sont effectuées, à des intervalles de temps fixes, ou variés. Entre chaque empreinte, des lavages de micro- leviers peuvent avoir heu.
Si le nombre d'empreintes observées est (p), alors au total, le procédé d'analyse de l'échantillon donne lieu, pour chaque ensemble de supports à un passage de (p.t.z.x) produits de fractionnement différents sur des zones de détection.
La séparation dans les micro-colonnes de fractionnement 2 ou les micro- colonnes de fractionnement secondaire 10 peut être effecutee à titre d'exemple nullement limitatif par électrophorèse, chromatographie ou électrochromatographie.
Des méthodes de séparation par chromatographique ou électrophorèse utilisables sont celles présentées dans l'article (Neraart JR, Lingeman H, Brin man UA T. Coupling of biological sample handling and capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A, 1999, 856, 483-514).
On peut utiliser des méthodes de séparation des peptides et des protéines, y compris les protéines hydrophobes, qui ont été présentées dans les articles suivants : (Herraiz T, Casai N. Evaluation of solid-phase extraction procédures in peptide analysis. Journal of Chromatography A, 1995, 708, 209, 221 ; Schweitz L, Petersson M, Johansson T, Νilsson S. Alternative methods providing enhanced sensitivity ansd selectivity in capillary electro-separation experiments. Journal of Chromatography A, 2000, 892, 203-217; Bosserhoff A, Wallach J, Frank RW. Micropreparative séparation of peptides derived from sodium dodecyl sulphate-solubilized proteins. J. Chromatogr, 1989, 473(1). 71-77; Huang JX, Guiochon G. Applications of preparative high- performance liquid chromatography to the séparation and purification of peptides and proteins. J chromatography 1989, 492, 431-69; Rivasseau C, Nanhoenacker G, Sandra P, Hennion MC. On-line solid-phase extraction in Microcolumn- Liquid Chromatography coupled to UN or MS détection: application to the analysis of cyanobacterial toxins. J. Microcolumn séparations, 2000, 12(5), 323-332; Kutter JP, Jacobson SC, Ramsey JM. Solid phase extraction on micro-fluidic devices. J. Microcolumn Séparations, 2000, 12(2), 93-97.). On peut utiliser des méthodes de séparation de protéines membranaires telles qu'évoquées dans les articles suivants : (Cf. Santoni N, Kieffer S, Desclaux D, Masson F, Rabilloud T. Membrane Proteomics: use of additive main effects with multiplicative interaction model to classify plasma membrane proteins according to their solubility and electrophoretic properties. Electrophoresis 2000. 21 (16). 3329-44; Santoni N, Doumas P, Rouquie D, Mansion M, Rabilloud T, Rossignol M. large scale characterization of plant plasma membrane proteins. Biochimie 1999. 81(6). 655-61; Thomas TC, Mac Νamee MG. Purification of membrane proteins. Methods in Enzymology. Nol 182, 499-520; Power SD, Lochrie MA, Poyton RO. Reversed-phase high performance liquid chromatographie purification of subunits of oligomeric membrane proteins. The nuclear coded subunits of yeast cytochrome c oxidase. J Chromatogr, 1983, 266, 585-98 ; Josic D, Hofmann W, Habermann R, Becker A, Reuter W. High performance liquid affinity chromatography of liver plasma membrane proteins. J. of Chromatography A, 1987, 397, 39-46.; Lee RP, Doughty SW, Ashman K, Walker J. Purification of hydrophobic intégral membrane proteins from mycoplasma hyopneumoniae by reversed-phase high performance liquid chromatography. Journal of Chromatography A, 1996, 737, 273-279; Sivars U, Tjerneld F. . Mechanisms of phase behaviour and protein partitioning in detergent/polymer aqueous two-phase Systems for purification of intégral membrane proteins . Biochimica et Biophysica Acta, 2000, 1474, 133-146; Ferro M, Seigneurin-Berny D, Rolland Ν, Chapel A, Salvi D, Garin J, Joyard J. Organic solvent extraction as a versatile procédure to identify hydrophobic chloroplast membrane proteins. Electrophoresis 2000, 21, 3517-3526; Stark M, Jornvall H, Johansson J. Isolation and characterization of hydrophobic polypeptides in human bile. Eur J Biochem 1999. 266(1). 209-14. ).
Pour la purification des peptides très hydrophobes on peut utiliser des solvants organiques tels qu'un mélange de dichlorométhane-hexafluoro-2-propanol contenant des trace de pyridine avec un gradient linéaire acide formique-2-propanol et acide formique-eau sur une phase stationnaire non polaire telle que Vydac C4 (Cf. Bollhagen R, Schmiedberger M, Grell E. High performance liquid chromatographie purification of extremely hydrophobic peptides : transmembrane segments Journal of Chromatography A, 1995, 711, 181-186).
On peut également utiliser des solvants non aqueux, comme évoqué en utilisation combinée avec des méthodes de séparation par l' électrophorèse capillaire non aqueuse (Cf. Cottet H, Struijk MP, Nan Dongen JLJ, Claessens HA, Cramers CA . Nonaqueous capillary electrophoresis using non-dissociating solvents. Application to the séparation of highly hydrophobic oligomers. Journal of Chromatography A, 2001, 915, 241-252; Veraart, J.R., Reinders, M.C., Lingeman, H. and Brinkman U.A. Non-aqueous capillary electrophoresis of biological samples after at-line solid-phase extraction. J. Chromatogr. A 811 (1998) 211-217; Yang, Q., Benson, L.M., Johnson, K.L. and Naylor, S. Analysis of lipophilic peptides and therapeutic drugs: on-line-nonaqueous capillary electrophoresis-mass spectrometry. J. Biochem. Biophys. Methods 38 (1999) 103-121 ;Belder, D., Elke, K. and Husmann, H. Use of coated capillaries for nonaqueous capillary electrophoresis. J. Microcol. Sep. 11 (1999) 209-213; Lister, A.S., Dorsey, J.G. and Burton, D.E. Current measurement of nonaqueous solvents: applications to capillary electrophoresis and electrochromatography. J. High Res. Chromatogr. 20 (1997) 523-528; Belder, D., Husmann, H. and Warnke, Directed control of electroosmotic flow in nonaqueous electrolytes using poly ethylene glycol coated capillaries. J. Electrophoresis 22 (2001) 666-672 ; Bj0rnsdottir, I. and Hansen, S.H.Comparison of séparation selectivity in aqueous and non-aqueous capillary electrophoresis. J. Chromatogr. A 711 (1995) 313-322; Walbroehl, Y. and Jorgenson, J.W. Capillary zone electrophoresis of neutral organic molécules by solvophobic association with tetraalkylammonium ion. Anal. Chem. 58 (1986) 479-481 ; Wei, H. and Li, S. F. Y. Nonaqueous capillary zone electrophoresis for séparation of free fatty acids with indirect fluorescence détection. Electrophoresis 19 (1998) 2187-2192 ; Raith, K., Wolf, R., Wagner, J. and Neubert, R.H.H.Separation of phospholipids by nonaqueous capillary electrophoresis with electrospray ionization mass spectrometry. J. Microcol. Sep. 10 (1998) 681-685 ; Drange, E. and Lundanes, E. Détermination of long-chained fatty acids using non-aqueous capillary electrophoresis and indirect UN détection. J. Chromatogr. A 771 (1997) 301-309; Esaka, Y., Yoshimura, K., Goto, M. and Kano, K. Νon-aqueous capillary zone electrophoresis using polyethylene glycol as a matrix agent. J. Chromatogr. A 822 (1998) 107-115; Jansson, M. and Roeraade. [Ν- Methylformamide as a séparation médium in capillary electrophoresis. J. Chromatographia 40 (1995) 163-169 ; Esaka, Y., Inagaki, S., Uchida, D., Goto, M. and Kano, K.Polyacrylamides as hydrophilic selectors in non-aqueous capillary electrophoresis. J. Chromatogr. A 905 (2001) 291-297; Hansen, S.H., Tj0rnelund, J. and Bj0rnsdottir, I. Selectivity enhancement in capillary electrophoresis using nonaqueous média. Trends Anal. Chem. 15 (1996) 175-180; Jussila, M., Sundberg, S., Hopia, A., Mâkinen, M. and Riekkola, M.-L. Séparation of linoleic acid oxidation products by micellar electrokinetic capillary chromatography and nonaqueous capillary electrophoresis. Electrophoresis 20 (1999) 111-117 ; Jussila, M., Sinervo, K., Porras, S. P. and Riekkola, M.-L. Modified liquid junction interface for nonaqueous capillary electrophoresis-mass spectrometry. Electrophoresis 21 (2000) 3311-3317; Koch, J.T., Beam, B., Phillips, K.S. and Wheeler, J.F. Hydrophobic interaction electrokinetic chromatography for the séparation of polycyclic àromatic hydrocarbons using non- aqueous matrices. J. Chromatogr. A 914 (2001) 223-231 ; Li, S. and Weber, S.G.Separation of neutral compounds in nonaqueous solvents by capillary zone electrophoresis. J. Am. Chem. Soc. 122 (2000) 3787-3788 ; Miller, J.L., Khaledi, M.G. and Shea, D. Séparation of hydrophobic solutés by nonaqueous capillary electrophoresis through dipolar and charge-transfer interactions with pyrylium salts. J. Microcol. Sep. 10 (1998) 681-685; Riekkola, M.-L., Wiedmer, S.K., Nalkό, LE. and Sirén, H. Selectivity in capillary electrophoresis in the présence of micelles, chiral selectors and non-aqueous média. . J. Chromatogr. A 792 (1997) 13-35 ; Riekkola, M.-L., Jussila, M., Porras, S.P. and Nalkό, LE. Νon-aqueous capillary electrophoresis. J. Chromatogr. A 892 (2000) 155-170 ; Sahota, R.S. and Khaledi, M.G. Nonaqueous capillary electrophoresis. Anal. Chem. 66 (1994) 1141-1146 ; Steiner, F. and Hassel, M. Nonaqueous capillary electrophoresis: A versatile completion of electrophoretic séparation techniques. Electrophoresis 21 (2000) 3994-4016; Tj0rnelund, J., Bazzanella, A., Lochmann, H. and Bâchmann, K.Coelectroosmotic séparations of anions in non-aqueous capillary electrophoresis. J. Chromatogr. A 811 (1998) 211-217; Wang, T.; Ward, N.L. and Khaledi, M.G. Efficiency studies in nonaqueous capillary electrophoresis. J. Chromatogr. A 859 (1999) 203-219 ; Wright, P.B., Lister, A.S. and Dorsey, J.G. Behavior and use of nonaqueous média without supporting electrolyte in capillary electrophoresis and capillary electrochromatography. Anal. Chem. 69 (1997) 3251-3259). On peut utiliser des surfactants zwittterioniques, comme C9-APSO4 ou
C10-APSO4, respectivement 3 ( nonyl-dimethyl-ammonio) propyl sulfate et 3 ( decyl - dimethyl-ammonio) propyl sulfate, pour l'extraction-préconcentration d'espèces moléculaires hydrophobes (Cf. Saitoh T, Hinze WL. Concentration of hydrophobic organic compounds and extraction of proteins using alkylammoniosulfate zwitterionic surfactant mediated phase séparations. Anal. Chem 1991, 63(21):2520-5.)
En jouant sur un équilibre entre les atomes de soufre et d'azote garantissant le caractère fortement zwitterionique d'une phase stationnaire constituée de monolithes macroporeux synthétisés in situ par photopolymérisation et contenant des copolymères à base de sulfoalkylbetaine (Ν,Ν-dimethyl-Ν-methacryloyloxyethyl-Ν-(3-sulfopropyl) ammonium betaine), des protéines basiques peuvent être extraites par interactions chromatographiques et élution avec des solutions aqueuses de faible force ionique modulée par des ions chaotropiques tel que perchlorate et thiocyanate. (Cf. Niklund C, Sjorgen A, Irgum K, Νes I. Anal. Chem. 2001. Feb 1, 73,(3) , 444-52).
Les analytes basiques peuvent eux aussi être séparés en combinaison avec l' électrophorèse capillaire non aqueuse (Cf. Karbaum, A. and Jira, Th. Nonaqueous capillary electrophoresis: Application possibilities and suitability of various solvents for the séparation of basic analytes. Electrophoresis, 1999, 20, 3396-3401).
Pour la séparation de protéines hydrophobes, la chromatographie par exclusion de taille peut aussi être utilisée avec des phases stationnaires apolaires et élution avec un mélange ternaire tel que (chloroforme-méthanol-acide trifluoro- acétique) (Cf. Bunger H, Kaufner L, Pison U. Quantitative analysis of hydrophobic pulmonary surfactant proteins by high performance liquid chromatography with light- scattering détection. J. Chromatogr A, 2000, 18, 870 (1-2), 363-9.)
On peut utiliser une méthode de rétro-extraction micellaire dans laquelle les protéines encapsulées à l'intérieur de micelles sont récupérées après destruction des micelles par un surfactant ayant une action contre-électrostatique (Cf. Jarudilokkul S,
Poppenborg LH, Stuckey DC. Backward extraction of reverse micellar encapsulated proteins using a counterionic surfactant. Biotechnol. Bioeng. 1999. 62 (5). 593-601.)
On peut envisager de purifier des glycoprotéines par chromatographie d'affinité aux lectines comme cela est présenté dans l'article suivant : (Cf. Gérard G, Purification of glycoproteins. Methods in Enzymology, vol 182, 529-539).
On peut encore purifier des complexes multi-enzymatiques de la façon décrite dans l'article suivant (Cf. Srere PA, Matthews CK. Purification of Multienzyme Complexes. Methods in Enzymology, vol 182, 539-551).
L'extraction et la chromatographie reposent en particulier sur la notion de polarité, qui provient d'une répartition asymétrique des nuages électroniques au sein des molécules.
Les échelles de polarité sont conçues de plusieurs manières indépendantes qui renvoient à des conséquences diverses des phénomènes de polarité:
- la première s'attache à mesurer l'énergie libre d' adsorption par unité de surface d'un solvant (avec une certaine polarité) à une phase solide (avec une certaine autre polarité). A titre d'exemple, cette méthode donne, par mesure d'adsorption sur l'alumine, les ordres de polarité suivants : eau > méthanol > éthanol > 2-propanol > diméthylsulfoxyde > acétonitrile > méthyléthylcétone.
- la deuxième s'attache à mesurer expérimentalement (Rohrschneider) des coefficients de distribution de solutés tests entre plusieurs phases. A titre d'exemple, cette méthode donne les ordres de polarité suivants: eau> diméthylsulfoxyde > acétonitrile > méthanol > méthyléthylcétone > éthanol > 2-proρanol. On peut déterminer dans la polarité globale de Rohrschneider la part des polarités partielles, c'est-à-dire respectivement les "pouvoir à accepter des protons", "pouvoir à donner des protons", "pouvoir à créer des interactions dipôle-dipôle". Il apparaît que les alcools sont surtout "accepteurs de protons", que l'acétonitrile et le méthyléthylcétone ont un "pouvoir à créer des interactions dipôles-dipôles", et que le diméthylsulfoxyde a autant un pouvoir à "accepter des protons" qu'à "créer des interactions dipôles-dipôles".
- la troisième s'attache à définir des paramètres de solubilité (Hildebrand et Scott), calculés à partir de l'énergie moléculaire de cohésion faisant le bilan de toutes les interactions inter-moléculaires d'un solvant, elle même calculée à partir de l'enthalpie molaire de vaporisation. A titre d'exemple, cette méthode donne les ordres de polarité suivants: eau > méthanol > éthanol > diméthylsulfoxyde > acétonitrile > 2-propanol > méthyléthylcétone.
La chromatographie de partage repose sur les solubilités différentielles des solutés entre deux phases liquides, plus précisément entre une phase liquide mobile et une autre phase liquide, dite stationnaire, épousant les mailles d'une phase solide poreuse de fine granulométrie.
La phase solide peut être polaire, telle que par exemple constituée de grains de gel de silice greffée avec des groupements aminopropyle ou paranitrobenzyle, ou alkylnitrile, ou glycéropropyle. En ce cas, la phase mobile, faiblement polaire, comme peut l'être un mélange (95 % hexane, 5% dichlorométhane) recevra un "modificateur polaire" pour donner un mélange à polarité accrue, comme (80 % hexane, 20% dichlorométhane), jusqu'à déplacer des solutés polaires interagissant avec la phase liquide polaire stationnaire. Il s'agit là de chromatographie de partage en phase normale. La phase solide peut aussi être apolaire, comme des matrices telles que matrice copolymère styrène-divinybenzène, ou bien matrice pyrocarbone, ou gels de silice greffés avec des groupements fonctionnels apolaires, tels que par exemple des groupements alkyle ou phenyl. En ce cas, la phase mobile, polaire, comme peut l'être un mélange (40% méthanol ou acétonitrile, 60% eau), recevra un "modificateur polaire" pour donner un mélange à polarité moindre (60 % méthanol ou acétonitrile,40 % eau), jusqu'à déplacer des solutés apolaires interagissant avec la phase liquide apolaire stationnaire. H s'agit là de chromatographie de partage en phase inversée.
Les autres techniques chromatographiques de séparation reposent sur une rétention différentielle de solutés contenus dans une phase mobile, liquide ou gazeuse, qui traverse une phase stationnaire solide. Selon la technique utilisée, le mode de rétention est la taille, l' adsorption ou l'affinité. La chromatographie par exclusion de taille repose sur une phase stationnaire constituée de billes poreuses formant un gel. La distribution des diamètres des pores à l'intérieur des billes poreuses correspond à une fourchette assez large. Selon leur encombrement stérique, les molécules peuvent ou non passer à l'intérieur d'un plus ou moins grand nombre de pores des billes poreuses. Celles qui passent le plus facilement à l'intérieur des pores des billes poreuses sont les plus retardées. Dans la pratique, le phénomène est biaisé par des interactions ioniques ou hydrophobes entre les solutés et la phase stationnaire. Par ailleurs des effets parasites - comme ceux causés par un écoulement turbulent de la phase mobile, ou bien comme ceux d'un effet gravitationnel dû à des différences de densité entre la phase mobile et les solutés - ont amené à conduire ce type de chromatographie avec des billes de très petite taille et à moyenne ou haute pression. La chromatographie par exclusion de taille est une technique douce, où les molécules peuvent rester dans tout milieu de toute force ionique ou de tout pH, avec toute teneur en détergents ou agents chaotropes, ou toute solution appropriée au maintien de leur intégrité. Par exemple, les protéines séparées par ce moyen peuvent garder une stabilité fonctionnelle ou structurale, car la phase mobile peut accepter les ions et les co-facteurs qui vont favoriser celles-ci.
La chromatographie d'exclusion de taille en conditions dénaturantes ou non dénaturantes peut aussi aider, tout en minimisant l'emploi de détergents, à la caracterisation d'agrégats moléculaires où des protéines de membranes sont partie prenante (Cf. Lôster K, Baum O, Hofman W, Reutter W. Characterization of molecular aggregates of alpha 1 betal integrin and other rat liver membrane pro teins by combination of size exclusion chromatography and chemical cross-linking. Journal of Chromatography A, 1995, 711, 187-199.) Des techniques chromatographiques particulièrement préférées sont celles qui reposent sur une adsorption différentielle de solutés contenus dans une phase mobile, liquide ou gazeuse, qui traverse un phase stationnaire solide. La sélectivité en chromatographie d' adsorption, comme dans d'autres techniques de chromatographie, repose sur un process complet pour chacun des solutés : entraînement par la phase mobile et interaction d'énergie spécifique avec la phase stationnaire. La polarité du soluté est intermédiaire entre celle de la phase mobile et celle de la phase stationnaire. Si la polarité du soluté est trop éloignée de celle de la phase mobile, il n' y a pas une solubilité suffisante du soluté dans la phase mobile pour empêcher une rétention irréversible sur la phase stationnaire. Si la polarité du soluté est trop éloignée de celle de la phase stationnaire, il n'y a pas d'interaction avec la phase stationnaire. Cette contradiction peut être partiellement résolue par l'emploi de mélanges binaires ou ternaires avec des polarités variées et des process successifs avec différentes phases mobiles de forces éluantes croissantes, c'est-à-dire des phases mobiles où l'on fait varier la composition des mélanges binaires ou ternaires de solvants à polarité différente pendant la séparation. L'apparition d'un mélange binaire ou ternaire suppose que le micro-environnement de la phase stationnaire va être le siège de gradient de concentrations entre différents solvants, selon que leur polarité est plus ou moins éloignée de celle de ladite phase stationnaire, ce qui va pouvoir donner lieu à des phénomènes de chromatographie de partage.
Un solvant est d'autant plus éluant que sa polarité se rapproche de celle du soluté, et finalement de celle de la phase stationnaire, puisque cette dernière est censée être proche de celle du soluté. Ceci rend difficile l'obtention d'un système chromatographique exhaustif : l'exhaustivité d'un système où la phase mobile peut contenir des solutés de polarité assez éloignées supposerait que la phase stationnaire ait une large gamme d' adsorption, c'est à dire qu'elle soit où très polaire ou très apolaire, ce qui va rendre difficile respectivement l' adsorption de solutés apolaires ou très polaires. A l'intérieur d'une échelle limitée de polarité des solutés, la sélectivité est d'autant meilleure qu'une faible variation de polarité du solvant entraîne un changement sélectif de l'équilibre d'adsorption de solutés de polarités voisines.
Pour une phase stationnaire donnée, on peut prévoir, outre la possibilité de faire varier la polarité de la phase mobile, d'autres moyens pour augmenter la sélectivité du processus chromatographique : on peut amener un compétiteur dans l' adsorption des solutés comme par exemple un cation ou un anion, ou bien modifier sélectivement les propriétés des solutés, comme par exemple en faisant varier le pH ou la force ionique.
On peut utiliser des matrices comportant une phase stationnaire dont les greffons sont constitués de polymères de molécules ayant un côté apolaire et un coté polaire, comme un copolymère macroporeux réalisé à partir d'un équilibre entre les deux monomères que sont le divinylbenzène, apolaire, et le N-vinylpyrrolidone, polaire.
La chromatographie par adsorption en phase normale repose sur l' adsorption différentielle des solutés sur une phase stationnaire solide et polaire, telle que notamment à base d'alumine mais surtout de silicates, ou de polymères hydrophiles, comme des gels d'agarose ou de dextran, la phase mobile étant, elle, apolaire.
A partir d'agarose, on obtient des micro-billes par un procédé d'émulsion- gélification à chaud utilisant d'abord un solvant non miscible à l'eau, puis un stabilisant, ledit procédé se terminant par l'éviction du solvant par succion filtration. Les gels d'agarose peuvent être réticulés par des agents réticulants tels que l'épichlorohydrine, le 2,3 dibromopropanol ou le divinylsulfone. Selon le pourcentage en agarose, (2, 4, 6%) les gels commerciaux Sepharose ont respectivement les appellations 2B, 4B, 6B. Le Sepharose CL, plus stable thermiquement et chimiquement, est réticulé avec du 2,3 -dibromopropanol en fortes conditions alcalines, opération suivie hydrolyse alcaline de ses groupements sulfates en conditions très réductrices, de manière à le rendre non-ionique ou très faiblement ionique. Le Sephadex est un gel de dextran réticulé avec l'épichlorohydrine qui est stable en conditions alcalines, salines, faiblement acides, mais qui est hydrolyse en conditions acides ou oxydantes marquées. Les gels Sephadex (LH-20) et (LH-60) peuvent être greffés avec des groupements hydroxypropyl qui se lient par des laisons ethers aux unités glucose des chaînes de dextranes, avec pour effet de moduler leur polarité
La silice est insoluble dans l'eau pour un pH variant de 2 à 8. Sa polarité est apportée par la présence à sa surface de groupements silanols (SiOH), au nombre de 4,6 par nm2, dont le groupement OH est polaire et donneur de protons dans des liaisons hydrogène. Un groupement silanol peut rester libre (silanol libre), ou bien engager une liaison hydrogène avec un groupement silanol voisin (silanol lié), ou encore engager une liaison hydrogène avec une molécule d'eau. Le groupement OH d'un silanol libre peut aussi être donneur de protons à une molécule d'eau (silanol libre hydraté par une couche d'eau monomoléculaire), ou à une autre molécule polaire. Par ailleurs, des silanols liés peuvent attirer des molécules d'eau : on alors des silanols hydratés par une couche d'eau pluri-moléculaire, ce sont des gels de sihce fortement hydratés. Les gels de sihce sont très poreux. Selon que leur surface spécifique est plus ou moins grande (elle varie de 200 à 600 m2 par gramme), il comportent des pores d'un plus ou moins grand diamètre et par suite un masquage plus ou moins grand des silanols libres. Les groupements silanols libres sont des sites d'adsorption "forts", totalement disponibles pour une liaison hydrogène. Les groupements silanols libres hydratés et les groupements silanols liés sont encore des sites d'adsorption. Par contre, les groupements silanols hydratés par une couche d'eau pluri-moléculaire sont plutôt des sites de chromatographie de partage. Dans les gels de silice fortement hydratés dont la surface spécifique dépasse 550 m2 par gramme et dont la teneur en eau dépasse 5%, on considère que la chromatographie de partage devient prépondérante par rapport à la chromatographie d'adsorption. Les gels de silice commercialisés ont une granulométrie variée et mentionnent le nombre de silanols restés libres par unité de surface (par exemple le Lichosorb Si 100 comporte 2,95 groupements silanols libres par nm2 pour une surface spécifique de 309 m2 par gramme, tandis que le Lichosorb Si 80 en comporte 2,20 pour une surface spécifique de 482 m2 par gramme).
En chromatographie d'adsorption, on cherche à garder constant le pouvoir d'adsorption de l'absorbant, et ce quelle que soit la phase mobile. Pour ce faire, on ajuste la teneur en eau d'un solvant à un niveau dit de "teneur en eau isoactivante" pour que l'énergie d'adsorption de l'adsorbant soit équivalente à ce qu'elle peut avoir avec un solvant de référence ayant une teneur en eau donnée (par exemple, le solvant de référence pourra être l'acétate d'éthyle à 0,06% d'eau lorsqu'on veut une référence pour le pouvoir absorbant d'une silice d'une surface spécifique de 550 m_ par gramme.)
On peut modifier la polarité des silices par greffage. Les greffons polaires peuvent être du type aminopropyle, paranitrobenzyle, alkylnitrile(nitro), glycéropropyle (diol). Les greffages peuvent être effectués par silanisation, c'est à dire par réactivité d'alkoxysilanes ou chlorosilanes mono, di- ou tri fonctionnels. Pour que cette réaction puisse avoir lieu, il faut que les molécules de silanes pénétrent dans les pores de la silice, ce qui suppose un diamètre de pores supérieur à 10 nm. De plus, une molécule de silane pouvant occuper deux fois la surface d'une molécule de silanol (0,4 nm2 contre 0,2 nm2), le rendement maximal de greffage est de 50%, c'est à dire 4 micromoles/nm_. Dans la pratique, les phases commerciales greffées non polymérisées ont un taux de greffage de 3,5 à 3,7 micromoles par nm2. Dans une réaction de silanisation avec des chlorosilanes trifonctionnels, seuls deux atomes de chlore peuvent réagir pour des raisons stériques, la liaison Si-Ci avec le troisième atome de chlore dudit silane tri- fonctionnel pouvant être hydrolysée par des traces d'eau, et la liaison Si-OH obtenue donnant lieu à une nouvelle réaction avec des silanes résiduels contenus dans le milieu reactionnel et conduisant à une réaction en chaîne de polymérisation. Les phases stationnaires polymérisées ont alors une grande capacité, mais une résistance importante au transfert de masse.
La chromatographie par adsorption en phase inversée repose sur l' adsorption différentielle des solutés sur une phase stationnaire solide et apolaire, telle que notamment des silices greffées avec des groupements apolaires, la phase mobile étant, elle, plus ou moins polaire, selon par exemple des proportions variées de solvants plus ou moins polaires, par exemple d'eau et de méthanol ou bien encore d'eau et d'acétonitrile.
Si certaines matrices telles que copolymère styrène-divinylbenzène ou pyrocarbone peuvent être apolaires "ex-abrupto", les groupements fonctionnels apolaires greffés sur les phases stationnaires telles que sihce ou Sepharose peuvent être des groupements alkyles Cl 8 ou C8 ou C4 , ou des groupements phényl. La procédure de greffage des silices greffées avec des groupements apolaires s'obtient par silanisation, tout comme la procédure de greffage des silices greffées avec des groupements polaires. Il faut noter, comme dans le cas de silices vierges (polaires) ou des silices greffées polaires, la présence de silanols résiduels provenant de l'hydrolyse des groupements réactifs de silanes trifonctionnels n'ayant pas réagi au cours de la synthèse. Ces silanols résiduels sont recouverts par des molécules d'eau et ceux qui sont accessibles créent un environnement propice à une chromatographie de partage sur phases stationnaires polaires: d'une part les molécules de solvant organique d'un mélange (eau-solvant organique) se fixent préférentiellement à la surface des greffons apolaires, d'autre part les molécules de soluté interagissent avec la phase liquide stationnaire. Le mécanisme d'interaction est soit un mécanisme de partage des solutés entre la phase mobile et la phase liquide adsorbée, soit basé sur une interaction hydrophobe entre les molécules de soluté et la phase stationnaire apolaire. De plus, si leur polarité est suffisante, les molécules de soluté peuvent déplacer des molécules de la phase liquide polaire stationnaire.
Les groupements silanols résiduels accessibles peuvent être éliminés (c'est le process appelé "end-capping") par un traitement au triméthylchlorosilane (TMCS).
On peut utiliser des matrices apolaires différentes des silices greffées avec des groupements alkyles C18 ou C8 ou C4 ou phényl. Par exemple, les Phenyl et Octyl- Sepharose peuvent être utilisés en chromatographie d'interactions hydrophobes, et sont obtenus lorsqu'on couple la réticulation du Sepharose CL avec une dérivation avec des groupements phenyl ou octyl.
On peut utiliser des matrices copolymère styrène-divinylbenzène ou pyrocarbone présentant l'avantage par rapport aux silices greffées d'être stables dans une fourchette de pH beaucoup plus larges (1 à 13) contre (2 à 7,5), car la silice est attaquable par les ions OH. Ce défaut des silices peut être résolu par l'application d'un revêtement siliconé sur la surface des pores que l'on trouve dans des phases stationnaires commerciales comme Capcell Pak.
On peut améliorer un point faible des matrices copolymeres, à savoir la résistance mécanique, en employant des matrices copolymeres macroporeuses. Celles-ci comportent à la fois une partie très fortement réticulée, imperméable aux solvants, et une partie peu réticulée propice aux échanges entre la phase stationnaire et la phase mobile, et des macro-pores, sans présence de polymères. D'autres phases stationnaires comme l'oxyde de zirconium poreux, ou le graphite poreux offrent naturellement les qualités de stabilité (pH de 1 à 14) et de résistance mécanique.
Une autre caractéristique des matrices copolymeres évoquées est la présence de groupements aromatiques, susceptibles d'interagir dans la formation de complexes donneurs-accepteurs d'électrons avec les solutés. On peut utiliser d'autres matrices copolymeres, telles que par exemple celles à base d'alcool vinylique ou de polyméthylméthacrylates.
On peut dans la présente invention utiliser des méthodes connues de séparation par chromatographie sur résines échangeuses d'ions permettant de séparer des solutés ioniques suivant leur attraction électrostatique à la phase stationnaire, laquelle comporte une matrice à laquelle sont greffés des groupements fonctionnels fixes, ionisés, et capables de fixer des contre-ions. Les micro-particules de la phase stationnaire ionisée accueillent en leur sein les ions de charge opposée, et en excluent les ions de même charge. Les matrices de la phase stationnaire peuvent être des silices greffées ou des matrices copolymeres. Par leur rôle d'exclusion, ainsi que par leur composition propre, comme par exemple la présence de noyaux aromatiques dans les matrices copolymeres polystyrène divinyl benzène donnant lieu à des interactions par électrons pi, les matrices apportent une contribution au process qui se rajoute à celles de leurs groupements fonctionnels ionisés. Une compétition pour la liaison à la phase stationnaire s'établit entre les ions solutés de la phase mobile et des contre-ions libérables par ladite phase stationnaire et donc échangeables. La phase mobile est une solution tampon dont le pH permet de contrôler les attractions électrostatiques des solutés, dans la mesure où à une certaine valeur du pH va correspondre une certaine charge des solutés. Par exemple les acides aminés des protéines, selon le pH, peuvent être présents dans la solution sous forme de molécules zwitterioniques ou sous forme d'anions ou sous forme de cations. De plus, les matrices greffées sont poreuses (il s'agit de micro-particules de sihce poreuse ou de copolymeres organiques de structure microporeuse ou macro-poreuse de type poly(styrène/divinylbenzène) ou polyacrylate), ce qui donne lieu en même temps à un mécanisme de séparation non-ionique, par exemple des mécanismes de partage de molécules avec une polarité donnée. Par exemple, des solutés non ioniques ne subissent pas de répulsion électrostatique pour pénétrer à l'intérieur des pores de la matrice. Ce faisant, ils sont soumis à un mécanisme de partage gouverné par des interactions hydrophobes et/ou des interactions par transfert de charges. Une matrice peut être échangeur de cations ou échangeur d'anions, faible ou fort. Les échangeurs de cations forts (SCX pour Strong Cation Exchangers), du type acides forts, peuvent être sulfoniques, c'est à dire greffés avec des groupements fonctionnels sulfonates SO3-. Les échangeurs de cations faibles, du type acides faibles, peuvent être carboxyliques, c'est à dire greffés avec des groupements fonctionnels carboxylates CO2-. Les échangeurs d'anions forts (SAX pour Strong Anion Exchangers), du type bases fortes, peuvent être des ammonium quaternaires, c'est à dire greffés avec des groupements fonctionnels NR3+, tels que par exemple triméthylammonium . Les échangeurs d'anions faibles, du type bases faibles, peuvent être des ammonium non quaternaires , c'est à dire greffés avec des formes protonées d'aminés primaire, secondaire ou tertiaire (groupements fonctionnels NHR2+, tels que par exemple diéthylaminoéthylammonium). Les abréviations du langage courant concernent, pour des échangeurs de cations, le CM, faiblement acide, pour Carboxymethyl, ainsi que SP et S, fortement acides, pour respectivement Sulphopropyl et methylSulfonate.
Egalement, les abréviations du langage courant concernent, pour des échangeurs d'anions, le DMAE et DEAE, faiblement basiques, pour respectivement
Dimethylaminoethyl et Diethylaminoethyl, ainsi que TMA, Q, et QAE, fortement basiques, pour respectivement Trimethylaminoethyl, Quaternary Ammonium,
Quaternary aminoethyl.
La force éluante dépend en partie de la nature de l'ion développeur véhiculé par la phase mobile.
Dans un premier mode de chromatographie de paires d'ions ou chromatographie d'interactions d'ions, on tire profit de la présence dans la phase mobile d'ions avec une charge opposée à celle du soluté. En présence de soluté, dans une phase mobile à faible constante diélectrique, chaque contre-ion peut former une paire avec une molécule de soluté de charge opposée par attraction électrostatique coulombienne.
Dans un deuxième mode de chromatographie de paires d'ions ou chromatographie d'interactions d'ions, on tire profit de la présence dans la phase mobile d'ions de grande taille (on les appelle les contre-ions) comportant une partie apolaire et une charge opposée à celle du soluté. L'électro-neutralité est assurée par la présence de co-ions de même signe que les ions du soluté. Dans une phase mobile à forte polarité comme l'eau, en présence de soluté, chaque contre-ion peut former une paire avec une molécule de soluté par interaction hydrophobe. Si l'on utilise une phase stationnaire apolaire, telle qu'une silice greffée avec des groupements alkyles, le contre-ion peut s'adsorber sur les greffons apolaires de la phase stationnaire, tout en devant laisser libres 60 à 70% d'entre eux. En effet, eux-mêmes se repoussent l'un l'autre par répulsion coulombienne entre ions de même charge lorsqu'ils se lient à des chaînes alkyles trop proches. Par ailleurs, tout en se liant à la phase stationnaire par leur partie apolaire, les contre-ions vont attirer au niveau de leur partie ionique des ions de charge opposée, comme les co-ions assurant l'électro-neutralité. Il s'opère un échange entre l'ion soluté et le co-ion qui sont de même charge. La capacité de rétention du soluté par la phase stationnaire dépendra, toutes choses égales, de la concentration en contre-ions. Si les ions du soluté sont suffisamment hydrophobes, on peut alors assister aussi au partage de paires d'ions (soluté/contre-ion) se fixant sur les groupements alkyles restés libres de la phase stationnaire et la solubilisation de ces mêmes ions (soluté et conte-ion) dans la phase mobile.
La rétention des solutés dépend de leur degré d'ionisation, de la teneur en solvant organique, et de la concentration en contre-ions dans la phase mobile. Lorsque les solutés sont capables de former des complexes avec un cation (Cu_+, Zn_+, Cd2+, Ni_+) ou un complexe donneur ou accepteur, on peut procéder respectivement à une chromatographie par échange de ligands, ou à la chromatographie avec transferts de charges. Dans la chromatographie par échange de ligands en mode statique, le cation métallique, par exemple le cuivre, est fixé dans la phase stationnaire, par exemple une silice vierge, par des liaisons ioniques ou covalentes, ce qui donne heu au "cuivrage" desdites phases stationnaires. Ainsi, une liaison covalente du cuivre avec la silice est obtenue en présence d'ammoniaque, donnant lieu à des silices recouvertes de silicates de cupri-diamines. Ces silicates de cupri-diamines fixés à la phase stationnaire sont capables d'échanger l'ammoniaque avec un soluté donneur de doublets, qui devient le nouveau ligand en formant une haison avec le cuivre de la phase stationnaire. Dans le même temps, les silicates de cupri-diamines peuvent solvater des molécules d'eau, ce qui les rend très hydrophiles. La rétention d'un soluté va dépendre de son caractère donneur (caractère complexant) et de son caractère hydrophile, ainsi que de la teneur en ammoniaque de la phase mobile, généralement un mélange ternaire eau-acétonitrile- ammoniaque dont la teneur en eau ne dépasse pas 50% afin de préserver la stabilité de la phase stationnaire.
Dans la chromatographie par échange de ligands en mode dynamique, la phase mobile contient un complexe d'un métal de transition avec un ligand comportant une chaîne hydrophobe, et la phase stationnaire, par exemple une silice greffée avec des groupements apolaires, tels que des groupements alkyle C18, est capable de fixer ce complexe hydrophobe. Dans la phase mobile, le métal de transition est en excès par rapport au ligand hydrophobe, de manière à être libre de pouvoir aussi conserver des sites de haison faibles avec des molécules de solvant. Lorsque des solutés sont capables de former des complexes avec le métal de transition, ils se partagent entre des liaisons avec le métal dans la phase mobile et des liaisons avec le métal engagé dans des complexes avec le ligand hydrophobe, lui même adsorbé sur la phase stationnaire hydrophobe. Dans la chromatographie avec transferts de charges, il y a compétition entre les solutés et le solvant pour donner (ou accepter) des électrons à (ou de) des greffons de la phase stationnaire respectivement accepteurs ou donneurs d'électrons et former les complexes correspondants. Lesdits complexes correspondants formés avec les greffons sont très spécifiques, car un greffon peut être ou non accepteur ou donneur selon un deuxième composé en présence potentiellement accepteur ou donneur. Ces complexes ont une enthalpie de formation très faible, de quelques kilojoules. Ainsi, des silices greffées avec des greffons tels que composés aromatiques peuvent donner des électrons à un soluté particulier ou un solvant particulier accepteurs d'électrons et former des complexes. Ce solvant particulier est appelé le "modificateur polaire" de la phase mobile. Dans un tel système, les molécules de solvant peuvent aussi solvater les greffons de la phase stationnaire. En conséquence, il peut y avoir, pour recevoir des électrons de la phase stationnaire, une compétition à deux (soluté, modificateur polaire) avec un biais qui est que le soluté peut interagir aussi avec les greffons solvatés par le modificateur polaire. Finalement, il y a compétition entre les solutés et le modificateur polaire pour donner (ou accepter) des électrons à (ou de) des greffons libres, non solvatés, de la phase stationnaire. La rétention des solutés est d'autant plus forte que le nombre de greffons libres de la phase stationnaire est élevé, et le nombre de noyaux aromatiques par greffon et la densité spatiale de ces noyaux sont élevés. Toutes choses égales, la compétition pour la liaison à la phase stationnaire va se jouer sur la teneur en modificateur polaire de la phase mobile.
Les principes précédemment évoqués sont compliqués dans le cas de molécules comme des peptides ou des protéines, qui sont des polymères d'acides aminés possédant chacun leur polarité, qui possèdent aussi leur charge nette globale pour un pH donné, et qui possèdent enfin une conformation spatiale qui dépend de la polarité du solvant. La conformation spatiale s'organise de telle sorte que les groupements fonctionnels de même polarité que celle du solvant soient exposés en surface de la molécule, tandis que les groupements fonctionnels de polarité opposée sont repoussés à l'intérieur de la molécule. Une autre possibilité est que les molécules de solvant s'auto-organisent (c'est le phénomène de solvatation) autour des groupements fonctionnels du soluté de polarité opposée, créant une sorte de poche de masquage. Cette dernière a pour effet de masquer la polarité desdits groupements fonctionnels du soluté de polarité opposée à celle du solvant.
En milieux aqueux, l'hydrophilicité d'une protéine ou d'un peptide dépend de sa composition en acides aminés. Lorsqu'à l'intérieur d'une séquence, la proportion d'acides aminés hydrohiles ou polaires est forte, les acides aminés hydrophobes ou apolaires (isoleucine, valine, leucine, phenylalanine) sont repoussés à l'intérieur de la molécule. Par contre, lorsqu'à l'intérieur d'une séquence, la proportion d'acides aminés apolaires ou hydrophobes est forte, il y a une interaction plus directe entre certains acides aminés hydrophobes et le milieu aqueux.
Ainsi, un premier moyen d'augmenter la sélectivité est d'utiliser des changements de composition de mélanges binaires ou ternaires de solvants de différentes polarités pour obtenir une variation de polarité de la phase mobile, afin de complètement modifier la conformation spatiale du peptide ou de la protéine. On a alors des conformations spatiales de peptides ou de protéines spécifiques de la nouvelle polarité obtenue, d'autant plus éloignées de la configuration initiale (dénaturées) que la nouvelle polarité du solvant binaire ou ternaire est éloignée de sa polarité initiale. En partant d'un solvant tel qu'un mélange d'eau et d'acétontrile, qui a pour effet de repousser vers l'intérieur de la molécule les groupements des acides aminés hydrophobes ou apolaires d'une protéine ou d'un peptide ayant une forte proportion d'acides aminés hydrophiles ou polaires, l'addition d'un solvant moins polaire va modifier la conformation de la protéine ou du peptide jusqu'à exposer les groupements fonctionnels moins polaires ou non polaires. Les peptides ou les protéines sont alors adsorbees sur une phase stationnaire greffée avec des groupements apolaires, tels que des groupements alkyles Cl 8, C8 ou C4. Les protéines ou le peptides comportant le plus d'acides aminés avec des groupements fonctionnels apolaires seront les plus retardées.
Un second moyen d'augmenter la sélectivité est d'utiliser des variateurs de solvatation des groupements fonctionnels, tels que des sels. A faible force ionique, les groupements fonctionnels hydrophobes ou apolaires sont entourés de molécules d'eau qui s'auto-organisent. Par contre, une forte force ionique démasque les groupements fonctionnels hydrophobes ou apolaires, en désorganisant les molécules d'eau qui les entourent. La chromatographie d'interactions hydrophobes consiste à partir d'une forte force ionique puis à la diminuer jusqu'à ce que les groupements fonctionnels hydrophobes ou apolaires des peptides ou protéines retrouvent leur masque en milieu aqueux de faible force ionique. Si l'on utilise une phase stationnaire apolaire, tels que greffées avec des groupements alkyles Cl 8, C8 ou C4, ou phenyl, les protéines qui ont le plus de groupements fonctionnels hydrophobes sont celles qui sont le plus retardées. Pour ce type de chromatographie, on utilisez souvent les Phenyl et Octyl-Sepharose. Plusieurs modèles ont tenté de décrire les lois de séparation en chromatographie, en particulier en s'attachant à paramétrer la hauteur de plateau théorique dans la micro-colonne.
Différents modèles (Nan Deemter, Giddings, Huber, Knox, Horvath) renvoient à différentes équations pour calculer la hauteur de plateau théorique H. Par exemple, l'équation de Nan Deemter est de la forme:
H = A/d + Bd + C
A est un terme qui rend compte de la diffusion axiale, B est un terme qui rend compte des transferts de masse incomplets entre phase mobile et phase stationnaire, C est un terme qui rend compte d'une part de trajets de longueur inégale pour traverser la colonne, d'autre part de la difficulté pour la phase mobile et les solutés d'accéder aux mailles formées par la phase stationnaire: il est optimal que la phase mobile et les solutés atteignent lesdites mailles par convection plutôt que par diffusion, d est le débit de la phase mobile au travers de la colonne. Tous les modèles rendent compte, entre autres, du fait que la diffusion axiale, un phénomène qui est d'autant plus marqué que les molécules sont petites et qui contrecarre la finesse de résolution des séparations, est d'autant plus limitée que la vitesse de la phase mobile est grande, mais que dans le même temps le transfert de masse entre les phases stationnaire et mobile est d'autant mieux effectué que la vitesse de la phase mobile est faible. Excepté pour la chromatographie par exclusion de taille, ils rendent aussi compte du fait que la qualité des séparations est d'autant meilleure que l'accès par convection de la phase mobile aux mailles formées par la phase stationnaire l'emporte sur l'accès par diffusion, c'est à dire que le diamètre des particules de le phase stationnaire est faible.
On peut dans la présente invention utiliser des méthodes connues de séparation par électrochromatographie, c'est-à-dire par électrophorèse effectuée dans un capillaire qui contient une phase stationnaire et qui est soumis à ses deux extrémités à un champ électrique (Cf. Manz A, Effenhauser CS, Burggraf, Harrison DJ, Seiler K, Fluri K . Electroosmotic pumping and electrophoretic séparations for miniaturized chemical analysis Systems. J. Micromech. Microeng, 1994, 4, 257-265 ; Jacobson SC, Kutter JP, Culbertson CT, Ramsey JM. Rapid electrophoretic and chromatographie analysis on microchips). Les solutés sont séparés à la fois selon leur mobilité électrophorétique et selon leur coefficient de distribution entre phase mobile et phase stationnaire (Cf. Altria KD. Overview of capillary electrophoresis and electrochromatography, Journal of Chromatography A, 1999, 856, 443-463; Quirino JP, Terabe S. Electrokinetic chromatography, Journal of Chromatography A, 1999, 465- 482 ; Smith NW, Carter-Finch AS, Electrochromatography, Journal of Chromatography A, 2000, 892, 219-255 ; Bartle KD, Carney RA, Cavazza A, Cikalo MG, Myers P, Robson MM, Roulin SCP, Sealey K. Capillary electrochromatography on silica columns : factors inflencing performance. Journal of Chromatography A, 2000, 892, 279-299; Pyell U. Advances in column technology and instrumentation in capillary electrochromatography, Journal of Chromatography A, 2000, 892, 257-278; Angus PDA, Demarest CW, Catalano T, Stobaugh JF. Aspects of column fabrication for packed capillary electrochromatography. Journal of Chromatography A, 887, 2000, 347-345; Rapp E, Bayer E. Improved column préparation and performance in capillary electrochromatography. Journal of Chromatography A, 2000, 887, 367-378; Luedtke S, Adam Th, von Doehren N, Unger KK. Towards the ultimate minimum particle diameter of silica packings in capillary electrochromatography, Journal of Chromatography A, 2000, 887, 339-346 ; Liu CH, Stationary phases for capillary electrophoresis and capillary electrochromatography. Electrophoresis 2001, 22, 612-628 ; Hayes JD, Malik A. Sol-gel open tubular ODS columns with reversed electroosmotic flow for capillary electrochromatography. Anal. Chem. 2001, 73, 987-996; Roed L, Lundanes E, Greibrokk T. Non-aqueous electrochromatography on continuous bed columns of sol- gel bonded large-pore C30 material: séparation of retinyl esters. J. Microcolumns Séparations. 2000. 12(11). 561-567.).
On peut appliquer un champ électrique de manière externe aux canaux sur leur longueur, comme cela a été présenté dans le document (Hayes MA. Extension of external voltage control of electro-osmosis to high pH buffers. Anal Chem, 1999, 71, 3793-3798).
On peut procéder à une électrochromatographie micellaire sur supports miniaturisés comme cela a été décrit dans le document suivant : (Cf. Culbertson CT, Jacobson SC, Ramsey JR. Micro-chip device for high efficiency séparations. Anal. Chem, 2000, 72, 5814-5819).
On peut utiliser des gradients d'élution, et notamment des micro-gradients d'élution ( Cf .Que AH, Kahle N, Νovotny MN. A micro-gradient elution system for capillary electrochromatography. J. Microcolumn séparations, 2000, 12(1), 1-5.).
La séparation et notamment la séparation des peptides ou des protéines peut être effectuée à l'aide de procédés de séparation par micro-chromatographie, micro- électrochromatographie ou micro-électrophorèse.
Le recueil "Protein Liquid Chromatography". Journal of Chromatography
Library, 2000, vol 61, éd. M. Kastner, Elsevier décrit la séparation des peptides ou protéines, sous la forme d'articles passant en revue leur séparation par chromatographie en phase inversée (Schliiter H. Reversed-Phase Chromatography, p 147-223), par chromatographie par échange d'ions (Roos P. Ion Exchange Chromatography. p 3-88), par chromatographie par interactions hydrophobes (Jacob LR . Hydrophobic Interaction
Chromatography. p 235-267), par chromatograhie sur hydroxyapatite (Deppert WR,
Lukacin R, Hydroxyapatite chromatography, p 271-297), par chromatographie d'affinité pour des ions métaux immobilisés (Kastner M, Immobilized Ion Affinity
Chromatography, p 301-377), par chromato-focalisation (Lukacin R, Deppert WR,
Chromatofocusing, p 385-413), par chromatographie d'affinité pour des ligands moléculaires (Kirchberger J., Bôhme HJ, Dye-Affinity Chromatography, p 415-446), par chromatographie par déplacement (Schliiter H, Jankowski J, Displacement Chromatography, p 505-522), par chromatographie de partage liquide-hquide (Hansson
UB, Wingren C. Liquid liquid partition chromatography, p 469-502), par chromatographie par liaison par les résidus cystéine (Whitney D. Covalent Chromatography, p 639-663).
On peut utiliser une séparation de peptides et de protéines par chromatographie en phase inversée sur des silices non poreuses mono-dispersées de 1,5 micron (Cf. Jilge G, Janzen R, Giesche H, Unger KK, Kinkel JN, Hearn MTW. Rétention and selectivity of proteins and peptides in gradient elution of non-porous monodisperse 1,5 micron reversed phase silica. Journal of Chromatography A. 1987, 397, 71-80 ; Jilge G, Janzen R, Giesche H, Unger KK, Kinkel JN, Hearn MTW. Mobile phase and surface mediated effects on recovery of native proteins in gradient elution on non-porous monodisperse 1,5 micron reversed phase silica. Journal of Chromatography A. 1987, 397, 80-89.)
On peut séparer des peptides et des protéines par chromatographie par échange d'anions sur une phase polymérique non poreuse mono-dispersée de 3 microns de poly(styrène-divinylbenzène) (Cf. Régnier FE, Rounds MA. Synthesis of a non- porous, polystyrene-based anion-exchange packing material and its application to fast high-performance liquid chromatography of proteins. Journal of Chromatography A. 1988. 443. 73-83).
On peut séparer des peptides et des protéines par chromatographie par interactions hydrophobes sur des silices non poreuses mono-dispersées de 1,5 micron (Cf. Jilge G, Janzen R, Giesche H, Unger KK, Kinkel JN, Hearn MTW. Performance of non-porous monodisperse 1,5 micron bonded silicas in the séparation of proteins by hydrophobic interaction chromatography Journal of Chromatography A. 1987, 397, 91- 97).
On peut séparer des protéines dans des solutions de pH 5, 7 et 9 par chromatographie par affinité pour des ions cuivriques immobilisés sur des phases stationnaires Sepharose CL-4B grâce à une procédure de couplage epoxy et utilisant le ligand chélateur tridenté N-(2-pyridylmethyl) aminoacétate (Cf. Chaouk H, Hearn MTW. New ligand, N-(2-pyridylmethyl)aminoacetate, for use in the immobilised métal iion affinity chromatographie séparation of pro teins. Journal of Chromatography A, 1999, 852, 105-115).
On peut retenir des peptides synthétiques ayant un un nombre plus ou moins grand de résidus histidine en chromatographie par affinité pour des ions métalliques immobilisés sur des phases stationnaires Sepharose CL-4B et utilisant l'ion acide iminodiacétique comme ligand chélateur tridenté ou l'ion acide nitrilotriacétqiue comme ligand chélateur tetradenté (Cf Kronina NN, Wirth HJ, Hearn MTW. Characterization by immobilised métal ion affinity chromatographie procédures of the binding behaviour of several synthetic peptides designed to hâve high affinity for Cu(U) ions. Journal of Chromatography A, 1999, 852, 261-272.)
On peut utiliser une chromatographie de peptides par chromatographie micellaire comme cela a été présenté dans l'article suivant : (Cf. Kord AS, Khaledi MG. Selectivity of organic solvents in micellar liquid chromatography of amino-acids and peptides. Journal of Chromatography A. 1993. 631, 1255-132).
La séparation des échantillons biologiques peut être effectuée par micro- électrophorèse avec une phase préalable d'enrichissement (Cf. Lichtenberg J, Nerpoorte E, de Rooij Ν. Sample preconcentration by field amplification stacking for microchip-based capillary electrophoresis. Electrophoresis 2001, 22, 258-271; Wu XZ, Hosaka A, Hobo T. An on-line electrophoretic concentration method for capillary electrophoresis of proteins. Anal. Chem, 1998, 70, 2081-2084; Tragas C, Pawliszyn J. On-line coupling of high performance gel filtration chromatography with imaged capillary isoelectric focusing using a membrane interface. Electrophoresis 2000, 21, 227-237; Cappiello A, Berloni A, Famiglini G, Mangani F, Palma P. Micro-SPE method for sample introduction in capillary HPLC/MS. Anal. Chem 2001, 73, 298-302; Timperman AT, Aebersold R. Peptide électro-extraction for direct coupling of in-gel digests with capillary LC-MS MS for protein identification and sequencing. Anal. Chem. 2000, 72, 4115-4121; Tong W, Link A, Eng JK, Yates JR UI. Identification of proteins in complexes by solid-phase micro-extraction / multistep elution / capillary electyrophoresis / tandem mass spectrometry. Anal Chem 1999, 71, 2270-2278; Figeys D, Ducret A, Yates JR III, Aebersold R. Protein identification by solid-phase micro extraction / multistep elution / capillary electyrophoresis / tandem mass spectrometry. Nature Biotechnology, 1999, 14, 1579-1583; Stegehuis DS, Irth H, Tjaden UR, van der Greef J. Isochatophoresis as on-line concentration pretreatment technique in capillary electrophoresis. J. Chromât, 1991, 538(2), 393-402.; Poison NA, Savin DP, Hayes MA. Electrophoretic focusing preconcentration technique using a continuous buffer System for capillary electrophoresis. J. Microcolumn Séparations, 2000, 12(2), 98-106.).
On peut utiliser dans des séparations électrophorétiques la focalisation iso- électrique, c'est-à-dire un gradient de pH sur la longueur du micro-capillaire de séparation. Ce gradient peut être obtenu par un ensemble de petites molécules ampholytes chargées selon leur pi, telles que celles synthétisées à base d'acide acrylique et de polyamines ou obtenues par couplage par épichlorhydrine . Le gradient de pH peut varier généralement de 3 à 10. Le gradient peut aussi être obtenu par greffage, dans un gel de polyacrylamide, de monomères d'acrylamide modifiés portant des groupements chimiques ionisables de PK acides ou basiques. Dans ce cas, le gradient de pH peut varier de 1 à 12,5 (Cf Kawano Y, Ito Y, Yamakawa Y, Yamashino T, Horii T, Hasegawa T, Ohta M. Rapid isolation and identification of staphylococcal exoproteins by reverse phase capillary high performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry .FEMS Microbiol Lett. 2000 Aug l;189(l):103-8 ; Bean SR, Lookhart GL.Electrophoresis of cereal storage proteins. J Chromatogr A. 2000 Jun 9;881(l-2):23-36 ; Issaq HJ. A décade of capillary electrophoresis. Electrophoresis. 2000 Jun;21(10):1921-39 ; Herrero-Martinez JM, Simo-Alfonso EF, Ra is-Ramos G, Gelfi C, Righetti PG. Détermination of cow's milk in non-bovine and mixed cheeses by capillary electrophoresis of whey proteins in acidic isoelectric buffers. J Chromatogr A. 2000 May 12;878(2):261-71; Jensen PK, Pasa-Tolic L, Peden KK, Martinovic S, Lipton MS, Anderson GA, Tolic N, Wong KK, Smith RD. Mass spectrometric détection for capillary isoelectric focusing séparations of complex protein mixtures. Electrophoresis. 2000 Apr;21(7):1372-80; Shen Y, Berger SJ, Anderson GA, Smith RD. High-efficiency capillary isoelectric focusing of peptides. Anal Chem. 2000 May l;72(9):2154-9; Shimura K, Zhi W, Matsumoto H, Kasai K. Accuracy in the détermination of isoelectric points of some proteins and a peptide by capillary isoelectric focusing: utility of synthetic peptides as isoelectric point markers. Anal Chem. 2000 Oct 1;72(19):4747- 57 ; Yang L, Lee CS, Hofstadler SA, Pasa-Tolic L, Smith RD. Capillary isoelectric focusing-electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron résonance mass spectrometry for protein characterization. Anal Chem. 1998 Aug 1;70(15):3235-41; Chartogne A, Tjaden UR, Van der Greef J. A free-flow electrophoresis chip device for interfacing . capillary isoelectric focusing on-line with electrospray mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 2000; 14(14): 1269-74 ; Wen J, Lin Y, Xiang F, Maison DW, Udseth HR, Smith RD. Microfabricated isoelectric focusing device for direct electrospray ionization-mass spectrometry. 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Récent progress in chiral séparation principles in capillary electrophoresis. Electrophoresis. 2000 Dec;21(18):4112-35; Mao Q, Pawliszyn J, Thormann W. Dynamics of capillary isoelectric focusing in the absence of fluid flow: high-resolution computer simulation and expérimental vah dation with whole column optical imaging. Anal Chem. 2000 Nov l;72(21):5493-502 ; Martinovic S, Berger SJ, Pasa-Tolic L, Smith RD. Séparation and détection of intact noncovalent protein complexes from mixtures by on-line capillary isoelectric focusing-mass spectrometry. Anal Chem. 2000 Nov l;72(21):5356-60; Huang T, Wu XZ, Pawliszyn J. Capillary isoelectric focusing without carrier ampholytes.Anal Chem. 2000 Oct l;72(19):4758-61;Barkemeyer BM, Hempe JM.. Effect of transfusion on hemoglobin variants in preterm infants. J Perinatol. 2000 Sep;20(6):355-8 ; Sugano M, Hidaka H, Yamauchi K, Nakabayashi T, Higuchi Y, Fujita K, Okumura N, Ushiyama Y, Tozuka M, Katsuyama T. 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On peut utiliser dans les séparations électrophorétiques des isochatophorèses , c'est à dire une électroséparation avec gradient de champ électrique (Cf. Chen S, Lee ML. Automated instrumentation for comprehensive isotachophoresis- capillary zone electrophoresis. Anal Chem. 2000 Feb 15;72(4):816-20) Les méthodes de séparation décrites ci-dessus peuvent être facilement appliquées dans les micro-colonnes de fractionnement 2 ou les micro-colonnes de fractionnement secondaire 10.
Dans un mode de réalisation préféré, les micro-colonnes de fractionnement comprennent des moyens de séparation par chromatographie. Dans le cas de plusieurs lots de micro-colonnes de fractionnement 2, la sélectivité particulière d'un lot est déterminée par la nature de la phase stationnaire de l'ensemble des micro-colonnes chromatographiques de fractionnement 2 formant le lot.
Selon la méthode de séparation utilisée, la sélectivité des micro-colonnes de fractionnement 2 d'un lot est déterminée par la polarité intrinsèque et la solvophobicité d'une phase stationnaire et par la polarité, l'amphipaticite et la solvophobicité des groupements fonctionnels qui y sont greffés. La sélectivité des micro-colonnes de fractionnement 2 est déterminée secondairement par d'autres critères comme la micro- porosité, la macro-porosité, l'aptitude à l'échange d'ions ou à l'interaction de paires d'ions ou à l'échange de ligands ou au transfert de charges ou aux réactions d'affinité de ladite phase stationnaire ou l'octroi d'un gradient de pH sur la longueur sur toute la longueur desdites micro-colonnes de fractionnement 2, ledit gradient de pH s'étendant sur une fourchette d'autant plus large que lesdites micro-colonnes de fractionnement 2 sont longues. Ladite sélectivité est déterminée tertiairement par un champ électrique appliqué à des phases stationnaires desdites micro-colonnes de fractionnement 2 (Cf. Method of electric field flow fractionation wherein the polarity of the electric field is periodically reversed. US Patent N°6113819). Pendant une séparation des constituants d'un échantillon, chaque lot de micro-colonnes de fractionnement 2 reçoit une phase mobile, du type éluant, qui lui est propre et en rapport avec la nature de la phase stationnaire de ses micro-colonnes de fractionnement 2.
Dans une variante adaptée à un mode de réalisation dans lequel le dispositif comprend des micro-colonnes de fractionnement secondaire 10, on prévoit que la séparation dans des micro-colonnes de fractionnement 2 s'effectue par une première méthode de chromatographie, et que la séparation dans les micro-colonnes de fractionnement secondaire 10 correspondantes s'effectue par une seconde méthode de chromatographie différente de la première. Compte tenu de la première méthode de séparation employée et de la sélectivité d'une micro-colonne de fractionnement 2, on retrouvera regroupées dans un produit de fractionnement capturé des molécules possédant une vitesse de migration similaire. On choisit donc de préférence une seconde méthode de chromatographie selon une sélectivité différente permettant une séparation efficace des molécules du produit de fractionnement obtenu avec la première méthode. Par exemple, la première méthode de chromatographie est une méthode par échange d'ion, la deuxième méthode étant une méthode de chromatographie par interactions hydrophobes.
Dans le cas de séparation par chromatographie, la détection est effectuée sur les zones de détection 10 par une détection par micro-leviers, suivie ou éventuellement précédée d'une détection supplémentaire par une des méthodes connues de l'Homme de l'Art pour la détection des éluats de chromatographie, directement ou après hyphénation, par exemple la spectrométrie de masse évoquée auparavant.
On a décrit des micro-colonnes de séparation par chromatographie. On peut utiliser des séparations par des moyens différents dont certains ont déjà été évoqués, en obtenant des sélectivités encore différentes.
Dans une variante, les micro-colonnes de fractionnement comprennent des moyens de séparation par micro-électrophorèse, de type micro-électrophorèse de zone, ou de type micro-isochatophorèse, ou de type micro-électrophorèse micellaire, ou de type micro-électrophorèse à focalisation iso-électrique obtenue par l'octroi d'un gradient de pH sur la longueur sur toute la longueur desdits micro-canaux, ledit gradient de pH s'étendant sur une fourchette d'autant plus large que lesdites micro-canaux sont longs. Dans ce cas également, la détection est effectuée à l'aide de micro-leviers et éventuellement par spectrométrie.
Dans une variante, la séparation dans les micro-colonnes de fractionnement est réalisée par une méthode dite de Field Flow Fractionation (cf. Suslov SA, Roberts AJ., Modeling os sample dynamics in rectangular asymetrical flow field flow fractionation channels. Anal Chem 2000, 72(18), 4331-45).
Dans une variante, les micro-canaux de micro-colonnes sont pourvus sur leur longueur de nano-électrodes (cf. US 6 123 819). Les molécules entraînées par un éluant sont d'autant plus freinées que leurs charges interagissent avec un champ électromagnétique crée par les nano-électrodes. On a décrit des micro-colonnes de fractionnement rectilignes et parallèles.
On peut envisager des arrangements différents des micro-colonnes de fractionnement 2. Les micro-colonnes de fractionnement 2 peuvent par exemple être rectilignes, courbes ou sinueuses. Elles sont fabriquées en partie ou en totalité grâce aux techniques employées dans la micro-fabrication sur silicium ou verre ou céramique ou plastique. Dans un mode de réalisation, les micro-colonnes de fractionnement sont monolithes.
Des méthodes de fabrication des supports sont décrites dans la suite de la description.
De façon générale, des lits de micro-colonnes, c'est-à-dire des rainures formées sur un support et prévues pour être recouvertes et fermées à l'aide d'un autre support présentant une surface plane où des rainures correspondantes peuvent être directement gravées lorsque lesdits supports sont à base de silicium ou de verre ou de céramique.
Par exemple, les micro-colonnes de fractionnement 2 et lesdites microcolonnes secondaires 10 peuvent être fabriquées en partie ou en totalité grâce aux techniques employées dans la micro-fabrication telles que photogravure, micromoulage, micro-emboutissage, photolymérisation, thermopolymérisation. (Cf. He B, Tait N, Régnier F. Fabrication of Nanocolumns for liquid chromatography. Anal. Chem, 1998, 70, 3790-3797 ; Régnier FE, He B, Lin S, Busse J. Chromatography and electrophoresis on chips : critical éléments of future integrated, microfluidic analytical Systems for life science, TIBTECH, 1999, 17, 101-106 ; Pesek JJ, Matyska MT. Open tubular capillary electrokinetic chromatography in etched fused-silica tubes. Journal of Chromatography, 2000, 887, 31-41). On peut obtenir le réseau micro-particulaire des micro-colonnes qui constitue les phases stationnaires par photogravure lorsque lesdits supports intégrés sont à base de silicium ou de verre ou de céramique (Cf. He B., Régnier F. Microfabricated liquid chromatography columns based on collocated monolith support structures, 451- 455; He B., Tait N., Régnier F. Fabrication of nanocolumns for liquid chromatography. Anal. Chem, 1998, 70, 3790-3797).
On peut obtenir le réseau microparticulaire par micro-moulage ou microemboutissage ou photopolymérisation ou thermopolymérisation in situ emboutissage lorsque lesdits supports sont à base de plastiques, ou bien peut être constitué de micro ou nano-baguettes insérées dans le ht desdites micro-colonnes (Cf. Gusev I, Huang X, Horvath C. Capillary columns with in situ formed porous monolithic packing for micro- high performance liquid chromatography and capillary electrochromatography, Journal of Chromatography A, 1999, 855, 273-290;Yu C, Svec F., Fréchet J. Towards stationary phases for chromatography on a microchip: molded porous polymer monoliths prepared in capillaries by photo-initiated in situ polymerization as séparation média for electrochromatography. Electrophoresis 2000, 21, 120-127; Svec F., Peters E.C., Sykora D., Fréchet J. Design of the monolithic polymers used in capillary electrochromatography columns. J. of Chromatography A., 2000, 887, 3-29. Josic D., Buchacher A., Jungbauer A. Monoliths as stationary phases for séparation of proteins and polynucleotides and enzymatic conversion. Journal of Chromatography B, 2001, 752, 191-205; Ngola SM, Fintschenko Y., Choi WY, Shepodd TJ. Conduct-as-cast polymer monohths as séparation média for capillary electrochromatography ; Pursch M, Sander LC. Stationary phases for capillary electrochromatography. Journal of Chromatography A, 2000, 887, 313-326.) Des micro-particules peuvent aussi être immobilisées dans un lit continu (Adam T., Unger KK, Dittmann MM, Rozing GP. Towards the column bed stabilization of columns in capillary electroendosmotic chromatography. Immobilization of microparticulate silica columns to a continuous bed. J. of chromatography A, 2000, 327-337; Roed L, Lundanes E, Greibrokk T. Nonaqueous electrochromatography on continuous bed columns of sol-gel bonded large- pore C30 material: séparation of retinyl esters. J. Microcolumns Séparations. 2000. 12(11). 561-567)
On peut revêtir le réseau micro-particulaire des micro-colonnes qui constitue la phase stationnaire d'un film fin de nature hydrophobe ou hydrophile et peut être soumis à des chimies de couplage connues de l'Homme de l'Art pour greffer des molécules caractérisées par principalement par leur polarité et leur amphipathicité. La gravure chimique augmente les propriétés de rétention, comme cela est indiqué dans le document suivant : (Cf. Pesek, Protein and peptides séparations on high surface area capillaries, Electrophoresis, 1999, 20, 2343-2348).
On peut munir les micro-canaux de micro-baguettes de monolithes polymères adéquates pour la séparation des protéines tant par électrochromatographie que par micro-HPLC (Cf. Hjerten, Electroosmosis and Pressure-driven chromatography in chips using continuous beds. Anal. Chem, 2000, 72, 81-87).
On peut obtenir des phases stationnaires de chromatographie par moulage à l'aide de moules en silicium. La très grande résolution des techniques de micro-moulage de plastique est directement liée à celle des moules en silicium. Elle se situe donc au niveau requis pour envisager la fabrication de phases stationnaires de chromatographie directement moulées dans le plastique grâce à des moules silicium dimensionnés pour fabriquer des phases stationnaires comportant un réseau plastique micro-particulaire très fin, comme par exemple en étant constitué de cubes polymériques de 5 microns d'arêtes séparés par des espaces de 500 nanomètres.
On peut utiliser des techniques de "Molecular Imprinting" visant à faire mimer par les plastiques des surfaces de reconnaissance moléculaire de molécules A calquées sur celles de molécules B ayant une affinité pour lesdites molécules A (Cf. Rachkov A, Minoura N. Towards molecularly imprinted polymers sélective to peptides and proteins. The epitope approach. Biochim. Biophys Acta 2001. 1544(1-2). 255-266; Haupt K, Mosbach K. Plastic antibodies: developments and applications. Trends Biotech 1998. 16(11). 468-75; Ramstrom O, Mosbach K. Sybthesis and catalysis by molecularly imprinted materials. Current Opinion Chem. Biol. 1999, 3(6). 759-64; Heegaard NH, Nilsson S, Guzman NA. Affinity capillary electrophoreis: important application areas and some récent developments . J. chromatography B Biomed Sci Appl. 1998. 715, 29-54.; Schweitz L, Petersson M, Johansson T, Nilsson S. Alternative methods providing enhanced sensitivity ansd selectivity in capillary electro-separation experiments. Journal of Chromatography A, 2000, 892, 203-217)
Pour qu'un système d'analyse chimique ou biochimique puisse être miniaturisé, il faut d'une part que les conduits et composants qui guident ou reçoivent les fluides (micro-canaux, micro-réservoirs, micro-mixers, micro-colonnes, etc) soient miniaturisés, d'autre part que les composants qui gèrent le parcours des fluides et des réactifs (micro-vannes, micropompes, micro-capteurs, micro-chauffeurs, etc) soient eux aussi miniaturisés, et enfin que des connexions puissent s'établir à l'intérieur et vers l'extérieur du dispositif. (Cf. Elwenspoek M, Lammerink TS J, Miyaké R, Fluitman JHJ. Towards integrated microliquid handling Systems. J. Micromech. Microeng. 1994, 4, 227-245. _ Verpoorte EMJ, van der Schoot BH, Jeanneret S, Manz A, Widmer HM, de Rooij NF. Three-dimensional micro flow manifolds for miniaturized chemical anlysis Systems . J. Micromech. Microeng.1994, 4, 246-256, 1994 _ Schabmueller CGJ, Koch M, Evans AGR, Brunnschweiler A. . Design and fabrication of a microfluidic circuitboard. J. Micromech.Microeng. 1999, 9, 176-179._ Lammerink TSJ, Spiering VL, Elwenspoek M, van den Berg A. Modular concept for fluid handhng system. Proc. IEEE Micro Electro Mechanical Systems, 1996, San Diego pp389-384 _ Richter M, Prak A, Eberl M, Leeuwis H, Woias P, Steckenborn A. 1997. A chemical microanalysis system as a microfluid demonstrator. Proc. Transducers 97, LEEE Chicago, pp303-306._ Kovacs GTA, Petersen K, Albin M. Silicon micromachining: sensors to Systems. Analytical Chemistry, 1996, 407A - 412A _ Gravesen P, Branebjerg J, Jensen OS.. .Microfluidics. A review.J. Micromech. Microeng. 1993. 3. 168-182. _ Shoji S, Esahi M. Microflow devices and Systems. J. Micromech. Microeng. 1994. 4. 157-171. _ Bϋttgenbach S., Robohm C. Microflow devices for miniaturized chemical analysis Systems. SPIE 1998, vol 3539, 51-61 _ Urban G, Jobst G, Moser I. Chemo-and biosensor microsystems for clinical applications. SPLE 1998. Nol 3539, 46-50).
On peut envisager des techniques et des fabrications séparées d'une part pour les supports avec micro-conduits et micro-canaux, d'autre part pour les microcomposants, quitte à procéder à un montage, de préférence automatisé, en fin de fabrication. Parmi les critères qui aident à orienter le choix d'un mode de fabrication pour une pièce donnée d'un dispositif miniaturisé d'analyse chimique ou biochimique figure le ratio d'aspect (aspect ratio en anglais) qui représente l'aptitude à respecter les côtes d'un plan en trois dimensions, en particulier à respecter un profil à partir de lignes brisées et non pas à partir de courbes Pour la fabrication des systèmes miniaturisés, au moins dans une première phase de fabrication, on peut partir part de supports plans et plats (parallèles à un plan et peu épais), dits en 2D, où l'essentiel des composants est fabriqué à partir de gravures, d'ablations et de dépôts sur surface plane.
On peut également faire des composants de moins en moins plans et plats tout en respectant de plus en plus finement un profil de fabrication, grâce à des techniques substractives du type gravure chimique, ablation physique, et des techniques additives du type dépôts tels qu' électrodéposition (electroplating), electroless plating, par vapeur chimique (CND et PENCD) et enfin des techniques de micro-moulage et de micro-emboutissage. Pour surmonter les limites de fabrication, notamment la profondeur limite obtenue par usinage, et les limites des techniques de dépôt ou de moulage pour sculpter des dispositifs où des formes en 3D avec un rapport élevé hauteur/ surface de base sont requises, on peut assembler plusieurs pièces, que l'on peut appeler «sous-composants», qui ont un degré de planéité et de platitude suffisant pour la mise en œuvre de techniques d'usinage d'une surface plane. On peut fabriquer des sous-composants juste assez plans et juste assez plats pour pouvoir être micro-fabriqués. Puis on les superpose et assemble par fusion ou collage après un éventuel emboîtement ou enclenchement, ce qui permet de reconstituer le micro-système voulu (US Patent N° 5 932 315: Microfluidic structure assembly with mating microfeatures _ US Patent N° 5 611 214. Microcomponent sheet architecture US Patent 5252294. Micromechanical structure).
Pour que cette solution soit applicable, il faut entre autres choses que le micro-système voulu puisse tenir dans volume plus ou moins aplati représenté par la superposition de sous-composants eux-mêmes nettement aplatis.
Il se peut que la fabrication de certains composants ne puisse pas faire appel à des techniques de micro-usinage des surfaces planes. Ce peut être le cas parce que les formes sont trop sophistiquées pour être techniquement réalisables ou pour être fabriquées par ces techniques à un coût raisonnable. Ce peut aussi être le cas parce que la fonction demandée à ces composants s'accommode mal de la miniaturisation elle- même ou des techniques de miniaturisation. La conséquence d'une telle situation est que ces composants vont rester à une macro-échelle, et que le packaging du microsystème devra être conçu pour assembler ou connecter des macro-pièces avec des micro-pièces. ( van der Schoot BH, Interfacing micro and macro mechanical worlds. J. Micromech. Microeng.1995, 5, 72-73 ).
On peut utiliser des techniques de gravure chimique humide de photolithographie, de gravure sèche avec divers rayonnements photoniques ou particulaires, de micro-façonnage avec micro-outillages ou lasers, de découpage, d'ablation, d'assemblage par fusion ou d'assemblage anodique, de collage, de soudure, de moulage, d'estampage à chaud (hot-embossing en anglais), de poinçonnage, de forage, d'électrodéposition, de dépôt de vapeur chimique, de fabrication par progression par feuilles successives (lamination en anglais).
La gravure humide est appliquée de façon connue au silicium et à ses dérivés dans l'industrie de la micro-électronique. Elle peut être isotrope. Elle peut aussi être anisotrope lorsqu'on cherche à profiter de l'orientation des cristaux et des propriétés des substances gravantes pour maîtriser sa direction. (S ato K., Shikida M, Yamashiro M, Tsunekawa M, Ito S. Characterization of anisotropic etching properties of single crystal silicon: surface roughening as a fonction of crystallographic orientation, the 1 lth IEEE International Workshop on MEMS, Heidelberg, Germany, 1998, 201-206).
Les techniques de gravure humide tant isotropes qu'anisotropes possèdent de nombreuses variantes. Les connaissances en physique des matériaux, chimie orbitale, physique des rayonnements, dopage des matériaux, permettent de tirer profit de la structure atomique de différents matériaux utilisés, aident à concevoir des méthodes de contrôle de la direction, de la profondeur et de l'arrêt des gravures sur différentes couches. Les techniques citées possèdent de nombreuses variantes. Les connaissances en traitement de surface permettent d'améliorer les qualités demandées aux matériaux en cours de fabrication ou les qualités demandées au produit fini.
Les connaissances en thermophysique et thermochimie différentielle entre deux matériaux permettent d'envisager des nouvelles techniques de fusion, de moulage, d'estampillage, de poinçonnage, en particulier des plastiques.
On peut utiliser une technique de micro-fabrication des polymères par stéréolithographie, en particulier pour le prototypage rapide en 3D.
Selon que l'on grave un matériau dans sa masse ou que l'on grave seulement des couches superficielles, on parle respectivement de "bulk micromachining" et de "surface micromachining".
Toutes ces techniques de micro-fabrication sont applicables non seulement à la fabrication des produits finis, mais aussi à celles des outils utilisés pour effectuer ces micro-fabrications, ainsi qu'aux micro-moules et aux micro-matrices d'estampage à chaud utilisés pour micro-répliquer en masse un micro-objet. Parmi les autres critères qui vont aider à sélectionner un mode et un matériau de fabrication figurent les qualités intrinsèques des matériaux composant l'objet fini, et les perspectives de maîtrise des coûts de fabrication.
Certaines techniques supposent un mode de fabrication moins adapté à la fabrication en grande quantité : gravure sèche par rayonnements photoniques ou particulaires (Bean. Anisotropic etching of silicon. 1978. vol ED-25(10), pp 1185-1193. IEEE Transactions of Electron devices.), ablation lasers, gravure avec micro-pointe.
Mais on peut utiliser ces techniques comme première étape dans un procédé de fabrication en grande quantité d'objets en plastique ou en céramique ou en métal selon des procédés appelés "par réplication" (Niggemann M., Ehrfeld W., Weber L.. Fabrication of miniaturized biotechnical devices. SPLE Conférence on Micromachining and Microfabrication Process Technology IN, Santa Clara, California, Sept 1998, vol 3511, pp 204 - 213 _ Ruprecht R, Bâcher W, Hausselt JH, Piotter N. Injection Molding of LIGA and LIGA-similar microstructures using filled and unfilled thermoplastics. SPLE, vol 2639, ppl46-158 _ Fleming JG, Barron CC, Νovel silicon fabrication process for high aspect ratio micromachined parts, SPLE vol 2639, 185-190 _ Keller CG, Howe RT. Νickel-filled HEXSLL thermally actuated tweezers, 8th International Conférence on Solid-State Sensors and Actuators, Stockholm, Sweden, 1995, June 25-29, pp 376-379. _ Selvakumar A, Najafi K, High density vertical comb array microactuators fabricated using a novel bulk/polysilicon trench refill technology, Solid State Sensor and Actuator
Workshop, Hilton head , 1994, SC June 13-16, pp 138-141 _ Becker H., Dietz W..
Microfluidic devices for μ-TAS applications fabricated by polymer hot embossing. Proceedings of SPLE. Microfluidic Devices and Systems. 21-22 sept 1998, Santa Clara, ppl77-182 _ Grzybowski BA, Haag R, Bowden N, Whitesides GM. Génération of micrometer-sized patterns for microanalytical applications using a laser direct-write method and microcontact printing. Anal. Chem, 1998, 70, 4645-4652 _ Martynova L,
Locascio E, Gaitan G, Kramer W, Christensen RG, MacCrehan WA.. Fabrication of plastic microfluid channels by imprinting methods. Anal. Chem. 1997, 69, 4763-4789).
On peut utiliser ces techniques à vocation unitaire pour micro-fabriquer des masters de réplication (par exemple des micro-moules pour moulage par injection ou pour moulage réactif, ou des micro-matrices d'estampage à chaud), à condition de réunir deux qualités : un ratio d'aspect élevé et une surface compatible avec les exigences du procédé de réplication. En effet, certaines étapes dans la réplication sont cruciales, en particulier la séparation de la matrice de réplication de l'objet nouvellement répliqué.
De préférence, on prend en compte la complexité du procédé choisi pour fabriquer une matrice de réplication. Par exemple, on peut fabriquer avec une très grande précision un micro-moule de moulage par injection ou une micro-matrice d'estampage à chaud avec la technique LIGA, où un rayonnement synchrotron issu d'une machinerie très onéreuse, très rare et très lourde, est utilisé dans les premières étapes. Mais de nouvelles techniques de gravure sèche et surtout de gravure humide avec des performances accrues peuvent se révéler plus souples avec des ratios d'aspect qui se rapprochent de plus en plus de la technique LIGA. Ainsi le gravure humide anisotrope a beaucoup progressé (Hôlke A., Henderson HT. Ultra-deep anisotropic etching of (110) silicon; J. Micromech. Microeng. 1999, 9, 51-57). D'autres résultats montrent aussi un progrès dans les performances de la gravure humide isotrope (Wet chemical isotropic etching procédures of silicon - a possibility for the production of deep structured microcomponents. Schwesinger N, Albrecht A.. SPLE vol 3223, p 72- 79).
Certaines techniques à vocation unitaire, peuvent être adaptées à la fabrication en masse lorsque les instruments de fabrication eux-mêmes qui servent à les mettre en œuvre sont miniaturisés et peuvent être utilisés de manière massivement parallèles. C'est une perspective proche pour l'ablation laser (grâce à la fabrication de micro-lasers) et la gravure par micropointe, plus lointaine pour certaines techniques de gravure sèche. La fabrication en grande quantité est possible avec certaines techniques telles que : gravure humide sur silicium et dérivés, et sur verres, photolithographie UN sur photorésists, fabrication par progression par couches successives de polymères avec utilisation de couches sacrificielles selon Webster et Mastrangelo cités ci-après en référence, moulage de poly(dimethylsiloxane) (PDMS), moulage de plastiques par injection avec micro-moule, moulage de céramiques et de métaux, estampage à chaud de polymères avec micro-matrice d'estampage.
La gravure humide peut être appliquée à tous types de dérivés du silicium et au quartz, ainsi qu'aux différents types de verre (par exemple pyrex, verres boro- phospho-silicatés, etc).
En matière de micro-fluidique, un critère important est la compatibilité avec l'utilisation de la micro-électrophorèse, de la micro-électrophorèse 2D et de la micro- électro-chromatographie pour séparer les molécules. Est importante aussi et surtout la compatibilité avec l'électro-osmose pour mouvoir des fluides, cette technique ayant l'avantage d'éviter des composants tels que micro-vannes et micro-pompes. Comme la micro-électrophorèse et la micro-électrophorèse 2D, l'électro-osmose ainsi que la micro-électro-chromatographie alliée à l'électro-osmose nécessitent l'application de différences de potentiel importantes. En conséquence, elles sont peu compatibles avec l'utilisation du silicium. Par contre, elles sont compatibles avec les verres et les plastiques. (Manz
A., Effenhauser CS, Burggraf Ν, Harrison DJ, Seiler K, Fluri K. Electroosmotic pumping and electrophoretic séparations for miniaturized chemical analysis Systems. J. Micromech. Microeng., 1994, 4, 257-265. - Mac Cormick RM, Nelson JR, Alonso- Amigo MG, Benvegnu DJ, Hooper HH. Microchannel electrophoretic séparations of DNA in injection-molded plastic substrates. Anal. Chem., 1997, 69, 2626-2630 _ Jacobson SJ, Kutter JP, Culbertson CT, Ramsey JM. .Rapid electrophoretic and chromatographie analysis on microchips, μ-TAS 1998, Banff, Canada, 315-318._ Microfabricated liquid chromatography columns based on collocated monolith support structures, μ-TAS 1998, Banff, Canada, 451-455. _ Paulus A., Williams SJ, Sassi AP, Kao PH, Tan H, Hooper HH . Integrated capillary electrophoresis using glass and plastic chips for multiplexed DNA analysis, pp 94-103. SPIE Proceedings Nol 3515 #3515-08. _ PM Martin, DW Matson, Bennett WD, Hammerstrom DJ. Fabrication of plastic microfluidic components. Polymer-based microfluidic analytical devices. SPLE Proceedings Vol 3515 # 3515-19). On peut envisager d'utiliser d'autres forces que la force électro-osmotique pour mouvoir les liquides où l'utilisation de micro-vannes et micropompes peut être minimisée, comme la force centrifuge (Madou MJ, Kellogg GJ: The LabCD: a centrifuge-based microfluidic platform for diagnostics. SPLE vol 3259, pp 80-93).
D'autres modes de propulsion de liquides peuvent être envisagés comme la force thermo-capillaire ( Burns MA, Mastrangelo CH, Sammarco T, Man FP, Webster JR, Johnson BN, Foerster B, Jones D, Fields Y, Kaiser AR, Burke DT. Microfabricated structures for integrated DNA analysis. P.N.A.S. 1996, vol. 93, pp5556-5561), ou les forces couplées à des alternances surfaces ou raies hydrophobes-surfaces ou raies hydrophiles (Jones DK, Mastrangelo CH, Burns MA, Burke DT. Sélective hydrophobic and hydrophhilic texturing of surfaces using photolithographic photodeposition of polymers. SPLE vol 3515, 136- 143 _ Eastman Kodak.. Device for fluid supply of a micro-metering device; US Patent N° 5805189 _ Beckton Dickinson. DNA microwell device and method.US Patent N° 5795748).
On pourra également envisager de faire acquérir au silicium une compatibilité avec des différences de potentiel importantes. (Characterization of silicon- based insulated channels for capillary electrophoresis, Nan den Berg et al., μ-TAS 98, Canada, pp-327-330).
La transparence, qualité recherchée en analyse biologique, est une qualité partagée entre les verres (Kricka L, Wilding P, et al.. Micromachined Glass-Glass Microchips for In Nitro Fertilization, Clinical Chemistry, 1995, 41, 9, 1358-1359) et certains plastiques.
Certains verres ayant les bons compromis de conditions de dopage et d'expansion thermique, ont la qualité de pouvoir facilement être assemblés au silicium (Albaugh KB, Rasmussen DH, "Mechanisms of anodic bonding of silicon to pyrex glass. Proc LEEE Solid State Sensors and Actuators Workshop. 1988. 109-110). La gravure humide sur verre, par nature isotrope, est parfaitement maîtrisée
(A new fabrication method for borosilicate glass capillary tubes with latéral inlets and outlets. Grétillat MA, Paoletti F, Thiébaud P, Roth S, Koudelka-Hep M, de Rooij ΝF. Sensors and Actuators A 60, 1997, 219-222. _ Corman T, Enoksson P, Stemme G. Deep wet etching of borosilicate glass using an anodically bonded silicon substrate as mask J. Micromech. Microeng., 1998, 8, 84-87.)
Comparés aux plastiques, les verres offrent entre autres pour l'analyse biochimique la compatibilité avec la détection par fluorescence et un bon coefficient d'échange thermique. Ils sont gravés cependant uniquement selon un mode isotrope, ce qui par exemple limite aujourd'hui la forme des micro-canaux sur verre à une forme circulaire.
Les plastiques, même s'ils ont une moindre compatibilité avec la détection par fluorescence et un moindre coefficient d'échange thermique que les verres, ont de nombreuses autres qualités, dont le faible prix de revient. On peut envisager l'amélioration de la détection par fluorescence avec les plastiques et réhmination des bruits de fond (en modulant la vitesse de migration des analytes et en utilisant une source lumineuse LED), comme cela a été rapporté (Wang Shau-Chun et Michael D. Morris de l'Université du Michigan à la 10 ème "Frederick Conférence on Capillary Electrophoresis " en Octobre 1999).
Le très faible coût de fabrication des objets micro-fabriqués en plastique vient du faible prix de la matière première, de la simplicité des procédés de production qui peuvent être envisagés, et de l'aptitude à la réplication par moulage ou par estampage à chaud, voire même pour les plastiques photoresists à la photolithographie. Pour la circuiterie électrique sur supports plastiques, on peut déposer du métal une fois le produit fini. On peut également marquer le support à l'aide d'une encre conductrice.
Parmi les plastiques, on peut faire la classification suivante : - les photoresists, usinables entre autres par photolithographie, dont par exemple le PMMA pour la lithographie aux rayons X, SU-8 ( photorésist négatif) et Novolac de Hoescht et AZ 9260 (photoresists positif) pour la photolithographie UN (Lorenz H, Despont M, Fahrni Ν, LaBianca Ν, Renaud P, SU-8: a low-cost négative resist for MEMS, J. Micromech. Microeng, 1997, 7, 121-124. _ .Loechtel B, Maciossek A, Surface micro components fabricated by UN depth lithography and electroplating, SPIE vol 2639, 174- 184 _ Conédéra N, Le Goff B, Fabre Ν. Potentialities of a new positive photorésist for the realization of thick moulds, J. Micromech. Microeng, 1999, 9, 173-175. _ Guérin LJ, Bossel M, Demierre M, Calmes S, Renaud P. Simple and low cost fabrication of embedded microchannels by using a new thick-film photoplastic. Proceedings of Transducers, Chicago, USA, 1997, ppl419-1422.)
- les élasto mères siliconés, dont le poly(dimethylsiloxane) (PDMS), utilisables entre autres par moulage simple, (Mac Donald JC, Duffy DC, Anderson JR, Chiu DT, Hongkai Wu, Schueller O, Whitesides GM, Fabrication of microfluidic Systems in poly(di ethylsiloxane), Electrophoresis 2000, 21, 27-40. _ Ocvirk G, Munroe M; Tang T, Oleschuk R, Westra K, Harrison DJ, Electrokinetic control of fluid flow in native poly(dimethysiloxane) capillary electrophoretic devices, Electrophoresis 2000, 21, 107-115.)
- un ensemble de plus en plus vaste usinable entre autres par moulage par injection et par emboutissage à chaud. Parmi ces derniers, on peut citer des polyamides
(PA), des polycarbonates (PC), des polyoxyméthylènes (POM), le cyclopentadienenorbomen copolymer (COC), des polyméthylmethacrylates (PMMA), le polyéthylène basse densité (PE-ld), le polyéthylène haute densité (PE-hd), le polypropylène (PP), des polystyrènes (PS), le cycloolefin copolymère (COC), le polyetheretherketone (PEEK). (Niggemann M., Ehrfeld W., Weber L.; Fabrication of miniaturized biotechnical devices, SPLE , vol 3511, pp 204 - 213 _ Becker H, Gartner C, Polymer microfabrication methods for microfluidic analytical applications, Electrophoresis 2000, 21, 12-26).
D'autres plastiques encore peuvent être micro-fabriqués: le polybutylèneterphtalate (PBT), le polyphenylène ether (PPE), le polysulfone (PSU), le liquid crystal polymer (LCD), le polyetherimide (PEI).Le polyactide biodégradable peut aussi être micro-fabriqué.
Le PMMA et le PC sont couramment employés dans le moulage par injection et l'estampage à chaud. Le COC est couramment cité dans l'estampage à chaud.
Les procédés de fabrication de masse des plastiques sont très variés. On peut envisager comme procédés :
- l'impression par matrices filiformes (wire imprinting) ( Locascio LF, Gitan M, Hong J, Eldefrawi M, Plastic microfluidic devices for clinical measurements, μ-TAS 1998, 367- 370 _ Chen YH, Chen SH, Analysis of DNA fragments by microchip electrophoresis fabricated on poly(methyl methacrylate) substrates using a wire- imprinting method, Electrophoresis 2000, 21, 165-170)
- l'estampage à chaud (Hot embossing) (Becker H., Dietz W, Dannberg P. Microfluidic manifolds by polymer hot embossing for μ-TAS applications. μ-TAS 1998, Banff, Canada, 253-256. _ Kempen LU, Kunz RE, Gale MT. Micromolded structures for integrated optical sensors. SPLE vol 2639, 278-285.). - le moulage par injection (Hagmann P, Ehrfeld W. Fabrication of microstructures of extrême structural heights by reaction injection molding, International Polymer Processing, 1989, Vol IN, Ν°3, pp 188-195. _ Weber L, Ehrfeld W, Freimuth H, Lâcher M, Lehr H, Pech B. . Micro-moulding - a powerful tool for the large scale production of précise microstructures. Proc. SPIE Symp. Micromachining and Microfabrication, 1996, vol 2879, pp 156- 167.).
- le moulage simple pour les élastomères siliconés (Kumar A, Whitesides GM. Appl. Phys. Lett, 1993, 63, 2002-2004 _ Wilbur JL, Kumar A, kim E, Whitesides GM, Adv. Mat. 1994, 7, 600-604.).
- la photohthographie des photoresists, dont par exemple la lithographie aux rayons X pour le PMMA, la photohthographie UN pour le photopolymère Epson SU-8.
Dans cette dernière, trois procédés sont couramment utilisés (Renaud P., Nan Lintel H, Heusckel M, Guérin L.. Photo-polymer microchannel technologies and applications. μ-TAS 1998, Banff. Canada, ppl7-22.). Ils commencent toutes trois par le dépôt d'une première couche de SU-8 qu'on expose aux UN. Pour la fabrication d'un microcanal, la première couche de photorésist fait le fond dudit micro-canal à section rectangulaire. La deuxième couche de photorésist fait les parois verticales dudit micro- canal. La troisième couche de photorésist termine le capillaire en constituant la partie couvercle.
- le "fill process" . On procède par remplissage avec une couche sacrificielle, comme par exemple l'Araldite GT6063 de Ciba-Geigy entre la deuxième et la troisième couche de photorésist. En fin de process, la couche sacrificielle est dissoute. - le "mask process" . On interpose une couche de métal sur la deuxième couche de photorésist qu'on ne développe pas. Cette deuxième couche de métal masque le microcanal. Une troisième couche de photorésist est déposée puis illuminée. Puis le photorésist est développé à l'intérieur et à l'extérieur dudit micro-canal.
- le "lamination process", un procédé sans dissolution, où l'on déroule une couche de film sec de SU-8 sur la construction faite à partir de la première couche de photorésist pour la sceller.
- la fabrication par progression par couches successives de polymères, avec utilisation de couches sacrificielles, dont par exemple le process utilisé par Webster JR, Burns MA, Mastrangelo CH, Man PF, Jones DK, Burke DT., (Webster JR, Burns MA, Burke DT., Mastrangelo CH , An inexpensive plastic technology for microfabricated capillary electrophoresis chips, μ-TAS 1998, 249-252), une technique qui part de parylène déposé sur du polycarbonate ou du silicium avec utilisation ultérieure de photorésist sacrificiel. L'avantage de cette technique réside dans le scellement des microcanaux naturellement inclus dans la méthode. La micro-fabrication par laser des plastiques est aussi possible, tout en étant réservée à une production unitaire. Ce peut être par exemple l'ablation directe dans la masse ou la découpe d'un joint que l'on glissera en sandwich entre deux couvercles.
Les traitements de surface de plastiques dépendent de l'application et du matériau utilisé. Par exemple, il faut souvent rendre hydrophile une surface hydrophobe. Pour assembler et sceller d'un couvercle des micro-fabrications en plastique, plusieurs procédés existent. On peut citer entre autres :
- le scellement par déroulement à chaud d'une feuille recouvrante de PET d'environ 30 microns coatée avec une couche d'un matériau, le plus souvent un polymère que l'on porte à son point de fusion pour qu'elle se mélange avec le substrat, - le scellement d'un couvercle ou l'assemblage d'une partie complémentaire par collage, ou par pression à chaud, ou par soudure au laser, ou par l'emploi d'ultrasons, ou par l'emploi de plasmas, etc. En ce qui concerne en particulier les séparations électrophorétiques par micro-électrophorèse d'échantillons biologiques, on peut effectuer ces séparations sur des supports gravés, moulés ou emboutis ( Cf. Liu Y, Foote RS, Culbertson CT, Jacobson SC, Ramsey RS, Ramsey JR. Electrophoretic séparations on microchips. J. Microcolumn Séparations, 2000, 12(7), 407-11; Alarie JP, Jacobson SC, Ramsey JM. Electrophoretic injection bias in a microchip valving scheme. Electrophoresis. 2001. Jan;22(2):312-7; Rocklin RD, Ramsey RS, Ramsey JM. A microfabricated fluidic device for performing two-dimensional liquid-phase séparations. Anal Chem. 2000 Nov l;72(21):5244-9; Liu Y, Foote RS, Jacobson SC, Ramsey RS, Ramsey JM. Electrophoretic séparation of proteins on a microchip with noncovalent, postcolumn labeling. Anal Chem. 2000 Oct 1;72(19):4608-13; Khandurina J, McKnight TE, Jacobson SC, Waters LC, Foote RS, Ramsey JM. Integrated system for rapid PCR- based DNA analysis in microfluidic devices. Anal Chem. 2000 Jul l;72(13):2995-3000; Alarie JP, Jacobson SC, Culbertson CT, Ramsey JM. Effects of the electric field distribution on microchip valving performance. Electrophoresis. 2000 Jan;21(l): 100-6.; Khandurina J, Jacobson SC, Waters LC, Foote RS, Ramsey JM. Microfabricated porous membrane structure for sample concentration and electrophoretic analysis. Anal Chem. 1999 May 1;71(9): 1815 ; Waters LC, Jacobson SC, Kroutchinina N, Khandurina J, Foote RS, Ramsey JM. Multiple sample PCR amplification and electrophoretic analysis on a microchip. Anal Chem. 1998 Dec 15;70(24):5172-6. ; Waters LC, Jacobson SC, Kroutchinina N, Khandurina J, Foote RS, Ramsey JM. Microchip device for cell lysis, multiplex PCR amplification, and electrophoretic sizing.Anal Chem. 1998 Jan l;70(l):158-62 ; von Brocke A, Nicholson G, Bayer E. Récent advances in capillary electrophoresis/electrospray-mass spectrometry. Electrophoresis. 2001 Apr;22(7):1251- 66; Schmid MG, Grobuschek N, Lecnik O, Gubitz G. Chiral hgand-exchange capillary electrophoresis. J Biochem Biophys Methods. 2001 Apr 24;48(2): 143-54 ; Nishi H, Kuwahara Y. Enantiomer séparation by capillary electrophoresis utilizing noncyclic mono-, oligo- and polysaccharides as chiral selectors. J Biochem Biophys Methods. 2001 Apr 24;48(2):89-102; Castellanos-Serra L, Hardy E. Détection of biomolecules in electrophoresis gels with salts of imidazole and zinc II: a décade of research. Electrophoresis. 2001 Mar;22(5): 864-73; Colyer C. Noncovalent labeling of proteins in capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence détection. Cell Biochem Biophys. 2000;33(3):323-37; Bonneil E, Waldron KC. On-line solid-phase preconcentration for sensitivity enhancement in capillary electrophoresis. J Capillary Electrophor. 1999 May-Aug;6(3-4):61-73; Horvath J, Dolnik N. Polymer wall coatings for capillary electrophoresis.Electrophoresis. 2001 ;22(4): 644-55 ; Kricka LJ. Microchips, microarrays, biochips and nanochips: personal laboratories for the 21st century. Clin Chim Acta. 2001 May;307(l-2):219-23. Wang J, Chatrathi MP, Tian B ; Brahmasandra SN, Ugaz NM, Burke DT, Mastroangelo CH, Bums MA. Electrophoresis in microfabricated devices using photopolymerized polyacrylamide gels and electrode- defined sample injection. Electrophoresis. 2001 Jan;22(2):300-ll; Dutta D, Leighton DT Jr. Dispersion réduction in pressure-driven flow through microetched channels. Anal Chem. 2001 Feb 1;73(3):504-13; Baldwin RP. Récent advances in electrochemical détection in capillary electrophoresis. Electrophoresis. 2000 Dec;21(18):4017-28 ; Bruin GJ. Récent developments in electrokinetically driven analysis on microfabricated devices. Electrophoresis. 2000 Dec;21(18):3931-51; Krishnan M, Namasivayam N, Lin R, Pal R, Burns MA. Microfabricated reaction and séparation Systems. Curr Opin Biotechnol. 2001 Feb;12(l):92-8; Hutt LD, Glavin DP, Bada JL, Mathies RA. Microfabricated capillary electrophoresis amino acid chirality analyzer for extraterrestrial exploration. Anal Chem. 1999 Sep 15;71(18):4000-6; Chiem ΝH, Harrison DJ. Microchip Systems for immunoassay: an integrated immunoreactor with electrophoretic séparation for sérum theophylline détermination. Clin Chem. 1998 Mar;44(3):591-8; Woolley AT, Lao K, Glazer AN, Mathies RA. Capillary electrophoresis chips with integrated electrochemical détection. Anal Chem. 1998 Feb 15;70(4):684-8; Colyer CL, Tang T, Chiem N, Harrison DJ. Clinical potential of microchip capillary electrophoresis Systems. Electrophoresis. 1997 Sep;l 8(10): 1733- 41).
En résumé, pour la fabrication des supports, on peut choisir du silicium, du verre ou en céramique ou en plastique.
Des lits de micro-colonnes de fractionnement 2 peuvent être gravés sur un support à base de silicium ou de verre ou de céramique. Des lits de micro-colonnes de fractionnement 2 peuvent être micro-moulés ou micro-emboutis à l'aide de matrices en silicium lorsque le support est à base de plastiques. Des lits de micro-colonnes de fractionnement 2 peuvent être revêtus d'un film fin de nature hydrophobe ou hydrophile.
Lorsque le support est à base de plastiques, le réseau micro-particulaire peut être obtenu par micro-moulage ou micro-emboutissage ou photopolymérisation ou thermopolymérisation in situ, ou peut être constitué de micro ou nano-baguettes s'insérant dans ledit ht desdites micro-colonnes.
Un réseau micro-particulaire des micro-colonnes de fractionnement 2 qui constitue les phases stationnaires peut par exemple être obtenu par photogravure lorsque le support est à base de silicium ou de verre ou de céramique. Un réseau micro- particulaire des micro-colonnes de fractionnement 2 qui constitue les phases stationnaires peut par exemple être obtenu par micro-moulage, micor-emboutissage, photopolymérisation ou thermopolymérisation in situ, ou peut être constitué de micro ou nano-baguettes s'insérant dans le lit desdites micro-colonnes. Un réseau micro- particulaire peut être revêtus d'un film fin de nature hydrophobe ou hydrophile. Un réseau micro-particulaire peut être soumis à des chimies de couplage connues de l'Homme de l'Art pour greffer des molécules caractérisées par leur polarité et leur amphipathicité.
Des méthodes d'obtention de revêtement des phases stationnaires sont évoquées par la suite.
On peut effectuer le revêtement des phases stationnaires avec des peptides par greffage, grâce aux chimies de couplage directes ou avec bras espaceurs connues de l'Homme de l'Art, telles que via le bromure de cyanogène, ou le carbodiimide ou le carbonyldiimidazole, ou oxirane ou l'azlactone. Une méthode de plus en plus utilisé est l'immobihsation sur gels tentaculaires de peptides via une fixation par activation de gel epoxy et dérivé azlactone (Pribl M. Bestimmung der Epoxyendgruppen in modifizierten chromatographischen Sorbentien un Gelen. Anal. Chem. 1980. 303. 113-116.).
On peut effectuer le revêtement des phases stationnaires avec des peptides par synthèse peptidique en phase solide, la phase solide servant à la synthèse étant aussi ladite phase stationnaire (Kumar KS, Rajasekharan Pillai NN, Das MR. Synthèses of four peptides from the immunodominant région of hepatitis C viral pathogens using PS TTEGDA support fot the investigation of HCN infection in human blood J. Peptide Res., 2000, 56, 88-96)
On peut greffer de façon coonue des phases stationnaires des microcolonnes de fractionnements 2 de monocouches de lipides de membranes cellulaires tels que par exemple des phosphatidylcholines. (Maget-Dana R. The monolayer technique: a potent tool for studying the interfacial properties of antimicrobial and membrane-lytic peptides and their interactions with lipid membranes. Biochim Biophys Acta. 1999 Dec 15;1462(l-2): 109-40; Mozsolits H, Lee TH, Wirth HJ, Perlmutter P, Aguilar MI. The interaction of bioactive peptides with an immobilized phosphatidylchoiline monolayer. Biophys. J, 1999, 1428-1444, 77, 3.). La détection de molécules à l'aide de micro-leviers est décrite plus en détail dans la suite de la description.
De façon générale, la détection d'interactions spécifiques est possible grâce à la mesure de la variation de propriétés mécaniques de microstructures. Dans la plupart des cas, ces microstructures se présentent sous la forme de micro-leviers. ( Betts TA, Tipple CA, Sepaniak MJ, Datskos PG. Selectivity of chemical sensors based on micro- cantilevers coated with thin polymer films. Anal. Chimica Acta, 2000, 422, 89; Fagan B, Xue B, Datkos P, Sepaniak M.. Modification of micro-cantilevers sensors with sol- gels to enhance performance and immobilize chemically sélective phases. Talanta, 2000, 53, 599; Wadu-Mesthrige K, Amro NA, Garno JC, Xu S, Liu G- Y. Fabrication of nanometer-sized proteins patterns using atomic force microscopy and sélective immobilization. Biophysical Journal. 2001, 80, 1891-1899; Viani MB, Pietrasanta LI, Thompson JB, Chand A, Gebeshuber IC, Kindt JH, Richter M, Hansma HG, Hansma PK. Probing protein-protein interactions in real time. Nat Struct Biol. 2000 Aug;7(8):644-7; Luckham PF, Smith K. Direct measurement of récognition forces between proteins and membrane receptors. Faraday Discuss. 1998;(lll):307-20; discussion 331-43; Micic M, Chen A, Leblanc RM, Moy NT. Scanning électron microscopy studies of protein-functionalized atomic force microscopy cantilever tips. Scanning. 1999 Νov-Dec;21(6):394-7; Bryant Z, Pande VS, Rokshar DS. Mechanical unfolding of a beta-hairpin using molecular dynamics. Biophys J. 2000 Feb ;78 (2): 584- 9; Willemsen OH, Snel MM, van Noort SJ, van der Werf KO, de Grooth BG, Figdor CG, Grève J. Optimization of adhésion mode atomic force microscopy résolves individual molécules in topography and adhésion. Ultramicroscopy. 1999 Oct;80(2): 133-44; Willemsen OH, Snel MM, Kuipers L, Figdor CG, Grève J, de Grooth BG.A physical approach to reduce nonspecific adhésion in molecular récognition atomic force microscopy. Biophys J. 1999 Feb;76(2):716-24; Heinz WF, Hoh JH. Relative surface charge density mapping with the atomic force microscope. Biophys J. 1999 Jan;76(l Pt l):528-38; Eckert R, Jeney S, Horber JK. Understanding intercellular interactions and cell adhésion: lessons from studies on protein-metal interactions. Cell Biol Int. 1997.21(11):707-13; Oberlheithner H, Schneider SW, Henderson RM. Structural activity of a cloned potassium channel (ROMK) monitored with the atomic force microscope : the « molecular sandwich » technique PNAS, 1997, 94(25), 14144-9; You H, Yu L. Investigation of the image contrast of tapping-mode atomic force microscopy using protein-modified cantilever tips. Biophys J. 1997 Dec;73(6):3299-308; Tokunaga M, Aoki T, Hiroshima M, Kitamura K, Yanagida T. Subpiconewton intermolecular force microscopy. Biochem Biophys Res Commun. 1997 Feb 24;231(3):566-9; Mitsui K, Hara M, Ikai A. Mechanical unfolding of alpha2- macroglobulin molécules with atomic force microscope. FEBS Lett. 1996 Apr 29;385(l-2):29-33; Florin EL, Moy NT, Gaub HE. Adhésion forces between individual ligand-receptor pairs. Science. 1994 Apr 15;264(5157):415-7; Fritz J, Baller MK, Lang HP, Rothuizen H, Nettiger P, Meyer E, Guntherodt H, Gerber C, Gimzewski JK. Translating biomolecular récognition into nanomechanics. Science. 2000 Apr 14;288(5464):316-8 ; Baller MK, Lang HP, Fritz J, Gerber C, Gimzewski JK, Drechsler U, Rothuizen H, Despont M, Nettiger P, Battiston FM, Ramseyer JP, Fornaro P, Meyer E, Guntherodt HJ.A cantilever array-based artificial nose. Ultramicroscopy. 2000 Feb;82(l-4):l-9).
Une détection à l'aide de micro-leviers peut être effectuée en mode statique ou en mode dynamique. En mode statique, la formation d'une couche à la surface du levier lors d'une interaction spécifique engendre un effet de contrainte mécanique qui se traduit par une courbure du levier. La sensibilité est dépendante de la raideur du micro-levier. Elle est de l'ordre de 0.1 N/m en général voire inférieure.
En mode dynamique, l'ajout d'une masse consécutive à une interaction spécifique sur un micro-levier résonnant engendre une diminution de sa fréquence de résonance. La sensibilité sera d'autant plus importante que la fréquence de résonance et le facteur de qualité seront élevés. Dans ce cas, les raideurs sont plus importantes entre 1 et 100 N/m et les facteurs de qualité sont compris entre 10 et 500 dans l'air, entre 1 et 10 dans les liquides. La sensibilité d'une telle détection est fortement augmentée si on effectue les mesures sous vide (le facteur de qualité peut atteindre des valeurs supérieures à 104).
Une telle approche suppose que l'on peut mesurer la déflexion dans le cas d'une mesure en statique ou la fréquence de résonance dans le cas d'une mesure en dynamique. On peut effectuer deux types de mesures. Une première approche est basée sur le principe de la déflexion optique laser qui est utilisé comme système de détection dans les microscopes à force atomique commerciaux. Il s'agit d'une détection externe. Cette technique est très sensible et permet d'accéder à des variations de déflexion inférieures à l'angstrom ou à des variations de fréquence de résonance de quelques hertz. Elle est utilisée dans la majeure partie des cas (cf. brevets WO 00/14539 ou US 5,445,008 ou J.Fritz et al., Science 288, 316, 2000).La seconde approche consiste à intégrer sur le micro-levier la fonction de détection. Elles sont en général de type piézorésistive (cf. brevet US 5,807,758 ou J. Thaysen et al., MEMS, 401, Interlaken, Janvier 2001) ou piézoélectrique (cf. Brevets US 5,719,324 ou US 6,054,277). L'avantage de cette deuxième approche est qu'elle permet, même si les sensibilités sont moindres, d'augmenter la compacité du système et surtout d'avoir une transduction électrique directe ce qui le rend facilement intégrable dans un système plus complexe.
On peut revêtir les micro-leviers d'une molécule particulière qui va lui conférer des propriétés d'adsorption ou d'affinité. En ce qui concerne le positionnement de la partie active (traitée spécifiquement pour une reconnaissance moléculaire particuhere) sur la surface du micro-levier, elle peut s'étendre sur toute la surface du micro-levier dans le cas d'une mesure en statique (effet de contrainte).L' effet de contrainte étant maximal à l'encastrement du micro-levier, une surface active réduite à la zone d'encastrement du micro-levier peut être suffisante. Dans le cas d'une mesure en dynamique, si on considère que la masse ajoutée ne modifie pas les propriétés de raideur du micro-levier, la partie active doit être positionnée à l' extrémité du microlevier. Cependant, une partie active couvrant la totalité de la surface du micro-levier est envisageable.
On connaît des techniques de fabrication de micro-leviers simples dans le cas où ils sont utilisés avec une détection optique externe. Des micro-usinages de surface et de volume associés à des dépôts de couches minces permettent d'élaborer des leviers en silicium, en oxyde de silicium, en nitrure de silicium. Ces micro-leviers peuvent être également métallisés (or, platine...). Les dimensions de ces micro-leviers sont typiquement de quelques centaines de microns pour la longueur, quelques dizaines de microns pour la largeur et quelques dixièmes de microns (pour une détection en statique) ou quelques microns (pour une détection en dynamique) pour l'épaisseur. Bien évidemment, les propriétés mécaniques des matériaux utilisés ainsi que les dimensions des micro-leviers vont modifier leurs raideurs et leurs fréquences propres de résonance. La réalisation de micro-leviers intégrant la fonction de détection est plus complexe et nécessite un nombre d'étapes de fabrication plus important. D'autre part, il faut prévoir les connexions électriques et ce nombre de connexions va évidemment croissant avec le nombre de micro-leviers. Dans le cas d'une détection piézoélectrique, le nombre de connexions est égale à 2 par micro-levier, la première pour l'électrode supérieure et la seconde pour l'électrode inférieure. L'électrode inférieure est en général mise à la masse et toutes les électrodes inférieures sont connectées ensemble pour former une masse commune. Il y a donc (n+1) connexions électriques pour n bras de leviers piézoélectriques, ce qui réduit sensiblement le nombre de connexions électriques. L'autre avantage d'une détection piézoélectrique est qu'elle permet d'assurer non seulement la fonction de détection mais également la fonction d'actionnement (mise en résonance dans le cas d'une mesure en dynamique) grâce à l'effet piézoélectrique direct et inverse. Il y a cependant deux inconvénients à utiliser une détection piézoélectrique. Le premier est lié au fait que les technologies d'élaboration de couches minces piézoélectriques (sol-gel ou evaporation radio fréquence) sont complexes et leur compatibilité avec les technologies silicium problématiques (effets d'interface notamment). Le deuxième inconvénient concerne la stabilité des propriétés ferroélectriques et piézoélectriques qui sont sujettes à des dérives thermiques, des effets d'hystérésis et surtout de vieillissement et de fatigue ce qui limite très fortement leur durée de vie pour des utilisations en dynamique.
Dans le cas d'une détection piézorésistive (cf. E. Cocheteau, C. Bergaud, B. Bélier, L. Bary, R. Plana « Formation of ultra-shallow p+/n junctions with BF2 implantation for the fabrication of improved piezoresistive cantilevers », Transducers' 2001/Eurosensors XN, Munich, 10-14 juin 2001), le nombre de connexions est égal à 2 au minimum pour chaque micro-levier soit 2n connexions électriques pour n micro-leviers. Ce nombre peut être égal à 4 si les piézorésistances sont connectées en pont de Wheatstone ce qui donne 4n connexions électriques. L'intégration d'un pont de Wheatstone permet de réduire la compacité du système complet par rapport à un montage avec un pont de Wheatstone externe. En outre, il permet de s'affranchir des effets de dérives thermiques. L'inconvénient d'une détection piezoresistive dans le cas d'une mesure en dynamique est qu'elle suppose que l'on dispose d'une excitation mécanique externe ou bien que les facteurs de qualité des microleviers sont suffisamment importants (>100) pour que la fréquence de résonance soit détectable en bruit blanc (excitation thermomécanique due au mouvement brownien). Il y a deux avantages à utiliser une détection piezoresistive. Le premier est que la réalisation de microleviers piézorésistifs est relativement simple et parfaitement compatible avec les technologies de la microélectronique silicium. Le second avantage est la sensibilité plus importante d'une détection piezoresistive par rapport à une détection piézoélectrique.
La sélectivité des micro-leviers 13, c'est-à-dire leur capacité à capturer des molécules particulières, dépend de la polarité intrinsèque, la solvophobicité et la porosité du matériau qui constitue le micro-levier ou un film fin revêtu sur le microlevier, et selon la polarité et la solvophobicité des groupements fonctionnels greffés sur le micro-levier. La sélectivité des micro-leviers 13 dépend également de critères comme l'échange d'ions et l'affinité des groupements fonctionnels, des conditions successives de micro-élution secondaire dans les micro-colonnes de fractionnement 2 ainsi que des conditions successives de micro-extraction et de micro-digestion conduites en amont desdits micro-leviers 13.
La capture d'une molécule, et notamment d'une protéine, par un microlevier 13 peut être effectuée par affinité. C'est le cas par exemple lorsque le microlevier a été revêtu avec un anticorps. Dans ce cas, le micro-levier capture une protéine précise, connue, et en indique la présence.
La capture d'une molécule, et notamment d'une protéine, par un microlevier 13 peut être effectué par adsorption. Dans ce cas, un même micro-levier sera apte à détecter une catégorie de protéines présentant des propriétés d'adsorption similaires. Des protéines non connues ou recherchées à priori pourront être détectées. En effectuant des comparaisons d'empreintes sur des échantillons différents, on pourra dégager des différences d'empreintes, notamment des différences de détections sur des micro-leviers 13 d'adsorption. Par la suite, en reproduisant la capture avec les mêmes étapes de sélection, on peut isoler les protéines différentes ainsi obtenues pour les analyser plus spécifiquement.
Dans un mode de réalisation dans lequel le dispositif d'analyse ne comprend pas de micro-colonnes de fractionnement secondaire, une elution pas à pas ou avec gradient permet le passage d' éluant secondaires différents entraînant différentes molécules selon leur affinité avec ces molécules et l'affinité des micro-leviers avec ces mêmes molécules. Des empreintes successives sont enregistrées, à chaque pas d'élution pour une elution pas à pas, ou à des instants différents pour une elution avec gradient d'élution. Comme on l'a déjà indiqué des lavages successifs sur les micro-leviers 13 peuvent être effectués, la rétention des micro-éluats secondaires ou des micro-extraits secondaires ou des produits de digestion secondaires des produits de fractionnements sur les micro-leviers 13 étant mesurée par la déviation ou par la fréquence de vibration desdits micro-leviers 13, plusieurs empreintes successives étant enregistrées. La série d'empreintes successives de détection du premier échantillon sur micro-leviers 13 est par exemple comparée ensuite à la série d'empreintes successives de détection sur micro-leviers 13 d'un deuxième échantillon. Pour un lavage des micro-leviers, on prévoit le passage dans les zones de détection d'un éluant apte à entraîner des molécules retenues sur les micro-leviers 13. Selon la sélectivité des micro-leviers 13 d'une zone de détection, on prévoit d'adapter le composition de l' éluant pour favoriser le décrochage des molécules retenues.
Le passage d' éluant de lavage dans les zones de détection peut être effectuée à l'aide de micro-canaux de capture 8, dans lesquels on envoie un éluant de lavage.
Dans une variante, on prévoit un circuit supplémentaire de lavage permettant d'amener un éluant de lavage directement en amont d'une zone de détection. Un tel mode de réalisation est préférable dans le cas où le dispositif d' analyse comprend des micro-colonnes de fractionnement secondaires.
Sur la figure 12, on a repris les références aux éléments semblables à ceux de la figure 3. Une micro-colonne de fractionnement 2 est intersectée au niveau d'un élément terminal par un micro-canal de capture 8, reliée en amont de l'intersection à un conduit d'alimentation en éluant secondaire 15, et comprenant en aval de l'intersection une micro-colonne de fractionnement secondaire 10. Une zone de détection 11 comprenant des micro-leviers 13 est située sur le micro-canal de capture 8 en aval de la micro-colonne de fractionnement secondaire 10. Un micro-conduit de lavage 70 comprend un orifice d'entrée 71 pour l'alimentation en éluant de lavage, et un orifice de sortie 72 débouchant dans le micro- canal de capture 8, en aval de la micro-colonne de fractionnement secondaire 10, et en amont de la zone de détection 11.
Si un éluant de lavage est amené par le micro-canal de capture 8 en traversant la micro-colonne de fractionnement secondaire 10, l' éluant de lavage entraînera des molécules retenue dans la micro-colonne de fractionnement secondaire 10. Le micro-conduit de lavage 70 permet d'amener l'éluant de lavage directement en amont de la zone de détection pour un lavage des micro-leviers 13, sans lavage de la micro-colonne de fractionnement secondaire 10.
Dans une première variante du dispositif d'analyse, on peut prévoir une détection supplémentaire, en aval des zones de détection li a l'aide de micro-leviers 13, par exemple par spectrométrie de masse. Des méthodes de spectrométrie de masse sont évoquées par la suite.
Dans une seconde variante, après une comparaison d'empreintes successives de deux échantillons, on prévoit qu'une détection des micro-éluats secondaires ou des micro-extraits secondaires ou des produits de digestion secondaires des produits de fractionnement est effectuée par spectrométrie de masse, mais essentiellement sur les zones de détection 11 où la série d'empreintes par micro-leviers 13 du premier échantillon diffère de la série d'empreintes par micro-leviers 13 du deuxième échantillon. On peut effectuer des détection par spectrométrie de masse de façon connue, comme cela est exposé dans les documents suivants : (Cf. Dongré AR, Eng JK, Yates JR LU. Emerging tandem-mass spectrometry techniques for the rapid identification of proteins. TiBTECH, 1997, 15, 418-425; Anderegg RJ, Wagner DS, Blackburn RK, Opiteck GJ, Jorgenson JW. A multidimensional approach to protein characterization. Journal of Protein Chemistry, 1997, 16, 5 ; Huang P, Jin X, Chen Y, Srinivasan JR, Lubman DM. Use of a mixed mode packing and voltage tuning for peptide mixture séparation in pressurized capillary electrochromatography with an ion trap storage/reflectron Time-of-Flight mass spectrometer detector. Anal. Chem, 1999, 71, 1786-1791 ; Martin SE, Shabanowitz J, Hunt DF, Marto JA. Subfemtomole MS and MS/MS peptide séquence analysis using Nano-HPLC micro-ESI Fourier Transform Ion Cyclotron Résonance Mass Spectrometry; Anal. Chem 2000, 72, 4266-4274; Gafiin CL, Eng JK, Cross ST, Detter JC, Yates JR LU. Automated identification of amino-acid séquence variation in proteins by HPLC/Microspray tandem Mass Spectrometry. Anal. Chem, 2000, 72, 757-763; Ji J, Chakraborty A, geng M, Zhnag X, Amini A, Bina M, Régnier F. Strategy for qualitative and quantitative analysis in proteomics based on signature peptides. Journal of Chromatography B, 2000, 745, 197-210 ; Nan Pelt CK, Corso TΝ, Schultz GA, Lowes S, Henion J. A four-column parallel chromatography system for isocratic or gradient LC/MS analyses. Anal. Chem. 2001, 73, 582-5888; Patterson SD et al. Towards defining the urinary proteome using liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Proteomics 2001, 1, 93-107 et 2, 108-117). Des techniques de spectrométrie de masse, ainsi que des solutions d'interfaçage entre la chromatograhie en phase liquide et lesdites techniques de spectrométrie de masse ont été décrites dans l'ouvrage de Niessen, "Liquid Chromatography - Mass Spectrometry, vol 79, Chromatographie Science Séries, Ed Jack Cazes, et le couplage LC-MS appliqué à l'analyse des protéines a été plus particulièrement décrit au chapitre 15, pp 501 - 537. La détection par spectrométrie de masse peut notamment être couplée de façon connue à deux méthodes de séparation préalable par chromatographie en phase liquide (notation abrégée LC-MS (LC = liquid chromatography, MS = mass spectrometry)). ( Cf. Link AJ, Eng J, Schieltz DM, Carmack E, Mize GJ, Morris DR, Garvik BM, Yates JR III. Direct analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nature Biotechnology, 1999, 17, 676-681; Washburn MP, Wolters D, Yates JR UI. Large-scale analysis of the yeast proteome by multi-dimensional protein identification technology. Nature Biotechnology. 2001, 19, 242-247; Davis MT, Beierle J, Bures ET, Mac Ginley MD, Mort J, Robinson JH, Saphr CS, YU W, Luethy R, Patterson SD. Automated LC-LC-MS-MS platform using binary ion-exchange and gradient reversed-phase chromatography for improved proteomic analyses. Journal of Chromatography B, 2001, 752, 281-291 ; Zhou H, Watts JD, Aebersold R. A systematic approach to the analysis of protein phosphorylation, 2001, 375-382).
Une détection par spectrométrie de masse peut également être couplée de façon connue à une séparation des peptides et des protéines en capillaires ou sur supports miniaturisés avec micro-canaux ou micro-colonnes par micro- chromatographie, micro-électrochromatographie ou micro-électrophorèse. (Cf. Xie S.,
Allington R.W., Svec F., Fréchet J. Rapid reverse-phase séparation of proteins and peptides using optimized moulded monolithic poly(styrene-co-divinylbenzene) columns; Josic D., Buchacher A., Jungbauer A. Monoliths as stationary phases for séparation of proteins and polynucleotides and enzymatic conversion. Journal of
Chromatography B, 2001, 752, 191-205; Walhagen K, Unger KK, Hearn MTW,
Capillary electroendoosmotic chromatography of peptides, Journal of Chromatography
A, 2000, 887, 165-185 ; Krull IS, Sebag A, Stevenson R, Spécifie applications of capillary electrochromatography to biopolymers, including proteins, nucleic acids, peptide mapping, antibodies, and so forth, Journal of chromatography A, 2000, 887,
137-136. ; He B, Ji J, Régnier FE. Capillary electrochromatography of peptides in a micro-fabricated system. Journal of Chromatography A, 1999, 853, 257-262).Pour une détection par spectrométrie de masse, on peut utiliser l'ionisation en nébulisation, comme par exemple la spectrométrie de masse en tandem avec ionisation en electrospray (ESI-MS, ou Electrospray Ionisation Mass Spectrometry) ou en désorption, comme par exemple la désorption sur matrice et assistée par laser dans la spectrométrie de masse MALDI (Martix Assisted Laser Désorption Ionization).
On peut prévoir l'utilisation d'une détection par spectrométrie de masse par triple quadrupole, ou par piège à ions (Ion Trap) ou en tandem avec ionisation en electrospray (ESI-MS-MS, ou ou Electrospray Ionisation Tandem Mass Spectrometry), on peut tirer profit de la dissociation par collision (CID, ou Collision Induced Dissociation): chaque peptide est susceptible de posséder un spectre de masse de dissocation par collision archivé dans les banques de données (Cf. Figeys D, Ning Y, Aebersold R. A microfabricated device for rapid protein identification by microelectrospray Ion Trap mass Spectrometry. Anal Chem, 1997, 69, 3153-3160) .
Des documents décrivent plus particulièrement la détection des peptides, protéines et carbohydrates par spectrométrie de masse.
Les polypeptides sont analysés par spectrométie de masse avant ou après digestion enzymatique (Cf. Roepstroff P. Mass spectrometry in protein studies from génome to function. Current Opinion in Biotechnology, 1997, 8, 6-13), par des techniques de spectrométrie de masse utilisant l'ionisation en nébulisation ou en désorption.
Les modifications post-traductionnelles des protéines peuvent être étudiées en soumettant les analytes à des phosphatases ou des glycosylases (Cf. Qin J, Chait BT. Identifications and characterization of posttranslational modifications of proteins by MALDI Ion Trap mass spectrometry . Anal Chem, 1997, 69, 4002-4009.) Lorque l'analyse par spectrométrie de masse a lieu après digestion avec une endopeptidase donnée, on peut comparer les spectres des masses observées avec les banques des spectres des masses théoriques des résidus de digestion avec ladite endopeptidase.
En spectrométrie de masse MALDI, les échantillons peuvent être déposés sur des membranes de poly(vinylidene difluoride), ou de polyurethane (Cf. Me Comb ME, Oleschuk RD, Manley DM, Donald L, Chow A, O'neil JD, Ens W, Stabding KG, Perreault H. Use of non-porous polyurethane membrane as a sample support for matrix-assisted laser désorption ionisation time-of-flight mass spectrometry of peptides and proteins. Rapid Commun Mass Spectrom, 1997, 11 (15), 1716-22) . Tout comme les peptides et les protéines, on peut prévoir d'analyser les glycoproteines par spectrométrie de masse (Cf. Ninh J, Loyaux D, Redeker N, Rossier R.. Sequencing of branched peptides with CLD/PSD MALDI-TOF in the low picomoles range: application to the structural study of the posttranslational polyglycylation of tubulin. Anal. Chem, 1997, 69, 3979-3985; Harvey DJ. Identification of protein-bound carbohydrates by mass spectrometry. Proteomics 2001, 1, 311-328; Yamagaki T, Nakanishi H. Ion intensity analysis of post-source decay fragmentation in curved-field reflectron matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of carbohydrates: for structural characterization of glycosylation in proteome analysis. Proteomics 2001, 1, 329, 339).
Sur la figure 4, les références aux éléments semblables à la figure 3 ont été reprises. Un premier support 20, sous la forme d'une plaque plane, comprend un canal d'alimentation 4 prévu pour l'alimentation en phase mobile et comprenant une zone d'enrichissement 21 de la phase mobile en échantillon. Le premier support 20 comprend une micro-colonne de fractionnement 2 comprenant une portion de micro-canal 3 muni d'un orifice d'introduction 3a en communication fluidique avec un canal d'alimentation 4 en aval d'une zone d'enrichissement 18 d'une phase mobile en échantillon, et un orifice d'évacuation 3b. Le premier support 20 comprend un micro-canal de capture 8 intersectant la micro-colonne de fractionnement 2 au niveau d'un élément terminal 9, et un canal d'alimentation en éluant secondaire 15 en communication fluidique avec une entrée du micro-canal de capture 8 en amont de l'intersection avec la micro-colonne de fractionnement 2. Un second support 22, sous la forme d'une plaque plane, comprend un micro-conduit 23 débouchant à une extrémité dans une micro-colonne de fractionnement secondaire en communication fluidique du côté opposé avec une zone de détection 11 pourvue de micro-leviers 13.
Un troisième support 24, également sous la forme d'une plaque plane, comprend un canal d'évacuation 6.
Les second et troisième supports 22, 24 sont disposés de part et d'autre du premier support 20, parallèlement au premier support, en étant accolés à ce dernier, de façon que le canal d'évacuation 6 du troisième support 24 est en communication fluidique avec l'orifice d'évacuation 3b de la micro-colonne de fractionnement 2, et le micro-conduit 23 du second support est en communication fluidique avec le micro-canal de capture 8, en aval de l'intersection avec la micro-colonne de fractionnement 2.
Sur la figure 5, où les références aux éléments semblables à ceux de la figure 4 ont été reprises, un premier support 20 comprend une pluralité de microcolonnes de fractionnement 2, et une pluralité de micro-canaux de capture 8 associés. Le second support 22 comprend une pluralité de micro-conduits en communication fluidique avec les micro-canaux de capture 8, et une pluralité de zone de détection 11. Le troisième support 24 comprend un canal d'évacuation 6 en communication fluidique avec l'ensemble des orifices d'évacuation 3b des micro-canaux 3. Les premiers, second et troisième support 20, 22, 24 sont disposés parallèlement.
Dans une variante de disposition des supports illustrée par les figures 6 et 7, les second et troisième support 22, 24 sont agencés perpendiculairement au premier support 20. Sur la figure 6, le premier support 20 comprend une unique micro-colonne de fractionnement 2. Sur la figure 7, le premiers support 20 comprend une pluralité de micro-colonnes de fractionnement 2, les second et troisièmes supports 22, 24 étant adaptés en conséquence.
Sur la figure 8, un support comprend quatre lots de micro-colonnes de fractionnement 2 agencés sensiblement en étoile. Les micro-colonnes de fractionnement 2 du premier lot s'inscrivent dans une fourchette de longueur petites. Les microcolonnes de fractionnement 2 du deuxième lot s'inscrivent dans une fourchette de longueurs plus grandes, celles du troisième lot s'inscrivent dans une fourchette de longueurs encore plus grandes, celles du quatrième lot s'inscrivent dans une fourchette de longueurs encore supérieures. Le support comprend micro-colonne d'enrichissement centrale 25 de forme carrée, en communication fluidique d'où est issue chacune des micro-colonnes de fractionnement des lots, au centre de laquelle débouche un canal d'introduction de l'échantillon situé dans un plan vertical, et non représenté sur la figure 8. Afin d'améliorer encore la sensibilité du dispositif d'analyse, c'est-à-dire sa capacité à détecter des protéines, on peut prévoir des extractions préalables des constituants de l'échantillon, avant l'introduction de l'échantillon dans les microcolonnes de fractionnement.
Sur la figure 9, un étage d'extraction préalable 30 comprend un support 31 représenté partiellement et pourvu d'une pluralité de mico-colonnes de fractionnement préalable 32 rectilignes parallèles et de même longueur, d'un canal d'alimentation 33 en communication fluidique avec les micro-colonnes de fractionnement 32, et un canal d'évacuation 34 en communication fluidique avec les micro-colonnes de fractionnement 32 du côté opposé au canal d'alimentation 33. Les micro-colonnes de fractionnement 32 sont formées par des portions de micro-canaux munies de moyens de séparation intermédiaires. Le support 31 comprend de moyens de capture fluidique 35 sous la forme de micro-canaux de capture 36, alimenté en éluant d'un côté à partir d'un conduit d'alimentation 37, et en communication fluidique du côté opposé avec un conduit de récupération 38 commun. Chaque micro-canal de capture traverse transversalement une micro-colonne de fractionnement 32 au niveau d'un élément terminal situé à proximité d'un orifice d'évacuation de la micro-colonne de fractionnement 32 du côté du canal d'évacuation 34. L'échantillon transporté par une phase mobile est amené par le canal d'alimentation 33, circule dans les micro-colonnes de fractionnement 32, où il subit une séparation en fonction d'une sélectivité des moyens de séparation des micro-colonnes de fractionnement 32. L'association d'une pluralité de micro-colonnes de fractionnement 32 permet une séparation importante dans des micro-colonnes de fractionnement 32 de faible diamètre, sans limiter un débit d'une phase mobile enrichie en échantillon. Les moyens de captures 35 permettent des captures successives des constituants de l'échantillon présents à un instant donné de capture au niveau de l'élément terminal d'intersection des micro-canaux de capture 36 avec les micro- colonnes de fractionnement 32.
Après une capture, on récupère dans le conduit de récupération 38 une portion des constituants de l'échantillon, qui est acheminée vers des micro-colonnes de fractionnement et des zones de détection tels que décrit précédemment. Les constituants séparés lors l'extraction préalable dans un lot de micro-colonnes de fractionnement préalable 32 possédant une sélectivité particulière pourront être mieux séparés par la suite en adaptant la sélectivité d'un ou plusieurs lots de micro-colonnes de fractionnement d'analyse vers lequel la portion capturée est acheminée.
Dans un lot de micro-colonnes de fractionnement d'extraction préalable, les micro-colonnes sont de longueurs égales afin de récupérer en extrémité de chaque micro-colonne sensiblement les mêmes constituants. En outre, les produits capturés sur différentes portions sont évacués collectivement dans un conduit de séparation. Au contraire, dans un lot de micro-colonne de fractionnement d'analyse, les micro-colonnes de fractionnement peuvent être de longueur différentes pour permettre un fractionnement différentiel, et chaque micro-canal de capture communique avec une zone de détection associée.
Dans un dispositif d'analyse, on peut prévoir une pluralité de lots de microcolonnes de fractionnement préalable possédant chacun une sélectivité de séparation différente, et communiquant chacun avec une pluralité de lots de micro-colonnes de fractionnement d'analyse, chaque lot de micro-colonnes de fractionnement d'analyse possédant une sélectivité particulière, de préférence adaptée en fonction de la sélectivité du lot d'extraction préalable.
Sur la figure 10, où les références aux éléments semblables à ceux de la figure 9 ont été reprises, un support 31 comprend un unique micro-canal de capture 36 traversant successivement les micro-colonnes de fractionnement préalable 32 d'un même lot, et débouchant finalement dans le conduit de récupération 38.
Sur la figure 11, où les références aux éléments semblables à ceux de la figure 9 ont été reprises, chaque micro-canal de capture 36 comprend une portion amont 36a située entre le conduit d'alimentation 37 et l'intersection avec la micro-colonne de fractionnement préalable 32, et une portion aval 36b située entre la micro-colonne de fractionnement préalable 32 et le conduit de récupération 38. La portion amont 36a et la portion aval 36b débouchent sur la micro-colonne de fractionnement préalable 32 en des points décalés, aux extrémités d'un segment de capture 40. La portion amont 36a débouche à l'extrémité aval du segment de capture 40, la portion aval 36b débouchant à l'extrémité amont du segment de capture 40.
Lors d'une capture, les constituants séparés de l'échantillon situés au niveau du segment de capture 40 seront capturés. Ainsi, on capture un plus grand nombre de constituants lors d'une même capture.
Ces moyens de capture avec micro-canal de capture à portion aval et amont décalées peut également être appliqués sur des micro-colonnes de fractionnement principal, comme cela est représenté sur la figure 14.
Sur la figure 14, où les références aux éléments semblables à ceux de la figure 3 ont été reprises, un support 1 comprend des micro-colonnes de fractionnement 2, des micro-canaux de captures 8 associés munis de portions amonts 8a et de portion avals 8b décalées, débouchant dans chaque micro-colonne de fractionnement 2 respectivement en aval et en amont d'un segment de capture 40.
La portion aval 8b d'un micro-canal de capture 8 débouche en aval sur une zone de détection 11 munie de micro-leviers 13. Un canal de sortie 45 relie l'ensemble des micro-canaux de capture 8 en aval des zones de détection 11, pour une évacuation des phases mobiles et des constituants non retenus par les micro-leviers sélectifs. Le support 1 comprend un micro-conduit de lavage 46 en communication fluidique avec chacun des micro-canaux de capture 8, directement en amont des zones de détection 11. Lors d'une capture, un éluant de capture, différent de la phase mobile enrichie en échantillon circulant dans les micro-colonnes de fractionnement 2, circule à contre-courant dans le segment de capture 40. L' éluant possède avec les constituants situés dans le segment de capture 40 à l'instant de la capture une affinité différente de la phase mobile. Les moyens de séparation étant cependant les mêmes, i.e. ceux de la micro-colonne de fractionnement 2, la sélectivité obtenue lors du passage de l' éluant de capture dans le segment de capture 40 est différente de la sélectivité obtenue pendant le passage de la phase mobile. En conséquence, pendant la capture, on réalise une séparation secondaire des produits de fractionnement situés dans le segment de capture 40. Pour améliorer encore la détection et la séparation des constituants, on peut prévoir qu'une micro-colonne de fractionnement comprend une portion terminale pourvue d'une sélectivité différente de la sélectivité de la portion amont de la micro- colonne. Compte tenu de la sélectivité de la portion amont, on sait que des constituants possédant certaines caractéristiques migreront plus rapidement et atteindront en premier la portion terminale. La sélectivité de la portion terminale est alors adaptée pour une séparation supplémentaire des constituants parvenant sensiblement au même moment en bout de la micro-colonne de fractionnement.
Cette différence de sélectivité d'une portion d'une micro-colonne de fractionnement peut être appliquée à une micro-colonne de fractionnement, une microcolonne de fractionnement secondaire, une micro-colonne de fractionnement préalable. Par portion terminale, on entend une portion située juste en amont d'une sortie ou de moyens de capture.
Dans le cas d'une application aux micro-colonnes de fractionnement ou aux micro-colonnes de fractionnement préalable, on pourra de façon avantageuse prévoir une portion terminale à sélectivité différente juste en amont d'un élément terminal de capture d'une micro-colonne de fractionnement préalable. Ainsi, on réalise un fractionnement ou une extraction préalable précis, permettant d'isoler des constituants d'un échantillon à partir d'un nombre de constituants initial très important, pour une détection plus précise par la suite.
Sur la figure 13, où les références aux éléments semblables à ceux de la figure 1 ont été reprises, un support d'analyse 1 comprend des moyens d'alimentation en échantillon et en phase mobile séparés.
Un support 1 représenté partiellement comprend un canal d'alimentation en échantillon 4 comprenant un orifice d'introduction 4a et un orifice d'évacuation 4b. Les orifices d'introduction 3a des micro-colonnes de fractionnement 2 débouchent dans le canal d'ahmentation en échantillon 4. Le support 1 comprend également un canal d'alimentation en phase mobile
41, et des micro-conduits d'alimentation en phase mobile 42 comprenant un orifice d'entrée 43 débouchant dans le canal d'alimentation en phase mobile 41, et un orifice de sortie 44 débouchant dans le canal d'alimentation en échantillon 4. Chaque orifice d'évacuation d'un micro-conduit d'alimentation en phase mobile 42 débouche dans le canal d'alimentation en échantillon 4 en regard d'un orifice d'introduction 3a d'une micro-colonne de fractionnement 2.
Chaque micro-conduit d'alimentation en phase mobile 42 prolongé par une micro-colonne de fractionnement 2 forme un micro-canal intersectant le canal d' ahmentation en échantillon 4. En d'autres termes, un micro-conduit d'alimentation en phase mobile 42 peut être envisagé comme une portion d'un micro-canal dénuée de moyens de séparation, et située en amont d'une portion de micro-canal munie de moyens de séparation et formant ainsi une micro-colonne de fractionnement 2, le micro-canal d'alimentation en échantillon 4 intersectant l'ensemble des micro-canaux au niveaux de l'orifice d'introduction 3a des micro-colonnes de fractionnement 2.
En fonctionnement, un échantillon circule dans le canal d'alimentation en échantillon 4, de l'orifice d'introduction 4a vers l'orifice d'évacuation 4b. Pour provoquer le passage d'une phase mobile enrichie en échantillon dans les microcolonnes de fractionnement 2, en vue d'une séparation et d'une détection, on provoque une circulation de phase mobile dans les micro-conduits d'alimentation en phase mobile 42. La phase mobile traverse transversalement le canal d'alimentation en échantillon 4 en s' enrichissant en échantillon, puis est récupérée en aval par les micro-colonnes de fractionnement 2.
Les micro-conduits d'alimentation en phase mobile 42 permettent à un instant donné une injection simultanément dans toutes les micro-colonnes de fractionnement 2 d'une même quantité de phase mobile enrichie en échantillon. Une différence de débit de phase mobile enrichie d'une micro-colonne de fractionnement 3 à une autre pourrait entraîner des variations de détection en amont des micro-colonnes de fractionnement 3, notamment si on a prévu une capture simultanée de produits de fractionnement au niveau d'éléments terminaux des micro-colonnes de fractionnement. Dans le cas d'un dispositif d'analyse comprenant un étage d'extraction préalable, on peut bien entendu prévoir en amont de l'étage d'extraction préalable une zone de capture d'échantillon tel que décrit ci-dessus.
On a décrit indifféremment une détection de protéines ou de peptides. Une cellule biologique comporte un grand nombre de protéines, pouvant générer après digestion un nombre plus grand encore de peptides. Dans le cas où l'on souhaite analyser les peptides, on prévoit une digestion enzymatique préalable de protéines, par exemple par la trypsine.
Afin d'améliorer la détection des peptides en grand nombre, on peut prévoir en amont de micro-colonnes une ou plusieurs micro-colonnes de tri, et notamment une micro-colonne de tri par chromatographie par exclusion de taille, déjà évoquée auparavant.
Dans la suite de la description, des exemples d'analyses possibles à l'aide d'un dispositif d'analyse selon un aspect de l'invention sont fournis. Exemple 1
On peut analyser deux échantillons biologiques, chacun à l'aide de 8 supports du type représenté sur la figure 8. Sur les supports, les échantillons sont séparés par électrochromatographie supplée par pression complémentaire.
Par exemple, chacun des supports contients 4 lots de 1000 microcolonnes de fractionnement présentant un gradient de longueur, avec une différence de longueur minimale de 20 microns entre deux micro-colonnes, si bien qu'entre la plus première et la dernière des 1000 micro-colonnes, il existe une différence de longueur de 20 mm. Les 1000 microcolonnes de fractionnement du premier lot présentent des longueurs comprises entre 12 et 14 cm. Les 1000 microcolonnes du deuxième lot présentent des longueurs comprises entre 14 et 16 cm. Les 1000 microcolonnes du troisième lot présentent des longueurs comprises entre 16 et 18 cm. Les 1000 microcolonnes du quatrième lot présentent des longueurs comprises entre 18 et 20 cm. On peut nommer un tel format de support par l'abréviation (FC, 4, 1000, 20, 12-14, 14- 16, 16-18, 18-20) ou de façon plus compacte par (FC, 4, 1000, 20, 12-20).
Les supports employés comprennent des micro-canaux de capture. Les produits de fractionnement adsorbés à l'instant t sur une micro-colonne de fractionnement à l'endroit d'intersection avec ledit micro-canal de capture correspondant sont capturés simultanément, et subissent des micro ou nano-élutions secondaires, orthogonales, parallèles, terminales, simultanées.
Les micro-canaux de capture débouchent sur des zones de détection à microleviers avec détection optique.
Les phases stationnaires des micro-colonnes de fractionnement du premier support (FC, 4, 1000, 20, 12-20) sont greffées avec des molécules chaînes alkyl C30. Un tel support peut être dénomé (FC, 4, 1000, 20, 12-20)-C30.
Les phases stationnaires des micro-colonnes de fractionnement du second support (FC, 4, 1000, 20, 12-20) sont greffées avec des molécules butyl. (FC, 4, 1000, 20, 12-20)-butyl. Les phases stationnaires des micro-colonnes de fractionnement du troisième support (FC, 4, 1000, 20, 12-20) sont greffées avec des molécules cyclo-hexyl. Un tel support peut être dénomé (FC, 4, 1000, 20, 12-20)-cyclohexyl.
Les phases stationnaires des micro-colonnes de fractionnement du quatrième support (FC, 4, 1000, 20, 12-20) sont greffées avec des molécules phenyl. Un tel support peut être dénomé (FC, 4, 1000, 20, 12-20)- phenyl. Les phases stationnaires des micro-colonnes de fractionnement du cinquième support (FC, 4, 1000, 20, 12-20) sont greffées avec des molécules ethyl. Un tel support peut être dénomé (FC, 4, 1000, 20, 12-20)-ethyl.
Les phases stationnaires des micro-colonnes de fractionnement du sixième support (FC, 4, 1000, 20, 12-20) sont greffées avec des molécules amino-propyl. Un tel support peut être dénomé (FC, 4, 1000, 20, 12-20)-amino-propyl.
Les phases stationnaires des micro-colonnes de fractionnement du septième support (FC, 4, 1000, 20, 12-20) sont greffées avec des molécules dihydroxypropyl. Un tel support peut être dénomé (FC, 4, 1000, 20, 12-20)-dihydroxypropyl Les phases stationnaires des micro-colonnes de fractionnement du huitième support (FC, 4, 1000, 20, 12-20) sont greffées avec des molécules cyanopropyl. Un tel support peut être dénomé (FC, 4, 1000, 20, 12-20)- cyanopropyl.
Chaque zone de détection associé à un micro-canal de capture comprend huit microleviers chacun muni d'un revêtement spécifique. Par exemple, le premier peut avoir un revêtement à base de chaînes alkyl C30, le deuxième un revêtement à base de chaînes octadecyl, le troisième un revêtement à base de chaînes octyl, le quatrième à bases de chaînes butyl, le quatrième à base de chaînes phenyl, le cinquième à base de chaînes cyclo-hexyl, le cinquième à base de chaînes ethyl, le sixième à base de chaînes amino-propyles, le septième à base de chaînes dihyroxypropyl, le huitième à base de chaînes cyanopropyl.
Les solvants de base pour les élutions primaires des chromatographies de fractionnement effectuées sur les supports de format (FC 4, 1000, 20, 12-20) peuvent être des mélanges ternaires eau, acide trifluoro-acétique (TFA), acétonitrile. On peut prévoir six pas d'élution primaire, l'éluant utilisé lors de chaque pas présentant successivement les variantes de composition suivantes : (eau, 10% acétonitrile, TFA 0,1%). (eau, 15% acétonitrile, TFA 0,1%), (eau, 20% acétonitrile, TFA 0,1%), (eau, 25% acétonitrile, TFA 0,1%), (eau, 30% acétonitrile, TFA 0,1%), (eau, 35% acétonitrile, TFA 0,1%).
On prévoit cinq paliers d'élution secondaire pour chaque palier d'élution primaire avec des éluants présentant successivement les variantes de composition suivantes : (eau, 15% acétonitrile, TFA 0,1%), (eau, 16% acétonitrile, TFA 0,1%), (eau,
17% acétonitrile, TFA 0,1%), (eau, 18% acétonitrile, TFA 0,1%), (eau, 19% acétonitrile, TFA 0,1%).
On réalise pour chaque échantillon les séries d'empreintes successives évoquées ci-dessus. La série d'empreintes successives du premier échantillon est comparée ensuite à la série d'empreintes successives du deuxième échantillon, les séries d'empreintes de détection étant ensuite archivées dans une base de données informatiques.
Là où sont détectées des différences, les fractionnements sont prélevés et analysés par l'une des nombreuses méthodes d'analyse connues de l'Homme de l'Art. Le procédé est applicable à toute recherche d'expression différentielle de protéines pour un tissu donné notamment pour la comparaison d'un individu sain et d'un individu souffrant d'une pathologie. Il est applicable également à la comparaison de l'expression des protéines dans deux situations physiologiques différentes. Il aussi applicable à la comparaison de l'expression de protéines chez deux souches de micro- organismes (virus, bactéries, levures), ou applicables à la détection d'expressions différentielles de protéines sur micro-organismes (virus, bactéries, levures) soumis à des stimuli précis.
Exemple 2
On peut utiliser le dispositif pour comparer des empreintes de protéines basiques entre deux échantillons. Chaque échantillon est analysé sur un support du type représenté sur la figure 8, et de format (FC, 4, 1000, 20, 12-20), conformément à la dénomination utilisée dans l'exemple 1.
Ces supports sont du type en plastique et des micro-colonnes de fractionnement monolithes macroporeuses synthétisées in situ. Les micro-colonnes de fractionnement sont à caractère fortement zwitterionique et contiennent des copolymeres à base de sulfoalkylbetaine (N,N-dimethyl-N-methacryloyloxyethyl-N-(3- sulfopropyl) ammonium betaine (Cf. Niklund C, Sjorgen A, Irgum K, Νes I. Anal. Chem. 2001. Feb 1, 73,(3) , 444-52).
Les protéines basiques sont séparées dans les micro-colonnes de fractionnement selon différentes méthodes avec des éluant primaires (éluant A :eau; éluant B: eau, 10 mM phosphate de sodium). Les produits de fractionnement sont séparés dans des micro-colonnes de fractionnement secondaire située en aval de moyens de capture. Les élutions secondaires sont modulées par des ions thiocyanate (éluant primaire + 10 mM thiocyanate) ou par des ions perchlorate (éluant primaire + 10 mMperchlorate).
La série d'empreintes successives du premier échantillon est comparée à la série d'empreintes successives du deuxième échantillon, les séries d'empreintes étant ensuite archivées dans une base de données informatiques. Là où sont détectées des différences, les fractionnements sont prélevés et analysés par l'une des nombreuses méthodes d'analyse connues de l'Homme de l'Art.
Exemple 3
On peut comparer spécifiquement les empreintes de peptides et de protéines membranaires de deux échantillons.
Par exemple, on prévoit que chaque échantillon est analysé sur deux support du type représenté sur la figure 8, possédant un format du type (FC, 4, 1000, 20, 12-20). Les supports intégrés possède des micro-colonnes de fractionnement greffées avec des chaînes alkyles C4.
Dans chaque premier support d'analyse d'un échantillon, les peptides membranaires sont dissouts dans le dichlorométhane (CH2C12)-hexafluoro-2-propanol (HFIP) (4:1) contenant des traces de pyridine, puis séparés dans micro-colonnes de fractionnement en utilisant différentes élutions primaires lors de différentes empreintes successives.
Les élutions primaires sont à base de mélanges de l' éluant A (acide formique-eau (2:3)) d'une part et de l'éluant B (acide formique -2-propanol (4:1)) d'autre part. Les élutions primaires présentent successivement les variantes de composition suivantes : (A 100%, B 0%); (A 80%, B 20%); (A 60%, B 40%); (A 40%,
B 60%); (A 20%, B 80%); (A 0%, B 100%);
A chaque fois qu'une séparation primaire est effectuée, on procède à trois paliers d'élution secondaire dans les micro-colonnes de fractionnement secondaire, avec des élutions secondaires présentant successivement les variantes de composition suivantes : (A 95%, B 5%); (A 90%, B 10%); (A 85%, B 15%).
Dans le deuxième support d'analyse d'un échantillon, les protéines membranaires, après extraction au Triton X-114, précipitation à l'éthanol à 90% et redissolution dans l'acide formique à 65%, sont séparées dans les micro-colonnes de fractionnement en utilisant différentes élutions primaires lors de différentes empreintes successives.
Les élutions primaires sont à base de mélanges de l'éluant A (acide formique-eau (65:35)) et de l'éluant B (acétonitrile-eau (65:35)). Les élutions primaires présentent successivement les variantes de composition suivantes : (A 100%, B 0%); (A 80%, B 20%); (A 60%, B 40%); (A 40%, B 60%); (A 20%, B 80%); (A 0%, B 100%).
A chaque fois qu'une séparation primaire est effectuée, on procède à trois paliers d'élution secondaire dans les micro-colonnes de fractionnement secondaire, avec des élutions secondaires présentant successivement les variantes de composition suivantes : (A 95%, B 5%); (A 90%, B 10%); (A 85%, B 15%)..
La série d'empreintes successives du premier échantillon est comparée ensuite à la série d'empreintes successives du deuxième échantillon, les séries d'empreintes de détection étant ensuite archivées dans une base de données informatiques. Là où sont détectées des différences, les fractionnements sont prélevés et analysés par l'une des nombreuses méthodes d'analyse connues de l'Homme de l'Art.
Exemple 4
On peut utiliser les données acquises lors d'analyses effectuées à l'aide de dispositif selon les exemples 1 à 3 décrits ci-dessus, pour configurer un test rapide sur consommable miniaturisé. Pour un tel test, on peut utiliser un dispositif muni de supports pourvus seulement des microcolonnes de fractionnement où de nombreuses comparaisons ont montré des différences d'empreintes reproductibles pour une pathologie donnée.
Un individu sain montre une empreinte A, l'individu atteint de la pathologie montrant une empreinte B. Un premier support (sA) est dédié à la reconnaissance de l'empreinte A, un deuxième support (sB) étant dédié à la reconnaissance de l'empreinte B.
Tant pour la fabrication dudit support (sA) que pour la fabrication dudit support (sB), les seules micro-colonnes où il y a toujours une même différence sont conservées. Les supports restent pourvus chacune de micro-canaux de capture débouchant sur des zones de détection munies de micro-leviers.
Dans ce test ciblé sur ladite pathologie, le nombre de microcolonnes, de microcanaux et de microleviers est très réduit. Les micro-colonnes de fractionnement choisies, plus précisément les sélectivité des méthodes de séparation en relation avec les composition des phases solides et liquides utilisées, sont adaptés pour mettre en évidence la présence dans un échantillon de protéines dont la présence ou l'absence est caractéristique de la pathologie ciblée.
Un dispositif d'analyse est adapté pour l'analyse comparative chimique ou biochimique de deux échantillons de nature chimique, ou bien deux échantillons de nature biochimique comme des extraits cellulaires crus ou issus d'une extraction préalable ou ayant subi une digestion enzymatique.
Un échantillon biologique est caractérisé en particulier par sa composition en chacun(e) des protéines, glycoproteines, phosphoprotéines, lipoprotéines, lipides, polysaccharides, hormones, vitamines synthétisés de manière permanente ou occasionnelle selon le tissu ou l'état physiologique ou pathologique envisagée. Un dispositif d'analyse, selon un aspect de l'invention, permet la détection de ces constituants par séparation et par l'obtention d'empreintes. Un dispositif d'analyse peut s'appuyer sur un gradient de longueur d'un grand nombre de micro-canaux ou de micro-colonnes de séparation par exemple par micro-électrophorèse, micro-chromatographie ou micro-électrochromatographie.
Un ensemble de micro-colonnes de fractionnement peut être associé à un deuxième, voire un troisième ensemble de micro-canaux ou micro-colonnes, chacun ou chacune des micro-canaux ou microcolonnes de séparation du premier ensemble étant individuellement couplé à chacun ou chacune des micro-canaux ou micro-colonnes de séparation dudit deuxième ensemble de micro-canaux ou micro-colonnes.
On a décrit une détection par micro-leviers sélectifs qui permet d'adapter la sélectivité des micro-leviers à la sélectivité de micro-colonnes de fractionnement auxquelles ils sont associé. Un détection supplémentaire peut être effectuée par spectrométrie de masse. Le dispositif d'analyse peut également utiliser des autres moyens de détection connus de l'Homme de l'Art tels que fluorescence, résonance plasmonique de surface (SPR), résonance magnétique nucléaire (NMR), électrochimie, spectrophotométrie, cette liste n'étant pas limitative. Une détection supplémentaire peut être effectuée par spectrométrie de masse. Le dispositif d'analyse peut également utiliser des autres moyens de détection connus de l'Homme de l'Art tels que fluorescence, résonance plasmonique de surface
(SPR), résonance magnétique nucléaire (NMR), électrochimie, spectrophotométrie, cette liste n'étant pas hmitative. Grâce à l'invention, on obtient un dispositif d'analyse permettant des séparations des constituants d'un échantillon, selon des sélectivités différentes, et une détection des constituants.
On peut également réaliser des séparations successives avec des sélectivités différentes pour mieux séparer des constituants d'un échantillon. Un dispositif d'analyse permet une analyse exhaustive et rapide d'un échantillon et sa comparaison avec un autre échantillon.
La détection par micro-leviers reliés à des moyens d'analyse permet un stockage et une comparaison de données enregistrées. Un dispositif selon l'invention est adapté pour une miniaturisation. Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation et aux variantes décrits ci-dessus. Des modifications peuvent être apportées sans sortir du cadre de l'invention.

Claims

Revendications
1 . Dispositif d'analyse chimique ou biochimique d'échantillons biologique ou chimique, notamment pour une analyse comparative d'au moins deux échantillons, comprenant une pluralité de micro-colonnes de fractionnement
(2) de constituants d'un échantillon, chaque micro-colonne de fractionnement (2) comprenant au moins une portion de micro-canal munie de moyens de séparation intermédiaires, la portion de micro-canal comprenant un orifice d'introduction d'une phase mobile enrichie en échantillon et un orifice d'évacuation situé à une extrémité terminale, caractérisé par le fait qu'il comprend des moyens fluidiques de capture (7) de produits de fractionnement au niveau d'un élément terminal de chaque micro-colonne de fractionnement (2) situé en amont de son orifice d'évacuation, des micro-canaux de capture destinés à récupérer les produits de fractionnement capturés, et des ensembles de micro-leviers sélectifs (13) associés aux micro-colonnes de fractionnement (2) et situés en aval des micro-canaux de capture, un micro-levier (13) comportant des moyens de détection reliés à des moyens d'analyse.
2. Dispositif selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu'une micro-colonne de fractionnement (2) ou un groupe (3) de micro-colonnes de fractionnement de même longueur diffère par sa longueur des autres micro- colonnes de fractionnement (2) ou groupes (3) de micro-colonnes de fractionnement, les éléments terminaux étant situés sur chaque micro-colonne de fractionnement (2) à une distance donnée de l'extrémité terminale de la microcolonne de fractionnement (2).
3 . Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé par le fait que chaque micro-colonne de fractionnnement (2) diffère d'une micro-colonne de fractionnement (2) immédiatement plus longue par un élément de longueur donné.
4. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il comprend des micro-colonnes de fractionnement secondaire (20) situées en aval des moyens fluidiques de capture (7) et en amont de l'ensemble de micro-leviers (13) associé à une micro-colonne de fractionnement (2), et destinées au fractionnement secondaire des produits de fractionnement capturés.
5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il comprend plusieurs lots de micro-colonnes de fractionnement (2), chaque lot de micro-colonnes de fractionnement (2) possédant une sélectivité déterminée par les moyens de séparation de ses micro-colonnes de fractionnement (2) comprenant une phase stationnaire revêtue ou non et/ou des moyens électriques de séparation.
6. Dispositif selon la revendication 5, caractérisé par le fait qu'il comprend un support (1) portant plusieurs lots de micro-colonnes de fractionnement (2), des moyens de captures (7) et des ensembles de micro-leviers (13) associés, et un canal d'alimentation de l'ensemble des lots de micro-colonnes de fractionnement.
7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que les micro-leviers sélectifs (13) comprennent des moyens de détection en fonction de leur état de surface ou de l'état de surface d'un revêtement, de leur nature chimique ou de la nature chimique d'un revêtement.
8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que les micro-colonnes (2) présentent un diamètre compris entre 1 microns (μm) et 100 microns (μm).
9. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il comprend un support de fractionnement (1) portant les micro-colonnes de fractionnement (2) et un support de détection (8) portant les micro-leviers (13), les supports étant sensiblement plans, et les supports étant sensiblement parallèles ou perpendiculaires entre eux.
10. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il comprend en amont des micro-colonnes de fractionnement (2) au moins un étage de fractionnement préalable comprenant au moins une micro-colonne de fractionnement préalable (32), des moyens de capture fluidiques (36, 37, 38) au niveau d'un élément terminal de la microcolonne de fractionnement préalable (2), et un canal de récupération des extraits préalables prévu pour amener les extraits préalables vers les micro-colonnes de fractionnement.
11. Dispositif selon la revendication 10, caractérisé par le fait qu'un étage de fractionnement préalable comprend une pluralité de micro-colonnes de fractionnement préalable (32), chacune intersectée par un micro-canal de capture (36), les micro-canaux de capture (36) étant reliés à un canal de récupération (38).
12. Dispositif selon la revendication 10, caractérisé par le fait qu'un étage de fractionnement préalable comprend une pluralité de micro-colonnes de fractionnement préalable (32), et un micro-canal de capture (36) intersectant successivement les micro-colonnes de fractionnement préalable, et débouchant dans un canal de récupération (38).
13. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'une micro-colonne de fractionnement comprend une portion terminale munie de moyens de séparation différents des moyens de séparation intermédiaires.
14. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait que des moyens de capture fluidique associés à une micro- colonne de fractionnement (3, 32) comprennent un micro-canal de capture (8, 36) comprenant une portion amont (8a, 36a) débouchant à une extrémité aval d'un segment de capture (40) de la micro-colonne (3, 32), et une portion aval (8b, 36b) débouchant à une extrémité amont du segment de capture (40).
15. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé par le fait qu'il comprend un micro-conduit (70) de lavage de microleviers sélectifs débouchant dans des micro-canaux de capture (8) directement en amont de micro-leviers sélectifs.
16. Ensemble d'analyse comparative chimique ou biochimique d'au moins deux échantillons biologiques ou chimiques caractérisé par le fait qu'il comprend au moins deux dispositifs comprenant une pluralité de micro-colonnes de fractionnement (2) de constituants d'un échantillon, chaque micro-colonne de fractionnement (2) comprenant au moins une portion de micro-canal munie de moyens de séparation intermédiaires, la portion de micro-canal comprenant un orifice d'introduction d'une phase mobile enrichie en échantillon et un orifice d'évacuation situé à une extrémité terminale, des moyens fluidiques de capture (7) de produits de fractionnement au niveau d'un élément terminal de chaque micro- colonne de fractionnement (2) situé en amont de son orifice d'évacuation, des micro-canaux de capture destinés à récupérer les produits de fractionnement capturés, et des ensembles de micro-leviers sélectifs (13) associés aux microcolonnes de fractionnement (2) et situés en aval des micro-canaux de capture, un micro-levier (13) comportant des moyens de détection reliés à des moyens d'analyse.
1 7 Procédé d'analyse chimique ou biochimique d'échantillons biologique ou chimique, caractérisé par le fait qu'on réalise des fractionnements différentiels d'une phase mobile enrichie en échantillon, on capture simultanément différents produits de fractionnement obtenus, et on analyse chacun des produits de fractionnement à l'aide d'un ensemble de micro-leviers sélectifs.
18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé par le fait que l'on fractionne un produit de fractionnement capturé avant de l'analyser.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 ou 18, caractérisé par le fait que l'on détecte des constituants d'un produit de fractionnement à l'aide des micro-leviers (13), selon des caractéristiques de polarité, solvophobicité ou porosité du matériau qui les constitue ou d'un revêtement des micro-leviers, ou selon des caractéristiques de polarité, solvophobicité, échange d'ion ou affinité avec des groupement fonctionnels greffés sur les micro-leviers.
20. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 19, caractérisé par le fait que l'on fractionne l'échantillon par chromatographie, par micro-électrophorèse, ou par interaction avec des nano-électrodes.
21 . Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 20, caractérisé par le fait que l'on analyse la déviation ou la fréquence de vibration des micro-leviers (13).
22. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 21, caractérisé par le fait que l'on analyse les éléments de fractionnement par spectrométrie de masse, avant ou après l'analyse à l'aide des micro-leviers (13).
23. Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 22, caractérisé par le fait que l'on analyse un premier échantillon, on analyse un second échantillon, et on compare les résultats d'analyse des deux échantillons.
24. Procédé selon la revendication 23, caractérisé par le fait qu'on analyse les premier et second échantillons en vue de la comparaison d'empreintes de protéines des échantillons, à l'aide de micro-leviers sélectifs aptes à montrer une empreinte de protéines différentielle.
25 . Procédé selon l'une quelconque des revendications 17 à 24, caractérisé par le fait que l'on effectue une extraction préalable sur un échantillon avant un fractionnement différentiel de l'échantillon.
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