EP1307452A1 - Utilisation de composes aromatiques polycycliques pour fabriquer des medicaments capables d'inhiber la telomerase - Google Patents

Utilisation de composes aromatiques polycycliques pour fabriquer des medicaments capables d'inhiber la telomerase

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Publication number
EP1307452A1
EP1307452A1 EP01958203A EP01958203A EP1307452A1 EP 1307452 A1 EP1307452 A1 EP 1307452A1 EP 01958203 A EP01958203 A EP 01958203A EP 01958203 A EP01958203 A EP 01958203A EP 1307452 A1 EP1307452 A1 EP 1307452A1
Authority
EP
European Patent Office
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formula
telomerase
compounds
radical
compound
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01958203A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jean-Louis Mergny
Laurent Lacroix
Marie-Paule Teulade-Fichou
Jean-Pierre Vigneron
Jean-Marie Lehn
Claude Helene
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Museum National dHistoire Naturelle
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Museum National dHistoire Naturelle
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Museum National dHistoire Naturelle filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1307452A1 publication Critical patent/EP1307452A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D471/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00
    • C07D471/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, at least one ring being a six-membered ring with one nitrogen atom, not provided for by groups C07D451/00 - C07D463/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D471/04—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the subject of the invention is the use of polycyclic aromatic compounds for manufacturing medicaments having telomerase inhibiting properties and which can be used, in particular, for the treatment of cancers.
  • the DNA of telomeres in humans consists essentially of a double strand and contains repeating motifs TTAGGG / CCCTAA.
  • the ends are single-stranded with a region 3 ′ rich in G motifs.
  • This single-stranded DNA can adopt a 4-strand structure involving G-quartets as illustrated in FIG. 1, or can form a T-loop.
  • telomerase allows the addition of these repeated DNA sequences at the end of the telomer, during cell division.
  • telomerase makes the cell immortal.
  • the cell loses 100 to 150 bases each division, which makes it quickly senescent.
  • telomeres maintained at a stable length during cell division.
  • telomerase was highly activated and that it allowed the addition of repeating motifs of telomeric sequences at the end of the telomer and therefore allowed the conservation of the length of the telomer in cancer cells. More than 85% of cancer cells show positive tests for the presence of telomerase while the vast majority of somatic cells do not have this characteristic.
  • telomerase is a very renowned target for treating cancer cells.
  • the first obvious approach to block telomerase was to use nucleotide structures (Chen. Et al., Proc. NatiL Acad. Sci. USA 1996, 93 (7), 2635-2639).
  • nucleotide structures which have been used in the prior art, mention may be made of (harninoanthraquinones (Sun et al. J. Med. Chem. 40 (14), 2113-6) or diethyloxadicarbocyanines (Wheelhouse RT et al. J. Am. Chem. Soc. 1998 (120) 3261-2)
  • Application WO 99/40087 describes the use of compounds capable of interacting with the G-quadruplex structures mentioned above. These are perylene compounds and carbocyanines containing at least seven rings including two heterocycles.
  • the invention therefore relates to the use of dibenzophenanthroline compounds for manufacturing drugs with anti-telomerase effect.
  • It also aims, according to another aspect, to provide new dibenzophenanthrolines and their use as active principle of medicaments.
  • R2 and R3, identical or different from each other, represent a hydrogen atom, or a group - CH 2 - NH - (CH 2 ) n - X, in which n is an integer of 2 at 4, and X is chosen from the radicals - NH 2 , - N (CH 3 ) 2 , a hetero cyclic radical such as the piperidyl, imidazolyl, morphohnyl radical, or a condensed heterocylic radical of the i ⁇ dole type,
  • - Z represents CH or N, each compound comprising two nitrogen at the 4 "Z" positions.
  • the invention relates in particular to the use of the compound of formula (II)
  • the compounds of formula (I) used, according to the invention, as active principles of medicaments are characterized in that they are capable of increasing the melting temperature
  • T G-quadruplex from 2 to 20 ° C at a concentration of 1 ⁇ M, in particular from 7 to 20 ° C for those of formulas (TV) to (LX). This increase in Tm was correlated with that of their anti-telomerase effect, in vitro.
  • IC 50 values of these compounds are advantageously less than 3 ⁇ M and even less than 1 ⁇ M for many of them.
  • the invention also relates, as new products, to the polycyclic aromatic compounds of formula (X)
  • - R ⁇ 3 R2 and R3, identical or different from each other, represent a hydrogen atom, or a group - CH 2 - NH - (CH 2 ) n - X, in which n is an integer from 2 to 4, and X is chosen from the radicals - NH, - N (CH 3 ) 2 , a heterocychic radical such as the piperidyl, imidazolyl, morpholinyl radical, or a condensed heterocylic radical of indole type,
  • the invention therefore also relates to pharmaceutical compositions containing a therapeutically effective amount of at least one of these new compounds in association with a pharmaceutically inert vehicle.
  • the drugs according to the invention or manufactured according to the invention are of particular interest for the treatment of cancers. They are prepared in forms suitable for the mode of administration desired for this type of treatment. They are most generally forms for oral, nasal, buccal injection, parenteral, rectal, vaginal or topical administration.
  • the drug compositions are formulated to obtain, in a conventional manner, tablets, dragees, pills, capsules, capsules and the like.
  • the dosage per unit of intake will be adapted by a person skilled in the art to obtain the desired therapeutic effect.
  • sterile or sterilizable solutions are prepared which can be administered subcutaneously, intravenously, intradermally, intramuscularly or parenterally. These solutions contain the required amount, for the desired effect, of active ingredient.
  • administrations can be carried out in 1 or more takes.
  • the other forms of administration are advantageously prepared according to the usual galenical formulations.
  • FIGS. 1 to 3 represent, respectively, FIG. 1A, a G-quartet structure and FIG. 1B an intramolecular quadruplex , - Figure 2A, the climical formulas of dibenzophenanthrolines tested as ligands of G-quartets and formula 2B, the scheme of synthesis of derivatives of dibenzophenanthrohnes according to the invention, following the protocol of Baudoin et al in JOC, 1997, 62 , 5448, FIG. 3A, the inhibition of telomerase by diphenanthrolines according to the invention and FIG. 3B, the correlation of this inhibition with the stabilization of G-quartet.
  • Materials and methods represent, respectively, FIG. 1A, a G-quartet structure and FIG. 1B an intramolecular quadruplex , - Figure 2A, the climical formulas of dibenzophenanthrolines tested as ligands of G-quartets and formula 2B, the scheme of synthesis of derivatives of
  • G-quartet ligands were carried out by fluorescence according to the FRET method (Fluorescence Resonance Energy Transfer), which corresponds to a dipole-dipole resonance interaction between two molecules close to each other, including one, the donor, transfers its excitation energy to the other molecule, or acceptor.
  • FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer
  • the formation of an intramolecular G-quartet structure must bring the 2 chromophores close enough to be able to observe an energy transfer.
  • a stock solution of oligonucleotide at the strand concentration of 0.2 ⁇ M in a 0.1 M LiCl 10 mM cacodylate buffer pH 7.6 is previously prepared, briefly heated to 90 ° C and slowly cooled to 20 ° C, then distributed in 600 ⁇ l ahquotes in the fluorescence cells. 3 ⁇ l of water (for control) or 3 ⁇ l of the product to be tested (stock at 200 ⁇ M, final concentration 1 ⁇ M) are then added and mixed. The samples are then left to incubate for at least 1 hour at 20 ° C before each measurement. The use of longer incubation times (up to 24 hours) has no influence on the result obtained.
  • the fluorescence profiles are then normahses between 20 ° C and 80 ° C, and the temperature for which the emission intensity at 515 nm is the average of those at high and low temperature is called Tm.
  • Tm the temperature for which the emission intensity at 515 nm is the average of those at high and low temperature.
  • the Tm of the reference sample without addition of product is 44 ° C. in a buffer of hthium chloride. This temperature is brought to more than 55 ° C. in the sodium chloride buffer.
  • the addition of a compound stabilizing G-quadruplex induces an increase in Tm. This increase is considered significant if it is greater than 3 ° C.
  • the anti-telomerase biological activity is determined by the following experimental protocol: Preparation of the extract enriched in human telomerase activity
  • the HL60a leukemia line is obtained from the ATCC (American Type Culture Collection, Rockville USA). The cells are cultured in suspension in iheu RPMI 1640 containing, 2 M L-Glutamine, Penicillin 200 U / ml, streptomycin 200 ⁇ g / ml, gentamycin 50 ⁇ g / ml and added with 10% fetal calf serum inactivated by heat.
  • telomerase activity is determined by a protocol for the extension of the TShgonucleotide ( 5 'AATCGTTCGAGCAGAGTT 3 '), in the presence of a cellular extract enriched in telomerase activity and of compounds which are added at different concentrations (10, 1, 0.1 and 0.1 ⁇ g / ml).
  • the extension reaction is followed by a PCR amplification of the extension products using the ohgonucleotides TS and CXext ( 5 'GTGCCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA 3 ').
  • the reaction medium is prepared according to the following composition:
  • Bovine albumin serum 0, 1 mg / ml Taq DNA polymerase 1 U / ml alpha 32 P dCTP (3000 Ci mmole) 0.5 ⁇ l
  • the ohgomicleotides are obtained from Eurogentec (Belgium) and are stored at - 20 ° C at a stock concentration of 1 mg / l in distilled water.
  • reaction samples are assembled in 0.2 ml PCR tubes and a drop of paraffin oil is placed on each of the reactions of the experiment before the tubes are closed.
  • reaction samples are then incubated in a Cetus 4800 type PCR apparatus under the following temperature conditions:
  • the samples are then analyzed by 12% acrylic gel electrophoresis in TBE IX buffer for 1 hour at a voltage of 200 volts, using a Novex electrophoresis system.
  • the acrylamide gels are then dried on a sheet of 3M Whatmann paper at 80 ° C. for 1 hour, analyzed and quantified.
  • the concentration of compound inducing a 50% inhibition of the telomerase reaction (IC 50 ) is determined using a semi-logarithmic graphical representation of the inhibition values obtained as a function of each of the concentrations of compound tested.
  • a compound is active as an anti-telomerase agent when the amount inhibiting 50% of the telomerase reaction is in particular less than 5 ⁇ M.
  • ⁇ T values are significantly lower than those obtained with most dibenzophenanthroline ligands. It will be observed in particular that the ⁇ T of hgand 5_ is + 12.5 ° C and that of ligand 13_ is + 19.7 ° C.
  • telomere test Telomerase Repeat Amphcfication Protocol
  • HL60 cell lysate As a source of telomerase, an HL60 cell lysate was used. The TRAP reaction mixture was added directly to the mixture of telomerase compound and extract. Amplification by PCR as described above was then carried out.
  • telomerase extension products were allowed to migrate on a 12% polyacrylamide gel under non-denaturing conditions.
  • FIG. 3A relates to the in vitro inhibition of telomerase by compounds l and 2, where B corresponds to tests without nuclear extracts and E, in the presence of telomerase-active nuclear extracts.
  • Compounds 1 and 2 were tested at 3 different concentrations: 0.1, let 10 ⁇ M, from right to left).
  • FIG. 3B shows the correlation between the inhibition of telomerase in vitro (Y axis, expressed in concentration necessary to obtain a 50% inhibition of telomerase activity in a standard TRAP test and the G4 stabilization (X axis, expressed in ⁇ Tm of the ohonucleotide with SEQ ID No. 1) The results correspond to an average of at least 2 independent experiments.
  • FIG. 3A shows, with particular regard to the compound
  • FIG. 3B shows the relationship between the effectiveness of the inhibition of telomerase and ⁇ Tm.
  • These cells are cultured in a Miheu MEM (Life technologies) comprising 10% of decomplemented fetal calf serum, glutamine, non-essential amino acids (1%) and antibiotics (penicillin and streptomycin).
  • the hgand is diluted in culture medium after adhesion of the cells on 96-well plates (2500 cells per well). The number of cells is estimated by the Promega "Cell titer 96 Aqueous One Solution Cell proliferation Assay" kit.
  • LTC50 measured for compound 1 is 0.5 micromixture on HeLa cells placed in the presence of compound 1 for 24 hours. A mortality of 100% is observed for concentrations of 5 micromolar or more. The toxicity of product 1 is enhanced when the cells are incubated for 96 hours in its presence (100% mortality at 0.5 micromolar).

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Abstract

L'invention vise l'utilisation de composés aromatiques capables de se lier à des structures G-quadruplex pour fabriquer des médicaments à effet anti-télomérase. Ces composés répondent à la formule (I) dans laquelle-- R1, R2 et R3, identiques ou différents l'un de l'autre, représentent un atome d'hydrogène, ou un groupe - CH2 - NH - (CH2)n - X, dans lequel n est un entier de 2 à 4, et X est choisi parmi les radicaux - NH2, - N (CH3)2, un radical hérocyclique comme le radical pipéridyle, imidazolyle, morpholinyle, ou un radical hétérocylique condensé de type indole,- Z représente CH ou N, chaque composé comportant deux azotes sur les positions "Z". Application à la fabrication de médicaments anti-cancéreux.

Description

Utilisation de composés aromatiques polycycliques pour fabriquer des médicaments capables d'inhiber la telomérase
L'invention a pour objet l'utilisation de composés aromatiques polycycliques pour fabriquer des médicaments présentant des propriétés inhibitrices de la telomérase et utilisables, en particulier, pour le traitement de cancers.
L'ADN des télomères chez l'homme est essentiellement constitué par un double brin et contient des motifs répétés TTAGGG/CCCTAA. Les extrémités sont en revanche monobrins avec une région 3' riche en motifs G. Cet ADN monobrin peut adopter une structure à 4 brins impliquant des G-quartets comme illustré sur la figure 1, ou peut former une boucle en T.
Du point de vue biologique, la telomérase permet l'ajout de ces séquences d'ADN répétées à l'extrémité du télomère, lors de la division cellulaire. Par cette action, la telomérase rend la cellule immortelle. En effet, en l'absence de cette activité enzymatique, la cellule perd à chaque division 100 à 150 bases, ce qui la rend rapidement sénescente. Lors de l'apparition de cellules cancéreuses à division rapide, il s'est avéré que ces cellules présentaient des télomères maintenus à une longueur stable au cours de la division cellulaire. Dans ces cellules cancéreuses, il est apparu que la telomérase était fortement activée et qu'elle permettait l'addition de motifs répétés de séquences télomériques à la fin du télomère et permettait donc la conservation de la longueur du télomère dans les cellules cancéreuses. Plus de 85 % des cellules cancéreuses présentent des tests positifs à la présence de telomérase alors que l'immense majorité des cellules somatiques ne présentent pas cette caractéristique.
Ainsi la telomérase est une cible très convoitée pour traiter les cellules cancéreuses. La première approche évidente pour bloquer la telomérase a consisté à utiliser des structures nucléotidiques (Chen. et al., Proc. NatiL Acad. Sci. USA 1996, 93(7), 2635-2639). Parmi les composés non nucléotidiques qui ont été utilisés dans l'art antérieur, on peut citer les (harninoanthraquinones (Sun et al. J. Med. Chem. 40(14), 2113-6) ou les diethyloxadicarbocyanines (Wheelhouse R. T. ét al. J. Am. Chem. Soc. 1998(120) 3261-2). La demande WO 99/40087 décrit l'utilisation de composés capables d'interagir avec les structures G-quadruplexes évoquées plus haut. Il s'agit des composés pérylènes et des carbocyanines contenant au moins sept cycles dont deux hétérocycles.
Les travaux des inventeurs ont montré que, de façon surprenante, des composés aromatiques à structure planaire en forme de croissant à savoir des dibenzophénanthrolines, dont certains sont connus pour leur effet stabilisateur de triplex, permettaient d'obtenir un résultat au moins équivalent avec des structures beaucoup moiαs compUquées du point de vue chimique.
Le développement de ces travaux a permis également d'élaborer de nouveaux composés aromatiques de ce type capables eux aussi de se fixer à la structure G quadruplex et présentant donc une activité inhibitrice des télomérases.
Selon l'un de ses aspects, l'invention vise donc l'utilisation de composés de dibenzophénantrolines pour fabriquer des médicaments à effet anti-télomérase.
Elle a également pour but, selon un autre aspect, de fournir de nouvelles dibenzophénantrolines et leur utilisation comme principe actif de médicaments.
L'utilisation de composés aromatiques capables de se lier à des structures G-quadruplex pour fabriquer des médicaments à effet anti-télomérase selon l'invention est caractérisée en ce que lesdits composés répondent à la formule (I)
dans laquelle
- Ri, R2 et R3, identiques ou différents l'un de l'autre, représentent un atome d'hydrogène, ou un groupe - CH2 - NH - (CH2)n - X, dans lequel n est un entier de 2 à 4, et X est choisi parmi les radicaux - NH2, - N (CH3)2, un radical hétéro cyclique comme le radical pipéridyle, imidazolyle, morphohnyle, ou un radical hétérocylique condensé de type iαdole,
- Z représente CH ou N, chaque composé comportant deux azotes sur les 4 positions "Z".
L'invention vise en particulier l'utilisation du composé de formule (II)
ou de formule (LU)
ou de formule (TV)
ou de formule (V)
ou de formule (VI)
ou de formule (Vu)
ou de formule (VTJI)
ou de formule (LX)
Les composés de formule (I) utilisés, selon l'invention, comme principes actifs de médicaments sont caractérisés en ce qu'ils sont capables d'augmenter la température de fusion
(T ) du G-quadruplex de 2 à 20°C à une concentration de lμM, notamment de 7 à 20°C pour ceux de formules (TV) à (LX). Cette augmentation de Tm a été correlée à celle de leur effet anti-télomérase, in vitro.
On observera avec intérêt que les valeurs de IC50 de ces composés sont avantageusement inférieures à 3 μM et même à 1 μM pour nombre d'entre eux.
Compte tenu des applications thérapeutiques visées, il est intéressant de noter que les composés de formule (I) présentent en outre des constantes de dissociation de l'ordre de
10"8 M et se lient donc très fortement aux structures G- quadruplexes alors que les constantes de dissociation des ligands de quadruplex connus à ce jour sont de l'ordre de 10"6 à 10"5 M.
Selon un autre aspect, l'invention vise en outre, en tant que nouveaux produits, les composés aromatiques polycycliques de formule (X)
dans laquelle - Rχ3 R2 et R3, identiques ou différents l'un de l'autre, représentent un atome d'hydrogène, ou un groupe - CH2 - NH - (CH2)n - X, dans lequel n est un entier de 2 à 4, et X est choisi parmi les radicaux - NH , - N (CH3)2, un radical heterocychque comme le radical pipéridyle, imidazolyle, morpholinyle, ou un radical hétérocylique condensé de type indole,
L'étude de ces produits, selon les tests rapportés dans les exemples, a montré qu'ils sont capables de stabihser les structures G- quadruplexes des télomères et sont utihsables en conséquence pour l'élaboration de médicaments à effet anti-télomérase, en particuher de médicaments anti-tumoraux.
L'invention vise donc également des compositions pharmaceutiques renfermant une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins l'un de ces nouveaux composés en association avec un véhicule pharmaceutiquement inerte.
Les médicaments selo rinvention ou fabriqués selon l'invention présentent un intérêt tout particuher pour le traitement de cancers. Ils sont élaborés sous des formes appropriées pour le mode d'administration souhaité pour ce type de traitement. H s'agit le plus généralement de formes pour une administration par voie orale, nasale, buccale injectable, parentérale, rectale, vaginale ou topique.
Pour l'administration par voie orale, on formule les compositions de médicaments pour obtenir, de manière classique, des comprimés, dragées, pilules, gélules, capsules et analogues. La posologie par unité de prise sera adaptée par l'homme du métier pour obtenir l'effet thérapeutique souhaité. Pour l'administration par voie injectable, on prépare des solutions stériles ou stérilisables acrministrables par voie sous- cutanée, intraveineuse, intradermique, intramusculaire ou parentérale. Ces solutions renferment la quantité requise, pour l'effet souhaité, de principe actif.
Ces administrations peuvent être effectuées en 1 ou plusieurs prises. Les autres formes d'administration sont avantageusement préparées selon les formulations galéniques habituelles.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent dans lesquels il sera fait référence aux figures 1 à 3, qui représentent , respectivement, la figure 1A, une structure G-quartet et la figure 1B un quadruplex intramoléculaire, - la figure 2A, les formules clrimiques de dibenzophénanthrolines testées comme ligands de G-quartets et la formule 2B, le schéma de synthèse de dérivés de dibenzophénanthrohnes selon l'invention, en suivant le protocole de Baudoin et al dans J.O.C., 1997, 62, 5448, la figure 3 A, l'inhibition de la telomérase par des diphénanthrolines selon l'invention et la figure 3B, la corrélation de cette inhibition avec la stabilisation de G-quartet. Matériels et méthodes
Oligonucléotides
Tous les oligonucléotides, modifiés ou non, ont été synthétisés par Eurogentec S.A.,
Seraing, Belgique. Poux les études de fluorescence, on attache une molécule de fluorésceine à l'extrémité 5' de l'ohgonucleotide utilisé, et une molécule de la tétraméthyhhodamine à son extrémité 3'. La concentration des échantillons est vérifiée par spectrophotométrie, en enregistrant le spectre d'absorbance entre 220 et 700 nxn et en utihsant le coefficient d'extinction molaire communiqué ar le fournisseur.
Dib enzophénanthrolines La synthèse des composés de 1 à 6 a été effectuée comme décrit par Baudoin et al dans
Chemistry : a European Journal 4, 1504-1508 (1998). Le composé 7, à savoir la 6-[2-(ρipéridin- l-yl)émyl)ammométhyl]dibenzo[èJ]4,7]ρhénanthrolirιe a été synthétisée selon le protocole décrit pour les composés 2 et 3 par Baudoin et al, J. Org. Chem, 62, 5458-5470 (1997). Les composés 8 à 12 ont été également synthétisés selon ce protocole (voir schéma de synthèse sur la figure 2B).
Tampons
Toutes les expériences ont été réalisées dans un tampon cacodylate de sodium 10 mM pH 7,6 contenant 0,1 M de chlorure de hthiu (ou de chlorure de sodium). L'absence de contamination fluorescente dans le tampon a été préalablement vérifiée. L'oligonucléotide fluorescent est ajouté à la concentration finale de 0,2 μM.
Méthode FRET
L'identification de ligands de G-quartets a été réalisée par fluorescence selon la méthode FRET (Fluorescence Résonance Energy Transfer), qui correspond à une interaction de résonance dipôle-dipôle entre deux molécules proches l'une de l'autre, dont l'une, le donneur, transfère son énergie d'excitation à l'autre molécule, ou accepteur. La formation d'une structure G-quartet intramoléculaire doit rapprocher suffisamment les 2 chromophores pour pouvoir observer un transfert d'énergie.
Etudes de fluorescence
Toutes les mesures de fluorescence ont été effectuées sur un appareil Spex Fluorolog DMIB, en utihsant une largeur de raie d'excitation de 1,8 mn et une largeur de raie d'émission de 4,5 nm. Les échantillons sont placés dans une cuvette en quartz micro de 0,2 x 1 cm. La température de l'échantiïïon est contrôlée par un bain-marie extérieur. L'ohgonucleotide seul a été analysé à 20, 30, 40, 50, 60, 70 et 80°C. Les spectres d'émission sont enregistrés en utihsant une longueur d'onde d'excitation de 470 nm. Les spectres d'excitation sont enregistrés en utihsant soit 515 nm, soit 588 nm comme longueur d'onde d'émission. Les spectres sont corrigés de la réponse de l'instrument par des courbes de référence. Une extinction importante (80-90 %) de la fluorescence de la fluoresceine à température ambiante est observée, en accord avec un reph intramoléculaire de l'ohgonucleotide à 20°C sous forme d'un G-quadruplex, ce qui induit une juxtaposition de ses extrémités 5' et 3', respectivement hées à la fluoresceine et à la tétraméthyhhodamine (ta ra en abrégé). Cette juxtaposition entraîne un phénomène déjà décrit, d'extinction de fluorescence du donneur par FRET, et une émission sensibilisée de l'accepteur. Tm en fluorescence
Une solution stock d'oligonucléotide à la concentration en brin de 0,2 μM dans un tampon 0,1 M LiCl 10 mM cacodylate pH 7,6 est préalablement préparée, chauffée brièvement à 90°C et refroidie lentement à 20°C, puis distribuée par ahquotes de 600 μl dans les cuves de fluorescence. 3 μl d'eau (pour le contrôle) ou 3 μl du produit à tester (stock à 200 μM, concentration finale 1 μM) sont alors ajoutés et mélangés. Les échantillons sont alors laissés à incuber pendant au moins 1 heure à 20°C avant chaque mesure. L'utilisation de temps d'incubation plus longs (jusqu'à 24 heures) n'a pas d'influence sur le résultat obtenu.
Chaque expérience ne permet que la mesure d'un seul échantillon. Celui-ci est d'abord incubé à une température initiale de 20°C, porté à 80°C en 40 minutes, laissé 5 minutes à 80°C, puis refroidi à 20°C en 62 minutes. Durant ce temps, la fluorescence est mesurée simultanément à deux longueurs d'onde d'émission (515 nm et 588 nm) en utihsant 470 nm comme longueur d'onde d'excitation. Une mesure est effectuée toutes les 30 secondes. La température du bain-marie est enregistrée en parallèle, et le profil de fluorescence en fonction de la température est reconstitué à partir de ces valeurs. Les profils de fluorescence sont ensuite normahses entre 20°C et 80°C, et la température pour laquelle l'intensité d'émission à 515 nm est la moyenne de celles à haute et basse température est appelée Tm. Dans ces conditions, le Tm de l'échantillon de référence sans addition de produit est de 44°C dans un tampon de chlorure de hthium. Cette température est portée à plus de 55°C dans le tampon de chlorure de sodium. L'addition d'un composé stabilisant le G-quadruplex induit une augmentation du Tm. Cette augmentation est jugée significative si elle est supérieure à 3°C. L'activité biologique anti-télomérase est déterminée par le protocole expérimental suivant : Préparation de l'extrait enrichi en activité telomérase humaine
La lignée de leucémie HL60 a est obtenue auprès de l'ATCC (American Type Culture Collection, Rockville USA). Les cellules sont cultivées en suspension dans du iheu RPMI 1640 contenant, L-Glutamine à 2 M, Pénicilline 200 U/ml, streptomycine 200 μg/ml, gentamycine 50 μg/ml et additionnées de 10 % de sérum fœtal de veau inactivé par la chaleur.
Une ahquote de 10 cellules est centrifugée à 3000xG et le surnageant écarté. Le culot de cellules est re-suspendu par plusieurs pipetages successifs dans 200 μl de tampon de lyse contenant CHAPS 0.5 %, Tris-HCl pH 7,5 10 mM, MgCl2 1 mM, EGTA 1 mM, β- mercaptoethanol 5 mM, PMSF 0.1 mM et glycérol 10 % et est conservé dans la glace pendant 30 minutes. Le lysat est centrifugé à 16 OOOxG pendant 20 minutes à 4°C et 160 μl de surnageant est récupéré. Le dosage des protéines de l'extrait est effectué par la méthode de Bradford. l'extrait est conservé à -80°C. Dosage de l'activité telomérase L'inhibition de l'activité telomérase est déterminée par un protocole d'extension de l'ohgonucleotide TS (5'AATCGTTCGAGCAGAGTT3'), en présence d'un extrait cellulaire enrichi en activité telomérase et des composés qui sont ajoutés à différentes concentrations (10, 1, 0,1 et 0,1 μg/ml). La réaction d'extension est suivie d'une amplification PCR des produits d'extension à l'aide des ohgonucléotides TS et CXext (5' GTGCCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA 3').
Le miheu réactionnel est préparé selon la composition suivante :
Tris HClpH 8,3 20 mM
MgCl2 1,5 mM
Tween 20 0,005 % (P/V) EGTA 1 mM dATP 50 μM dGTP 50 μM dCTP 50 μM dTTP 50 μM Oligo ucléotide TS 2 μg/ml
Ohgonucléotide CXext 2 μg/ml
Sérum Albumine bovine 0, 1 mg/ml Taq DNA polymérase 1 U/ml alpha 32P dCTP (3000 Ci mmole) 0.5 μl
Extrait telomérase 200 ng sous un volume de 10 μl
Produit à tester ou solvant sous un volume de 5 μl Eau bi-distillée QD 50 μl
Les ohgomicléotides sont obtenus auprès d'Eurogentec (Belgique) et sont conservés à - 20°C à une concentration stock de 1 mg/ l dans de l'eau distillée.
Les échantillons réactionnels sont assemblés dans des tubes à PCR de 0.2 ml et une goutte d'huile de paraffine est déposée sur chacune des réactions de l'expérience avant la fermeture des tubes.
Les échantillons réactionnels sont ensuite incubés dans un appareil à PCR de type Cetus 4800 selon les conditions de températures suivantes :
15 minutes à 30°C,
1 minute à 90°C, suivis de 30 cycles de,
30 secondes à 94°C,
30 secondes à 50°C, et 1 minute 30 secondes à 72°C, suivis d'un cycle final de 2 minutes à 72°C. Pour chacun des échantillons, une ahquote de 10 μl est pipettée sous la couche d'huile et mélangée avec 5 μl d'un tampon de dépôt contenant :
TBE 3X glycérol 32 % (P/V)
Bleu de bromophénol 0.03 % Xylène cyanol 0.03 %
Les échantillons sont ensuite analysés par électrophorèse en gel d'acryla ide 12 % dans un tampon TBE IX pendant 1 heure sous une tension de 200 volts, à l'aide d'un système d' électrophorèse Novex.
Les gels d'acrylamide sont ensuite séchés sur une feuille de papier whatmann 3 MM à 80°C pendant 1 heure, analysés et quantifiés
Pour chaque concentration de composé testée, les résultats sont exprimés en pourcentage d'inhibition de la réaction et calculés à parth du contrôle enzymatique non traité et de l'échantillon sans enzyme (blanc) selon la formule suivante : (Valeur Composé - valeur blanc / Valeur contrôle enzymatique - valeur blanc) x 100.
La concentration de composé induisant une inhibition de 50 % de la réaction telomérase (IC50) est déterminée à l'aide d'une représentation graphique semi logarithmique des valeurs d'irihibition obtenues en fonction de chacune des concentrations de composé testée.
On considère qu'un composé est actif en tant qu'agent anti-télomérase lorsque la quantité inhibant 50 % de la réaction telomérase est notamment inférieure à 5 μM. Ligands G-4 spécifiques
Dans les essais dont les résultats rapportés ci-après, on a utilisé deux oligonucléotides de séquences SEQ ID N°l et SEQ ID N°2, substitués en 5' par un groupe fluoresceine (fluo en abrégé) et en 3' par un groupe tamra, répondant aux séquences suivantes : fluo-GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-tamra, fluo-TTGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-tamra
13 composés de dibenzophénanthro nes ont été testés. Leurs formules sont données sur la figure 2A.
On compare les composés 1 à 7 à une concentration en colorant de lμM. Les résultats sont résumés dans le tableau 1.
Composés ΔTm G4(FRET)(°C) IC50 Telomérase ΔTm triplex3 lμM colorant (μM) 15 μM colorant
1 +11,5 0,3 20 2 +5,5 1,45 37 3 +9,5 0,75 44
4 +11,5 1,0 18
5 +12,5 0,5 7
6 +10 0,9 16
7 +2,5 2,0 n.d.
8 +15 0,46
9 +10,5 0,95
10 +8,4 n.d.
11 +18 0,13
12 +7 0,48
13 +19,7 0:028 a) valeurs déduites des observations rapportées par Baudoin et al dans Chemistry cité ci-dessus. Ces résultats corifrment la haison des composés de dibenzophénan hrohnes à l'ADN quadruplex.
Dans des conditions identiques, la tétra [N-méthylpyridyl] porphyrine et une dianthraquinone 2,6-disubstituée donnent des stabilisations d'environ 4°C.
Ces valeurs de ΔT sont significativement plus faibles que celles obtenues avec la plupart des ligands de dibenzophénanthrolines. On observera en particuher que la ΔT du hgand 5_est de +12,5°C et celle du ligand 13_est de +19,7°C.
L'effet de ΔTm a été comparé à l'efficacité d'inhibition de la telomérase. On a réahsé un essai TRAP (Telomérase Repeat Amphcfication Protocol) sur les composés là 7_dans des conditions identiques, en opérant selon Krupp et al Nucleic Acids Res. 25, 919-921 (1997). Comme source de telomérase, on a utilisé un lysat de cellules HL60. Le mélange réactionnel TRAP a été ajouté directement au mélange de composé et d'extrait de telomérase. Une amplification par PCR comme décrit ci-dessus a ensuite été effectuée.
Les produits d'élongation de la telomérase ont été mis à migrer sur un gel de polyacrylamide à 12% en conditions non dénaturantes.
La figure 3A se rapporte à l'inhibition in vitro de la telomérase par les composés l et 2, où B correspond à des tests sans extraits nucléaires et E, en présence d'extraits nucléaires télomérase-actifs. Les composés 1 et 2 ont été testés à 3 concentrations différentes: 0,1, let 10 μM, de la droite vers la gauche).
La figure 3B dorme la corrélation entre l'inhibition de la telomérase in vitro (axe Y, exprimée en concentration nécessaire pour obtenir une inhibition de 50% de l'activité telomérase dans un essai standard TRAP et la stabilisation G4 (axe X, exprimée en ΔTm de l'ohgonucleotide avec SEQ ID N°l). Les résultats correspondent à une moyenne d'au moins 2 expériences indépendantes.
L'examen de la figure 3A montre, en ce qui concerne tout particulièrement le composé
L, que des concentrations croissantes conduisent à la disparition des bandes de plus faible mobilité, correspondant aux produits d'élongation de la telomérase. On constate que le composé 2 inhibe également la telomérase. Les résultats donnés dans le tableau 1 sont illustrés par la figure 3B qui montre le rapport entre l'efficacité de l'inhibition de la telomérase et ΔTm.
On constate que les composés qui inhibent efficacement la telomérase in vitro, tout spécialement les composés 1, 3, 4, 5, 6 et 13. stabihsent tous la structure G-quartet de plus de
9°C. Les composés 2 et 7 présentent des valeurs de IC50, respectivement de 1,4 et 2 μM.
Effet antiprolifératif de composés de dibenzophénantrolines
Des cellules de lignées cancéreuses sont mises à incuber pendant 3 jours en présence de différentes concentrations du composé 1.
La cytotoxicité du composé 1, le plus actif sur la telomérase, a été testée sur la lignée tumorale humaine humaine HeLa.
Ces cellules sont cultivées dans un Miheu MEM (Life technologies) comprenant 10% de sérum de veau fétal décomplémenté, de la glutamine, des acides aminés non essentiels (1%) et des antibiotiques (pénicilline et streptomycine). Le hgand est dilué au miheu culture après adhésion des cellules sur des plaques 96 puits (2500 cellules par puits). Le nombre de cellules est estimé par le kit "Cell titer 96 Aqueous One Solution Cell prolifération Assay" de Promega.
Chaque mesure a été effectuée en quadruphcate. Les cellules sont laissées en présence du composé pendant 1 à 4 jours, puis comptées. LTC50 mesurée pour le composé 1 est de 0,5 micromolaixe sur les cellules HeLa mises en présence du composé 1 pendant 24 heures. Une mortalité de 100 % est observée pour des- concentrations de 5 micromolaires ou plus. La toxicité du produit 1 est renforcée lorsque les cellules sont incubées pendant 96 heures en sa présence (100 % de mortalité à 0.5 micromolaires).

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation de composés aromatiques capables de se her à des structures G-quadruplex pour fabriquer des médicaments à effet anti-télomérase, caractérisée en ce que lesdits composés répondent à la formule (I)
dans laquelle
- - Ri, R2 et R3, identiques ou différents l'un de l'autre, représentent un atome d'hydrogène, ou un groupe - CH2 - NH - (CH2)n - X, dans lequel n est un entier de 2 à 4, et X est choisi parmi les radicaux - NH2, - N (CH3)2, un radical heterocychque comme le radical pipéridyle, - imidazolyle, morpholinyle, ou un radical hétérocyhque condensé de type indole,
- Z représente CH ou N, chaque composé comportant deux azotes sur les positions "Z".
2. Utilisation selon la revendication 1 d'un dérivé de formule (LI)
de formule (JTI)
ou de formule (IV)
ou de formule (V)
ou de formule (VI)
ou de formule (Vu)
de formule (Vffl)
de formule (LX)
3. Nouvelles α^benzophénanthrolines, caractérisées en ce qu'elles répondent à la formule (IV)
dans laquelle R et R3 sont identiques et représentent un groupe -CH2-NH-(CH2)n-X, dans lequel n est un entier de 2 à 4, et X est choisi parmi les radicaux -NH2, N(CH3)2, un hérocychque comme le radical pipéridyle, imidazohyle, ou un radical hétérocyhque condensé de type indole.
4. Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un composé selon la revendication 3, en association avec un véhicule pharmaceutiquement inerte.
5. Utihsation de composés de formule I selon la revendication 1, pour fabriquer des médicaments pour une administration par voie orale, nasale, buccale, injectable, parentérale, rectale, vaginale ou topique.
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