EP1336108A2 - Verfahren zur quantitativen bestimmung der vorhandenen bindungskapazität in einer wässrigen proteinlösung - Google Patents

Verfahren zur quantitativen bestimmung der vorhandenen bindungskapazität in einer wässrigen proteinlösung

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EP1336108A2
EP1336108A2 EP01974024A EP01974024A EP1336108A2 EP 1336108 A2 EP1336108 A2 EP 1336108A2 EP 01974024 A EP01974024 A EP 01974024A EP 01974024 A EP01974024 A EP 01974024A EP 1336108 A2 EP1336108 A2 EP 1336108A2
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EP
European Patent Office
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protein
albumin
test protein
binding capacity
solutions
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EP01974024A
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Inventor
Eberhard Munzert
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Gambro Lundia AB
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Teraklin AG
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • Human serum albumin is the most important plasma protein in the human organism, not least because of its amount of more than 50% of the plasma proteins. In addition to maintaining the colloid osmotic pressure, it has a transport function that is at the forefront of the physiological tasks of this protein. Many endogenous metabolic products as well as exogenously supplied lipophilic substances, such as drugs, which due to their physicochemical properties are only slightly or not at all dissolved in the plasma, are bound to the serum albumin and transported by it and distributed in the body. Substances such as hormones that have specific transport proteins in the blood are also transported in an albumine-bound manner when these specific transport proteins are overloaded.
  • a restricted excretion or elimination function (e.g. in liver failure) can thus affect the protein binding of unbound portions of certain substances or medicines, which in turn can lead to a changed drug effect or influence on physiological control loops.
  • the object underlying the invention was therefore to be able to determine the free binding capacity of a protein, in particular of albumin, quantitatively or semi-quantitatively, it being particularly desirable to obtain a determination method which can be carried out as simply and quickly as possible using series tests ,
  • L3 LM + B + C L4 LM + C L5 LM + B L6 LM in which A is the test protein, C is a reference protein, B is a marker substance which can bind to at least one specific binding site of the test protein (A) and the reference protein (C), and LM is a solvent for A, B and C and where A and C are each present in the same amount in solutions L1 to L4,
  • test protein or reference protein can be a single protein or a protein mixture.
  • the test protein is preferably an albumin, in particular human serum albumin.
  • the reference protein or protein mixture can match the test protein or protein mixture and differ only in the loading state.
  • the reference protein can also be a protein or protein mixture that is different from the test protein, provided that the marker substance (B) specifically used for the test protein can also bind to the reference protein.
  • the amount of the test protein (A) is usually determined by determining the concentration of the test protein in the test solution, such as human serum albumin in the serum.
  • concentration of the test protein in the test solution such as human serum albumin in the serum.
  • a test sample with a known concentration of the test protein can also be used, in particular when pre-selection experiments are carried out which do not require particular accuracy.
  • human serum contains 35 to 55 grams per liter of albumin, so that in overview series experiments, the upper limit of 55 grams per liter of human serum albumin is assumed as the defined amount of the test protein and a corresponding amount of approximately in the solution of the reference protein 55 grams per liter.
  • Human serum albumin is known to have multiple binding sites, the most important of which are referred to as BSI and BSII. These binding sites selectively bind special substances. For example, warfarin, furosemide or dansylamide binds to BS I, while indoles such as trypotophan or diazepam, bile acids, dansyl sarcosine and medium-chain fatty acids bind to BS II.
  • a marker substance (B) which can bind to at least one specific binding site of the test protein and of the reference protein should be added to the aqueous protein solution of the test protein and of the reference protein.
  • the marker substance can also be a mixture of substances.
  • the marker substance will bind to a binding site of the protein, such as the albumin.
  • certain marker substances bind to several binding sites simultaneously and saturate these binding sites.
  • the marker substance (B) is expediently added only in an amount such that all binding sites specific for this marker substance are saturated. That is, if a protein is used which has a specific binding site for exactly one molecule of a specific marker substance, a maximum of 1 mol of the marker substance is added per mole of the protein. Needless to say, in series tests, a corresponding amount of marker substance is added in all of these tests, so that the series tests can be compared with one another and are reproducible.
  • the molar ratio of B: A and B: C is preferably set to 0.5 to 2.
  • a marker substance which binds to several binding sites on the protein, more than 1 mol of marker substance may be added accordingly per mol of the protein. However, if the test protein and / or reference protein is known to be partially loaded at its specific binding site, the molar amount of the marker substance added can be reduced accordingly, for example to 0.5 mol marker substance per mol of the protein.
  • solutions L1 to L6 at a pH of 6-8, preferably from 7.2 to 7.6, which is achieved by using an appropriate buffer in the aqueous solution of the protein.
  • the reference protein (C) used can expediently consist of high-purity albumin or of reference plasma (for example from lyophilisate).
  • the binding of BCP bromocresol purple; 5,5'-dibromo-o-cresolsulfonphthalein
  • albumin results in a typical, photometrically detectable shift in the absorption maximum from 589 nm to 598 nm or a reduction in the adsorption at 589 nm.
  • BCP bromocresol purple; 5,5'-dibromo-o-cresolsulfonphthalein
  • the extinction at 589 nm + 5 nm can therefore be determined photometrically in all six solutions L1 to L6. An extinction value is then obtained as an output signal for each of the solutions.
  • the test protein ie the solutions L1 and L2
  • concentrations of displacer for example indole-3-propionic acid in the range from 0 ⁇ mol / l to 80 ⁇ mol / l, based on the total sample mix.
  • the displacer is a substance competing for the binding site, which is referred to here as “D”.
  • the six solutions then have the following compositions: L1 LM + A + B + D L2 LM + A + D
  • Both binding sites of human serum albumin are important in pharmacology, since the binding of drugs to the albumin molecule strongly influences the effectiveness (depot effect) of the drug.
  • the method according to the invention can also be of interest to veterinary medicine in monitoring the binding capacity during drug treatment, since BCP also binds to bovine serum albumin (BSA).
  • BSA bovine serum albumin
  • the albumin concentration of a given solution is determined.
  • the albumin solution is diluted with phosphate-buffered saline (PBS) pH 7.4 to a concentration of 75 ⁇ mol albumin.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • 100 ⁇ l of each are placed in a column (8 wells) of a microtiter plate (six measured values plus two control values).
  • 100 ⁇ l of 75 ⁇ mol BCP / I, pH 7.4 (control values only buffer) are added to each well, then 100 ⁇ l buffer (or a substance to be tested for albumin binding) is added to each well.
  • the optical density of the solution is measured at a wavelength close to the absorption maximum of BCP at pH 7.4 (589 nm ⁇ 1 nm).
  • 100 ⁇ l buffer (minimum value 0%) and 100 ⁇ l high-purity reference albumin in the same concentration as the sample (maximum value 100%) can be used as reference values.
  • the values obtained are referred to here from the output signal and inserted into the above equation, which gives the binding capacity of the test album.

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Abstract

Bei einem Verfahren zur quantitativen oder halbquantitativen Bestimmung der freien Bindungskapazität in einer wässrigen Testprotein-Lösung werden a) sechs Lösungen (L1 bis L6) von der folgenden Zusammensetzung bereitet: L1 LM + A + B, L2 LM + A, L3 LM + B + C, L4 LM + C, L5 LM + B, L6 LM, worin A das Testprotein, C ein Referenzprotein, B eine Markersubstanz, welche an wenigstens einer bestimmten Bindungsstelle des Testproteins (A) und des Referenzproteins (C) binden kann, und LM ein Lösungsmittel für A, B und C bedeutet und wobei A und C in den Lösungen L1 bis L4 jeweils in gleicher Menge enthalten sind, b) für jede Lösung L1 bis L6 eine bestimmte physikalische Eigenschaft bestimmt und als Ausgangssignal S>L1< bis S>L6< erfasst und c) die Bindungskapazität (K) des Testproteins nach der Formel (I) bestimmt.

Description

Verfahren zur quantitativen Bestimmung der vorhandenen Bindungskapazität in einer wäßrigen Proteinlösung
In verschiedenen Fällen ist es erwünscht, Aussagen über die vorhandenen freien Bindungsstellen und/oder die vorhandene Bindungskapazität von Proteinen oder Proteingemischen treffen zu können. Beispielsweise kommt es im Leberversagen aufgrund einer eingeschränkten exkretorischen und/oder metabolischen hepatischen Funktion zu einer Akkumulation albumingebundener Substanzen im Blut, welches zu einer Überladung des Albuminmoleküls führen kann.
Humanes Serumalbumin (HSA)ist nicht zuletzt aufgrund seiner Menge von mehr als 50% der Plasmaproteine das bedeutsamste Plasmaprotein im menschlichen Organismus. Neben der Aufrechterhaltung des kolloidosmotischen Druckes übt es vor allem eine Transportfunktion aus, die bei diesem Protein im Vordergrund der physiologischen Aufgaben steht. Viele endogene Stoffwechselprodukte sowie exogen zugeführte lipophiie Substanzen, wie Medikamente, die aufgrund ihrer physikochemi- schen Eigenschaften nur gering oder gar nicht im Plasma gelöst vorliegen, werden an das Serumalbumin gebunden und von ihm transportiert und im Körper verteilt. Auch Substanzen, wie zum Beispiel Hormone, die spezifische Transportproteine im Blut besitzen, werden bei Überladung dieser spezifischen Transportproteine albumingebunden transportiert.
Verschiedene Untersuchungen befassen sich mit der Bindungsstärke und dem Bindungsort bestimmter Einzelsubstanzen, sowie mit der Beeinflussung einzelner definierter Liganden untereinander. Diese Untersuchungen zielen jedoch nicht auf Aussagen über den bindungsstellenspezifischen Beladungszustand bzw. die daraus resultierende freie Bindungskapazität des Proteins ab. Da jedoch die überwiegende Mehrheit albumingebundener endogener Liganden und exogen zugefügter Substanzen, wie Medikamenten, an den Bindungsstellen (BS) I und II des humanen Serumalbumis bindet, kann es bei einer eingeschränkten Ausscheidungs- bzw. Eliminationsfunktion dieser Substanzen (z.B. im Leberversagen) zu deren Akkumulation und einer Beeinflussung bzw. Verdrängung ' bzgl. der Bindung an HSA kommen. Diese Beeinflussung oder Verdrängung kann kompetitiver (bzgl. derselben spezifischen Bindungsstellen) oder allosterischer (durch Konformationsänderung an verschiedenen Bindungsstellen) Natur sein.
Eine eingeschränkte Ausscheidungs- bzw. Eliminationsfunktion (z.B. im Leberversagen) kann also die Proteinbindung ungebundener Anteile bestimmter Substanzen oder Madikamente beeinflussen, was wiederum zu einer veränderten Medikamentenwirkung bzw. Beeinflussung physiologischer Regelkreise führen kann.
Eine Kenntnis der noch vorhandenen bindungsstellenspezifischen Bindungskapazität bzw. der schon erfolgten Beladung dieser Bindungsstelle könnte somit Aussagen über mögliche Veränderun- gen der physiologischen und/oder toxischen Wirkung von Medikamenten ermöglichen bzw. diese Veränderung erklären.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand somit darin, die freie Bindungskapazität eines Proteins, insbesondere von Albumin, quantitativ bzw. halbquantitativ bestimmen zu können, wobei es insbesondere erwünscht ist, eine Bestimmungsmethode zu erhalten, die möglichst einfach und schnell anhand von Reihenversuchen durchgeführt werden kann.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einem Verfahren zur quantitativen oder halbquantitativen Bestimmung der freien Bindungskapazität in einer wäßrigen Testprotein-Lösung gelöst, bei dem man
a) sechs Lösungen (L1 bis L6) von der folgenden Zusammensetzung bereitet L1 LM + A + B L2 LM + A
L3 LM + B + C L4 LM + C L5 LM + B L6 LM, worin A das Testprotein, C ein Referenzprotein, B eine Markersubstanz, welche an wenigstens einer bestimmten Bindungsstelle des Testproteins (A) und des Referenzproteins (C) binden kann, und LM ein Lösungsmittel für A, B und C bedeutet und wobei A und C in den Lösungen L1 bis L4 jeweils in gleicher Menge enthalten sind,
b) für jede Lösung L1 bis L6 eine bestimmte physikalische Eigenschaft bestimmt und als Ausgangssignal Su bis Sι_6 erfaßt und
c) die Bindungskapazität (K) des Testproteins nach der Formel
K = ^ ~ SL2) χ l 00o/o
(S 3 ~ ^ 4) ~ (# 5 ~ SL6)
bestimmt. Bevorzugt handelt es sich um ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der freien bzw. noch verfügbaren für Bindungsstellen I bzw. II spezifischen Bindungskapazitäten des Albuminmoleküls ohne vorherige qualitative oder quantitative Analyse der bereits an die Bindungsstellen gebundenen und diese so besetzenden Liganden bzw. ohne vorherige qualitative oder quantitative Analyse von Liganden, die eine allosterische Beeinflussung der Bindungskapazität bewirken könnten, in einer wäßrigen Testproteinlösung mit den vorgenannten Stufen a) bis c). Wenn in diesem Zusammenhang von einem Testprotein oder Referenzprotein die Rede ist, so kann es sich dabei um ein einzelnes Protein oder ein Proteingemisch handeln. Bevorzugt ist das Testprotein ein Albumin, insbesondere humanes Serumalbumin.
Das Referenzprotein oder Referenzproteingemisch kann mit dem Testprotein oder Testproteingemisch übereinstimmen und sich lediglich durch den Beladungszustand unterscheiden. Es kann sich aber bei dem Referenzprotein auch um ein von dem Testprotein unterschiedliches Protein oder Proteingemisch handeln, soweit die für das Testprotein spezifisch eingesetzte Markersubstanz (B) auch an das Referenzprotein binden kann.
Die Menge des Testproteins (A) wird gewöhnlich durch Ermittlung der Konzentration des Testproteins in der Testlösung, wie beispielsweise von humanem Serumalbumin im Serum ermittelt. Es kann aber auch eine Testprobe mit bekannter Konzentration des Testproteins verwendet werden, insbe- sondere dann, wenn Vorauswahl- Versuche gemacht werden, bei denen es nicht auf besondere Genauigkeit ankommt. Beispielsweise ist bekannt, daß menschliches Serum 35 bis 55 Gramm je Liter Albumin enthält, so daß man bei Überblick-Reihenversuchen als definierte Menge des Testproteins die Obergrenze von 55 Gramm pro Liter des humanen Serumalbumins annimmt und in der Lösung des Referenzproteins eine entsprechende Menge von etwa 55 Gramm je Liter einsetzt.
Es ist bekannt, daß humanes Serumalbumin mehrere Bindungsstellen aufweist, von denen die wichtigsten als BSI und BSII bezeichnet werden. Diese Bindungsstellen binden selektiv spezielle Substanzen. Beispielsweise bindet Warfarin, Furosemid oder Dansylamid an BS I, wogegen Indole, wie Trypotophan oder auch Diazepam, Gallensäuren, Dansylsarcosin und mittelkettige Fettsäuren an BS II binden.
Gemäß den obigen Ausführungen soll der wäßrigen Proteinlösung des Testproteins wie des Referenzproteins eine Markersubstanz (B) zugesetzt werden, die an wenigstens einer bestimmten Bindungsstelle des Testproteins und des Referenzproteins binden kann. Die Markersubstand kann auch ein Substanzgemisch sein. Im Regelfall wird die Markersubstanz an eine Bindungsstelle des Proteins, wie des Albumins, binden. Es ist aber nicht auszuschließen, daß bestimmte Markersubstanzen gleichzeitig an mehreren Bindungsstellen binden und diese Bindungsstellen absättigen.
Die Markersubstanz (B) wird zweckmäßig nur in solcher Menge zugegeben, daß alle für diese Mar- kersubstanz spezifischen Bindungsstellen abgesättigt werden. D.h., wenn ein Protein verwendet wird, das eine spezifische Bindungsstelle für genau ein Molekül einer speziellen Markersubstanz aufweist, wird je Mol des Proteins maximal 1 Mol der Markersubstanz zugegeben. Es braucht nicht erwähnt zu werden, daß bei Reihenversuchen in allen diesen Versuchen eine übereinstimmende Menge an Markersubstanz zugegeben wird, damit die Reihenversuche untereinander vergleichbar und reproduzierbar sind. Vorzugsweise wird das Molverhältnis von B:A und von B:C auf 0,5 bis 2 eingestellt.
Wenn eine Markersubstanz benutzt wird, die auf dem Protein an mehrere Bindungsstellen bindet, wird gegebenenfalls entsprechend mehr als 1 Mol Markersubstanz je Mol des Proteins zugegeben. Wenn jedoch das Testprotein und/oder Referenzprotein bekanntermaßen an seiner spezifischen Bindungsstelle teilweise beladen ist, kann man die molare Menge der zugegebenen Markersubstanz entsprechend vermindern, beispielsweise auf 0,5 Mol Markersubstanz je Mol des Proteins.
Zweckmäßig ist es, eine Markersubstanz zu benutzen, deren Bindungskonstante etwa der Bindungskonstante der zu erwartenden Liganden des Testproteins entspricht, da bei einer zu hohen Bindungskonstante der Markersubstanz infolge der Reversibilität der Bindungsvorgänge ein Austausch der Liganden gegen Markersubstanz erfolgen würde, so daß das Ergebnis bezüglich der freien Bindungsstellen verfälscht würde.
Zweckmäßig ist es, in den Lösungen L1 bis L6 bei einem pH-Wert von 6 - 8, vorzugsweise von 7,2 bis 7,6 zu arbeiten, was durch Verwendung eines entsprechenden Puffers in der wäßrigen Lösung des Proteins erreicht wird.
Das verwendete Referenzprotein (C) kann zweckmäßig aus hochreinem Albumin oder aus Referenzplasma (zum Beispiel aus Lyophilisat) bestehen.
Entsprechend den obigen Ausführungen wird für jede der Lösungen L1 bis L6 eine bestimmte physikalische Eigenschaft ermittelt und als Ausgangssignal Sι_ι bis S 6 erfaßt.
Beispielsweise ergibt die Bindung von BCP (Bromkresolpurpur; 5,5'-Dibrom-o-kresolsulfonphthalein) an Albumin eine typische, photometrisch erfaßbare Verschiebung des Absorptionsmaximums von 589 nm auf 598 nm bzw. eine Verminderung der Adsorption bei 589 nm. Bei Verwendung von BCP als Markersubstanz kann somit zweckmäßig in allen sechs Lösungen L1 bis L6 photometrisch die Extinktion bei 589 nm + 5 nm bestimmt werden. Für jede der Lösungen bekommt man dann einen Extinktionswert als Ausgangssignal. Diese Extinktionswerte werden dann in die oben angegebene Gleichung eingesetzt, was die Bindungskapazität K ergibt.
Um Ungenauigkeiten bei der Albuminquantifizierung zu kompensieren ist es möglich, dem Testpro- tein, d.h. den Lösungen L1 und L2, korrelierende Konzentrationen an Verdränger (zum Beispiel In- dol-3-propionsäure im Bereich von 0 μMol/l bis 80 μMol/l, bezogen auf den Gesamtprobenansatz) zuzugeben. Der Verdränger ist eine um die Bindungsstelle konkurrierende Substanz, die hier mit „D" bezeichnet wird. Die sechs Lösungen erhalten dann folgende Zusammensetzungen: L1 LM + A + B + D L2 LM + A + D
L3 LM + B + C
L4 LM + C
L5 LM + B
L6 LM.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können einfach und schnell klinische Reihenmessungen durchgeführt werden, die deutliche Unterschiede in der Albumin-Bindungskapazität von gesunden Probanden und beispielsweise Patienten mit Leberversagen ergeben.
Beide Bindungsstellen des humanen Serumalbumins sind in der Pharmakologie von Bedeutung, da die Bindung von Medikamenten an das Albuminmolekül die Wirksamkeit (Depotwirkung) des Medikaments stark beeinflußt. Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch für- die Tiermedizin bei der Überwachung der Bindungskapazität während medikamentöser Behandlung interessant werden, da BCP auch an Rinderserumalbumin (BSA) bindet.
Beispiel
Nachfolgend wird beispielhalber die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens für die Analytik mittels Mikrotiterplatten mit einem Napf-Volumen von 300 μl beschrieben.
Die Albuminkonzentration einer vorgegebenen Lösung wird bestimmt. Die Albuminlösung wird mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) pH 7,4 auf eine Konzentration von 75 μMol Albumin l\ verdünnt. Jeweils 100 μl hiervon werden in eine Spalte (8 Näpfe) einer Mikrotiterplatte gegeben (sechs Meßwerte plus zwei Kontrollwerte). Jedem Napf werden 100 μl 75 μMol BCP/I, pH 7,4 (Kontrollwerte nur Puffer) zugesetzt, anschließend kommen in jeden Napf 100 μl Puffer (oder eine auf ihre Albuminbindung zu untersuchende Substanz). Die optische Dichte der Lösung wird bei einer Wellenlänge nahe dem Absorptionsmaximum von BCP bei pH 7,4 (589 nm ± 1 nm) gemessen. Als Referenzwerte können 100 μl Puffer (Minimalwert 0%) und 100 μl hochreines Referenzalbumin in der gleichen Konzentration wie die Probe (Maximalwert 100%) verwendet werden. Die erhaltenen Werte werden hier aus Ausgangssignal bezeichnet und in die obige Gleichung eingesetzt, was die Bindungskapazität des Testalbumins ergibt.
Bei Patienten mit Leberversagen korreüert der Grad der Reduktion der Albuminbindungskapazität mit der Ausprägung der Leberschädigung. In einer kontrollierten klinischen Studie konnte gezeigt werden, daß eine Verbesserung der Leberfunktion auch mit einer Verbesserung der anfangs eingeschränkten Albuminbindungskapazität einherging. Weiterhin konnte die eingeschränkte Albuminbindungskapazität bei Patienten im Leberversagen durch die selektive extrakorporale Elimination albumingebundener Substanzen durch Albumindialyse signifikant verbessert werden.
Bei Untersuchungen zum Bindungsverhalten eines spezifischen Liganden zeigten sich überraschenderweise deutliche Unterschiede zwischen unterschiedlichen kommerziellen Albuminprepera- tionen sowie zwischen Plasmaproben von gesunden Spendern und Patienten mit einer schweren Leberinsuffizienz, welche auf eine unterschiedliche Beladung der spezifischen Bindungsstelle zurück zu führen war.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur quantitativen Bestimmung der freien Bindungskapazität in einer wäßrigen Testproteinlösung, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) sechs Lösungen (L1 bis L6) von der folgenden Zusammensetzung bereitet:
L1 LM + A + B
L2 LM + A L3 LM + B + C
L4 LM + C
L5 LM + B
L6 LM,
worin A das Testprotein, C ein Referenzprotein, B eine Markersubstanz, welche an wenigstens einer bestimmten Bindungsstelle des Testproteins (A) und des Referenzproteins (C) binden kann, und LM ein Lösungsmittel für A, B und C bedeutet und wobei A und C in den Lösungen L1 bis L4 jeweils in gleicher Menge enthalten sind,
b) für jede Lösung L1 bis L6 eine bestimmte physikalische Eigenschaft bestimmt und als Ausgangssignal Su bis Sι_6 erfaßt und
c) die Bindungskapazität (K) des Testproteins nach der Formel
bestimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß man als Testprotein (A) ein Albumin, vorzugsweise humanes Serumalbumin oder Serumproteine anderer Spezies, zum Beispiel Rinderserumalbumin, verwendet.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH- Wert der Lösungen L1 bis L6 mit Puffer auf 6 bis 8, vorzugsweise 7,2 bis 7,6 einstellt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Markersubstanz BCP (5,5'-Dibrom-o-kresosulfonphthalein) verwendet und das Signals photometrisch bei 589 nm +5 nm erfaßt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Vergleichsproteinlösung aus einem hochreinen Albumin oder aus Referenzplasma, zum Beispiel Ly- ophilisat, besteht.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das Mol- Verhältnis von A:B und von C:B auf 0,5 bis 2 einstellt.
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