EP1356098A2 - Verfahren zur bestimmung einer partiellen nukleotidsequenz eines nukleinsäuremoleküls - Google Patents

Verfahren zur bestimmung einer partiellen nukleotidsequenz eines nukleinsäuremoleküls

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EP1356098A2
EP1356098A2 EP01960566A EP01960566A EP1356098A2 EP 1356098 A2 EP1356098 A2 EP 1356098A2 EP 01960566 A EP01960566 A EP 01960566A EP 01960566 A EP01960566 A EP 01960566A EP 1356098 A2 EP1356098 A2 EP 1356098A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
primer
acid molecule
nucleotide sequence
polymerase
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01960566A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Eckhard Nordhoff
Christine Luebbert
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
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Filing date
Publication date
Application filed by Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV filed Critical Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Publication of EP1356098A2 publication Critical patent/EP1356098A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6872—Methods for sequencing involving mass spectrometry

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining a partial nucleotide sequence of a nucleic acid molecule, comprising the steps: (a) incubation of a primer which hybridizes to the nucleic acid molecule with multiple copies of the nucleic acid molecule in the presence of a polymerase and a mixture of deoxyribonucleotides at an annealing temperature which is between 5 ° C and 40 ° C above the theoretical melting temperature of the primer; (b) determination of the molecular masses of successive nucleic acid fragments, which were generated by elongation of the primer in step (a), by means of mass spectrometry; and (c) determining the nucleotide sequence by determining the molecular weight increases between the successive size nucleic acid fragments.
  • the present invention further relates to a method for determining a partial nucleotide sequence of a nucleic acid molecule, comprising the steps of: (a) incubating a primer which hybridizes to the nucleic acid molecule with multiple copies of the nucleic acid molecule in the presence of a polymerase and a mixture of deoxyribonucleotides; (b) heat denaturation of the complexes consisting of nucleic acid molecule and extended primer and / or nucleic acid molecule, extended primer and polymerase; (c) optionally repeating steps (a) and (b) one or more times; (d) determination of the molecular masses of successive nucleic acid fragments, which were generated by elongation of the primer in step (a), by means of mass spectrometry; and (e) determining the nucleotide sequence by determining a molecular weight increase between the successive size nucleic acid fragments.
  • the invention also relates to a method for determining a partial nucleotide sequence of a nucleic acid molecule, comprising the steps of: (a) incubating a primer that hybridizes to the nucleic acid molecule with multiple copies of the nucleic acid molecule in the presence of a polymerase and a mixture of deoxyribonucleotides at an annealing temperature that is between 5 ° C and 40 ° C above the theoretical melting temperature of the primer, with each deoxyribonucleotide labeled with a different dye; (b) electrophoretic or chromatographic separation of the
  • the invention relates to a method for determining a partial nucleotide sequence of a nucleic acid molecule, comprising the steps: (a) incubation of a primer which hybridizes to the nucleic acid molecule with multiple copies of the nucleic acid molecule in the presence of a polymerase and a mixture of deoxyribonucleotides, each deoxyribonucleotide with a different dye is marked; (b) heat denaturation of the complexes consisting of nucleic acid molecule and extended primer and / or nucleic acid molecule extended primer and polymerase; (c) optionally repeating steps (a) and (b) one or more times; (d) electrophoretic or chromatographic separation of the nucleic acid fragments generated by elongation of the primer in step (a); and (e) determination of the nucleotide sequence by determination of the dye (s) with which nucleic acid fragments successively in size were marked by incorporation of the corresponding deoxyribonucleo
  • ddNTPs dideoxynucleoside triphosphates
  • populations of DNA molecules are formed whose elongation terminates statistically at positions that correspond to each complementary C, T, A or G of the template strand. If the populations of DNA molecules are marked differentially (for example, by using ddNTP-specific fluorescent dyes), the enzymatic reaction can be carried out in a reaction mixture which contains all four different ddNTPs. If the populations of DNA molecules are indistinguishably marked, the enzymatic reaction must be carried out in four different reaction batches, each containing one of the four different ddNTPs. The populations of labeled DNA molecules can finally be separated using polyacrylamide gel electrophoresis, for example, and the sequence of the DNA template can be determined.
  • ddNTPs ddGTP, ddATP, ddTTP, ddCTP
  • PCR polymerase chain reaction
  • mass spectrometry mass spectrometry
  • the base-specific termination of the elongation reaction through the incorporation of modified stop nucleotides, usually ddNTPs, as practiced with the Sanger sequencing method and all related sequencing techniques, has a number of disadvantages. For example, for optimal results it is necessary to carefully match the ratio of dNTPs and stop nucleotides. If the DNA template to be sequenced was amplified in a previous PCR reaction, it is therefore necessary, as far as possible, to remove dNTPs that were not used in the PCR reaction before sequencing. With a large number of samples to be sequenced, this step is time consuming and costly. Another disadvantage is that only DNA polymerases can be used, the stop nucleotides as the substrate accept and install correctly. Finally, the commercially available stop nucleotides are significantly more expensive than unmodified nucleotides.
  • the technical problem underlying the present invention was to provide a simpler, faster and less expensive method for sequencing nucleic acid molecules.
  • the present invention thus relates to a method for determining a partial nucleotide sequence of a nucleic acid molecule, comprising the steps: Temperature that is between 5 ° C and 40 ° C above the theoretical melting temperature of the primer; (b) determination of the molecular masses of successive nucleic acid fragments, which were generated by elongation of the primer in step (a), by means of mass spectrometry; and (c) determining the nucleotide sequence by determining the molecular weight increases between the successive size nucleic acid fragments.
  • partial nucleotide sequence means that only that part of the sequence of a nucleic acid molecule that does not hybridize to the primer is determined. If the nucleic acid molecule has an excess of length of preferably up to 25 nucleotides that does not hybridize with the primer and the primer hybridizes flush at the 3 'end of the nucleic acid molecule, the sequence of the entire part that does not hybridize with the primer can be determined.
  • nucleic acid molecules which have a total length of preferably less than 50 nucleotides and the primers have a total length of preferably not more than 25 nucleotides
  • the sequence hybridizing to the primer (which was either already known and served as the basis for the synthesis of the primer sequence) can be added has or the complete Hybridization of the primer can be derived from the primer sequence as a complementary sequence), the total sequence of the nucleic acid molecule can be determined.
  • these embodiments also belong to the invention.
  • the primer is preferably incubated under stringent hybridization conditions which permit hybridization of the primer only at the region of the nucleic acid molecule which is complementary in its sequence to the sequence of the primer.
  • stringent hybridization conditions which permit hybridization of the primer only at the region of the nucleic acid molecule which is complementary in its sequence to the sequence of the primer.
  • non-stringent hybridization conditions which allow hybridization of the primer to a region of the nucleic acid molecule whose sequence at one or more positions is not complementary to the sequence of the primer. This area preferably has no more than three “mismatches”.
  • Stringent or non-stringent hybridization conditions are known to the person skilled in the art and can easily be determined depending on, for example, the length of the primer to be used (see, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, CSH Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, New York (1989); or Higgins and Harnes, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, EAL Press Oxford, Washington DC (1985)).
  • Stringent hybridization conditions are, for example, hybridization in 6xSSC and 0.1% SDS at 65 ° C or in 50% formamide and 4xSSC at 42 ° C and subsequent washing in 0.1xSSC and 0.1% SDS at 65 ° C.
  • Non-stringent hybridization conditions are, for example, hybridization and subsequent washing in 4xSSC and 1% SDS at 50 ° C.
  • the stringency can also be regulated exclusively via the temperature. In this case, stringent hybridization conditions are usually achieved by selecting the hybridization temperature higher than the melting temperature of the nucleic acid molecules to be hybridized.
  • At least 6 x 10 8 copies, more preferably at least 3 x 10 10 copies and most preferably at least 3 x 10 11 copies of the nucleic acid molecule to be sequenced are preferably used to carry out the method according to the invention.
  • the copies of the to be sequenced Nucleic acid molecules are identical at least in the area of the nucleic acid sequence to be sequenced and the primer binding site. They are preferably identical copies of the nucleic acid molecule to be sequenced.
  • the term “mixture of deoxyribonucleotides” means that only nucleotides are used in step (a), the incorporation of which allows a further elongation of the primer in the 5'-3 'direction by the polymerase activity. In other words, this mixture contains no nucleotides, such as, for example, dideoxyribonucleotides, the incorporation of which would prevent further elongation of the primer due to the missing 3'-OH group.
  • Suitable nucleotides are thus, for example, the deoxyribonucleotides dGTP, dATP, dTTP and dCTP or derivatives thereof.
  • Suitable dNTP derivatives are, in particular, those which have improved ion stability, such as, for example, 7-deazadATP and -dGTP (F. Kirpekar et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 9 (1995) 525. K. Schneider and BT Chait , Nucleic Acids Res. 23 (1995) 1570) or 2'-F-dNTP (W. Tang, L. Zhu, LM. Smith, Anal. Chem. 69 (1997) 302).
  • the theoretical melting temperature of any primer can be readily determined by the person skilled in the art (see, for example, Sambrook et al., Loc. Cit.).
  • the molecular masses of the nucleic acid fragments generated in step (a) are determined by mass spectrometry and then the molecular mass increases between the primer used and the nucleic acid fragment that corresponds to the primer extended by one nucleotide, the latter nucleic acid fragment and the nucleic acid fragment that corresponds to the one extended by two nucleotides etc. determined.
  • nucleotides can be determined by determining the increase in molecular weight which differ in size from two nucleic acid fragments, can be determined simply and unambiguously, and thus the associated sequence of the nucleic acid molecule due to the complementarity of double-stranded nucleic acid molecules.
  • the increases in molecular mass can be derived in a simple manner from the molecular masses of the generated nucleic acid fragments determined by mass spectrometry.
  • the specific molecular masses of successive nucleic acid fragments that is to say nucleic acid fragments which differ from one another only by the incorporation of an additional nucleotide, are subtracted from one another. These values are then compared with the molecular mass increases expected for the incorporation of nucleotides A, C, G or T.
  • the assignment of the built-in nucleotide takes place within maximum deviation tolerances, for example, +/- 4 Da.
  • the smallest difference between the four possible molecular mass increases (+ A, + C, + G or + T) is nominally 9 Da and concerns the incorporation of A (+313 Da) versus T (304 Da). This is sufficiently taken into account by a maximum deviation tolerance of +/- 4 Da.
  • nucleic acid fragments resulting from the incorporation of one of the four possible nucleotides by addition of the associated known molecular mass increases (nominal: A: +313 Da, C: +289 Da, T: +304 Da, G: +329 Da ) be calculated.
  • the four possible molecular masses calculated in this way are then compared with the actually determined value.
  • nucleotide The assignment of which nucleotide was incorporated is carried out within predefined deviation tolerances, eg +/- 4 Da.
  • the four possible molecular masses of the nucleic acid fragments extended by a further nucleotide are then calculated by means of addition and compared with the associated experimental value.
  • the molecular masses of nucleic acid molecules can be precisely calculated in a simple manner known to the person skilled in the art from the known atomic masses of the various chemical elements by means of addition. This calculation takes into account the chemical composition of the nucleotide monomers (i.e.
  • the monoisotopic or average atomic masses can be used for these calculations.
  • the monoisotopic molecular mass is calculated, which is used for comparison if the isotope of the nucleic acid molecules to be analyzed can be separated. The high instrumental resolution required is provided by modern mass spectrometers.
  • 3a demonstrates this using an example of a set of nucleic acid fragments generated according to the invention.
  • the molecular mass increases for the nucleic acid fragments were determined to within 0.1 Da. If the mass spectrometer does not succeed in separating the isotopy of nucleic acid molecules, for example because they are too large, average atomic masses are used for the calculation and thus average molecular masses are calculated.
  • the method according to the invention advantageously allows nucleic acid molecules to be sequenced without using stop nucleotides, which lead to base-specific termination of the elongation reaction.
  • the method according to the invention is based on the surprising finding that oligonucleotides hybridize at complementary sequences of larger nucleic acid molecules at a temperature which is well above their melting temperature for a sufficient time to be extended by one or more nucleotides in the presence of a polymerase and dNTPs the double strand formed is thermally denatured again.
  • the nucleic acid fragments arise in the process according to the invention in that the attachment of the primer is short-lived at the high annealing temperature and the complex consisting of nucleic acid molecule (template), primer and enzyme is thermally unstable.
  • formed synthesis complexes disintegrate after a short time and leave a primer that has only been extended by one or a few nucleotide (s).
  • nucleic acid molecules no longer have to be purified before sequencing in order to remove nucleotide contamination, for example by a previous PCR amplification.
  • the method according to the invention permits automation of the method steps, which further accelerates the implementation. It is also conceivable to use the method according to the invention for "multiplexing", ie for the simultaneous determination of different partial nucleotide sequences within a nucleic acid molecule.
  • the specific primers are marked differently, so that the associated nucleic acid fragments resulting from the elongation of the primers can be separated, for example, by reversible affinity binding (solid phase purification). These can then be analyzed separately from one another by mass spectrometry.
  • primers can be used whose molecular mass is changed by an additional chemical group (mass tag, eg half the mass of one of the four nucleotides) so that the sequencing ladder in the mass spectrum can be clearly separated for the incorporation of one or a few nucleotides.
  • mass tag eg half the mass of one of the four nucleotides
  • Such techniques or the specific "mass tagging" of nucleic acids are known in the prior art (for example P. Ross et al., High level of multiplex genotyping by MALDI-TOF mass spectrometry, Nature Biotechnology 16 (1998) 1347, WO 99/29898 , or WO 99/29897).
  • the method according to the invention is particularly suitable for the sequencing of short nucleic acid sections of up to 25 nucleotides, preferably of up to 15 nucleotides, more preferably of up to 10 nucleotides and most preferably of up to 7 or 5 nucleotides.
  • the method according to the invention is therefore particularly suitable for the detection of single nucleotide polymorphisms (single nucleotide polymorphisms, SNPs). Examples 2 and 3 and the associated Figures 2 and 3 also document possible applications and characteristics.
  • the nucleic acid molecule to be sequenced can of course also be, for example, a cDNA, a vector, a plasmid, a cosmid, an artificial bacterial chromosome (BAC), artificial yeast chromosome (BAC) Chromosomes, YAC) or natural genomic DNA or act as a fragment thereof.
  • BAC bacterial chromosome
  • BAC yeast chromosome
  • YAC natural genomic DNA or act as a fragment thereof.
  • foreign DNA segments for example cDNA copies of isolated messenger RNA (English: messenger RNA, mRNA) or fragments of genomic DNA, are routinely used in cloning techniques
  • Vectors, plasmids or cosmids installed and then introduced into guest cells, for example E. coli or yeast cells.
  • the complete sequence of the externally introduced nucleic acid can thus be determined by determining the partial nucleotide sequence, for example of a vector.
  • the sequencing technique according to the invention enables partial and rapid sequence information (eg terminal partial nucleotide sequences) of the DNA sections incorporated in the different clones to be generated quickly and efficiently. This information can then be used to identify clones by means of sequence comparison or to make statements about their quality.
  • sequence information comprising a few nucleotides is already sufficient to answer this question.
  • the method according to the invention comprises the following steps between step (a) and (b): (aa) heat denaturation of the complex consisting of nucleic acid molecule and extended primer; and (ab) optionally repeating steps (a) and (aa) one or more times.
  • the present invention also relates to a method for determining a partial nucleotide sequence of a nucleic acid molecule, comprising the steps of: (a) incubating a primer which hybridizes to the nucleic acid molecule with multiple copies of the nucleic acid molecule in the presence of a polymerase and a mixture of deoxyribonucleotides; (b) heat denaturation of the complexes consisting of nucleic acid molecule and extended primer and / or nucleic acid molecule, extended primer and polymerase; (c) optionally repeating steps (a) and (b) one or more times; (d) determining the molecular masses of successive nucleic acid fragments, generated by elongation of the primer in step (a) by means of mass spectrometry; and (e) determining the nucleotide sequence by determining the molecular weight increases between the successive size nucleic acid fragments.
  • nucleic acid fragments can also be generated by elongation of the primer of different lengths in that after the primer has hybridized to the nucleic acid molecule to be sequenced, the annealing temperature is increased rapidly and without interruption so that it the complexes consisting of nucleic acid molecule and extended primer and / or nucleic acid molecule, extended primer and polymerase are denatured.
  • the temperature is raised to above 80 ° C, more preferably to above 90 ° C and most preferably to above 94 ° C.
  • the annealing temperature and duration in step (a) is of minor importance in this embodiment.
  • the annealing temperature is preferably below the optimum temperature of the polymerase used, so that there is negligible elongation of the primer during step (a).
  • Hybridization preferably takes place for 1 to 10 seconds, more preferably for 1 to 5 seconds and most preferably for 1 second.
  • One skilled in the art can readily determine the optimal annealing temperature and duration for a given primer.
  • the nucleic acid fragments are purified / isolated before the mass spectrometric analysis.
  • sequencing products can be cleaned and concentrated very quickly and cost-effectively for mass spectrometric analysis by the use of ZipTips (P10 pipette tips with a small reverse phase column integrated at the end) sold by Millipore Corporation, Bedford, MA, USA, and the associated purification protocols.
  • ZipTips P10 pipette tips with a small reverse phase column integrated at the end
  • mass spectrometry is matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) or electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS).
  • MALDI-TOF-MS matrix-assisted laser desorption / ionization time-of-flight mass spectrometry
  • ESI-MS electrospray ionization mass spectrometry
  • the present invention relates to a method for determining a partial nucleotide sequence of a nucleic acid molecule, comprising the steps: (a) incubation of a primer which hybridizes to the nucleic acid molecule with multiple copies of the nucleic acid molecule in the presence of a polymerase and a mixture of deoxyribonucleotides an annealing temperature which is between 5 ° C and 40 ° C above the theoretical melting temperature of the primer, each deoxyribonucleotide being labeled with a different dye; (b) electrophoretic or chromatographic separation of the primer to form a primer.
  • Electrophoretic or chromatographic methods for the separation of nucleic acid fragments are known to the person skilled in the art and include, for example, gel electrophoretic, capillary electrophoretic, ion exchange chromatographic or reverse phase chromatographic methods.
  • the present invention also relates to a method for determining a partial nucleotide sequence of a nucleic acid molecule, comprising the steps: (a) incubating a primer that hybridizes to the nucleic acid molecule with multiple copies of the nucleic acid molecule in the presence of a polymerase and a mixture of deoxyribonucleotides, each deoxyribonucleotide being labeled with a different dye; (b) heat denaturation of the complexes consisting of nucleic acid molecule and extended primer and / or nucleic acid molecule, extended primer and polymerase; (c) optionally repeating steps (a) and (b) one or more times; (d) electrophoretic or chromatographic separation of the nucleic acid fragments generated by elongation of the primer in step (a); and (e) determination of the nucleotide sequence by determination of the dye (s) with which nucleic acid fragments successively in size were marked by incorporation of the corresponding deoxyribon
  • nucleic acid sections mentioned above apply.
  • 1 or 2 nucleotides are preferably identified from the sequence or their sequence is established.
  • the dyes are fluorescent dyes, the fluorescence being excited by means of a laser.
  • the annealing temperature is between 10 ° C., preferably 15 ° C. and 20 ° C., preferably 30 ° C., above the theoretical melting temperature of the primer.
  • steps (a) and (b) are repeated between 2 and 40 times.
  • steps (a) and (b) are repeated between 5 and 20 times.
  • step (b) is carried out by means of microwaves or infrared light irradiation or in a thermal cycler.
  • an ultrasound treatment is carried out between steps (a) and (b).
  • the polymerase is a thermostable polymerase.
  • Thermostable polymerases are known to the person skilled in the art and include, for example, the thermostable Taq DNA polymerase which has been isolated from the thermophilic microorganism Thermus aquaticus.
  • Other examples are the naturally occurring thermostable DNA polymerases Hot Tub TM, Pyrostase TM, Pfu, Pwo, Tbr, Tfl and the genetically engineered thermostable polymerases Tli, Amplitaq®, Thermo Sequenase TM, Vent TM, Deep Vent TM, Tth and UlTma TM ,
  • the nucleic acid molecule is double-stranded and is denatured before step (a).
  • nucleic acid molecule is N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N-(2-aminoethyl)-2-aminoethyl-N
  • DNA polymerase is used.
  • the primer is 10 to 15 nucleotides long.
  • Another advantage of the method according to the invention is that short primers can be used for sequencing nucleic acid molecules. This not only enables very stringent conditions in the hybridization of the primer, which leads to incorrect attachment of the primer can be excluded, but also reduces due to the lower synthesis costs additionally the costs incurred in carrying out the method according to the invention.
  • the short length of the primers used has a positive effect on the mass spectrometric analysis. This is due to the fact that shorter oligonucleotides are detected in mass spectrometry with higher sensitivity and mass resolution than longer ones.
  • the primer is 10 to 12 nucleotides long.
  • Figure 1 MALDI-TOF mass spectrum of a Sanger sequencing reaction (a) and a sequencing reaction according to the invention (b).
  • Example 1 The spectra of the sequence reaction products generated in Example 1 were recorded in the linear mode of a Bruker Scout MTP Reflex III mass spectrometer. The selected section shows the signals of the generated first four conductor oligonucleotides (primer + 1, 2,3,4 nucleotides). The incorporation of the corresponding dideoxy and deoxyribonucleotides is indicated in each case.
  • Figure 2 MALDI-TOF mass spectra of the sequencing conductors generated with different values T on neai.
  • the spectra of the sequencing reaction products generated in Example 2 were recorded in the linear mode of a Bruker Scout MTP Reflex III mass spectrometer.
  • the individual values for T ann eai are given in the corresponding partial illustrations. It can clearly be seen how the yield of the sequencing products increases from 41 ° C. to 63 ° C. with increasing T a nn ⁇ ai.
  • the expected (calculated) melting temperature for the primer used is 45 ° C.
  • Nucleotide internals are shown for the first three nucleotides in the upper part of the illustration. The insertion of G in one but not the other sequencing strand results in a signal doublet for the first nucleotide (incorporation of complementary C versus A).
  • the signals coincide due to the same resulting empirical formula (incorporation of C followed by A versus incorporation of A followed by C). The result is a signal but two mass differences from the previous doublet, on the basis of which the incorporation of A versus C was determined.
  • incorporation of G versus C which confirms the insertion of G two nucleotides beforehand.
  • P indicates the signal of the primer used.
  • Figure 3 MALDI-TOF mass spectra of the sequencing products generated in Example 3 for DNA templates (a-d).
  • the spectra were recorded in the high-resolution reflector mode of a Bruker Scout MTP Reflex III mass spectrometer.
  • the selected section shows the signal of the primer and the signals of the generated first four conductor oligonucleotides.
  • the inserts in FIG. 3a show the associated signal greatly enlarged in the X direction.
  • the resolution of the isotopy on which the corresponding oligonucleotides are based can be clearly recognized therein.
  • the nucleotide incorporation on which the different sequencing products are based, assigned on the basis of the determined mass differences, is indicated.
  • the assignments substitution (b), insertion (c) and deletion (d) are obvious.
  • P indicates the signal of the primer used.
  • Example 1 Sanger versus sequencing reaction according to the invention, implementation: thermal denaturation of the active synthesis complex consisting of DNA template, primer and DNA polymerase.
  • the reaction temperature is increased rapidly, so that the synthesis complex consisting of DNA template, primer and DNA polymerase is thermally denatured during the ongoing extension of the primer. This process is statistically distributed, decreasing in frequency with the length of the synthesis products, and results in a sequencing ladder according to the invention. Both sequencing reactions were carried out in 10 ⁇ ⁇ reaction volume.
  • Sanger sequencing reaction 54 ° C / 20 s, 72 ° C / 30 s, 94 ° C / 20 s
  • sequencing reaction according to the invention 54 ° C / 1s, 94 ° C / 5s.
  • a comparison of the data shown in FIG. 1 shows that the reaction products according to the invention can be obtained as disruptive by-products in Sanger sequencing reactions.
  • the stop with dA in addition to ddA is particularly troublesome for the detection of SNPs, since the molecular masses of dA and ddG are identical and the side reaction in question can thus simulate the exchange of A for G in an allele. This problem is avoided in the sequencing reaction according to the invention.
  • the selected annealing temperature T an n ea i significantly exceeds the melting temperature of the primer T m , its attachment and thus also the lifespan of the synthesis complex consisting of DNA template, primer and DNA polymerase is short-lived. As a result, the primer becomes only a few nucleotides extended before the synthesis stops. This process is statistically distributed, decreasing in frequency with the length of the synthesis products, and results in a sequencing ladder according to the invention.
  • DNA double strand template 47/48 bp PCR product.
  • Human genomic DNA served as the starting material.
  • the amplified regions (alleles) differ by inserting G at position 25 of the sequencing strand in an allele.
  • a primer that was only 12 nucleotides long was chosen, which attaches to the sequencing strand immediately before the expected mutation. This mutation was clearly detected by the detected sequencing products (see Figure 2). All sequencing reactions were carried out in 10 ⁇ ⁇ reaction volume.
  • reaction buffer 20 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 2 mM MgCl 2 , 75 mM Tris-HCl, pH 9.5 (reaction buffer). All reaction mixtures were subjected to 20 reaction cycles to increase the yield of sequencing products. For this purpose, the reaction mixtures were first heated to 94 ° C for 2 minutes in a thermal cycler (Eppendorf mastercycler gradient), followed by 20 temperature cycles: Tanneai / 1s, 94 ° C. The values used for T an neai ranged from 41 ° C. to 80 ° C. within a selected gradient (see FIG. 2).
  • Example 3 Use of the sequencing reaction according to the invention, implementation: Tanneai »T m , for the detection of SNPs (single nucleotide polymorphisms).
  • CGC AAC CTT CGC 1 unit thermosequenase
  • dNTP deoxyribonucleoside triphosphate
  • reaction buffer 20 mM (NH 4 ) 2 SO 4

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsäuremoleküls, umfassend die Schritte: (a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsäuremoleküls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden; (b) Bestimmung der Molekülmassen von in der Grösse aufeinanderfolgenden Nukleinsäurefragmenten, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden, mittels Massenspektrometrie; und (c) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung der Molekülmassenzuwächse zwischen den in der Grösse aufeinanderfolgenden Nukleinsäurefragmenten.

Description

VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG EINER PARTIELLEN NUKLEOTIDSEQUENZ EINES NUKLEINSAUREMOLEKULS
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsauremolekuls, umfassend die Schritte: (a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsauremolekuls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden bei einer Annealing-Temperatur, die zwischen 5°C und 40°C über der theoretischen Schmelztemperatur des Primers liegt; (b) Bestimmung der Molekülmassen von in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsaurefragmenten, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden, mittels Massenspektrometrie; und (c) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung der Molekülmassenzuwächse zwischen den in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsaurefragmenten. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsauremolekuls, umfassend die Schritte: (a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsauremolekuls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden; (b) Hitzedenaturierung der Komplexe bestehend aus Nukleinsäuremolekül und verlängertem Primer und/oder Nukleinsäuremolekül, verlängertem Primer und Polymerase; (c) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (a) und (b); (d) Bestimmung der Molekülmassen von in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsaurefragmenten, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden, mittels Massenspektrometrie; und (e) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung einer Molekülmassenzuwächse zwischen den in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsaurefragmenten. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsauremolekuls, umfassend die Schritte: (a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsauremolekuls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden bei einer Annealing-Temperatur, die zwischen 5°C und 40°C über der theoretischen Schmelztemperatur des Primers liegt, wobei jedes Desoxyribonukleotid mit einem unterschiedlichen Farbstoff markiert ist; (b) elektrophoretische oder chromatographische Auftrennung der
Nukleinsäurefragmente, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden; und (c) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung des/der Farbstoff e(s), mit dem/denen in der Größe aufeinanderfolgende Nukleinsäurefragmente durch Inkorporation der entsprechenden Desoxyribonukleotide markiert wurden. Schließlich betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsauremolekuls, umfassend die Schritte: (a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsauremolekuls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden, wobei jedes Desoxyribonukleotid mit einem unterschiedlichen Farbstoff markiert ist; (b) Hitzedenaturierung der Komplexe bestehend aus Nukleinsäuremolekül und verlängertem Primer und/oder Nukleinsäuremolekül verlängertem Primer und Polymerase; (c) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (a) und (b); (d) elektrophoretische oder chromatographische Auftrennung der Nukleinsäurefragmente, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden; und (e) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung des/der Farbstoff e(s), mit dem/denen in der Größe aufeinanderfolgende Nukleinsäurefragmente durch Inkorporation der entsprechenden Desoxyribonukleotide markiert wurden.
Die heutzutage hauptsächlich verwendeten Verfahren zur Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen beruhen auf dem Prinzip des enzymatischen Sequenzierverfahrens, das 1977 von Sanger et al. entwickelt wurde (Sanger et al. 1977, PNAS 74: 5463). Bei diesem Verfahren wird ein spezifischer Primer an ein zu sequenzierendes einzelsträngiges DNA-Template hybridisiert, und mittels einer DNA-Polymerase verlängert. Durch den Einsatz von Didesoxynukleosid- triphosphaten (ddNTPs) wird dabei die Elongation der Primer basenspezifisch terminiert, wodurch Populationen von DNA-Molekülen entstehen, deren Längen durch den Abstand zwischen dem 5'-Ende des Primers und der Position des basenspezifischen Strangabbruchs bestimmt sind. Werden vier unterschiedliche ddNTPs verwendet (ddGTP, ddATP, ddTTP, ddCTP), entstehen Populationen von DNA-Molekülen, deren Elongation statistisch an Positionen abbrechen, die jedem komplementären C, T, A oder G des Template-Stranges entsprechen. Sind die Populationen von DNA-Molekülen unterscheidbar markiert (beispielsweise durch die Verwendung von ddNTP-spezifischen Fluroeszenz-Farbstoffen), kann die enzymatische Reaktion in einem Reaktionsansatz, der alle vier verschiedenen ddNTPs enthält, durchgeführt werden. Sind die Populationen von DNA-Molekülen nicht unterscheidbar markiert, muß die enzymatische Reaktion in vier unterschiedlichen Reaktionsansätzen durchgeführt werden, die jeweils eines der vier verschiedenen ddNTPs enthalten. Die Populationen von markierten DNA- Molekülen können schließlich beispielsweise mittels Polyacrylamid- Gelelektrophorese aufgetrennt und die Sequenz des DNA-Templates bestimmt werden.
Neuere Varianten des Sequenzierverfahrens nach Sanger umfassen den Einsatz der Polymerasekettenreaktion (PCR) und der Massenspektrometrie zur Analyse der Populationen von DNA-Molekülen.
Die basenspezifische Terminierung der Elongationsreaktion durch den Einbau von modifizierten Stopnukleotiden, üblicherweise ddNTPs, wie bei der Sequenzierungsmethode nach Sanger und allen damit verwandten Sequenzierungstechniken praktiziert, ist jedoch mit einer Reihe von Nachteilen verbunden. Beispielsweise ist es für optimale Ergebnisse erforderlich, das Verhältnis von dNTPs und Stopnukleotiden sorgfältig aufeinander abzustimmen. Wurde das zu sequenzierende DNA-Template in einer vorangegangenen PCR- Reaktion amplifiziert, ist es deshalb notwendig, vor der Sequenzierung dNTPs, die in der PCR-Reaktion nicht verbraucht wurden, weitestgehend zu entfernen. Bei einer großen Anzahl von zu sequenzierenden Proben ist dieser Schritt zeitaufwendig und kostenintensiv. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß nur DNA-Polymerasen eingesetzt werden können, die Stopnukleotide als Substrat akzeptieren und korrekt einbauen. Und schließlich sind die kommerziell verfügbaren Stopnukleotide deutlich teurer als unmodifizierte Nukleotide.
Dementsprechend war das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende technische Problem, eine einfachere, schnellere und kostengünstigere Methode zur Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen zur Verfügung zu stellen.
Dieses technische Problem wird durch die in den Ansprüchen charakterisierten Ausführungsformen gelöst.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsauremolekuls, umfassend die Schritte: (a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsauremolekuls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden bei einer Annealing-Temperatur, die zwischen 5°C und 40°C über der theoretischen Schmelztemperatur des Primers liegt; (b) Bestimmung der Molekülmassen von in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsaurefragmenten, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden, mittels Massenspektrometrie; und (c) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung der Molekülmassenzuwächse zwischen den in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsaurefragmenten.
Der Begriff "partielle Nukleotidsequenz" bedeutet erfindungsgemäß, daß nur der/ein Teil der Sequenz eines Nukleinsauremolekuls bestimmt wird, der nicht an den Primer hybridisiert. Sofern das Nukleinsäuremolekül einen nicht mit dem Primer hybridisierenden Längenüberschuß von vorzugsweise bis zu 25 Nukleotiden aufweist und der Primer bündig abschließend am 3' Ende des Nukleinsauremolekuls hybridisiert, kann der gesamte nicht mit dem Primer hybridisierende Teil in seiner Sequenz ermittelt werden. Bei Nukleinsäuremolekülen, die eine Gesamtlänge von vorzugsweise weniger als 50 Nukleotiden aufweisen und die Primer eine Gesamtlänge von vorzugsweise nicht mehr als 25 Nukleotiden haben, kann durch Addition der zum Primer hybridisierenden Sequenz (die entweder bereits bekannt war und als Grundlage für die Synthese der Primersequenz gedient hat oder die bei vollständiger Hybridisierung des Primers aus der Primersequenz als Komplementärsequenz abgeleitet werden kann) die Gesamtsequenz des Nukleinsauremolekuls ermittelt werden. In dem hier beschriebenen Verfahren gehören auch diese Ausführungsformen zur Erfindung.
Die Inkubation des Primers erfolgt vorzugsweise unter stringenten Hybridisierungsbedingungen, die eine Hybridisierung des Primers nur an dem Bereich des Nukleinsauremolekuls erlauben, der in seiner Sequenz komplementär zu der Sequenz des Primers ist. Es ist jedoch auch vorstellbar, eine Hybridisierung des Primers unter nicht stringenten Hybridisierungsbedingungen durchzuführen, die eine Hybridisierung des Primers an einem Bereich des Nukleinsauremolekuls erlauben, dessen Sequenz an einer oder mehreren Positionen nicht komplementär zu der Sequenz des Primers ist. Vorzugsweise weist dieser Bereich nicht mehr als drei "Mismatches" auf. Stringente bzw. nicht stringente Hybridisierungsbedingungen sind dem Fachmann bekannt und können in Abhängigkeit von beispielsweise der Länge des zu verwendenden Primers einfach bestimmt werden (siehe, z.B., Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edition, CSH Press, Cold Spring Harbor, New York (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, New York (1989); oder Higgins and Harnes, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, EAL Press Oxford, Washington D.C. (1985)). Stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise Hybridisierung in 6xSSC und 0,1% SDS bei 65°C oder in 50% Formamid und 4xSSC bei 42°C und anschließendes Waschen in 0,1xSSC und 0,1% SDS bei 65°C. Nicht stringente Hybridisierungsbedingungen sind beispielsweise Hybridisierung und anschließendes Waschen in 4xSSC und 1%SDS bei 50°C. Die Stringenz kann auch ausschließlich über die Temperatur reguliert werden. In diesem Fall werden üblicherweise stringente Hybridisierungsbedingungen dadurch erreicht, daß die Hybridisierungstemperatur höher als die Schmelztemperatur der zu hybridisierenden Nukleinsäuremoleküle gewählt wird.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden vorzugsweise mindestens 6 x 108 Kopien, stärker bevorzugt mindestens 3 x 1010 Kopien und am meisten bevorzugt mindestens 3 x 1011 Kopien des zu sequenzierenden Nukleinsauremolekuls eingesetzt. Die Kopien des zu sequenzierenden Nukleinsauremolekuls sind mindestens in dem Bereich der zu sequenzierenden Nukleinsäuresequenz und der Primerbindungsstelle identisch. Vorzugsweise handelt es sich um identische Kopien des zu sequenzierenden Nukleinsauremolekuls.
Der Begriff "Gemisch von Desoxyribonukleotiden" bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung, daß in Schritt (a) ausschließlich Nukleotide verwendet werden, deren Einbau eine weitere Elongation des Primers in 5'-3'-Richtung durch die Polymeraseaktivität erlaubt. Mit anderen Worten, dieses Gemisch enthält keine Nukleotide, wie beispielsweise Didesoxyribonukleotide, deren Einbau aufgrund der fehlenden 3'-OH-Gruppe eine weitere Elongation des Primers unterbinden würde. Geeignete Nukleotide sind somit beispielsweise die Desoxyribonukleotide dGTP, dATP, dTTP und dCTP oder Derivate davon. Geeignete dNTP-Derivate sind vor allem solche, die eine verbesserte lonenstabilität aufweisen wie z.B. 7-deaza- dATP und -dGTP (F. Kirpekar et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 9 (1995) 525. K. Schneider and B.T. Chait, Nucleic Acids Res. 23 (1995) 1570) oder 2'-F- dNTP (W. Tang, L. Zhu, LM. Smith, Anal. Chem. 69 (1997) 302). Die theoretische Schmelztemperatur eines beliebigen Primers ist für den Fachmann ohne weiteres bestimmbar (siehe z.B. Sambrook et al., loc. cit.). Vorzugsweise wird die theoretische Schmelztemperatur nach folgender Formel ermittelt: Tm (°C) = 69,3 + (%GC * 0,41) - (650/n), wobei %GC=GC Gehalt in Prozent, n=Anzahl der enthaltenen Nukleotide.
Die Bestimmung der Molekülmasse von Nukleinsäuremolekülen mittels Massenspektrometrie ist im Stand der Technik bekannt und kann vom Fachmann ohne weiteres durchgeführt werden (siehe z.B. Nordhoff et al., Mass Spectrometry of nucleic acids, Mass Spectrometry Reviews, 15 (1996) 67; Nordhoff et al., Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry as a new method for the characterization of nucleic acids, Trends Anal. Chem., 15 (1996) 240; Limbach, Mass Spectrom. Reviews, 15 (1996) 297; Burlingame, Mass Spectrometry, 70 (1998) 647; Nordhoff et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 6, 771 (1992); Wu et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 7 (1993) 142; Fitzgerald et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 7 (1993) 895; Nordhoff et al., Nucleic Acids Res. 21 (1993) 3347; Nordhoff et al., Nucleic Acids Res. 22 (1994) 2460; Kirpekar et al., Nucleic Acids Res. 22 (1994) 3866; Vestal et al., Rapid Commun. Mass Spectrom. 9 (1995) 1044; Koster et al., Nature Biotechnol. 14 (1996) 1123; Little et al., Nature Med. 3 (1997) 1413; Ross et al., Nature Biotechnol. 16 (1998) 1347; Kirpekar et al., DNA sequence analysis by MALDI mass spectrometry, Nucleic Acids Res. 26 (1998) 2554). Erfindungsgemäß werden die Molekülmassen der in Schritt (a) generierten Nukleinsäurefragmente massenspektrometrisch bestimmt und anschließend die Molekülmassenzuwächse zwischen dem verwendeten Primer und dem Nukleinsäurefragment, das dem um ein Nukleotid verlängerten Primer entspricht, letzterem Nukleinsäurefragment und dem Nukleinsäurefragment, das dem um zwei Nukleotide verlängerten Primer entspricht, usw. ermittelt. Da der Einbau eines Nukleotids einen spezifischen Molekülmassenzuwachs verursacht und der Molekülmassenzuwachs für den Einbau jedes möglichen Nukleotids bekannt ist (nominal: A/313Da, C/289Da, G/329Da und T/304Da), können durch die Bestimmung der Molekülmassenzuwächse die Nukleotide, um die sich zwei Nukleinsäurefragmente in ihrer Größe unterscheiden, einfach und eindeutig bestimmt werden und damit aufgrund der Komplementarität doppelsträngiger Nukleinsäuremoleküle die zugehörige Sequenz des Nukleinsauremolekuls. Die Molekülmassenzuwächse lassen sich in einfacher Weise aus den massenspektrometrisch bestimmten Molekülmassen der generierten Nukleinsäurefragmente ableiten. Hierzu werden die bestimmten Molekülmassen aufeinanderfolgender Nukleinsäurefragmente, das heißt Nukleinsäurefragmente, die sich nur um den Einbau eines zusätzlichen Nukleotids voneinander unterscheiden, voneinander subtrahiert. Diese Werte werde dann mit den für den Einbau der Nukleotide A, C, G oder T erwarteten Molekülmassenzuwächse verglichen. Die Zuordnung des eingebauten Nukleotids erfolgt innerhalb maximaler Abweichungstoleranzen, z.B., +/- 4 Da. Die geringste Differenz zwischen den vier möglichen Molekülmassenzuwächsen (+A, +C, +G oder +T) beträgt nominal 9 Da und betrifft den Einbau von A (+313 Da) versus T (304 Da). Dies wird durch eine maximale Abweichungstoleranz von +/- 4 Da hinreichend berücksichtigt. Sind größere Abweichungstoleranzen erwünscht, können diese zum Beispiel durch den Einsatz von aus der US Patentschrift 5,691,141 (Koster, 25. November 1997) bekannten Massen-modifizierten Nukleotiden bereitgestellt werden. Alternativ zu dieser Vorgehensweise können auch sukzessive, ausgehend von der bestimmten oder berechneten Molekülmasse des Primers, die Molekülmassen der aus dem Einbau eines der vier möglichen Nukleotide resultierenden Nukleinsäurefragmente durch Addition der damit verknüpften bekannten Molekülmassenzuwächse (nominal: A: +313 Da, C: +289 Da, T: +304 Da, G: +329 Da) berechnet werden. Die so berechneten vier möglichen Molekülmassen werden dann mit dem tatsächlich bestimmten Wert verglichen. Die Zuordnung, welches Nukleotid eingebaut wurde, erfolgt innerhalb vorgegebener Abweichungstoleranzen, z.B. +/- 4 Da. Ausgehend von der bestimmten oder berechneten Molekülmasse des um ein Nukleotid verlängerten Primers werden dann analog die vier möglichen Molekülmassen der um ein weiteres Nukleotid verlängerten Nukleinsäurefragmente mittels Addition berechnet und mit dem zugehörigen experimentellen Wert verglichen. Die Molekülmassen von Nukleinsäuremolekülen können in einfacher, dem Fachmann bekannter Weise aus den bekannten Atommassen der verschiedenen chemischen Elemente mittels Addition exakt berechnet werden. Diese Rechnung berücksichtigt die chemische Zusammensetzung der Nukleotidmonomere (das heißt die Anzahl der darin enthaltenen Kohlenstoffatome, Sauerstoffatome, Wasserstoffatome und Phosphoratome), die jeweilige Anzahl der verschiedenen enthaltenen Nukleotide (A, C, G und T), die mit jeder Verknüpfung zweier Nukleotide verbundene Stoffbilanz (Austritt eines Wassermoleküls pro Addition eines Nukleotidmonomers), sowie mögliche chemische Modifikationen und Besonderheiten der chemischen Zusammensetzung der endständigen Nukleotide. Je nach Bedarf können für diese Berechnungen die monoisotopischen oder mittleren Atommassen herangezogen werden. Im ersten Fall wird die monoisotopische Molekülmasse berechnet, die zum Vergleich herangezogen wird, wenn es gelingt, die Isotopie der zu analysierenden Nukleinsäuremoleküle aufzutrennen. Das entsprechend nötige hohe instrumentelle Auflösungsvermögen wird von modernen Massenspektrometern bereitgestellt. Figur 3a demonstriert dies an einem Beispiel für einen Satz erfindungsgemäß generierter Nukleinsäurefragmente. In diesem Fall wurden die Molekülmassenzuwächse für die Nukleinsäurefragmente auf <0.1 Da genau bestimmt. Gelingt es nicht im Massenspektrometer, die Isotopie von Nukleinsäuremolekülen aufzutrennen, z.B. weil diese zu groß sind, werden für die Berechnung mittlere Atommassen herangezogen und damit mittlere Molekülmassen berechnet. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt es vorteilhafterweise, Nukleinsäuremoleküle ohne Verwendung von Stopnukleotiden, die zu einer basenspezifischen Terminierung der Elongationsreaktion führen, zu sequenzieren. Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf dem überraschenden Befund, daß Oligonukleotide bei einer Temperatur, die weit über deren Schmelztemperatur liegt, noch hinreichend lange an komplementäre Sequenzen größerer Nukleinsäuremoleküle hybridisieren, um in der Gegenwart einer Polymerase und dNTPs um ein oder mehrere Nukleotide verlängert zu werden, bevor der gebildete Doppelstrang thermisch wieder denaturiert wird. Ohne an eine wissenschaftliche Theorie gebunden wollen zu sein, entstehen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Nukleinsäurefragmente dadurch, daß bei der hohen Annealing- Temperatur die Anlagerung des Primers kurzlebig ist und der Komplex bestehend aus Nukleinsäuremolekül (Template), Primer und Enzym thermisch instabil ist. Infolgedessen zerfallen gebildete Synthesekomplexe nach kurzer Zeit und hinterlassen einen Primer, der nur um ein oder wenige Nukleotid(e) verlängert wurde.
Durch den vollständigen Verzicht auf den Einsatz von Stopnukleotiden müssen Nukleinsäuremoleküle vor der Sequenzierung nicht mehr aufgereinigt werden, um Nukleotidkontaminationen, beispielsweise durch eine vorangegangene PCR- Amplifikation, zu entfernen. Dies vereinfacht und beschleunigt erheblich die Bereitstellung von zu sequenzierenden Nukleinsäuremolekülen, wodurch sich das erfindungsgemäße Verfahren besonders für Hochdurchsatz-Anwendungen für die gleichzeitige Durchführung einer Vielzahl von Sequenzierreaktionen eignet. Zudem erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren eine Automatisierung der Verfahrensschritte, was die Durchführung weiter beschleunigt. Es ist auch vorstellbar, daß erfindungsgemäße Verfahren für "multiplexing" einzusetzen, d.h. für die gleichzeitige Bestimmung unterschiedlicher partieller Nukleotidsequenzen innerhalb eines Nukleinsauremolekuls. In dieser Ausführungsform werden die spezifischen Primer unterschiedlich markiert, so daß die zugehörigen, durch die Elongation der Primer entstehenden Nukleinsäurefragmente beispielsweise über reversible Affinitätsanbindung (Festphasen-Aufreinigung) aufgetrennt werden können. Diese können anschließend getrennt voneinander massenspektrometrisch analysiert werden. Alternativ dazu können Primer eingesetzt werden, deren Molekülmasse durch eine zusätzliche chemische Gruppe (mass tag, z.B. die halbe Masse eines der vier Nukleotiden) so verändert wird, daß für den Einbau eines oder einiger Nukleotide die Sequenzierleitern im Massenspektrum eindeutig aufgetrennt werden können. Solche Techniken bzw. das spezifische "mass tagging" von Nukleinsäuren sind im Stand der Technik bekannt (z.B. P. Ross et al., High level of multiplex genotyping by MALDI-TOF masspectrometry, Nature Biotechnology 16 (1998) 1347, WO 99/29898, oder WO 99/29897).
Im Gegensatz zu bekannten Sequenzierverfahren, die ebenfalls die Analyse von Nukleinsaurefragmenten mittels Massenspektrometrie umfassen, werden durch den Verzicht auf Stopnukleotide Artefakte und Zweideutigkeiten bei der Interpretation der massenspektrometrischen Daten vermieden. Zweideutigkeiten bei herkömmlichen Verfahren können entstehen, da die Molekülmassen von Didesoxyribonukleotiden und Desoxyribonukleotiden teilweise sehr ähnlich bzw. identisch sind und somit unter Umständen ein Molekülmassenzuwachs schwer einem bestimmten Desoxyribonukleotid zugeordnet werden kann (siehe Beispiel 1 und Figur 1).
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonderes für die Sequenzierung von kurzen Nukleinsäure-Abschnitten von bis zu 25 Nukleotiden, vorzugsweise von bis zu 15 Nukleotiden, stärker bevorzugt von bis zu 10 Nukleotiden und am meisten bevorzugt von bis zu 7 bzw. 5 Nukleotiden. Somit ist das erfindungsgemäße Verfahren besonders für den Nachweis von Einzelnukleotid- Polymorphismen (Single nucleotide polymorphisms, SNPs) geeignet. Beispiele 2 und 3 sowie die zugehörigen Figuren 2 und 3 dokumentieren außerdem mögliche Anwendungen und Charakteristika.
Bei dem zu sequenzierenden Nukleinsäuremolekül kann es sich natürlich auch beispielsweise um eine cDNA, einen Vektor, ein Plasmid, ein Cosmid, ein artifizielles Bakterien-Chromosom (engl.: Bacterial Artificial Chromosome, BAC), artifizielles Hefe-Chromosom (engl.: Yeast Artificial Chromosome, YAC) oder natürliche genomische DNA oder in Fragment davon handeln. In der modernen Molekularbiologie und Genomforschung werden routinemäßig durch Klonierungstechniken fremde DNA-Abschnitte, z.B. cDNA Kopien isolierter Boten- RNA (engl.: messenger RNA, mRNA) oder Fragmente genomischer DNA, in Vektoren, Plasmide oder Cosmide eingebaut und anschließend in Gastzellen, z.B. E. coli oder Hefezellen, eingeschleust. Auf diese Weise ist es möglich, umfangreiche Klon-Bibliotheken von cDNA oder genomischer DNA zu generieren und für die Sequenzierung, die Expression kodierter Peptid- oder Proteinsequenzen oder die Detektion komplementärer DNA- oder RNA-Moleküle bereitzustellen. Je nach Länge der fremd eingeführten Nukleinsäure (siehe oben) kann somit durch die Bestimmung der partiellen Nukleotidsequenz beispielsweise eines Vektors die komplette Sequenz der fremd eingeführten Nukleinsäure bestimmt werden. Die erfindungsgemäße Sequenziertechnik gestattet es schnell und effizient, partielle Sequenzinformationen (z.B. endständige partielle Nukleotidsequenzen) der in den verschiedenen Klonen eingebauten DNA- Abschnitte zu generieren. Diese Informationen können dann herangezogen werden, um Klone mittels Sequenzvergleich zu identifizieren oder Aussagen über deren Güte zu machen. Für die Expression der eingebauten Fremd-DNA ist für die folgenden Arbeiten insbesondere von Interesse, ob die kodierende Region im richtigen Leseraster kloniert wurde. Für die Beantwortung dieser Frage sind in den meisten Fällen wenige Nukleotide umfassende Sequenzinformationen bereits ausreichend.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren zwischen Schritt (a) und (b) folgende Schritte: (aa) Hitzedenaturierung des Komplexes bestehend aus Nukleinsäuremolekül und verlängertem Primer; und (ab) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (a) und (aa).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsauremolekuls, umfassend die Schritte: (a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsauremolekuls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden; (b) Hitzedenaturierung der Komplexe bestehend aus Nukleinsäuremolekül und verlängertem Primer und/oder Nukleinsäuremolekül, verlängertem Primer und Polymerase; (c) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (a) und (b); (d) Bestimmung der Molekülmassen von in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsaurefragmenten, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden, mittels Massenspektrometrie; und (e) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung der Molekülmassenzuwächse zwischen den in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsaurefragmenten.
Überraschenderweise konnte im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung gezeigt werden, daß Nukleinsäurefragmente durch unterschiedlich lange Elongation des Primers auch dadurch generiert werden können, daß nach der Hybridisierung des Primers an das zu sequenzierende Nukleinsäuremolekül die Annealing-Temperatur schnell und ohne Unterbrechung so erhöht wird, daß es zu einer Denaturierung der Komplexe bestehend aus Nukleinsäuremolekül und verlängertem Primer und/oder Nukleinsäuremolekül, verlängertem Primer und Polymerase kommt. Vorzugsweise wird die Temperatur auf über 80°C, stärker bevorzugt auf über 90°C und am stärksten bevorzugt auf über 94°C erhöht. Die Annealing-Temperatur und -dauer in Schritt (a) ist in dieser Ausführungsform von untergeordneter Bedeutung. Vorzugsweise liegt die Annealing-Temperatur unter dem Temperaturoptimum der eingesetzten Polymerase, so daß es während Schritt (a) zu einer vernachlässigbaren Elongation des Primers kommt. Je geringer der Temperaturunterschied zwischen Annealing-Temperatur und Temperaturoptimum der verwendeten Polymerase ist, desto kürzer wird die Hybridisierungsdauer gewählt. Vorzugsweise findet eine Hybridisierung für 1 bis 10 Sekunden statt, stärker bevorzugt für 1 bis 5 Sekunden und am stärksten bevorzugt für 1 Sekunde. Der Fachmann kann ohne weiteres für einen gegebenen Primer die optimale Annealing-Temperatur und -dauer ermitteln.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden vor der massenspektrometrischen Analyse die Nukleinsäurefragmente gereinigt/isoliert.
Verfahren zur Aufreinigung und Aufkonzentrierung sind den Fachmann bekannt. Beispielsweise sind verschiedene Festphasen-gestützte Techniken bekannt und auf dem Markt verfügbar und erprobt. Sequenzierprodukte können durch den Einsatz von aus WO 94/11103, EP 0 885 958, US-Patent 5,405,951 und US- Patent 5,705,628 bekannten magnetischen Partikeln und Binde-, Wasch- und Elutionslösungen aufgereinigt und angereichert werden. Geeignete magnetische Partikel, Reagenzien und Protokolle werden auf dem Markt von verschiedenen bekannten Herstellern angeboten (z.B.: Dynal oder PE Biosystems). Weiterhin können Sequenzierungsprodukte durch den Einsatz von der Firma Millipore Corporation, Bedford, MA, USA vertriebenen ZipTips (P10 Pipettierspitzen mit einer kleinen am Ende integrierter Umkehrphasensäule) und den dazugehörigen Aufreinigungsprotokollen sehr schnell und kosteneffizient für die massenspektrometrische Analyse aufgereinigt und aufkonzentriert werden.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Massenspektometrie Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization time-of-flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) oder Electrospray-Ionisations Massenspektrometrie (ESI-MS).
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsauremolekuls, umfassend die Schritte: (a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsauremolekuls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden bei einer Annealing-Temperatur, die zwischen 5°C und 40°C über der theoretischen Schmelztemperatur des Primers liegt, wobei jedes Desoxyribonukleotid mit einem unterschiedlichen Farbstoff markiert ist; (b) elektrophoretische oder chromatographische Auftrennung der
Nukleinsäurefragmente, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden; und (c) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung des/der Farbstoffe(s), mit dem/denen in der Größe aufeinanderfolgende Nukleinsäurefragmente durch Inkorporation der entsprechenden Desoxyribonukleotide markiert wurden.
Elektrophoretische oder chromatographische Verfahren zur Auftrennung von Nukleinsaurefragmenten sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise gelelektrophoretische, kapillarelektrophoretische, lonenaustausch- chromatographische oder Umkehrphasen-chromatographische Verfahren.
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsauremolekuls, umfassend die Schritte: (a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsauremolekuls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden, wobei jedes Desoxyribonukleotid mit einem unterschiedlichen Farbstoff markiert ist; (b) Hitzedenaturierung der Komplexe bestehend aus Nukleinsäuremolekül und verlängertem Primer und/oder Nukleinsäuremolekül, verlängertem Primer und Polymerase; (c) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (a) und (b); (d) elektrophoretische oder chromatographische Auftrennung der Nukleinsäurefragmente, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden; und (e) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung des/der Farbstoffe(s), mit dem/denen in der Größe aufeinanderfolgende Nukleinsäurefragmente durch Inkorporation der entsprechenden Desoxyribonukleotide markiert wurden.
Für die beiden vorangegangenen Ausführungsformen gelten, wie auch für alle anderen Ausführungsformen der Erfindung, die vorstehend genannten Längen der Nukleinsäureabschnitte. Auch werden für die beiden vorangegangenen Ausführungsformen der Erfindung vorzugsweise 1 oder 2 Nukleotide aus der Sequenz identifiziert bzw. deren Reihenfolge festgestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Farbstoffe Fluoreszenz-Farbstoffe, wobei die Fluoreszenz mittels eines Lasers angeregt wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegt die Annealing-Temperatur zwischen 10°C, vorzugsweise 15°C und 20°C, vorzugsweise 30°C über der theoretischen Schmelztemperatur des Primers.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden Schritte (a) und (b) zwischen 2 und 40 mal wiederholt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform werden Schritte (a) und (b) zwischen 5 und 20 mal wiederholt. In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Schritt (b) mittels Mikrowellen oder Infrarotlichtbestrahlung oder in einem Thermo-Cycler durchgeführt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird zwischen Schritt (a) und (b) eine Ultraschallbehandlung durchgeführt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die Polymerase eine thermostabile Polymerase.
Thermostabile Polymerasen sind dem Fachmann bekannt und umfassen beispielsweise die thermostabile Taq-DNA-Polymerase, die aus dem thermophilen Mikroorganismus Thermus aquaticus isoliert wurde. Weitere Beispiele sind die natürlich vorkommenden thermostabilen DNA-Polymerasen Hot Tub™, Pyrostase™, Pfu, Pwo, Tbr, Tfl sowie die gentechnisch hergestellten thermostabilen Polymerasen Tli, Amplitaq®, Thermo Sequenase™, Vent™, Deep Vent™, Tth und UlTma™.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül doppelsträngig und wird vor Schritt (a) denaturiert.
In einer zusätzlichen bevorzugten Ausführungsform ist das Nukleinsäuremolekül
DNA.
Es ist jedoch auch vorstellbar, mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens RNA-
Moleküle zu sequenzieren. Dem Fachmann ist klar, daß abhängig vom dem zu sequenzierenden Nukleinsäuremolekül entweder eine DNA- oder RNA-abhängige
DNA-Polymerase eingesetzt wird.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Primer 10 bis 15 Nukleotide lang.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß zur Sequenzierung von Nukleinsäuremolekülen kurze Primer verwendet werden können. Dies ermöglicht nicht nur sehr stringente Bedingungen bei der Hybridisierung des Primers, wodurch Fehlanlagerungen des Primers ausgeschlossen werden können, sondern reduziert aufgrund der geringeren Synthesekosten darüber hinaus zusätzlich die Kosten, die bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens anfallen. Zudem wirkt sich die geringe Länge der verwendeten Primer positiv auf die massenspektrometrische Analyse aus. Dies begründet sich darin, daß kürzere Oligonukleotide bei der Massenspektrometrie mit höherer Empfindlichkeit und Massenauflösung nachgewiesen werden als längere.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der Primer 10 bis 12 Nukleotide lang.
Die vorstehend zitierten Publikation sind hiermit per Referenz Teil der Beschreibung.
Die Figuren zeigen:
Figur 1: MALDI-TOF Massenspektrum einer Sanger-Sequenzierreaktion (a) und einer erfindungsgemäßen Sequenzierreaktion (b).
Die Spektren der in Beispiel 1 generierten Sequenzreaktionsprodukte wurden im Linearbetrieb eines Bruker Scout MTP Reflex III Massenspektrometers aufgenommen. Der gewählte Ausschnitt zeigt die Signale der generierten ersten vier Leiteroligonuleotide (Primer + 1 ,2,3,4 Nukleotide). Der Einbau der entsprechenden Didesoxy- und Desoxyribonukleotide ist jeweils angezeigt.
Figur 2: MALDI-TOF Massenspektren der mit verschiedenen Werten Tanneai generierten Sequenzierleitern.
Die Spektren der in Beispiel 2 generierten Sequenzierreaktionsprodukte wurden im Linearbetrieb eines Bruker Scout MTP Reflex III Massenspektrometers aufgenommen. Die einzelnen Werte für Tanneai sind in den zugehörigen Teilabbildungen angegeben. Es ist deutlich ersichtlich, wie die Ausbeute der Sequenzierprodukte mit Erhöhung von Tannβai von 41 °C bis zu 63 °C zunimmt. Die erwartete (berechnete) Schmelztemperatur für den verwendeten Primer beträgt 45 °C. Die Zuordnung der aus den bestimmten Massendifferenzen abgeleiteten Nukleotideinbauten ist für die ersten drei Nukleotide in den oberen Teilabbildungen angezeigt. Für das erste Nukleotid resultiert aufgrund der Insertion von G in einem aber nicht dem anderen Sequenzierstrang ein Signalduplett (Einbau von komplementärem C versus A). Für das zweite Nukleotid fallen die Signale aufgrund gleicher resultierender Summenformel zusammen (Einbau von C gefolgt von A versus Einbau von A gefolgt von C). Es resultiert ein Signal aber zwei Massendifferenzen zum vorherigen Duplett, anhand derer der Einbau von A versus C bestimmt wurde. Für das dritte Nukleotid resultiert wieder ein Duplett, Einbau von G versus C, womit die Insertion von G zwei Nukleotide zuvor bestätigt wird. P indiziert das Signal des verwendeten Primers.
Figur 3: MALDI-TOF Massenspektren der in Beispiel 3 für DNA-Templates (a- d) generierten Sequenzierprodukte.
Die Spektren wurden im hochauflösenden Reflektorbetrieb eines Bruker Scout MTP Reflex III Massenspektrometers aufgenommen. Der gewählte Ausschnitt zeigt das Signal des Primers sowie die Signale der generierten ersten vier Leiteroligonuleotide. Die Einschübe in Figur 3a zeigen das zugehörige Signal in X- Richtung stark vergrößert. Die Auflösung der den entsprechenden Oligonukleotiden zugrundeliegenden Isotopie ist darin deutlich zu erkennen. Der den verschiedenen Sequenzierprodukten zugrundeliegende Nukleotideinbau, zugeordnet aufgrund der bestimmten Massendifferenzen, ist angezeigt. Die Zuordnungen Substitution (b), Insertion (c) und Deletion (d) ist offensichtlich. P indiziert das Signal des verwendeten Primers.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1: Sanger versus erfindungsgemäßer Sequenzierreaktion, Ausführung: thermische Denaturierung des aktiven Synthesekomplexes bestehend aus DNA-Template, Primer und DNA-Polymerase.
Die Reaktionstemperatur wird schnell erhöht, so daß der Synthesekomplex bestehend aus DNA-Template, Primer und DNA-Polymerase während der laufenden Verlängerung des Primers thermisch denaturiert wird. Dieser Prozeß ist statistisch verteilt, in Häufigkeit abnehmend mit der Länge der Syntheseprodukte, und resultiert in einer erfindungsgemäßen Sequenzierleiter. Beide Sequenzierreaktionen wurden in 10 μ\ Reaktionsvolumen durchgeführt. Darin enthalten waren jeweils 100 ng DNA Doppelstrang-Template (Sequenzierstrang: 5'-d(ACT GGA AGA CTT TAA CTG ATG TCA CGG TTA GCG AAG GTT GCG AAT GTC AA)-3'), 10 pmol Sequenzierprimer (5'-d(TTG ACA TTC GCA ACC TTC GC)-3'), 1 Einheit Thermosequenase (Amersham, UK), 200 pmol von jedem Nukleosidtriphosphat und 20 mM (NH4)2S04, 2 mM MgCI2, 75 mM Tris- HCI, pH 9.5 (Reaktionspuffer). Im Fall der Sanger-Sequenzierreaktion waren 5% von jedem Nukleosidtriphosphat ddNTP, der Rest dNTP. Im Falle der erfindungsgemäßen Sequenzierreaktion wurden ausschließlich dNTPs eingesetzt. Beide Reaktionsmischungen wurden zwecks Erhöhung der Ausbeute an Sequenzierprodukten 20 Reaktionszyklen unterworfen (zyklisches Sequenzieren). Hierzu wurden die Reaktionsansätze in einem Thermocycler (Eppendorf mastercyler gradient) zunächst für 2 Minuten auf 94 °C erhitzt gefolgt von 20 Temperaturzyklen:
Sanger-Sequenzierreaktion: 54 °C /20 s, 72 °C/30 s, 94 °C/20 s, erfindungsgemäße Sequenzierreaktion: 54 °C/1s, 94 °C/5s. Der Vergleich der in Figur 1 gezeigten Daten zeigt, daß die erfindungsgemäßen Reaktionsprodukte bei Sanger-Sequenzierreaktionen als störende Nebenprodukte anfallen können. Insbesondere der Stop mit dA neben ddA ist für die Detektion von SNPs störend, da die molekularen Massen von dA und ddG identisch sind und somit besagte Nebenreaktion den Austausch von A durch G in einem Allel vortäuschen kann. Diese Problematik wird bei der erfindungsgemäßen Sequenzierreaktion vermieden.
Beispiel 2: Erfindungsgemäße Sequenzierreaktion, Ausführung: Tanneai » Tm
Übersteigt die gewählte Annealing-Temperatur Tanneai signifikant die Schmelztemperatur des Primers Tm, ist dessen Anlagerung und somit auch die Lebensdauer des Synthesekomplexes bestehend aus DNA-Template, Primer und DNA-Polymerase kurzlebig. Als Folge wird der Primer um nur wenige Nukleotide verlängert, bevor die Synthese abbricht. Dieser Prozeß ist statistisch verteilt, in Häufigkeit abnehmend mit der Länge der Syntheseprodukte, und resultiert in einer erfindungsgemäßen Sequenzierleiter.
DNA Doppelstrang-Template: 47/48 bp PCR Produkt. Als Ausgangsmaterial diente humane genomische DNA. Die amplifizierten Regionen (Allele) unterscheiden sich durch Insertion von G an Position 25 des Sequenzierstranges in einem Allel. Für die Sequenzierreaktion wurde ein nur 12 Nukleotide langer Primer gewählt, der sich unmittelbar vor der erwarteten Mutation an den Sequenzierstrang anlagert. Diese Mutation wurde durch die detektierten Sequenzierprodukte eindeutig nachgewiesen (siehe Figur 2). Alle Sequenzierreaktionen wurden in 10 μ\ Reaktionsvolumen durchgeführt. Darin enthalten waren jeweils 50 ng DNA-Template, 4 pmol Sequenzierprimer, 1 Einheit Thermosequenase (Amersham, UK), 200 pmol von jedem Nukleosidtriphosphat und 20 mM (NH4)2S04, 2 mM MgCl2, 75 mM Tris-HCI, pH 9.5 (Reaktionspuffer). Alle Reaktionsmischungen wurden zwecks Erhöhung der Ausbeute an Sequenzierprodukten 20 Reaktionszyklen unterworfen. Hierzu wurden die Reaktionsmischungen zunächst für 2 Minuten in einem Thermocycler (Eppendorf mastercycler gradient) auf 94 °C erhitzt, gefolgt von 20 Temperaturzyklen: Tanneai/1s, 94 °C. Die verwendeten Werte für Tanneai erstreckten sich innerhalb eines gewählten Gradienten von 41 °C bis 80 °C (siehe Figur 2).
Beispiel 3: Einsatz der erfindungsgemäßen Sequenzierreaktion, Ausführung: Tanneai » Tm, zur Detektion von SNPs (Single nukleotide polymorphisms).
Zum Nachweis von SNPs ist es günstig mit kurzen Primern zu arbeiten, da die damit verbundenen geringeren Molekulargewichte der Sequenzierprodukte deren Detektion durch MALDI-MS mehrfach positiv beeinflussen. Zum einen werden kleinere DNA Moleküle empfindlicher nachgewiesen als größere (höhere Nachweisempfindlichkeit), zum anderen werden kleinere DNA Moleküle besser aufgelöst als größere. Eine hohe Signalauflösung ist insbesondere dann wichtig, wenn DNA Proben heterozygoter Individuen analysiert werden. Im extremsten Fall gilt es, den Austausch von Adenin durch Thymin oder vice versa in einem Allel aber nicht dem anderen, aufzulösen. Von allen möglichen aus dem Austausch einer Nukleobase resultierenden Massendifferenzen, ist die mit diesem Austausch verbundene die geringste (A/T: 9Da, C/T: 15 Da, A/G 16 Da, C/A: 24 Da, C/G: 40 Da, T/G: 25 Da). Die Genauigkeit der Massendifferenzbestimmung wird durch kürzere Primer, sofern der Abstand zwischen Primer und SNP-Position gleich bleibt, ebenfalls günstig beeinflußt. Oligonukleotide < 20 Nukleotide können mit akzeptablen Empfindlichkeitseinbußen im hochauflösenden Reflektormodus von MALDI-Flugzeitmassenspektrometern analysiert werden. In diesem Betriebsmodus ist es möglich, die Isotopie der Analytmoleküle aufzulösen und Molekulargewichtsdifferenzen auf 0.01-0.1 Da genau zu bestimmen (siehe Figur 3a). Die Leistungsfähigkeit der erfindungsgemäßen Sequenzierreaktion für den Nachweis von SNPs wurde an verschiedenen Systemen erfolgreich erprobt und evaluiert. Es wurden unter anderem in einem 50 Basenpaare langen DNA- Template alle für eine Position möglichen SNPs realisiert. Diese Templates wurden einzeln als auch als Zweikomponenten-Mischungen (Heterozygote) simultan sequenzanalysiert. Hierzu wurde ein nur 12 Nukleotide langer Primer eingesetzt. Das 3'-Ende des Primers wurde mit Absicht 2 Nukleotide vor den SNP plaziert, um so die Vorteile der erfindungsgemäßen Sequenzierreaktion gegenüber der bekannten primer extension reaction (PER) zu demonstrieren. Diese umfassen erhöhte Flexibilität bei der Primerwahl (kann im Gegensatz zur PER mehrere Nukleotide stromabwärts plaziert werden) und die Generierung von Sequenzinformation (mehr als ein Nukleotid) die die richtige Anlagerung des Primers verifiziert und Deletions- und Insertionsmutationen von der Substitution eines Nukleotids eindeutig unterscheidet. Figur 3 demonstriert dies anhand einer Auswahl, alle bezogen auf den schwierigeren heterozygoten Fall. Beide Sequenzierreaktionen wurden in 10 μ\ Reaktionsvolumen durchgeführt. Darin enthalten waren jeweils 100 ng DNA Doppelstrang-Template, 4 pmol Sequenzierprimer (5'-d(CGC AAC CTT CGC)-3'), 1 Einheit Thermosequenase (Amersham, UK), 200 pmol von jedem Desoxyribonukleosidtriphosphat (dNTP) und 20 mM (NH4)2S04, 2 mM MgCI2, 75 mM Tris-HCI, pH 9.5 (Reaktionspuffer). Beide Reaktionsmischungen wurden zwecks Erhöhung der Ausbeute an Sequenzierprodukten 20 Reaktionszyklen unterworfen. Hierzu wurden die Reaktionsansätze in einem Thermocycler (Eppendorf mastercyler gradient) zunächst für 2 Minuten auf 94 °C erhitzt gefolgt von 20 Temperaturzyklen: 56 °C/1s, 94 °C/5s.
Verwendete Templates (gezeigt sind die Sequenzierstränge; die entsprechenden Nukleotide, die mit dem Primer einen Doppelstrang ausbilden, sind unterstrichen):
(a) 100% 5'-d(ACT GGA AGA CTT TAA CTG ATG TCA CGG TTA GCG AAG GTT GCG AAT GTC AA)-3'
(b) 50% 5'-d(ACT GGA AGA CTT TAA CTG ATG TCA CGG TTA GCG AAG GTT GCG AAT GTC AA)-3'50% 5'-d(ACT GGA AGA CTT TAA CTG ATG TCA CGG TAA GCG AAG GTT GCG AAT GTC AA)-3' (Substitution von T durch A an der Position 29, fett gedruckt)
(c) 50% 5'-d(ACT GGA AGA CTT TAA CTG ATG TCA CGG TTA GCG AAG GTT GCG AAT GTC AA)-3'50% 5'-d(ACT GGA AGA CTT TAA C TG ATG TCA CGG TTC AGC GAA GGT TGC GAA TGT CAA)-3' (Insertion von C zwischen Position 29 und 30)
(d) 50% 5'-d(ACT GGA AGA CTT TAA CTG ATG TCA CGG TTA GCG AAG GTT GCG AAT GTC AA)-3'50% 5'-d(ACT GGA AGA CTT TAA C TG ATG TCA CGG TAG CGA AGG TTG CGA ATG TCA A)-3* (Deletion von T 29)

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsauremolekuls, umfassend die Schritte:
(a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsauremolekuls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden bei einer Annealing-Temperatur, die zwischen 5°C und 40°C über der theoretischen Schmelztemperatur des Primers liegt;
(b) Bestimmung der Molekülmassen von in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsaurefragmenten, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden, mittels Massenspektrometrie; und
(c) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung der Molekülmassenzuwächse zwischen den in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsaurefragmenten.
2. Verfahren nach Anspruch 1, das zwischen Schritt (a) und (b) folgende Schritte umfaßt:
(aa) Hitzedenaturierung des Komplexes bestehend aus Nukleinsäuremolekül und verlängertem Primer; und
(ab) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (a) und (aa).
3. Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsauremolekuls, umfassend die Schritte:
(a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsauremolekuls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden; (b) Hitzedenaturierung der Komplexe bestehend aus Nukleinsäuremolekül und verlängertem Primer und/oder Nukleinsäuremolekül, verlängertem Primer und Polymerase;
(c) gegebenenfalls ein oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (a) und (b);
(d) Bestimmung der Molekülmassen von in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsaurefragmenten, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden, mittels Massenspektrometrie; und
(e) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung der Molekülmassenzuwächse zwischen den in der Größe aufeinanderfolgenden Nukleinsaurefragmenten.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei vor der massenspektrometrischen Analyse die Nukleinsäurefragmente gereinigt/isoliert werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Massenspektometrie Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization time-of- flight Massenspektrometrie (MALDI-TOF-MS) oder Electrospray-Ionisations Massenspektrometrie (ESI-MS) ist.
6. Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleins uremolekuls, umfassend die Schritte:
(a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsauremolekuls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden bei einer Annealing-Temperatur, die zwischen 5°C und 40°C über der theoretischen Schmelztemperatur des Primers liegt, wobei jedes Desoxyribonukleotid mit einem unterschiedlichen Farbstoff markiert ist; (b) elektrophoretische oder chromatographische Auftrennung der Nukleinsäurefragmente, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden; und
(c) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung des/der Farbstoffe(s), mit dem/denen in der Größe aufeinanderfolgende Nukleinsäurefragmente durch Inkorporation der entsprechenden Desoxyribonukleotide markiert wurden.
7. Verfahren zur Bestimmung einer partiellen Nukleotidsequenz eines Nukleinsauremolekuls, umfassend die Schritte:
(a) Inkubation eines Primers, der an das Nukleinsäuremolekül hybridisiert, mit multiplen Kopien des Nukleinsauremolekuls in Gegenwart einer Polymerase und einem Gemisch von Desoxyribonukleotiden, wobei jedes Desoxyribonukleotid mit einem unterschiedlichen Farbstoff markiert ist;
(b) Hitzedenaturierung der Komplexe bestehend aus Nukleinsäuremolekül und verlängertem Primer und/oder Nukleinsäuremolekül, verlängertem Primer und Polymerase;
(c) gegebenenfalls ein- oder mehrmalige Wiederholung der Schritte (a) und (b);
(d) elektrophoretische oder chromatographische Auftrennung der Nukleinsäurefragmente, die durch Elongation des Primers in Schritt (a) generiert wurden; und
(e) Bestimmung der Nukleotidsequenz durch Bestimmung des/der Farbstoffe(s), mit dem/denen in der Größe aufeinanderfolgende Nukleinsäurefragmente durch Inkorporation der entsprechenden Desoxyribonukleotide markiert wurden.
8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Farbstoffe Fluoreszenz- Farbstoffe sind und die Fluoreszenz mittels eines Lasers angeregt wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 , 2, 4, 5, 6 oder 8, wobei die Annealing-Temperatur zwischen 15°C und 30°C über der theoretischen Schmelztemperatur des Primers liegt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 3, 4, 5, 7 oder 8, wobei Schritte (a) und (b) zwischen 2 und 40 mal wiederholt werden.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei Schritte (a) und (b) zwischen 5 und 20 mal wiederholt werden.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 3, 4, 5, 7, 8, 10 oder 11 , wobei Schritt (b) mittels Mikrowellen oder Infrarotlichtbestrahlung oder in einem Thermo- Cycler durchgeführt wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 3, 4, 5, 7, 8 oder 10 bis 12, wobei zwischen Schritt (a) und (b) eine Ultraschallbehandlung durchgeführt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Polymerase eine thermostabile Polymerase ist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Nukleinsäuremolekül doppelsträngig ist und vor Schritt (a) denaturiert wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das Nukleinsäuremolekül DNA ist.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der Primer 10 bis 15 Nukleotide lang ist.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Primer 10 bis 12 Nukleotide lang ist.
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