EP1363557A1 - Bioartifizielles gerät zur lagerung, kultivierung und/oder vermehrung von zellen - Google Patents

Bioartifizielles gerät zur lagerung, kultivierung und/oder vermehrung von zellen

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Publication number
EP1363557A1
EP1363557A1 EP02710668A EP02710668A EP1363557A1 EP 1363557 A1 EP1363557 A1 EP 1363557A1 EP 02710668 A EP02710668 A EP 02710668A EP 02710668 A EP02710668 A EP 02710668A EP 1363557 A1 EP1363557 A1 EP 1363557A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
reactor vessel
flow
flow chamber
chamber
cell culture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02710668A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Boris-Wolfgang Hochleitner
Paul Hengster
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
HENGSTER, PAUL
Hochleitner Boris-Wolfgang
Margreiter Raimund
Original Assignee
Margreiter Raimund
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Margreiter Raimund filed Critical Margreiter Raimund
Priority to EP02710668A priority Critical patent/EP1363557A1/de
Publication of EP1363557A1 publication Critical patent/EP1363557A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
    • C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/34—Filtering material out of the blood by passing it through a membrane, i.e. hemofiltration or diafiltration
    • A61M1/3472—Filtering material out of the blood by passing it through a membrane, i.e. hemofiltration or diafiltration with treatment of the filtrate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
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    • A61M1/3472—Filtering material out of the blood by passing it through a membrane, i.e. hemofiltration or diafiltration with treatment of the filtrate
    • A61M1/3486—Biological, chemical treatment, e.g. chemical precipitation; treatment by absorbents
    • A61M1/3489—Biological, chemical treatment, e.g. chemical precipitation; treatment by absorbents by biological cells, e.g. bioreactor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/34—Internal compartments or partitions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis

Definitions

  • the invention relates to a bioartificial device for storing, cultivating and / or multiplying cells, in particular liver cells, with a reactor vessel in which a cell culture chamber through semipermeable walls on the one hand from a flow chamber for a nutrient medium and on the other hand from a flow chamber for a body substance, in particular plasma or blood is divided.
  • Bioreactors with two flow chambers allow the storage, culture and proliferation of all cells or tissues of all kinds. This enables on the one hand
  • Raktorgefäß allows the supply and supply of nutrient substrates or oxygen via the one circuit, and the simultaneous or intermittent discharge of
  • Synthesis products of the cells or the exchange of substances with the patient via the other circuit as is required in the context of a bioartificial liver. However, it could also be a metabolic or synthetic product from the
  • Reactor vessel for obtaining a substance can be derived, for example if
  • Bacterial cells are cultivated that produce a specific product.
  • a separate supply of different substances can also be carried out via the two circulatory systems be made possible.
  • a basic nutrient medium is supplied via the first circuit and a growth factor or differentiation factor is continuously or intermittently supplied or a product is derived via the second circuit at the same or different speed, possibly through other membrane types, as may be the case due to different penetration behavior.
  • Gases (oxygen) can also be supplied separately from the medium via the second circuit.
  • Devices with liver function should be able to temporarily take over a patient's liver function, especially in the case of one of the following diseases:
  • Acute liver failure (fulminant course of infectious hepatitis, intoxications such as tuber poisoning, etc.)
  • Acute liver failure is a constellation of clinical symptoms that result from sudden liver failure (Hoofnagle).
  • Hepatic encephalopathy, coagulopathy and jaundice must be present.
  • brain edema, kidney failure and finally multi-organ failure occur.
  • different symptoms may be preferred.
  • paracetamol poisoning is known to cause encephalopathy and severe coagulopathy with little jaundice, while fulminant non-A non-B hepatitis is often associated with severe jaundice.
  • Hyperacute liver failure is used to describe patients who experience encephalopathy within 8 days of the onset of jaundice. In terms of etiology, paracetamol poisoning and sometimes acute hepatitis A and B are the most likely to belong to this group.
  • the acute liver failure includes patients with a period of eight to twenty-eight days between jaundice and encephalopathy. Most liver failures of viral aetiology present themselves in this way. With subacute liver failure, encephalopathy occurs with a latency of four to twenty-six weeks. Most patients in this group have so-called non-A non-B hepatitis, where no viral agent can be identified.
  • hepatitis B is the most common viral hepatitis agent that can cause acute liver failure, followed by non-A non-B and hepatitis A. This is particularly true in France, where 46% of all patients with acute liver failure are HBV positive. In Japan it is as high as 62%. Due to the low prevalence of HBV infections in the UK, non-A non-B hepatitis is the leading viral cause of acute liver failure in the UK. Hepatitis C plays a minor role in the large series of the western world (Sallie et al 1994), although few well-documented case reports of fulminant hepatitis C have been published (Theilmann 1992).
  • Paracetamol (acetaminophen) poisoning was present in 250 of 342 cases of acute liver failure that were recorded at King's College, London between 1993 and 1994 with encephalopathy - grade III and IV, respectively.
  • Rare causes were Wilson's disease, gestational doses, lymphoma / malignant transformation, sepsis, Budd-Chiari syndrome, ischemic hepatitis, and reactions to medications (e.g. cyproterones, non-steroidal anti-inflammatory drugs, chloroquine, rifampicin, isoniazid, halothane, flucloxacillin).
  • liver failure results in multi-organ failure.
  • the prognosis is decisively influenced by the presence of encephalopathy with consecutive brain edema.
  • Patients with acute liver failure whose enzaphalopathy does not progress beyond Grade I-II have an excellent prognosis, while the patient group with Grade III-IV has a much higher mortality.
  • 80% of patients with grade IV encephalopathy usually develop cerebral edema (O'Grady et al. 1988).
  • the pathogenetic factors leading to hepatic encephalopathy and cerebral edema have not yet been investigated.
  • a distinction can be made between vasogenic factors that lead to extracellular edema due to the disturbed blood-brain barrier and cytotoxic mediators that lead to intracellular edema.
  • the latter include benzodiazepine agonists, an altered gamma-aminobutyric acid status, an increased concentration of aromatic amines, ammonia and mercaptans.
  • Basile et al. (1991) was able to detect increased concentrations of 1,4-benzodiazepines in the brains of patients with acute liver failure.
  • the clinical signs that result from the increased intracranial pressure are coma, systemic hypertension, abnormal pupillary reflexes and impairment of the brainstem reflexes.
  • the increased intracranial pressure further reduces cerebral blood flow (Almdal et al. 1989, Sari et al. 1990) with consecutive cerebral ischemia and sometimes epileptiform activity.
  • hypoglycemia occurs early in the clinical course and is the result of increased circulating insulin with impaired gluconeogenesis and reduced glucogen breakdown. Hypophosphataemia is also observed early. The frequently found metabolic acidosis can be explained by the reduced lactate metabolism of the liver and by tissue hypoxia with increasing peripheral lactate formation (Bihari, 1985).
  • Infections are a frequent complication of acute liver failure, although it must be assumed that the function of neutrophil leukocytes and copper's stellate cells and opsonization are impaired in liver failure. This leads to an impaired clearance of endotoxins and a translocation of bacteria through the mucosal barrier of the intestine.
  • coagulopathy Another characteristic symptom of acute liver failure is coagulopathy.
  • the prothrombin time correlates well with the severity of liver damage. Since the coagulation factor V has the shortest half-life, it is the most sensitive parameter for coagulopathy. However, this cannot only be explained by a restricted synthesis of coagulation factors.
  • an increased peripheral oxygen consumption occurs in the context of disseminated intravascular coagulation (DIG) (O'Grady et al. 1986).
  • DIG disseminated intravascular coagulation
  • the platelet function is also restricted; Thrombocytopenia and restricted aggregation in acute liver failure have been described.
  • Orthotopic liver transplantation is the treatment of choice for fulminant and chronic liver failure.
  • a blatant lack of organs Data from the United States show that a patient is listed for a transplant every 30 minutes, while a donor is reported only about every 2 hours. The situation in this country is similar.
  • In 1996 there were 973 liver transplants in the Eurotransplant area, while in the same period 1,393 new patients were registered on the waiting list for a liver transplant.
  • liver transplantation is often unavoidable in acute liver failure because after a fulminant course of infectious hepatitis or intoxication (tuber leaf fungus, acetaminophen, carbon tetrachloride, etc.) the liver does not regenerate quickly enough. Mortality without transplantation is reported in the literature between 70% -90%. Although several groups have formulated clinical criteria for the indication for liver transplantation, it can be extremely difficult to find the right one Determine the time of the transplant or get a suitable organ in good time. Temporary liver replacement would allow the patient to
  • liver regeneration phase survives without the costly transplantation, which is often not available in time due to the lack of organs.
  • lifelong Im unsuppression with all its side effects could also be dispensed with.
  • a variety of different procedures have been tried as temporary liver replacements.
  • the invention has now set itself the task of creating a bioartificial device of the type mentioned in the introduction, in which cell cultivation, in particular on microscopic carrier particles (microcarriem), and its use as an extracorporeal system is possible under the following conditions: 1. Sufficient space for the cells contained in a suspension (e.g. 2 x 10 10 liver cells)
  • a device according to the invention is now characterized in that at least one of the two flow chambers is formed by a tube made of a semi-permeable material and wound helically in the cell culture chamber.
  • This arrangement creates a maximum exchange area with the simplest construction, since the flow chamber is practically completely surrounded by the cell culture, in particular in the form of a suspension.
  • the device according to the invention has the advantage that instead of several parallel connections for inflow and outflow, only a single connection between the hose and the inflow or outflow must be provided, the hose having the large exchange surface required due to the helical winding.
  • the exchange area between plasma / blood and the cell suspension should be considerably larger than the exchange area between the nutrient medium and the cell suspension
  • the flow chamber arranged centrally in the reactor vessel can also be formed by a helically arranged hose made of a semi-permeable hose. The two hose coils can therefore be arranged coaxially one inside the other.
  • the flow chamber for the nutrient medium also has a large exchange area.
  • the central flow chamber for the nutrient medium is cylindrical and a wall a semipermeable membrane.
  • the semipermeable membrane preferably consists of a nitrocellulose, such as that for
  • Membrane filter is used, the choice of pore size
  • Transfer rates between the nutrient medium and the cell culture chamber can be better tailored to their needs. Since such nitrocellulose membranes are not self-supporting, it is preferably provided that the membrane on a
  • Wire mesh is supported.
  • a nitrocellulose membrane with a pore size of 0.3 ⁇ m has proven particularly favorable, which has a transfer rate of 33 ml / min for the nutrient medium per square centimeter and a pressure difference of 1 bar between the cell culture chamber and the flow chamber.
  • each flow chamber is assigned to a rotatingly driven carrier.
  • the rotation of the chamber leads to a kind of weightless state in which cells do not lie in layers one above the other, but are kept in suspension by the stirring effect in the suspension and are supplied more evenly and better with the nutrient medium.
  • the carrier of the flow chamber through which the nutrient medium flows is preferably connected to a central drive shaft and the carrier of the hose coil through which the body substance flows is connected to a driven flange of the reactor vessel which is rotatably mounted on the central drive shaft.
  • the or each tube preferably consists of a polyvinylidene difluoride (PVDF) and at least the outer tube has a pore size corresponding to approximately 100,000 Daltons. If both flow chambers are formed by helical coils, the flow directions of the nutrient medium and the body substance are preferably opposite.
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • the speed of rotation is variable and should be set between 20 and 40 revolutions per minute.
  • the two carriers are preferably driven separately, so that, for example, the inner carrier can be driven more quickly in order to counteract a gradient between the outer and inner walls.
  • the volume of the cylinder interior is preferably about one liter. It comes with a Suspension culture of hepatocytes filled without gas bubbles. In this case, the cell suspension contains about 2 x 10 10 cells, which corresponds approximately to the yield of a pig liver.
  • An outer tube coil for plasma / blood preferably comprises one
  • the bioreactor is heated to 37 ° C. by an incubator, a water jacket, an external heating coil or the like. Because of the continuous supply of oxygen from the oxygen saturated
  • Hose can have an average lifespan of the liver cells of 20 days, with a very good to sufficient functionality over at least
  • the reactor vessel is preferably cylindrical and has a horizontally arranged axis.
  • the inlet and outlet connections of the or each flow chamber can be arranged in the two end faces of the reactor vessel. They are preferably arranged on the same side, the tube being able to be returned in different ways from the end of the helix.
  • a first possibility provides a second helical winding, a second possibility a straight reflux section and a preferred third variant a rigid reflux pipe, which can run in particular in the central shaft.
  • the bioartificial device can have stationary connections and fixed flow chambers.
  • the reactor vessel is rotatably mounted on a fixed bearing block to which the flow chambers are attached and provided with an external drive.
  • a gentle stirring effect in the cell culture suspension can be achieved in that the particularly pot-like reactor vessel has at least one wing or the like protruding between the helical coils or flow-through chambers, which stands up from the bottom of the vessel.
  • FIG. 5 shows an associated diagram of the intracranial pressure curve of the test animals
  • FIG. 6 shows a second embodiment of a bioartificial device with liver function in an axial section according to FIG. 1 and
  • FIG. 7 shows a third embodiment of a bioartificial device in an axial section according to FIG. 1.
  • a bioartificial device has a reactor vessel 6 which is arranged in a base frame 1 so as to be rotatable about a horizontal axis 13.
  • a bearing block 2 is vertically inserted into the base frame 1, in which a hollow cylindrical outer drive shaft 4 is mounted, which has an end flange 5.
  • the flange 5 and a housing pot 11 made of, in particular, transparent material and connected to it via an easily detachable locking ring 16 form the reactor vessel 6.
  • a central drive shaft 3 is rotatably mounted in the hollow cylindrical drive shaft 4.
  • Both drive shafts 3, 4 are provided with drive transmission elements 33, 34, for example gearwheels, pulleys or the like, which are connected to an output element 32 of a motor 31 via a corresponding traction means.
  • the drive transmission element 34 preferably has a larger outer diameter, so that the speed of the drive shaft 4 is less than the speed of the drive shaft 3.
  • the reactor vessel 6 has a cell culture chamber 14 which is accessible via at least one test opening 15 formed in the flange 5. These can be used to take a sample of the cell culture as well as to remove or supply it in order to compensate for any pressure changes in the reactor vessel 6.
  • a piece of tube or hose 54 preferably extends from the or a test opening 15 into the interior of the cell culture chamber 14 in order to enable a sample to be taken from a region that is not at the edge.
  • the flow chambers 17 and 21 are arranged separately from one another and each formed in a tube which consists of a semipermeable material, in particular a polyvinylidene difluoride (PVDF), the pore size of which corresponds to a maximum of approximately 100,000 daltons.
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • Nutrient medium is formed by the hose coil 18, which is wound helically on a carrier 19 which has a plurality of carrier strips receiving the turns.
  • the end of the support 19 protrudes from a connecting element 20 which is fastened to the central drive shaft 3 by means of a screw 81.
  • the carrier 19 and the hose coil 18 therefore rotate with the drive shaft 3.
  • the tube forming the flow chamber 21 for plasma or blood is also helically wound in the form of a tube coil 22 on two to eight carrier strips which form the carrier 23.
  • the carrier strips of the carrier 23 protrude near the outer wall 12 of the reactor vessel 6 from the flange 5, which is provided on the outer drive shaft 4, which rotates preferably more slowly.
  • Both tube coils 18, 22 are arranged in the cell culture chamber 14, the horizontal rotation axis 13 and the preferred speed difference between the two tube coils providing a slightly gentle stirring effect in the cell culture, by means of which the mass exchange between the nutrient medium in the central tube and the cell culture and between the plasma or blood in the outer tube and the cell culture.
  • the helical arrangement of the two hoses also results in a very large exchange area between the individual media.
  • the hose windings can be arranged in contact with one another (FIG. 1) or at a distance (FIG. 2) on the carriers 19, 23.
  • a contacting arrangement results in a greater overall length due to a higher number of turns, while a spaced arrangement enables replacement over the entire circumference of the hose, since there is no mutual covering in the contact area of the turns.
  • connections 47, 48, 49, 50 are provided on the bearing block 2, which have radial bores 27, 28, 29, 30 in the central drive shaft 3 in Flow connection.
  • outer ring channels 41 are provided for each inflow or return flow, which are delimited by axially spaced separating rings 42 and the respective flow connections between the connections 47, 48, 49, 50 and radial bores 37 , 38, 39, 40 of the rotating outer drive shaft 4.
  • inner ring channels 35 are provided per inflow or return flow, which are delimited by axially spaced separating rings 36 and the respective flow connection between the radial bores 37, 38, 39, 40 of the outer drive shaft 4 and the bores 27, 28, 29, 30 of the faster rotating central drive shaft 3.
  • the central drive shaft 3 contains four mutually parallel flow channels 7, 8, 9, 10. Of these, the flow channel 7 is extended by an extension tube 25 projecting into the housing pot 11, the radially bent end of which extends with the first end of the hose coil 18 opposite the flange 5 connected is.
  • the flow channel 8 is extended into a connecting element 20 and ends in a radial inlet bore 24, to which the flange-near second end of the hose coil 18 is connected. Nutrient medium for supplying the cell culture can thus via the first connection 47 into the outer ring channel 41, through the bore 37 of the outer drive shaft 4 into the inner ring channel 35, through the bore 27 of the central drive shaft 3 in its first flow channel 7 and through the extension tube 25 flow into the hose coil 18.
  • the circulating nutrient medium flows through the inlet opening 24, the second flow channel 8 and the radial bore 28 of the central drive shaft 3 into the associated inner ring channel 35 and through the bore 38 of the outer drive shaft 4 and the associated outer ring channel 41 to the second connection 48 of the bearing block 2.
  • the flow channels 9, 10 of the central drive shaft 3 are connected via inner radial bores 43, 44 to ring channels 45 which are delimited by separating rings 46 and are arranged between the central drive shaft 3 and the flange 5 of the outer drive shaft 4.
  • the flange 5 has channels 51, 52 which lead into the area of the outer carrier 23.
  • the hose coil 22 is connected to the outlet of the channel 51.
  • An extension tube 53 leads from the outlet of the channel 52 to the free end of the carrier 23, at which the second end of the hose coil 22 is connected to the extension tube 53.
  • Plasma or blood flows into the bioartificial device via the third connection 49 and passes through the associated outer ring channel 41 and the bore 39 of the outer drive shaft 4 into the associated inner ring channel 35, through the bore 29 of the central drive shaft 3 into its third flow channel 9, through the second, inner bore 43 at the end of the flow channel 9 into the associated ring channel 45, and finally through the channel 51 in the flange 5 to the outer tube coil 22, in which the plasma or cell is cleaned by exchange of substances with the cell culture in the cell culture chamber 14 Blood is done.
  • the treated plasma or blood flows through the extension tube 53 and the channel 52 in the flange 5 into the associated ring channel 45, through the inner bore 44 of the central drive shaft 3 in its fourth flow channel 10, through the outer bore 30 of the central drive shaft 3 in the associated inner ring channel 35, and through the bore 40 of the outer drive shaft 4 and the associated ring channel 41 to the fourth connection 50 of the bearing block 2.
  • the bearing block 2 is removed from the base frame 1, so that the reactor vessel 6 can be set up, the axis 13 extending perpendicularly.
  • the bearing block 2 with the flange 5 and the hose coils 18, 22 arranged on the two supports 19, 23 can be removed upwards.
  • the used cell culture can be emptied or new cell culture can be filled into the housing pot 11.
  • the unit of flange 5 with the two hose coils 18, 22 and the bearing block 2 is placed on the housing pot 11 and sealed with the help of the closure ring 16 to the reactor vessel 6.
  • the reactor vessel 6 can then be folded over and inserted horizontally into the base frame 1 with the help of the bearing block 2.
  • the housing pot 11 has a volume of approximately one cubic decimeter and can hold approximately 2 ⁇ 10 10 hepatocytes suspended in a medium.
  • the speeds of the two drive cells 3, 4 are in particular between 20 and 40 revolutions per minute, the speed of the central drive shaft 3 corresponding, for example, to one and a quarter times the speed of the outer drive shaft 4. In this case, the speeds are from 20 and 30 revolutions to 25 and 37.5 revolutions per minute. 4 and 5 show the result of an animal experiment in which three Germans
  • Fig. 4 shows that the control animal and the plasmapheresis control animal each had a survival time of almost 24 hours.
  • the third animal whose plasma was cleaned or regenerated in the bioartificial device according to the invention, lived for almost 50 hours, the cause of death, as shown in FIG. 5, not being an increase in intracranial pressure (ICP).
  • ICP intracranial pressure
  • the intracranial pressure increased extremely in the control animal, and decreased in the plasmapheresis control animal, but significantly.
  • a central cylindrical holding element 103 is removably arranged in a bearing block 102.
  • the holding element has the connections 147, 148 shown, via which nutrient medium can be supplied and removed, and two further connections, via which blood and plasma can be supplied and removed.
  • the connections 147, 148 open into flow channels 107, 108 which extend parallel to the axis 113.
  • a flange 105 with a circumferential roller bearing 160 is mounted on the holding element 103, on which a housing pot 111 of a reactor vessel 106 is rotatably mounted.
  • the housing pot 111 is provided on the outside of the wall 112 with a ring gear 161 and is rotatably connected to a motor 131 via a drive transmission element.
  • the flange 105 and the housing pot 11 of the reactor vessel 106 contain a cell culture chamber 114, into which two stirring elements 162 protrude from the bottom of the housing pot 111, which are caused by the rotation of the housing wall 112 conditioned, gentle mixing of the contents of the cell culture chamber
  • the flow channel 108 ends in a connecting element 120 which is fixed to the flange 105 or the holding element 103 by means of a screw 181 and has a radial bore 124.
  • the flow channel 107 is continued beyond the connecting element 120 through an extension tube 125.
  • a hose 118 wound helically on the strips of a support 119 is connected on the one hand to the extension tube 125 and on the other hand to the radial bore 124, the hose coil projecting centrally into the rotating housing pot 111 as an extension of the holding element 103.
  • a second hose 122 helically wound on strips of a carrier 123, serves as the flow chamber for blood and plasma and is connected to flow channels in the holding element 103 via channels (not shown) in the flange 105, of which the flow channel 109 is indicated by dashed lines.
  • the reactor vessel 106 has a test opening 115 which is connected to the cell culture chamber 114 via an inner hose or tube piece 154.
  • FIG. 7 shows a further embodiment in which the flow chamber 21 for plasma or blood is again in the form of a hose coil 22 which is arranged near the outer wall 12 of the reactor vessel 6.
  • the flow chamber 17 for the nutrient medium in this embodiment is formed by a cylindrical insert divided into two spaces 82, 83, which is fastened to the central drive shaft 3 by means of a screw 81 and has a wall made of a semipermeable membrane 71.
  • the insert comprises two end plates 73, 74 and an approximately central partition 76 which are connected by a central spacer 75.
  • the semipermeable membrane 71 is supported by a wire mesh 72, which is reinforced per space 82, 83 by at least one coil spring 79, 80.
  • the semipermeable membrane 71 is made in particular of nitrocellulose and has a pore size of 0.3 ⁇ m.
  • the wire mesh 72 has, for example, a mesh size of 45 ⁇ m and consists of a corrosion-resistant metal or a suitable plastic.
  • the end plate 73 corresponds to the connecting element 20 of FIGS. 1 and 2, which to the
  • Front of the central drive shaft 3 connects.
  • the end plate 73 has an opening 77 aligned with the flow channel 7, which opens into the first space 82.
  • a tube piece 78 which extends parallel to the axis 13 from the end plate 73, and the return flow of the nutrient medium from the second space projects into the second space 83
  • both flow chambers 17, 21 are rotatably arranged in the housing pot 11 of the reactor vessel 6 and are described in FIGS. 1 to 3 via the drive shafts 3, 4 Way driven.
  • the flow chamber for the nutrient medium as a cylindrical insert with a semipermeable nitrocellulose membrane 71 in the embodiment according to FIG. 6 with stationary flow chambers and driven housing pot 111.

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Abstract

Ein bioartifizielles Gerät weist ein Reaktorgefäß (6) auf, in dem eine Zellkulturkammer (14) durch semipermeable Wandungen von einer Durchflußkammer (17,21) für ein Nährmedium und von einer Durchflußkammer (21) für Plasma und Blut abgeteilt ist. Zumindest eine Durchflußkammer (17, 21) ist durch einen schraubenförmig gewickelten Schlauch (18, 22) aus einem semipermeablen Material gebildet.

Description

BIOARTIFI ZIELLES GERÄT ZUR LAGERUNG , KULTIVIERUNG UND/ODER VERMEHRUNG VON ZELLEN
Die Erfindung betrifft ein bioartifizielles Gerät zur Lagerung, Kultivierung und/oder Vermehrung von Zellen, insbesondere von Leberzellen, mit einem Reaktorgefäß, in dem eine Zellkulturkammer durch semipermeable Wandungen einerseits von einer Durchflußkammer für ein Nährmedium und andererseits von einer Durchflußkammer für eine Körpersubstanz, insbesondere Plasma oder Blut abgeteilt ist.
Beispiele für Geräte mit einer Durchflußkammer für die Kultivierung von Zellen, beispielsweise Inselzellen oder dergleichen, zeigen die US-Patente 4 242 460, 4 323 457 oder 4 649 114. In allen drei Geräten ist die Durchflußkammer durch einen gewendelten Schlauch oder dergleichen gebildet.
Beispiele für Geräte und Systeme der eingangs genannten Art mit zwei Durchflußkammern, die als bioartifizielle Leber eingesetzt werden können, zeigen die US-Patente 5 043 260, 5 605 835, 5 827 729 und 6 008 049.
Bioreaktoren mit zwei Durchflußkammern erlauben die Lagerung, Kultur und Vermehrung von allen Zellen oder Geweben aller Art. Dies ermöglicht einerseits
Verhältnisse mit Zell-Zellkontakten (random collisions), anderseits aber den Austausch von Stoffen an den Zelloberflächen. Solche Verhältnisse können für die unterschiedlichsten Zellen insbesondere für Zellen mit unlimitierter Zellteilung
(Stammzellen) von Vorteil sein und erlauben die zeitlich unbegrenzte Kultur und Vermehrung. Die Ausstattung mit zwei getrennten Perfusionskreisläufen durch das
Raktorgefäß ermöglicht die Zufuhr und Versorgung mit Nährsubstraten bzw. Sauerstoff über den einen Kreislauf, und die gleichzeitige oder intermittierende Ableitung von
Syntheseprodukten der Zellen bzw. den Stoffaustausch mit dem Patienten über den anderen Kreislauf, wie dies im Rahmen einer bioartifiziellen Leber erforderlich ist. Es könnte jedoch auch ein Stoffwechselprodukt oder Syntheseprodukt aus dem
Reaktorgefäß zur Gewinnung einer Substanz abgeleitet werden, beispielsweise wenn
Bakterienzellen kultiviert werden, die ein bestimmtes Produkt erzeugen.
Zur Kultivierung von Zellen im Rahmen der Zellexpansion kann über die beiden Kreislaufsysteme auch eine getrennte Zufuhr von verschiedenen Substanzen ermöglicht werden. Zum Beispiel wird über den ersten Kreislauf ein basales Nährmedium zugeführt und über den zweiten Kreislauf mit gleicher oder unterschiedlicher Geschwindigkeit, durch gegebenenfalls andere Membrantypen, wie dies durch ein unterschiedliches Penetrationsverhalten bedingt sein kann, kontinuierlich oder intermittierend ein Wachstumsfaktor oder Differenzierungsfaktor zugeleitet oder ein Produkt abgeleitet. Auch kann über den zweiten Kreislauf die vom Medium getrennte Zufuhr von Gasen (Sauerstoff) erfolgen.
Geräte mit Leberfunktion sollen in der Lage sein, vorübergehend die Leberfunktion eines Patienten zu übernehmen, insbesondere im Falle einer der folgenden Erkrankungen:
1. Akutes Leberversagen (fulminanter Verlauf infektiöser Hepatitiden, Intoxikationen wie Knollenblätterpilzvergiftung, etc.)
2. Primäre Nichtfunktion eines Lebertransplantats 3. Überbrückung bis zur Lebertransplantation bei plötzlicher Verschlechterung einer chronischen Leber-Erkrankung 4. Intermittierende Behandlung bei chronischer Leberinsuffizienz.
Das akute Leberversagen ist eine Konstellation von klinischen Symptomen, die auf- grund eines plötzlichen Leberausfalls resultieren (Hoofnagle). Definitionsgemäß müssen hepatische Enzephalopathie, Koagulopathie und Ikterus vorhanden sein. In vielen Fällen tritt jedoch Hirnödem, Nierenversagen und schließlich Multiorganversagen hinzu. Abhängig von der Ätiologie können unterschiedliche Symptome bevorzugt sein. Beispielsweise ist bekannt, daß bei Paracetamolvergiftung Enzephalopathie und schwere Koagulopathie mit nur geringem Ikterus auftreten, während eine fulminante Non-A non-B Hepatitis häufig mit einem schweren Ikterus vergesellschaftet ist.
Der zeitliche Faktor erlaubt eine gewisse prognostische Aussage. Paradoxerweise hat die Gruppe von Patienten, bei denen sich die Enzephalopathie am schnellsten ent- wickelt, die große Chance auf Spontanremission (Gimson 1986, Benhamou 1991). Somit wird ein hyperakutes, akutes und subakutes Leberversagen unterschieden (O'Grady 1993). Hyperakutes Leberversagen wird benutzt, um Patienten zu beschreiben, bei denen die Enzephalopathie innerhalb von 8 Tagen nach Beginn des Ikterus einsetzt. In Hinblick auf die Ätiologie gehören die Paracetamolvergiftung und manch- mal die akute Hepatitis A und B am ehesten in diese Gruppe. Das akute Leber- versagen umfaßt Patienten mit einer Zeitspanne von acht bis achtundzwanzig Tagen zwischen Ikterus und Enzephalopathie. Die meisten Leberversagen viraler Ätiologie präsentieren sich derart. Beim subakuten Leberversagen tritt die Enzephalopathie mit einer Latenz von vier bis sechsundzwanzig Wochen auf. Die meisten Patienten dieser Gruppe haben eine sogenannte non-A non-B Hepatitis, wo kein virales Agens identifiziert werden kann.
Über 50 % der Fälle von akutem Leberversagen in nordamerikanischen und europäischen Zentren haben die Verlaufsform und das klinische Bild einer akuten viralen Hepatitis, obwohl in vielen Fällen kein spezifischer viraler Hepatitiserreger identifiziert werden kann (Fagan und Harrison 1994). In den meisten Serien ist Hepatitis B der häufigste virale Hepatitiserreger, der ein akutes Leberversagen verursachen kann, gefolgt von non-A non-B und Hepatitis A. Das gilt besonders in Frankreich, wo 46% aller Patienten mit akutem Leberversagen HBV positiv sind. In Japan sind es sogar 62%. Aufgrund der niedrigen Prevalenz von HBV Infektionen in Großbritannien ist im Vereinigten Königreich die non-A non-B Hepatitis die häufigste virale Ursache eines akuten Leberversagens. Hepatitis C spielt in den großen Serien der westlichen Welt eine untergeordnete Rolle (Sallie et al 1994), obwohl wenige gut dokumentierte Fallberichte von fulminanter Hepatitis C publiziert sind (Theilmann 1992).
Von 342 Fällen von akutem Leberversagen, die von 1993 - 1994 mit Enzephalopathie - Grad III bzw. IV im King's College, London aufgenommen wurden, lag in 250 Fällen eine Paracetamol (Acetaminophen)-Vergiftung vor. Eine virale Genese wurde bei 44 Patienten angenommen (Hepatitis A n=8, Hepatitis B n=8, Non-A,B,C,D,E n=28). Sel- tene Ursachen waren Morbus Wilson, Schwangerschaftsgestosen, Lymphom/maligne Transformation, Sepsis, Budd-Chiari Syndrom, Ischämische Hepatitis, und Reaktionen auf Medikamente (z.B. Cyproterone, Nichtsteroidale Antiphlogistika, Chloroquin, Rifampicin, Isoniazid, Halothane, Flucloxacillin).
Zum Zeitpunkt der Einlieferung des Patienten ist die maßgebliche Leberschädigung bereits abgelaufen. Die histologische Untersuchung der Leber zeigt zu diesem Zeitpunkt Nekrosezonen und - abhängig von der Latenz - auch bereits Regenerationszonen. Die klinischen Symptome und der Verlauf der Krankheit hängen vom Zusammenspiel dreier Faktoren ab: 1 ) der Regenerationsfähigkeit der Leber, 2) den adversen metabolischen Konsequenzen eines Leberausfalls und 3) der Abgabe von proinflam- matorischen, teils toxischen Mediatoren aus der nekrotischen Leber. Charakteristischerweise zieht ein Leberversagen ein Multiorganversagen nach sich.
Die Prognose wird vom Vorliegen einer Enzephalopathie mit konsekutivem Hirnödem entscheidend beeinflußt. Patienten mit akutem Leberversagen, deren Enzaphalopathie nicht über Grad l-ll hinaus fortschreitet, haben eine exzellente Prognose, während die Patientengruppe mit Grad lll-IV eine wesentlich höhere Mortalität aufweist. Üblicherweise entwickeln 80% der Patienten mit einer Enzephalopathie Grad IV ein Hirnödem (O'Grady et al. 1988). Die pathogenetischen Faktoren, die zur hepatischen Enzephalo- pathie und Hirnödem führen, sind noch wenig untersucht. Es kann zwischen vasoge- nen Faktoren, die aufgrund der gestörten Blut-Hirnschranke zu einem extrazellulären Ödem führen und zytotoxischen Mediatoren, die zum intrazellulären Ödem führen, unterschieden werden. Als letztere kommen Benzodiazepinagonisten, ein veränderter Gamma-Aminobuttersäurestatus, eine erhöhte Konzentration an aromatischen Aminen, Ammoniak und Mercaptane in Betracht. Basile et al. (1991) konnte in Gehirnen von Patienten mit akutem Leberversagen erhöhte Konzentrationen von 1 ,4-Benzo- diazepinen nachweisen.
Die klinischen Zeichen, die aufgrund des erhöhten intracraniellen Drucks resultieren, sind Koma, systemische Hypertension, abnorme Pupillenreflexe und Beeinträchtigung der Hirnstammreflexe. Der erhöhte intracranielle Druck bedingt weiter eine verminderte cerebrale Durchblutung (Almdal et al. 1989, Sari et al. 1990) mit konsekutiver cerebraler Ischämie und manchmal epileptiformer Aktivität.
Eine Hypoglykämie tritt im klinischen Verlauf frühzeitig auf und ist die Folge von vermehrt zirkulierendem Insulin bei gleichzeitig beeinträchtigter Gluconeogenese und vermindertem Glucogenabbau. Zudem wird auch eine Hypophosphatämie frühzeitig beobachtet. Die häufig vorgefundene metabolische Azidose kann durch den eingeschränkten Laktatmetabolismus der Leber und durch Gewebshypoxie mit zunehmen- der peripherer Laktatbildung (Bihari, 1985) erklärt werden.
Infektionen sind eine häufige Komplikation des akuten Leberversagens, wobei angenommen werden muß, daß im Leberversagen vor allem die Funktion der neutrophilen Leukozyten und der Kupfferschen Sternzellen sowie die Opsonierung beeinträchtigt ist. Dies führt zu einer beeinträchtigten Clearance von Endotoxinen und einer Transloka- tion von Bakterien durch die Mucosabarriere des Darms.
In der Serie vom King's College wurden in 80% der Patienten mit akutem Leberversa- gen bakterielle Infektionen identifiziert, wobei kulturell Staphylokokkus aureus als häufigster Erreger nachgewiesen wurde (Rolando et al. 1990). Pilzinfektionen, meist Candida albicans, gewinnen im späteren Verlauf der Erkrankung zunehmend Bedeutung (Rolando 1991).
Ein weiteres charakteristisches Leitsymptom des akuten Leberversagens ist die Koagulopathie. Die Prothrombinzeit korreliert gut mit dem Schweregrad des Leberschadens. Da der Gerinnungsfaktor V die kürzeste Halbwertszeit aufweist, ist er der sensitivste Parameter für die Koagulopathie. Diese ist allerdings nicht nur durch eine eingeschränkte Synthese von Gerinnungsfaktoren erklärbar. Zusätzlich tritt noch im Rahmen einer disseminierten intravasalen Gerinnung (DIG) ein vermehrter peripherer Sauerstoffverbrauch auf (O'Grady et al. 1986). Auch die Plättchenfunktion ist eingeschränkt; Thrombozytopenien und eingeschränkte Aggregation bei akutem Leberversagen sind beschrieben worden.
Die orthotope Lebertransplantation ist Therapie der Wahl beim fulminanten und chronischen Leberversagen. Wir werden jedoch zunehmend mit einem eklatanten Organmangel konfrontiert. Daten aus den USA zeigen, daß alle 30 Minuten ein Patient für eine Transplantation gelistet, während nur etwa alle 2 Stunden ein Spender gemeldet wird. Ähnlich ist die Situation auch hierzulande. Im Jahr 1996 erfolgten im Eurotrans- plant-Raum 973 Lebertransplantationen, während im gleichen Zeitraum 1393 neue Patienten auf der Warteliste für eine Lebertransplantation registriert wurden. 200 (12%) Patienten sind im Jahr 1996 auf der Warteliste für eine Lebertransplantation verstorben.
Eine Lebertransplantation ist beim akuten Leberversagen oft unumgänglich, weil sich nach fulminantem Verlauf infektiöser Hepatitiden oder Intoxikation (Knollenblätter-Pilz, Acetaminophen, Tetrachlorkohlenstoff, etc.) die Leber nicht schnell genug regeneriert. Die Mortalität ohne Transplantation wird in der Literatur zwischen 70%-90% angegeben. Wenn auch von mehreren Gruppen klinische Kriterien für die Indikation zur Leber- transplantation formuliert wurden, so kann es äußerst schwierig sein, den richtigen Zeitpunkt der Transplantation festzulegen oder ein geeignetes Organ rechtzeitig zu bekommen. Ein temporärer Leberersatz würde es ermöglichen, daß der Patient die
Phase der Leberregeneration ohne die kostspielige und auf Grund des Organmangels oft nicht rechtzeitig verfügbare Transplantation übersteht. Auch könnte dann auf die lebenslange Im unsuppression mit all ihren Nebenwirkungen verzichtet werden. Als temporärer Leberersatz wurde eine Vielzahl unterschiedlicher Verfahren erprobt.
Hämodialyse, Hämadsorption mit Aktivkohle, Affinitätschromatographie zur Entfernung von Stoffwechselprodukten und viele andere Techniken haben keine weitverbreitete
Akzeptanz gefunden. Die vielversprechendste Entwicklung ist die der „bioartifiziellen" Leber. In Anbetracht der Komplexität der metabolischen und physiologischen Funktionen der Leber enthält dieses extrakorporale Leber-Ersatzsystem lebende Hepatozyten. Da humane Leberzellen nicht in ausreichendem Maß zur Verfügung stehen und in Kultur nur unzulänglich vermehrt werden können, wurden entweder Hepatomzell-Linien oder xenogene Hepatozyten vom Schwein eingesetzt. Dies ist mit entsprechender Sicherheit für den Patienten nur dann möglich, wenn Patientenplasma oder Blut nicht in direkten Kontakt mit dem Leberzell-Kompartment treten. Nur so können unerwünschte Immunreaktionen und Infektionen verhindert werden. Eine semipermeable Membran trennt daher Blut/Plasma auf der einen Seite von den Hepatozyten auf der anderen und ermöglicht dennoch den notwendigen Stoffaustausch. Einzelne Fallbe- richte über den kontinuierlichen Einsatz einer solchen bioartifiziellen Leber bei Patienten mit fulminantem Leberversagen gaben vorerst Anlaß zur Hoffnung. Allerdings konnten kontrollierte klinische Studien mit diesen teils käuflich erhältlichen Systemen keinen Vorteil hinsichtlich des Überlebens für Patienten mit akutem Leberversagen zeigen.
Die Erfindung hat es sich nun zur Aufgabe gestellt, ein bioartifizielles Gerät der eingangs genannten Art zu schaffen, in dem eine Kultivierung von Zellen, insbesondere auf mikroskopisch kleinen Trägerpartikeln (Microcarriem), und dessen Einsatz als extrakorporales System unter folgenden Bedingungen möglich wird: 1. Ausreichender Platz für die in einer Suspension enthaltenen Zellen (beispielsweise 2 x 1010 Leberzellen)
2. Maximale Austauschoberfläche der Trennwand zwischen der Zellkultur und der Durchflußkammer für die Körpersubstanz
3. Stoffaustausch bis zu einer maximalen Masse von etwa 100 000 bis 120 000 Dalton 4. Ausschluß von Gasblasen und bevorzugt:
5. Einhaltung von Mikrograviditätsbedingungen, dh extrem niedrige Scherkräfte und Turbulenzen 6. Kontinuierliche Zufuhr von sauerstoffgesättigtem Nährmedium
7. Kontinuierliche Beurteilung von Zellqualität und Kondition des Nährmediums.
Ein erfindungsgemäßes Gerät ist nun dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eine der beiden Durchflußkammern durch einen in der Zellkulturkammer schraubenförmig gewickelten Schlauch aus einem semipermeablen Material gebildet ist. Diese Anordnung schafft eine maximale Austauschfläche bei einfachster Konstruktion, da die Durchflußkammer praktisch vollständig von der insbesondere in Form einer Suspension vorgesehenen Zellkultur umgeben ist. Im Gegensatz zu Reaktoren, in denen mehrere gerade parallel zueinander angeordnete Durchflußkammern in Form von flachen Schlitzen, Hohlfasern oder dergleichen vorgesehen sind, weist das erfindungsgemäße Gerät den Vorteil auf, daß anstelle mehrerer paralleler Anschlüsse für Zufluß und Abfluß nur eine einzige Anschlußverbindung zwischen dem Schlauch und dem Zufluß bzw. dem Abfluß vorgesehen sein muß, wobei der Schlauch aufgrund der schraubenförmigen Wicklung die benötigte große Austauschoberfläche aufweist.
Da in der Verwendung als bioartifizielle Leber die Austauschfläche zwischen Plasma/Blut und der Zellsuspension wesentlich größer sein sollte, als die Austauschfläche zwischen dem Nährmedium und der Zellsuspension ist weiters bevorzugt vorgesehen, daß die Durchflußkammer für die Körpersubstanz durch eine nahe der Außenwand des Reaktorgefäßes angeordnete Schlauchwendel gebildet ist, und die Durchflußkammer für das Nährmedium innerhalb der Schlauchwendel zentral im Reaktorgefäß angeordnet ist. Die zentral im Reaktorgefäß angeordnete Durchflußkammer kann in einer ersten bevorzugten Ausführung ebenfalls durch einen schraubenlinienförmig angeordneten Schlauch aus einem semipermeablen Schlauch gebildet sein. Die beiden Schlauchwendeln können daher koxaxial ineinander angeordnet sein. In dieser Ausführung weist auch die Durchflußkammer für das Nährmedium eine große Austauschfläche auf.
In einer zweiten bevorzugten Ausführung ist vorgesehen, daß die zentrale Durchflußkammer für das Nährmedium zylindrisch ausgebildet und eine Wandung aus einer semipermeablen Membran aufweist. In dieser Ausführung besteht die semipermeable Membran bevorzugt aus einer Nitrozellulose, wie sie auch für
Membranfilter Verwendung findet, wobei hier durch Wahl der Porengröße die
Übertrittsraten zwischen dem Nährmedium und der Zellkulturkammer besser auf deren Bedürfnisse abgestimmt werden können. Da derartige Nitrozellulosemembranen nicht selbsttragend sind, ist bevorzugt vorgesehen, daß die Membran auf einem
Maschendrahtgeflecht abgestützt ist.
Für die Verwendung als bioartifizielle Leber hat sich eine Nitrozellulosemembran mit einer Porengröße von 0,3 μm als besonders günstig erwiesen, die pro Quadratzentimeter und einer Druckdifferenz von 1 bar zwischen der Zellkulturkammer und der Durchflußkammer für das Nährmedium eine Übertrittsrate von 33 ml/min aufweist.
Sowohl für die Versorgung der Zellen mit dem Nährmedium als auch für den Stoffaus- tausch mit der Körpersubstanz ist es von Vorteil, wenn jede Durchflußkammer einem rotierend angetriebenen Träger zugeordnet ist. Die Rotation der Kammer führt zu einer Art von schwerelosem Zustand, in dem Zellen nicht in Schichten übereinander liegen, sondern durch den Rühreffekt in der Suspension in Schwebe gehalten und gleichmäßiger und besser mit dem Nährmedium versorgt werden. Bevorzugt sind dabei der Träger der vom Nährmedium durchflossenen Durchflußkammer mit einer zentralen Antriebswelle und der Träger der von der Körpersubstanz durchflossenen Schlauchwendel mit einem angetriebenen Flansch des Reaktorgefäßes verbunden, der auf der zentralen Antriebswelle drehbar gelagert ist.
Der bzw. jeder Schlauch besteht bevorzugt aus einem Polyvinylidendifluorid (PVDF) und zumindest der äußere Schlauch hat eine Porengröße entsprechend etwa 100 000 Dalton. Wenn beide Durchflußkammern durch Schlauchwendeln gebildet sind, sind die Durchflußrichtungen des Nährmediums und der Körpersubstanz bevorzugt entgegengesetzt.
Die Rotationsgeschwindigkeit ist variabel und sollte zwischen 20 und 40 Umdrehungen pro Minute angesetzt werden. Die beiden Träger werden bevorzugt getrennt angetrieben, sodaß beispielsweise der innere Träger schneller angetrieben werden kann, um einem Gradienten zwischen Außen- und Innenwand entgegenzuwirken. Das Volumen des Zylinderinneren beträgt vorzugsweise etwa ein Liter. Es wird mit einer Suspensionkultur von Hepatozyten gasblasenfrei gefüllt. Die Zellsuspension enthält in diesem Fall etwa 2 x 1010 Zellen, was etwa der Ausbeute einer Schweineleber entspricht. Eine äußere Schlauchwendel für Plasma/Blut umfaßt bevorzugt eine
Oberfläche von ca. 4,5 m2. Der Bioreaktor wird durch einen Brutschrank, einen Wassermantel, eine äußere Heizwendel od. dgl. auf 37°C temperiert. Aufgrund der kontinuierlichen Versorgung mit Sauerstoff aus dem mit Sauerstoff gesättigten
Nährmedium durch die Wandung der inneren Durchflußkammer und dem bevorzugt mit Sauerstoff angereicherten Plasma bzw. Blut durch die Wandung des äußeren
Schlauchs kann eine durchschnittliche Lebensdauer der Leberzellen von 20 Tagen erreicht werden, wobei eine sehr gute bis ausreichende Funktionalität über mindestens
14 Tage festgestellt worden ist.
Bevorzugt ist das Reaktorgefäß zylindrisch ausgebildet und weist eine horizontal angeordnete Achse auf.
Die Zu- und Ablaufanschlüsse der bzw. jeder Durchflußkammer können in den beiden Stirnseiten des Reaktorgefäßes angeordnet sein. Bevorzugt sind sie an derselben Seite angeordnet, wobei der Schlauch vom Ende der Wendel auf unterschiedliche Weise zurückgeführt sein kann. Eine erste Möglichkeit sieht eine zweite schrauben- förmige Wicklung vor, eine zweite Möglichkeit einen geraden Rückflußabschnitt und eine bevorzugte dritte Variante ein starres Rückflußrohr, das insbesondere in der zentralen Welle verlaufen kann.
Alternativ kann das bioartifizielle Gerät stationäre Anschlüsse und feststehende Durchflußkammern aufweisen. In diesem Fall ist das Reaktorgefäß auf einem feststehenden Lagerblock, an dem die Durchflußkammern befestigt sind, drehbar gelagert und mit einem äußeren Antrieb versehen. Ein schonender Rühreffekt in der Zellkultursuspension kann dabei dadurch erzielt werden, daß das insbesondere topfartige Reaktorgefäß zumindest einen zwischen die Schlauchwendeln bzw. Durchflußkammern ragenden Flügel od. dgl. aufweist, der vom Gefäßboden hochsteht.
Nachstehend wird nun die Erfindung anhand der Figuren der beiliegenden Zeichnung näher beschrieben, ohne darauf beschränkt zu sein.
Es zeigen: Fig. 1 einen Axialschnitt durch eine erste Ausführung eines bioartifiziellen Gerätes mit Leberfunktion nach der Linie l-l der Fig. 3,
Fig. 2 einen um 90° versetzten Axialschnitt durch das bioartifizielle Gerät nach der Linie ll-ll der Fig. 3,
Fig. 3 eine Stirnansicht,
Fig. 4 ein Säulendiagramm der Überlebenszeiten dreier Versuchstiere,
Fig. 5 ein zugehöriges Diagramm über den intracraniellen Druckverlauf der Versuchstiere, Fig. 6 eine zweite Ausführung eines bioartifiziellen Gerätes mit Leberfunktion in einem Axialschnitt gemäß Fig. 1 und
Fig. 7 eine dritte Ausführung eines bioartifiziellen Gerätes in einem Axialschnitt gemäß Fig. 1.
Gemäß Fig. 1 bis 3 weist ein bioartifizielles Gerät ein Reaktorgefäß 6 auf, das um eine horizontale Achse 13 drehbar in einem Grundgestell 1 angeordnet ist. In das Grundgestell 1 ist ein Lagerblock 2 vertikal eingeschoben, in dem eine hohlzylindrische äußere Antriebswelle 4 gelagert ist, die einen endseitigen Flansch 5 aufweist. Der Flansch 5 und ein mit diesem über einen leicht lösbaren Verschlußring 16 verbundener Gehäu- setopf 11 aus insbesondere durchsichtigem Material bilden das Reaktorgefäß 6. In der hohlzylindrischen Antriebswelle 4 ist eine zentrale Antriebswelle 3 drehbar gelagert. Beide Antriebswellen 3, 4 sind mit Antriebsübertragungselementen 33, 34, beispielsweise Zahnrädern, Riemenscheiben od. dgl. versehen, die über ein entsprechendes Zugmittel mit einem Abtriebselement 32 eines Motors 31 verbunden sind. Das An- triebsübertragungselement 34 weist bevorzugt einen größeren Außendurchmesser auf, sodaß die Drehzahl der Antriebswelle 4 kleiner als die Drehzahl der Antriebswelle 3 ist.
Das Reaktorgefäß 6 weist eine Zellkulturkammer 14 auf, die über mindestens eine im Flansch 5 ausgebildete Prüföffnung 15 zugänglich ist. Über diese kann eine Probeent- nähme der Zellkultur ebenso erfolgen wie eine Entnahme bzw. Zufuhr, um eventuelle Druckänderungen im Reaktorgefäß 6 auszugleichen. Von der bzw. einer Prüföffnung 15 erstreckt sich vorzugsweise ein Rohr- oder Schlauchstück 54 ins Innere der Zellkulturkammer 14, um eine Probenentnahme aus einem nicht randständigen Bereich zu ermöglichen. Durch die Zellkulturkammer 14 führt eine Durchflußkammer 17 für ein Nährmedium und eine Durchflußkammer 21 für eine Körpersubstanz, insbesondere Plasma bzw.
Blut. Die Durchflußkammern 17 und 21 sind voneinander getrennt angeordnet und jeweils in einem Schlauch ausgebildet, der aus einem semipermeablen Material, insbesondere einem Polyvinylidendifluorid (PVDF) besteht, dessen Porengröße maximal etwa 100.000 Dalton entspricht. Die Durchflußkammer 17 für das
Nährmedium ist durch die Schlauchwendel 18 gebildet, die auf einem Träger 19 schraubenförmig gewickelt ist, der mehrere die Windungen aufnehmende Trägerleisten aufweist. Der Träger 19 steht stirnseitig von einem Verbindungselement 20 ab, das mittels einer Schraube 81 an der zentralen Antriebswelle 3 befestigt ist. Der Träger 19 und die Schlauchwendel 18 drehen sich daher mit der Antriebswelle 3 mit. Der die Durchflußkammer 21 für Plasma bzw. Blut bildende Schlauch ist ebenfalls in Form einer Schlauchwendel 22 auf zwei bis acht Trägerleisten schraubenförmig aufgewickelt, die den Träger 23 bilden. Die Trägerleisten des Trägers 23 stehen nahe der Außenwand 12 des Reaktorgefäßes 6 vom Flansch 5 ab, der an der bevorzugt langsamer drehenden äußeren Antriebswelle 4 vorgesehen ist.
Beide Schlauchwendeln 18, 22 sind in der Zellkulturkammer 14 angeordnet, wobei durch die horizontale Drehachse 13 und den bevorzugten Drehzahlunterschied zwischen den beiden Schlauchwendeln ein geringfügig schonender Rühreffekt in der Zellkultur gegeben ist, durch den der Stoffaustausch zwischen dem Nährmedium im zentralen Schlauch und der Zellkultur sowie zwischen dem Plasma bzw. Blut im äußeren Schlauch und der Zellkultur begünstigt wird. Die schraubenförmige Anordnung der beiden Schläuche ergibt weiters eine sehr große Austauschfläche zwischen den einzelnen Medien. Die Schlauchwindungen können einander berührend (Fig. 1 ) oder mit Abstand (Fig. 2) auf den Trägern 19, 23 angeordnet sein. Eine berührende Anordnung ergibt aufgrund einer höheren Anzahl von Windungen eine größere Gesamtlänge, während eine beabstandete Anordnung den Austausch auf dem gesamten Umfang des Schlauches ermöglicht, da die gegenseitige Abdeckung im Berührungsbereich der Windungen entfällt.
Der Zufluß des Nährmediums und des Plasmas bzw. Blutes in die Schlauchwendel 18, 22 und deren Rückfluß erfolgen jeweils über die zentrale Antriebswelle 3 in voneinander getrennten Strömungskanälen. Am Lagerblock 2 sind Anschlüsse 47, 48, 49, 50 vorgesehen, die mit radialen Bohrungen 27, 28, 29, 30 der zentralen Antriebswelle 3 in Strömungsverbindung stehen. Zwischen der Innenwand des Lagerblocks 2 und der äußeren Antriebswelle 4 sind pro Zufluß bzw. Rückfluß äußere Ringkanäle 41 vorgesehen, die durch axial beabstandete Trennringe 42 begrenzt sind und die jeweils Strömungsverbindungen zwischen den Anschlüssen 47, 48, 49, 50 und radialen Bohrun- gen 37, 38, 39, 40 der sich drehenden äußeren Antriebswelle 4 herstellen. Zwischen der Innenwand der äußeren Antriebswelle 4 und der zentralen Antriebswelle 3 sind pro Zufluß bzw. Rückfluß innere Ringkanäle 35 vorgesehen, die durch axial beabstandete Trennringe 36 begrenzt sind und die jeweilige Strömungsverbindung zwischen den radialen Bohrungen 37, 38, 39, 40 der äußeren Antriebswelle 4 und den Bohrungen 27, 28, 29, 30 der sich schneller drehenden zentralen Antriebswelle 3 herstellen.
Die zentrale Antriebswelle 3 enthält vier zueinander parallele Strömungskanäle 7, 8, 9, 10. Von diesen ist der Strömungskanal 7 durch ein in den Gehäusetopf 11 ragendes Verlängerungsrohr 25 verlängert, dessen radial abgebogenes Ende mit dem dem Flansch 5 gegenüberliegenden, ersten Ende der Schlauchwendel 18 verbunden ist. Der Strömungskanal 8 ist in ein Verbindungselement 20 verlängert, und endet in einer radialen Eintrittsbohrung 24, an die das flanschnahe zweite Ende der Schlauchwendel 18 angeschlossen ist. Nährmedium zur Versorgung der Zellkultur kann somit über den ersten Anschluß 47 in den äußeren Ringkanal 41 , durch die Bohrung 37 der äußeren Antriebswelle 4 in den inneren Ringkanal 35, durch die Bohrung 27 der zentralen Antriebswelle 3 in deren ersten Strömungskanal 7 und durch das Verlängerungsrohr 25 in die Schlauchwendel 18 strömen. Aus der Schlauchwendel 18 fließt das zirkulierende Nährmedium durch die Eintrittsöffnung 24, den zweiten Strömungskanal 8 und die radiale Bohrung 28 der zentralen Antriebswelle 3 in den zugehörigen inneren Ringkanal 35 sowie durch die Bohrung 38 der äußeren Antriebswelle 4 und den zugehörigen äußeren Ringkanal 41 zum zweiten Anschluß 48 des Lagerblocks 2.
Die Strömungskanäle 9, 10 der zentralen Antriebswelle 3 sind über innere radiale Bohrungen 43, 44 mit Ringkanälen 45 verbunden, die durch Trennringe 46 begrenzt und zwischen der zentralen Antriebwelle 3 und dem Flansch 5 der äußeren Antriebswelle 4 angeordnet sind. Der Flansch 5 weist Kanäle 51 , 52 auf, die in den Bereich des äußeren Trägers 23 führen. Am Ausgang des Kanales 51 ist die Schlauchwendel 22 angeschlossen. Vom Ausgang des Kanales 52 führt ein Verlängerungsrohr 53 zum freien Ende des Trägers 23, an dem das zweite Ende der Schlauchwendel 22 mit dem Verlängerungsrohr 53 verbunden ist. Plasma bzw. Blut strömt über den dritten Anschluß 49 in das bioartifizielle Gerät ein und gelangt durch den zugehörigen äußeren Ringkanal 41 und die Bohrung 39 der äußeren Antriebswelle 4 in den zugehörigen inneren Ringkanal 35, durch die Bohrung 29 der zentralen Antriebswelle 3 in deren dritten Strömungskanal 9, durch die zweite, innere Bohrung 43 am Ende des Strömungskanals 9 in den zugehörigen Ringkanal 45, und schließlich durch den Kanal 51 im Flansch 5 zur äußeren Schlauchwendel 22, in der durch Stoffaustausch mit der Zellkultur in der Zellkulturkammer 14 eine Reinigung des Plasmas bzw. Blutes erfolgt. Das behandelte Plasma bzw. Blut fließt durch das Verlängerungsrohr 53 und den Kanal 52 im Flansch 5 in den zugehörigen Ringkanal 45, durch die innere Bohrung 44 der zentralen Antriebswelle 3 in deren vierten Strömungskanal 10, durch die äußere Bohrung 30 der zentralen Antriebswelle 3 in den zugehörigen inneren Ringkanal 35, und durch die Bohrung 40 der äußeren Antriebswelle 4 und den zugehörigen Ringkanal 41 zum vierten Anschluß 50 des Lagerblockes 2.
Für die Erstbefüllung bzw. Entleerung wird der Lagerblock 2 aus dem Grundgestell 1 entnommen, sodaß das Reaktorgefäß 6 aufgestellt werden kann, wobei die Achse 13 lotrecht verläuft. Nach Abnahme des Verschlußringes 16 kann der Lagerblock 2 mit dem Flansch 5 und den auf den beiden Trägern 19, 23 angeordneten Schlauch- wendein 18, 22 nach oben abgenommen werden. Die verbrauchte Zellkultur kann entleert bzw. neue Zellkultur in den Gehäusetopf 11 eingefüllt werden. Die Einheit aus Flansch 5 samit den beiden Schlauchwendeln 18, 22 und dem Lagerblock 2 wird auf den Gehäusetopf 11 aufgesetzt und mit Hilfe des Verschlußringes 16 zum Reaktorgefäß 6 dichtend verschlossen. Anschließend kann das Reaktorgefäß 6 umgelegt und mit Hilfe des Lagerblockes 2 liegend in das Grundgestell 1 eingesteckt werden.
In bevorzugter Ausführung hat der Gehäusetopf 11 einen Rauminhalt von etwa einem Kubikdezimeter und kann ca. 2 x 1010 in einem Medium suspendierte Hepatozyten aufnehmen. Die Drehzahlen der beiden Antriebszellen 3, 4 liegen insbesondere zwischen 20 und 40 Umdrehungen pro Minute, wobei die Drehzahl der zentralen Antriebswelle 3 beispielsweise dem Eineinviertelfachen der Drehzahl der äußeren Antriebswelle 4 entspricht. In diesem Fall liegen somit die Drehzahlen von 20 und 30 Umdrehungen bis 25 und 37,5 Umdrehungen pro Minute. Die Fig. 4 und 5 zeigen das Ergebnis eines Tierversuches, in dem bei drei deutschen
Landschweinen mit je etwa 30 kg Lebendgewicht die Überlebensdauer in einem chirurgisch herbeigeführten Modell des akuten Leberversagens ermittelt wurde. Das akute Leberversagen wurde durch eine 80%-Leberresektion mit anschließender ein- stündiger Abklemmung des Hilus der Restleber herbeigeführt. Weiters wurde unter anderem der intracranielle Druck (ICP) kontrolliert. Da eine Plasmapherese auch zur Therapie bei akuter Leberinsuffizienz eingesetzt wird, wurde folgende Vorgabe getroffen: Eines der drei Tiere blieb ohne Therapie (Kontrolle), bei einem zweiten Tier wurde aus dem Blut in einem Plasmapheresegerät Plasma abgetrennt und als Vollblut ohne weitere Manipulation wieder reinfundiert (Kontrolle Plasmapherese). Beim dritten Tier wurde ebenfalls aus dem Blut in einem Plasmapheresegerät Plasma abgetrennt, und dieses dann durch ein bioartifizielles Gerät mit den oben beschriebenen Angaben hindurchgeführt. Das behandelte Plasma wurde wiederum mit dem zuvor abgetrennten Restblut vermischt und zurückgeführt (IBAL 1).
Fig. 4 zeigt, daß das Kontrolltier und das Plasmapherese-Kontrolltier eine Überlebenszeit von jeweils nahezu 24 Stunden aufwiesen. Hingegen lebte das dritte Tier, dessen Plasma im erfindungsgemäßen bioartifiziellen Gerät gereinigt bzw. regeneriert wurde, nahezu 50 Stunden, wobei die Todesursache, wie Fig. 5 zeigt, nicht in einem Anstieg des intracraniellen Drucks (ICP) gelegen hat. Hingegen stieg der intracranielle Druck beim Kontrolltier extrem, und beim Plasmapherese-Kontrolltier zwar vermindert, aber doch deutlich.
In der Ausführung nach Fig. 6 ist in einen Lagerblock 102 ein zentrales zylindrisches Halteelement 103 abnehmbar angeordnet. Das Halteelement weist die gezeigten Anschlüsse 147, 148, über die Nährmedium zu- und abgeführt werden kann, sowie zwei weitere Anschlüsse auf, über die Blut und Plasma zu- und abgeführt werden kann. Die Anschlüsse 147, 148 münden in Strömungskanäle 107, 108, die sich parallel zur Achse 113 erstrecken. Auf dem Halteelement 103 ist ein Flansch 105 mit einem umfänglichen Wälzlager 160 montiert, auf dem ein Gehäusetopf 111 eines Reaktorgefäßes 106 drehbar gelagert ist. Der Gehäusetopf 111 ist an der Außenseite der Wandung 112 mit einem Zahnkranz 161 versehen, und über ein Antriebsübertragungselement mit einem Motor 131 drehbar verbunden. Der Flansch 105 und der Gehäusetopf 1 11 des Reaktorgefäßes 106 beinhalten eine Zellkulturkammer 114, in die vom Boden des Gehäu- setopfes 111 zwei Rührelemente 162 ragen, die die durch die Rotation der Gehäuse- wandung 112 bedingte, schonende Durchmischung des Inhalts der Zellkulturkammer
114 unterstützen.
Der Strömungskanal 108 endet in einem mittels einer Schraube 181 am Flansch 105 bzw. dem Halteelement 103 fixierten Verbindungselement 120, das eine radiale Bohrung 124 aufweist. Der Strömungskanal 107 ist jenseits des Verbindungselementes 120 durch ein Verlängerungsrohr 125 weitergeführt. Ein auf Leisten eines Trägers 119 schraubenförmig gewickelter Schlauch 118 ist einerseits an das Verlängerungsrohr 125 und andererseits an die radiale Bohrung 124 angeschlossen, wobei die Schlauchwendel zentral in Verlängerung des Halteelementes 103 in den rotierenden Gehäusetopf 111 ragt.
Als Durchflußkammer für Blut und Plasma dient ein zweiter auf Leisten eines Trägers 123 schraubenförmig gewickelter Schlauch 122, der über nicht gezeigte im Flansch 105 verlaufende Kanäle mit Strömungskanälen im Halteelement 103 verbunden ist, von denen der Strömungskanal 109 strichliert angedeutet ist. Das Reaktorgefäß 106 weist eine Prüföffnung 115 auf, die über ein inneres Schlauch- oder Rohrstück 154 mit der Zellkulturkammer 114 in Verbindung ist.
In Fig. 7 ist eine weitere Ausführung dargestellt, in der die Durchflußkammer 21 für Plasma bzw. Blut wiederum in Form einer Schlauchwendel 22 ausgebildet ist, die nahe der Außenwand 12 des Reaktorgefäßes 6 angeordnet ist. Die Durchflußkammer 17 für das Nährmedium ist in dieser Ausführung hingegen durch einen in zwei Räume 82, 83 unterteilten zylindrischen Einsatz gebildet, der mittels einer Schraube 81 an der zentralen Antriebswelle 3 befestigt ist und eine Wandung aus einer semipermeablen Membran 71 aufweist. Der Einsatz umfaßt zwei Endplatten 73, 74 und eine etwa mittige Trennwand 76, die durch ein zentrales Distanzelement 75 verbunden sind. Die semipermeable Membran 71 wird durch ein Maschendrahtgeflecht 72 unterstützt, das pro Raum 82, 83 durch zumindest eine Schraubenfeder 79, 80 verstärkt ist. Die semipermeable Membran 71 ist insbesondere aus Nitrozellulose gefertigt und weist eine Porengröße von 0,3 μm auf. Das Maschendrahtgeflecht 72 weist beispielsweise eine Maschenweite von 45 μm auf und besteht aus einem korrosionsbeständigen Metall bzw. aus einem geeigneten Kunststoff. Die Endplatte 73 entspricht dem Verbindungselement 20 der Fig. 1 und 2, das an die
Stirnseite der zentralen Antriebswelle 3 anschließt. Die Endplatte 73 weist eine mit dem Strömungskanal 7 fluchtende Öffnung 77 auf, die in den ersten Raum 82 mündet.
In den zweiten Raum 83 ragt ein Rohrstück 78, das sich parallel zur Achse 13 von der Endplatte 73 erstreckt, und dem Rückfluß des Nährmediums aus dem zweiten Raum
83 in den Strömungskanal 8 der zentralen Antriebswelle 3 dient.
In der Ausführung nach Fig. 7 sind - so wie in den Fig. 1 bis 3 - beide Durchflußkammern 17, 21 drehbar im Gehäusetopf 11 des Reaktorgefäßes 6 angeordnet und werden über die Antriebswellen 3, 4 in der in den Fig. 1 bis 3 beschriebenen Weise angetrieben. Es ist aber ebenso möglich, in der Ausführung nach Fig. 6 mit stationären Durchflußkammern und angetriebenem Gehäusetopf 111 die Durchflußkammer für das Nährmedium als zylindrischer Einsatz mit einer semipermeablen Nitrozellulosemembran 71 auszubilden.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e :
1. Bioartifizielles Gerät zur Lagerung, Kultivierung und/oder Vermehrung von Zellen, insbesondere von Leberzellen, mit einem Reaktorgefäß (6), in dem eine Zellkultur- kammer (14) durch semipermeable Wandungen einerseits von einer Durchflußkammer (17) für ein Nährmedium und andererseits von einer Durchflußkammer (21) für eine Körpersubstanz, insbesondere Plasma oder Blut abgeteilt ist, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eine der beiden Durchflußkammern (17, 21) durch einen in der Zellkulturkammer (14) schraubenlinienförmig angeordneten Schlauch aus einem semipermeablen Material gebildet ist.
2. Gerät nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Durchflußkammer (21) für die Körpersubstanz durch eine nahe der Außenwand (12) des Reaktorgefäßes (6) angeordnete Schlauchwendel (22) gebildet ist, und die Durchflußkammer (17) für das Nährmedium innerhalb der Schlauchwendel (22) zentral im Reaktorgefäß
(6) angeordnet ist.
3. Gerät nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß jede der beiden Durchflußkammern (17, 21) durch einen in der Zellkulturkammer (14) schrauben- linienförmig angeordneten Schlauch (18, 22) aus einem semipermeablen Material gebildet ist, und die beiden Schlauchwendeln (18, 22) koaxial angeordnet sind.
4. Gerät nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die zentrale Durchflußkammer (17) für das Nährmedium zylindrisch ausgebildet und eine Wandung aus einer semipermeablen Membran (71) aufweist.
5. Gerät nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Membran (71) auf einem Maschendrahtgeflecht (72) abgestützt ist.
6. Gerät nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß zumindest eine Durchflußkammer (17, 21) auf einem angetriebenen Träger (19, 23) angeordnet ist.
7. Gerät nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger (19) der von Nährmedium durchflossenen Durchflußkammer (17) mit einer zentralen
Antriebswelle (3) verbunden ist.
8. Gerät nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger (23) der von der Körpersubstanz durchflossenen Schlauchwendel (22) mit einem angetriebenen Flansch (5) des Reaktorgefäßes (6) verbunden ist, der auf der zentralen Antriebswelle (3) drehbar gelagert ist.
9. Gerät nach einem der Ansprüche 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Drehzahlen der beiden angetriebenen Träger (19, 23) unterschiedlich sind.
10. Gerät nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktorgefäß (106) eine angetriebene Umfangswand (112) aufweist, und jede Durchflußkammer (17, 21) auf einem feststehenden Träger (119, 123) angeordnet ist.
11. Gerät nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der angetriebenen Umfangswand (112) zumindest ein zwischen die Durchflußkammern (17, 21) ragendes Rührelement (162) zugeordnet ist.
12. Gerät nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktorgefäß (106) einen angetriebenen Gehäusetopf (111) aufweist, von dessen Boden das Rührelement (162) hochsteht.
13. Gerät nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Reaktorgefäß (1) zylindrisch ausgebildet und dessen Achse (13) horizontal angeordnet ist.
14. Gerät nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Zu- und Ablaufanschlüsse (47, 48, 49, 50) der Durchflußkammern (17, 21) an derselben Seite des Reaktorgefäßes (6) angeordnet sind, und ein Anschluß jeder Durchflußkammer (17, 21) an einem durch das Reaktorgefäß (6) geführten Rohr (25, 53) vorgesehen ist.
15. Gerät nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Zellkulturkammer (14) mindestens eine Prüf- bzw. Druckausgleichsöffnung (15) zugeordnet ist.
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