EP1278539A1 - Proteine omp associee a un lysat de cellules tumorales autologues et/ou heterologues - Google Patents
Proteine omp associee a un lysat de cellules tumorales autologues et/ou heterologuesInfo
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- EP1278539A1 EP1278539A1 EP01931780A EP01931780A EP1278539A1 EP 1278539 A1 EP1278539 A1 EP 1278539A1 EP 01931780 A EP01931780 A EP 01931780A EP 01931780 A EP01931780 A EP 01931780A EP 1278539 A1 EP1278539 A1 EP 1278539A1
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Classifications
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Definitions
- the invention relates to a pharmaceutical composition
- a pharmaceutical composition comprising an Omp membrane protein, in particular an OmpA membrane protein of Klebsiella pneumoniae, associated with a lysate of autologous and / or heterologous tumor cells as well as the use of these compositions for the prevention and treatment cancer.
- Vaccination is an effective way to prevent or reduce viral or bacterial infections.
- the success of vaccination campaigns in these fields has made it possible to extend the concept of vaccine previously used in the field of infectious diseases to the fields of cancer and autoimmune diseases.
- Vaccine antigens administered alone in the host are often not immunogenic enough to induce an immune response, and must therefore be combined with an adjuvant or coupled to a carrier protein to induce (or increase) their immunogenicity. Under these conditions, only a humoral type immune response can be induced.
- CTL cytotoxic T lymphocytes
- CTL epitope peptide sequences interacting with Let class molecules presented to CD8 + T lymphocytes
- the difficulty lies in the generation of CTL in vivo, due to the low immunogenicity of these peptides (Melief, 1992, Adv. Cancer Res., 58, 143-175; Nandaz and Sercaz, 1995, Cell, 82, 13- 17).
- dendritic cells for example, have been used to generate CTL anticancer responses (Nestlé FO et al., 1998, Nat. Med., 4, 328-332).
- the approaches consisted of loading the dendritic cells ex vivo with the antigen of interest (peptides or cell lysate) and re-implanting these cells in the patient.
- Other approaches consist in transfecting the dendritic cells ex vivo with the gene coding for the antigen of interest and in reinjecting these transfected cells (Gilboa E. et al., 1998, Cancer Immunol. Immunother., 46, 82-87 ).
- an anti-tumor vaccination carried out with peptides corresponding to CTL epitopes and in the presence of such an adjuvant can lead to a specific state of tolerance which can lead in certain cases to the desired opposite effect, that is to say to a decrease in the immune response (Toes et al., Proc. ⁇ at. Acad. Sci., USA, 1996, 93, 7855-7860).
- the international patent application published on April 5, 1990 under the number WO 90/03183 describes immunotherapeutic vaccines comprising antigens originating from melanoma cell lysates, an adjuvant, called “DETOX” consisting of a detoxified endotoxin of the monophosphoryl lipid A type. (MPL) derived from Sahnonella minnesota and a carrier derived from the cell envelope of Mycobacterium bovis, strain BCG.
- MPL monophosphoryl lipid A type.
- MPL monophosphoryl lipid A type.
- the possible side effects of DETOX and of BCG derivative used in immunotherapeutic vaccines are known to those skilled in the art.
- the object of the present invention consists of new and improved immunotherapeutic compositions which in particular have the advantage of:
- an Omp protein such as the P40 protein of Klebsiella pneumoniae
- a lysate of autologous and / or heterologous tumor cells preferably without recourse to the addition of an adjuvant or a carrier, had the advantages mentioned above.
- the present invention relates to a pharmaceutical composition
- a pharmaceutical composition comprising in an acceptable pharmaceutical medium at least one Omp protein, or one of its fragments, associated with a lysate of autologous and / or heterologous tumor cells.
- Proteins derived from said Omp protein whose amino acid sequence exhibits homology, as defined below, of at least 80%, preferably 85%, 90%, 95% and 99%, after optimal alignment with the sequence of the reference Omp protein and which are capable of generating or increasing a CTL and / or anti-tumor response can also be used as Omp protein in the pharmaceutical compositions according to the present invention.
- the term “protein” will also be understood to denote the peptides or polypeptides and the term “Omp” (for “Outer Membrane Protein”), the proteins of the outer membrane.
- Omp the OmpA, the porines (in particular the OmpC and F) and the OmpX of E. coli.
- the Omp is chosen from among. OMP of Enterobacteriaceae.
- the Omp is chosen from OmpA, namely the proteins of the external membrane of type A, and more particularly those of Klebsiella pneumoniae. Even more preferably, the one called P40 will be used as described in patents WO 95/27787 and WO 96/14415.
- the term “fragment of an Omp protein” is intended to denote in particular any fragment of the amino acid sequence included in the amino acid sequence of the Omp protein which is capable of generating or increasing a CTL and / or anti-tumor response, said fragment Omp protein comprising at least 5 amino acids, preferably at least 10 amino acids or more preferably at least 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75 and 100 consecutive amino acids of the sequence of said Omp protein .
- composition according to the invention comprises an Omp protein or one of its fragments according to the invention, characterized in that said Omp protein, or one of its fragments, is obtained by a process extraction from a culture of said enterobacterium.
- the composition according to the invention comprises an Omp protein or one of its fragments, characterized in that said Omp protein or one of its fragments, is obtained by recombinant route.
- Omp protein or one of its fragments is obtained by recombinant route.
- Omp proteins obtained by the recombinant route are particularly well defined, and can thus be used and marketed for administration in humans more easily and quickly, in particular for reasons of marketing authorization.
- the Omp protein used in the compositions according to the invention is the OmpA protein from Klebsiella pneumoniae.
- the invention relates to the use in the compositions according to the invention, of the amino acid sequence of said OmpA protein of Klebsiella pneumoniae, or one of its fragments, which comprises: a) the sequence of amino acids of sequence SEQ ID ⁇ ° 1; b) the amino acid sequence of a sequence having a homology of at least 80%, preferably 85%, 90%, 95% and 99%, after optimal alignment with the sequence SEQ ID No. 1; or c) the amino acid sequence of a fragment of at least 5 amino acids, preferably 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75 and 100 amino acids, of a sequence as defined in a).
- nucleic acid or amino acid sequence having a homology of at least 80% after optimal alignment with a determined nucleic acid or amino acid sequence is meant a sequence which after optimal alignment with said determined sequence includes a percentage identity of at least 80% with said determined sequence.
- percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences within the meaning of the present invention is meant a percentage of identical nucleotides or amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed randomly and over their entire length.
- Sequence comparisons between two nucleic acid or amino acid sequences are traditionally carried out by comparing these sequences after having optimally aligned them, said comparison being carried out by segment or by "comparison window” to identify and compare the regions. sequence similarity locale.
- Optimal alignment of sequences for comparison can be carried out, in addition to manually, using the local homology algorithm of Smith and Waterman (1981) [Ad. App.
- the percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences is determined by comparing these two optimally aligned sequences per comparison window in which the region of the nucleic acid or amino acid sequence to be compared. may include additions or deletions with respect to the reference sequence for optimal alignment between these two sequences.
- the percentage of identity is calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide or the amino acid residue is identical between the two sequences, by dividing this number of identical positions by the total number of positions in the comparison window. and multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage of identity between these two sequences.
- BLAST 2 sequences available on the site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, the parameters used being those given by default (in particular for the parameters “open gap penaltie”: 5, and “extension gap penaltie”: 2; the chosen matrix being for example the “BLOSUM 62” matrix proposed by the program), the percentage of identity between the two sequences to be compared being calculated directly by the program.
- sequences having a homology of at least 80% with the reference Omp sequence, or among the amino acid sequences of fragment of reference Omp sequence it is preferred:
- - the peptide sequences capable of inducing CTL activity (Cytotoxic T Lymphocytes), as it can be evaluated with a standard method for measuring CTL activity based for example on the measurement of percentage of specific lysis of co- incubated with effector lymphocytes from animals immunized with a peptide derived from the reference Omp sequence associated with a relevant peptide; and or
- said homologous peptides or said Omp fragments will be capable of inducing a CTL activity and / or of generating or increasing an antitumor activity at least equal to 10%, preferably 20%, 30%, 50% and 75% of the activity measured under the same conditions for the reference Omp sequence.
- the other essential element of the pharmaceutical compositions according to the invention relates to a lysate of autologous and / or heterologous tumor cells.
- autologous tumor cells means tumor cells belonging to the subject who will receive the compositions according to the invention.
- heterologous tumor cells should be understood to mean cells originating from tumors originating from an individual different from that for which the composition according to the invention is intended.
- the use of heterologous cells makes it possible to obtain pharmaceutical compositions which make it possible in particular to treat patients suffering from cancer from whom the removal of tumor cells is not possible.
- the use of heterologous cells also makes it possible to obtain standardized compositions according to the invention comprising antigens found in many types of cancer and thus usable in a majority of patients.
- Tumor cells can be obtained from a sample of cancerous tissue, for example following a biopsy or surgical resection.
- a cell lysate can be defined within the meaning of the present invention as a mixture of intracellular and / or membrane antigens, preferably intracellular and membrane.
- lysates of tumor cells forming part of the pharmaceutical composition according to the invention
- tumor cells expressing an associated tumor antigen particular preference is given to tumor tumor cells originating from cancers with tumor cells expressing an associated tumor antigen, as mentioned below.
- Said autologous and / or heterologous tumor cell lysate according to the invention can be obtained by mechanical, chemical or enzymatic lysis of tumor cells.
- freeze / thaw In order to lyse the cells mechanically, mention may in particular be made of the techniques known to those skilled in the art, namely in particular sonication, ultrasonication or freezing / thawing. Particularly preferred is freeze / thaw, and most particularly the use of multiple freeze / thaw cycles.
- the cells can also be lysed using chemical compounds or enzymes, such as for example digitonin lysis buffer, triton X-100 or Nonidet P40. Any method of breaking the cell membrane of tumor cells can be used to obtain a lysate.
- chemical compounds or enzymes such as for example digitonin lysis buffer, triton X-100 or Nonidet P40. Any method of breaking the cell membrane of tumor cells can be used to obtain a lysate.
- the pharmaceutical composition according to the invention can also comprise a cytokine or a growth factor, in particular alpha or gamma interferon, TNF, GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor), IL-2, IL-4, IL-6 and IL-18, an HSP (Heat Shock Protein) such as for example hs ⁇ 70, hs ⁇ 90, hs ⁇ 96, which makes it possible to potentiate the immune response, and / or fibroblasts genetically engineered to release a cytokine or growth factor. Mention may be made of fibroblasts expressing GM-CSF sold by the company Immune Response Corporation.
- the compositions according to the invention can also contain antigen presenting cells. The latter can be chosen in particular from macrophages, B lymphocytes or dendritic cells and preferably from macrophages.
- Antigen presenting cells can be obtained by in vitro production from stem cells from human blood or spinal cord (see
- macrophages humans obtained from blood mononuclear cells preferably isolated from the patient to be treated.
- the number of macrophages can be increased using M-CSF (Macrophage Colony Stimulating Factor).
- the use of antigen presenting cells is optional in the present invention.
- the invention also relates to compositions according to the invention without antigen presenting cells allowing a therapeutic treatment which does not require ex vivo manipulation of antigen presenting cells and whose implementation is thus easier and more simplified and not having the possible disadvantages of those using antigen presenting cells.
- compositions according to the invention can also comprise an adjuvant making it possible to increase the immune response, in particular chosen from the group of adjuvant comprising Qs21 (mixture of saponins marketed by the company
- Leif Leishmania major Initiation Factor marketed by the company Corixa
- CT cholera toxin
- LT LT for “Heat labile enterotoxin”, just like the detoxified versions of CT or the LT.
- composition according to the invention is characterized in that it contains no other adjuvant making it possible to increase the immune response such as those mentioned above, apart from said Omp protein, in particular said enterobacterium OmpA protein , or one of its fragments.
- the pharmaceutically acceptable medium is the medium in which the compounds of the invention are administered, preferably a medium injectable into humans. It can for example consist of water, an aqueous saline solution or an aqueous solution based on dextrose and or glycerol.
- composition according to the invention also contains a detergent.
- compositions according to the invention can also contain a detergent, and in particular any type of pharmaceutically acceptable surfactant, such as for example anionic, cationic, nonionic or amphoteric surfactants.
- a detergent such as for example anionic, cationic, nonionic or amphoteric surfactants.
- the invention also relates to the compositions according to the invention, characterized in that they are conveyed in a form which makes it possible to ensure and / or improve their stability, and thus also comprise, for example, vectors making it possible to ensure and / or to improve the stability of the Omp protein association or one of its fragments and of the lysate of autologous and / or heterologous tumor cells, in particular the vectors chosen from liposomes, virosomes, nanospheres, microspheres or microcapsules.
- the invention also includes the use of an Omp protein or a fragment thereof associated with a lysate of autologous and / or heterologous tumor cells for the preparation of a pharmaceutical composition intended to generate or enhance an immune response against a tumor cell.
- the Omp protein or one of its fragments is used in combination with a lysate of autologous tumor cells for the preparation of a pharmaceutical composition intended to generate or increase an immune response against said cell autologous tumor.
- the use according to the invention relates to the preparation of a pharmaceutical composition intended for preventing or treating cancers, preferably cancers associated with a tumor antigen.
- pancreatic adenocarcinoma (Hammel et al., 1998, Eur. J. Gastroenterol. Hepatol., 10: 345-8);
- Another subject of the invention is the use of an Omp protein or of a fragment thereof associated with a lysate of autologous and / or heterologous tumor cells for the preparation of a pharmaceutical composition intended for inhibiting the growth of tumors .
- compositions according to the invention consist in particular in:
- tumor cells - optionally and not preferably to carry out primary or secondary cultures of said tumor cells;
- compositions according to the invention with adequate concentrations of protein Omp or one of its fragments and lysate of tumor cells;
- compositions comprising for example from 0.01 to 50 mg, and preferably from 0.1 to 25 mg of cell lysate, and from 0.1 to 50 mg, and preferably from 1 to 25 mg of Omp.
- the Lysat / Omp ratio can be between 1/2 and 1/10, and preferably between 1/5 and 1/8.
- antigen presenting cells When antigen presenting cells are used, these are incubated in vitro with the Omp protein, or a fragment thereof, associated with a lysate of autologous and / or heterologous tumor cells. They could for example be incubated at 37 ° C for a period of between 5 minutes and 24 hours.
- the amounts and concentrations of antigen presenting cells to be used are those described in the prior art. We can thus use for example 10 7 antigen presenting cells per ml.
- the antigen presenting cells brought into contact with the Omp protein, or a fragment thereof, associated with a lysate of autologous and / or heterologous tumor cells are then injected into the patient, preferably the patient from which they originated. Depending on the patient's physical condition, for example, 10 6 to 10 12 antigen presenting cells may be injected.
- the subject of the invention is also a device suitable for implementing the above-mentioned therapeutic method, such as for example a kit, comprising at least the Omp and the means necessary to prepare the compositions according to the invention, such as for example a protocol, a pharmaceutically acceptable medium or a lysis buffer.
- this device may also contain these cells, preferably purified.
- the subject of the invention is a method for detecting tumor antigens, characterized in that it consists in:
- the first step of this process consists in mixing the tumor extracts with proteins or fragments of Omp, in particular in the quantities and proportions mentioned above. Prior to this step, it is possible to modify the Omp or their fragment so as to make them suitable for the step of isolating the Omp-antigen complexes, it is for example possible to biotinylate the Omp.
- an affinity chromatography column can be used, then by carrying out successive elutions, the tumor antigens will be separated and isolated.
- Conventional techniques are then used to identify said antigens, such as, for example, the sequencing of said antigens by techniques known to those skilled in the art using mass spectrometry, a Maldi-Tof and bioinformatics.
- the legends of the figures and examples which follow are intended to illustrate the invention without in any way limiting its scope.
- Figure 1 Measurement of tumor volume following immunization with a B16.F10 lysate with or without P40.
- Figures 2A and 2B Measurement of the percentage of eyes with pathology (Figure 2A) and the degree of pathology (Figure 2B) in TRP / Tag mice following immunization with an eye lysate with or without P40. Degree 0: no visible pathology; Degree 1: moderate pathology; Degree 2: severe pathology.
- Figures 3A and 3B SDS-PAGE gel showing the fractions of the mixtures of the lysate of B16.F10 with P40-biotin ( Figure 3 A) or TT-biotin ( Figure 3B) eluted with detergent from a streptavidin-sepharose column (' TT 'for Tetanus Toxoid).
- 2,500 melanoma B16.F10 cells were implanted subcutaneously on day 0 in C57BL / 6 mice, from which the B16.F10 cells were originally derived. Also on day 0, the C57BL / 6 mice were immunized subcutaneously at the base of the tail with P40 (350 ⁇ g) mixed with a lysate of 10 B16.F10 cells (ground with a Dounce homogenizer, sonicated and passed over nylon screen) or with lysate alone. A second immunization 10 days apart from the first was also done using the same injection method. From day 18 post-implantation, the volume of the subcutaneous tumor was measured.
- TRP / Tag mice develop tumors in the eyes, which can therefore be easily seen.
- a mixture of P40 (350 ⁇ g) and tumor eye lysate (ground with a Dounce homogenizer, sonicated and passed through a nylon sieve) or lysate alone were injected subcutaneously at the base of the tail in TRP / Tag mice at 4 weeks of age. The frequency and severity of eye tumors were measured daily.
- the biotinylation of the P40 or TT proteins is carried out in a mixture containing 340 ⁇ l of P40 or TT at 6 milligrams (mg) / ml, 100 ⁇ l of NaHCO3, 0.5 Mole / liter (M), pH 8.5, 100 ⁇ l of S-NHS biotin (2 mg / ml) and 460 ⁇ l of ultra pure water.
- the mixture is then placed for 2 hours (h) at 4 ° C in order to stop the biotinylation reaction and is then dialyzed overnight against PB S in dialysis cassettes at room temperature with magnetic stirring in order to remove the biotin in excess.
- the P40 biotin (2 mg / ml) + lysate (0.9 x 10 6 cells per ml) or TT biotin (2 mg / ml) + lysate (0.9 x 10 6 cells per ml) mixture is dialyzed in a cassette dialysis against ultra pure water overnight, at room temperature, with magnetic stirring. This step makes it possible to promote the hydrophobic interactions between P40 and the lysate. TT serves as a negative control.
- the support used for this chromatography low pressure affinity is an analytical column with a stationary phase of high performance sepharose-streptavidin previously saturated with BSA in order to eliminate all artefactual interactions.
- the samples used are either P40 biotin + lysate or TT biotin + lysate obtained after the dialysis step and are incubated with the resin for half an hour at room temperature so that the biotin streptavidin interactions take place correctly.
- the washing step is carried out with five column volumes of PBS IX and the elution of the proteins and peptides retained by P40 is carried out with five column volumes of PBS IX + 0.1% of chaps.
- the resin is then washed with 2 column volumes of PBS IX.
- the samples are lyophilized and taken up in Tris Glycine / SDS buffer, heated at 99 ° C for 5 min and centrifuged for 1 min at 13,000 rpm ("rpm" for revolutions per minute).
- the proteins are analyzed by denaturing electrophoresis on polyacrylamide gel.
- the proteins are visualized by staining with silver nitrate. As shown in FIGS. 3 A and 3B, several proteins are eluted with the detergent in the case of the P40-lysate mixture (FIG. 3 A), but not in the case of the TT-lysate mixture (FIG. 3B), demonstrating the existence of specific hydrophobic interactions of Omp.
- Omp proteins unlike the carrier proteins conventionally used such as TT, make it possible to specifically retain antigens and thereby isolate and analyze them. OMPs therefore make it possible to isolate a larger number of tumor antigens compared to conventional carriers.
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Abstract
L'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une protéine de membrane Omp, notamment une protéine de membrane OmpA de <i>Klebsiella pneumoniae</i>, associée à lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues tout comme l'utilisation de ces compositions pour la prévention et le traitement du cancer. Un procédé de mise en évidence d'antigènes tumoraux utilisant ces Omp est un autre objet de l'invention.
Description
PROTEINE OMP ASSOCIEE A UN LYSAT DE CELLULES TUMORALES AUTOLOGUES ET/OU HETEROLOGUES
L'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une protéine de membrane Omp, notamment une protéine de membrane OmpA de Klebsiella pneumoniae, associée à un lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues tout comme l'utilisation de ces compositions pour la prévention et le traitement du cancer.
La vaccination est un moyen efficace de prévenir ou de réduire les infections virales ou bactériennes. Le succès des campagnes de vaccination dans ces domaines a permis d'étendre le concept de vaccin jusqu'alors utilisé dans le domaine de l'infectiologie aux domaines du cancer et des maladies auto-immunes. Les antigènes vaccinaux administrés seuls chez l'hôte ne sont souvent pas assez immunogéniques pour induire une réponse immunitaire, et doivent donc être associés à un adjuvant ou couplés à une protéine porteuse pour induire (ou augmenter) leur immunogénicité. Dans ces conditions, seule une réponse immune de type humorale peut être induite. Or, dans le cadre d'une thérapie antivirale, la génération de lymphocytes T cytotoxiques (CTL) capables de reconnaître et de détruire le virus est de toute importance (Bachmann et al., 1994, Eur. J. Immunol., 24, 2228-2236 ; Borrow P., 1997, J. Virol. Hepat, 4, 16-24), comme l'attestent de nombreuses études montrant, in vivo, le rôle protecteur des réponses dirigées contre les épitopes viraux (Arvin AM, 1992, J. Inf. Dis., 166, S35- S41 ; Koszinowski et al., 1987, Immunol. Lett., 16, 185-192).
L'importance des réponses CTL a aussi été fortement documentée dans les réponses antitumorales notamment celles dirigées contre les cellules de mélanome (revue dans Rivoltini et al., 1998, Crit. Rev. Immunol., 18, 55-63). Le ou les épitopes CTL (séquences peptidiques interagissant avec les molécules de classe Let présentés aux lymphocytes T CD8+) ont été définis pour plusieurs antigènes. Cependant, la difficulté réside dans la génération de CTL in vivo, due à la faible immunogénicité de ces peptides (Melief, 1992, Adv. Cancer Res., 58, 143-175 ; Nandaz et Sercaz, 1995, Cell, 82, 13- 17). Grâce à leur efficacité à présenter les antigènes et à stimuler le système immunitaire, les cellules dendritiques, par exemple, ont été utilisées pour générer des
réponses CTL anticancéreuses (Nestlé F.O. et al., 1998, Nat. Med., 4, 328-332). Les approches ont consisté à charger les cellules dendritiques ex vivo avec l'antigène d'intérêt (peptides ou lysat cellulaire) et réimplanter ces cellules chez le patient. D'autres approches consistent à transfecter ex vivo les cellules dendritiques avec le gène codant pour l'antigène d'intérêt et à réinjecter ces cellules transfectées (Gilboa E. et al., 1998, Cancer Immunol. Immunother., 46, 82-87). Ces approches ont été utilisées avec succès chez la souris et récemment chez l'homme (Hsu F.J. et al., 1996, Nat. Med., 2, 52-58) mais restent néanmoins complexes dans la mesure où ces cellules doivent être traitées ex vivo (transformation des cellules ou internalisation des antigènes) et transplantées dans l'organisme hôte. De même, l'utilisation de particules de type viral (Layton G.T. et al., 1993, J. Immunol, 151, 1097-1107) ou de l'adjuvant incomplet de Freund (IF A) (Nalmori et al., Eur. J. Immunol., 1994, 24, 1458-1462) permet de générer des réponses CTL. Toutefois, une vaccination antitumorale réalisée avec des peptides correspondant à des épitopes CTL et en présence d'un tel adjuvant peuvent conduire à un état de tolérance spécifique qui peut conduire dans certains cas à l'effet contraire recherché, c'est-à-dire à une diminution de la réponse immune (Toes et al., Proc. Νat. Acad. Sci., USA, 1996, 93, 7855-7860).
La demande de brevet internationale publiée le 5 avril 1990 sous le numéro WO 90/03183 décrit des vaccins immunothérapeutiques comprenant des antigènes provenant de lysat de cellules de mélanomes, un adjuvant, dénommé « DETOX » constitué d'une endotoxine détoxifiée de type monophosphoryl lipide A (MPL) dérivée de Sahnonella minnesota et un porteur dérivé d'enveloppe cellulaire de Mycobacterium bovis, souche BCG. Les possibles effets secondaires du DETOX et de dérivé du BCG utilisés en vaccins immunothérapeutiques sont connus de l'homme du métier. L'objet de la présente invention consiste en de nouvelles compositions immunothérapeutiques améliorées qui présentent notamment l'avantage de :
- permettre un traitement prophylactique et thérapeutique ;
- permettre un traitement dès l'apparition de tumeurs à un stade précoce avant l'apparition des symptômes liés aux stades avancés de la maladie ; - permettre un traitement non toxique présentant peu ou prou d'effets secondaires ;
- permettre d'inhiber la croissance de tumeurs.
De manière surprenante, il a été mis en évidence qu'une protéine Omp, telle que la protéine P40 de Klebsiella pneumoniae, associée à un lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues, de préférence sans recours à l'addition d'un adjuvant ou d'un porteur, présentait les avantages ci-dessus mentionnés.
Ces propriétés des Omp pourraient notamment s'expliquer par le fait que les protéines Omp, contrairement aux protéines porteuses classiquement utilisées, permettent de retenir de façon spécifique des antigènes et notamment de mieux retenir un plus grand nombre d'antigènes tumoraux comparativement aux porteurs classiques. Ainsi, la présente invention est relative à une composition pharmaceutique comprenant dans un milieu pharmaceutique acceptable au moins une protéine Omp, ou un de ses fragments, associée à un lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues.
Les protéines dérivées de ladite protéine Omp dont la séquence d'acides aminés présente une homologie, telle que définie ci-après, d'au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 99 %, après alignement optimal avec la séquence de la protéine Omp de référence et qui sont capables de générer ou accroître une réponse CTL et/ou antitumorale peuvent être également utilisées comme protéine Omp dans les compositions pharmaceutiques selon la présente invention. Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme «protéine » également les peptides ou les polypeptides et par le terme « Omp » (pour « Outer Membrane Protein »), les protéines de la membrane externe. On peut citer comme exemples d'Omp, les OmpA, les porines (notamment les OmpC et F) et l'OmpX d'E. coli. Dans un mode de réalisation préféré, l'Omp est choisie parmi les. Omp d'entérobactéries.
Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'Omp est choisie parmi les OmpA, à savoir les protéines de la membrane externe de type A, et plus particulièrement celles de Klebsiella pneumoniae. Encore plus préferentiellement, on utilisera celle dénommée P40 telle que décrite dans les brevets WO 95/27787 et WO 96/14415.
Par fragment d'une protéine Omp, on entend désigner en particulier tout fragment de séquence d'acides aminés compris dans la séquence d'acides aminés de la protéine Omp qui est capable de générer ou accroître une réponse CTL et/ou antitumorale, ledit fragment de la protéine Omp comprenant au moins 5 acides aminés, de préférence au moins 10 acides aminés ou de manière plus préférée au moins 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75 et 100 acides aminés consécutifs de la séquence de ladite protéine Omp.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention comprend une protéine Omp ou l'un de ses fragments selon l'invention, caractérisée en ce que ladite protéine Omp, ou l'un de ses fragments, est obtenue par un procédé d'extraction à partir d'une culture de ladite entérobactérie.
Les procédés d'extraction de protéines de membrane bactériennes sont connus de l'homme de l'art et ne seront pas développés dans la présente description. On peut citer par exemple, mais sans s'y limiter le procédé d'extraction décrit par Haeuw J.F. et al. (EUT. J. Biochem, 255, 446-454, 1998).
Dans un autre mode de réalisation préféré, la composition selon l'invention comprend une protéine Omp ou l'un de ses fragments, caractérisée en ce que ladite protéine Omp ou l'un de ses fragments, est obtenue par voie recombinante. On préfère tout particulièrement les protéines Omp obtenues par voie recombinante. En effet, ces protéines recombinantes sont particulièrement bien définies, et pourront ainsi être utilisées et commercialisées pour une administration chez l'homme plus facilement et rapidement notamment pour des raisons d'autorisation de mise sur le marché.
Les méthodes de préparation de protéines recombinantes sont aujourd'hui bien connues de l'homme de l'art et ne seront pas développées dans la présente description. Parmi les cellules utilisables pour la production de ces protéines recombinantes, il faut citer bien entendu les cellules bactériennes (Olins P.O. et Lee S.C., 1993, Récent advances in heterologous gène expression in E. coli. Curr. Op. Biotechnology 4:520- 525), mais également les cellules de levure (Buckholz R.G., 1993, Yeast Systems for the Expression of Heterologous Gène Products, Curr. Op. Biotechnology, 4:538-542), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifère (Edwards C.P. et Aruffo A., 1993, Current applications of COS cell based transient
expression Systems, Curr. Op. Biotechnology, 4:558-563) mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre par exemple des baculovirus (Luckow N?A., 1993, Baculovirus Systems for the expression of human gène products, Curr. Op. Biotechnology, 4:564-572). De manière tout à fait préférée, la protéine Omp utilisée dans les compositions selon l'invention est la protéine OmpA de Klebsiella pneumoniae.
En particulier, l'invention concerne l'utilisation dans les compositions selon l'invention, de la séquence d'acides aminés de ladite protéine OmpA de Klebsiella pneumoniae, ou l'un de ses fragments, qui comprend : a) la séquence d'acides aminés de séquence SEQ ID Ν° 1 ; b) la séquence d'acides aminés d'une séquence présentant une homologie d'au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 %, 95 % et 99 %, après alignement optimal avec la séquence SEQ ID N° 1 ; ou c) la séquence d'acides aminés d'un fragment d'au moins 5 acides aminés, de préférence 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75 et 100 acides aminés, d'une séquence telle que définie en a).
Par séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés présentant une homologie d'au moins 80 % après alignement optimal avec une séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés déterminée, on entend désigner une séquence qui après alignement optimal avec ladite séquence déterminée comprend un pourcentage d'identité d'au moins 80 % avec ladite séquence déterminée.
Par «pourcentage d'identité» entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par «fenêtre de comparaison» pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la
comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad. App. Math., 2:482], au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol., 48:443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, ou encore par les logiciels de comparaison BLAST N ou BLAST P).
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenêtre de comparaison dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.
Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, «BLAST 2 séquences», disponible sur le site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/bl2.html, les paramètres utilisés étant ceux donnés par défaut (en particulier pour les paramètres «open gap penaltie» : 5, et «extension gap penaltie» : 2 ; la matrice choisie étant par exemple la matrice «BLOSUM 62» proposée par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer étant calculé directement par le programme. Parmi lesdites séquences présentant une homologie d'au moins 80 % avec la séquence Omp de référence, ou parmi les séquences d'acides aminés de fragment de séquence Omp de référence, on préfère :
- les séquences de peptides capables d'induire une activité CTL (Lymphocytes T Cytotoxiques), telle qu'elle peut être évaluée avec une méthode standard de mesure d'activité CTL basée par exemple sur la mesure de pourcentage de lyse spécifique de cellules co-incubées avec des lymphocytes effecteurs issus d'animaux immunisés avec
un peptide dérivé de la séquence Omp de référence associé à un peptide relevant ; et/ou
- les séquences de peptides capables de générer ou d'accroître une activité antitumorale, telle que mesurée notamment dans les exemples ci-après.
De préférence, lesdits peptides homologues ou lesdits fragments d'Omp seront capables d'induire une activité CTL et/ou de générer ou d'accroître une activité antitumorale au moins égale à 10 %, de préférence 20 %, 30 %, 50 % et 75 %, de l'activité mesurée dans les mêmes conditions pour la séquence Omp de référence.
L'autre élément essentiel des compositions pharmaceutiques selon l'invention concerne un lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues. Au sens de la présente invention, on entend par cellules tumorales autologues, des cellules de tumeurs appartenant au sujet qui va recevoir les compositions selon l'invention.
Par cellules tumorales hétérologues, il faut comprendre des cellules issues de tumeurs provenant d'un individu différent de celui à qui la composition selon l'invention est destinée. L'utilisation de cellules hétérologues permet d'obtenir des compositions pharmaceutiques permettant notamment de traiter des patients atteints de cancer chez qui un prélèvement de cellules tumorales n'est pas possible. L'utilisation de cellules hétérologues permet aussi d'obtenir des compositions selon l'invention standardisées comprenant des antigènes retrouvés dans de nombreux types de cancer et ainsi utilisables chez une majorité de patients.
Les cellules tumorales peuvent être obtenues suite à un prélèvement de tissus cancéreux, par exemple suite à une biopsie ou résection chirurgicale.
Ces cellules peuvent ensuite être utilisées telles quelles ou être mises en culture avant d'être lysées. Un lysat cellulaire peut être défini au sens de la présente invention comme un mélange d'antigènes intracellulaires et/ou membranaires, préferentiellement intracellulaires et membranaires.
Parmi les lysats de cellules tumorales entrant dans la composition pharmaceutique selon l'invention, on préfère les lysats de cellules tumorales exprimant un antigène tumoral associé, notamment un antigène tumoral dont l'expression est induite par le caractère tumoral ou potentiellement tumoral de la cellule.
Parmi lesdites cellules tumorales exprimant un antigène tumoral associé, on préfère en particulier les cellules tumorales de tumeurs issues de cancers à cellules tumorales exprimant un antigène tumoral associé, tels que cités ci-après.
Ledit lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues selon l'invention peut-être obtenu par une lyse mécanique, chimique ou enzymatique de cellules tumorales.
Pour lyser les cellules de façon mécanique on peut notamment citer les techniques connues de l'homme de métier, à savoir notamment la sonication, l'ultrasonication ou la congélation/décongélation. On préfère tout particulièrement la congélation/décongélation, et tout particulièrement l'utilisation de plusieurs cycles de congélation/décongélation.
On peut aussi lyser les cellules en utilisant des composés chimiques ou des enzymes, comme par exemple un tampon de lyse à digitonine, du triton X-100 ou du Nonidet P40. Toute méthode permettant de rompre la membrane cellulaire des cellules de tumeurs pourra être utilisée afin d'obtenir un lysat.
La composition pharmaceutique selon l'invention peut comprendre en outre une cytokine ou un facteur de croissance, notamment l'interféron alpha ou gamma, le TNF, le GM-CSF (Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor), l'IL-2, l'IL-4, l'IL-6 et IL-18, une HSP (Heat Shock Protein) telle que par exemple l'hsρ70, l'hsρ90, l'hsρ96, qui permet de potentialiser la réponse immunitaire, et/ou des fibroblastes modifiés génétiquement de façon à relarguer une cytokine ou un facteur de croissance. On peut citer les fibroblastes exprimant du GM-CSF commercialisés par la société Immune Response Corporation. Dans un mode de réalisation de l'invention, les compositions selon l'invention peuvent contenir en outre des cellules présentatrices d'antigènes. Ces dernières peuvent être choisies notamment parmi les macrophages, les lymphocytes B ou les cellules dendritiques et préferentiellement parmi les macrophages.
Les cellules présentatrices d'antigènes peuvent être obtenues par production in vitro à partir de cellules souches issues du sang humain ou de la moelle épinière (voir
Inaba et al., 1992, J. Exp. Med., 176:1693-1702). On pourra utiliser des macrophages
humains obtenus à partir de cellules mononucléaires sanguines isolées préferentiellement du patient devant être traité. Le nombre de macrophages pourra être augmenté en utilisant du M-CSF (Macrophage Colony Stimulating Factor).
On pourra noter que l'utilisation de cellules présentatrices d'antigènes est facultative dans la présente invention. Ainsi, l'invention concerne aussi des compositions selon l'invention sans cellules présentatrices d'antigènes permettant un traitement thérapeutique qui ne nécessite pas de manipulations ex vivo de cellules présentatrices d'antigènes et dont la mise en œuvre est ainsi plus aisée et plus simplifiée et ne présentant pas les possibles inconvénients de ceux utilisant des cellules présentatrices d'antigènes.
Les compositions selon l'invention peuvent comprendre en outre un adjuvant permettant d'augmenter la réponse immunitaire, notamment choisi dans le groupe d'adjuvant comprenant le Qs21 (mélange de saponines commercialisé par la société
Aquila), l'ISCOM (Immunostimularoty complexe commercialisé par la société CSL Ltd.), les CpG (séquences d'ADN de bactéries commercialisées par la société Coley
Pharmaceutical Group), Leif (Leishmania major Initiation Factor commercialisé par la société Corixa), la CT (toxine cholérique) ou la LT (LT pour « Heat labile enterotoxin » entérotoxine labile à la chaleur), tout comme les versions détoxifiées de la CT ou la LT.
Sous un autre aspect, la composition selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle ne contient aucun autre adjuvant permettant d'augmenter la réponse immunitaire tel que ceux mentionnés ci-dessus, hormis ladite protéine Omp, notamment ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments.
Au sens de la présente invention, le milieu pharmaceutiquement acceptable est le milieu dans lequel les composés de l'invention sont administrés, préferentiellement un milieu injectable chez l'homme. Il peut par exemple être constitué d'eau, d'une solution aqueuse saline ou d'une solution aqueuse à base de dextrose et ou de glycérol.
Dans un mode de réalisation particulier, la composition selon l'invention contient en outre un détergent.
Les compositions selon l'invention peuvent contenir en outre un détergent, et notamment tout type de tensioactif pharmaceutiquement acceptable, comme par exemple des tensioactifs anioniques, cationiques, non-ioniques ou amphotères. On
utilise préferentiellement les détergents Zwittergent 3-12 et l'octylglucopyrannoside et encore plus préferentiellement le Zwittergent 3-14.
L'invention concerne également les compositions selon l'invention caractérisées en ce qu'elles sont véhiculées sous une forme permettant d'assurer et/ou d'améliorer leur stabilité, et ainsi comprendre en outre par exemple des vecteurs permettant d'assurer et/ou d'améliorer la stabilité de l'association protéine Omp ou l'un de ses fragments et du lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues, en particulier les vecteurs choisis parmi les liposomes, les virosomes, les nanosphères, les microsphères ou les microcapsules. L'invention comprend également l'utilisation d'une protéine Omp ou d'un de ses fragments associé à un lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre une cellule tumorale.
Dans une forme de réalisation préférée selon l'invention, la protéine Omp ou l'un de ses fragments est utilisée associée à un lysat de cellules tumorales autologues pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre ladite cellule tumorale autologue.
Plus généralement, l'utilisation selon l'invention est relative à la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou à traiter les cancers, de préférence les cancers associés à un antigène tumoral.
Parmi les cancers dont les tumeurs expriment un antigène tumoral associé pouvant être prévenus ou traités par les utilisations selon la présente invention, on peut citer en particulier, mais sans s'y limiter :
• le cancer du sein, du poumon, du côlon, et le carcinome gastrique (Kawashima et al., 1999, Cancer Res., 59:431-5) ;
• le mésothéliome, l'ostéosarcome, les cancers du cerveau (Xie et al., 1999, J. Natl. Cancer. Inst, 91:169-75) ;
• le mélanome (Zheuten et al., 1998, Bratilsl. Lek. Listy, 99:426-34) ;
• l'adénocarcinome pancréatique (Hammel et al., 1998, Eur. J. Gastroenterol. Hepatol., 10:345-8) ;
• le cancer colorectal (Ogura et al., 1998, Anticancer Res., 18:3669-75) ;
• le carcinome des cellules rénales (Jantzer et al., 1998, Cancer Res., 58:3078-86) ; et
• le cancer de l'ovaire et du col de l'utérus (Sonoda et al., 1996, Cancer., 77:1501-9).
Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'une protéine Omp ou d'un de ses fragments associée à un lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à inhiber la croissance de tumeurs.
Ces différentes utilisations mettent en œuvre les compositions précédemment décrites.
La méthode thérapeutique de mise en œuvre des compositions selon l'invention consiste notamment à :
- évaluer chez un patient le type de cancer dont il est atteint ;
- à choisir en fonction du type de cancer un traitement utilisant des cellules tumorales autologues et/ou hétérologues ;
- le cas échéant à prélever des cellules tumorales ; - de façon facultative et non préférée à réaliser des cultures primaires ou secondaires desdites cellules tumorales ;
- à préparer les compositions selon l'invention avec des concentrations adéquates de protéine Omp ou d'un de ses fragments et de lysat de cellules tumorales ;
- à injecter au patient ladite composition, de préférence en sous-cutanée ou en intradermique ;
- si nécessaire à répéter ces injections plusieurs fois, de préférence 3 injections à un mois d'intervalle et par la suite un rappel tous les 3 à 6 mois.
Les concentrations adéquates de protéine Omp ou d'un de ses fragments et de lysat de cellules tumorales pourront notamment être choisies de manière à obtenir des compositions comprenant par exemple de 0,01 à 50 mg, et préferentiellement de 0,1 à 25 mg de lysat cellulaire, et de 0,1 à 50 mg, et préferentiellement de 1 à 25 mg d'Omp. Le rapport Lysat/Omp pouvant être compris entre 1/2 et 1/10, et préferentiellement entre 1/5 et 1/8.
Quand des cellules présentatrices d'antigènes sont utilisées, ces dernières sont incubées in vitro avec la protéine Omp, ou un de ses fragments, associée à un lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues. Elles pourront par exemple être
incubées à 37°C pendant une durée comprise entre 5 minutes et 24 heures. Les quantités et concentrations de cellules présentatrices d'antigènes devant être utilisées sont celles décrites dans l'art antérieur. On pourra ainsi utiliser par exemple 107 cellules présentatrices d'antigènes par ml. Les cellules présentatrices d'antigènes mises au contact de la protéine Omp, ou un de ses fragments, associée à un lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues sont ensuite injectées au patient, de préférence au patient dont elles sont issues. En fonction de la condition physique du patient, on pourra lui injecter par exemple de 106 à 1012 cellules présentatrices d'antigènes.
L'invention a encore pour objet un dispositif adapté à la mise en oeuvre de la méthode thérapeutique ci-dessus mentionnée, tel que par exemple un kit, comprenant au moins l'Omp et les moyens nécessaires à préparer les compositions selon l'invention, tels que par exemple un protocole, un milieu pharmaceutiquement acceptable ou un tampon de lyse. Quand des cellules présentatrices d'antigènes sont utilisées, ce dispositif pourra aussi contenir ces cellules, préférablement purifiées. Enfin, l'invention a pour objet un procédé de mise en évidence d'antigènes tumoraux caractérisé en ce qu'il consiste à :
- associer une protéine Omp ou l'un de ses fragments à un lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues de manière à former des complexes entre les protéines Omp ou leurs fragments et les antigènes tumoraux du lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues ;
- à isoler les complexes ainsi formés ;
- à séparer de ces complexes les antigènes tumoraux ; et
- à identifier lesdits antigènes tumoraux.
La première étape de ce procédé consiste à mélanger les extraits tumoraux aux protéines ou fragments d'Omp, notamment dans les quantités et proportions ci-dessus mentionnées. Préalablement à cette étape, il est possible de modifier les Omp ou leur fragment de manière à les rendre aptes à l'étape d'isolement des complexes Omp- antigènes, on pourra par exemple biotinyler les Omp.
Pour isoler les complexes ainsi formés, on peut utiliser une colonne de chromatographie d'affinité puis en procédant à des élutions successives, les antigènes tumoraux seront séparés et isolés.
On procède ensuite à des techniques classiques pour identifier lesdits antigènes, comme par exemple le séquençage desdits antigènes par des techniques connues de l'homme du métier utilisant la spectrométrie de masse, un Maldi-Tof et la bioinformatique. Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.
Légendes des figures :
Figure 1 : Mesure du volume des tumeurs suite à une immunisation avec un lysat B16.F10 avec ou sans P40.
Figures 2A et 2B : Mesure du pourcentage d'yeux présentant la pathologie (Figure 2A) et du degré de pathologie (Figure 2B) chez des souris TRP/Tag suite à une immunisation avec un lysat d'yeux avec ou sans P40. Degré 0 : pas de pathologie visible ; Degré 1 : pathologie moyenne ; Degré 2 : pathologie sévère.
Figures 3A et 3B : Gel SDS-PAGE montrant les fractions des mélanges du lysat de B16.F10 avec P40-biotine (Figure 3 A) ou TT-biotine (Figure 3B) éluées au détergent d'une colonne de streptavidine-sépharose ('TT' pour Toxoïde Tétanique).
Exemple I : Mesure de l'activité antitumorale chez la souris C57BL/6
2 500 cellules du mélanome B16.F10 ont été implantées en sous-cutané au jour 0 dans des souris C57BL/6, dont les cellules B16.F10 ont été originalement dérivées. Egalement au jour 0, les souris C57BL/6 ont été immunisées en sous-cutané à la base de la queue avec P40 (350 μg) mélangée avec un lysat de 10 cellules B16.F10 (broyées avec un homogénéisateur Dounce, soniquées et passées sur un tamis en nylon) ou avec du lysat seul. Une deuxième immunisation à 10 jours d'intervalle avec la première a également été faite selon le même mode d'injection. A partir du jour 18 postimplantation, le volume de la tumeur sous-cutanée a été mesuré.
Comme le montre la figure 1, l'immunisation de souris C57BL/6 ayant reçu le même jour des cellules du mélanome B 16F 10 avec P40 mélangée au lysat de B 16F 10,
mais pas avec le lysat seul, ralentit de façon significative le développement du mélanome sous-cutané.
Exemple II : Mesure de l'activité antitumorale chez la souris TRP/Tag
Les souris TRP/Tag développent des tumeurs dans les yeux, pouvant ainsi facilement être visualisables.
Un mélange de P40 (350 μg) et de lysat d'yeux tumoraux (broyés avec un homogénéisateur Dounce, soniqués et passés sur un tamis en nylon) ou du lysat seul ont été injectés en sous-cutané à la base de la queue chez les souris TRP/Tag à 4 semaines d'âge. La fréquence et la sévérité des tumeurs oculaires ont été mesurées quotidiennement.
La fréquence et la sévérité des tumeurs oculaires chez les souris TRP/Tag sont significativement diminuées après immunisation avec le mélange de P40 et du lysat (voir figures 2A et 2B). Par contre, aucun effet n'a été observé chez les souris traitées avec le lysat seul. Ce résultat est d'autant plus surprenant puisque le processus de transformation maligne de l'épithélium rétinal pigmenté chez les souris TRP/Tag débute dès avant la naissance, donc au moins 3 semaines avant la première immunisation. Ainsi, même lorsque la tumeur est déjà à un stade avancé, la présente invention permet d'obtenir une diminution significative de cette tumeur.
Exemple III : Comparaison de la capacité à retenir des antigènes de P40 à celle de TT
La biotinylation des protéines P40 ou TT s'effectue dans un mélange contenant 340 μl de P40 ou de TT à 6 milligrammes (mg)/ml, 100 μl de NaHCO3, 0,5 Mole/litre (M), pH 8.5, 100 μl de S-NHS biotine (2 mg/ml) et 460 μl d'eau ultra pure.
Le mélange est ensuite placé 2 heures (h) à 4°C afin d'arrêter la réaction de biotinylation puis est dialyse sur la nuit contre du PB S dans des cassettes de dialyses à température ambiante sous agitation magnétique afin d'éliminer la biotine en excès.
Le mélange P40 biotine (2 mg/ml) + lysat (0,9 x 106 cellules par ml) ou TT biotine (2 mg/ml) + lysat (0,9 x 106 cellules par ml) est dialyse dans une cassette de dialyse contre de l'eau ultra pure une nuit, à température ambiante, sous agitation magnétique. Cette étape permet de favoriser les interactions hydrophobes entre P40 et le lysat. TT sert de contrôle négatif. Le support utilisé pour cette chromatographie
d'affinité basse pression est une colonne analytique avec une phase stationnaire de sépharose-streptavidine haute performance préalablement saturée avec de la BSA afin d'éliminer toutes les interactions artéfactuelles. Les échantillons utilisés sont soit P40 biotine + lysat soit TT biotine + lysat obtenus après l'étape de dialyse et sont incubés avec la résine une demie heure à température ambiante afin que les interactions biotine streptavidine se fassent correctement.
L'étape de lavage s'effectue avec cinq volumes colonne de PBS IX et l'élution des protéines et peptides retenus par P40 se fait avec cinq volumes colonne de PBS IX + 0,1 % de chaps. La résine est ensuite lavée avec 2 volumes colonne de PBS IX. Les échantillons sont lyophilisés et repris dans du tampon Tris Glycine/SDS, chauffés à 99°C pendant 5 mn et centrifugés 1 mn à 13000 rpm (« rpm » pour tours par minute). Les protéines sont analysées par électrophorèse dénaturante sur gel polyacrylamide.
Après séparation, les protéines sont visualisées par coloration au nitrate d'argent. Comme le montrent les figures 3 A et 3B, plusieurs protéines sont éluées au détergent dans le cas du mélange P40-lysat (figure 3 A), mais pas dans le cas du mélange TT-lysat (figure 3B), démontrant l'existence d'interactions hydrophobes spécifiques des Omp. Ainsi, les protéines Omp, contrairement aux protéines porteuses classiquement utilisées telles que TT, permettent de retenir de façon spécifique des antigènes et de ce fait d'isoler et d'analyser ces derniers. Les Omp permettent donc d'isoler un plus grand nombre d'antigènes tumoraux comparativement aux porteurs classiques.
Claims
REVENDICATIONS
1) Composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu pharmaceutiquement acceptable au moins une protéine Omp, ou un de ses fragments, associée à un lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues.
2) Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite protéine Omp, ou l'un de ses fragments, est obtenue par un procédé d'extraction à partir d'une culture d'entérobactérie.
3) Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite protéine Omp, ou l'un de ses fragments, est obtenue par voie recombinante.
4) Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite protéine Omp est la protéine OmpA de Klebsiella pneumoniae.
5) Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que la séquence d'acides aminés de ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, comprend : a) la séquence d'acides aminés de séquence SEQ ID N° 1 ; b) la séquence d'acides aminés d'une séquence présentant une homologie d'au moins 80 % avec la séquence SEQ ID N° 1 ; ou c) la séquence d'acides aminés d'un fragment d'au moins 5 acides aminés d'une séquence telle que définie en a). 6) Composition selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues est un mélange d'antigènes intracellulaires eJoxx membranaires, préferentiellement intra et membranaires.
7) Composition selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre une cytokine et/ou un facteur de croissance ou des fibroblastes relarguant une cytokine et/ou un facteur de croissance.
8) Composition selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre des cellules présentatrices d'antigènes et préferentiellement des macrophages.
9) Composition selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre un adjuvant.
10) Composition selon l'une des revendications 1 à 8, sans autre adjuvant permettant d'induire une réponse immunitaire. 11) Composition selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce que ledit milieu pharmaceutiquement acceptable est constitué d'eau, d'une solution aqueuse saline ou d'une solution aqueuse à base de dextrose et/ou de glycérol.
12) Composition selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisée en ce que ladite composition contient en outre un détergent. 13) Composition selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité.
14) Utilisation d'une protéine Omp ou d'un de ses fragments associée à un lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre une cellule tumorale.
15) Utilisation d'une protéine Omp ou d'un de ses fragments associée à un lysat de cellules tumorales autologues pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer ou accroître une réponse immunitaire contre ladite cellule tumorale autologue.
16) Utilisation d'une protéine Omp ou d'un de ses fragments associée à un lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à prévenir ou à traiter les cancers, de préférence les cancers associés à un antigène tumoral. 17) Utilisation d'une protéine Omp ou d'un de ses fragments associée à un lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à inhiber la croissance des tumeurs.
18) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 14 à 17, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 13.
19) Dispositif caractérisé en ce qu'il comprend au moins une Omp et un
moyen nécessaire à la préparation des compositions selon l'invention telles que définies dans l'une quelconque des revendications 1 à 13.
20) Procédé de mise en évidence d'antigènes tumoraux caractérisé en ce qu'il consiste à : - associer une protéine Omp ou un de ses fragments à un lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues de manière à former des complexes entre les protéines Omp ou leurs fragments et les antigènes tumoraux du lysat de cellules tumorales autologues et/ou hétérologues ;
- isoler les complexes ainsi formés ; - séparer de ces complexes les antigènes tumoraux ; et
- identifier lesdits antigènes tumoraux.
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