EP1317281A1 - Utilisation de lipopeptides pour l'immunotherapie des sujets vih+ - Google Patents

Utilisation de lipopeptides pour l'immunotherapie des sujets vih+

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EP1317281A1
EP1317281A1 EP01967441A EP01967441A EP1317281A1 EP 1317281 A1 EP1317281 A1 EP 1317281A1 EP 01967441 A EP01967441 A EP 01967441A EP 01967441 A EP01967441 A EP 01967441A EP 1317281 A1 EP1317281 A1 EP 1317281A1
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EP
European Patent Office
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hiv
lipopeptides
present
viral
chain
Prior art date
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Ceased
Application number
EP01967441A
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German (de)
English (en)
Inventor
Pierre Caudrelier
Rapha[Lle El Habib
Michel Klein
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sanofi Pasteur SA
Sanofi Vaccines US Inc
Original Assignee
Aventis Pasteur SA
Aventis Pasteur Inc
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Publication date
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Priority claimed from FR0102846A external-priority patent/FR2821556B1/fr
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    • C12N2740/16334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Definitions

  • the present invention describes a method of treating subjects infected with HIV and relates more particularly to the use of lipopeptides in immunotherapy in subjects HIV + under anti-retroviral therapy.
  • HIV envelope glycoprotein the poxviruses expressing epitopes derived from HIV structural or regulatory proteins as well as lipopeptides.
  • lipopeptides comprising a peptide part having between 10 and 40 amino acids approximately and comprising at least one antigenic determinant, said lipopeptide also comprising one or more chains derived from fatty acids comprising from 10 to 20 carbon atoms, and / or one or more steroid groups modified and coupled to ⁇ f ⁇ IH2 or ⁇ NH2 functions of said amino acids. Based on an experiment carried out in mice, the authors indicate that said lipopeptides can be used to induce CTL against any antigenic determinant of any pathogenic agent including HIV.
  • lipopeptides according to the invention can be used to control at least temporarily the viremia in HIV + subjects on anti-retroviral therapy after stopping anti-retroviral treatment as described below. .
  • HIV-related infections Several methods of treating HIV have been proposed to date.
  • the only method of treating HIV-related infections that is currently used is a method based on the administration of a combination anti-retroviral medication known as HAART.
  • HAART a combination anti-retroviral medication
  • antiretroviral therapy is far from an ideal solution.
  • this type of therapy requires a degree of patient involvement which is often difficult to obtain. Failure to adhere to treatment results in treatment failure and can facilitate the emergence of viruses resistant to antiviral products.
  • the present invention therefore relates to the use of lipopeptides for the preparation of a vaccine for the control of viral rebound after stopping antiretroviral therapy in HIV + subjects with a viral load less than or equal to 10,000 copies per ml of plasma and a CD4 + level greater than or equal to 300 cells per mm 3 , in which the lipopeptides consist of a peptide chain of 7 to 100 amino acids comprising at least one CTL epitope of an HIV protein, linked by covalent bond to a lipid chain comprising from 8 to 20 carbon atoms.
  • the HIV + subjects have a viral load less than or equal to 50 copies per ml of plasma and a CD4 count greater than or equal to 500 cells per mm3.
  • the lipopeptides consist of a lipid chain comprising 16 carbon atoms. According to another embodiment, the lipopeptides correspond to a mixture comprising 5 different lipopeptides having CTL epitopes derived from the Nef, Gag and Pol proteins of HIV.
  • VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLK ⁇ (Palm) -NH2 HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKLK ⁇ (P I m) - N H 2 EKIRLRPGGKKKYKLKVIHK ⁇ (Palm) -NH2 NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDK ⁇ (Palm) -NH 2
  • the mixture further comprises a lipopeptide whose peptide chain consists of a ubiquitous helper epitope.
  • the lipopeptides are administered intramuscularly at a dose of 50 ⁇ g to 3 mg of total lipopeptides, preferably in 4 doses respectively on D0, 1 month, 2 months and 3 months.
  • the lipopeptides are co-administered with a recombinant attenuated virus vaccine.
  • Said recombinant attenuated virus is preferably an ALVAC and in particular an ALVAC vCP1452 or vCP1433.
  • an immunomodulator preferably TIL2 is administered sequentially or simultaneously.
  • FIG. 1 gives a schematic representation of the lipopeptides constituting a mixture according to the invention.
  • ⁇ (Palm) -NH2 means that a palmitic acid is linked to the ⁇ NH2 function of lysine, the COOH-terminal end of the lipid is therefore amidated.
  • Lysine is located at the C-terminus of the peptide chain.
  • the peptide chain is represented according to the one-letter code in which:
  • A Ala; D: Asp; E: Glu; F: Phe: G: Gly; H: His; I: Ile; K: Lys: L: Leu; M: Met; N: Asn; P: Pro; Q: Gin; A: Arg; S: Ser; T: Thr; V: Val; W: Trp; Y: Tyr.
  • the vaccination method according to the present invention is useful for the treatment of subjects infected with HIV subjected to antiretroviral therapy and having a viral load less than 10,000, preferably less than 5,000, in particular less than 1,000 viral copies / ml of plasma and a cell count T CD4 + greater than 300 cells / ml, preferably greater than 500 cells / ml. Patients preferably have a viral load of less than 50 viral copies / ml and a CD4 + count greater than 500.
  • the concentrations of HIV RNA in the plasma can be quantified either by amplification of the targets (e.g. quantitative polymerase chain reaction [RT-PCR], Amplicor HIV Monitor test, Roche Molecular Systems), or by l amplification of nucleic acid sequences, [NASBA®], NucliSens TM HIV-1 QT assay, Organon Teknika).
  • targets e.g. quantitative polymerase chain reaction [RT-PCR], Amplicor HIV Monitor test, Roche Molecular Systems
  • NASBA® NucliSens TM HIV-1 QT assay, Organon Teknika
  • the test which has been used in the context of the present invention is the Amplicor HIV Monitor test, Roche Molecular Systems.
  • HIV + subjects who have lost their CD4 + and / or CD8 + cellular responses against HIV antigens can also be vaccinated by the method according to the invention.
  • the vaccination method according to the present invention makes it possible to control the viral rebound in patients infected with HIV after stopping antiretroviral therapy.
  • Control of viral rebound means in the context of the present invention that after stopping antiretroviral therapy, the viral rebound which appears is delayed, absent, or that the viral load present after the viral rebound ("post -rebound set point ”) is checked.
  • the viral rebound appears more than 2 months and in particular more than
  • the post-rebound set point represents the plasma viral load which is present in the absence of antiretroviral therapy after the viral rebound.
  • the post-rebound viral load is considered to be controlled when it is maintained at values lower than the resumption values of antiretroviral therapy as defined in the official recommendations published in the different countries and this for a period of at least 1 month, preferably at least 2 months, in particular at least 6 months.
  • These resumption values for anti-retroviral therapy are typically 10,000 to 50,000 copies of RNA / ml of plasma.
  • the post-rebound viral load is maintained at values lower than 10 000 viral copies / ml, preferably lower than 5000 viral copies / ml in particular lower than 1000 viral copies / ml of plasma.
  • the present invention therefore provides a method which has the advantage of allowing at least temporary, and preferably permanent, cessation of antiretroviral therapy in HIV + subjects by allowing control of the phenomenon of viral rebound generally associated with such a stoppage.
  • CD4 + response is understood to mean the capacity of CD4 + T cells to be stimulated or activated by the vaccine according to the invention.
  • CD4 + responses can be measured by the various methods well known to those skilled in the art which have been described above.
  • lipopeptide in the context of the present invention means at least one compound consisting of a peptide chain comprising from 7 to 100 amino acids, preferably from 10 to 50 amino acids and more particularly from 20 to 35 amino acids and a lipid chain comprising from 8 to 20 carbon atoms, preferably from 14 to 18 carbon atoms and in particular 16 carbon atoms.
  • the lipopeptides according to the present invention preferably correspond to a mixture of at least two different lipopeptides.
  • the peptide chain of the lipopeptides according to the present invention comprises at least one CTL epitope of an HIV protein and may also include one or more T helper epitopes of an HIV protein. Polyepitopic peptide chains comprising several CTL epitopes are particularly suitable.
  • CTL epitope of an HIV protein is understood to mean, in the context of the present invention, the sequences derived from HIV structural and regulatory proteins which induce a response mediated by CD8 + cells of the immune system, such as epitopes. from the proteins Env, Gag, Pol, Tat and Nef. Any CTL epitope of HIV as defined above can be used in the context of the present invention. Such epitopes can be identified by using the algorithms described to do this in the literature. As non-limiting examples of CTL epitopes which can be used in the lipopeptides according to the invention, mention may be made of the epitopes listed in Table 4 of application WO99 / 27954.
  • the epitopes present in the lipopeptides according to the invention can come from a single strain of HIV or preferably from different strains of HIV, preferably from strains of primary isolates. These epitopes are in the case of the use of a single strain originating from the conserved regions of the HIV genome.
  • helper T epitope of HIV is intended to mean the sequences derived from proteins of structure and regulation of HIV that induce an auxiliary response mediated by CD4 cells of the immune system. Any auxiliary T epitope corresponding to the above definition can be used in the context of the present invention.
  • the lipid chain is saturated or unsaturated, linear or branched, and contains from 8 to 20 carbon atoms. It is preferably linear and saturated.
  • the lipid chain is a palmitic acid.
  • the lipid chain is linked by covalent bond at the C-terminal or at the N-terminal of the peptic chain directly or via one or more amino acid (s) selected preferably from the group consisting of lysine, lysineamide, cysteine, serine, threonine. Preferably via a single amino acid corresponding to a lysine, a lysineamide or a cysteine.
  • the COOH function of the fatty acid can be linked directly to the ⁇ NH2 or ⁇ NH2 function at the N-terminal of the peptide chain by an amide bond.
  • the lipid chain is linked via an amino acid, preferably an N-terminal or C-terminal lysine of the peptide chain by amide bonds.
  • an amino acid preferably an N-terminal or C-terminal lysine of the peptide chain by amide bonds.
  • said link is advantageously carried out via a lysineamide residue, which simplifies the process of peptide synthesis.
  • the lipid chain derives from an alkyl halide as defined above, its bonding to the peptide chain can be carried out in C-terminal or in N-terminal, preferably via a cysteine by a thioether bond.
  • the present invention therefore relates to the administration of a composition comprising at least the lipopeptide as defined above and a pharmaceutically acceptable carrier or diluent.
  • the composition administered comprises at least two different lipopeptides and in particular at least 5 different lipopeptides.
  • the lipopeptides contained in such a mixture differ in their peptide chain, each lipopeptide comprising at least one CTL epitope which is different from the CTL epitope (s) present on the other lipopeptides of the mixture.
  • the lipopeptides present in the mixture can also differ in their lipid chain.
  • all the lipopeptides consist of the same lipid chain.
  • the lipid chain is a C16 chain.
  • the lipid chain derives from a palmitic acid which is linked via a lysine or lysineamide residue on one of the ends of the peptide chain.
  • the lipopeptides according to the present invention can be administered by any conventional route usually used in the field of vaccines, such as the parenteral route (intradermal, intramuscular, subcutaneous, etc.).
  • the lipopeptides according to the invention are preferably administered by the intramuscular route.
  • the administration can be carried out by the injection of a single dose or of repeated doses, for example and preferably in 4 doses on D0, at 1 month, at 2 months and 3 months.
  • Booster injections may be given preferably every three months.
  • any plasmid vector containing regulatory elements of eukaryotic viruses can be used as a eukaryotic expression vector.
  • Any vector can be used which allows the expression of proteins under the control of the SV40 “early” or “late” promoter, the metallothionein promoter, the human cytomegalovirus, the murine mammary tumor virus, the Rous sarcoma virus, from the promoter of the polyhedrine, or other promoters effective for expression in eukaryotic cells.
  • the ALVAC vCP 1433 or 1452 will preferably be used.
  • the structure of these two ALVACs as well as their manufacturing process are described in detail in patent US5990091, which will be referred to for a complete description of these.
  • Anti-retroviral therapy is preferably stopped about 4 weeks after the last lipopeptide injection. If the immunotherapy by administration of lipopeptides is followed by a treatment with NL2, preferably a treatment comprising 5 courses, the anti-retroviral therapy is stopped approximately 8 weeks after the last course, or approximately 28 weeks after the last lipopeptide injection in the case of a dosage regimen comprising 4 injections (D0, 1 month, 2 months and 3 months).
  • the solution is reconstituted by adding 1 ml of a 5% glucose solution (W / V) and buffered or not.
  • composition thus obtained comprises 2.5 mg of total lipopeptides per ml.
  • the lipopeptide TT830-846 consists of a C16 lipid chain derived from a palmitic acid, linked at the C-Terminal of the peptide chain and synthesized according to the synthesis method described above for the other lipopeptides.
  • the N-terminal end is acetylated, this in order to avoid the cyclization of glutamine (Q) into pyroGlu.
  • the induction of an HIV-specific cytotoxic response is demonstrated by a method for measuring intracellular INFgamma (in FACS) or secreted (ELISPOT).
  • the proliferation of CD4 + T lymphocytes against HIV is measured by culturing the cells in the presence of HIV antigens and by measuring the incorporation of tritiated thymidine after 7 days of culture.
  • the CD4 cells are purified on magnetic beads and the proliferation test is carried out on this subpopulation thus purified.

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Abstract

La présente invention a pour objet l'utilisation de lipopeptides pour la préparation d'un vaccin pour le contrôle du rebond viral chez les sujets VIH+sous thérapie anti-rétrovirale présentant une charge virale inférieure ou égale à 10000 copies par ml de plasma et un taux de CD4+ supérieur ou égal à 300 cellules par mm3, dans laquelle les lipopeptides sont constitués d'une chaîne peptidique de 7 à 100 acides aminés comprenant au moins un épitope CTL d'une protéine du VIH, liée par liaison covalente à une chaîne lipidique comprenant de 8 à 20 atomes de carbone.

Description


  



   Utilisation de lipopeptides pour l'immunothérapie des sujets VIH+
La présente invention décrit une méthode de traitement des sujets infectés par   le VIH    et concerne plus particulièrement l'utilisation de lipopeptides en immunothérapie chez les sujets VIH+ sous thérapie   anti-rétrovirale.   



   Ces travaux ont été cofinancés par   I'ANRS.   



   La grande majorité des études réalisées sur le SIDA a pour objet de mettre au point une méthode prophylactique visant à protéger les individus contre une infection par   le VIH.    De nombreux antigènes ont été proposés à cette fin. On peut citer à titre d'exemple : la glycoprotéine d'enveloppe du   VIH,    les poxvirus exprimant des épitopes dérivant de protéines de structure ou de régulation du VIH ainsi que des   lipopeptides.   



   L'utilisation de lipopeptides a été proposée comme stratégie anti-SIDA en particulier dans FR9015870. Ce document décrit des lipopeptides comprenant une partie peptidique ayant entre 10 et 40 acides aminés environ et comportant au moins un déterminant   antigénique,    ledit lipopeptide comprenant également une ou plusieurs chaînes dérivées d'acides gras comportant de 10 à 20 atomes de carbone, et/ou un ou plusieurs groupements stéroïdes modifiés et couplés sur des fonctions   aNH2    ou   sNH2    desdits acides aminés. Sur la base d'une expérience réalisée chez la souris, les auteurs indiquent que lesdits lipopeptides peuvent être utilisés pour induire des CTL contre tout déterminant   antigénique    de tout agent pathogène incluant le VIH.



   La fabrication de micelles mixtes ou micro-agrégats contenant au moins deux   lipopeptides,      I'un    comprenant un épitope CTL, le deuxième comprenant un épitope T auxiliaire et leur utilisation pour induire une réponse immunitaire est décrite dans W099/27954. Selon ce document, cette formulation permet d'induire une réponse de meilleure qualité par l'adjonction d'une réponse T auxiliaire.



   Aucun de ces deux documents ne décrit ni ne suggère que les lipopeptides selon l'invention peuvent être utilisés pour contrôler au moins temporairement la   virémie    chez les sujets VIH+ sous thérapie anti-rétrovirale après arrêt du traitement anti-retroviral comme cela est décrit ci-dessous.



   Plusieurs méthodes de traitement du VIH ont été proposées à ce jour. La seule méthode de traitement des infections liées au   VIH    qui est utilisée à l'heure actuelle correspond à une méthode basée sur l'administration   d'une    association de médicaments anti-rétroviraux connue sous le nom de multithérapie antirétrovirale. Bien que représentant une avancée considérable dans le traitement du   SIDA, la therapie anti-retrovirale    est loin d'être une solution idéale. Outre les effets secondaires qui sont importants, ce type de thérapie nécessite un degré de participation du malade qu'il est souvent difficile d'obtenir. La non adhérence au traitement se traduit par un échec du traitement et peut faciliter l'émergence de virus résistant aux produits antiviraux.



   Différentes stratégies thérapeutiques ont donc été développées comprenant des interruptions intermittentes de la thérapie anti-retrovirale ainsi que l'utilisation d'immunomodulateurs de type   IL2.   



   Aucune des stratégies proposées à ce jour n'a apportée de solution satisfaisante. II existe donc un besoin de mise en place d'une méthode de traitement des sujets VIH+ qui ne présente pas les inconvénients des méthodes proposées jusqu'à présent. De plus, toute stratégie thérapeutique qui permettrait de limiter la durée de la thérapie anti-rétrovirale est hautement souhaitable.



   Le déposant a mis en évidence de façon surprenante que après l'infection par le VIH, la thérapie anti-rétrovirale peut être stoppée par   I'administration    de lipopeptides tels que définis ci-dessous qui induisent des réponses cellulaires
CD4+ et   CD8+    spécifiques du VIH. Ces réponses cellulaires maintiennent la charge virale à des valeurs faibles et contrôlent le rebond viral après l'arrêt de la thérapie anti-retrovirale.



   La présente invention a donc pour objet l'utilisation de lipopeptides pour la préparation d'un vaccin pour le contrôle du rebond viral après arrêt de la thérapie anti-retrovirale chez les sujets VIH+ présentant une charge virale inférieure ou égale à 10000 copies par ml de plasma et un taux de CD4+ supérieur ou égal à 300 cellules par   mm3,    dans laquelle les lipopeptides sont constitués d'une chaîne peptidique de 7 à 100 acides aminés comprenant au moins un épitope CTL   d'une    protéine du   VIH,    liée par liaison covalente à une chaîne lipidique comprenant de   8    à 20 atomes de carbone.



   Selon un autre mode de réalisation, les sujets VIH+ présentent une charge virale inférieure ou   égale à 50copies    par ml de plasma et un taux de CD4 supérieur ou égal à 500 cellules par mm3.



   Selon un mode de réalisation les lipopeptides sont constitués d'une chaîne lipidique comprenant 16 atomes de carbone. 



   Selon un autre mode de   réa ! isation, les lipopeptides    correspondent à un mélange comprenant 5 lipopeptides différents présentant des épitopes CTL issus des protéines Nef, Gag et Pol du VIH.



   Selon un mode de réalisation spécifique, le mélange de lipopeptides comprend les lipopeptides suivants :   
VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGLKe (Palm)-NH2
HTQGYFPDWQNYTPGPGVRYPLTFGWLYKLKs (Palm)-N H2
EKIRLRPGGKKKYKLKVIHKs (Palm)-NH2
NPPIPVGEIYKRWIILGLNKIVRMYSPTSILDKs (Palm)-NH2
AIFQSSMTKILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLYKe (Palm)-NH2.   



   Selon un mode de réalisation spécifique le mélange comprend en outre un lipopeptide dont la chaîne peptidique est constituée d'un épitope helper ubiquitaire.



   Selon un mode de réalisation les lipopeptides sont administrés par voie intramusculaire à une dose de   50 ; j. g à    3 mg de lipopeptides totaux, de préférence en 4 doses respectivement à   J0,    1 mois, 2 mois et 3 mois.



   Selon un autre mode de réalisation, les lipopeptides sont   co-administrés    avec un vaccin à virus atténué recombinant. Ledit virus atténué recombinant est de préférence un ALVAC et en particulier un ALVAC vCP1452 ou vCP1433.



   Selon un autre mode de réalisation, un immunomodulateur, de préférence de   l'IL2    est administré de façon séquentielle ou simultanée.



   Les autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront dans la description détaillée qui suit par référence à la figure 1 qui donne une représentation schématique des lipopeptides constitutifs d'un mélange selon l'invention. Dans la figure 1 s   (Palm)-NH2    signifie qu'un acide palmitique est fié sur la fonction   sNH2    de la lysine, l'extrémité   COOH-terminale    du lipide est donc   amidée.    La lysine est située à l'extrémité C-terminale de la chaîne peptidique.

   La chaîne peptidique est représentée selon le code à une lettre dans lequel :
A : Ala ; D : Asp ; E : Glu ; F : Phe : G : Gly ; H : His ; I :   Ile    ; K : Lys : L :
Leu ; M : Met ; N : Asn ; P : Pro ; Q : Gln ; R : Arg ; S : Ser ; T : Thr ; V : Val ; W :
Trp ; Y : Tyr.



   La méthode de vaccination selon la présente invention est utile pour le traitement des sujets infectés par le HIV soumis à une thérapie anti-rétrovirale et ayant une charge virale inférieure à 10000, de préférence inférieure à 5000, en particulier inférieure à 1000 copies virales/ml de plasma et un taux de cellules 
T CD4+ supérieur à 300 cellules/ml, de préférence supérieur à 500   cellules/ml.    Les patients présentent de préférence une charge virale inférieure à 50 copies   virales/ml    et un taux de CD4+ supérieur à 500.



   La charge virale exprimée par le nombre de copies   d'ARN/ml    de plasma représente la quantité de virus présente dans le sang. Elle est désignée aussi sous les termes de titre viral ou viremie. De nombreuses techniques sont utilisables pour mesurer la charge virale d'un patient. Une revue de   t'état    de   l'art    se trouve dans   Report of the NIH To Define Principles of Therapy of VIH Infection   publié dans the Morbidity and Mortality Weekly Reports, April 24, 1998, Vol. 47, No. RR-5, révisé le 17/6/98 auquel on pourra se référer pour un descriptif des techniques. On sait que les taux de réplication du   VIH    chez les personnes infectées peuvent être mesurés de façon précise par la mesure du VIH dans le plasma.

   L'ARN du   VIH    dans le plasma est contenu dans des particules circulaires de virus ou virion, chaque virion contenant 2 copies de   I'ARN    gnomique du VIH. On peut quantifier les concentrations d'ARN de   VIH    dans le plasma soit par amplification des cibles (e. g., réaction en chaîne quantitative de la polymerase [RT-PCR], test   Amplicor   
VIH Monitor, Roche Molecular Systems), soit par l'amplification des séquences d'acides nucléiques,   [NASBAO], NucliSensT" VIH-1    QT assay, Organon Teknika).



  Le test qui a été utilisé dans le cadre de la présente invention est le test   Amplicor      VIH    Monitor, Roche Molecular Systems.



   Le taux de cellules T CD4+ correspond au nombre total de cellules exprimant le marqueur CD4 par   mm3    de sang. Ce taux est déterminé selon les recommandations décrites dans The Morbidity and Mortality Weekly Report, 46 (RR-02) Jan, 10 1997. Centers for Disease Control. En résumé, le nombre absolu de CD4+ dans le sang entier est mesuré par un processus à trois phases.



  Le comptage des CD4+ est le fruit de trois techniques de laboratoire : le comptage des cellules sanguines blanches (WBC) ; la détermination du pourcentage de
WBCs qui sont des lymphocytes (différentiel) ; et la détermination du pourcentage de lymphocytes qui sont des cellules T CD4+ par   immunophenotypage par flux   cytométrique           par exemple par utilisation du système FACSCount de
Becton Dickinson.



   On entend par        thérapie anti-retrovirale   un traitement comprenant une combinaison efficace d'agents anti-rétroviraux. La thérapie anti-rétrovirale implique l'utilisation de deux grandes catégories de   médicaments i. e. les    inhibiteurs de la transcriptase inverse et les inhibiteurs de protéase. Les inhibiteurs de la transcriptase inverse peuvent être de nature nucléosidique, tels que : AZT, ddl, ddC, d4T et 3TC en combinaison avec AZT et Combivir, ou de nature non nucléosidique tels que Delavirdine et Nevirapine. Une revue des inhibiteurs non nucléosidiques est donnée dans Clinical Care (10197) Vol. 9, No 10, p 75.

   De préférence la thérapie anti-rétrovirale correspond à une thérapie hautement active   (HAART) ie    ; une combinaison d'un inhibiteur de protéase, d'un inhibiteur non nucléosidique de la transcriptase inverse et d'un inhibiteur nucléosidique de la transcriptase inverse, ou une combinaison de deux inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse et d'un inhibiteur nucléosidique de la transcriptase inverse.



   Les patients pouvant être traités par la méthode selon l'invention sont donc les personnes infectées par   le VIH    qui sont soumise à une thérapie anti-retrovirale précocement après   linfection ie.    dans les 3 mois suivant l'infection ainsi que les personnes infectées et traitées plus de 3 mois après l'infection, ces dernières étant désignées dans le cadre de la présente invention personnes infectées chroniques.



   La méthode selon l'invention permet donc le traitement des personnes nouvellement infectées   (i. e. infectées    depuis 90 jours ou moins) qui'sont placées sous thérapie anti-retrovirale quelques mois après l'infection par le   VIH    et présentent donc une   virémie    contrôlée. Ces personnes ont la particularité de présenter un Western Blot incomplet. La méthode selon la présente invention permet également le traitement des patients infectés chroniques sous thérapie anti-retrovirale. La   virémie    est contrôlée lorsque la charge virale est maintenue à une valeur inférieure à 10000 copies virales par ml de plasma.



   Les sujets HIV+ qui présentent des réponses cellulaires CD4+ et CD8+ contre les antigènes du HIV, en particulier ceux qui présentent des réponses cellulaires prolifératives contre les épitopes de l'enveloppe (par exemple gp120) sont préférés. Les sujets qui présentent aussi des réponses cellulaires contre les épitopes de Gag (par exemple p24) sont plus particulièrement préférés. Les sujets
HIV+ qui ont perdu leurs réponses cellulaires CD4+   et/ou    CD8+ contre les antigènes du VIH peuvent également être vaccinés par la méthode selon l'invention. 



   La méthode de vaccination selon la présente invention permet le contrôle du rebond viral chez les patients infectés par le   HIV après l'arrêt de la thérapie    anti  rétrovirale.   



   Le    <  <     contrôle du rebond viral   signifie dans le cadre de la présente invention que après l'arrêt de la thérapie anti-rétrovirale, le rebond viral qui apparaît est retardé, absent, ou que la charge virale présente après le rebond viral post-rebound set   point)))    est contrôlée.



   Le rebond viral est observé généralement dans les 1 à 3 semaines qui suivent t'arrêt de la thérapie anti-retrovirale. Le rebond viral est considéré comme retardé lorsqu'il apparaît plus d'un mois après t'arrêt de la thérapie   anti-rétrovirale.   



  De préférence le rebond viral apparaît plus de 2 mois et en particulier plus de 6 mois après t'arrêt de la thérapie   anti-rétrovirale.   



   La charge virale post-rebond (  post-rebound set point  ) représente la charge virale plasmatique qui est présente en l'absence de thérapie anti-retrovirale après le rebond viral. La charge virale post rebond est considérée comme étant contrôlée lorsqu'elle est maintenue à des valeurs inférieures aux valeurs de reprise de la thérapie anti-retrovirale telles que définies dans les recommandations officielles publiées dans les différents pays et ce pendant une durée d'au moins 1 mois, de préférence d'au moins 2 mois, en particulier d'au moins 6 mois. Ces valeurs de reprise de la thérapie anti-rétrovirale sont typiquement de 10000 à 50000 copies d'ARN/ml de plasma.

   De préférence la charge virale post rebond est maintenue à des valeurs inférieures à   10000 copies virales/ml,    de préférence inférieures à   5000 copies virales/ml    en particulier inférieures à   1000 copies    virales/ml de plasma.



   La présente invention fournit donc une méthode qui a t'avantage de permettre t'arrêt au moins temporaire, et de préférence définitif de la thérapie antirétrovirale des sujets VIH+ en permettant le contrôle du phénomène de rebond viral généralement associé à un tel arrêt.



   Un tel contrôle du rebond viral est obtenu par administration des lipopeptides selon l'invention qui induisent des réponses cellulaires CD4+ et CD8+ spécifiques du VIH.



   On entend par        réponse   CD8+           la capacité des cellules T cytotoxiques à reconnaître et à tuer les cellules exprimant des peptides du   VIH    dans le contexte des molécules du MHC classe   1.    Une telle réponse peut être mesurée par différentes méthodes bien connues de l'homme de   I'art    telles que par exemple par la technique des tétramères sur des PBMC frais ou en culture, par des tests
Elispot de   l'INFgamma,    ou des tests de   cytotoxicité    fonctionnelle.



   On entend par        réponse CD4+   la capacité des cellules T CD4+ à être stimulées ou activées par le vaccin selon l'invention. Les réponses CD4+ peuvent être mesurées par les diverses méthodes bien connues de   I'homme    de   l'art    qui ont été décrites ci-dessus.



   On entend par   lipopeptide   dans le cadre de la présente invention, au moins un composé constitué une chaîne peptidique comprenant de 7 à   100    acides aminés, de préférence de 10 à 50 acides aminés et plus particulièrement de 20 à 35 acides aminés et d'une chaîne lipidique comprenant de 8 à 20 atomes de carbone, de préférence de 14 à 18 atomes de carbone et en particulier 16 atomes de carbone. Les lipopeptides selon la présente invention correspondent de préférence à un mélange d'au moins deux lipopeptides différents.



   La chaîne peptidique des lipopeptides selon la présente invention comprend au moins un épitope CTL d'une protéine du VIH et peut également inclure un ou plusieurs épitopes T auxiliaire   d'une    protéine du VIH. Les chaînes peptidiques   polyépitopiques    comprenant plusieurs épitopes CTL sont particulièrement appropriées.



   On entend par   épitope CTL d'une protéine du   VIH   dans le    cadre de la présente invention, les séquences dérivées des protéines de structure et de régulation du   VIH    qui induisent une réponse médiée par les cellules CD8+ du système immunitaire, telles que les épitopes issus des protéines Env, Gag, Pol,
Tat et Nef. Tout épitope CTL du VIH tel que défini ci-dessus peut être utilisé dans le cadre de la présente invention. De tels épitopes peuvent être identifiés par utilisation des algorithmes décrit pour ce faire dans la littérature. On peut citer à titre d'exemple non limitatifs d'épitopes CTL utilisables dans les lipopeptides selon l'invention les épitopes listes dans le tableau 4 de la demande W099/27954.

   Les épitopes présents dans les lipopeptides selon l'invention peuvent être issus d'une seule souche de VIH ou de préférence de différentes souches de   VIH,    de préférence de souches d'isolats primaires. Ces épitopes sont dans le cas de l'utilisation d'une souche unique issus des régions conservées du génome du VIH.



   On entend par        épitope T auxiliaire du   VIH           dans le cadre de la présente invention, les séquences dérivées des protéines de structure et de régulation du 
VIH qui induisent une réponse   auxiliaire médiée    par les cellules CD4 du système immunitaire. Tout épitope T auxiliaire répondant à la définition ci-dessus peut être utilisé dans le cadre de la présente invention.



   Selon un mode de réalisation   préféré le lipopeptide selon l'invention    correspond à un mélange dans lequel les chaînes peptidiques sont issues des protéines Env, Gag, Pol et Nef du VIH, et en particulier sont issues de Gag, Pol et
Nef.



   La chaîne lipidique est saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, et comprend de 8 à   20    atomes de carbone. Elle est de préférence linéaire et saturée.



  La chaîne lipidique dérive de préférence d'un acide gras de formule COOH (CH2) n-CH3 avec n=12-16, en particulier n=14, ou d'un halogénure d'alkyle de formule CH2X- (CH2) m-CH3 avec X= Br ou Cl et m=12-16, de préférence avec m=14. Selon un mode particulièrement avantageux, la chaîne lipidique est un acide palmitique.



   La chaîne lipidique est liée par liaison covalente en C-terminal ou en Nterminal de la chaîne peptique directement ou via un ou plusieurs acide (s) aminé (s) sélectionné (s) de préférence dans le groupe consistant en lysine,   lysineamide,    cystéine, serine, thréonine. De préférence via un seul acide aminé correspondant à une lysine, une   lysineamide    ou une cystéine.



   Lorsque la chaîne lipidique dérive d'un acide gras la fonction COOH de   I'acide    gras peut être liée directement sur la fonction   aNH2    ou   eNH2    en N-terminal de la chaîne peptidique par une liaison amide. De préférence, la chaîne lipidique est liée via un acide aminé, de préférence une lysine en N-terminal ou en Cterminal de la chaîne peptidique par des liaisons amide. Dans le cas d'une liaison en C-terminal de la chaîne peptidique, ladite liaison est réalisée avantageusement via un résidu   lysineamide,    ce qui permet de simplifier le procédé de synthèse peptidique.



   Lorsque la chaîne lipidique dérive d'un halogénure d'alkyle tel que défini cidessus, sa liaison sur la chaîne peptidique peut être réalisée en C-terminal ou en
N-terminal, de préférence via une cystéine par une liaison   thioéther.   



   Les lipopeptides selon la présente invention peuvent être synthétisés par toute méthode classique. Des méthodes utilisables dans le cadre de la présente invention sont décrites en particulier dans les documents US5019383,   FR9015870,   
US5993823 et   W099/27954    auxquels on pourra se référer pour un descriptif complet des procédés de synthèse. Des méthodes de synthèse des lipopeptides selon la présente invention sont également décrites dans les références suivantes :        Yeast binding protein farnesyltransferase. Binding of S-alkyl peptides and related analogs    .    Rozema et al in Organic Letters 1 (5), 815-817 (1999) ;        Angiotensin analogues palmitoylated in position 1 and 4        Maletinska et al in J.



  Med. Chem. 40,3271-3279 (1997) ;        Synthetic peptide vaccines : palmitoylation of peptide antigens by a thioesther bond increases immunogenicity        Beekman et al in J. Pept. Res. 50,357-364 (1997) ; et        Synthesis and structural characterization of human-identical lung surfactant SP-C protein          Mayer-Fligge    et al. in J. Peptide
Sci 4,355-363 (1998) auxquelles on pourra se référer pour un descriptif des techniques.



   La présente invention a donc pour objet l'administration d'une composition comprenant au moins au lipopeptide tel que défini ci-dessus et un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable.



  De préférence, la composition administrée comprend au moins deux lipopeptides différents et en particulier au moins   5 lipopeptides différents.    Les lipopeptides contenus dans un tel mélange diffèrent par leur chaîne peptidique, chaque lipopeptide comportant au moins un épitope CTL qui est différent du ou des épitope (s) CTL présent (s) sur les autres lipopeptides du mélange.



  Les lipopeptides présents dans le mélange peuvent également différer par leur chaîne lipidique. De préférence tous les lipopeptides sont constitués de la même chaîne lipidique. Selon un aspect préféré de l'invention, la chaîne lipidique est une chaîne en C16. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, la chaîne lipidique dérive d'un acide palmitique qui est lié via un résidu lysine ou   lysineamide    sur   l'une    des extrémités de la chaîne peptidique.



   Selon un mode de réalisation préféré, le mélange selon la présente invention est constitué des lipopeptides tels que définis à la figure 1. Le déposant a mis en évidence de façon surprenante que les lipopeptides selon l'invention sont efficaces en   I'absence    de tout lipopeptide contenant un épitope T helper universel tel que décrit dans   W099/27954.   



   Les lipopeptides sont présents dans le mélange en des quantités équipondérales, de préférence en des quantités   équimolaires.   



   Le mélange de lipopeptides est préparé à partir des lipopeptides individuels sous forme lyophilisée de la façon suivante. On solubilise les lipopeptides dans de 
I'acide acétique pur et on les mélange selon un ordre   défini i. e.    en partant du moins hydrophobe et en finissant par le plus hydrophobe. Un exemple de préparation   d'un    mélange selon l'invention est donné dans les exemples qui suivent.



   Le terme        support ou diluant pharmaceutiquement acceptable   est utilisé dans son sens classique et peut par exemple représenter pour une solution injectable, telle que   de l'eau,    une solution saline tamponnée ou une solution   glucosée.    Le support ou diluant pharmaceutiquement acceptable va être sélectionné en fonction de la forme galénique choisie, du mode et de la voie d'administration ainsi que de la pratique pharmaceutique. Les supports ou diluants appropriés ainsi que les exigences en matière de formulation pharmaceutique sont décrits en détails dans Remington's Phamaceutical Sciences, représentant un ouvrage de référence dans ce domaine.



   Les lipopeptides selon la présente invention peuvent être administrés par toute voie classique habituellement utilisée dans le domaine des vaccins, telle que la voie parentérale (intradermique, intramusculaire, sous-cutanée, etc..). On administre de préférence les lipopeptides selon l'invention par voie intramusculaire.



  L'administration peut être réalisée par l'injection   d'une    dose unique ou de doses répétées, par exemple et de préférence en 4 doses à   J0,    à 1 mois, à 2 mois et 3 mois. Des injections de rappel peuvent éventuellement être administrées de préférence tous les trois mois.



   On administre les lipopeptides selon l'invention à raison de 50 microgrammes à 3 milligrammes de lipopeptides totaux et ce pour les quatre injections ainsi que pour les injections de rappel.



   Dans le cadre de la présente invention on peut avantageusement administrer les lipopeptides de façon simultanée ou séquentielle avec un vaccin
ADN ou un vaccin à virus recombinant atténué.



   Dans le cas du vaccin ADN, tout vecteur   plasmidique    contenant des éléments régulateurs de virus eucaryotes peut être utilisé comme vecteur d'expression eucaryote. On peut utiliser tout vecteur permettant l'expression de protéines sous le contrôle du promoteur        précoce        ou   tardif   SV40, du promoteur de la metallothionéine, du   cytomegalovirus    humain, du virus de la tumeur mammaire murine, du virus du sarcome de Rous, du promoteur de la polyhedrine, ou d'autres promoteurs efficaces pour l'expression en cellule eucaryote.



   Les quantités thérapeutiques d'ADN   plasmidique    peuvent être produites par fermentation en E coli, suivie d'une purification. Des aliquotes de la banque cellulaire de travail sont utilisés pour inoculer le milieu de croissance et sont cultivés jusqu'à saturation dans des flacons sous agitation ou en bioréacteur selon des techniques bien connues. L'ADN plasmidique peut être purifié en utilisant une méthode de bioséparation standard telle que une résine d'échangeuse d'anions en phase solide de QIAGEN, Inc. (Valencia, California). Si nécessaire, I'ADN superenroulé peut être isolé des formes ouvertes circulaires ou linéaires par un gel d'électrophorèse ou toute autre méthode appropriée pour ce faire.



   L'ADN   plasmidique    purifié peut être préparé pour les injections en utilisant des formulations variées. Le plus simple est la reconstitution de   l'ADN    lyophilisé en tampon phosphate stérile (PBS). Cette méthode nommée"ADN nu"est utilisée de préférence pour des administrations intramusculaires (IM) dans le cadre de la présente invention.



   Dans le cadre de la présente invention, le vecteur   plasmidique    contient des séquences codant un ou plusieurs peptides ou protéines   contenant des épitopes    dont au moins certains sont communs avec ceux présents dans le ou les lipopeptides administrés.



   Pour maximiser les effets immunothérapeutiques des vaccins à minigène
ADN, il peut être souhaitable d'employer une autre méthode pour formuler   I'ADN    plasmidique purifié. On peut par exemple utiliser des lipides cationiques dans la formulation comme cela est décrit dans WO   93/24640.    De plus, des glycolipides, des liposomes fusogéniques, des peptides et des composés mentionnés comme globalement protecteurs, interactifs, qui ne condensent pas, peuvent aussi être mélangés à   I'ADN    plasmidique pour agir sur des variables comme la stabilité, la dispersion intramusculaire, ou le ciblage d'organes ou de cellules spécifiques.



   Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, les lipopeptides selon la présente invention sont administrés de façon séquentielle ou simultanée avec un vaccin à virus recombinant atténué. De préférence les lipopeptides et le vaccin à virus recombinant atténué sont administrés soit simultanément soit séquentiellement selon une méthode de primovaccination-rappel (prime-boost) dans laquelle le virus recombinant atténué est administré en   primovaccination.    



   On entend par        vaccin à virus recombinant atténué   une composition comprenant un virus recombinant atténué et un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable.



   Un        virus recombinant atténué   dans le cadre de la présente invention est un virus qui a été génétiquement modifié par des techniques modernes de biologie moléculaire, par ex. des endonucléases de restriction et un traitement par des ligases, et qui a ainsi été rendu moins virulent que le virus sauvage par délétion de certains gènes ou qui a été atténué par passages en série sur une lignée cellulaire issue d'un hôte qui n'est pas   t'hôte    naturel, ou sur des cellules permissives primaires ou à basse température.



  Les virus recombinants atténués selon la présente invention expriment au moins un épitope   CTL d'une protéine    du   VIH,    et au moins un épitope T helper de préférence spécifique du VIH. Les virus expriment de préférence les protéines
Gag, Env et protéase et des épitopes CTL de Pol et Nef. Parmi les virus recombinant atténués utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer à titre d'exemple non limitatif les adénovirus, les virus adéno-associés, les   alphavirus    et les poxvirus.



   Le virus atténué agit comme un vecteur pour une protéine rétrovirale immunogène grâce à la capacité du virus de coder pour   I'ADN    étranger. Le virus induit de préférence une réponse helper et une réponse cytotoxique contre les cellules infectées par le VIH.



   Le virus est ensuite introduit dans le corps humain par des méthodes ordinaires de vaccination avec un virus vivant. Un vaccin à virus vivant peut par exemple être administré à environ   104-108      particules/dose,    ou de   105    à   109    pfu par dose. Le dosage réel d'un tel vaccin peut facilement être déterminé par un test ordinaire de vaccinologie.



   On utilise de préférence dans le cadre de la présente invention des poxvirus. Une revue détaillée sur ces vecteurs est fournie dans le brevet
US5863542 auquel on pourra se référer pour un descriptif complet de ces derniers.



  Un exemple représentatif de poxvirus recombinant est   IALVAC.   



  L'ADN inséré dans ces vecteurs code pour les antigènes du VIH qui comprennent au moins   l'un    des épitopes suivants :   VIH-I    Gag (+ protéase)   (LAI),      gp120    (MN) (+ la partie transmembranaire de gp41), Nef (BRU) CTL, Pol   (LAI) CTL.    De préférence
I'ALVAC comprend au moins un épitope CTL de Nef et au moins un épitope CTL de   Pol (Transcriptase Inverse). Les épitopes    CTL de Nef et de Pol sont de préférence les épitopes CTL   Nef1,    Nef2,   Pol1, Pol2    et   Pol3.    De plus des séquences codant pour Tat et/ou Rev peuvent avantageusement être ajoutées.



  Dans la liste ci-dessus, sont mises entre parenthèses les souches virales dont dérivent les antigènes.



  Les séquences d'ADN codant pour les antigènes du   VIH tels    que définis ci-dessus peuvent dériver de toute souche connue du VIH (VIH1 et VIH2, de préférence   VIH1), incluant les    souches de laboratoire et les isolats primaires. Les séquences des épitopes CTL de Nef et de Pol identifiés ci-dessus sont décrites dans le brevet
US5990091 et correspondent aux séquences suivantes :
MPLTEEAELE LAENREILKE PVHGVYYDPS KDLIAEIQKQ   GQGQWTYQIY   
QEPFKNLKTG :   épitope    CTL   Pol-3    (60 aa)
MEWRFDSRLA FHHVARELHP EYFKNC :   épitope    CTL Nef-2 (26 aa)
MA IFQSSMTKIL EPFRKQNPDI VIYQYMDDLY VGSDLEIGQH RTKIEELRQH
LLRWGLTT :

     épitope    CTL   Pol-2    (60 aa)
MV GFPVTPQVPL RPMTYKAAVD LSHFLKEKGG LEGLIHSQRR QDILDLWIYH
TQGYFPDWQN YTPGPGVRYP LTFGWCYKLV P :   épitope    CTL Nef-1 (83 aa)   MIETVPVKL KPGMDGPKVK QWPLTEEKIK ALVEICTEME KEGKISKIGP    :   épitope    CTL   Pol-1    (49 aa)
Dans le cadre de la présente invention on utilisera de préférence   I'ALVAC    vCP 1433 ou 1452. La structure de ces deux ALVAC ainsi que leur procédé de fabrication sont décrits en détails dans le brevet US5990091, auquel on se référera pour un descriptif complet de ces derniers.



   Selon un autre mode de réalisation, un immunomodulateur, de préférence de l'IL2, est administré de façon séquentielle ou simultanée. L'IL2 est de préférence administré après le traitement par les lipopeptides et de préférence en 5 cures de 5 jours à raison de 4,5 millions d'unités deux fois par jour.



   La thérapie anti-retrovirale est de préférence stoppée environ 4 semaines après la dernière injection de lipopeptides. Si l'immunothérapie par administration de lipopeptides est suivie d'un traitement par de l'IL2, de préférence d'un traitement comprenant 5 cures, la thérapie anti-rétrovirale est stoppée environ 8 semaines après la dernière   cure,,    soit environ   28    semaines après la dernière injection de lipopeptides dans le cas d'un schéma posologique comprenant 4 injections   (J0,    1 mois, 2 mois et 3 mois).



   La présente invention va être décrite de façon plus détaillée dans les exemples qui suivent. Les exemples décrits ci-dessous sont donnés à titre purement illustratif de l'invention et ne peuvent en aucun cas être considérés comme limitant la portée de cette dernière.



   Exemple 1 : préparation d'une composition de lipopeptides selon l'invention.



   Un mélange comprenant   5 lipopeptides    comprenant des séquences peptidiques issues des protéines Nef, Gag et Pol de la souche LAI du virus   VIH    correspondant aux séquences Nef 66-97,   Nef116-145,      gag17-35,    gag253-284 et   pol325-355    est préparé selon le procédé décrit ci-dessous.



  Pour chaque lipopeptide, une lysine a été ajoutée à l'extrémité C-terminale du peptide et un acide palmitique a été greffé sur la chaîne latérale de cette lysine (liaison amide). La synthèse est réalisée sur phase solide (résine de type polystyrène comportant des substituants amides tricycliques) en utilisant la stratégie Fmoc. Les acides aminés sont ajoutés de l'extrémité C-terminale à l'extrémité N-terminale. En fin de synthèse, le peptide est détaché de la résine et les chaînes latérales sont   déprotégées    par un traitement à   I'acide      trifluoroacétique.   



   Le peptide est purifié par HPLC en utilisant deux systèmes de solvants différents. Le peptide pur est ensuite soumis à une chromatographie échangeuse d'ions de façon à permuter les ions trifluoroacétate par des ions acétate. Le peptide est filtré (0,22 um) et réparti en flacons de 100 mg et lyophilisé.



   Chaque lipopeptide est ensuite solubilisé par addition d'acide acétique pur jusqu'à une concentration de 12,5 mg   net/ml.    Les lipopeptides Nef66,   Nef116    et   Gag17    sont solubles dans   I'acide    acétique pur. Les lipopeptides Gag253 et   Pol325    ne sont pas solubles dans   I'acide    acétique pur. II est donc nécessaire d'introduire une étape de sonication pour faciliter la solubilisation de ces deux derniers. Si les agrégats ne sont pas dissociés, on continue la sonication en espaçant chaque période de sonication (30 s) par des arrêts de 30 s, pendant lesquels les flacons sont agités manuellement. A la fin de l'étape de sonication, les suspensions doivent être homogènes (mais ne seront pas limpides).

   Chaque lipopeptide est ensuite dilué par addition d'eau pour préparation injectable. Si la solution obtenue n'est pas totalement limpide, on peut effectuer des étapes de chauffage au bain marie   (à 40 C2 C)    et sonication (1 min maximum) en espaçant par des arrêts de 30 s. La préparation finale est obtenue en mélangeant les lipopeptides en quantités équipondérales en les ajoutant dans l'ordre suivant (lipopeptides les plus hydrophiles aux plus hydrophobes) :
Nef66 ;   Nef116    ;   Gag17    ;   Pol325    ; Gag253
Le mélange est maintenu sous agitation   (à      I'aide      d'un    barreau aimenté) pendant les additions des différents lipopeptides. Le mélange à filtrer doit être limpide.

   II est préférable de le passer au bain-marie à   40 C2 C    (5 minutes maximum) jusqu'à obtention d'un mélange parfaitement liquide et limpide. Ne pas dépasser   10 min.    Le mélange est alors filtré puis réparti en flacon à raison de 500   pg    de chaque lipopeptide par flacon, puis lyophilisé.



   Pour préparer la composition selon l'invention, on reconstitue la solution par addition de   1 ml    d'une solution glucose à 5% (PN) et tamponnée ou non.



   La composition ainsi obtenue comprend 2.5 mg de lipopeptides totaux par   ml.   



   Exemple 2 : Préparation d'une composition selon l'invention
On prépare selon le procédé décrit dans l'exemple 1 une composition comprenant outre les lipopeptides mentionnés dans l'exemple 1, un lipopeptide   TT830-846    dans lequel la chaîne peptidique est constituée de   t'épitope    830-846 de la toxine tétanique. Cet épitope est décrit dans la littérature comme étant un épitope T-helper universel.



   Le lipopeptide   TT830-846    est constitué d'une chaîne lipidique en C16 dérivée   d'un    acide palmitique, liée en C-Terminal de la chaîne peptidique et synthétisé selon le procédé de synthèse décrit ci-dessus pour les autres lipopeptides. Dans le cas du lipopeptide TT830-846, l'extrémité N-terminale est acétylée, ceci afin d'éviter la cyclisation de la glutamin (Q) en   pyroGlu.   



   Le lipopeptide TT830-846 est ajouté dans la préparation finale après le lipopeptide GAG17.



   La composition ainsi obtenue comprend 3,0 mg de lipopeptides totaux par   ml.   



   Exemple   3    : Immunothérapie de sujets VIH+
Des sujets VIH+ primo-infectes et infectés chroniques présentant une charge virale inférieure ou égale à 1000 copies par ml de plasma et un taux de 
CD4+ supérieur ou égal à 300 cellules par   mm3    ont été soumis à une méthode d'immunothérapie selon la présente invention.



   Le schéma posologique suivant a été utilisé :
Injection à   J0,    1 mois, 2 mois et 3 mois par voie intramusculaire de 1   ml    de la composition de l'exemple 1 ou de 1 mi de la composition de l'exemple 2.



     L'ALVAC-HIV    (vCP1433) est   co-administré    par voie intramusculaire à une dose de   1065 TCID50,    cette même dose étant utilisée pour les 4 injections.



   Une partie des sujets sont soumis après l'immunothérapie à un traitement par de   l'IL2    en 3 cures ou 5 cures de 5 jours à raison de 4,5 millions d'unités deux fois par jour.



   La thérapie anti-rétrovirale est arrêtée 4 semaines après la dernière injection de lipopeptides ou, quand celle ci est suivie d'un traitement par IL2 par exemple en 5 cures, 8 semaines après la dernière cure, soit 28 semaines après la dernière vaccination.



   L'efficacité de l'immunothérapie, mise en évidence par le contrôle au moins temporaire de la   virémie,    est déterminée par la mesure de la charge virale selon la méthode décrite ci-dessus.



   L'induction d'une réponse cytotoxique spécifique du   HlV > est    mise en évidence par une méthode de mesure de l'INFgamma intracellulaire (en FACS) ou sécrété (ELISPOT).



   L'induction d'une réponse spécifique du   HIV médiée    par les cellules CD4 est mise en évidence par la méthode de   Iymphoprolifération    en présence d'antigène du VIH.



   La prolifération des lymphocytes T CD4+ vis-à-vis du VIH est mesurée en cultivant les cellules en présence d'antigènes du VIH et en mesurant l'incorporation de thymidine   tritiée    après 7 jours de culture.



  La capacité des cellules mononucléées du sang à proliférer est vérifiée en cultivant les cellules avec un   mitogène    ou un antigène témoin (tétanique par exemple).



  Pour connaître la sous-population responsable de la prolifération, les cellules
CD4 sont purifiées sur des billes magnétiques et le test de prolifération est effectué sur cette sous-population ainsi purifiée.
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