EP1268764A2 - Procede d'obtention d'acides nucleiques a partir d'un echantillon de l'environnement - Google Patents

Procede d'obtention d'acides nucleiques a partir d'un echantillon de l'environnement

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Publication number
EP1268764A2
EP1268764A2 EP00985340A EP00985340A EP1268764A2 EP 1268764 A2 EP1268764 A2 EP 1268764A2 EP 00985340 A EP00985340 A EP 00985340A EP 00985340 A EP00985340 A EP 00985340A EP 1268764 A2 EP1268764 A2 EP 1268764A2
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EP
European Patent Office
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vector
dna
nucleic acids
nucleic acid
collection
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00985340A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Pascale Jeannin
Jean-Luc Pernodet
Michel Guerineau
Pascal Simonet
Sophie Courtois
Carmela Cappellano
François FRANCOU
Alain Raynal
Maria Ball
Guennadi Sezonov
Karine Tuphile
Asa Frostegard
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Aventis Pharma SA
Original Assignee
Aventis Pharma SA
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Filing date
Publication date
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Publication of EP1268764A2 publication Critical patent/EP1268764A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method of preparing nucleic acids from a sample of the environment, more particularly to a method of obtaining a collection of nucleic acids from a sample.
  • the invention also relates to nucleic acids or collections of nucleic acids obtained according to the process and their application to the synthesis of new compounds, in particular new compounds of therapeutic interest.
  • a subject of the invention is also the new means used in the process for obtaining the above nucleic acids, such as new vectors and new methods for preparing such vectors or also recombinant host cells comprising an acid. nucleic acid of the invention.
  • the invention also relates to methods for detecting a nucleic acid of interest within a collection of nucleic acids obtained according to the above method, as well as the nucleic acids detected by such a method and the polypeptides encoded by such methods. nucleic acids.
  • the invention also relates to nucleic acids obtained and detected according to the above methods, in particular nucleic acids coding for an enzyme participating in the biosynthetic pathway of antibiotics such as ⁇ -lactams, aminoglycosides, nucleotides heterocyclic or polyketides as well as the enzyme encoded by these nucleic acids, the polyketides produced by the expression of these nucleic acids and finally pharmaceutical compositions comprising a pharmacologically active amount of a polyketide produced by the expression of such nucleic acids.
  • nucleic acids coding for an enzyme participating in the biosynthetic pathway of antibiotics such as ⁇ -lactams, aminoglycosides, nucleotides heterocyclic or polyketides as well as the enzyme encoded by these nucleic acids, the polyketides produced by the expression of these nucleic acids and finally pharmaceutical compositions comprising a pharmacologically active amount of a polyketide produced by the expression of such nucleic acids.
  • antibiotics penicillin, erythromycin, actinomycin, tetracycline, cephalosporin
  • anticancer drugs cholesterol-lowering agents or even pesticides.
  • the products of therapeutic interest of microbial origin known to date come mainly (around 70%) from the group of actinomycetes and more particularly from the genus Streptomyces.
  • the rediscovery rate of previously known antibiotics is around 99%.
  • fluorescence microscopy techniques have made it possible to count more than 10 10 bacterial cells in 1 g of soil, while only 0.1 to 1% of these bacteria can be isolated after seeding on culture media.
  • Methods have thus been developed which include a step of extracting DNA from telluric organisms, if necessary after prior isolation of the organisms contained in the soil samples.
  • the DNA thus extracted after lysis of the bacterial cells without prior stage of culture ' in vitro, is cloned into vectors used to transfect host organisms, in order to constitute DNA libraries originating from soil bacteria.
  • Such techniques have been used on samples from aquatic environments, whether fresh or marine. They comprise a first stage of prior concentration of the cells present freely or in the form of particles, generally consisting of filtration of large volumes of water on different filtration devices, for example conventional filtration on a membrane, tangential or rotational filtration or even ultrafiltration. .
  • the pore size is between 0.22 and 0.45 mm and often requires prefiltration in order to avoid clogging due to the treatment of large volumes.
  • the harvested cells are lysed directly on the filters in small volumes of solutions, by enzymatic and / or chemical treatment.
  • WISCONSIN ALUMNI RESEARCH FOUNDATION describes a step of lysis of bacteria in situ using an extraction buffer containing a protease and SDS.
  • Bacteria lysis techniques have also been used using a succession of sonication steps, microwave heating and thermal shock (PICARD et al. (1992).
  • the in situ chemical or enzymatic treatments of the sample have the disadvantage of only lysing certain categories of microorganisms due to the selective resistance of the various indigenous microorganisms at the lysis stage due to their heterogeneous morphology .
  • Gram-positive bacteria resist heat treatment with SDS detergent while almost all Gram-negative cells are lysed.
  • some of the direct extraction protocols described above promote the adsorption of the extracted nucleic acids on the mineral particles of the sample, thus significantly reducing the amount of accessible DNA.
  • the quantity of DNA directly usable for cloning into recombinant vectors is also dependent on the purification steps subsequent to its extraction.
  • the extracted DNA is then purified, for example by the use of polyvinylpolypyrrolidone, by precipitation in the presence of ammonium or potassium acetate, by centrifugations on a cesium chloride gradient, or else chromatographic techniques, in particular on a hydroxyapatite support, on an ion exchange column or molecular sieving or by electrophoresis techniques on agarose gel.
  • Another object of the invention was to overcome the drawbacks of the previous purification protocols and to develop a DNA purification step making it possible to optimally maintain the diversity of the DNA of the initial sample, on the one hand, and, quantitatively promoting its obtaining, on the other.
  • Such techniques use a first step of separation of the different organisms from the telluric microflora from the other constituents of the starting sample, prior to the step of extraction of the DNA itself.
  • the prior separation of a microbial fraction from a soil sample most often comprises a physical dispersion of the sample by grinding the latter in a liquid medium, for example using devices of the type Waring Blender or a mortar.
  • Chemical dispersions have also been described, for example on ion exchange resins or else dispersions using non-specific detergents such as sodium deoxycholate or polyethylene glycol. Whatever the mode of dispersion, the solid sample must be suspended in water, phosphate buffer or saline solution.
  • the physical or chemical dispersion step can be followed by centrifugation on a density gradient allowing the separation of the cells contained in the sample and the particles of the latter, it being understood that the bacteria have densities lower than those of most soil particles.
  • the physical dispersion step can also be followed alternately by a low speed centrifugation step or even a cell elutriation step.
  • the DNA can then be extracted from the separated cells by all available lysis methods and can be purified by numerous methods, including the purification methods described in paragraph 1.1 above.
  • the inclusion of cells in agarose with a low melting point can be carried out in order to protect the lysis.
  • the methods described in the state of the art known to the applicant are not satisfactory because of the presence, in the fractions containing the extracted DNA, of undesirable constituents of the starting sample having a significant influence on the quality and the amount of final DNA.
  • the present invention proposes to solve the technical difficulties encountered in the processes of the prior art as will be described below.
  • the objective of such a molecular characterization of the extracted and purified DNA is to obtain profiles representing the proportions of the different bacterial taxa present in this DNA extract.
  • the molecular characterization of the extracted and purified DNA makes it possible to determine whether artefacts were introduced during the implementation of the various extraction and purification stages and, if necessary, whether the diversity of origin of the DNA. extracted and purified is representative of the microbial diversity initially present in the sample, especially in the soil sample.
  • MPN-PCR is of complex use due to the multiplication of dilutions and repetitions which makes it unsuitable for a large number of samples or of pairs of primers.
  • viral vectors phages, plasmids, phagemids, cosmids, phosmids, vectors of the BAC type (bacterial artificial chromosome) or else can be used.
  • bacteriophage P1 PAC type vectors (artificial chromosome based on bacteriophage P1)
  • YAC type vectors artificial yeast chromosome
  • yeast plasmids or any other vector capable of maintaining and stably expressing genomic DNA.
  • Example 1 of PCT application No. WO 99 / 20,799 describes the construction of a genomic DNA library by cloning into a vector of the BAC type.
  • PCT application No. WO 99 / 20,799 cites numerous appropriate cellular hosts, such as Escherichia coli, in particular the strain DH 10B or even the strain 294 (ATCC 31446, the strain E. coli B, E. Coli X 1776 (ATCC N ° 31.537), E.coli DH5 ⁇ and E.coli W3110
  • This PCT application also cites other appropriate host cells such as Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Schigella or also strains of the bacillus type such as B. subtilis and ⁇ . licheniformis as well as bacteria of the genus
  • US Patent No. 5, 824,485 cites in particular the strain of Streptomyces lividans TK66 or also yeast cells such as those of Saccharomyces pombe.
  • This technique made it possible to detect a chromosomal DNA fragment of about 26 kb carrying part of the operon for biosynthesis of surfactin.
  • the article by HONG-FU et al. (1995) describes the construction of expression cassettes containing the different open reading phases of the operon responsible for the biosynthesis of polyketides, the different expression cassettes having been constructed artificially by combining the open reading phases which are not found together naturally in the genome of Streptomyces coelicolor.
  • This article shows that the combination, in artificial expression cassettes, of open reading frames originating from different bacterial strains allows the production of polyketides with different structural characteristics and more or less large antibiotic activities against Bacillus subtilis and Bacillus cereus.
  • Polyketides are part of a large family of natural products of variable structure and with a wide variety of biological activities. Polyketides include, for example, tetracyclines and erythromycin (antibiotics), FK506 (immunosuppressant), doxorubicin (anti-cancer agent), monensin (a coccidiostatic agent) as well as avermectin (an antiparasitic agent).
  • polyketide synthases which catalyze repeated condensation cycles between acyl thioesters (in general acetyl, propionyl, malonyl or methylmalonyl thioesters). Each condensation cycle results in the formation, on a growing carbon chain, of a ⁇ -keto group which can then undergo, if necessary, one or more series of reducing steps.
  • New artificial polyketides have thus been produced by genetic engineering, such as mederrhodin A or dihydrogranatirhodin.
  • genetic engineering such as mederrhodin A or dihydrogranatirhodin.
  • the vast majority of new polyketide molecules obtained by genetic engineering are very different, from a structural point of view, from the corresponding natural polyketides.
  • the invention relates first of all to a method for the construction of DNA libraries originating from a sample of the environment, such a sample being able either to be an aquatic medium (fresh or marine water), a soil sample (layer surface, soil or sediment), or a sample of eukaryotic organisms containing an associated microflora, such as for example a sample from plants, insects or even marine organisms and having an associated microflora.
  • a sample of the environment such a sample being able either to be an aquatic medium (fresh or marine water), a soil sample (layer surface, soil or sediment), or a sample of eukaryotic organisms containing an associated microflora, such as for example a sample from plants, insects or even marine organisms and having an associated microflora.
  • the development of a process for constructing a DNA library of an environmental sample, and in particular of a soil sample includes critical steps, the implementation of which must necessarily be optimized for obtaining a DNA bank whose content in nucleic acids of interest meets the objectives initially set.
  • a first critical step consists in the extraction and subsequent purification of the nucleic acids initially contained in the sample, that is to say mainly of the nucleic acids contained in the various organisms making up the microflora of this sample.
  • the quality of the purification of the extracted DNA is decisive on the result obtained.
  • a second important step in a process for building a library of nucleic acids from an environmental sample is the evaluation of the genetic diversity of the extracted and purified nucleic acids.
  • the development of a simple and reliable production step of pre-screening the extracted and purified DNA in order to verify that it accounts, at least partially, for the phylogenetic diversity of the organisms initially present in the sample starting point in fact makes it possible to determine the advantage or not of using the initial source of DNA extracted and purified for the construction of the bank of nucleic acids proper or on the contrary not to continue the construction of the bank d nucleic acids due to excessive artefacts introduced during the extraction and purification of nucleic acids.
  • a third critical step is the insertion of the nucleic acids extracted and purified into vectors capable of integrating nucleic acids of selected length, on the one hand, and, on the other hand, of allowing their transfection or even the integration into the genome in specific cell hosts as well as, if necessary, allowing expression thereof in such cell hosts.
  • the vectors capable of integrating large nucleic acids that is to say of size greater than 100 kb when the objective pursued consists in cloning and identification of one .
  • complete operon capable of directing a complete pathway for biosynthesis of a compound of industrial interest, in particular of a compound of pharmaceutical or agronomic interest.
  • nucleic acids means both DNA and RNA sequences as well as hybrid RNA / DNA sequences of more than 2 nucleotides, indifferently under the single strand or double strand shape.
  • library or “collection” is used in the present description with reference to either a set of extracted and, where appropriate purified, nucleic acids, coming from a sample of the environment, to a set of recombinant vectors, each of the recombinant vectors of the set comprising a nucleic acid originating from the abovementioned set of nucleic acids extracted and, where appropriate purified, as well as to a set of recombinant host cells comprising one or more nucleic acids originating from the all of the abovementioned extracted and, where appropriate, purified nucleic acids, said nucleic acids being either carried by one or more recombinant vectors, or integrated into the genome of said recombinant host cells.
  • environment sample is used to designate either a sample of aquatic origin, for example fresh or saline water, or a telluric sample originating from the surface layer of a soil, from sediments or from lower layers of the soil. (underground), as well as samples of eukaryotic organisms, possibly multicellular, of plant origin, from marine organisms or even insects and having an associated microflora, this associated microflora constituting organisms of interest .
  • operon means a set of open reading frames whose transcription and / or translation is co-regulated by a single set of signals for regulating transcription and / or translation.
  • an operon can also comprise said signals for regulating transcription and / or translation.
  • metabolic pathway for the purposes of the invention or also “biosynthetic pathway” is meant a set of anabolic or catabolic biochemical reactions effecting the conversion of a first chemical species into a second chemical species.
  • an antibiotic biosynthesis pathway is made up of all of the biochemical reactions converting primary metabolites into antibiotic intermediates, and subsequently into antibiotics.
  • regulation sequence placed "in phase" in English operably linked
  • transcription regulation sequence s
  • the transcription regulation sequence are localized, relative to the nucleotide sequence d interest whose expression is sought, so as to allow the expression of said sequence of interest, the regulation of said expression being dependent on factors interacting with the regulatory nucleotide sequences.
  • nucleotide sequence of interest whose expression is sought is placed "under the control" of the nucleotide sequences which regulate transcription.
  • isolated in the sense of the present invention designates a biological material which has been removed from its original environment (the environment in which it is naturally located).
  • a polynucleotide or a polypeptide naturally present in an organism is not isolated.
  • the same polypeptide separated from its natural environment or the same polynucleotide separated from the adjacent nucleic acids in which it is naturally inserted into the genome of the organism, is isolated.
  • Such a polynucleotide can be included in a vector and / or such a polynucleotide can be included in a composition and nevertheless remains in an isolated state, because the vector or the composition does not constitute its natural environment.
  • purified does not require that the material be present in a form of absolute purity, exclusive of the presence of other compounds. Rather, it is a relative definition.
  • a polypeptide or a polynucleotide is in the purified state after purification of the starting material of at least one order of magnitude, preferably 2 or 3 and preferably 4 or 5 orders of magnitude.
  • the "percentage of identity" between two nucleotide or amino acid sequences can be determined by comparing two optimally aligned sequences, through a comparison window.
  • the part of the nucleotide or polypeptide sequence in the comparison window can thus include additions or deletions (for example "gaps") with respect to the reference sequence (which does not include these additions or these deletions) so as to obtain an optimal alignment of the two sequences.
  • the percentage is calculated by determining the number of positions at which an identical nucleic base or amino acid residue is observed for the two sequences (nucleic or peptide) compared, then by dividing the number of positions at which there is identity between the two bases or amino acid residues by the total number of positions in the comparison window, then multiplying the result by 100 to obtain the percentage of sequence identity.
  • the optimal alignment of the sequences for the comparison can be achieved by computer using known algorithms contained in the package of the company WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison, WISCONSIN.
  • the percentage of sequence identity may be carried out using the BLAST software (BLAST versions 1.4.9 of March 1996, BLAST 2.0.4. Of February 1998 and BLAST 2.0.6. Of September 1998 ), using only the default settings (SF AltschuI et al., J. Mol. Biol. 1990 215: 403-410, SF AltschuI et al., Nucleic Acids Res. 1997 25: 3389-3402).
  • the query sequence and the databases used can be peptide or nucleic, any combination being possible.
  • microparticles from samples of dry soil combine physicochemical properties favorable to the extraction of an optimal quantity of nucleic acids which, in their nature, could be representative of the genetic diversity of organisms initially present in the starting soil sample. It has been shown in particular that the method of direct extraction of nucleic acids according to the invention allows the extraction of DNA from rare microorganisms, such as certain rare Streptomyces or spore-forming microorganisms.
  • micro-particles of the soil sample for the purposes of the present invention is meant particles derived from the sample having an average size of approximately 50 ⁇ m, that is to say on average between 45 and 55 .mu.m /.
  • the micro-particles are obtained from soil samples previously dried or desiccated and then ground until micro-particles of average size between 2 ⁇ m and 50 ⁇ m, before resuspension in a liquid buffer medium of the microparticles obtained.
  • Such a liquid buffer medium can consist of a nucleic acid extraction buffer, in particular a conventional DNA extraction buffer well known to those skilled in the art.
  • the grinding of the soil sample into microparticles has the dual function of mechanically lysing the majority of the organisms present in the initial soil sample and of making non-lysed organisms accessible by this mechanical treatment at optional later stages of lysis. chemical and / or enzymatic.
  • a first object of the invention consists of a method of preparing a collection of nucleic acids from a soil sample containing organisms, said method comprising a first step (l- (a)) of obtaining micro-particles by grinding the soil sample previously dried or desiccated, then suspending the micro-particles in a liquid buffer medium.
  • the grinding step is carried out using an agate or tungsten ball device or even using a tungsten ring device.
  • agate or tungsten ball device or even using a tungsten ring device.
  • These devices are preferred because the hardness of materials such as agate or tungsten significantly facilitates the production of microparticles of the size specified above. For this reason, we will not preferentially choose, or even avoid, recourse to a glass ball grinding device, which has proved to be much less effective.
  • the drying or classification of the soil sample can be carried out by any method known to those skilled in the art. For example, the raw soil sample can be dried at room temperature for 24 to 48 hours.
  • the liquid buffer medium can consist of a medium for extracting the DNA present in the microparticles.
  • An extraction buffer designated TENP containing 50 mM tris, 20 mM EDTA, 100 mM NaCl and 1% (weight / volume) of polyvinylpolypyrrolidone, at pH 9.0, will be used most preferably.
  • the method of preparing a collection of nucleic acids from a soil sample is further characterized in that the step of obtaining microparticles by grinding the previously dried or desiccated soil sample is followed by a step 1- (b) of extraction of the nucleic acids present in the microparticles.
  • a step of purifying the DNA extracted from the microparticles of the soil sample meeting the selectivity and yield criteria defined above comprises a treatment of the extracted DNA by a combination of two successive chromatography steps, respectively a molecular sieve chromatography and an anion exchange chromatography.
  • step I- (b) of extraction of the nucleic acids is followed by a step l- (c) of purification of the nucleic acids extracted using the two steps of chromatography following:
  • the chromatographic medium of the type "molecular sieve" of the nucleic acid purification step above consists of a Sephacryl type of chromatographic support ®
  • the chromatographic medium anion exchange used in the second stage of purification of the extracted DNA is a media type Elutip ® d, or a chromatographic support with equivalent characteristics.
  • Contaminants such as humic acids severely affect the analyzes and subsequent uses of the nucleic acids whose purification is sought.
  • the micro-particles of the soil sample can be the subject of subsequent steps of chemical, enzymatic or physical lysis treatment, or else of a combination of chemical, enzymatic or physical treatments.
  • step l- (a) is followed by the following steps:
  • a sonication treatment of a device of the titanium micro-tip type, such as the 600 W Vibracell Ultrasound icator device sold by the company Bioblock or a Cup Horn type sonicator.
  • the sonication stage is carried out at a power of 15 W for a period of 7 to 10 min and comprises successive sonication cycles, the actual sonication being carried out for 50% of the duration of each cycle.
  • step l- (a) is followed by the following steps:
  • the incubation step in the presence of lysozyme and achromopeptidase will be carried out at a final concentration of 0.3 mg / ml of each of the two enzymes, preferably for 30 minutes at 37 ° C.
  • the SDS will be used at a final concentration of 1% and for an incubation time of 1 hour at a temperature of 60 ° C before centrifugation and precipitation.
  • step l- (a) is followed by the following steps:
  • the suspensions of soil micro-particles are vortexed and then homogenized by gentle agitation on a circular rotation agitator for a period of two hours before being frozen at ⁇ 20 ° C.
  • the suspensions are again agitated violently by vortexing for 10 minutes, after thawing and before the sonication step.
  • nucleic acids extracted by the embodiments of the direct nucleic acid extraction process described above are preferably purified according to the purification step consisting of a first pass on molecular sieve and then a subsequent pass. elution fractions obtained after chromatography on a molecular sieve on an anion exchange chromatographic support.
  • said sample of the environment undergoes a first treatment such as to allow separation organisms contained in this sample, other macroconstituents in the sample.
  • This second embodiment of the method for preparing a collection of nucleic acids according to the invention promotes the obtaining of large nucleic acids, which are practically impossible to obtain according to the first embodiment of the method according to the invention described above, the mechanical lysis step carried out to obtain micro-particles also having the effect of physically breaking the nucleic acids of the soil sample or of the nucleic acids contained in the organisms of the sample of ground.
  • nucleic acids Obtaining large nucleic acids has been sought by the applicant with the aim of isolating and characterizing nucleic acids comprising, at least partially, all of the coding sequences belonging to the same operon capable of directing biosynthesis a compound of industrial interest.
  • nucleic acids having a size greater than 100 are obtained by implementing the second embodiment of the method for preparing a collection of nucleic acids from a soil sample according to the invention.
  • kb preferably greater than 200, 250 or 300 kb, and very preferably nucleic acids of size greater than 400, 500 or even 600 kb.
  • nucleic acids from a sample of the environment according to the invention consists of a combination of four successive steps intended for obtaining nucleic acids having the characteristics described above.
  • the environmental sample is a soil sample
  • a first step of obtaining a suspension by dispersion of the soil sample in liquid medium favored the accessibility of the organisms contained in the sample without causing significant mechanical lysis of the cells.
  • the first step of obtaining a dispersion of the above soil sample makes the sample organisms accessible to the outside environment and also allows a partial dissociation of the sample organisms and the macro-constituents. It thus makes possible a subsequent separation of the organisms initially contained in the sample from the other constituents of the latter.
  • a preliminary treatment by grinding is necessary in order to make the organisms of the associated microflora accessible at the later stages of the process.
  • the present process comprises a step of separation of the organisms from the other mineral and / or organic constituents obtained previously by centrifugation on a density gradient.
  • the organisms thus separated are then subjected to a step of lysis and then extraction of the nucleic acids.
  • the centrifugation step on a density gradient surprisingly made it possible to separate the cells of organisms from the soil particles contained in the suspension of the sample.
  • a density gradient centrifugation of a soil sample made it possible to find, at the aqueous phase / gradient interface, a population of organisms representative of the diversity organisms present in the initial sample, because these organisms are of extremely variable volume, density and shape.
  • a density gradient centrifugation of a soil sample made it possible to find, at the aqueous phase / gradient interface, a population of organisms representative of the diversity organisms present in the initial sample, because these organisms are of extremely variable volume, density and shape.
  • a step of germination of the spores, in particular of actinomycetes is carried out, which has the effect of significantly increasing the amount of actinomycete DNA recovered.
  • the last step consists of a step of purification of the nucleic acids thus extracted on a cesium chloride gradient.
  • the purification of nucleic acids on the cesium chloride gradient allows a substantial, even complete elimination, of the substances making up the density gradient. This characteristic is decisive with regard to the subsequent use of the purified nucleic acids since the density gradient is known as a powerful enzymatic inhibitor, capable if necessary of inhibiting the catalytic activity of the enzymes used to prepare the insertion of the acids. nucleic acids extracted into vectors.
  • the method for preparing a collection of nucleic acids from a sample of the environment containing organisms according to the invention comprises the following sequence of steps:
  • step (ii) separation of the organisms from the other mineral and or organic constituents of the homogeneous suspension obtained in step (i) by centrifugation on a density gradient;
  • step (iii) lysis of the microorganisms separated in step (ii) and extraction of the nucleic acids; (iv) purification of the nucleic acids on a cesium chloride gradient.
  • the suspension of the soil sample is obtained by dispersing this sample by grinding using a device of the Waring Blender type or a device with equivalent characteristics.
  • the sample suspension is obtained after three successive grindings of a duration of one minute each in a device of the Waring Blender type.
  • the ground sample will be cooled in ice between each of the grindings.
  • the organisms are then separated from the soil particles by centrifugation on a density cushion of the "Nycodenz” type, sold by the company Nycomed Pharma AS. (Oslo, Norway).
  • the preferred centrifugation conditions are 10,000 g for 40 minutes at 4 ° C., advantageously in a rotor with movable bowls of the "TST 28.38 rotor” type sold by the company KONTRON.
  • the ring of organisms localized, after centrifugation, at the interphase of the upper aqueous phase and the lower phase of Nycodenz is then removed and washed by centrifugation before resumption of the cell pellet in an appropriate buffer.
  • Step (iii) of lysis of the organisms separated in step (ii) described above can be carried out in any manner known to those skilled in the art.
  • the cells are lysed in a solution
  • the actual DNA extraction can advantageously be carried out by adding a solution of lauryl sarcosyl (1% of the final weight of the solution) in the presence of proteinase K and incubation of the final solution at 37 ° C. for 30 minutes .
  • the nucleic acids extracted in step (iii) are then purified on a cesium chloride gradient.
  • the step of purification of the nucleic acids on a cesium chloride gradient is carried out by centrifugation at 35,000 revolutions / minute for 36 hours, for example on a rotor of the Kontron 65.13 type.
  • said nucleic acids consist mainly, if not exclusively, of DNA molecules.
  • the nucleic acids can be recovered after inclusion of the organisms, separated on a density gradient, in an agarose block and lysis, for example chemical and / or enzymatic, of the organisms included in the agarose block.
  • Another subject of the invention consists of a collection of nucleic acids consisting of the nucleic acids obtained in step ll- (iv) of the process for preparing a collection of nucleic acids according to the invention or also obtained in the step (c) or a subsequent step of the process for preparing a collection of nucleic acids according to the invention.
  • the invention also relates to a nucleic acid characterized in that it is contained in a collection of nucleic acids as defined above.
  • such a nucleic acid constituting a collection of nucleic acids according to the invention is characterized in that it comprises a nucleotide sequence coding for at least one operon, or part of an operon. Most preferably, such an operon codes for all or part of a metabolic pathway.
  • Example 9 describes the construction of a genomic DNA library from a strain of Streptomyces alboniger and its cloning in the shuttle cosmids pOS700l and pOS700R respectively. It has been shown according to the invention that in the DNA library produced in the integrative vector pOS700l nine clones contain nucleotide sequences belonging to the operon responsible for the puromycin biosynthetic pathway. Likewise, it could be identified within the DNA library produced in the replicative vector pOS 700R twelve. clones containing nucleotide sequences of the operon responsible for the puromycin biosynthetic pathway.
  • certain integrative and replicative cosmids of the libraries produced present, after digestion with the restriction endonucleases Clal and EcoRV, a fragment with a size of 12 kb capable of containing all the sequences of the operon responsible for the biosynthesis pathway puromycin.
  • a nucleic acid according to the invention contains, at least in part, nucleotide sequences of the operon responsible for the puromicyne biosynthetic pathway.
  • Example 2 describes the construction of a DNA library according to a process in accordance with the present invention in a pBluescript SK ' vector from a soil contaminated with lindane.
  • the recombinant vectors were transfected into cherscherichia coli DH10B cells and then the transformed cells were cultured in an appropriate culture medium in the presence of lindane. Screening of the transformed cell clones of the library made it possible to show that, out of 10,000 clones screened, 35 of them exhibited a degradation phenotype of lindane. The presence of the linA gene in these clones could be confirmed by PCR amplification using primers specific for this gene.
  • the invention also relates to a nucleic acid containing a nucleotide sequence of the metabolic pathway causing the biodegradation of lindane. It is therefore clearly demonstrated, as described above, that a method of preparing a collection of nucleic acids from a soil sample containing organisms according to the invention as well as a method of preparing a collection of recombinant vectors containing the nucleic acids constituting the above-mentioned collection of nucleic acids was entirely suitable for the isolation and characterization of nucleotide sequences included in an operon.
  • a further demonstration of the ability of a method according to the invention to identify coding nucleotide sequences involved in a biosynthetic pathway regulated in the form of an operon is further described below: this is cloning and some characterization of sequences coding for polyketide synthases involved in the biosynthetic pathway of polyketides, which belong to a family of molecules of which certain representatives are of major therapeutic interest, in particular antibiotic.
  • the present invention therefore further relates to a nucleic acid constituting a collection of nucleic acids according to the invention, characterized in that it comprises the whole of a nucleotide sequence coding for a polypeptide.
  • a nucleic acid constituting a collection of nucleic acids according to the invention is of prokaryotic origin.
  • a nucleic acid constituting a collection of nucleic acids according to the invention comes from a bacterium or a virus.
  • a nucleic acid constituting a collection of nucleic acids according to the invention is of eukaryotic origin.
  • such a nucleic acid is characterized in that it comes from a fungus, a yeast, a plant or an animal.
  • the method according to the invention thus consists in universally amplifying a 700 bp fragment located inside a 16 S ribosomal DNA sequence, then hybridizing the amplified DNA with an oligonucleotide probe of variable specificity and finally to compare the intensity of hybridization of the sample compared to an external standard range of DNA of known sequence or origin.
  • the amplification prior to hybridization with the oligonucleotide probe makes it possible to quantify genera or species of microorganisms which are not abundant.
  • amplification with universal primers makes it possible, during hybridization, to use a large series of oligonucleotide probes.
  • the subject of the invention is also a method for determining the diversity of nucleic acids contained in a collection of nucleic acids, and very particularly of a collection of nucleic acids originating from a sample of the environment, preferably a sample of the soil, said method comprising the following steps:
  • nucleic acids of the collection of nucleic acids to be tested with a pair of oligonucleotide primers hybridizing to any bacterial 16 S ribosomal DNA sequence
  • oligonucleotide probe or a plurality of oligonucleotide probes, each probe specifically hybridizing with a 16 S ribosomal DNA sequence common to a kingdom, an order, a subclass or a bacterial genus;
  • a first pair of primers hybridizing with universally conserved regions of the 16 S ribosomal RNA gene consists respectively of the primers FGPS 612 (SEQ ID No 12) and FGPS 669 (SEQ ID No 13).
  • a second embodiment of a pair of primers preferred according to the invention consists of the pair of universal primers 63 f (SEQ ID No. 22) and 1387r (SEQ ID No. 23).
  • the amplification step using a pair of universal primers can be carried out on a collection of recombinant vectors into each of which has been inserted a nucleic acid from the collection of nucleic acids considered, prior to the hybridization step with oligonucleotide probes specific for a kingdom, an order, a subclass or a particular bacterial genus.
  • Such a method for determining the diversity of nucleic acids contained in a collection is very particularly applicable to collections of nucleic acids obtained in accordance with the teaching of the present description.
  • Example 3 details a method for preparing a collection of nucleic acids from a soil sample containing organisms, comprising a step of indirect DNA extraction by dispersing a soil sample before separation of the cells on a Nycodenz gradient, lysis of the cells then purification of the DNA on a cesium chloride gradient.
  • the nucleic acid collection thus obtained was used as such or in the form of inserts in cosmid-type vectors in an amplification process using the aforementioned universal primers of the 16 S rDNA, then the DNAs. amplified were subjected to a detection step using oligonucleotide probes of sequences SEQ ID No. 14 to SEQ ID No. 21 which are presented in Table 4.
  • nucleic acids 106 also form part of the invention, as well as the nucleic acids having at least 99%, preferably 99.5% or 99.8% identity. nucleic acids with the nucleic acids comprising the sequences SEQ ID No. 60 to SEQ ID No. 106. Such sequences can be used in particular as probes to screen clones of a DNA library and thus identify those, among the clones of the library, which contain such sequences, these sequences being likely to be in the vicinity of coding sequences of interest, such as sequences coding for enzymes involved in the pathway for biosynthesis of antibiotic metabolites, for example polyketides.
  • nucleic acids contained in a collection of nucleic acids according to the invention come from ⁇ -proteobacteria, ⁇ -proteobacteria, ⁇ -proteobacteria, ⁇ -proteobacteria, actinomycetes as well as a genus related to acidobacterium.
  • Each of the nucleic acids contained in a collection of nucleic acids prepared in accordance with the invention can be inserted into a cloning and / or expression vector.
  • vectors known from the prior art can be used, such as viral vectors, phages, plasmids, phagemids, cosmids, phosmids, BAC type vectors, P1 bacteriophages, BAC type vectors, YAC type vectors, yeast plasmids or any other vector known to the state of technique by those skilled in the art.
  • vectors allowing stable expression of the nucleic acids of a DNA library.
  • such vectors preferably include transcription regulation sequences which are located in phase ("operably linked") with the genomic insert so as to allow the initiation and / or regulation of the expression of at least part of said DNA insert.
  • the invention also relates to a process for the preparation of a collection of recombinant vectors characterized in that the nucleic acids obtained in step ll- (iv) or in step l- (c ) or any other subsequent step in a process for preparing a collection of nucleic acids from a soil sample containing organisms according to the invention are inserted into a cloning and / or expression vector.
  • the nucleic acids constituting a collection of nucleic acids according to the invention can be separated according to their size, for example by electrophoresis on a gel. agarose, if necessary after digestion using a restriction endonuclease.
  • the average size of the nucleic acids constituting a collection of nucleic acids according to the invention can be made of a substantially uniform size by the implementation of a physical rupture step prior to their insertion into the cloning and / or expression vector.
  • a step of physical or mechanical rupture of the nucleic acids can consist of successive passages of the latter, in solution, in a metal channel of approximately 0.4 mm in diameter, for example the channel of a syringe needle having a such diameter.
  • the average size of the nucleic acids can in this case be between 30 and 40 kb in length.
  • the construction of the preferred vectors according to the invention is shown in FIGS. 25 (integrative cosmid conjugate) and 26 (integrative BAC).
  • Cloning and / or expression vectors which can advantageously be used for the insertion of nucleic acids contained in a DNA collection or library according to the invention are in particular the vectors described in European patent N ° EP-0 350 341 and in US Pat. No. 5,688,689, such vectors being specially adapted for the transformation of strains of actinomycetes.
  • Such vectors contain, in addition to a DNA sequence of the insert, an att attachment sequence as well as a DNA sequence coding for an integrase (int sequence) functional in the strains of actinomycetes.
  • the applicant first sought to increase expression of the integrase gene by substituting for the initial transcription promoter a transcription promoter capable of significantly increasing the number of integrase transcripts.
  • the applicant was able to show that the lack of stability of the integrase transcripts was caused by deficits in the termination of the transcription of the corresponding messenger RNA.
  • the applicant then inserted a terminator site placed downstream of the sequence coding for the integrase of the vector so as to obtain a messenger RNA of determined size.
  • the insertion of an additional termination signal downstream of the nucleotide sequence coding for the integrase of the vector has made it possible to obtain a family of integrative vectors of cosmid type and of BAC type.
  • the terminating site is placed downstream of the att attachment site.
  • the applicant has developed new conjugate vectors and new replicative vectors of the cosmid type and new conjugate vectors of the BAC type which can advantageously be used for the insertion of the nucleic acids constituting a collection of nucleic acids. prepared according to the process of the invention.
  • vectors of the cosmid type capable of receiving inserts having a maximum size of approximately 50 kb.
  • cosmid vectors are very particularly suitable for the insertion of nucleic acids constituting a collection of nucleic acids obtained according to the method of the invention comprising a first step of direct DNA extraction by mechanical lysis of the organisms contained in the initial soil sample.
  • BAC type vectors capable of receiving DNA inserts of such size.
  • Such BAC type vectors are very particularly suitable for the insertion of the nucleic acids constituting a collection of nucleic acids obtained in accordance with the method according to the invention in which the first step consists of an indirect extraction of DNA. by prior separation of the organisms contained in the initial soil sample and elimination of the macro-constituents of said soil sample.
  • vectors of the BAC type are advantageously used for the insertion of large nucleic acids containing, at least partially, the nucleotide sequence of an operon.
  • the process for preparing a collection of recombinant cloning and / or expression vectors according to the invention is further characterized in that the cloning and / or expression vector is of the plasmid type.
  • such a method is characterized in that the cloning and / or expression vector is of the cosmid type.
  • it may be a replicative cosmid in E. coli and integrative in Streptomyces.
  • An entirely preferred cosmid vector corresponding to such a definition is the cosmid pOS700l described in Example 3.
  • the cosmid vector is conjugative and integrative in Streptomyces.
  • conjugate vectors of the cosmid type or of the BAC type which include in their nucleotide sequences a motif recognized by the cellular enzymatic machinery called "origin of conjugation" are used whenever it is desired to avoid the use of techniques. heavy and not very automated transformation.
  • the transfection of vectors initially hosted by E. coli cells into Streptomyces cells conventionally requires a stage of recovery of the recombinant vector contained in Esche chia coli cells, and its purification prior to the stage of transformation of protoplasts of Streptomyces. It is commonly accepted that a transfection of a set of 1000 clones of Escherichia coli in Streptomyces requires obtaining approximately 8000 clones so that each clone of E. coli has a chance to be represented.
  • a transfection step by conjugation of a vector hosted by E.coli to Streptomyces cells requires the same number of clones of each of the microorganisms, the conjugation step taking place "clone to clone" and also not understanding the technical difficulties associated with the step of transferring genetic material by transformation of protoplasts, for example in the presence of polyethylene glycol.
  • novel conjugation vectors of cosmid type and of BAC type have been developed according to the invention so as to allow maximum efficiency of the conjugation step.
  • the new conjugative vectors according to the invention have been constructed by placing a selection marker gene at the end of the DNA of the vector which is lastly transferred to the receptor bacteria.
  • Conjugative and integrative cosmids in Streptomyces preferred according to the invention are the cosmids pOSV303, pOSV306 and pOSV307 described in Example 5.
  • a process for preparing a collection of recombinant vectors according to the invention is implemented. works with a replicating cosmid both in E. coli and in Streptomyces. Such a cosmid is advantageously the cosmid pOS 700R described in Example 6.
  • the above method can be implemented with a replicative cosmid in E. coli and Streptomyces and conjugative in Streptomyces.
  • Such a replicative and conjugative cosmid can be obtained from a replicative cosmid according to the invention, by the insertion of a appropriate transfer origin, such as RK2, as described in Example 5 for the construction of the vector pOSV303.
  • a transfer origin such as RK2
  • BAC-type cloning and / or expression vector use is made of a BAC-type cloning and / or expression vector.
  • the vector of the BAC type is integrative and conjugative in Streptomyces.
  • such an integrative and conjugative BAC vector in Streptomyces is the BAC vector pOSV 403 described in Example 8, or else the BAC vectors pMBD-1, pMBD-2, pMBD-3, pMBD-4, pMBD-5 and pMBD-6 described in Example 15.
  • the invention further relates to a recombinant vector characterized in that it is chosen from the following recombinant vectors: a) a vector comprising a nucleic acid constituting a collection of nucleic acids according to the invention; b) a vector as obtained according to a method eliminating any recourse to the action of a restriction endonuclease on the DNA fragment to be inserted, as described previously.
  • the invention also relates to a vector chosen from the following vectors:
  • the invention further relates to a collection of recombinant vectors as obtained according to any one of the methods according to the invention.
  • a method for preparing a recombinant cloning and / or expression vector according to the invention is characterized in that the insertion of a nucleic acid into the cloning and / or expression vector , includes the following steps:
  • the first homopolymeric nucleic acid is of poly (A) or poly (T) sequence
  • - the second homopolymeric nucleic acid is of poly (T) or poly (A) sequence.
  • the homopolymeric nucleic acids have a length of between 25 and 100 nucleotide bases, preferably between 25 and 70 nucleotide bases.
  • the process for the preparation of a recombinant cloning and / or expression vector described above is particularly suitable for the construction of DNA libraries in BAC type vectors.
  • said method is further characterized in that the size of the nucleic acid to be inserted is at least 100 kb, and preferably at least 200, 300, 400, 500 or 600 kb.
  • Such a preparation process is therefore particularly suitable for the insertion of the nucleic acids contained in a collection of nucleic acids obtained according to the process of the invention.
  • Such a method of preparing a recombinant cloning and / or expression vector according to the invention is characterized in that the step of inserting a nucleic acid in said cloning and / or expression vector comprises the following steps:
  • the elimination of the outgoing 3 ′ sequences is carried out using an exonuclease, such as the Klenow enzyme.
  • the filling of the outgoing 5 ′ sequences is carried out using a polymerase, and very preferably T4 polymerase, in the presence of the four nucleotide triphosphates.
  • a process for preparing a recombinant cloning and / or expression vector by eliminating the outgoing 3 'sequences and filling in the outgoing 5' sequences as described above is particularly suitable for the construction of DNA libraries from of cosmid-like vectors.
  • oligonucleotides comprising one or more rare restriction sites are added to the vector at the level of the cloning site of the DNA to be inserted, in accordance with the teaching of Example 10. This addition of oligonucleotides facilitates the subsequent recovery of the inserts without cleavage of the latter.
  • any type of host cell can be used for transfection or transformation with a nucleic acid or a recombinant vector according to the invention, in particular a prokaryotic or eukaryotic host cell, use will preferably be made of host cells whose physiological, biochemical and genetic characteristics are well characterized, easily cultivable on a large scale and whose culture conditions for the production of metabolites are well known.
  • the host cell receiving a nucleic acid or a recombinant vector according to the invention is phylogenetically close to the donor organisms initially contained in the sample from the environment from which the nucleic acids originate.
  • a host cell according to the invention must have a use of codons similar to, or at least close to, the donor organisms initially present in the environmental sample, especially the soil sample.
  • the size of the DNA fragments capable of carrying the nucleotide sequences of interest sought can be variable.
  • enzymes encoded by genes of average size of 1 kb can be expressed from small inserts while the expression of secondary metabolites will require the maintenance in the host organism of fragments of much larger size, for example from 40 kb to more than 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb or 600 kb.
  • Eschenchia coli host cells are a preferred choice for cloning large DNA fragments.
  • strains of Eschenchia coli can be advantageously used for the construction of a DNA library according to the invention, such as the strains E.coli Sure, E.coli DH5 ⁇ , or even E.coli 294 ( ATCC No. 31446).
  • E. coli host cells can in all cases constitute transient hosts in which the recombinant vectors according to the invention can be maintained with great efficiency, the genetic material being able to be easily manipulated and archived and stably.
  • cellular hosts can also be advantageously used, such as cells of Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Myxococcus, Aspergillus nidulans or even Neurospora crassa.
  • Streptomyces lividans cells can be used with success and constitute expression systems complementary to Eschenchia coli.
  • Streptomyces lividans is a model for studying the genetics of Streptomyces and has also been used as a host for heterologous expression of many secondary metabolites. Streptomyces lividans, has in common with other actinomycetes such as Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Streptomyces fradiae, as well as Streptomyces griseochromogenes, precursor molecules and regulatory systems necessary for the expression of all or part of the complex biosynthetic pathways, such as for example the pathway for biosynthesis of polyketides or the pathway for biosynthesis of non-ribosomal polypeptides representing classes of molecules of very diverse structures.
  • actinomycetes such as Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Streptomyces fradiae, as well as Streptomyces griseochromogenes, precursor molecules and regulatory systems necessary for the expression of all or part of the complex biosynthetic pathways
  • Streptomyces lividans also has the advantage of accepting foreign DNA with high transformation efficiencies.
  • the invention also relates to a recombinant host cell comprising a nucleic acid according to the invention, constituting a collection of nucleic acids prepared according to a process in accordance with the invention, or a recombinant host cell comprising a recombinant vector as defined above.
  • a recombinant cell according to the invention is a bacterium, and very preferably a bacterium chosen from E.coli and Streptomyces.
  • a recombinant host cell according to the invention is characterized in that it is a yeast or else a filamentous fungus.
  • the invention also relates to a collection of recombinant host cells, each of the constituent host cells of the collection comprising a nucleic acid originating from a collection of nucleic acids produced according to a method for preparing a collection of nucleic acids. from a soil sample containing organisms as described above.
  • the invention also relates to a collection of recombinant host cells, each of the constituent host cells of the collection comprising a recombinant vector according to the invention. Due to the large size of the inserts it is necessary to have maximum processing efficiency. For this purpose, a Streptomyces lividans receptor strain constitutively expressing the integrase of pSAM2 in order to promote the site-specific integration of the vector is preferred. For this, the int gene under the control of a strong promoter is integrated into the chromosome. The overproduction of integrase does not induce excision phenomena (Raynal et al., 1998).
  • a collection of recombinant host cells was obtained after transfection of the host cells by a collection of recombinant vectors each containing a nucleic acid insert from a collection of nucleic acids prepared according to the method according to the invention .
  • DNA fragments obtained according to the method of the invention in which a step of indirect DNA extraction from the organisms contained in the soil sample is implemented were first of all cloned into the integrative cosmid pOS700l.
  • the step of inserting the DNA fragments into the integrative cosmid pOS700l was carried out according to the method of the invention in which tails of homopolymeric polynucleotides poly (A) and poly (T) were added at the end 3 'respectively of the vector nucleic acid and DNA fragments to be inserted.
  • the recombinant vectors thus constructed were packaged in lambda phage heads and the phages obtained were used to infect E. coli cells according to techniques well known to those skilled in the art.
  • This bank of clones was screened with pairs of primers specific for a nucleotide sequence coding for a enzyme involved in the polyketide biosynthesis pathway, the PKS type I enzyme, also known as ⁇ -ketoacyl synthase.
  • polyketides constitute a chemical class of great structural diversity comprising a large number of molecules of pharmaceutical interest such as tylosin, monensin, vermectin, erythromycin, doxorubicin or even FK506.
  • Polyketides are synthesized by condensation of acetate molecules under the action of enzymes called polyketide synthases (PKSs).
  • PKSs polyketide synthases
  • Polyketide synthases type II are generally involved in the synthesis of polycyclic aromatic antibiotics and catalyze the condensation of acetate units iteratively.
  • Polyketide synthases type I are involved in the synthesis of macrocyclic polyketides or macrolides and constitute multifunctional modular enzymes.
  • nucleotide sequences coding for polyketide synthases of type I made it possible to identify recombinant clones containing DNA inserts comprising a sequence nucleotide encoding new polyketide synthases.
  • the nucleotide sequences coding for these new polyketide synthases are referenced as the sequences SEQ ID No. 33 to SEQ ID No. 44 and SEQ ID No. 115 to SEQ ID No. 120.
  • Another subject of the invention consists of a nucleic acid coding for a new polyketide synthase I, characterized in that it comprises one of the nucleotide sequences SEQ ID No. 34 to SEQ ID No. 44 and SEQ ID No. 115 at SEQ ID N ° 120.
  • such a nucleic acid is in an isolated and / or purified form.
  • the invention also relates to a recombinant vector comprising a polynucleotide comprising one of the sequences SEQ ID No. 34 to SEQ ID No. 44 and SEQ ID No. 115 to SEQ ID No. 120
  • the invention also relates to a recombinant host cell comprising a nucleic acid chosen from polynucleotides comprising one of the nucleotide sequences SEQ ID No. 34 to SEQ ID No. 44 and SEQ ID No. 115 to SDEQ ID No. 120 as well than to a recombinant host cell comprising a recombinant vector into which is inserted a polynucleotide comprising one of the nucleotide sequences SEQ ID No. 34 to SEQ ID No. 44 and SEQ ID No. 115 to SEQ ID No. 120.
  • the recombinant vectors containing a DNA insert coding for a new polyketide synthase type I according to the invention are vectors for cloning and expression.
  • a recombinant host cell as described above is a bacterium, a yeast or even a filamentous fungus.
  • amino acid sequences of new polyketide synthases originating from organisms contained in a soil sample have been deduced from the nucleotide sequences SEQ ID No. 34 to SEQ ID No. 44 AND SEQ ID No. 115 to SEQ ID No. 120 below. above. These are polypeptides comprising one of the amino acid sequences SEQ ID No. 48 to SEQ ID No. 59 and SEQ ID No. 121 to 126.
  • the invention also relates to new polyketide synthases comprising an amino acid sequence chosen from the sequences SEQ ID No. 48 to SEQ ID No. 59 and SEQ ID No. 121 to SEQ ID No. 126.
  • nucleotide sequence SEQ ID No 114 which comprises six open reading frames which respectively encode the polypeptides of sequences SEQ ID No 121 to SEQ ID No 126.
  • nucleotide sequence SEQ ID No. 113 of the cosmid a26G1 which contains the sequence complementary to the sequence SEQ ID No. 114.
  • Genomic DNA was also extracted and amplified according to the invention from pure bacterial strains, such as
  • PCR amplification of the DNA of each of the bacterial strains described above was carried out using pairs of primers specific for polyketide synthase type I nucleic sequences.
  • New bacterial polyketide synthase type I genes were thus isolated and characterized. These are the nucleic sequences of sequences SEQ ID No. 30 to SEQ ID No. 32.
  • a subject of the invention is therefore also nucleotide sequences coding for new type I polyketide synthases chosen from polynucleotides comprising one of the nucleotide sequences SEQ ID No. 30 to SEQ ID No. 32.
  • Also part of the invention are recombinant vectors comprising the nucleotide sequences coding for new polyketide synthase type I defined above.
  • the invention also relates to recombinant host cells characterized in that they contain a nucleic acid coding for a new polyketide synthase type I comprising a nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID No. 30 to SEQ ID No. 32 as well as Recombinant host cells comprising a recombinant vector as defined above.
  • the subject of the invention is also polypeptides encoded by sequences comprising the nucleic acids SEQ ID Nos. 30 to 32, and more precisely polypeptides comprising the amino acid sequences SEQ ID No. 47 to SEQ ID No. 50.
  • the subject of the invention is also a process for the production of a polyketide synthase type I according to the invention, said process for producing comprising the following steps: - Obtaining a recombinant host cell comprising a nucleic acid coding for a polyketide synthase type I comprising a nucleotide sequence chosen from the sequences SEQ ID No. 33 to SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 30 to SEQ ID No. 32 and SEQ ID No. 115 to SEQ ID No. 120;
  • the new type I polyketide synthases obtained according to the method described above can be characterized by fixation on an immunoaffinity chromatography column on which antibodies recognizing these polyketide synthases have been immobilized beforehand.
  • HPLC high performance liquid chromatography techniques
  • reverse phase chromatography techniques such as reverse phase chromatography techniques.
  • anion or cation exchange chromatography well known to those skilled in the art.
  • polyketide synthases recombinant or non-recombinant, according to the invention can be used for the preparation of antibodies.
  • the invention therefore also relates to an antibody specifically recognizing a polyketide synthase type I according to the invention or a peptide fragment of such a polyketide synthase.
  • the antibodies according to the invention can be monoclonal or polyclonal.
  • Monoclonal antibodies can be prepared from of hybridoma cells according to the technique described by KOHLER and MILSTEIN C. (1975), Nature, Vol. 256: 495.
  • the polyclonal antibodies can be prepared by immunization of a mammal, in particular mice, rats or rabbits with a polyketide synthase of type I according to the invention, if necessary in the presence of an adjuvant compound of immunity, such as Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, aluminum hydroxide or a compound from the family of muramyl peptides.
  • an adjuvant compound of immunity such as Freund's complete adjuvant, Freund's incomplete adjuvant, aluminum hydroxide or a compound from the family of muramyl peptides.
  • the antibody fragments such as the Fab, Fab ', F (ab') 2 fragments, or even the single chain antibody fragments containing the variable part (ScFv) described by MARTINEAU et al. (1998) J. Mol. Biol., Vol.
  • the antibody preparations according to the invention are useful in particular in qualitative or quantitative immunological tests aimed either at simply detecting the presence of a polyketide synthase type I according to the invention, or at quantifying the amount of this polyketide synthase, for example in the culture supernatant or the cell lysate of a bacterial strain capable of producing such an enzyme.
  • Another subject of the invention consists of a method for detecting a polyketide synthase type I according to the invention or a peptide fragment of this enzyme, in a sample, said method comprising the steps of:
  • the invention also relates to a kit or kit for detecting a polyketide synthase type I according to the invention in a sample, comprising: a) an antibody according to the invention; b) where appropriate, reagents necessary for the detection of the antigen / antibody complex possibly formed.
  • An antibody directed against a polyketide synthase type I according to the invention can be labeled using a detectable isotopic or non-isotopic marker, according to methods well known to those skilled in the art.
  • the subject of the invention is therefore a method for detecting a nucleic acid of determined nucleotide sequence, or of nucleotide sequence structurally related to a determined nucleotide sequence, in a collection of recombinant host cells according to the invention, characterized in that it includes the following stages:
  • the invention also relates to a method for detecting a nucleic acid, of determined nucleotide sequences, or of nucleotide sequences structurally related to a determined nucleotide sequence, in a collection of recombinant host cells according to the invention, characterized in that it comprises the following steps:
  • the recombinant clones of interest were detected by their phenotype corresponding to their ability to degrade lindane.
  • the isolated clones and / or clone sets of the prepared DNA library were cultured in a culture medium in the presence of lindane and the degradation of lindane was observed by the formation of a halo disorder in the immediate environment of the cells.
  • the invention also relates to a method for identifying the production of a compound of interest by one or more recombinant host cells in a collection of recombinant host cells according to the invention, characterized in that it comprises the following steps:
  • the subject of the invention is also a method for selecting a recombinant host cell producing a compound of interest from a collection of recombinant host cells according to the invention, characterized in that it comprises the following steps:
  • the invention also relates to a process for the production of a compound of interest, characterized in that it comprises the following steps:
  • a compound of interest according to the invention may consist of a polyketide produced by the expression of at least one nucleotide sequence comprising a sequence chosen from the sequences SEQ ID N ° 33 to 44, SEQ ID N ° 30 to 32 and SEQ ID N ° 1 15 to SEQ ID N ° 120.
  • the invention also relates to a composition comprising a polyketide produced by the expression of at least one nucleotide sequence comprising a sequence chosen from the sequences SEQ ID No. 33 to SEQ ID No. 44, SEQ ID No. 30 to SEQ ID N ° 32, and SEQ ID N ° 115 to SEQ ID N ° 120.
  • a polyketide produced by the expression of at least one nucleotide sequence above is preferably the product of the activity of several coding sequences included within a functional operon whose translation products are the different enzymes necessary for the synthesis of a polyketide, one of the above sequences being understood and expressed in said operon.
  • Such an operon comprising a nucleic acid sequence according to the invention coding for a polyketide synthase can be constructed for example according to the teaching of Borchert et al. (1992).
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a pharmacologically active amount of a polyketide according to the invention, where appropriate in combination with a pharmaceutically compatible vehicle.
  • Such pharmaceutical compositions will advantageously be suitable for the administration, for example parenterally, of an amount of a polyketide synthesized by a polyketide synthase of type I according to the invention ranging from 1 ⁇ g / kg per day to 10 mg / kg per day, preferably at least 0.01 mg / kg per day and most preferably between 0.01 and 1 mg / kg per day.
  • compositions according to the invention can be administered either orally, rectally, parenterally, intravenously, subcutaneously or even intradermally.
  • the invention also relates to the use of a polyketide obtained by the expression of a polyketide synthase type I according to the invention for the manufacture of a medicament, in particular of a medicament with antibiotic activity.
  • FIG. 1 illustrates the diagram of the different lysis steps carried out according to protocols 1, 2, 3n 4a, 4b, 5a, and 5b described in Example 1.
  • Figure 2 illustrates one. 0.8% agarose gel electrophoresis of DNA extracted from 300 mg of soil no. 3 (Côte St André) after various lysis treatments (protocols 1 to 5, see Fig. 1).
  • M lambda phage molecular weight marker
  • Figure 3 illustrates the proportion of different genera of actinomycetes cultivated following treatments 1 to 5 (see Fig. 1).
  • the number of cfu colony forming unit
  • Figure 4 illustrates the. recovery of lambda phage DNA digested with Hind ⁇ added in soils at different concentrations before (G) or after (G * ) grinding.
  • T treatments thermal shock
  • S sonication
  • the quantification was carried out by phospho-imager analysis after dot-blot hybridization. A sample of each soil was used for each concentration of lambda phage added. The soil characteristics are reproduced in Table 1. The samples corresponding to 10 and 15 ⁇ g of added DNA were not treated.
  • Figure 5 illustrates the PCR amplification of DNAs extracted from soil No. 3 according to protocols 1, 2, 3, 5a and 5b.
  • Primers FGPS 122 and FGPS 350 (Table 2) were used to target Streptosporangium spp. native. The DNA extracts were used undiluted or diluted 1/10 th and 1/100 th .
  • M 123 bp molecular weight marker (Gibco BRL),
  • C amplification control without DNA.
  • Figure 6 illustrates the quantities of DNA extracted after inoculation of spores (a) or mycelium (b) of S. lividans OS48.3 inoculated in soils at different concentrations.
  • the amount of mycelium added to the soil corresponds to the number of spores inoculated into the germination medium. About 50% of the spores have germinated, the number of cells or genomes contained in the hyphae of the germinated spores has not been determined. The quantities of spores and mycelium inoculated are therefore not directly comparable.
  • the extraction protocol was carried out according to protocol 6 (cf. equipment and methods section).
  • the symbol (') indicates that RNA has been included in the extraction buffer.
  • the target DNA was amplified by PCR with the primers FGPS 516 and FGPS 517, the quantification was carried out by phosphoimager after hybridization in dot blot using the probe FGPS 518. A sample of each sol was used for each concentration of hyphae or spores. The soil characteristics are described in Table 1.
  • FIG. 7 represents the phylogenetic tree obtained by the Neighbor Joining algorithm, positioning the 16S rDNA sequences contained in the soil DNA bank, with respect to cultured reference bacteria.
  • gray the sequences from the clone pools of the bank.
  • the bootstrap values are indicated at the node level, after resampling 100 repetitions.
  • the scale bar indicates the number of substitutions per site.
  • the access number of the sequences in the Genbank database is indicated in brackets.
  • FIG. 8 represents a diagram of the vector pOSint 1.
  • FIG. 9 represents a diagram of the vector pWED1.
  • FIG. 10 represents a diagram of the vector pWE15 (ATCC No. 37503).
  • FIG. 11 represents a diagram of the vector pOS 700I.
  • FIG. 12 represents a diagram of the vector pOSV010.
  • FIG. 13 represents the fragment containing a "cos" site inserted into the plasmid pOSV010 during the construction of the vector pOSV 303.
  • FIG. 14 represents a diagram of the vector pOSV 303.
  • FIG. 15 represents a diagram of the vector pE116.
  • FIG. 16 represents a diagram of the vector pOS 700 R.
  • FIG. 17 represents a diagram of the vector pOSV 001.
  • FIG. 18 represents the diagram of the vector pOSV 002.
  • FIG. 19 represents a diagram of the vector pOSV 014.
  • FIG. 20 represents a diagram of the vector pBAC 11.
  • FIG. 21 represents a diagram of the vector pOSV 403.
  • FIG. 22 represents the DNA electrophoresis gels of the library after digestion with the enzymes BamHI and Dral of the positive clones of the library screened with the oligonucleotides PKS-I.
  • FIG. 23 illustrates the production of puromycin by the recombinants of S. lividans compared to the production of the wild strain S. alboniger.
  • Figure 24 illustrates Alignment of soil PKSs with conserved active sites of other PKSs.
  • the references for each peptide are indicated.
  • the beta-ketoacyl synthase domains were aligned using the PILEUP program from GCG (Wisconsin Package Version 9.1, Genetics Computer Group, Madison, Wisc).
  • Figure 25 illustrates the construction of a conjugative integrative cosmid.
  • Figure 26 illustrates the construction of an integrative conjugative BAC.
  • FIG. 27 illustrates the construction diagram of the vector pOSV 308.
  • FIG. 28 illustrates the construction diagram of the vector POSV306.
  • FIG. 29 illustrates the construction diagram of the vector pOSV307.
  • FIG. 30 illustrates the construction diagram of the vector PMBD-1.
  • FIG. 31 presents a detailed map of the plasmid pMBD-2 as well as a diagram of construction of the vector pMBD-3.
  • Figure 32 illustrates a detailed map of plasmid pMBD-4.
  • FIG. 33 illustrates the scheme of construction of the plasmid pMBD-5 from the plasmid pMBD-1.
  • Figure 34 illustrates the detailed map of the pBTP-3 vector.
  • Figure 35 illustrates the construction scheme of the vector pMBD-6 from the vector pMBD-1.
  • FIG. 36 illustrates the map of cosmid a26G1, the DNA insert of which contains open reading frames coding for several polyketide synthase.
  • FIG. 37 is a diagram representing the DNA insert (strand +) of the cosmid a26G1, on which the different reading frames coding for several polyketide synthase are positioned.
  • EXAMPLE 1 Method for preparing a collection of nucleic acids from a soil sample containing organisms, comprising a step of direct extraction of DNA from the soil sample.
  • the content of clay and organic matter ranges respectively from 9 to 47% and from 1.7 to 4.7%, the pH varying from 4.3 to 5.8.
  • Soil samples were collected from the surface layer 5-10 cm deep. All visible roots have was removed and the soils were stored at 4 ° C for a few days if necessary, after which they were dried for 24 hours at room temperature and sieved (average mesh size 2 mm) before being kept for several months at 4 ° C.
  • the avirulent strain of Bacillus anthracis was used as an inoculum of bacterial cells. Bacillus anthracis was multiplied on a culture broth of the "trypticase soy broth” (TSB) type (Biomérieux, Lyon, France) for approximately 6 hours, checking that the DO ⁇ oo was kept below 0.6. These conditions allow the development of vegetative cells without spore formation (Patra et al., (1996), FEMS Immunol. Médical Microbiology, vol.15: 223-231.). The spores of Streptomyces lividans OS48.3 (CLERC-BARDIN et al.
  • Streptosporangium fragile AC1296 (Institute Pushino, Moscow) were cultivated according to techniques described by HICKEY and TRESNER (1952).
  • the DNA of the spores and hyphae of S. Lividans was extracted from the pure cultures according to the lysis protocol 6 described below (except that no grinding was carried out), while the spores of S. hygroscopicus and S. fragile were extracted by chemical / enzymatic lysis (Hintermann et al., 1981).
  • a TENP buffer 50 mM Tris, 20 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% w / v of polyvinylpolypyrrolidone developed by PICARD (1992) was used. Similar buffers were later used by d '' other authors (CLEGG et al., 1997; KUSKE et al., 1998; ZHOU et al., 1996).
  • Tris and EDTA protect DNA from nuclease activity
  • NaCI provides a dispersing effect
  • PVPP absorbs humic acids and other phenolic compounds
  • protocol 6 This protocol was used to quantify DNA from native Actinomycetes and DNA from Gram-positive bacteria inoculated in selected soils. In all cases, the soil samples were dried and sieved as described above. After grinding, 0.5 ml of TENP buffer was added to 200 mg dry weight of soil (except for protocol 1 in which the buffer was added to unground ground).
  • the soil suspensions were Vortexed for ten minutes and centrifuged (4000 g for five minutes), after which an aliquot fraction (25 ⁇ l) of the supernatant was analyzed by gel electrophoresis (0.8% agarose).
  • Protocol 1 No lysis treatment.
  • TENP buffer was added to unground ground, a DNA extraction step was performed as described above.
  • the TENP buffer is then added and the DNA is extracted as described above.
  • the size distribution of the DNA fragments is similar regardless of the method used.
  • Protocol 3 In protocols 3 to 5, the effectiveness of several other treatments of lysis subsequent to the grinding of the soil was tested, either separately or in different combinations. Protocol 3:
  • This protocol is identical to protocol 2, except that it includes a homogenization step using an Ultraturrax type mixer (Janker and Kunkel, IKA Labortechnik, Germany) set at half the maximum speed for 5 minutes .
  • PROTOCOLS 4a and 4b are PROTOCOLS 4a and 4b:
  • Protocol 3 These protocols are identical to protocol 3 except for an additional sonication step.
  • sonicator Two types were compared: a titanium microtip sonicator (600W Vibracell Ultrason icator, Bioblock, lllkirch, France) (Protocol 4a) and a Cup Horn type sonicator (protocol 4b).
  • the Vibracell microtip producing ultrasound is in direct contact with the soil solution.
  • the soil solution is stored in tubes which are placed in a water bath through which the ultrasound passes.
  • the best compromise in terms of quantity of DNA extracted and size of fragments, consists of sonication with the titanium microtip and the Cup Horn type sonicator respectively for 7 and 10 minutes, by setting the power to 15 W and with active cycles at 50%.
  • Protocol 6 is identical to protocol 5b except that, before sonication, the soil suspensions are subjected to a Vortex treatment and then agitated by rotation on a wheel for two hours before being frozen at - 20 ° C.
  • Protocol 6 was used in the experiments in which the soils were seeded with bacterial cells as well as in the experiments in which the native actinomycetes were quantified (see below).
  • the bacterial cells were counted using an epifluorescence microscope of the Zeiss Universal type with a 100x objective. For each soil type, three filters were counted, and at least 200 cells were counted on each of the filters.
  • Actidione 50 mg / l
  • nystatin 50 mg / ml
  • Actinomycete colonies were counted after incubation for 15 days at 28 ° C.
  • total CFU The total quantity of cultivable bacteria was also determined for each of the lysis protocols 1 to 5.
  • the soil suspensions were diluted in series and seeded in triplicate on Bennett agar medium (WAKSMAN et al., 1961) supplemented with nystatin and actidione (each at 50 mg / l).
  • Each Petri dish was covered with a cellulose nitrate filter (Millipore) and incubated for three days at 28 ° C. After the colony count on the membranes, the filters were removed and the petri dishes were again incubated for 7 days at 28 ° C and then counted again.
  • a cellulose nitrate filter Millipore
  • Dilutions corresponding respectively to 0, 2.5, 5, 7.5, 10 and 15 ⁇ g of DNA / g of dry weight of soil were prepared in volumes of 60 ⁇ l. These DNA dilutions were added to batches of 5g of dry soil which were subsequently vigorously mixed by vortexing for 5 minutes before grinding.
  • Phage lambda DNA was also added to a soil before grinding at concentrations corresponding to 0, 10 and 15 ⁇ g of DNA / g of dry weight of the soil.
  • the extraction buffer is added and the DNA is extracted according to protocol 2 (see above).
  • RNA In order to determine whether the saturation of the nucleic acid adsorption sites of soil colloids could increase the recovery rate of DNA, sandy soil (soil no. 4) and the clay soil (soil No. 5) were incubated with an RNA solution before any other treatment.
  • Commercial RNA from Saccharomyces cerevisiae
  • the DNA was extracted according to protocol No. 2. It was subsequently determined that an identical effect of the addition of RNA on DNA recovery could be achieved by adding the RNA directly to the extraction buffer.
  • RNA was then added at a concentration corresponding to 50 mg of RNA / g of dry weight of the soil.
  • the hybridization membranes (GeneScreen plus, Life Science Products, Boston, United States of America) were prehybridized for at least 2 hours in 20 ml of a solution containing 6 ml of 20 x SSC, 1 ml of solution of DENHARDT's, 1 ml of 10% SDS and 5 mg of salmon sperm DNA.
  • Hybridization was carried out overnight in the same solution in the presence of a probe labeled beforehand with two membrane washes in 2 x SSC buffer for 5 minutes at room temperature, then a third wash in 2 x SSC buffer, 0.1% SDS and a fourth wash in 1 x SSC buffer, 0.1% SDS for 30 minutes at hybridization temperature.
  • the hybridization signals were quantified with a BIORAD radioanalytical imaging system (Molecular Analyst Software, BIORAD, Ivry S / Seine, France).
  • This probe which hybridizes at positions 1392-1406 of the 16.c rDNA gene of E. coli (Amann et al. (1995)) was labeled at its ends with ATP ⁇ 32 P using a T4 polynucleotide kinase (BOEHRINGER MANNHEIM , Melan, France).
  • a calibration curve was prepared from the DNA of E.coli DH5 ⁇ .
  • the conversion of stones to bacteria in the soil required simplification, assuming that the average number of copies (rm) is 7, as for E.coli.
  • HindIII digested lambda phage DNA was used to quantify the recovery of extracellular DNA. Unamplified extracts from soils, to which lambda phage DNA had been added, were hybridized with HindIII digested lambda phage DNA randomly labeled using the Klenow fragment (Boehringer Mannheim, Melan, France ).
  • the amounts of DNA were calculated by interpolation from a calibration curve prepared with the purified DNA.
  • Taq DNA polymerase (Appligene Oncor, France) was used according to the manufacturer's instructions.
  • the PCR program used for all the amplifications is as follows: initial denaturation for 3 minutes at 95 ° C, then 35 cycles consisting of 1 minute at 95 ° C, 1 minute at 55 ° C and 1 minute at 72 ° C, followed by a final extension at 72 ° C for 3 minutes.
  • the DNA isolated and purified from fragile Streptosporangium was used as a control at concentrations ranging from 100 fg to 100 ng.
  • the primers FGPS122 and FGPS350 were chosen, complementary to part of the 16S rDNA, after alignment of the 16S rDNA sequences of actynomycetes. Their specificity has been tested on a collection of strains of actynomycetes (Streptomyces, Streptosporangium and other closely related genera).
  • PCR products were hybridized with the oligonucleotide probe FGPS643 (Table 2).
  • controls of pure DNA from S. fragile were mixed with the soil extracts obtained after treatments according to the lysis protocols 4b and 5b then purified according to protocol D.
  • the soil extracts were treated with DNase (one unit of DNase / ml, GIBCO BRL) for 30 minutes at room temperature. DNase was then inactivated by heating at 65 ° C for 10 minutes. Inactivation verification was performed by PCR.
  • the humic acid concentrations were measured by spectrophotometry (DO 2 sonm) against a standard curve of commercial humic acids (Sigma). Undiluted, 10x diluted and 10x diluted Dnase sol solutions were mixed from 100. fg to 100ng of S. fragile DNA before PCR amplification.
  • increasing concentrations of Streptomyces hygroscopicus DNA from (100 pg to 1 ⁇ g) were added to the DNA of S. fragile in order to simulate the presence of non-target DNA and its influence on the PCR process.
  • each of the phases was transferred to another tube, mixed with 100 ⁇ l of the sample and left at 4 ° C overnight to allow separation.
  • the lower phase was dialyzed for one hour through a Millipore membrane in the presence of an excess of a 7.5 TE buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA at pH 7.5 and 1 M Mg Cl 2 ) in order to d '' remove excess salts.
  • Each protocol is terminated by an ethanol precipitation step, and the DNA is resuspended in 10 ⁇ l of TE 7.5 buffer.
  • the efficiency of the purification protocols was verified by PCR amplification of undiluted aliquots of the DNA solutions and of aliquots diluted 10 and x 100 times, using standard protocols (see below).
  • the quantities of hyphae of S. lividans were calculated on the basis of the number of spores from which they originate. After adding the bacterial suspensions, the soil samples are mixed vigorously by vortexing for 5 minutes before grinding. The DNA is extracted according to protocol No. 6 (see below).
  • DNA extraction was carried out according to lysis protocol No. 6. PCR amplification and hybridization were performed as described above. The primers and probes are targeted to chromosomal regions located outside the 16S region, and are highly specific for the respective organisms, so as to avoid background signals.
  • primers R499 and R500 were used (Patra et al. (1996)) and the amplification products were hybridized with the oligonucleotide probe C501 (Table 2).
  • the PCR reactions were carried out using the primers FGPS516 and FGPS517, and the amplification products were hybridized with the oligonucleotide probe FGPS518 (Table 2).
  • the amplified region is a part of the cassette specifically constructed to obtain the strain OS48.3 (CLERC-BARDIN et al., Unpublished).
  • the calibration accounts were in all cases obtained using the purified DNA of the target organism.
  • the soil suspensions were precipitated with isopropanol, and aliquots of the resuspended pellets were analyzed by gel electrophoresis, in a first step, in order to estimate the quality and the amount of DNA released.
  • a visual comparison of the intensities of the colored DNA with ultraviolet radiation allowed a semi-quantitative estimate of the effectiveness of the treatments.
  • the presence of migration profiles of multiple sizes of DNA fragments (discrete bands) and the disappearance of long fragments indicates that DNA degradation has taken place.
  • Hybridization showed that the quantities of extracellular DNA, as determined by extraction without lysis treatment (protocol No. 1), ranged from 4 ⁇ g / g for the acidic soil (No. 6) to 36 ⁇ g / g for soil n ° 3 (table 3).
  • Ground grinding increased the amounts of DNA extracted from all soils (e.g. 26 ⁇ g / g soil) for soil 6 and 59 ⁇ g / g soil ( for floor 3) (table 3; figure 2).
  • the band intensity of the smallest fragments is very low, indicating that most of the fragments are much larger than 1 kb.
  • Protocol No. 3 includes a homogenization step in an Ultraturax-type mixer device after the addition of the buffer extraction to soil samples. This step leads to an increase in the quantities of DNA extracted, as determined by dot blot hybridization for two of the soils (sandy soil No. 3 and acidic soil No. 6), while the two soils rich in organic matter (soil no. 1 and no. 2) led to the production of lower amounts of DNA.
  • Protocols No. 4a and No. 4b made it possible to assess the influence of two types of sonication on DNA yields from previously ground and homogenized soils. Sonication did not have a positive effect on
  • the number of bacteria per gram of dry weight of the soil ranged from 1.4 x 10 9 (+/- 0.4) in tropical soil No. 5 to 10 x 10 9
  • colonies of Streptomyces sp. dominated the viable actinomycete flora when no lysis treatment was applied (protocol 1), and represented 65% of the total number of colonies identified. After grinding, the percentage of colonies of Streptomyces decreased to 51%, while the proportion of colonies belonging to the genus Micromonospora increased from 14% to 41%.
  • Organisms belonging to the genera such as Streptosporangium, Actinomadura, Microbispora, Dactilosporangium and Actinoplanes appeared on the plates in small numbers (2-8% of the total number of colonies identified) after grinding, homogenization with the Ultraturrax device, and were sonicated, but were generally absent when these treatments were combined with chemical / enzymatic lysis.
  • the total number of cultivable bacteria remaining after each lysis treatment (protocols 2 to 5) was also sought for soil No. 4. The results indicate that the number of cultivable bacteria does not decrease with the intensity of the lysis treatments (approximately 2 ⁇ 10 6 CFU / g of soil in all cases, and also when a treatment is applied, as according to Protocol 1).
  • DNA could either be a fraction of extracellular DNA released from already dead organisms, which can persist in the soil for months (WARD et al., 1990), or DNA released from organisms easily lysed during the first stages of treatment.
  • lambda phage DNA digested with HindIII was added, in various concentrations, to the soils before and after grinding.
  • a combination of other lysis treatments has been tested, including sonication (Cup device
  • the 23 kb band was absent in several cases, indicating that the long fragments were preferentially adsorbed to soil particles, or were more sensitive to degradation, compared to the short fragments.
  • the hybridization signals obtained from soil suspensions which were treated by thermal shock and sonication were, at most, weak.
  • the sample with the highest amount of DNA (15 ⁇ g DNA / g dry weight of soil) was the only one for which the signal obtained was significantly different from the level of background noise. No difference, (or small differences) was observed between the samples treated by thermal shock and those treated by thermal shock and sonication, indicating that thermal shock has a detrimental effect on DNA.
  • the best recoveries were observed for soil # 2, which has the highest organic matter content (Table 1), while no DNA was recovered from clay soil # 5.
  • the samples were extracted immediately or after a one hour incubation period at 28 ° C, then the DNA extracts were purified and analyzed by gel electrophoresis.
  • the intensity of the bands obtained from samples seeded with DNA after grinding increases with the concentration of RNA, indicating that the treatment could have a positive effect.
  • hybridization signals for the control samples did not differ from the background noise levels, significant amounts of DNA were released from the RNA-treated samples, and the signals increased with the amount of DNA added as well as with RNA concentration.
  • protocol B (see section Materials and Methods) was used for all the experiments in which PCR amplifications and / or hybridizations on task (Dot Blot) were carried out.
  • the first step was to determine whether the quantities of PCR product were proportional to the number of target DNA molecules initially present in the reaction tube. Streptosporangium fragile DNA was used as target (see Materials and Methods section).
  • the primers used were the primers FGPS122 and FGPS350 (Table 2).
  • the gel electrophoresis of the PCR products showed that the band intensity increases with the increase in the concentration of the targets.
  • the PCR products were hybridized with the oligonucleotide probe FGPS643 (table 2), and the signals were quantified by phosphorescence imaging (phospho-imaging).
  • the various amounts of target S. fragile DNA made it possible to provide the expected amounts of PCR product when, before amplification, the DNA of S. fragile was mixed with DNA of Streptomyces hygroscopicus and added to the PCR mixture of 50 ⁇ l in a range of 100 pg to 1 ⁇ g in order to simulate the non-target DNA released from the soil microflora.
  • extraction protocol No. 6, purification method D, and PCR amplification combined with spot hybridization (Dot Blot) and phosphorescence imaging (phospho-imaging) were used to count target DNAs that had been released.
  • the extracted DNA can be clearly distinguished from background noise only when the number of added spores exceeds 10 5 for soils 3 and 5 and 10 7 for soil 2 ( Figure 6a).
  • the extracted DNA can be detected above an amount corresponding to 10 3 spores / g of soil for soils 2 and 3, and above 10 7 spores / g for soil n ° 5 (figure b).
  • the hybridization signal increases with increasing amounts of the inoculated cells.
  • a 100-fold increase in the number of seeded cells leads to an almost 100-fold increase in DNA yield. This increase is clearly less when the hyphae are inoculated, particularly in soils 2 and 3 ( Figure 6).
  • the results obtained when phage lambda DNA was used as an inoculum the DNA was also recovered from clay-rich soil (# 5) when the bacterial cells were used as an inoculum.
  • RNA treatment increased the recovery of Streptomyces DNA from this soil for both the spores and the mycelium ( Figure 6).
  • Example 2 Construction of a DNA library of low molecular weight ( ⁇ 10 kb) from a soil contaminated with lindane: cloning and expression of the linA gene
  • This example describes the construction of a soil DNA library in E. coli. It demonstrates the cloning and expression of small genes from a non-cultivable microflora. Lindane is an organochlorine pesticide, recalcitrant to degradation and persistent in the environment. Aerobically, its biodegradation is catalyzed by a dehydrochlorinase, coded by the linA gene, making it possible to transform lindane into 1,2,4-trichlorobenzene.
  • the linA gene has only been identified among two strains isolated from the soil: Sphingomonas paucimobilis, isolated in Japan (Seeno and Wada 1989, Imai et al 1991, Nagata et al 1993) and Rhodanobacter lindaniclasticus isolated in France (Thomas et al 1996, Nalin et al 1999).
  • Dry soils are ground for 10 minutes in a Restch centrifugal mill equipped with 6 tungsten balls. 10 grams of ground ground are suspended in 50 ml of TENP pH 9 buffer (Tris 50 mM, EDTA 20 mM, NaC1 100 mM, polyvinylpolypirrolidone 1% w / v), and homogenized using a vortex for 10 min.
  • TENP pH 9 buffer Tris 50 mM, EDTA 20 mM, NaC1 100 mM, polyvinylpolypirrolidone 1% w / v
  • the supernatant is precipitated with sodium acetate (3M, pH 5.2) and isopropanol, to be taken up in sterile TE buffer (10 mM Tris, EDTA 1 mM, pH 8.0).
  • sterile TE buffer (10 mM Tris, EDTA 1 mM, pH 8.0).
  • the extracted DNA is then purified on a S400 molecular sieving column (Pharmacia) and on an Elutip d ion exchange column (Schleicher and Schuell), according to the manufacturers' instructions, then stored in TE.
  • the vector pBluescript SK- and the DNA extracted from the soil are each digested by the enzymes Hind ⁇ and BamHI (Roche), at the rate of 10 units of enzymes for 1 ⁇ g of DNA (incubation for 2 hours at 37 ° C. ). DNA is then ligated by the action of T4 DNA ligase (Roche), overnight at 15 ° C, at the rate of one unit of enzyme per 300 ng of DNA (approximately 200 ng of DNA insert and 100 ng of digested vector) .
  • ElectroMAX DH10B TM (Gibco BRL) are transformed by the ligation mixture (2 ⁇ l) by electroporation (25 ⁇ F, 200 and 500 ⁇ , 2.5 kV) (Biorad Geneuterer).
  • the transformed cells are diluted so as to obtain approximately 100 colonies per dish and then are spread on LB medium (10 g / l Tryptone, 5 g / l yeast extract, 5 g / NaCl ) added with Ampicilin (100 mg / l), ⁇ -HCH (500 mg / l), X-gal 60 mg / l (5-bromo-4-chloro-3-indolyl- ⁇ -D-galactoside) , and IPTG 40 mg / l (isopropylthio- ⁇ -D-galactoside), and incubated overnight at 37 ° C. Since ⁇ -hexachlorocyclohexane (Merck-Schuchardt) is insoluble in water, a 50 g / l solution is prepared in DMSO (dimethyl sulfoxide) (Sigma).
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the screening of the library is carried out by visualization of a halo of degradation of lindane around the colony (lindane precipitating in culture media). Out of 10,000 clones screened, 35 thus exhibited a degradation activity of lindane. The presence of the linA gene in these clones could be confirmed by PCR using specific primers, described by Thomas et al (1996). Digests carried out on the inserts as well as on the amplification products showed identical profiles between all the screened clones and the reference control, R. lindaniclasticus. The clones carrying the linA gene also presented an insert of the same size (approximately 4 kb).
  • a method of preparing a collection of nucleic acids from a soil sample comprising a step of indirect DNA extraction.
  • the cell ring located at the interphase of the aqueous phase and the Nycodenz phase, is removed, washed in 25 ml of sterile water and centrifuged at 10,000 g for 20 minutes. cell is then taken up in a 10 mM Tris solution, EDTA 100 mMn pH 8.O.
  • a step of enriching the soil in a solution of yeast extract can be included in order to allow in particular the germination of the bacterial spores of the soil.
  • the cells are lysed in a 10 mM Tris solution, 100 mM EDTA, pH 8.0 containing 5 mg.ml '1 of lysozyme and 0.5 mg.ml "1 of achromopeptidase for 1 hour at 37 ° C.
  • a solution of lauryl sarcosyl ( 1% final) and proteinase K (2 mg.ml "1 ) is then added and incubated at 37 ° C for 30 minutes.
  • the DNA solution is then purified on a cesium chloride density gradient by centrifugation at 35,000 rpm for 36 hours on a Kontron 65.13 rotor.
  • the cesium chloride gradient used is a gradient at 1 g / ml of CsCI, having a refractive index of 1.3860 (Sambrook et al., 1989).
  • the cells are mixed with an equal volume of agarose at 1.5% (weight / volume) Seaplaque (Agarose Seaplaque FMC Products. TEBU, Le Perray en Yvelines, France), at low melting point and poured into a 100 ⁇ l block.
  • the blocks are then incubated in a lysis solution: EDTA 250 mM, sucrose 10.3%, lysozyme 5 mg.ml "1 and achromopeptidase 0.5 mg.ml " 1 at 37 ° C for 3 hours.
  • the blocks are then washed in a 10 mM Tris - 500 mM EDTA solution and incubated overnight at 37 ° C. in 500 mM EDTA containing 1 mg.ml '1 of proteinase K and 1% lauryl sarcosyl. After several washes in Tris-EDTA, the blocks are stored in 500 mM EDTA.
  • the quality of the DNA thus extracted is checked by electrophoresis in pulsed fields.
  • the amount of DNA extracted was evaluated on an electrophoresis gel against a standard range of calf thymus DNA.
  • the DNAs extracted from the soil are characterized by PCR hybridization, a method which consists in first amplifying the DNAs using primers located on universally conserved regions of the rR16S gene, then in hybridizing the amplified DNAs with different oligonucleotide probes of known specificity (Table 4), for the purpose quantify the intensity of the hybridization signal with respect to an external standard range of genomic DNA.
  • the DNAs extracted from the soil as well as the genomic DNAs extracted from pure cultures are amplified with the primers FGPS 612-669 (Table 1) under the standard conditions of amplification by PCR.
  • the amplification products are then denatured by an equal volume of 1N NaOH, deposited on a nylon membrane (GeneScreen Plus, Life Science Products) and hybridized with an oligonucleotide probe marked at its end with g 32 P ATP by action of the T4 polynucleotide kinase.
  • One of the decisive steps for the extraction of soil cells is the dispersion of the soil sample in order to dissociate the cells adhering to the surface or inside the aggregates of soil particles.
  • Three successive grinding cycles of one minute each make it possible to obtain a better extraction efficiency of the cells as well as a larger quantity of DNA recovered, compared to a single grinding cycle of one minute 30.
  • Table 5 reports the extraction efficiencies obtained after centrifugation on a Nycodenz gradient, on the total viable microflora (counted by microscopy after staining with acridine orange), on the total cultivable microflora (counted on solid medium Trypticase-Soy 10% ), and on the microflora of actinomycetes cultivable on HV agar medium (after incubation at 40 ° C in a solution of yeast extract 6% -SDS 0.05% in order to cause sprout germination).
  • the extracted DNA was quantified either after a lysis of the cells in a liquid medium (without purification on a cesium chloride gradient) or after a lysis of the cells included in an agarose block (after digestion of the agarose with a b-agarase).
  • the quantity of DNA extracted from the cells is 330 ng per gram of dry soil.
  • Electrophoresis in pulsed fields showed that the soil DNA extracted after Nycodenz and CsCI gradient could reach a size of 150 kb and that the agarose block lysis made it possible to extract fragments greater than 600kb.
  • the aim of the molecular characterization of the DNA extracted from the soil is to obtain profiles representing the proportions of the different bacterial taxa present in the DNA extract. It also involved knowing the extraction biases induced by the prior separation of the cell reaction from the soil, in comparison with a direct extraction method due to the lack of direct visualization of the microbial diversity present in the soil. Indeed, little information has been gathered on the extraction of cells on a Nycodenz gradient according to their morphological structure (cell diameter, filamentous or sporulated forms).
  • the method implemented according to the present invention consists in universally amplifying a 700 bp fragment inside the 16S rDNA sequence, in hybridizing this amplifier with a probe.
  • oligonucleotide of variable specificity in terms of reign, order, subclass or genus
  • the amplification prior to hybridization makes it possible to quantify genera or species of microorganisms which are not abundant.
  • amplification with universal primers makes it possible, during hybridization, to use a large series of oligonucleotide probes. It allows them to compare different lysis modes (direct or indirect extraction) on well-defined taxonomic groups. The results are collated in Table 6.
  • This stage causes the germination of the spores, and on the one hand certainly allows better recovery of this type of cells and on the other hand greater efficiency of lysis on germinating cells.
  • the tipA gene codes for a 19 KD protein, the transcription of which is induced by the antibiotic thiostrepton or nosiheptide.
  • the tipA promoter is well regulated: induction in exponential phase and in stationary phase (200X) Murakami T, Holt TG, Thompson CJ. J. Bacteriol
  • the resistance gene codes for a phosphotransferase (hph)
  • the gene used comes from a cassette constructed by Blondelet et al in which the hyg gene is under the control of its own promoter and the promoter plac inducible by IPTG Blondelet-Rouault et al; .
  • the pSAM2 element is integrated into the chromosome by a site-specific integration mechanism. Recombination takes place between two identical 58 bp sequences present on the plasmid (attP) and on the chromosome (atfB).
  • the int gene located near the aftP site, is involved in the site-specific integration of pSAM2, and its product has similarities to the integrases of temperate bacteriophage enterobacteria. It has been shown that a fragment of pSAM2 containing only the attP attachment site as well as the int gene was able to integrate in the same way as the whole element. See French patent n ° 88 06638 dated 05/18/1988, as well as Raynal A et al. Mol Microbiol 1998 28: 333-42).
  • Step 1 / The TipA promoter was isolated from the plasmid pPM927 (Smokvina et al. Gene 1990; 94: 53-9) on a 700 base pair Hindlll-BamHI fragment cloned into the vector pUC18 (Yannish-Perron et al. , 1985) digested with Hindlll / BamHI
  • Step 2 This HindIII-BamHI fragment was subsequently transferred from pUC18 to pUC19 (Yannish-Perron et al., 1985).
  • Step 3 A BamHI-BamHI insert of 1500 base pairs carrying the int gene and the attP site of pSAM2 was isolated from the plasmid pOSintl, represented in FIG. 8, (Raynal A et al. Mol Microbiol 1998 28: 333-42 ) and cloned at the BamHI site of the preceding vector (pUC19 / TipA), in the orientation making it possible to put the int gene under the control of the TipA promoter.
  • Step 4 The BamHI site located 5 ′ of the int gene was deleted by partial BamHI digestion then treatment with the Klenow enzyme. A Hindlll-BamHI fragment carrying TipA-int-attP was thus isolated from pUC19 and transferred to pBR322 Hindlll / BamHI.
  • Step 5 The Hygromycin cassette isolated from pHP45 ⁇ hyg (Blondelet-Rouault et al., 1997) on a Hindlll-Hindlll fragment was cloned at the Hindlll site located upstream of the TipA promoter.
  • Step 6 The Hindlll site located between the ⁇ Hyg cassette and the TipA promoter was removed by Klenow treatment after partial Hindlll digestion.
  • Step 7 The plasmid obtained at the end of the previous step makes it possible to isolate a single Hindlll-BamHI fragment, carrying all the ⁇ Hyg / TipA / int attP elements, which was cloned after Klenow treatment at the EcoRV site of the cosmid pWED Le cosmid pWED1, shown in Figure 9, is derived from cosmid pWE15, shown in Figure 10 (Wahl GM, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1987 84: 2160-4) by deletion of a Hpal-Hpal fragment carrying the Neomycin gene and SV40 origin.
  • Example 5 Construction of several conjugative and integrative cosmids in Streptomyces, the vector pOSV 303. POSV306 and POSV307
  • Step 1 the pOSVOOl vector
  • the vector map pOSV 001 is shown in Figure 17.
  • Step 2 the vector pOSV002
  • Hygromycin marker ( ⁇ hyg cassette), and selectable from Streptomyces, so that the gene conferring resistance to hygromycin is transferred last, which ensures complete transfer of the BAC with the DNA insert from the ground.
  • the PstI and Hindlll ends are made compatible after treatment with the Klenow fragment of the DNA polymerase making it possible to generate "blunt ends".
  • the orientation of the ⁇ hyg fragment is determined at the end of construction.
  • the vector map pOSV002 is shown in Figure 18.
  • Step 3 the vector pOSV010
  • the Xbal-Hindlll fragment isolated from the plasmid pOSV002 and containing the hygromycin resistance marker and the origin of transfer is cloned into the plasmid pOSintl digested with Xbal and Hindlll.
  • the orientation of the sites is such that the hygromycin marker will always be transferred last.
  • the plasmid pOSintl represented in FIG. 8, was described in the article by Raynal et al. (Raynal A et al. Mol Microbiol 1998 28: 333-42).
  • the principle is to insert a "cos" site in the plasmid pOSV010 allowing the packaging in the plasmid pOSV010, represented in FIG. 12.
  • This fragment is obtained by PCR. From a fragment carrying the cohesive ends (cos) of ⁇ (lambda bacteriophage or cosmid pHC79), amplification by PCR is carried out using oligonucleotides corresponding to the sequences -50 / + 130 relative to the cos site. These oligonucleotides also contain the Nsil, PstI compatible, Xhol, Sali compatible, EcoRV, "blunt end" cloning sites.
  • the PCR fragment is bounded by a PstI site at the 5 'end and by a Hincll site at the 3' end, allowing cloning into the vector pOSV010 ( Figure 12) previously digested with the enzymes Nsil and EcoRV, causing the deletion of the laclq repressor.
  • the vector map pOSV303 is shown in Figure 14.
  • the vector pOSV303 contains cloning sites such as the Nsil site,. PstI compatible, the Xhol site, Sali compatible or the EcoRV site for obtaining "free ends”.
  • Step 1 Construction of the vector POSV308.
  • the vector pOSV308 was constructed according to the method illustrated in FIG. 27. A 643 bp fragment containing the cos region was amplified using the pair of primers with sequences SEQ ID No. 107 and
  • SEQ ID No. 108 from the cosmid vector pHc79 described by HOHM B and COLLINS (1980). This amplified nucleotide fragment was cloned directly into the vector pGEMT-easy sold by the company PROMEGA, as illustrated in FIG. 27 in order to produce the vector pOSV308.
  • Step 2 Construction of the vector pOSV306.
  • the vector pOSV010 was constructed as described in step 3 of construction of the vector pOSV303, as described in paragraph 5.1 of this example.
  • the vector pOSVIO was digested with the enzymes EcoRV and Nsil in order to excise a fragment of 7874 bp which was subsequently purified, as illustrated in FIG. 28.
  • the vector pOSV308 obtained in step 1) above was subjected to digestion with the enzymes EcORV and PstI in order to excise a fragment of 617 bp, which was subsequently purified.
  • the 617 bp cos fragment obtained from the vector pOSV308 was ligated into the vector pOSVI O, in order to obtain the vector pOSV306, as illustrated in FIG. 28.
  • the cosmid pOSV307 still contains the Laclq gene, in order to improve the stability of the cosmid in Streptomyces, for example in the strain S17-1 of Streptomyces.
  • the vector pOSV010 was subjected to digestion with the enzyme Pvull, to obtain a fragment of 8761 bp which was purified, then dephosphorylated.
  • the vector pOSV308, as obtained as described in step 1) of paragraph 5.2 above, was digested with the enzyme EcoRI in order to obtain a fragment of 663 bp, which was then purified and treated by Klenow's enzyme.
  • Example 6 Construction of the replicative cosmid shuttle E. coli-Streptomvces pOS700R.
  • the transformation efficiency is approximately 3000 transformants per ⁇ g of DNA.
  • the small fragments are very preferably integrated.
  • Equipped with a screen to select the plasmids carrying an insert This screen makes it possible, by eliminating the vectors which are closed on themselves and not digested, to work with a higher ratio between vector and DNA to be inserted, which allows better cloning efficiency to constitute banks.
  • Step 1 the pOSVOOl vector
  • the vector map pOSV 001 is shown in Figure 17.
  • Step 2 the vector pOSV002
  • the vector map pOSV002 is shown in Figure 18.
  • Step 3 the pOSVOIQ vector
  • the Xbal-Hindlll fragment isolated from the plasmid pOSV002 and containing the hygromycin resistance marker and the origin of transfer is cloned into the plasmid pOSintl digested with Xbal and Hindlll.
  • the orientation of the sites is such that the hygromycin marker will always be transferred last.
  • the plasmid pOSintl represented in FIG. 8, was described in the article by Raynal et al. (Raynal A et al. Mol Microbiol 1998 28: 333-42). This construction allows the expression of integrase in E. coli and in Streptomyces.
  • Step 4 the vector POSV014
  • This "cassette” carries the gene coding for the repressor C1 of phage ⁇ and the gene conferring resistance to tetracycline.
  • This gene carries in its 5 'non-coding region the target sequence of the repressor. insertion of DNA in the HindIII site located in the coding sequence of C1 leads to the non-production of the repressor and therefore to the expression of resistance to tetracycline.
  • the vector map pOSV014 is shown in Figure 19.
  • Step 5 the vector pOSV 403, integrative and conjugative BAC vector
  • the Pstl-Pstl fragment of the vector pOSV014 carrying all of the elements and functions described above is cloned into the pasmide pBAC11 (pBeloBACH) digested with NotI. The ends are made compatible by treatment with the Klenow enzyme.
  • the vector map pOSV403 is shown in Figure 21. The diagram in Figure 21 shows the orientation selected.
  • the vector pOSV403 contains the Hindlll and Nsil sites.
  • the Nsil site is quite rare in Streptomyces and has the advantage of being compatible with PstI.
  • the PstI site is frequent at
  • Streptomyces and can be used to perform partial digestions.
  • Recombinant clones carrying an insert cloned into the repressor C1, and therefore inactivating this repressor become resistant to tetracycline. Since the BACs are only present at the rate of one copy per cell, it is necessary to select the recombinant clones with a lower dose of tetracycline than the usual dose of 20 ⁇ g / ml, for example with a dose of 5 ⁇ g / ml. Under these conditions there is no background noise. It is also possible to use a system developed and marketed by the company InVitrogen, in which the insertion of DNA into the vector inactivates a gyrase inhibitor whose expression is toxic for E. coli. The fragment is preferably isolated from the vector pZErO-2 (http://www.invitrogen.com/).
  • Example 9 Construction of a S. alboniger bang in the 2 integrative (pOS700l) and replicative .pOS700R_ cosmids
  • the puromycin biosynthesis pathway from Streptomyces alboniger was cloned in the two cosmid shuttles pOS700l and pOS700R.
  • the genes of the puromycin biosynthetic pathway are carried by a BamHI DNA fragment of approximately 15 Kb.
  • DNA has a molecular weight between 20 and 150 Kb, determined by pulsed field electrophoresis.
  • the two cosmids were digested with the enzyme BamHI (single cloning site).
  • the BamHI partial digestion conditions for genomic DNA were determined (50 ⁇ g of DNA and 12 units of enzyme, 5 minutes of digestion). After checking the size by agarose gel electrophoresis, the partially digested DNA was introduced into the vectors. In the ligation, 15 ⁇ g of genomic DNA + 2 ⁇ g of the integrative vector or 5 ⁇ g of the replicative vector were used.
  • Each ligation mixture was used for the in vitro packaging of DNA in the heads of lambda bacteriophage.
  • the cosmids were used to transfect E. coli and thus generate two libraries of approximately 25,000 ampicillin-resistant clones.
  • the DNA of all of these clones was isolated and quantified. To test the libraries, several clones were chosen, the DNA purified and was digested with BamHI, in order to verify the presence and the size of the inserts. The clones tested contain between 20 and 35 Kb of S. alboniger insert.
  • the clones capable of containing the complete puromycin biosynthesis pathway were identified by hybridization with a probe corresponding to the puromycin resistance gene, the 1.1 kb pac gene. (Lacalle et al. Gene 1989; 79, 375-80)
  • Three resistant clones were selected to verify the production of puromycin. They correspond to the recombinants of S. lividans containing an insert in the integrative vector pOS700l (G 20) or an insert in the replicative vector (G21 and G22).
  • the strains are seeded in a culture medium, the composition of which is as follows: Bacteriological peptone Organotechnics 5 g / l of final medium
  • 50 ml of liquid culture medium distributed in 250 ml Erlenmeyer flasks, are inoculated with 2 ml of aqueous suspension of spores and mycelium of each of the strains.
  • the cultures are incubated for 4 days at 28 ° C. with shaking at 220 rpm.
  • 50 ml of production media distributed in 250 ml Erlenmeyer flasks, are then seeded with 2 ml of these precultures.
  • the production medium used is an industrial medium optimized for the production of pristinamycin (RPR 201 medium).
  • the cultures are incubated at 28 ° C., with shaking at 220 rpm.
  • Comparative HPLC analyzes from the cultures of the different strains show the production of puromycin in the culture of the wild strain from 24 h of incubation. A production, although lower, is also clearly detected from 48 h on in the culture of clone G20 containing the cosmid pOS700l (FIG. 23). Puromycin was also detected as a trace in clone G23 containing the full operon coding for the compound in the plasmid pRCPH. However, no production was observed in the cultures of clones G21 and G22 containing the cosmid pOS700R. The results are shown in Figure 23. c) Conclusions
  • EXAMPLE 10 DNA CLONING OF SOLDANS OF VECTORS 1) - Preparation of DNA from the soil to be cloned
  • the size of the molecules must be between 30 and 40kb.
  • the DNA extracted from the soil is heterogeneous in size and includes molecules reaching 200 or 300kb.
  • the DNA is broken mechanically by passing the solution through a 0.4mm diameter needle. Fragments of a size close to 30kb are not affected by these repeated passes through a needle and it is therefore not necessary to make a separation by size especially since the packaging in the particles automatically eliminates the short inserts.
  • the soil DNA is separated by pulsed field electrophoresis (CHEF type) under conditions such that the fragments between
  • 100 and 300kb are concentrated in a band of about 5mm. This is obtained by carrying out the migration in a gel with 0.7% normal agarose or 1% low melting agarose with a pulse time of 100 seconds for 20 hours and at a temperature of 10 ° C.
  • the porosity of a 0.7% agarose gel allows the DNA to be removed by electroelution provided that there is a total absence of ethidium bromide.
  • This DNA is then manipulated with pipetting instruments with an enlarged and hydrophobic orifice to avoid mechanical fragmentation of the molecules. - Between 100 and 300 kb
  • the strip containing the fragments of a size between 100 and 300kb is cut.
  • a 1% agarose gel with a low melting point is used for migration. This property makes it possible to melt the gel at a tolerable temperature for DNA of 65 ° C and to then digest it with agarase (Agarase marketed by the company Boehringer) at a temperature of 45 ° C according to the supplier's prescriptions.
  • agarase Agarase marketed by the company Boehringer
  • a cosmid vector, open to any cloning site, is modified at the 3 'ends by adding a monotonic polynucleotide.
  • the DNA to be cloned is modified at the 3 'ends by adding a monotonic polynucleotide which can pair with the previous one.
  • the vector-fragment association to be cloned is made by these polynucleotides and the cos sequence of the vector allows the in vitro packaging of DNA in capsids of phage Lamda.
  • the vector used is a self-replicating vector in E. coli and integrative in Streptomyces.
  • E. coli For E. coli, the selection is made on resistance to ampicillin and for Streptomyces, it is made on resistance to hygromycin.
  • the cosmid is open at one of the 2 possible sites (BamHI or Hindlll) and the 3 ′ ends are lengthened by polyA with the terminal transferase under the conditions where the supplier of the enzyme provides for the addition of 50 to 100 nucleotides.
  • the 3 ′ ends of the DNA are lengthened by polyT with terminal transferase under the conditions providing an elongation comparable to that of the vector. Under the experimental conditions described by the manufacturer, the polyA polyT tails are 30 to 70 bases long. Molecule assembly and in vitro packaging.
  • a vector molecule is mixed for an inserted DNA molecule.
  • the mass concentration of DNA is 500 ⁇ g.ml "1 .
  • the mixture is packaged and the transfection efficiency depends on the strain used as receptor and on the inserted DNA: zero with the test DNA and the strain DH5 ⁇ , the efficiency is comparable for the strains SURE and DH10B; on extraction, the DNA yield is however higher with the strain DH10B.
  • Soil DNA is blunt-ended by eliminating outgoing 3 'sequences and filling outgoing 5' sequences. This is done with: Klenow enzyme, T4 polymerase, the 4 nucleotide triphosphates.
  • the cosmid vector is digested with BamHI, then treated with the Klenow enzyme to make it blunt and then dephosphorylated to prevent it from closing on itself. After ligation, the mixture is packaged and transfected as previously described.
  • the conjugative and integrative pBAC plasmid has Hindlll and Nsil sites as cloning sites.
  • the insertion of a DNA sequence at these sites inactivates the repressor C1 of the phage Lambda which controls the expression of the gene for resistance to tetracycline. Inactivation of the repressor therefore makes the cell resistant to this antibiotic ( ⁇ g.ml "1 ). Cloning at these sites is facilitated by the modification of the vector and the preparation of the DNA to be cloned. Vector preparation. Hindlll example
  • the Hind III site is modified: the first base (A) is replaced to form an outgoing 5 'sequence, which cannot pair with its similars.
  • the operation is carried out by the Klenow enzyme in the presence of dATP.
  • the success of the operation is verified by carrying out a ligation of the vector on itself before and after treatment with the Klenow enzyme. With the same amount of DNA tested, 3000 clones are obtained before treatment and 60 after treatment.
  • DNA preparation (size between 100 and 300kb). DNA blunt ends.
  • the DNA is blunt-ended by eliminating the outgoing 3 'sequences and filling in the outgoing 5' sequences. This operation is done with: Klenow enzyme, T4 polymerase, the 4 nucleotide triphosphates.
  • oligonucleotides recognizing the modified HindIII sequence of the vector. They contain rare restriction sites to allow subsequent cloning (Swal; Notl). This technique is derived from that of: Elledge SJ, Mulligan JT, Ramer SW, Spottswood M, Davis RW. Proc Natl Acad Sci U S A 1991 Mar 1; 88 (5): 1731-5 Two complementary oligonucleotides are used: Oligo 1: 5'-GC ⁇ ATTTAAATATTAATGCGGCCGCCCGGG-3 '
  • Oligo 2 5'-CCCGGGCGGCCGCATTAATATTTAAATA-3 '(SEQ ID N ° 26) They are phosphorylated 5 ′ by the T4 polynucleotide kinase in the presence of ATP, after their hybridization. This phosphorylation step can be eliminated using the already phosphorylated oligonucleotides.
  • the ligation of this double-stranded adapter with the DNA to be inserted into a vector is made by the T4 ligase in the presence of a very large excess of adapter (1000 molecules of adapter for a DNA molecule to be inserted), in 15 hours at 14 ° C. The excess adapter is removed by electrophoresis on an agarose gel and the molecules of interest are recovered from the gel by hydrolysis of the latter with agarase or by electroelution.
  • Ligation is carried out at 14 ° C. over 15 hours with 10 vector molecules for one insert molecule.
  • the receptor strain is strain DH10B.
  • the transformation is done by electroporation. To express resistance to tetracycline, the transformants are incubated at 37 ° C. for 1 hour in an environment without antibiotics. The selection of the clones is done by culture overnight, on LB agar medium supplemented with tetracycline at ⁇ g.ml * 1 .
  • Example 12 Construction of a cosmid bong in E. coli and Streptomyces lividans: Cloning of soil DNA
  • the objective is the construction of a large DNA library from the environment, without prior stage of culture of microorganisms, in order to access the metabolic genes of bacteria (or any other organism) that we do not know how to cultivate under standard laboratory conditions.
  • the procedure described was used to generate a DNA library in Escherichia coli using the shuttle cosmid E. coli-S. lividans pOS700l and DNA extracted and purified from the bacterial fraction of a soil. This latter method makes it possible to obtain DNA of high purity and an average size of 40 kb.
  • the DNA and the vector are assembled by mixing a vector molecule and an inserted DNA molecule.
  • the mixture is then packaged in the heads of lambda bacteriophages (Amersham kit) which are used to transfect E. coli DH10B.
  • the transfected cells are then seeded on LB agar medium in the presence of ampicillin for selection of the recombinants resistant to this antibiotic.
  • a bank of around 5000 clones of E. ampicillin resistant coli was obtained. Each clone was seeded in LB or TB medium + ampicillin in a microplate well (96 wells) and stored at -80 ° C.
  • the sequence at the sites of insertion of the soil fragments into the vector, pOS7001, generated during the construction of the library was analyzed. To do this, 17 cosmids from the library were purified and sequenced with a primer, seq. 5 'CCGCGAATTCTCATGTTTGACCG 3', which hybridizes between the BamHI sites and the HindIII cloning site present in the vector.
  • the sequences obtained made it possible to estimate that the length of the homopolymeric tails at the junction points is very variable, between 13 and 60 poly-dA / dT. Beyond the tails, the sequences of the soil fragments thus generated have a G + C percentage between 53 and 70%. Such high percentages were unexpected, but similar results have already been reported on crude DNA preparations from soil (Chatzinotas A. et al., 1998).
  • a “pooling” strategy of 48 or 96 clones was used for the analysis of microbial and metabolic wealth.
  • the cosmid DNA extracted from these "clone pools” was then used to carry out PCR or hybridization experiments.
  • Example 13 Diversity of 16S ribosomal DNA within cloned DNA.
  • cosmids of the bank are extracted from clone pools by alkaline lysis and are then purified on a cesium chloride gradient, in order to take the cosmid DNA band in supercoiled form and with the aim of eliminating any Escherichia coli chromosomal DNA that may interfere with the study. After linearization of the cosmids by the action of nuclease S1
  • the 16S rDNA sequences contained in the clone pools are amplified under standard amplification conditions, from the universal primers 63f (5'- CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3 ') and 1387r (5'- GGGCGGWGTGTACAAGGC-3 ') defined by MARCHESI et al. (1998).
  • the amplification products of approximately 1.5 kilobases are purified from the Qiaquik gel extraction kit (Qiagen) and then directly cloned into the vector pCR II (Invitrogen) in Escherichia coli TOP10, according to the manufacturer's instructions.
  • the insert is then amplified using primers M13 Forward and M13 reverse specific to the cloning site of the vector.
  • pCR II The amplification products of expected size (approximately 1.7 kb) are analyzed by RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) using the enzymes Cfol, Mspl and BstUI (0.1 units) in order to select the clones to be sequenced.
  • the restriction profiles obtained are separated on 2.5% metaphor agarose gel (FMC Products) containing 0.4 mg of ethidium bromide per ml.
  • the 16S rDNA sequences are then determined directly using the PCR products purified by the "Qiaquick gel extraction" kit using the sequencing primers defined by Normand (1995).
  • Phylogenetic analyzes are obtained by comparing the sequences with the prokaryotic 16S rDNA sequences gathered in the Ribosomal Database Project (RDP) database, version 7.0 MAIDAK et al. (1999) thanks to the SIMILARITY MATCH program, allowing obtain the similarity values with respect to the sequences in the database.
  • RDP Ribosomal Database Project
  • proteobacteria 18 sequences with a percentage of similarity between 89 and 99%.
  • a second group of sequences is represented by the subclass g of proteobacteria, comprising 9 sequences whose percentages of similarity vary between 84 and 99%).
  • the groups of b-proteobacteria, d-proteobacteria, firmicutes with low G + C% and high G + C% respectively comprise 1, 4, 3 and 5 sequences.
  • the phylogenetic tree represented in FIG. 7 was produced from the alignment of the sequences by the MASE software (Faulner and Jurak, 1988) and corrected by the method of the 2 parameters of Kimura (1980), and using the Neighbor Joining algorithm (Saitou and Nei 1987).
  • Phylogenetic analysis made it possible to compare the 16S rDNA sequences cloned in the soil DNA library, with the prokaryotic 16S rDNA sequences gathered in the Ribosomal databases Database Project (RDP), (version 7.0, SIMILARITY-MATCH program, Maidak et al 1999), and in the GenBank database thanks to BLAST 2.0 software (Atschul et al, 1997).
  • S. coelicolor ATCC101478, S. ambofaciens NRRL2420, S. lactamandurans ATCC27382, S. rimosus ATCC109610, B. Subtilis ATCC6633 and B. licheniformis THE1856 (RPR collection) were used as DNA sources for the PCR experiments.
  • S. lividans TK24 is the host strain used for the cosmid shuttle POSI700.
  • Escherichia coli Top10 (INVITROGEN) was used as host for the cloning of PCR products and E. coli Sure (STRATAGENE) was used as host for the shuttle cosmid pOS700l.
  • the culture conditions for E. coli, the preparation of plasmids, the digestion of DNA, the electrophoresis on agarose gel were carried out according to standard procedures (Sambroock et al., 1996).
  • pairs of primers a1-a2 and b1-b2 were defined by the team of N. Bamas-Jacques and their use was optimized for the screening of DNA from pure strains and the soil bank for genes encoding PKSI)
  • Table 8 PCR primers homologous to the PKSI genes used for screening the library.
  • the amplification mixture contained: in a final volume of 50 ⁇ l, between 50 and 150 ng of genomic DNA, 200 ⁇ M of dNTP, 5 mM of MgCl 2 final, 7% DMSO, 1x Appligene buffer, 0.4 ⁇ M of each primer and 2.5U of Taq Polymerase Appligene.
  • the amplification conditions used are: denaturation at 95 ° C for 2 minutes, hybridization at 65 ° C for 1 minute, elongation at 72 ° C for 1 minute, for the first cycle, followed by 30 cycles where the temperature is lowered up to 'at 58 ° C as described in K. Seow et al., 1997.
  • the final extension step is carried out at 72 ° C for 10 minutes.
  • the PCR conditions are the same as above for the a1-a2 pair using between 100 and 500 ng of cosmid extracted from pools of 48 clones.
  • the amplification mixture contained 200 ⁇ M dNTP, 2.5mM final MgCI 2 , 7% DMSO, 1x Quiagen buffer, 0.4 ⁇ M of each primer and 2.5U of Taq polymerase Hot-start (Qiagen).
  • the amplification conditions used are: denaturation 15 'at 95 ° C followed by 30 cycles: the denaturation at 95 ° C + the hybridization at 65 ° C for the first cycle and 62 ° C for the other cycles , elongation at 72 ° C, final extension step from 10 'to 72 ° C.
  • the identification of positive clones from pools of 48 or 96 clones is carried out using replicates of the corresponding mother microplates on solid medium or any other standard replication method.
  • the fragments are purified on agarose gel (Gel Extraction Kit (Qiagen)) and cloned in E.coli TOP 10 (Invitrogen) using the TOPO TA cloning kit (Invitrogen).
  • the plasmid DNA of subclones is extracted by alkaline lysis on a Biorobot (Qiagen) and dialysis for 2 h on VS membrane 0.025 ⁇ m (Millipore).
  • the samples are sequenced with the primers M13 "Universal” and "Reverse” on the sequencer ABI 377 96 (PERKIN ELMER).
  • the sequencing of the PCR products obtained with the pair of primers a1-a2 made it possible to identify, from the strain S. ambofaciens, the sequence of a KS gene already described (European Patent Application No. EP0791656) as belonging to the biosynthesis pathway for plantenolide, macrolidic precursor of spiramycin, and two sequences never described, Stramb 9 and Stramb12, (see sequence list).
  • the screening method allowed the identification of a KS sequence (sacen / 17) identical to that of the KS of module 1 already published in Genebank (Access number M63677), coding for synthetase 1 (DEBS1) of 6-deoxyerythronolide B.
  • KS sequence sequence identical to that of the KS of module 1 already published in Genebank (Access number M63677)
  • DEBS1 synthetase 1
  • Another sequence not correlated to the erythromycin biosynthetic pathway has been identified and it is the sequence SEQ ID No. 32.
  • the screening was carried out under the conditions described in the Materials and Methods section using the pairs of primers validated from producing strains.
  • the intensity of the bands obtained was variable, but only one amplification band was present for each target DNA pool. Under these conditions, 8 groups of target DNA were detected, corresponding to 9 positive clones after dereplication. The screening carried out with the second pair of primers, b1-b2, gave less specific amplification results since numerous satellite bands were observed alongside the 700 bp band. However, 9 groups of target DNA were detected, corresponding to 14 positive clones after dereplication from these positive clones, the DNA was extracted for the sequencing and transformation steps of .S. lividans. Cosmid analysis
  • Streptomyces lividans by transformation of protoplasts in the presence of PEG 1000.
  • the transformation efficiency varies between 30 and 1000 transformants per ⁇ g of cosmid DNA used.
  • the PCR method developed on pure strains was used as described on the bank's cosmids and 24 clones were thus identified.
  • FIG. 24 The alignment of the protein sequences deduced from PKSs I of the soil with other PKSs I present in different microorganisms (FIG. 24) shows the presence of a very conserved region which corresponds to the consensus region of the active site of b-ketoacyl. synthetase.
  • Analysis of the sequences obtained with the "Codonpreference" method revealed the presence of a strong bias in the use of codons rich in G + C in a single reading phase.
  • the proteins deduced according to this reading phase show a strong similarity with known type I KSs (Blast program). In particular, the similarity between the sequences of soil KSs and KSs of the erythromycin cluster is approximately 53%.
  • the sequence of the PCR product obtained from this clone is identical to that of the pool, which confirms the reliability of the method used.
  • G + C in soil sequences suggests that they can be derived from genomes with codon usage similar to that of actinomycetes.
  • PKSI ranges from a few kb for penicillin to around 120 kb for rapamycin.
  • the size of the cosmid inserts may therefore not be sufficient for the expression of the most complex clusters.
  • the inventors identified a cosmid clone containing an insert of 34071 bp containing several open reading frames coding for polypeptides of the polyketide synthase type.
  • the cosmid thus identified by screening the library contains six open reading frames coding for polyketide synthase polypeptides or for strongly related polypeptides, non-ribosomal peptides synthase.
  • a detailed map of this cosmid is shown in Figure 36.
  • the complete nucleotide sequence of the cosmid constitutes the sequence SEQ ID No. 113 of the sequence listing.
  • the DNA insert contained in the sequence SEQ ID No. 113 constitutes the complementary nucleotide sequence (strand -) of the nucleotide sequence coding for the various polyketide synthases.
  • the nucleotide sequence of the DNA insert contained in the cosmid of FIG. 36 which includes the open reading frames coding for the polyketide synthase (strand +) polypeptides is shown diagrammatically in FIG. 37 and constitutes the sequence SEQ ID No. 114 sequence listing.
  • the orfl sequence comprises an open partial reading frame with a length of 4615 nucleotides.
  • This sequence constitutes the sequence SEQ ID No. 115, which begins at the nucleotide in position 1 and ends at the nucleotide in position 4615 of the sequence SEQ ID No. 114.
  • sequence SEQ ID No. 1 15 codes for the ORF1 polypeptide of 1537 amino acids, this polypeptide constituting the sequence SEQ ID No. 121.
  • the polypeptide of sequence SEQ ID No. 121 is related to the non-ribosomal peptide synthases. This polypeptide has a degree of amino acid identity of 37% with the peptide synthase of Anabaena sp.90 referenced under the access number "emb CACO1604.1" in the Genbank database.
  • the nucleotide sequence orf2 is 8301 nucleotides in length and constitutes the sequence SEQ ID No 116 which begins at the nucleotide at position 4633 and ends at the nucleotide at position 12933 of the sequence SEQ ID No 114.
  • the ORF2 sequence codes for the ORF2 peptide with a length of 2766 amino acids, this polypeptide constituting the sequence SEQ ID No. 122.
  • the polypeptide of sequence SEQ ID No. 122 has an amino acid sequence identity of 41% with the MtaD sequence of Stigmatella aurantiaca referenced under the access number "gb AAF 19812.1" from the GENBANK database.
  • the ORF2 polypeptide constitutes a polyketide synthase.
  • the nucleotide sequence orf3 has a length of 5292 nucleotides and constitutes the sequence SEQ ID No. 117.
  • the sequence SEQ ID No. 117 corresponds to the sequence which begins at the nucleotide in position 12936 and which ends at the nucleotide in position 18227 of the sequence SEQ ID No. 114.
  • the nucleotide sequence SEQ ID No. 117 codes for the polyketide synthase ORF3 polypeptide of 1763 amino acids, this polypeptide constituting the sequence SEQ ID No. 123 according to the invention.
  • the ORF3 polypeptide of sequence SEQ ID No. 123 has an identity of 42% in amino acids with the MtaB sequence of Stigmatella aurantiaca referenced under the access number “gb AAF 19810.1” from the GENBANK database.
  • the nucleotide sequence orf4 has a length of 6462 nucleotides and constitutes the sequence SEQ ID No. 118 according to the invention.
  • the nucleotide sequence SEQ ID No. 118 corresponds to the sequence starting at the nucleotide at position 18224 and ending at the nucleotide at position 24685 of the nucleotide sequence SEQ ID No. 114.
  • the nucleotide sequence SEQ ID No. 118 codes for the polyketide synthase ORF4 polypeptide of 2153 amino acids, this polypeptide constituting the sequence SEQ ID No. 124 according to the invention.
  • the ORF4 polypeptide of sequence SEQ ID No. 124 has an amino acid sequence identity of 46% with the epoD sequence of Sorangium cellulosum referenced under the access number “gb AAF62883.1 from the GENBANK database.
  • the orf ⁇ nucleotide sequence has a length of 5088 nucleotides and constitutes the sequence SEQ ID No. 119 according to the invention.
  • sequence SEQ ID No. 119 corresponds to the sequence starting at the nucleotide at position 24682 and ending at the nucleotide at position 29769 of the nucleotide sequence SEQ ID No. 114.
  • the nucleotide sequence SEQ ID No 119 codes for the polyketide synthase ORF5 polypeptide of 1695 amino acids, this polypeptide constituting the sequence SEQ ID No 125 according to the invention.
  • polyketide synthase ORF5 polypeptide of sequence SEQ ID No. 125 has an amino acid identity of 43% with the epod sequence of Sorangium cellulosium referenced under the access number "gb AAF 62883.1" from the GENBANK database.
  • the nucleotide sequence ifif has a length of 4306 nucleotides, and constitutes the sequence SEQ ID No. 120 according to the invention.
  • the nucleotide sequence SEQ ID No. 120 corresponds to the sequence starting at the nucleotide at position 29766 and ending at the nucleotide at position 34071 of the sequence SEQ ID ID No. 1 14.
  • sequence SEQ ID No. 120 contains an open partial reading frame coding for the ORF6 polypeptide of 1434 amino acids of the polyketide synthase type, this polypeptide constituting the sequence SEQ ID No. 126 according to the invention.
  • the polypeptide of sequence SEQ ID No. 126 has an amino acid identity of 43% with the epoD sequence of Sorangium cellulosum referenced under the access number "gb AAF 62883.1" from the GENBANK database.
  • EXAMPLE 15 Construction of integrative BAC shuttle vectors at Streptomyces
  • the BAC vector pMBD-1 was obtained according to the following steps: Step 1: The vector pOSVO10 was subjected to digestion with the enzymes PsTI and BstZ171 in order to obtain a nucleotide fragment of 6.3 kb.
  • Step 2 The vector pDNR-1 was digested with the enzymes PstI and Pvull in order to obtain a nucleotide fragment of 4.145 kb.
  • Step 3 The 6.3 kb nucleotide fragment originating from the vector pOSV017 was ligated to the 4.15 kb fragment originating from the vector pDNR-1, in order to produce the vector pMBD-1, as illustrated in the figure. 30.
  • the vector pMBD-2 is a vector of the BAC type containing an integrative box " ⁇ c31 int- ⁇ hyg".
  • ⁇ c31 is a temperate phage with a broad host spectrum whose attachment site (attP) is well located.
  • the ⁇ c31 int fragment is the minimal fragment of the ⁇ c31 actinophagus capable of inducing the integration of a plasmid into the chromosome of Streptomyces Lividans.
  • ⁇ hyg is a derivative of the interposon ⁇ capable of conferring resistance to hygromicine in E. coli and S. Lividans.
  • BAC vectors containing the integration system ⁇ c31 are described by SOSIO et al. (2000) and in PCT application No. 99 6734 published on December 29, 1999.
  • the BAC pmBD-2 vector was constructed according to the following steps:
  • Step 1 Construction of an integrative box intc31 int ⁇ hyg in a multicopy plasmid of E.coli.
  • the ⁇ c31 int fragment was first amplified from the plasmid pOJ436 using the following pair of primers:
  • the primer EV ⁇ c31 l (SEQ ID No. 109) (which makes it possible to introduce an EcoRV site at the 5 ′ end of the sequence ⁇ c31) and the primer Bll ⁇ c31 F (SEQ ID No. 110) (which allows 'introduction of a BgLII site at the 3' end of the sequence ⁇ c31).
  • the ⁇ hyg fragment was obtained by digestion using the enzyme BamHI from the plasmid pHP45 ⁇ hyg described by BLONDELET-ROUAULT (1997).
  • Step 2 Construction of the vector pMBD-2.
  • the bacterial artificial chromosome pBAce3.6 described by FRENGEN et al. (1999) was digested with the enzyme Nhel and then treated with the enzyme Eco polymerase.
  • the vector pMCS5 ⁇ c31 int- ⁇ hyg was digested with the enzymes SnaBI and EcoRV in order to recover the integrative box.
  • the vector pMBD-3 is an integrative ( ⁇ c31 int) and conjugative (OriT) vector of the BAC type, which comprises the selection marker ⁇ hyg.
  • the vector pMBD-3 was obtained by amplifying the OriT gene from the plasmid pOJ436 using the pair of primers with sequences SEQ ID No. 111 and SEQ ID No. 112 which contain pacl restriction sites.
  • the nucleotide fragment amplified using the primers SEQ ID No. 111 and SEQ ID No. 112 was cloned into the vector pMBD2 previously digested with the enzyme Pac1.
  • the construction diagram of the vector pMBD-3 is illustrated in FIG. 31. 15.4 Construction of the DMBD-4 vector
  • the detailed map of the vector pMBD-4 is represented in FIG. 32.
  • the vector pMBD4 was obtained by cloning the integrative box ⁇ c31 int- ⁇ hyg into the vector pCYTAC2.
  • the construction diagram of the vector pMBD-5 is illustrated in FIG. 33.
  • the vector pMBD-5 was constructed by recombination of the nucleotide fragment comprised between the two loxP sites of the vector pMBD-1 illustrated in FIG. 33 with the loxp site contained in the BAC vector designated pBTP3, a detailed map of the plasmid pBTP3 being represented at Figure 34.
  • the vector pMBD-6 was constructed by recombining the nucleotide fragment comprised between the two loxP sites of the vector pMBD-1 at the level of the loxP site of the BAC vector pBeloBad 1, as shown in FIG. 35.
  • n 3; standard deviation in parentheses.
  • d The quantity of DNA extracted was evaluated on an electrophoresis gel relative to a standard range of calf thymus DNA.
  • e The quantification was carried out after digestion of the agarose by the action of a b-agarase
  • Table 6 Characterization of the DNAs extracted according to their proportion in a, b, and g subclasses of Proteobacteria, in Gram + with low GC% and in Actinomycetes; the hybridization signal with the prokaryotic probe serving as a 100% reference.
  • Blondelet-Rouault MH Weiser J, Lebrihi A, Branny P, Pernodet JL.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de préparation d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de l'environnement, plus particulièrement un procédé d'obtention d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon. L'invention est également relative aux acides nucléiques ou aux collections d'acides nucléiques obtenus selon le procédé et leur application à la synthèse de nouveaux composés, notamment de nouveaux composés d'intérêt thérapeutique. L'invention a également pour objet les moyens nouveaux mis en oeuvre dans le procédé d'obtention d'acides nucléiques ci-dessus, tels que de nouveaux vecteurs et des nouveaux procédés de préparation de tels vecteurs ou encore des cellules hôtes recombinantes comprenant un acide nucléique de l'invention. L'invention concerne encore des procédés pour détecter un acide nucléique d'intérêt au sein d'une collection d'acides nucléiques obtenus selon le procédé ci-dessus, ainsi que les acides nucléiques détectés par un tel procédé et les polypeptides codés par de tels acides nucléiques.

Description

Procédé d'obtention d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de l'environnement, acides nucléiques ainsi obtenus et leur application à la synthèse de nouveaux composés
La présente invention concerne un procédé de préparation d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de l'environnement, plus particulièrement un procédé d'obtention d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon. L'invention est également relative aux acides nucléiques ou aux collections d'acides nucléiques obtenus selon le procédé et leur application à la synthèse de nouveaux composés, notamment de nouveaux composés d'intérêt thérapeutique.
L'invention a également pour objet les moyens nouveaux mis en oeuvre dans le procédé d'obtention d'acides nucléiques ci-dessus, tels que de nouveaux vecteurs et des nouveaux procédés de préparation de tels vecteurs ou encore des cellules hôtes recombinantes comprenant un acide nucléique de l'invention.
L'invention concerne encore des procédés pour détecter un acide nucléique d'intérêt au sein d'une collection d'acides nucléiques obtenus selon le procédé ci-dessus, ainsi que les acides nucléiques détectés par un tel procédé et les polypeptides codés par de tels acides nucléiques.
L'invention a également trait à des acides nucléiques obtenus et détectés selon les procédés ci-dessus, en particulier des acides nucléiques codant pour une enzyme participant à la voie de biosynthèse d'antibiotiques tels que les β-lactames, les aminoglycosides, les nucléotides hétérocycliques ou encore des polykétides ainsi que l'enzyme codée par ces acides nucléiques, les polykétides produits grâce à l'expression de ces acides nucléiques et enfin des compositions pharmaceutiques comprenant une quantité pharmacologiquement active d'un polykétide produit grâce à l'expression de tels acides nucléiques.
Depuis la découverte de la production de la streptomycine par les actinomycètes, la recherche de nouveaux composés d'intérêt thérapeutique, et tout particulièrement de nouveaux antibiotiques, a eu recours de manière accrue à des méthodes de criblage des métabolites produits par les micro-organismes du sol. De telles méthodes consistent principalement à isoler les organismes de la microflore tellurique, à les cultiver sur des milieux nutritifs spécialement adaptés puis à détecter une activité pharmacologique dans les produits retrouvés dans les surnageants de culture ou dans les lysats cellulaires ayant, le cas échéant, subi au préalable une ou plusieurs étapes de séparation et/ou de purification.
Ainsi, les méthodes d'isolement et de culture in vitro des organismes constituant la microflore tellurique ont permis, à la date d'aujourd'hui, de caractériser environ 40.000 molécules, dont environ la moitié présente une activité biologique.
Des produits majeurs ont été caractérisés selon de telles méthodes de culture in vitro, tels que des antibiotiques (pénicilline, érythromycine, actinomycine, tétracycline, céphalosporine), des anticancéreux, des anticholestérolémiants ou encore des pesticides. Les produits d'intérêt thérapeutique d'origine microbienne connus à ce jour proviennent majoritairement (environ 70%) du groupe des actinomycètes et plus particulièrement du genre Streptomyces. Toutefois, d'autres composés thérapeutiques, tels que les teicoplanines, la gentamycine et les spinosines, ont été isolés à partir de micro- organismes de genres plus difficiles à cultiver tels que Micromonospora, Actinomadura, Actinoplanes, Nocardia, Streptosporangium, Kitasatosporia ou encore Saccharomonospora.
Mais la pratique illustre le fait que la caractérisation de nouveaux produits naturels synthétisés par les organismes de la microflore du sol est restée limitée, en partie du fait que l'étape de culture in vitro aboutit le plus souvent à une sélection d'organismes déjà connus antérieurement.
Les méthodes de séparation et de culture in vitro des organismes telluriques en vue d'identifier de nouveaux composés d'intérêt présentent donc de nombreuses limites.
Chez les actinomycètes, par exemple, le taux de redécouverte d'antibiotiques déjà connus antérieurement est d'environ 99%. En effet, des techniques de microscopie en fluorescence ont permis de dénombrer plus de 1010 cellules bactériennes dans 1g de sol, alors que seulement 0,1 à 1 % de ces bactéries peuvent être isolées après ensemencement sur des milieux de culture.
A l'aide de techniques de cinétique de réassociation d'ADN, il a pu être montré qu'entre 12.000 et 18.000 espèces bactériennes peuvent être contenues dans 1g de sol, alors qu'à ce jour, seuls 5000 microorganismes non eucaryotes ont été décrits, tout habitat confondu.
Des études d'écologie moléculaire ont permis d'amplifier et cloner de nombreuses séquences nouvelles d'ADNr 16S à partir d'ADN de l'environnement. Les résultats de ces études ont conduit à tripler le nombre de divisions bactériennes caractérisées antérieurement.
A la date d'aujourd'hui, les bactéries sont subdivisées en 40 divisions, certaines d'entre elles n'étant constituées que par des bactéries ne pouvant être cultivées. Ces derniers résultats témoignent de l'ampleur de la biodiversité microbienne restée inexploitée à ce jour.
Des travaux récents ont tenté de surmonter les nombreux obstacles à l'accès à la biodiversité de la microflore du sol, dont notamment l'étape de culture in vitro préalable à l'isolement et la caractérisation de composés d'intérêt industriel, surtout d'intérêt thérapeutique.
Des méthodes ont ainsi été mises au point qui incluent une étape d'extraction de l'ADN des organismes telluriques, le cas échéant après un isolement préalable des organismes contenus dans les échantillons de sol. L'ADN ainsi extrait, après lyse des cellules bactériennes sans étape préalable de culture' in vitro, est clone dans des vecteurs utilisés pour transfecter des organismes hôtes, afin de constituer des banques d'ADN provenant de bactéries du sol.
Ces banques de clones recombinants sont utilisées pour détecter la présence de gènes codant pour des composés d'intérêt thérapeutique ou alternativement pour détecter la production de composés d'intérêt thérapeutique par ces clones recombinants.
Toutefois, les méthodes d'accès direct à l'ADN de la microflore du sol, décrites dans l'état de la technique présentent des inconvénients lors de la mise en oeuvre de chacune des étapes décrites ci-dessus, de nature à affecter considérablement la quantité et la qualité du matériel génétique obtenu et exploitable.
L'état de la technique concernant chacune des étapes de construction de banques d'ADN provenant d'échantillons de sol est détaillé ci-après, ainsi que les inconvénients techniques identifiés par le demandeur et qui ont été surmontés selon la présente invention.
1. Etape d'extraction de l'ADN à partir d'un échantillon du sol.
1.1 Extraction directe d'ADN de l'environnement.
Il s'agit pour l'essentiel d'un procédé mettant en oeuvre des techniques d'extraction d'ADN réalisées directement sur l'échantillon dans l'environnement, le plus souvent après une lyse in situ préalable des organismes de l'échantillon.
De telles techniques ont été mises en oeuvre sur des échantillons provenant de milieux aquatiques, que ce soit d'eau douce ou marine. Elles comprennent une première étape de concentration préalable des cellules présentes librement ou sous forme de particules, consistant en général en une filtration de grands volumes d'eau sur différents dispositifs de filtration, par exemple filtration classique sur membrane, filtration tangentielle ou rotationnelle ou encore ultrafiltration. La taille des pores est comprise entre 0,22 et 0,45 mm et nécessite souvent une préfiltration dans le but d'éviter des colmatages dus au traitement de grands volumes.
Dans un second temps, les cellules récoltées sont lysées directement sur les filtres dans des petits volumes de solutions, par traitement enzymatique et/ou chimique.
Cette technique est par exemple illustrée par les travaux de STEIN et al. , 1996, Journal of Bacteriology, Vol.178 (3): 591-599 qui décrit le clonage de gènes codant pour de l'ADN ribosomal et pour un facteur d'élongation de la transcription (EF 2) à partir d'Archaebactéries du plancton marin. Des techniques d'extraction directe d'ADN à partir d'échantillons de sol ou de sédiment ont été également décrites, basées sur des protocoles de lyse physique, chimique ou enzymatique réalisée in situ. Par exemple, le brevet US N°5, 824,485 (Chromaxome
Corporation) décrit une lyse chimique des bactéries directement sur l'échantillon prélevé par addition d'un tampon de lyse chaud à base d'isothiocyanate de guanidium.
La demande Internationale n°WO 99/20.799 (WISCONSIN ALUMNI RESEARCH FOUNDATION) décrit une étape de lyse des bactéries in situ à l'aide d'un tampon d'extraction contenant une protéase et du SDS.
D'autres techniques ont également été utilisées telles que la réalisation de plusieurs cycles de congélation-décongélation de l'échantillon puis pressage de l'échantillon décongelé à haute pression. Ont été également utilisées des techniques de lyse des bactéries à l'aide d'une succession d'étapes de sonication, de chauffage par micro-ondes et de chocs thermiques (PICARD et al. (1992).
Toutefois, les techniques d'extraction directe d'ADN de l'état de la technique décrites ci-dessus ont une efficacité très variable du point de vue quantitatif et qualitatif.
Ainsi, les traitements chimiques ou enzymatiques in situ de l'échantillon ont le désavantage de ne lyser que certaines catégories de micro-organismes du fait de la résistance sélective des différents micro- organismes indigènes à l'étape de lyse en raison de leur morphologie hétérogène.
Ainsi, les bactéries à Gram-positif résistent à un traitement à chaud au détergent SDS alors que la quasi-totalité des cellules à Gram- négatif sont lysées . En outre, certains des protocoles d'extraction directe décrits ci- dessus favorisent l'adsorption des acides nucléiques extraits sur les particules minérales de l'échantillon, réduisant ainsi significativement la quantité d'ADN accessible.
Par ailleurs, si certains protocoles de l'état de la technique divulguent une étape de traitement mécanique pour lyser les micro- organismes de l'échantillon prélevé, une telle étape de lyse mécanique est systématiquement effectuée en milieu liquide dans un tampon d'extraction, ce qui ne permet pas une bonne homogénéisation de l'échantillon de départ sous la forme de particules fines permettant une accessibilité maximale à la diversité des organismes présents dans l'échantillon. Des essais de broyage ont également été effectués sur échantillon de sol brut à l'aide de billes de verre, mais la quantité d'ADN extrait était faible.
Il a été observé selon l'invention qu'une première étape de lyse mécanique in situ en milieu liquide avait des effets négatifs sur la quantité d'ADN susceptible d'être extrait.
La quantité d'ADN directement utilisable pour le clonage dans des vecteurs recombinants est également tributaire des étapes de purification subséquentes à son extraction. Dans l'état de la technique, l'ADN extrait est ensuite purifié, par exemple par l'utilisation de polyvinylpolypyrrolidone, par une précipitation en présence d'acétate d'ammonium ou de potassium, par des centrifugations sur gradient de chlorure de césium, ou encore des techniques chromatographiques, notamment sur support d'hydroxyapatite, sur colonne échangeuse d'ions ou encore tamisage moléculaire ou par des techniques d'électrophorèse sur gel d'agarose.
Les techniques de purification d'ADN décrites antérieurement, surtout lorsque celles-ci sont combinées avec les techniques d'extraction d'ADN de l'environnement précitées, sont susceptibles de conduire à une co-purification de l'ADN avec des composés inhibiteurs provenant de l'échantillon initial qui sont difficiles à éliminer.
La co-extraction de composés inhibiteurs avec l'ADN nécessite la multiplication du nombre d'étapes de purification ce qui conduit à des pertes importantes de l'ADN initialement extrait et réduit simultanément la diversité du matériel génétique initialement contenu dans l'échantillon, ainsi que sa quantité.
Un autre but de l'invention a été de surmonter les inconvénients des protocoles de purification antérieurs et de mettre au point une étape de purification d'ADN permettant de maintenir de manière optimale la diversité de l'ADN de l'échantillon initial, d'une part, et, de favoriser quantitativement son obtention, d'autre part.
Tout particulièrement, les améliorations qualitatives et quantitatives à la purification d'ADN sont maximales lorsqu'elles font appel à une combinaison d'un procédé d'extraction direct de l'ADN selon l'invention et d'un procédé de purification ultérieur, comme cela sera décrit ci-après.
1.2. Extraction indirecte d'ADN de l'environnement.
De telles techniques ont recours à une première étape de séparation des différents organismes de la microflore tellurique des autres constituants de l'échantillon de départ, préalablement à l'étape d'extraction de l'ADN proprement dite. Dans l'état de la technique, la séparation préalable d'une fraction microbienne d'un échantillon de sol comprend le plus souvent une dispersion physique de l'échantillon par broyage de ce dernier en milieu liquide, par exemple en utilisant des dispositifs du type Waring Blender ou encore un mortier. II a également été décrit des dispersions chimiques, par exemple sur des résines échangeuses d'ions ou encore des dispersions à l'aide de détergents non spécifiques tels que le déoxycholate de sodium ou du polyéthylène glycol. Quel que soit le mode de dispersion, l'échantillon solide doit être mis en suspension dans de l'eau, du tampon phosphate ou une solution saline.
L'étape de dispersion physique ou chimique peut être suivie d'une centrifugation sur gradient de densité permettant la séparation des cellules contenues dans l'échantillon et des particules de ce dernier, étant entendu que les bactéries ont des densités inférieures à celles de la plupart des particules du sol.
L'étape de dispersion physique peut aussi être suivie alternativement d'une étape de centrifugation à faible vitesse ou encore une étape d'élutriation cellulaire.
L'ADN peut ensuite être extrait des cellules séparées par toutes les méthodes de lyse disponibles et être purifié par de nombreuses méthodes, y compris les méthodes de purification décrites au paragraphe 1.1 précédent. Notamment, l'inclusion des cellules dans de l'agarose à bas point de fusion peut être réalisée afin de ménager la lyse. Toutefois, les méthodes décrites dans l'état de la technique connues du demandeur ne donnent pas satisfaction du fait de la présence, dans les fractions contenant l'ADN extrait, de constituants indésirables de l'échantillon de départ ayant une influence significative sur la qualité et la quantité d'ADN final. La présente invention se propose de résoudre les difficultés techniques rencontrées dans les procédés de l'art antérieur comme cela sera décrit ci-après.
2. Caractérisation moléculaire de l'ADN extrait.
Lorsque l'on désire construire une banque d'ADN à partir d'un échantillon de l'environnement, en particulier à partir d'un échantillon de sol, il est avantageux de vérifier la qualité et la diversité de la source d'ADN extrait et purifié préalablement à son insertion dans des vecteurs appropriés.
L'objectif d'une telle caractérisation moléculaire de l'ADN extrait et purifié est d'obtenir des profils représentant les proportions des différents taxons bactériens présents dans cet extrait d'ADN. La caractérisation moléculaire de l'ADN extrait et purifié permet de déterminer si des artefacts ont été introduits lors de la mise en oeuvre des différentes étapes d'extraction et de purification et, le cas échéant, si la diversité d'origine de l'ADN extrait et purifié est représentative de la diversité microbienne présente initialement dans l'échantillon, notamment dans l'échantillon de sol. A la connaissance du demandeur, il est recouru dans l'état de la technique à des procédés d'hybridation quantitative mettant en oeuvre des sondes oligonucléotidiques spécifiques de différents groupes bactériens, appliqués directement à l'ADN extrait de l'environnement. Malheureusement, une telle approche est peu sensible et ne permet pas de détecter des genres ou des groupes taxonomiques présents en faible abondance.
L'état de la technique décrit aussi des procédés de PCR quantitative, telle que la MPN-PCR ou encore la PCR quantitative par compétition. Toutefois, ces techniques présentent d'importants inconvénients.
Ainsi, la MPN-PCR est d'une utilisation complexe du fait de la multiplication des dilutions et des répétitions qui la rend inappropriée pour un grand nombre d'échantillons ou de couples d'amorces.
Par ailleurs, la PCR quantitative par compétition est d'une mise en oeuvre difficile du fait de la nécessité de construire un compétiteur spécifique à l'ADN cible qui, en outre, n'induit pas de biais ou d'artefacts dans la compétition proprement dite. II est ainsi proposé selon l'invention un procédé de précriblage d'une banque d'ADN provenant d'un échantillon de l'environnement qui est à la fois rapide, simple et fiable et permet de tester la qualité de l'ADN préalablement extrait et purifié et de déterminer ainsi l'intérêt de construire une banque de clones préparés à partir de cet ADN purifié de départ.
3. Vecteurs pour le clonage de l'ADN extrait et purifié à partir d'un échantillon de l'environnement.
De nombreux vecteurs ont déjà été décrits dans l'état de la technique afin de cloner de l'ADN préalablement extrait d'un échantillon de l'environnement.
Ainsi, selon la description de la demande internationale n°WO 99/20.799, peuvent être utilisés des vecteurs viraux, des phages, des plasmides, des phagemides, des cosmides, des phosmides, des vecteurs du type BAC (chromosome artificiel bactérien) ou encore le bactériophage P1 , des vecteurs de type PAC (chromosome artificiel basé sur le bactériophage P1 ), des vecteurs du type YAC (chromosome artificiel de levure), des plasmides de levure ou tout autre vecteur capable de maintenir et d'exprimer de manière stable un ADN génomique.
L'exemple 1 de la demande PCT n°WO 99/20.799 décrit la construction d'une banque d'ADN génomique par clonage dans un vecteur du type BAC.
A la connaissance du demandeur, aucune banque d'ADN provenant d'un échantillon de l'environnement n'avait encore été effectivement réalisée avec des vecteurs de type conjugatif, une telle technique étant rendue pour la première fois accessible et reproductible par l'homme du métier grâce à l'enseignement de la présente invention.
4. Hôtes cellulaires
Dans l'état de la technique, de nombreuses cellules hôtes ont été décrites comme pouvant être utilisées afin d'héberger les vecteurs contenant les inserts d'ADN provenant de l'ADN extrait et purifié à partir d'un échantillon de l'environnement.
Ainsi, la demandé PCT N°WO 99/20.799 cite de nombreux hôtes cellulaires appropriés, tels que Escherichia coli, en particulier la souche DH 10B ou encore la souche 294 (ATCC 31446, la souche E. coli B, E. Coli X 1776 (ATCC N°31.537), E.coli DH5 α et E.coli W3110
(ATCC n°27.325).
Cette demande PCT cite également d'autres cellules hôtes appropriées telles que Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, Schigella ou encore des souches du type bacillus telles que B. subtilis et β. licheniformis ainsi que les bactéries du genre
Pseudomonas, Streptomyces ou Actinomyces.
Le brevet US N°5, 824,485 cite en particulier la souche de Streptomyces lividans TK66 ou encore des cellules de levure telles que celles de Saccharomyces pombe.
5. Caractérisation de gènes d'intérêt dans des banques d'ADN provenant d'un échantillon de l'environnement. La demande PCT N° WO 99/20.799 décrit une identification du phénotype de différents clones appartenant à la banque d'ADN de B.cereus, respectivement un clone produisant de l'hémolysine, un clone hydrolysant l'esculine ou encore un clone produisant un pigment orange. Des techniques de mutagenèse basées sur l'utilisation d'un transposon codant pour l'enzyme pho A ont permis subséquemment d'isoler des clones mutés et de caractériser les séquences responsables des phénotypes observés.
L'article de STEIN et al. (1996) précité décrit l'utilisation d'amorces spécifiques de l'ADN ribosomal afin d'amplifier l'ADN inséré dans les vecteurs hébergés par certains clones d'une banque d'ADN génomique d'Archaebactéries de plancton marin et l'identification de plusieurs séquences codantes dans l'ADN ainsi amplifié.
L'article de BORSCHERT S. et al., (1992) décrit le criblage d'une banque d'ADN génomique de Bacillus subtilis à l'aide de couples d'amorces hybridant avec des régions conservées de peptide synthétases connues afin d'identifier un ou plusieurs gènes correspondant dans le génome de Bacillus subtilis.
Cette technique a permis de détecter un fragment d'ADN chromosomique d'environ 26 kb portant une partie de l'opéron de biosynthèse de la surfactine.
L'article de KAH-TONG S. et al.(1997) décrit le criblage d'une banque d'ADN provenant du sol à l'aide d'amorces hybridant avec des séquences conservées de l'opéron responsable de la voie de biosynthèse des polykétides de type II et montre l'identification, au sein de cette banque d'ADN, de séquences apparentées au gène PKS-β. Cet article décrit aussi la construction de cassettes d'expression hybrides dans lesquelles la séquence de la sous-unité PKS-β, retrouvée naturellement dans l'opéron responsable de la biosynthèse des polykétides, a été remplacée par différentes séquences apparentées retrouvées dans la banque d'ADN.
De même, l'article de HONG-FU et al. , (1995) décrit la construction de cassettes d'expression contenant les différentes phases de lecture ouverte de l'opéron responsable de la biosynthèse des polykétides, les différentes cassettes d'expression ayant été construites artificiellement en combinant les phases de lecture ouverte qui ne sont pas retrouvées ensemble naturellement dans le génome de Streptomyces coelicolor. Cet article montre que la combinaison, dans les cassettes d'expression artificielles, de cadres de lecture ouvert originaires de différentes souches bactériennes permet la production de polykétides ayant différentes caractéristiques structurales et des activités antibiotiques plus ou moins grandes vis-à-vis de Bacillus subtilis et Bacillus cereus.
Les polykétides font partie d'une grande famille de produits naturels de structure variable et possédant une grande diversité d'activités biologiques. Font partie des polykétides par exemple, les tétracyclines et l'érythromycine (antibiotiques), le FK506 (immunosuppresseur), la doxorubicine (agent anti-cancéreux), la monensine (un agent coccidiostatique) ainsi que l'avermectine (un agent antiparasitaire).
Ces molécules sont synthétisées grâce à des enzymes multifonctionnelles appelées polykétides synthases, qui catalysent des cycles de condensation répétés entre des acyl thioesters (en général des acétyl, propionyl, malonyl ou méthylmalonyl thioesters). Chaque cycle de condensation aboutit à la formation, sur une chaîne croissante carbonée, d'un groupe β-kéto qui peut ensuite subir, le cas échéant, une ou plusieurs séries d'étapes réductrices.
Compte-tenu de l'intérêt clinique important des polykétides, leur mécanisme commun de biosynthèse ainsi que le haut degré de conservation observé entre les groupes de gènes codant pour les polykétides synthases, il s'est développé un intérêt accru pour le développement de nouveaux polykétides par génie génétique.
De nouveaux polykétides artificiels ont ainsi été produits par génie génétique, tels que la méderrhodine A ou la dihydrogranatirhodine. La grande majorité des molécules nouvelles de polykétides obtenues par génie génétique sont très différentes, du point de vue structural, des polykétides correspondants naturels.
De l'état de la technique, il ressort ainsi qu'il existe un besoin d'obtention de nouveaux polykétides d'intérêt et tout particulièrement de polykétides d'intérêt thérapeutique présentant notamment, par rapport à leurs homologues naturels, un niveau accru d'activité antibiotique ou encore un spectre d'activité antibiotique différent, soit plus large que celui des polykétides connus, soit au contraire plus sélectif.
Ce besoin est, comme cela sera décrit ci-après, en partie comblé selon la présente invention.
DESCRIPTION DE L'INVENTION
L'invention concerne tout d'abord un procédé pour la construction de banques d'ADN provenant d'un échantillon de l'environnement, un tel échantillon pouvant être indifféremment un milieu aquatique (eau douce ou marine), un échantillon de sol (couche superficielle du sol, sous-sol ou sédiments), ou encore un échantillon d'organismes eucaryotes contenant une microflore associée, tel que par exemple un échantillon provenant de plantes, d'insectes ou encore d'organismes marins et possédant une microflore associée.
La mise au point d'un procédé de construction d'une banque d'ADN d'un échantillon de l'environnement, et tout particulièrement d'un échantillon de sol, comprend des étapes critiques dont la mise en oeuvre doit être nécessairement optimisée pour l'obtention d'une banque d'ADN dont le contenu en acides nucléiques d'intérêt répond aux objectifs initialement fixés.
Une première étape critique consiste en l'extraction et la purification ultérieure des acides nucléiques contenus initialement dans l'échantillon, c'est-à-dire principalement des acides nucléiques contenus dans les divers organismes composant la microflore de cet échantillon.
La qualité de la purification de l'ADN extrait est déterminante sur le résultat obtenu.
Une seconde étape importante d'un procédé de construction d'une banque d'acides nucléiques provenant d'un échantillon de l'environnement est l'évaluation de la diversité génétique des acides nucléiques extraits et purifiés. La mise au point d'une étape de réalisation simple et fiable de pré-criblage de l'ADN extrait et purifié afin de vérifier qu'il rend compte, au moins partiellement, de la diversité phylogénétique des organismes présents initialement dans l'échantillon de départ, permet en effet de déterminer l'intérêt ou non d'utiliser la source initiale d'ADN extrait et purifié pour la construction de la banque d'acides nucléiques proprement dite ou au contraire de ne pas poursuivre la construction de la banque d'acides nucléiques du fait d'artefacts trop importants introduits au moment de l'extraction et de la purification des acides nucléiques. Il a en outre été identifié selon l'invention que la qualité des inserts introduits dans les vecteurs pour construire la banque est déterminante. Il a ainsi été déterminé que l'utilisation d'enzymes de restriction pour cliver l'ADN extrait et purifié à partir de l'échantillon de l'environnement était de nature à introduire des artefacts ou " biais " dans la structure des inserts obtenus. En effet, l'ADN extrait du sol ou d'autres environnements, provenant en très grande majorité d'organismes non cultivables, est composé de molécules dont le taux de bases G et C est par définition inconnu et de plus variable en fonction de l'origine de ces organismes.
Une troisième étape critique est l'insertion des acides nucléiques extraits et purifiés dans des vecteurs capables d'intégrer des acides nucléiques de longueur choisie, d'une part, et, d'autre part, d'en permettre la transfection ou encore l'intégration dans le génome dans des hôtes cellulaires déterminés ainsi que, le cas échéant, d'en permettre l'expression dans de tels hôtes cellulaires.
Constituent des vecteurs d'intérêt, les vecteurs capables d'intégrer des acides nucléiques de grande taille, c'est-à-dire de taille supérieure à 100 kb lorsque l'objectif poursuivi consiste en un clonage et en une identification d'un .opéron complet capable de diriger une voie complète de biosynthèse d'un composé d'intérêt industriel, en particulier d'un composé d'intérêt pharmaceutique ou agronomique.
DEFINITIONS
Au sens de la présente invention, on entend par " acides nucléiques ", " polynucléotides " et " oligonucléotides " aussi bien des séquences d'ADN, d'ARN, que des séquences hybrides ARN/ADN de plus de 2 nucléotides, indifféremment sous la forme simple brin ou double brin. Le terme " banque " ou " collection " est utilisé dans la présente description en référence indifféremment à un ensemble d'acides nucléiques extraits et, le cas échéant purifiés, provenant d'un échantillon de l'environnement, à un ensemble de vecteurs recombinants, chacun des vecteurs recombinants de l'ensemble comprenant un acide nucléique provenant de l'ensemble d'acides nucléiques extraits et, le cas échéant purifiés précités, ainsi qu'à un ensemble de cellules hôtes recombinantes comprenant un ou plusieurs acides nucléiques provenant de l'ensemble des acides nucléiques extraits et, le cas échéant, purifiés précités, lesdits acides nucléiques étant soient portés par un ou plusieurs vecteurs recombinants, soit intégrés dans le génome desdites cellules hôtes recombinantes.
On désigne par " échantillon de l'environnement " indifféremment un échantillon d'origine aquatique, par exemple d'eau douce ou saline, ou un échantillon tellurique provenant de la couche superficielle d'un sol, de sédiments ou encore de couches inférieures du sol (sous-sol), ainsi que des échantillons d'organismes eucaryotes, le cas échéant multicellulaires, d'origine végétale, provenant d'organismes marins ou encore d'insectes et possédant une microflore associée, cette microflore associée constituant des organismes d'intérêt.
On entend par " opéron " selon l'invention, un ensemble de cadres ouverts de lecture dont la transcription et/ou la traduction est co- régulée par un ensemble unique de signaux de régulation de la transcription et/ou de la traduction. Selon l'invention, un opéron peut également comprendre lesdits signaux de régulation de la transcription et/ou de la traduction.
Par " voie métabolique " aux fins de l'invention ou encore " voie de biosynthèse " on entend un ensemble de réactions biochimiques anaboliques ou cataboliques réalisant la conversion d'une première espèce chimique en une seconde espèce chimique.
Par exemple, une voie de biosynthèse d'un antibiotique est constituée de l'ensemble des réactions biochimiques convertissant des métabolites primaires en produits intermédiaires des antibiotiques, puis subséquemment en antibiotiques. Par séquence de régulation placée " en phase " (en anglais operably linked) par rapport à une séquence nucléotidique dont l'expression est recherchée, on signifie que la ou les séquences de régulation de la transcription sont localisées, par rapport à la séquence nucléotidique d'intérêt dont l'expression est recherchée, de manière à permettre l'expression de ladite séquence d'intérêt, la régulation de la dite expression étant dépendante de facteurs interagissant avec les séquences nucléotidiques régulatrices.
Selon une autre terminologie, on peut dire également que la séquence nucléotidique d'intérêt dont l'expression est recherchée est placée " sous le contrôle " des séquences nucléotidiques régulatrices de la transcription.
Le terme " isolé " au sens de la présente invention désigne un matériel biologique qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement).
Par exemple, un polynucléotide ou un polypeptide présent à l'état naturel dans un organisme (virus, bactérie, champignon, levure, plante ou animal) n'est pas isolé. Le même polypeptide séparé de son environnement naturel ou le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de l'organisme, est isolé.
Un tel polynucléotide peut être inclus dans un vecteur et/ou un tel polynucléotide peut être inclus dans une composition et demeure néanmoins à l'état isolé, du fait que le vecteur ou la composition ne constitue pas son environnement naturel.
Le terme " purifié " ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusif de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.
Un polypeptide ou un polynucléotide est à l'état purifié après purification du matériel de départ d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement 4 ou 5 ordres de grandeur.
Le " pourcentage d'identité " entre deux séquences de nucléotides ou d'acides aminés, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison. La partie de la séquence nucléotidique ou polypeptide dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des " gaps ") par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences.
Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auquel une base nucléique ou un résidu d'aminoacide identique est observé pour les deux séquences (nucléique ou peptidique) comparées, puis en divisant le nombre de positions auquel il y a identité entre les deux bases ou résidus d'aminoacides par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par 100 afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus contenus dans le package de la Société WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison, WISCONSIN.
A titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être effectué à l'aide du logiciel BLAST (versions BLAST 1.4.9 de Mars 1996, BLAST 2.0.4. de Février 1998 et BLAST 2.0.6. de Septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut (S.F. AltschuI et al., J. Mol. Biol. 1990 215: 403-410, S. F. AltschuI et al., Nucleic Acids Res. 1997 25: 3389-3402). Blast recherche des séquences similaires/homologues à une séquence " requête " de référence, à l'aide de l'algorithme d'AltschuI et al. La séquence requête et les bases de données utilisées peuvent être peptidiques ou nucléiques, toute combinaison étant possible.
EXTRACTION ET PURIFICATION D'ACIDES NUCLEIQUES PROVENANT D'UN ECHANTILLON DE L'ENVIRONNEMENT.
1. Extraction directe d'acides nucléiques
Il a été montré selon la présente invention que, pour l'obtention d'une banque d'acides nucléiques provenant d'organismes contenus dans un échantillon du sol, il était important de créer des conditions dans lesquelles, d'une part, les différents organismes de l'échantillon sont rendus accessibles aux étapes ultérieures d'extraction des acides nucléiques et, d'autre part, que l'étape initiale de traitement de l'échantillon de sol permette une lyse mécanique maximale des organismes de l'échantillon de nature à rendre directement accessibles les acides nucléiques de ces organismes, principalement l'ADN génomique et plasmidique, aux tampons utilisés pour les étapes ultérieures d'extraction. II a été ainsi démontré selon l'invention qu'une accessibilité maximale des acides nucléiques provenant des micro-organismes d'un échantillon du sol était atteinte par un broyage poussé et à sec de l'échantillon de sol préalablement séché afin d'obtenir des micro- particules. Le demandeur a ainsi déterminé que le séchage de l'échantillon de sol préalable à tout traitement ultérieur provoque une diminution significative de la cohésion de l'échantillon de sol brut et favorise en conséquence sa désagrégation ultérieure sous la forme de micro-particules, lorsqu'un traitement par broyage approprié est opéré.
De manière surprenante, le demandeur a montré que des micro-particules d'échantillons de sol sec réunissaient des propriétés physico-chimiques favorables à l'extraction d'une quantité optimale d'acides nucléiques qui, dans leur nature, pouvaient être représentatifs de la diversité génétique des organismes présents initialement dans l'échantillon de sol de départ. Il a été montré en particulier que le procédé d'extraction directe d'acides nucléiques selon l'invention permettait l'extraction d'ADN provenant de micro-organismes rares, tels certains Streptomyces rares ou des micro-organismes sporulés.
Par " micro-particules " de l'échantillon de sol aux fins de la présente invention, on entend des particules dérivées de l'échantillon ayant une taille moyenne d'environ 50 μm, c'est à dire comprise en moyenne entre 45 et 55 μm/.
Selon l'invention, les micro-particules sont obtenues à partir d'échantillons de sol préalablement séchés ou dessiqués puis broyés jusqu'à l'obtention de micro-particules de taille moyenne comprise entre 2μm et 50μm, avant remise en suspension dans un milieu tampon liquide des micro-particules obtenus.
Un tel milieu tampon liquide peut consister en un tampon d'extraction d'acides nucléiques, en particulier un tampon d'extraction d'ADN conventionnel bien connu de l'homme du métier.
Le broyage de l'échantillon de sol en micro-particules a pour double fonction de lyser mécaniquement la majorité des organismes présents dans l'échantillon de sol initial et de rendre accessibles les organismes non lysés par ce traitement mécanique à des étapes facultatives ultérieures de lyse chimique et/ou enzymatique.
Ainsi, un premier objet de l'invention consiste en un procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol contenant des organismes, ledit procédé comprenant une première étape (l-(a)) d'obtention de micro-particules par broyage de l'échantillon de sol préalablement séché ou dessique, puis mise en suspension des micro-particules dans un milieu tampon liquide.
De manière tout à fait préférée, l'étape de broyage est réalisée à l'aide d'un dispositif à billes d'agate ou de tungstène ou encore à l'aide d'un dispositif à anneaux de tungstène. Ces dispositifs sont préférés car la dureté de matériaux comme l'agate ou le tungstène facilite significativement l'obtention des micro-particules de la taille spécifiée ci- dessus. Pour cette raison, on ne choisira pas préférentiellement, voire on évitera, un recours à un dispositif de broyage à billes de verre, qui s'est révélé beaucoup moins efficace. Le séchage ou la classification de l'échantillon de sol peut-être réalisée par toute méthode connue de l'homme du métier. Par exemple, l'échantillon de sol brut peut être séché à température ambiante pendant une durée de 24 à 48 heures.
Comme indiqué précédemment, le milieu tampon liquide peut consister en un milieu d'extraction de l'ADN présent dans les microparticules. On utilisera de manière tout à fait préférée un tampon d'extraction désigné TENP contenant respectivement 50 mM tris, 20 mM EDTA, 100 mM NaCI et 1 % (poids/volume) de polyvinylpolypyrrolidone, à pH 9,0. Le procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol est en outre caractérisé en ce que l'étape d'obtention de micro-particules par broyage de l'échantillon de sol préalablement séché ou dessique est suivie d'une étape l-(b) d'extraction des acides nucléiques présents dans les micro-particules.
Il est constant que l'extraction des acides nucléiques est accompagnée d'une co-extraction de composés et/ou de constituants du sol indésirables nécessitant la purification ultérieure des acides nucléiques extraits, une telle étape de purification ultérieure devant être à la fois suffisamment sélective pour permettre l'élimination des composés et/ou constituants du sol indésirables et d'un rendement suffisant pour entraîner une perte faible en quantité de l'ADN préalablement extrait.
Il a été montré selon l'invention qu'une étape de purification de l'ADN extrait des micro-particules de l'échantillon de sol répondant aux critères de sélectivité et de rendement définis ci-dessus, comprend un traitement de l'ADN extrait par une combinaison de deux étapes successives de chromatographie, respectivement une chromatographie sur tamis moléculaire et une chromatographie d'échange d'anions.
Selon une autre caractéristique du procédé ci-dessus, l'étape I- (b) d'extraction des acides nucléiques est suivie d'une étape l-(c) de purification des acides nucléiques extraits à l'aide des deux étapes de chromatographie suivantes:
- passage de la solution contenant les acides nucléiques sur un tamis moléculaire, puis récupération des fractions d'élution enrichies en acides nucléiques;
- passage des fractions d'élution enrichies en acides nucléiques sur un support de chromatographie d'échange d'anions, puis récupération des fractions d'élution contenant les acides nucléiques.
La nature et l'ordre des étapes de chromatographie ci-dessus sont essentiels à une bonne sélectivité et un excellent rendement de l'étape de purification de l'ADN préalablement extrait des microparticules de l'échantillon du sol préalablement séché ou dessique.
De manière très avantageuse, le support chromatographique du type " tamis moléculaire " de l'étape de purification d'acides nucléiques ci-dessus consiste en un support chromatographique de type Sephacryl®
S400 HR ou un support chromatographique de caractéristiques équivalentes.
De manière tout à fait préférée, le support chromatographique d'échange d'anions utilisé lors de la seconde étape de purification de l'ADN extrait est un support de type Elutip® d, ou un support chromatographique de caractéristiques équivalentes.
En combinant les étapes l-(a) d'obtention de micro-particules de l'échantillon de sol sec, l-(b) d'extraction des acides nucléiques présents dans les micro-particules et l-(c) de purification par les étapes chromatographiques décrites ci-dessus, il a été possible selon l'invention d'extraire directement l'ADN du sol sans purification préalable des cellules des organismes contenus initialement dans l'échantillon, tout en évitant la co-extraction de contaminants du sol, tels que par exemple les acides humiques qui est observée avec les procédés de l'état de la technique.
Les contaminants, tels que les acides humiques affectent sévèrement les analyses et les utilisations subséquentes des acides nucléiques dont la purification est recherchée.
Selon le procédé ci-dessus, il est en outre possible d'accéder aux acides nucléiques contenus dans les organismes qui n'ont pas été lysés mécaniquement au cours de l'étape l-(a) d'obtention de microparticules de l'échantillon de sol, dans le but d'obtenir une collection quasi-exhaustive de la diversité génétique des acides nucléiques présents initialement dans l'échantillon de sol. Ainsi, les micro-particules de l'échantillon de sol peuvent faire l'objet d'étapes ultérieures de traitement de lyse chimique, enzymatique ou physique, ou encore d'une combinaison de traitements chimiques, enzymatiques ou physiques.
Selon un premier aspect, le procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol selon l'invention, peut être en outre caractérisé en ce que l'étape l-(a) est suivie des étapes suivantes:
• traitement de la suspension de sol dans un milieu tampon liquide par sonication;
• extraction et récupération des acides nucléiques.
De manière préférée, on aura recours, pour un traitement par sonication, à un dispositif de type à micro-pointe en titane, tel que le dispositif 600 W Vibracell Ultrason icator commercialisé par la Société Bioblock ou encore un sonicateur de type Cup Horn.
De manière tout à fait préférée, l'étape de sonication est réalisée à une puissance de 15 W pendant une durée de 7 à 10 min et comprend des cycles successifs de sonication, la sonication proprement dite étant réalisée pendant 50% de la durée de chaque cycle.
Selon un second aspect, le procédé ci-dessus peut être en outre caractérisé en ce que l'étape l-(a) est suivie des étapes suivantes:
• traitement de la suspension de sol dans un milieu tampon liquide par sonication;
• incubation de la suspension à 37°C après sonication en présence de lysozyme et d'achromopeptidase;
• addition de SDS avant centrifugation et précipitation des acides nucléiques;
• récupération des acides nucléiques précipités.
De préférence, l'étape d'incubation en présence de lysozyme et d'achromopeptidase sera réalisée à une concentration finale de 0,3 mg/ml de chacune des deux enzymes, préférentiellement pendant 30 minutes à 37°C. De manière préférée, le SDS sera utilisé à une concentration finale de 1% et pendant un temps d'incubation de 1 heure à la température de 60°C avant centrifugation et précipitation.
Selon un troisième aspect, le procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol ci-dessus est en outre caractérisé en ce que l'étape l-(a) est suivie des étapes suivantes:
- homogénéisation de la suspension de sol avec une étape de mixage violent (vortex) suivie d'une étape de simple agitation;
- congélation de la suspension homogène suivie d'une décongélation ;
- traitement par sonication de la suspension après décongélation; - incubation de la suspension à 37°C après sonication en présence de lysozyme et d'achromopeptidase;
- addition de SDS avant centrifugation et précipitation des acides nucléiques;
- récupération des acides nucléiques.
De manière préférée, les suspensions de micro-particules de sol sont passées au vortex puis homogénéisées par une agitation douce sur un agitateur à rotation circulaire pendant une durée de deux heures avant d'être congelées à -2O°C. Préférentiellement, les suspensions sont à nouveau agitées violemment par vortex pendant 10 minutes, après décongélation et avant l'étape de sonication.
Il va sans dire que les acides nucléiques extraits par les modes de réalisation du procédé d'extraction directe d'acides nucléiques décrit ci-dessus sont préférentiellement purifiés selon l'étape de purification constituée d'un premier passage sur tamis moléculaire puis un passage subséquent des fractions d'élution obtenues à l'issue de la chromatographie sur tamis moléculaire sur un support chromatographique d'échange d'anions. 2. Extraction indirecte des acides nucléiques
Selon un second mode de réalisation du procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de l'environnement, selon l'invention, ledit échantillon de l'environnement subit un premier traitement de nature à permettre la séparation des organismes, contenus dans cet échantillon, des autres macroconstituants de l'échantillon.
Ce second mode de réalisation du procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques selon l'invention favorise l'obtention d'acides nucléiques de grande taille, qui sont pratiquement impossibles à obtenir selon le premier mode de réalisation du procédé selon l'invention décrit ci-dessus, l'étape de lyse mécanique opérée pour l'obtention des micro-particules ayant également pour effet de casser physiquement les acides nucléiques de l'échantillon de sol ou des acides nucléiques contenus dans les organismes de l'échantillon de sol.
L'obtention d'acides nucléiques de grande taille a été recherchée par le demandeur dans le but d'isoler et de caractériser les acides nucléiques comprenant, au moins partiellement, l'ensemble des séquences codantes appartenant à un même opéron capable de diriger la biosynthèse d'un composé d'intérêt industriel.
De manière préférée, on obtient, en mettant en oeuvre le second mode de réalisation du procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol selon l'invention , des acides nucléiques ayant une taille supérieure à 100 kb, de préférence supérieure à 200, 250 ou 300 kb, et de manière tout à fait préférée d'acides nucléiques d'une taille supérieure à 400, 500 ou encore 600 kb.
Ce second mode de réalisation d'un procédé de préparation d'une collection d'acides . nucléiques à partir d'un échantillon de l'environnement selon l'invention est constitué d'une combinaison de quatre étapes successives destinées à l'obtention des acides nucléiques ayant les caractéristiques décrites ci-dessus.
Lorsque l'échantillon de l'environnement est un échantillon de sol, il a été montré selon l'invention qu'une première étape d'obtention d'une suspension par dispersion de l'échantillon de sol en milieu liquide favorisait l'accessibilité des organismes contenus dans l'échantillon sans provoquer de lyse mécanique significative des cellules.
La première étape d'obtention d'une dispersion de l'échantillon de sol ci-dessus rend accessibles les organismes de l'échantillon au milieu extérieur et permet également une dissociation partielle des organismes de l'échantillon et des macro-constituants. Elle rend ainsi possible une séparation ultérieure des organismes contenus initialement dans l'échantillon des autres constituants de ce dernier. Lorsque l'échantillon de l'environnement provient par exemple de végétaux, d'organismes marins ou d'insectes, un traitement préalable par broyage est nécessaire afin de rendre les organismes de la microflore associée accessible aux étapes ultérieures du procédé.
Ainsi, le présent procédé comprend une étape de séparation des organismes des autres constituants minéraux et/ou organiques obtenus précédemment par une centrifugation sur un gradient de densité. Les organismes ainsi séparés sont ensuite soumis à une étape de lyse puis d'extraction des acides nucléiques .
L'étape de centrifugation sur un gradient de densité a, de manière surprenante, permis de séparer les cellules d'organismes des particules de sol contenues dans la suspension de l'échantillon. On aurait en effet pu s'attendre à ce qu'une proportion des cellules soient entraînées avec les macro-particules au sein de la phase de gradient. En outre, il n'avait jamais été démontré jusqu'à présent qu'une centrifugation sur gradient de densité d'un échantillon de sol permettait de retrouver, à l'interface phase aqueuse/gradient, une population d'organismes représentative de la diversité des organismes présents dans l'échantillon de départ, du fait que ces organismes sont de volume, densité et forme extrêmement variables. On pouvait raisonnablement supposer qu'ils seraient retrouvés indifféremment au sein de la phase aqueuse, à l'interface phase aqueuse/gradient de densité et également au sein du gradient de densité lui-même.
Ainsi, l'homme du métier pouvait s'attendre à ce que des organismes présentant des densités plus faibles ou plus grandes que la densité du gradient de densité utilisé (densité du gradient de densité comprise entre 1 ,2 et 1 ,5 g/ml , préférentiellement 1 ,3 g/ml) ne pouvait être récupérés, ce qui aurait eu pour effet d'introduire un biais dans la représentativité des organismes effectivement séparés et, par voie de conséquence, également dans la diversité des acides nucléiques extraits.
En outre, dans un mode de réalisation particulier du procédé, une étape de germination des spores, en particulier d'actinomycètes, est réalisée, ce qui a pour effet d'accroître de manière significative la quantité d'ADN d'actinomycètes récupérée. La dernière étape consiste en une étape de purification des acides nucléiques ainsi extraits sur un gradient de chlorure de césium.
De manière surprenante, la purification des acides nucléiques sur le gradient de chlorure de césium permet une élimination substantielle, voire complète, des substances composant le gradient de densité. Cette caractéristique est déterminante en ce qui concerne l'utilisation ultérieure des acides nucléiques purifiés car le gradient de densité est connu comme un puissant inhibiteur enzymatique, capable le cas échéant d'inhiber l'activité catalytique des enzymes utilisées pour préparer l'insertion des acides nucléiques extraits dans des vecteurs. Selon ce second mode de réalisation, le procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de l'environnement contenant des organismes selon l'invention comprend la succession d'étapes suivantes:
(i) obtention d'une suspension par dispersion de l'échantillon de l'environnement en milieu liquide puis homogénéisation de la suspension obtenue par agitation douce;
(ii) séparation des organismes des autres constituants minéraux et ou organiques de la suspension homogène obtenue à l'étape (i) par centrifugation sur un gradient de densité;
(iii) lyse des microorganismes séparés à l'étape (ii) et extraction des acides nucléiques ; (iv) purification des acides nucléiques sur un gradient de chlorure de césium .
Préférentiellement, la suspension de l'échantillon de sol est obtenue par dispersion de cet échantillon par broyage à l'aide d'un dispositif de type Waring Blender ou un dispositif de caractéristiques équivalentes. De manière tout à fait préférée, la suspension d'échantillon est obtenue après trois broyages successifs d'une durée d'une minute chacun dans un dispositif de type Waring Blender. De préférence, l'échantillon broyé sera refroidi dans la glace entre chacun des broyages.
De manière préférée, les organismes sont ensuite séparés des particules du sol par centrifugation sur un coussin de densité du type " Nycodenz ", commercialisé par la Société Nycomed Pharma AS. (Oslo , Norvège). Les conditions préférées de centrifugation sont de 10.000g pendant 40 minutes à 4°C, avantageusement dans un rotor à godets mobiles du type " rotor TST 28.38 " commercialisé par la Société KONTRON.
L'anneau d'organismes localisé, après centrifugation, à l'interphase de la phase supérieure aqueuse et de la phase inférieure de Nycodenz est alors prélevé et lavé par centrifugation avant reprise du culot cellulaire dans un tampon approprié.
L'étape (iii) de lyse des organismes séparés à l'étape (ii) décrite ci-dessus peut être réalisée de toute manière connue de l'homme du métier. Avantageusement, les cellules sont lysées dans une solution
Tris 10 mM-EDTA 100mM à pH 8.0 en présence de lysozyme et d'achromopeptidase, avantageusement pendant une heure à 37°C.
L'extraction proprement dite de l'ADN peut être avantageusement réalisée par addition d'une solution de lauryl sarcosyl (1 % du poids final de la solution) en présence de protéinase K et incubation de la solution finale à 37°C pendant 30 minutes.
Les acides nucléiques extraits à l'étape (iii) sont ensuite purifiés sur un gradient de chlorure de césium. Préférentiellement, l'étape de purification des acides nucléiques sur un gradient de chlorure de césium est réalisée par centrifugation à 35.000 tours/minute pendant 36 heures, par exemple sur un rotor du type Kontron 65.13.
Selon un aspect particulier du procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol contenant des organismes selon l'invention, lesdits acides nucléiques sont constitués majoritairement, sinon exclusivement, de molécules d'ADN.
Selon un autre aspect, les acides nucléiques peuvent être récupérés après inclusion des organismes, séparés sur un gradient de densité, dans un bloc d'agarose et lyse, par exemple chimique et/ou enzymatique, des organismes inclus dans le bloc d'agarose.
Un autre objet de l'invention consiste en une collection d'acides nucléiques constitués des acides nucléiques obtenus à l'étape ll-(iv) du procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques selon l'invention ou encore obtenue à l'étape (c) ou une étape ultérieure du procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques selon l'invention.
L'invention est encore relative à un acide nucléique caractérisé en ce qu'il est contenu dans une collection d'acides nucléiques telle que définie ci-dessus.
Selon un premier aspect, un tel acide nucléique constitutif d'une collection d'acides nucléiques selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique codant au moins un opéron, ou une partie d'un opéron. De manière tout à fait préférée, un tel opéron code pour la totalité ou une partie d'une voie métabolique.
L'exemple 9 décrit la construction d'une banque d'ADN génomique à partir d'une souche de Streptomyces alboniger et son clonage respectivement dans les cosmides navettes pOS700l et pOS700R. Il a été montré selon l'invention que dans la banque d'ADN réalisée dans le vecteur intégratif pOS700l neuf clones contiennent des séquences nucléotidiques appartenant à l'opéron responsable de la voie de biosynthèse de la puromycine. De même, il a pu être identifié au sein de la banque d'ADN réalisée dans le vecteur réplicatif pOS 700R douze clones contenant des séquences nucléotidiques de l'opéron responsable de la voie de biosynthèse de la puromycine.
En particulier, certains cosmides intégratifs et replicatifs des banques réalisées présentent, après digestion par les endonucléases de restriction Clal et EcoRV, un fragment d'une taille de 12 kb susceptible de contenir la totalité des séquences de l'opéron responsable de la voie de biosynthèse de la puromycine.
Ainsi, selon un autre aspect, un acide nucléique selon l'invention contient, au moins en partie, des séquences nucléotidiques de l'opéron responsable de la voie de biosynthèse de la puromicyne.
L'exemple 2 ci-après décrit la construction d'une banque d'ADN selon un procédé conforme à la présente invention dans un vecteur pBluescript SK' à partir d'un sol contaminé par du lindane.
Les vecteurs recombinants ont été transfectés dans des cellules ύΕscherichia coli DH10B puis les cellules transformées ont été cultivées dans un milieu de culture approprié en présence de lindane. Un criblage des clones de cellules transformées de la banque a permis de montrer que, sur 10.000 clones criblés, 35 d'entre eux présentaient un phénotype de dégradation du lindane . La présence du gène linA chez ces clones a pu être confirmée par amplification PCR grâce à des amorces spécifiques de ce gène.
Ainsi, selon un autre aspect, l'invention concerne également un acide nucléique contenant une séquence nucléotidique de la voie métabolique provoquant la biodégradation du lindane. II est donc clairement démontré, comme décrit plus haut, qu'un procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol contenant des organismes selon l'invention ainsi qu'un procédé de préparation d'une collection de vecteurs recombinants contenant les acides nucléiques constitutifs de la collection d'acides nucléiques précités était tout à fait apte à l'isolement et à la caractérisation de séquences nucléotidiques incluses dans un opéron.
Une démonstration supplémentaire de l'aptitude d'un procédé selon l'invention à l'identification de séquences nucléotidiques codantes impliquées dans une voie de biosynthèse régulée sous la forme d'un opéron est en outre décrite plus loin: il s'agit du clonage et de la caractérisation de séquences codant pour des polykétides synthases impliquées dans la voie de biosynthèse des polykétides, qui appartiennent à une famille de molécules dont certains représentants sont d'un intérêt thérapeutique majeur, en particulier antibiotique. La présente invention a donc en outre pour objet un acide nucléique constitutif d'une collection d'acides nucléiques selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend la totalité d'une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide.
Selon un premier aspect, un acide nucléique constitutif d'une collection d'acides nucléiques selon l'invention est d'origine procaryote.
Selon un second aspect, un acide nucléique constitutif d'une collection d'acides nucléiques selon l'invention provient d'une bactérie ou d'un virus.
Selon un troisième aspect, un acide nucléique constitutif d'une collection d'acides nucléiques selon l'invention est d'origine eucaryote.
En particulier, un tel acide nucléique est caractérisé en ce qu'il provient d'un champignon, d'une levure, d'une plante ou d'un animal.
CARACTERISATION MOLECULAIRE DE LA COLLECTION D'ACIDES NUCLEIQUES EXTRAITS DU SOL.
Afin de surmonter les nombreux inconvénients techniques des méthodes de caractérisation des banques d'ADN extraits et purifiés à partir d'un échantillon de l'environnement qui ont été décrits dans la partie de la description relative à l'état de la technique, le demandeur a mis au point un procédé simple et fiable permettant de caractériser qualitativement et semi-quantitativement les acides nucléiques obtenus à l'issue du procédé décrit ci-dessus.
Le procédé selon l'invention consiste ainsi à amplifier universellement un fragment de 700 pb localisé à l'intérieur d'une séquence d'ADN ribosomal de type 16 S, puis d'hybrider l'ADN amplifié avec une sonde oligonucléotidique de spécificité variable et enfin de comparer l'intensité d'hybridation de l'échantillon par rapport à une gamme étalon externe d'ADN de séquence ou d'origine connue. L'amplification préalable à l'hybridation avec la sonde oligonucléotidique permet de quantifier des genres ou des espèces de micro-organismes peu abondants. De plus, l'amplification par des amorces universelles permet, lors de l'hybridation, d'utiliser une large série de sondes oligonucléotidiques.
Ainsi, l'invention a en outre pour objet un procédé de détermination de la diversité des acides nucléiques contenus dans une collection d'acides nucléiques, et tout particulièrement d'une collection d'acides nucléiques provenant d'un échantillon de l'environnement, préférentiellement d'un échantillon du sol, ledit procédé comprenant les étapes suivantes:
- mise en contact des acides nucléiques de la collection d'acides nucléiques à tester avec un couple d'amorces oligonucléotidiques hybridant à toute séquence d'ADN ribosomal 16 S bactérien;
- réalisation d'au moins trois cycles d'amplification ;
- détection des acides nucléiques amplifiés à l'aide d'une sonde oligonucléotidique ou d'une pluralité de sondes oligonucléotidiques, chaque sonde hybridant spécifiquement avec une séquence d'ADN ribosomal 16 S commune à un règne, un ordre, une sous-classe ou un genre bactérien;
- le cas échéant, comparaison des résultats de l'étape de détection précédente avec les résultats de détection, à l'aide de la sonde ou de la pluralité de sondes d'acides nucléiques de séquence connue constituant une gamme étalon.
De manière préférée, un premier couple d'amorces hybridant avec des régions universellement conservées du gène de l'ARN ribosomal 16 S est constitué respectivement des amorces FGPS 612 (SEQ ID N°12) et FGPS 669 (SEQ ID N°13).
Un second mode de réalisation d'un couple d'amorces préféré selon l'invention est constitué du couple d'amorces universelles 63 f (SEQ ID N°22) et 1387r (SEQ ID N°23).
Selon un mode particulier de réalisation d'un procédé de détermination de la diversité des acides nucléiques d'une collection d'acides nucléiques, l'étape d'amplification à l'aide d'un couple d'amorces universelles peut être réalisée sur une collection de vecteurs recombinants dans chacun desquels a été inséré un acide nucléique de la collection d'acides nucléiques considérée, préalablement à l'étape d'hybridation avec les sondes oligonucléotidiques spécifiques d'un règne, d'un ordre, d'une sous-classe ou d'un genre bactérien particulier.
Un tel procédé de détermination de la diversité des acides nucléiques contenus dans une collection est tout particulièrement applicable aux collections d'acides nucléiques obtenus conformément à l'enseignement de la présente description.
Ainsi, l'exemple 3 détaille un procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol contenant des organismes comprenant une étape d'extraction indirecte d'ADN par dispersion d'un échantillon du sol préalablement à la séparation des cellules sur gradient de Nycodenz, lyse des cellules puis purification de l'ADN sur gradient de chlorure de césium.
La collection d'acides nucléiques ainsi obtenue a été utilisée telle quelle ou sous la forme d'inserts dans des vecteurs de type cosmide dans un procédé d'amplification à l'aide des amorces universelles de l'ADNr 16 S précitées, puis les ADN amplifiés ont été soumis à une étape de détection à l'aide de sondes oligonucléotidiques de séquences SEQ ID N°14 à SEQ ID N°21 qui sont présentées dans le tableau 4.
Les résultats montrent qu'un procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol contenant des organismes selon l'invention permet d'accéder à l'ADN de plus de 14% de la microflore tellurique totale, soit 2 x 108 cellules par gramme de sol, alors que la microflore totale cultivable ne représente qu'à peine 2% de la population microbienne totale. Afin de déterminer la diversité phylogénétique d'une collection d'acides nucléiques préparés conformément à l'invention, 47 séquences du gène ARNr 16S ont été isolées et séquencées. Ces séquences correspondent respectivement aux séquences nucléotidiques SEQ ID N°60 à SEQ ID N°106. Les acides nucléiques comprenant les séquences SEQ ID N° 60 à SEQ ID N° 106 font également partie de l'invention, ainsi que les acides nucléiques possédant au moins 99 %, préférentiellement 99,5% ou 99,8% d'identité en acides nucléiques avec les acides nucléiques comprenant les séquences SEQ ID N° 60 à SEQ ID N° 106. De telles séquences peuvent être utilisées notamment en tant que sondes pour cribler des clones d'une banque d'ADN et identifier ainsi ceux , parmi les clones de la banque, qui contiennent de telles séquences, ces séquences étant suceptibles d'être à proximité de séquences codantes d'intérêt, telles que des séquences codant pour des enzymes impliquées dans la voie de biosynthèse de métabolites antibiotiques, par exemple des polykétides.
La comparaison des séquences d'ARNr 16S à partir d'une banque d'ADN réalisée conformément à l'invention avec les séquences répertoriées dans la base données RDP (Maidak B.L., Cole J.R., Parker C.T., Garrity G. M., Larsen N., Li B., Lilburn T.G., McCaughey, M.J., Olsen G.J., Overbeek R., Pramanik S., Schmidt T.M., Tiedje J.M., Woese C.R. (1999) " A new projet of the RDP (Ribosomal Database Project) " Nucleic Acids Research Vol. 27: 171-173) ont permis de déterminer que les acides nucléiques contenus dans une collection d'acides nucléiques selon l'invention proviennent d'α-protéobactéries, de β-protéobactéries, de δ-protéobactéries, de γ-protéobactéries, d'actinomycètes ainsi que d'un genre apparenté à acidobactérium. Ces résultats, présentés dans le tableau 7 ainsi que par l'arbre phylogénétique de la figure 7 rendent compte de la grande diversité phylogénétique des acides nucléiques contenus dans une banque d'ADN préparée conformément au procédé selon l'invention.
VECTEURS DE CLONAGE ET/OU D'EXPRESSION
Chacun des acides nucléiques contenus dans une collection d'acides nucléiques préparés conformément à l'invention peut être inséré dans un vecteur de clonage et/ou d'expression.
A cette fin, tous types de vecteurs connus de l'état de la technique peuvent être utilisés, tels que des vecteurs viraux , des phages, des plasmides, des phagemides, des cosmides, des phosmides, des vecteurs de type BAC, des bactériophages P1 , des vecteurs de type BAC, des vecteurs de type YAC, des plasmides de levure ou encore tout autre vecteur connu de l'état de la technique par l'homme du métier.
On aura avantageusement recours selon l'invention à des vecteurs permettant une expression stable des acides nucléiques d'une banque d'ADN. A cette fin, de tels vecteurs incluent préférentiellement des séquences de régulation de la transcription qui sont localisées en phase (" operably linked ") avec l'insert génomique de manière à permettre l'initiation et/ou la régulation de l'expression d'au moins une partie dudit insert d'ADN.
Il résulte de ce qui précède, que l'invention concerne encore un procédé de préparation d'une collection de vecteurs recombinants caractérisé en ce que les acides nucléiques obtenus à l'étape ll-(iv) ou à l'étape l-(c) ou toute autre étape ultérieure d'un procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol contenant des organismes selon l'invention sont insérés dans un vecteur de clonage et/ou d'expression. Préalablement à leur insertion dans un vecteur de clonage et/ou d'expression, les acides nucléiques constitutifs d'une collection d'acides nucléiques selon l'invention peuvent être séparés en fonction de leur taille, par exemple par électrophorèse sur un gel d'agarose, le cas échéant après digestion à l'aide d'une endonucléase de restriction. Selon un autre aspect, la taille moyenne des acides nucléiques constitutifs d'une collection d'acides nucléiques selon l'invention peut être rendue d'une taille sensiblement uniforme par la mise en oeuvre d'une étape de rupture physique préalablement à leur insertion dans le vecteur de clonage et/ou d'expression. Une telle étape de rupture physique ou mécanique des acides nucléiques peut consister en des passages successifs de ces derniers, en solution, dans un canal métallique d'environ 0,4 mm de diamètre, par exemple le canal d'une aiguille de seringue ayant un tel diamètre.
La taille moyenne des acides nucléiques peut dans ce cas être comprise entre 30 et 40 kb de longueur. La construction des vecteurs préférés selon l'invention est shématisée dans les figures 25 (cosmide intégrarif conjugatif) et 26 (BAC intégratif ).
Des vecteurs de clonage et/ou d'expression pouvant être avantageusement utilisés aux fins d'insertion des acides nucléiques contenus dans une collection ou banque d'ADN selon l'invention sont notamment les vecteurs décrits dans le brevet européen N°EP-0 350 341 et dans le brevet US N°5 688 689, de tels vecteurs étant spécialement adaptés à la transformation de souches d'actinomycètes. De tels vecteurs contiennent, outre une séquence d'ADN de l'insert, une séquence d'attachement att ainsi qu'une séquence d'ADN codant pour une intégrase (séquence int) fonctionnelle dans les souches d'actinomycètes.
Toutefois, il a été observé selon l'invention que certains vecteurs de clonage et/ou d'expression présentaient des inconvénients et que leur capacité fonctionnelle théorique n'était pas atteinte dans la pratique.
Ainsi, il est apparu que le système d'intégration contenu dans des vecteurs de l'état de la technique, et notamment dans les vecteurs décrits dans le brevet européen n°EP 0 350 41 ne permettait pas en réalité une bonne intégration de l'insert d'ADN de la banque au sein du chromosome bactérien.
Partant de l'hypothèse que les déficits fonctionnels d'intégration de tels vecteurs au sein du chromosome bactérien étaient dus à un défaut dans l'expression du gène de l'intégrase présent dans ces vecteurs, le demandeur a tout d'abord cherché à augmenter l'expression du gène de l'intégrase en substituant au promoteur de la transcription initial un promoteur de la transcription susceptible d'augmenter significativement le nombre de transcrits de l'intégrase.
Les résultats ont été décevants et la fonction d'intégration au chromosome de ces vecteurs n'a pas été améliorée.
De manière surprenante, il a été montré selon l'invention que les difficultés d'expression de l'intégrase contenues dans cette famille de vecteurs intégratifs ne se situait pas au niveau de la quantité d'expression des transcrits, mais au niveau de leur stabilité.
Selon une seconde hypothèse, le demandeur a pu montrer que le défaut de stabilité des transcrits de l'intégrase était causé par des déficits dans la terminaison de la transcription de l'ARN messager correspondant.
Le demandeur a alors inséré un site terminateur placé en aval de la séquence codant pour l'intégrase du vecteur de manière à obtenir un ARN messager de taille déterminée. L'insertion d'un signal de terminaison additionnel en aval de la séquence nucléotidique codant pour l'intégrase du vecteur a permis l'obtention d'une famille de vecteurs intégratifs de type cosmide et de type BAC .
Préférentiellement, le site terminateur est placé en aval du site d'attachement att.
En outre, le demandeur a mis au point de nouveaux vecteurs conjugatifs et de nouveaux vecteurs réplicatifs du type cosmide et de nouveaux vecteurs conjugatifs de type BAC qui peuvent avantageusement être utilisés pour l'insertion des acides nucléiques constitutifs d'une collection d'acides nucléiques préparés selon le procédé de l'invention.
Lorsque l'insertion de fragments d'ADN de taille moyenne est recherchée, on utilise préférentiellement des vecteurs du type cosmide, capables de recevoir des inserts ayant une taille maximale d'environ 50 kb.
De tels vecteurs cosmidiques sont tout particulièrement adaptés pour l'insertion d'acides nucléiques constitutifs d'une collection d'acides nucléiques obtenus selon le procédé de l'invention comprenant une première étape d'extraction directe d'ADN par lyse mécanique des organismes contenus dans l'échantillon de sol initial.
Lorsque l'insertion d'acides nucléiques de grande taille, en particulier d'acides nucléiques d'une taille supérieure à 100 kb, voire supérieure à 200, 300, 400, 500 ou 600 kb est recherchée, on aura alors recours préférentiellement à des vecteurs du type BAC capables de recevoir des inserts d'ADN d'une telle taille. De tels vecteurs de type BAC sont tout particulièrement adaptés pour l'insertion des acides nucléiques constitutifs d'une collection d'acides nucléiques obtenus conformément au procédé selon l'invention dans lequel la première étape est constituée d'une extraction indirecte de l'ADN par séparation préalable des organismes contenus dans l'échantillon de sol initial et élimination des macro-constituants dudit échantillon de sol.
En particulier, des vecteurs du type BAC sont avantageusement mis en oeuvre pour l'insertion d'acides nucléiques de grande taille contenant, au moins partiellement, la séquence nucléotidique d'un opéron.
Ainsi, le procédé de préparation d'une collection de vecteurs recombinants de clonage et/ou d'expression selon l'invention est en outre caractérisé en ce que le vecteur de clonage et/ou d'expression est du type plasmide.
Selon un autre aspect, un tel procédé est caractérisé en ce que le vecteur de clonage et/ou d'expression est du type cosmide.
Selon un premier aspect, il peut s'agir d'un cosmide réplicatif chez E.coli et intégratif chez Streptomyces. Un vecteur cosmidique tout à fait préféré répondant à une telle définition est le cosmide pOS700l décrit à l'exemple 3.
Selon encore un autre aspect, le vecteur cosmidique est conjugatif et intégratif chez Streptomyces.
De manière générale, des vecteurs conjugatifs de type cosmide ou de type BAC, qui comprennent dans leurs séquences nucléotidiques un motif reconnu par la machinerie enzymatique cellulaire appelé " origine de conjugaison " sont utilisés chaque fois que l'on veut éviter un recours à des techniques de transformation lourdes et peu automatisables. Par exemple, la transfection de vecteurs initialement hébergés par des cellules de E.coli dans des cellules de Streptomyces nécessite classiquement une étape de récupération du vecteur recombinant contenu dans les cellules de Esche chia coli, et sa purification préalable à l'étape de transformation de protoplastes de Streptomyces. Il est communément admis qu'une transfection d'un ensemble de 1000 clones de Escherichia coli dans Streptomyces requiert l'obtention d'environ 8000 clones pour que chaque clone de E. coli ait une chance d'être représenté.
A l'inverse, une étape de transfection par conjugaison d'un vecteur hébergé par E.coli vers des cellules de Streptomyces nécessite le même nombre de clones de chacun des micro-organismes, l'étape de conjugaison ayant lieu " clone à clone " et ne comprenant en outre pas les difficultés techniques liées à l'étape de transfert de matériel génétique par transformation de protoplastes, par exemple en présence de polyéthylène glycol.
Afin d'optimiser la construction de banque d'ADN chez Streptomyces, il a été mis au point selon l'invention, de nouveaux vecteurs conjugatifs de type cosmide et de type BAC de nature à permettre une efficacité maximale de l'étape de conjugaison. Notamment, les nouveaux vecteurs conjugatifs selon l'invention ont été construits en plaçant un gène marqueur de sélection à l'extrémité de l'ADN du vecteur qui est transféré à la bactérie réceptrice en dernier lieu. Ce perfectionnement aux vecteurs conjugatifs de l'état de la technique permet de ne sélectionner positivement que les bactéries réceptrices ayant reçu la totalité de l'ADN du vecteur et, en conséquence, la totalité de l'ADN de l'insert d'intérêt.
Des cosmides conjugatifs et intégratifs chez Streptomyces préférés selon l'invention sont les cosmides pOSV303, pOSV306 et pOSV307 décrits à l'exemple 5. Selon un autre aspect, un procédé de préparation d'une collection de vecteurs recombinants selon l'invention est mis en oeuvre à l'aide d'un cosmide réplicatif à la fois chez E.coli et chez Streptomyces. Un tel cosmide est avantageusement le cosmide pOS 700R décrit à l'exemple 6. Selon encore un autre aspect, le procédé ci-dessus peut être mis en oeuvre avec un cosmide réplicatif chez E. coli et Streptomyces et conjugatif chez Streptomyces.
Un tel cosmide réplicatif et conjugatif peut être obtenu à partir d'un cosmide réplicatif conforme à l'invention, par l'insertion d'une origine de transfert appropriée, telle que RK2, comme décrit à l'exemple 5 pour la construction du vecteur pOSV303.
Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé de préparation d'une collection de vecteurs recombinants selon l'invention, on a recours à un vecteur de clonage et/ou d'expression de type BAC.
Selon un premier aspect, le vecteur du type BAC est intégratif et conjugatif chez Streptomyces.
De manière tout à fait préférée, un tel vecteur BAC intégratif et conjugatif chez Streptomyces est le vecteur BAC pOSV 403 décrit à l'exemple 8, ou encore les vecteurs BAC pMBD-1 , pMBD-2, pMBD-3, pMBD-4, pMBD-5 et pMBD-6 décrits à l'exemple 15.
L'invention a en outre pour objet un vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les vecteurs recombinants suivants: a) un vecteur comprenant un acide nucléique constitutif d'une collection d'acides nucléiques selon l'invention; b) un vecteur tel qu'obtenu selon un procédé éliminant tout recours à l'action d'une endonucléase de restriction sur le fragment d'ADN à insérer, tel que décrit précédemment. De manière tout à fait préférée, l'invention est également relative à un vecteur choisi parmi les vecteurs suivants:
- le cosmide pOS700l;
- le cosmide pOSV303; - le cosmide pOSV306;
- le cosmide pOSV307;
- le cosmide pOS700R;
- le vecteur BAC pOSV403;
- le vecteur BAC pMBD-1 ; - le vecteur BAC pMBD-2;
- le vecteur BAC pMBD-3;
- le vecteur BAC pMBD-4;
- le vecteur BAC pMBD-5;
- le vecteur BAC pMBD-6. L'invention est en outre relative à une collection de vecteurs recombinants tels qu'obtenus selon l'un quelconque des procédés selon l'invention.
Procédé de préparation d'un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression selon l'invention.
Les techniques conventionnelles d'insertion d'ADN au sein d'un vecteur afin de préparer un vecteur de clonage et/ou d'expression recombinant font classiquement appel à une première étape au cours de laquelle une endonucléase de restriction est incubée à la fois avec l'ADN à insérer et avec le vecteur récepteur créant ainsi des extrémités compatibles entre l'ADN à insérer et l'ADN du vecteur permettant l'assemblage des deux ADN avant une étape de ligation finale permettant l'obtention du vecteur recombinant.
Toutefois, une telle technique conventionnelle présente des inconvénients notables, tout particulièrement lorsque est recherchée l'insertion d'acides nucléiques de grande taille dans un vecteur de clonage et/ou d'expression. En effet, l'action préalable d'une enzyme de restriction sur les fragments d'ADN destinés à être insérés dans un vecteur est susceptible de réduire notablement la taille de cet ADN préalablement à son insertion dans le vecteur. Il va sans dire qu'une réduction significative de la taille de l'ADN préalablement à son insertion sur un vecteur est une situation particulièrement défavorable lorsqu'est recherché le clonage de fragments d'ADN de grande taille susceptible de contenir l'ensemble des séquences codantes et, le cas échéant, également des séquences régulatrices, d'un opéron dont l'expression constitue une voie de biosynthèse complète d'un métabolite d'intérêt industriel, et tout particulièrement d'un composé d'intérêt thérapeutique.
Pour remédier aux inconvénients des techniques de l'art antérieur, il a été mis au point selon l'invention deux procédés de préparation d'un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression qui ne nécessitent pas le recours à une endonucléase de restriction sur l'ADN à insérer préalablement à son introduction au sein du vecteur. De tels procédés sont en conséquence tout à fait adaptés au clonage de longs fragments d'ADN susceptibles de contenir, au moins partiellement, l'ensemble des séquences codantes et, le cas échéant, également des séquences régulatrices, d'un opéron complet responsable d'une voie de biosynthèse.
Selon un premier aspect, un procédé de préparation d'un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression selon l'invention est caractérisé en ce que l'insertion d'un acide nucléique dans le vecteur de clonage et/ou d'expression, comprend les étapes suivantes:
- ouvrir le vecteur de clonage et/ou d'expression à un site de clonage choisi, à l'aide d'une endonucléase de restriction appropriée;
- ajouter un premier acide nucléique homopolymérique à l'extrémité 3' libre du vecteur ouvert;
- ajouter un second acide nucléique homopolymérique, de séquence complémentaire au premier acide nucléique homopolymérique, à l'extrémité 3' libre de l'acide nucléique à insérer dans le vecteur;
- assembler l'acide nucléique du vecteur et l'acide nucléique par hybridation du premier et du second acide nucléique homopolymérique de séquences complémentaires l'une de l'autre;
refermer le vecteur par ligation.
Un tel procédé est décrit aux exemples 10 et 13 ci-après. De manière avantageuse, le procédé ci-dessus peut comporter les caractéristiques suivantes, isolément ou en combinaison:
- le premier acide nucléique homopolymérique est de séquence poly(A) ou poly(T); - le second acide nucléique homopolymérique est de séquence poly(T) ou poly(A).
De manière tout à fait préférée, les acides nucléiques homopolymériques ont une longueur comprise entre 25 et 100 bases nucléotidiques, préférentiellement entre 25 et 70 bases nucléotidiques. Le procédé de préparation d'un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression décrit ci-dessus est particulièrement adapté à la construction de banques d'ADN dans des vecteurs de type BAC. Ainsi, selon un mode de réalisation avantageux du procédé de préparation d'un vecteur recombinant décrit ci-dessus, ledit procédé est en outre caractérisé en ce que la taille de l'acide nucléique à insérer est d'au moins 100 kb, et préférentiellement d'au moins 200, 300, 400, 500 ou 600 kb. Un tel procédé de préparation est donc particulièrement adapté à l'insertion des acides nucléiques contenus dans une collection d'acides nucléiques obtenus selon le procédé de l'invention.
Afin de permettre l'insertion de fragments d'ADN de grande taille dans des vecteurs de clonage et/ou d'expression, il a été mis au point selon l'invention, un second procédé ayant permis d'éliminer tout recours à l'action d'une endonucléase de restriction sur l'ADN destiné à être inséré au sein du vecteur.
Un tel procédé de préparation d'un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression selon l'invention est caractérisé en ce que l'étape d'insertion d'un acide nucléique dans ledit vecteur de clonage et/ou d'expression comprend les étapes suivantes:
- création de bouts francs sur les extrémités de l'acide nucléique de la collection par élimination des séquences 3' sortantes et remplissage des séquences 5' sortantes;
- ouverture du vecteur de clonage et/ou d'expression à un site de clonage choisi à l'aide d'une endonucléase de restriction appropriée;
- adition d'adaptateurs oligonucléotidiques complémentaires ; - création de bouts francs aux extrémités de l'acide nucléique du vecteur par élimination des séquences 3' sortantes et remplissage des séquences 5' sortantes, puis déphosphorylation des extrémités 5' afin de prévenir une recircularisation du vecteur;
- insertion de l'acide nucléique de la collection dans le vecteur par ligation.
De manière préférée, l'élimination des séquences 3' sortantes est réalisée à l'aide d'une exonucléase, telle que l'enzyme de Klenow.
De manière préférée, le remplissage des séquences 5' sortantes est réalisé à l'aide d'une polymérase, et de manière tout à fait préférée de la T4 polymérase, en présence des quatre nucléotides triphosphates.
Un procédé de préparation d'un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression par élimination des séquences 3' sortantes et remplissage des séquences 5' sortantes tel que décrit ci-dessus est particulièrement adapté à la construction de banques d'ADN à partir de vecteurs de type cosmide.
Un tel procédé d'obtention de vecteurs recombinants est décrit à l'exemple 12.
Dans un mode particulier de préparation d'un vecteur recombinant selon l'invention, des oligonucléotides comprenant un ou plusieurs sites de restriction rares sont ajoutés sur le vecteur au niveau du site de clonage de l'ADN à insérer, conformément à l'enseignement de l'exemple 10. Cet ajout d'oligonucléotides facilite la récupération ultérieure des inserts sans clivage de ces derniers.
CELLULES HOTES
Bien que tout type de cellules hôtes puisse être utilisé pour la transfection ou la transformation avec un acide nucléique ou un vecteur recombinant selon l'invention, notamment une cellule hôte procaryote ou eucaryote, on utilisera de préférence des cellules hôtes dont les caractères physiologiques, biochimiques et génétiques sont bien caractérisés, facilement cultivables à grande échelle et dont les conditions de culture pour la production de métabolites soient bien connues. De manière préférentielle, la cellule hôte réceptrice d'un acide nucléique ou d'un vecteur recombinant selon l'invention est phylogénétiquement proche des organismes donneurs contenus initialement dans l'échantillon de l'environnement desquels les acides nucléiques sont originaires. De manière tout à fait préférée, une cellule hôte selon l'invention doit posséder un usage des codons similaire, ou du moins proche, des organismes donneurs présents initialement dans l'échantillon de l'environnement, tout particulièrement de l'échantillon de sol. La taille des fragments d'ADN susceptible de porter les séquences nucléotidiques d'intérêt recherchées peut être variable. Ainsi, des enzymes codées par des gènes de taille moyenne de 1 kb pourront être exprimées à partir d'inserts de petite taille alors que l'expression de métabolites secondaires nécessiteront le maintien dans l'organisme hôte de fragments de taille bien supérieure, par exemple de 40 kb à plus de 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb ou 600 kb.
Ainsi, les cellules hôtes de Eschenchia coli constituent un choix privilégié pour le clonage de grands fragments d'ADN.
De manière tout à fait préférée, on aura recours à l'utilisation de la souche de Eschenchia coli désignée DH10B et décrite par Shizuya et al; (1992) pour laquelle des protocoles de clonage dans des vecteurs BAC ont été optimisés.
Toutefois, d'autres souches de Eschenchia coli peuvent être avantageusement utilisées pour la construction d'une banque d'ADN selon l'invention, telles que les souches E.coli Sure, E.coli DH5 α, ou encore E.coli 294 (ATCC N°31446).
En outre, la construction d'une banque d'ADN par transfection de cellules de E.coli avec des vecteurs recombinants selon l'invention est également possible, l'expression de gènes de divers procaryotes tels que Bacillus, Thermotoga, Corynebacterium, Lactobacillus ou Clostridium ayant été décrite dans la demande PCT N°WO 99/20799.
De manière générale, des cellules hôtes de E.coli peuvent dans tous les cas constituer des hôtes transitoires dans lesquels des vecteurs recombinants selon l'invention pourront être maintenus avec une grande efficacité, le matériel génétique pouvant être facilement manipulé et archivé et façon stable.
Dans le but d'exprimer la plus grande diversité moléculaire possible, d'autres hôtes cellulaires pourront être également avantageusement mis en oeuvre tels que des cellules de Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Myxococcus, Aspergillus nidulans ou encore Neurospora crassa.
Il a en outre été montré selon la présente invention, que des cellules de Streptomyces lividans peuvent être utilisées avec succès et constituent des systèmes d'expression complémentaires à Eschenchia coli.
Streptomyces lividans constitue un modèle pour l'étude de la génétique des Streptomyces et a également été utilisé comme hôte d'expression hétérologue de nombreux métabolites secondaires. Streptomyces lividans, possède en commun avec d'autres actinomycètes tels que Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, Streptomyces fradiae, ainsi que Streptomyces griseochromogenes, les molécules précurseurs et les systèmes de régulation nécessaires à l'expression de tout ou partie des voies de biosynthèses complexes, telles que par exemple la voie de biosynthèse des polykétides ou encore la voie de biosynthèse des polypeptides non ribosomiques représentant des classes de molécules de structures très diverses.
Streptomyces lividans présente également l'avantage d'accepter l'ADN étranger avec des efficacités de transformation élevées.
Ainsi, l'invention concerne aussi une cellule hôte recombinante comprenant un acide nucléique selon l'invention, constitutif d'une collection d'acides nucléiques préparée selon un procédé conforme à l'invention, ou encore une cellule hôte recombinante comprenant un vecteur recombinant tel que défini précédemment.
Selon un premier aspect, il peut s'agir d'une cellule hôte recombinante d'origine procaryote ou eucaryote. Avantageusement, une cellule recombinante selon l'invention est une bactérie, et de manière tout à fait préférée une bactérie choisie parmi E.coli et Streptomyces.
Selon un autre aspect, une cellule hôte recombinante selon l'invention est caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure ou encore d'un champignon filamenteux.
L'invention a également trait à une collection de cellules hôtes recombinantes, chacune des cellules hôtes constitutive de la collection comprenant un acide nucléique provenant d'une collection d'acides nucléiques réalisée conformément à un procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol contenant des organismes tel que décrit ci-dessus.
L'invention est également relative à une collection de cellules hôtes recombinantes, chacune des cellules hôtes constitutives de la collection comprenant un vecteur recombinant selon l'invention. En raison de la grande taille des inserts il est nécessaire d'avoir une efficacité maximale de transformation. Dans ce but, une souche réceptrice de Streptomyces lividans exprimant l'intégrase de pSAM2 de façon constitutive afin de favoriser l'intégration site-spécifique du vecteur est préférée. Pour cela, le gène int sous contrôle d'un promoteur fort est intégré dans le chromosome. La surproduction d'intégrase n'induit pas de phénomènes d'excision (Raynal et al., 1998).
La production d'un nouveau métabolite à partir de l'insert pourrait être toxique pour Streptomyces si l'insert ne contient pas de gènes de résistance à l'antibiotique produit ou si ce gène est peu ou pas exprimé. La capacité des différents gènes permettant à Streptomyces ambofaciens de résister à l'antibiotique qu'il produit est étudiée (Gourmelen et al., 1998; Pernodet et al., 1999). Certains de ces gènes codent des transporteurs de type ABC susceptibles de conférer un large spectre de résistance. Ces gènes peuvent être introduits et surexprimés dans la souche hôte de Streptomyces lividans. A l'inverse, une souche hypersensible aux antibiotiques peut être utilisée (Pernodet et al., 1996), afin de détecter dans la banque la présence de gènes de résistance. En effet, chez les micro-organismes producteurs d'antibiotique, ces gènes de résistance sont souvent associés aux gènes de la voie de biosynthèse de l'antibiotique. La sélection de clones résistants peut permettre d'effectuer simplement un premier tri avant les tests plus complexes de détection d'un nouveau métabolite produit par le clone.
ISOLEMENT ET CARACTERISATION DE NOUVELLES SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES CODANT POUR DES POLYKETIDES SYNTHASES.
Selon l'invention, une collection de cellules hôtes recombinantes a été obtenue après transfection des cellules hôtes par une collection de vecteurs recombinants contenant chacun un insert d'acide nucléique provenant d'une collection d'acides nucléiques préparée conformément au procédé selon l'invention.
Plus précisément, les fragments d'ADN obtenus selon le procédé de l'invention dans lequel il est mis en oeuvre une étape d'extraction indirecte d'ADN des organismes contenus dans l'échantillon de sol ont été tout d'abord clones dans le cosmide intégratif pOS700l.
L'étape d'insertion des fragments d'ADN dans le cosmide intégratif pOS700l a été réalisée selon le procédé de l'invention dans lequel des queues de polynucléotides homopolymériques poly(A) et poly(T) ont été ajoutées à l'extrémité 3' respectivement de l'acide nucléique du vecteur et des fragments d'ADN à insérer.
Les vecteurs recombinants ainsi construits ont été encapsidés dans des têtes de phage lambda et les phages obtenus ont été utilisés pour infecter des cellules de E. coli selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Une banque d'environ 5000 clones de Eschenchia coli a été obtenue.
Cette banque de clones a été criblée avec des couples d'amorces spécifiques d'une séquence nucléotidique codant pour une enzyme impliquée dans la voie de biosynthèse des polykétides, l'enzyme PKS de type I, aussi désignée β-kétoacyl synthase .
On rappelle ici que les polykétides constituent une classe chimique d'une grande diversité structurale comprenant un nombre important de molécules d'intérêt pharmaceutique tels que la tylosine, la monensine, la vermectine, l'érythromycine, la doxorubicine ou encore le FK506.
Les polykétides sont synthétisés par condensation de molécules d'acétate sous l'action d'enzymes appelées polykétide synthases (PKSs). Il existe deux types de polykétide synthases. Les polykétide synthases de type II sont impliquées en général dans la synthèse des antibiotiques aromatiques polycycliques et catalysent la condensation d'unités acétate de façon itérative.
Les polykétide synthases de type I sont impliquées dans la synthèse des polykétides macrocycliques ou macrolides et constituent des enzymes modulaires multifonctionnelles.
Compte-tenu de leur intérêt thérapeutique, il existe un besoin dans l'état de la technique d'isoler et de caractériser de nouvelles polykétides synthases qui peuvent être utilisées pour la production de nouveaux composés pharmaceutiques, notamment de nouveaux composés pharmaceutiques à activité antibiotique.
Le criblage de la banque de clones recombinants décrite ci- dessus à l'aide d'amorces PCR amplifiant sélectivement des séquences nucléotidiques codant pour des polykétide synthases de type I a permis d'identifier des clones recombinants contenant des inserts d'ADN comprenant une séquence nucléotidique codant pour de nouvelles polykétide synthases. Les séquences nucléotidiques codant pour ces nouvelles polykétides synthases sont référencées comme les séquences SEQ ID N°33 à SEQ ID N°44 et SEQ ID N°115 à SEQ ID N°120. Un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique codant pour une nouvelle polykétide synthase I, caractérisé en ce qu'il comprend l'une des séquences nucléotidiques SEQ ID N°34 à SEQ ID N°44 et SEQ ID N°115 à SEQ ID N°120.
De préférence, un tel acide nucléique se présente sous une forme isolée et/ou purifiée. L'invention concerne aussi un vecteur recombinant comprenant un polynucléotide comprenant l'une des séquences SEQ ID N°34 à SEQ ID N°44 et SEQ ID N°115 à SEQ ID N°120
L'invention a également trait à une cellule hôte recombinante comprenant un acide nucléique choisi parmi les polynucléotides comprenant l'une des séquences nucléotidiques SEQ ID N°34 à SEQ ID N°44 et SEQ ID N° 115 à SDEQ ID N°120 ainsi qu'à une cellule hôte recombinante comprenant un vecteur recombinant dans lequel est inséré un polynucléotide comprenant l'une des séquences nucléotidiques SEQ ID N°34 à SEQ ID N°44 et SEQ ID N°115 à SEQ ID N°120.
Avantageusement, les vecteurs recombinants contenant un insert d'ADN codant pour une nouvelle polykétide synthase de type I selon l'invention sont des vecteurs de clonage et d'expression. De préférence, une cellule hôte recombinante telle que décrite ci-dessus est une bactérie, une levure ou encore un champignon filamenteux.
Les séquences en acides aminés de nouvelles polykétide synthases provenant d'organismes contenus dans un échantillon de sol ont été déduites des séquences nucléotidiques SEQ ID N°34 à SEQ ID N°44 ET SEQ ID N° 115 à SEQ ID N°120 ci-dessus. Il s'agit des polypeptides comprenant l'une des séquences en acides aminés SEQ ID N°48 à SEQ ID N°59 et SEQ ID N° 121 à 126.
L'invention concerne encore de nouvelles polykétides synthases comprenant une séquence en acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID N°48 à SEQ ID N°59 et SEQ ID N° 121 à SEQ ID N°126.
Fait également partie de l'invention la séquence nucléotidique SEQ ID N°114 qui comprend six cadres ouverts de lecture qui codent respectivement les polypeptides de séquences SEQ ID N°121 à SEQ ID N°126.
Fait également partie de l'invention la séquence nucléotidique SEQ ID N°113 du cosmide a26G1 , qui contient la séquence complémentaire de la séquence SEQ ID N°114. On a aussi extrait et amplifié selon l'invention de l'ADN génomique provenant de souches bactériennes pures, telles que
Streptomyces coelicolor (ATCC N° 101.478), Streptomyces ambofaciens
(NRRL N°2.420), Streptomyces lactamandurans (ATCC N°27.382), Streptomyces rimosus (ATCC N°109.610), Bacillus subtilis (ATCC
N°6633) ou encore Bacillus lichenifornis et Saccharopolyspora erythrea.
Une amplification par PCR de l'ADN de chacune des souches bactériennes décrites ci-dessus a été effectuée à l'aide des couples d'amorces spécifiques des séquences nucléiques de polykétide synthase de type I.
De nouveaux gènes de polykétide synthases de type I bactériennes ont ainsi pu être isolés et caractérisés. Il s'agit des séquences nucléiques de séquences SEQ ID N°30 à SEQ ID N°32.
L'invention a donc en outre pour objet des séquences nucléotidiques codant pour de nouvelles polykétides synthases de type I choisies parmi les polynucléotides comprenant l'une des séquences nucléotidiques SEQ ID N°30 à SEQ ID N°32.
Font également partie de l'invention des vecteurs recombinants comprenant les séquences nucléotidiques codant pour de nouvelles polykétides synthases de type I définies ci-dessus.
L'invention concerne aussi des cellules hôtes recombinantes caractérisées en ce qu'elles contiennent un acide nucléique codant pour une nouvelle polykétide synthase de type I comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N°30 à SEQ ID N°32 ainsi que des cellules hôtes recombinantes comprenant un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus.
L'invention a également pour objet des polypeptides codés par des séquences comprenant les acides nucléiques SEQ ID N° 30 à 32, et plus précisément des polypeptides comprenant les séquences d'acides aminés SEQ ID N° 47 à SEQ ID N° 50.
L'invention a en outre pour objet un procédé de production d'une polykétide synthase de type I selon l'invention, ledit procédé de production comprenant les étapes suivantes: - obtention d'une cellule hôte recombinante comprenant un acide nucléique codant pour une polykétide synthase de type I comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N°33 à SEQ ID N°44, SEQ ID N°30 à SEQ ID N°32 et SEQ ID N°115 à SEQ ID N°120;
- culture des cellules hôtes recombinantes dans un milieu de culture approprié;
- récupération et, le cas échéant, purification de la polykétide synthase de type I à partir du surnageant de culture ou du lysat cellulaire.
Les nouvelles polykétide synthases de type I obtenues selon le procédé décrit ci-dessus peuvent être caractérisées par fixation sur une colonne de chromatographie d'immuno-affinité sur laquelle des anticorps reconnaissant ces polykétides synthases ont été préalablement immobilisés.
Les polykétide synthases de type I selon l'invention, et plus particulièrement les polykétide synthases recombinantes décrites ci- dessus peuvent être aussi purifiées par des techniques de chromatographie liquide à haute performance (HPLC), telles que par exemple des techniques de chromatographie en phase inverse ou de chromatographie d'échanges d'anions ou de cations, bien connues de l'homme du métier.
Les polykétide synthases, recombinantes ou non recombinantes, selon l'invention peuvent être utilisées pour la préparation d'anticorps.
Selon un autre aspect, l'invention a donc encore pour objet un anticorps reconnaissant spécifiquement une polykétide synthase de type I selon l'invention ou un fragment peptidique d'une telle polykétide synthase.
Les anticorps selon l'invention peuvent être monoclonaux ou polyclonaux . Les anticorps monoclonaux peuvent être préparés à partir de cellules d'hybridome selon la technique décrite par KOHLER et MILSTEIN C. (1975), Nature, Vol.256:495.
Les anticorps polyclonaux peuvent être préparés par immunisation d'un mammifère, en particulier des souris, des rats ou des lapins avec une polykétide synthase de type I selon l'invention, le cas échéant en présence d'un composé adjuvant de l'immunité, tels que l'adjuvant complet de Freund, l'adjuvant incomplet de Freund, l'hydroxyde d'aluminium ou encore un composé de la famille des muramyl peptides. Constituent également des " anticorps " au sens de la présente invention, les fragments d'anticorps tels que les fragments Fab, Fab', F(ab')2, ou encore les fragments d'anticorps simple chaîne contenant la partie variable (ScFv) décrits par MARTINEAU et al. (1998) J. Mol. Biol., Vol.28O (1): 117-127 ou encore dans le brevet US 4,946,778, ainsi que les anticorps humanisés décrits par REINMANN KA et al. (1997), AIDS Res. Hum. Retroviruses, vol.13(11):933-943 ou par LEGER O.J et al. (1997), Hum. Antibodies, vol.8 (1): 3-16.
Les préparations d'anticorps selon l'invention sont utiles notamment dans des tests immunologiques qualitatifs ou quantitatifs visant, soit à simplement détecter la présence d'une polykétide synthase de type I selon l'invention, soit à quantifier la quantité de cette polykétide synthase, par exemple dans le surnageant de culture ou le lysat cellulaire d'une souche bactérienne susceptible de produire une telle enzyme. Un autre objet de l'invention consiste en un procédé de détection d'une polykétide synthase de type I selon l'invention ou un fragment peptidique de cette enzyme, dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de :
a) mettre en contact un anticorps selon l'invention avec l'échantillon à tester;
b) détecter le complexe antigène/anticorps éventuellement formé. L'invention est également relative à un kit ou nécessaire de détection d'une polykétide synthase de type I selon l'invention dans un échantillon, comprenant : a) un anticorps selon l'invention; b) le cas échéant, des réactifs nécessaires à la détection du complexe antigène/anticorps éventuellement formé.
Un anticorps dirigé contre une polykétide synthase de type I selon l'invention peut être marqué à l'aide d'un marqueur détectable isotopique ou non isotopique, selon des procédés bien connus de l'homme du métier.
Le criblage d'une banque d'ADN selon l'invention à l'aide d'une paire d'amorces hybridant avec des séquences cibles dont la présence est recherchée, telles que des séquences de la voie de biosynthèse de la puromycine, des séquences du gène linA impliquées dans la biodégradation du lindane ou encore des séquences codant pour des polykétides synthases de type I ont été détaillées ci-avant.
L'invention a donc pour objet un procédé de détection d'un acide nucléique de séquence nucléotidique déterminée, ou de séquence nucléotidique structuralement apparentée à une séquence nucléotidique déterminée, dans une collection de cellules hôtes recombinantes selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
- mettre en contact la collection de cellules hôtes recombinantes avec un couple d'amorces hybridant avec la séquence nucléotidique déterminée ou hybridant avec la séquence nucléotidique structurellement apparentée à une séquence nucléotidique déterminée;
- réaliser au moins trois cycles d'amplification ;
- détecter l'acide nucléique éventuellement amplifié.
Pour les conditions d'amplification appropriées en fonction des séquences cibles recherchées, l'homme du métier pourra se référer avantageusement aux exemples ci-dessous.
Selon un autre aspect, l'invention concerne aussi un procédé de détection d'un acide nucléique, de séquences nucléotidiques déterminées, ou de séquences nucléotidiques structurellement apparentées à une séquence nucléotidique déterminée, dans une collection de cellules hôtes recombinantes selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
- mettre en contact la collection de cellules hôtes recombinantes avec une sonde hybridant avec la séquence nucléotidique déterminée ou hybridant avec une séquence nucléotidique structurellement apparentée à la séquence nucléotidique déterminée;
- détecter l'hybride éventuellement formé entre la sonde et les acides nucléiques compris dans les vecteurs de la collection.
Pour effectuer le criblage d'une banque d'ADN selon l'invention en vue de détecter la présence d'une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide capable de dégrader le lindane, on a détecté les clones recombinants d'intérêt par leur phénotype correspondant à leur capacité à dégrader le lindane. Dans ce but, les clones isolés et/ou des ensembles de clones de la banque d'ADN préparée ont été mis en culture dans un milieu de culture en présence de lindane et la dégradation du lindane a été observée par la formation d'un halo trouble dans l'environnement immédiat des cellules.
L'invention concerne aussi un procédé pour identifier la production d'un composé d'intérêt par une ou plusieurs cellules hôtes recombinantes dans une collection de cellules hôtes recombinantes selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
- culture des cellules hôtes recombinantes de la collection dans un milieu de culture approprié; - détection du composé d'intérêt dans le surnageant de culture ou dans le lysat cellulaire d'une ou plusieurs des cellules recombinantes cultivées.
L'invention a en outre pour objet un procédé pour sélectionner une cellule hôte recombinante produisant un composé d'intérêt dans une collection de cellules hôtes recombinantes selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
- culture des cellules hôtes recombinantes de la collection dans un milieu de culture approprié; - détection du composé d'intérêt dans le surnageant de culture ou dans le lysat cellulaire d'une ou plusieurs des cellules hôtes recombinantes cultivées;
- sélection des cellules hôtes recombinantes produisant le composé d'intérêt.
L'invention concerne encore un procédé pour la production d'un composé d'intérêt caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes:
- cultiver une cellule hôte recombinante sélectionnée selon le procédé décrit ci-dessus;
- récupérer et, le cas échéant, purifier, le composé produit par ladite cellule hôte recombinante.
L'invention est également relative à un composé d'intérêt caractérisé en ce qu'il est obtenu selon le procédé ci-dessus décrit. Un composé d'intérêt selon l'invention peut consister en un polykétide produit grâce à l'expression d'au moins une séquence nucléotidique comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N°33 à 44, SEQ ID N°30 à 32 et SEQ ID N°1 15 à SEQ ID N°120. L'invention concerne encore une composition comprenant un polykétide produit grâce à l'expression d'au moins une séquence nucléotidique comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N°33 à SEQ ID N°44, SEQ ID N°30 à SEQ ID N°32, et SEQ ID N°115 à SEQ ID N°120. Un polykétide produit grâce à l'expression d'au moins une séquence nucléotidique ci-dessus est préférentiellement le produit de l'activité de plusieurs séquences codantes incluses au sein d'un opéron fonctionnel dont les produits de traduction sont les différentes enzymes nécessaires à la synthèse d'un polykétide, l'une des séquences ci- dessus étant comprise et exprimée dans ledit opéron. Un tel opéron comprenant une séquence d'acide nucléique selon l'invention codant pour une polykétide synthase peut être construit par exemple selon l'enseignement de Borchert et al. (1992).
L'invention est encore relative à une composition pharmaceutique comprenant une quantité pharmacologiquement active d'un polykétide selon l'invention, le cas échéant en association avec un véhicule pharmaceutiquement compatible.
De telles compositions pharmaceutiques seront avantageusement adaptées pour l'administration, par exemple par voie parentérale, d'une quantité d'un polykétide synthétisé par une polykétide synthase de type I selon l'invention allant de1μg/kg par jour à 10 mg/kg par jour, de préférence au moins 0,01 mg/kg par jour et de manière tout à fait préférée entre 0,01 et 1 mg/kg par jour.
Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être indifféremment administrées par voie orale, rectale, parentérale, intraveineuse, sous-cutanée ou encore intradermique.
L'invention concerne aussi l'utilisation d'un polykétide obtenu grâce à l'expression d'une polykétide synthase de type I selon l'invention pour la fabrication d'un médicament, en particulier d'un médicament à activité antibiotique.
L'invention sera en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples ci-après.
La figure 1 illustre le schéma des différentes étapes de lyse effectuées selon les protocoles 1 , 2, 3n 4a, 4b, 5a, et 5b décrits à l'exemple 1.
La Figure 2 illustre une. électrophorèse sur gel d'agarose 0.8% des ADN extraits à partir de 300 mg du sol n°3 (Côte St André) après différents traitements de lyse (protocoles 1 à 5, cf. Fig. 1). M : marqueur de poids moléculaire de phage lambda
La Figure 3 illustre la proportion de différents genres d'actinomycètes cultivés à la suite des traitements 1 à 5 (cf. Fig. 1). Le nombre d'ufc (unité formant colonie) a été déterminé sur un milieu sélectif pour ce groupe de bactéries. Un nombre total d'environ 400 colonies a été analysé.
La Figure 4 illustre la. récupération d'ADN de phage lambda digéré par Hind\\\ additionné dans les sols à différentes concentrations avant (G) ou après (G*) broyage. Les traitements T (chocs thermiques) et S (sonication) sont des traitements additionnels de lyse. La quantification a été réalisée par analyse au phospho-imageur après hybridation en dot-blot. Un échantillon de chaque sol a été utilisé pour chaque concentration de phage lambda ajouté. Les caractéristiques des sol sont reproduites dans le tableau 1. Les échantillons correspondant à 10 et 15 μg d'ADN ajouté n'ont pas été traités.
La Figure 5 illustre l'amplification par PCR des ADN extraits à partir de sol n°3 selon les protocoles 1, 2, 3, 5a et 5b. Les amorces FGPS 122 et FGPS 350 (tableau 2) ont été utilisés afin de cibler Streptosporangium spp. indigènes. Les extraits d'ADN ont été utilisés non dilués ou dilués au 1/10ème et 1/100ème . M : marqueur de poids moléculaires 123 pb ( Gibco BRL), C : contrôle d'amplification sans ADN.
La Figure 6 illustre les quantités d'ADN extrait après inoculation de spores (a) ou de mycélium (b) de S. lividans OS48.3 inoculés dans les sols à différentes concentrations. La quantités de mycélium ajoutée dans le sol correspond au nombre de spores inoculées dans le milieu de germination. Environ 50% des spores ont germé, le nombre de cellules ou de génomes contenues dans les hyphes des spores germées n'a pas été déterminé. Les quantités de spores et de mycélium inoculées ne sont donc pas directement comparables. Le protocole d'extraction a été mené selon le protocole 6 (cf. section matériel et méthodes). Le symbole (') indique que de l'ARN a été inclus dans le tampon d'extraction. L'ADN cible a été amplifié par PCR avec les amorces FGPS 516 et FGPS 517, la quantification a été réalisée par phosphoimageur après hybridation en dot blot en utilisant le sonde FGPS 518. Un échantillon de chaque sol a été utilisé pour chaque concentration d'hyphes ou de spores. Les caractéristiques des sols sont décrites dans le tableau 1.
La figure 7 représente l'arbre phylogénétique obtenu par l'algorithme de Neighbour Joining , positionnant les séquences d'ADNr 16S contenues dans la banque d'ADN du sol, par rapport à des bactéries de références cultivées. En grisé:. les séquences issues des pools de clones de la banque. Les valeurs de bootstrap sont indiquées au niveau des noeuds, après rééchantillonnage de 100 répétitions. La barre d'échelle indique le nombre de substitutions par site. Le numéro d'accès des séquences dans la base de données Genbank est indiqué entre parenthèses.
La figure 8 représente un schéma du vecteur pOSint 1.
La figure 9 représente un schéma du vecteur pWED1.
La figure 10 représente un schéma du vecteur pWE15 (ATCC N° 37503).
La figure 11 représente un schéma du vecteur pOS 700I.
La figure 12 représente un schéma du vecteur pOSV010.
La figure 13 représente le fragment contenant un site " cos " inséré dans le plasmide pOSV010 au cours de la construction du vecteur pOSV 303.
La figure 14 représente un schéma du vecteur pOSV 303.
La figure 15 représente un schéma du vecteur pE116.
La figure 16 représente un schéma du vecteur pOS 700 R.
La figure 17 représente un schéma du vecteur pOSV 001.
La figure 18 représente le schéma du vecteur pOSV 002.
La figure 19 représente un schéma du vecteur pOSV 014.
La figure 20 représente un schéma du vecteur pBAC 11. La figure 21 représente un schéma du vecteur pOSV 403.
La figure 22 représente les gels d'électrophorèse d'ADN de la banque après digestion par les enzymes BamHI et Dral des clones positifs de la banque criblée avec les oligonucléotides PKS-I.
La figure 23 illustre la production de puromycine par les recombinants de S. lividans comparée à la production de la souche sauvage S. alboniger.
La Figure 24 illustre Alignement de PKSs du sol avec les sites actifs conservés d'autres PKSs. Les références pour chaque peptide sont indiquées. Les domaines béta-kétoacyl synthase ont été alignés en utilisant le programme PILEUP de GCG (Wisconsin Package Version 9.1 , Genetics Computer Group, Madison, Wisc).
La Figure 25 illustre la construction d'un cosmide intégratif conjugatif.
La Figure 26 illustre la construction d'un BAC intégratif conjugatif.
La figure 27 illustre le schéma de construction du vecteur pOSV 308.
La figure 28 illustre le schéma de construction du vecteur POSV306.
La figure 29 illustre le schéma de construction du vecteur pOSV307.
La figure 30 illustre le schéma de construction du vecteur PMBD-1. La figure 31 présente une carte détaillée du plasmide pMBD-2 ainsi qu'un schéma de construction du vecteur pMBD-3.
La figure 32 illustre une carte détaillée du plasmide pMBD-4.
La figure 33 illustre le schéma de construction du plasmide pMBD-5 à partir du plasmide pMBD-1.
La figure 34 illustre la carte détaillée du vecteur pBTP-3.
La figure 35 illustre le schéma de construction du vecteur pMBD-6 à partir du vecteur pMBD-1.
La figure 36 illustre la carte du cosmide a26G1 dont l'insert d'ADN contient des cadres ouverts de lecture codant pour plusieurs polykétides synthase.
La figure 37 est un schéma représentant l'insert d'ADN (brin +) du cosmide a26G1 , sur lequel sont positionnés les différents cadres de lecture codant pour plusieurs polykétides synthase.
EXEMPLES:
EXEMPLE 1 : Procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol contenant des organismes, comprenant une étape d'extraction directe d'ADN à partir de l'échantillon de sol.
1. MATERIEL ET METHODES
1.1 SOLS: Les caractéristiques des six sols utilisés dans cette étude sont listées dans le tableau 1.
La teneur en argile et en matière organique va respectivement de 9 à 47% et de 1 ,7 à 4,7%, le pH variant de 4,3 à 5,8.
Des échantillons de sol ont été collectés à partir de la couche superficielle de 5 à 10 cm de profondeur. Toutes les racines visibles ont été éliminées et les sols ont été conservés à 4°C pendant quelques jours si nécessaire, après quoi ils ont été séchés pendant 24 heures à la température ambiante et tamisés (taille moyenne de maille 2 mm) avant d'être conservés jusqu'à plusieurs mois à 4°C.
1.2 SOUCHES BACTERIENNES ET CONDITIONS DE CULTURE:
L'ADN extracellulaire ainsi que les souches bactériennes fournissant des cellules végétatives, des spores ou des hyphae, utilisées pour innoculer les échantillons de sol, ont été choisies de telle sorte que leur présence puisse être suivie spécifiquement.
Afin d'obtenir de grandes quantités d'ADN extracellulaire, la souche lysogénique de E.coli 1192 Hfr P4X (metB), contenant le phage lambda CI857 Sam7, a été cultivée sur milieu Luria-Bertani (LB) pendant deux heures à 3O°C, puis 30 minutes à 40°C, puis 3 heures à 37°C. L'ADN du phage lambda a été extrait selon la technique décrite par SAMBROOK J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd, éd. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y.
La souche avirulente de Bacillus anthracis (STERNE 7700) a été utilisée comme inoculum de cellules bactériennes. Bacillus anthracis a été multiplié sur un bouillon de culture de type " trypticase soy broth " (TSB) (Biomérieux, Lyon, France) pendant environ 6 heures, en vérifiant que la DOβoo soit maintenue en dessous de 0,6. Ces conditions permettent le développement des cellules végétatives sans formation de spores (Patra et al., (1996), FEMS Immunol. Médical Microbiology, vol.15:223-231.). Les spores de Streptomyces lividans OS48.3 (CLERC- BARDIN et al. non publié) ont été éliminées mécaniquement des cultures de l'organisme sur un milieu R2YE (HOPWOOD et al., (1985), Genetic Manipulation of Streptomyces-A Laboratory Manual. The John Innés Foundation , Norwich .United Kingdom). Les hyphae de S. lividans OS48.3 ont été obtenus à partir des spores en pré-germination, car l'on s'attendait à ce que l'utilisation de hyphae courtes minimise la rupture et la perte subséquente d'ADN. Les spores ont été mises en suspension dans du tampon TES (Acide N-Tris [hydroxyméthyl]méthyl-2- aminoéthanesulfonique ; Sigma-AIdrich Chimie, France) (0.05M; pH 8) (Holben WE et al., (1988), APPL. Environ. Microbiol. vol.54:703-711 , puis ont été soumises à un choc thermique (50°C pendant 10 minutes suivi d'un refroidissement sous un courant d'eau froide puis ajoutées à un volume égal de milieu de pré-germination (extrait de levure 1%, casaminoacides 1% CaCI2 0,01 M). La solution a été incubée à 37°C sur un agitateur. La proportion de spores germées a été estimée à environ 50%, en accord avec les résultats de HOPWOOD et al. (1985). Après centrifugation, les culots ont été resuspendus dans du tampon TES, ajoutés à 3% de milieu TSB, et incubés à 37°C jusqu'à l'obtention d'une DO45o de 0,15 (HOPWOOD et al. , (1985)). Streptomyces hygroscopicus SWN 736 et
Streptosporangium fragile AC1296 (Institute Pushino, Moscou) ont été cultivés selon des techniques décrites par HICKEY et TRESNER (1952).
L'ADN des spores et des hyphae de S. Lividans a été extrait à partir des cultures pures selon le protocole de lyse 6 décrit ci-dessous (excepté qu'aucun broyage n'a été réalisé), tandis que les spores de S. hygroscopicus et de S. fragile ont été extraites par lyse chimique/enzymatique (Hintermann et al., 1981).
1.3 CHOIX DU TAMPON D'EXTRACTION: Un tampon TENP (50 mM Tris, 20 mM EDTA, 100 mM NaCI, 1% pds/vol de polyvinylpolypyrrolidone développé par PICARD (1992) a été utilisé. Des tampons similaires ont été ultérieurement utilisés par d'autres auteurs (CLEGG et al., 1997; KUSKE et al., 1998; ZHOU et al., 1996).
Le Tris et l'EDTA protègent l'ADN de l'activité nucléase, le NaCI apporte un effet dispersant et la PVPP absorbe les acides humiques et les autres composés phénoliques (HOLBEN et al. (1988); PICARD et al., (1992).
Dans cette étude, l'efficacité d'extraction de ce tampon a été évaluée à différents pH (6,0 - 10,0) en utilisant 20 sols différents ayant une gamme de pH de 5,8 à 8,3 et une teneur en matière organique entre 0,2 et 6,3%. Ces vingt sols (les autres caractéristiques ne sont pas indiquées) ont été utilisés uniquement dans cette expérience. La quantité d'ADN a été déterminée de manière colorimétrique comme décrit par RICHARD (1974), et détaillé ci-après. 1.4 PROTOCOLE DE LYSE IN SITU ET D'EXTRACTION D'ADN:
Plusieurs protocoles utilisant un nombre croissant d'étapes ont été testés afin d'évaluer l'efficacité de différentes techniques pour lyser les microbes du sol in situ. Pour ces expériences, la microflore indigène du sol a été ciblée dans six sols. Des expériences additionnelles ont été conduites afin d'étudier les effets des traitements de lyse sur l'ADN libéré, en analysant les quantités et la qualité d'ADN récupéré provenant d'un ADN de phage lambda préalablement additionné aux sols.
Une fois qu'un protocole optimisé (désigné protocole 6) a été développé, ce protocole a été utilisé pour quantifier l'ADN provenant d'Actinomycètes indigènes et d'ADN provenant de bactéries Gram- positives inoculées dans les sols sélectionnés. Dans tous les cas, les échantillons de sol ont été séchés et passés au tamis comme décrit ci- dessus. Après broyage, 0,5 ml de tampon TENP ont été ajoutés à 200 mg poids sec de sol excepté pour le protocole 1 dans lequel le tampon a été ajouté à un sol non broyé).
Pour les divers traitements de lyse (voir ci-dessous), les suspensions de sol ont été passées au Vortex pendant dix minutes et centrifugées (4000 g pendant cinq minutes), après quoi une fraction aliquote (25 μl) du surnageant a été analysée par électrophorèse sur gel (0,8% d'agarose).
Une autre fraction aliquote du surnageant représentant un volume connu, généralement 350 μl, a été précipitée avec de l'isopropanol.
Cinq fractions aliquotes (représentant de l'ADN dérivé de 1 g de sol) ont été réunies et resuspendues dans 100 μl d'un tampon TE stérile (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0) avant purification (protocole D, voir ci- dessous) et quantification, soit par hybridation (Dot Blot) de l'ADN total, soit par hybridation (Dot Blot) des produits d'amplification PCR (voir ci- dessous).
Les signaux d'hybridation ont été quantifiés par imagerie par phosphorescence (technique de " phospho-imaging " voir ci-dessous). 1.5 EVALUATION DES METHODES DE LYSE CELLULAIRE IN SITU:
La qualité et la quantité de l'ADN extrait après un nombre croissant d'étapes de traitement de lyse (protocole 2-5b) ont été comparées à celles de l'ADN extracellulaire obtenu après lavage du sol avec un tampon d'extraction (protocole 1 ; voir aussi figure 1).
Protocole 1 : Pas de traitement de lyse.
Le tampon TENP a été ajouté à un sol non broyé, une étape d'extraction d'ADN a été réalisée comme décrit ci-dessus.
Protocole 2. Broyage du sol suivi d'une extraction d'ADN.
Deux types de dispositifs différents ont été utilisés pour le broyage du sol.
Afin de comparer leur efficacité respective, 5g de sol sec ont été broyés pendant 30 secondes dans un broyeur contenant des anneaux de tungstène, ou pendant des temps variés jusqu'à 60 minutes dans un broyeur de sol contenant un mortier et des billes en agate (20 mm de diamètre).
Le tampon TENP est ensuite ajouté et l'ADN est extrait comme décrit ci-dessus.
Les résultats d'électrophorèse sur gel ont montré qu'un broyage de 4O minutes en utilisant des billes en agate étaient nécessaires afin d'obtenir des quantités d'ADN extraits équivalentes à celles obtenues après 30 secondes de broyage en utilisant des anneaux de tungstène.
La distribution de taille des fragments d'ADN est similaire quelle que soit la méthode employée.
Ainsi, ces traitements ont été considérés comme équivalents et celui qui sera utilisé dans les protocoles décrits ci-dessous ne sera en conséquence pas spécifié.
Dans les protocoles 3 à 5, l'efficacité de plusieurs autres traitements de lyse ultérieure au broyage du sol a été testée, soit séparément, soit dans différentes combinaisons. Protocole 3:
Ce protocole est identique au protocole 2 , sauf qu'il comprend une étape d'homogénéisation à l'aide d'un mixeur de type Ultraturrax (Janker et Kunkel, IKA Labortechnik, Allemagne) réglé à la moitié de la vitesse maximale pendant 5 minutes.
PROTOCOLES 4a et 4b:
Ces protocoles sont identiques au protocole 3 à l'exception d'une étape additionnelle de sonication.
Deux types de dispositifs sonicateurs ont été comparés : un sonicateur à micropointe de titane (600W Vibracell Ultrason icator, Bioblock, lllkirch, France) (Protocole 4a) et un sonicateur de type Cup Horn (protocole 4b).
La micropointe Vibracell produisant des ultrasons est en contact direct avec la solution de sol.
En ce qui concerne le dispositif de type Cup Horn, la solution de sol est conservée dans des tubes qui sont placés dans un bain d'eau à travers lequel passent les ultrasons.
Des expériences préliminaires ont été réalisées afin de déterminer les conditions optimales pour les deux sonicateurs (résultats non présentés).
Le meilleur compromis, en terme de quantité d'ADN extrait et de taille de fragments, consiste en une sonication avec la micropointe de titane et le sonicateur de type Cup Horn respectivement pendant 7 et 10 minutes, en réglant la puissance à 15 W et avec des cycles actifs à 50%.
Protocoles 5a et 5b:
Après sonication avec une micropointe de titane ou un dispositif de type Cup Horn (respectivement protocoles 4a et 4b) du lysozyme et de l'achromopeptidase ont été ajoutés, chacune des enzymes à une concentration finale de 0,3 mg/ml. Les suspensions de sol ont été incubées pendant 30 minutes à 37°C, après quoi du lauryl sulfate à une concentration finale de 1 % a été ajouté, puis des suspensions ont été incubées pendant 1 heure à 60°C avant centrifugation et précipitation comme décrit ci-dessus. En plus des protocoles décrits ci-dessus, l'effet de la sonication
(Cup Horn, voir protocole 4b) et de chocs thermiques (30 secondes dans l'azote liquide suivi de trois minutes dans l'eau bouillante, les traitements étant répétés trois fois ) sur l'ADN de phage lambda digéré par Hindlll préalablement ajouté au sol ont été examinés (voir ci-après). Des chocs thermiques ont été suggérés dans l'état de la technique comme des moyens de lyse cellulaire in situ (PICARD et al. (1992)).. Cependant, du fait qu'un tel traitement a un effet préjudiciable sur l'ADN libre (voir la section résultats) il n'a pas été inclus dans les protocoles décrits ci-dessus.
PROTOCOLE OPTIMISE
Après évaluation des différents traitements de lyse, un protocole optimisé a été défini, désigné protocole 6. Le protocole 6 est identique au protocole 5b excepté que, avant la sonication, les suspensions de sol sont soumises à un traitement par Vortex puis agitées par rotation sur une roue pendant deux heures avant d'être congelées à - 20°C.
Après décongélation, les suspensions de sol sont passées au Vortex pendant 10 minutes avant sonication. Le protocole 6 a été utilisé dans les expériences dans lesquelles les sols ont été ensemencés avec des cellules bactériennes ainsi que dans les expériences dans lesquelles les actinomycètes indigènes ont été quantifiés (voir ci-dessous).
1.6 COMPTAGE AU MICROSCOPE: L'efficacité du broyage du sol comme méthode pour lyser des cellules bactériennes a été examinée au microscope.
5g de sol brut séché ont été mélangés dans un dispositif de type Waring Blender avec 50 ml d'eau stérilisée ultrapure pendant 1 ,5 minutes; simultanément, 1g (poids sec) de sol broyé (protocole n°2) a été mis en suspension dans 10 ml par agitation pendant 10 minutes. Les suspensions de sol ont fait l'objet de dilutions en séries et de l'acridine orange a été ajoutée à une concentration finale de 0,001%.
Après 2 minutes, les suspensions ont été filtrées à travers une membrane de marque NUCLEOPORE de type 0,2 μm black. Chaque filtre a été rincé avec de l'eau stérile lysée, traitée avec 1 ml d'isopropanol pendant 1 minute afin de fixer les cellules bactériennes, puis rincé de nouveau.
Les cellules bactériennes ont été comptées à l'aide d'un microscope a épifluorescence du type Zeiss Universal avec un objectif 100x. Pour chacun des types de sol, trois filtres ont été comptés, et au moins 200 cellules ont été comptées sur chacun des filtres.
1.7 NUMERATION DES ACTINOMYCETES CULTIVABLES ET NOMBRE TOTAL D'UNITES FORMANT COLONIES (CFU): Les actinomycètes ayant survécu aux traitements de lyse (protocoles 1-5) ont été examinés spécifiquement avec le sol n°3 (Côte Saint André, voir tableau 1).
Après une dilution de 10 fois d'une solution d'extrait de levure (6% poids/volume) et de SDS (0,05%) afin d'induire la germination
(Hayakawa et al. (1988)), les suspensions de sol ont été diluées en séries dans de l'eau stérile, incubées à 40°C pendant 20 minutes et ensemencées sur du milieu HV (HAYAKAWA et al., 1987).
Le milieu HV a été additionné de actidione (50 mg/l) et de nystatine (50 mg/ml).
Les colonies d'actinomycètes ont été comptées après incubation pendant 15 jours à 28°C.
Au total, environ 400 colonies ont été examinées.
L'identification a été réalisée sur la base des caractéristiques morphologiques macro-et microscopiques ainsi que sur l'analyse de la teneur en acide diaminopimélique des isolats (SHIRLING et al., 1966);
STANECK et al., 1974; WILLIAMS et al., 1993).
La quantité totale de bactéries cultivables (CFU totales) a été également déterminée pour chacun des protocoles de lyse 1 à 5. Les suspensions de sol ont été diluées en série et ensemencées en triple sur un milieu agar Bennett (WAKSMAN et al., 1961) additionné de nystatine et d'actidione (chacune à 50 mg/l).
Chaque boîte de Pétri a été couverte d'un filtre de nitrate de cellulose (Millipore) et incubée pendant trois jours à 28°C. Après la numération des colonies sur les membranes, les filtres ont été retirées et les boîtes de Pétri ont été à nouveau incubées pendant 7 jours à 28°C puis comptées à nouveau.
1.8 RECUPERATION DE L'ADN DE PHAGE LAMBDA AJOUTE AUX SOLS: L'ADN de phage lambda a été digéré avec Hindlll, extrait par un mélange de phénol-chloroforme, précipité puis resuspendu dans de l'eau stérile ultrapure selon des protocoles standard (SAMBROOK et al., 1989).
Des dilutions correspondant respectivement à 0, 2,5, 5, 7,5, 10 et 15 μg d'ADN/g de poids sec de sol ont été préparées dans des volumes de 60 μl. Ces dilutions d'ADN ont été ajoutées à des lots de 5g de sol sec qui ont été subséquemment vigoureusement mélangés par vortex pendant 5 minutes avant broyage.
L'ADN de phage lambda a aussi été ajouté à un sol avant broyage à des concentrations correspondant à 0, 10 et 15 μg d'ADN/g de poids sec du sol.
Après broyage, le tampon d'extraction est ajouté et l'ADN est extrait selon le protocole 2(voir ci-dessus).
1.9 SATURATION DES SITES D'ADSORPTION AVEC DE L'ARN: Afin de déterminer si la saturation des sites d'adsorption d'acides nucléiques des colloïdes du sol pouvait augmenter le taux de récupération de l'ADN, le terreau sablonneux (sol n°4) et le sol argileux (sol n°5) ont été incubés avec une solution d'ARN avant tout autre traitement. De l'ARN commercial de Saccharomyces cerevisiae
(BOHRINGER MANNHEIM, MEYLAN, France) a été dilué dans du tampon phosphate (pH 7,1) et ajouté aux échantillons de sol sec et tamisés (2 ml/g de sol) à des concentrations finales de 20, 50 et 100 mg d'ARN/g de poids sec du sol. Les tubes contenant les suspensions de sol ont été agités par rotation pendant deux heures à température ambiante. Après centrifugation, les culots de sol ont été séchés au four (50°C) pendant la nuit. L'ADN de phage lambda a ensuite été ajouté aux sols (0, 20 ou 50 μg/g de poids sec du sol) afin de simuler le sort de l'ADN libéré après lyse cellulaire.
L'ADN a été extrait selon le protocole n°2. Il a été déterminé par la suite qu'un effet identique de l'addition d'ARN sur la récupération d'ADN pouvait être atteint en ajoutant l'ARN directement au tampon d'extraction.
Cette procédure simplifiée a été utilisée pour le sol argileux n°5 dans les expériences dans lesquelles les micro-organismes ont été inoculés dans les sols.
L'ARN a ensuite été ajouté à une concentration correspondant à 50 mg d'ARN/g de poids sec du sol.
1.10 DETERMINATION QUALITATIVE ET QUANTITATIVE DE L'EFFICACITE DES PROTOCOLES D'EXTRACTION: La qualité de l'ADN (absence de dégradation) a été estimée sur la base de la taille des fragments d'ADN ou de la position relative des bandes de migration d'ADN après électrophorèse d'une fraction aliquote d'une solution d'ADN sur un gel d'agarose à 0,8%.
L'intensité de fluorescence a permis une estimation semi- quantitative des rendements d'extraction. Une autre fraction aliquote a été utilisée pour des déterminations quantitatives de la teneur en ADN par hybridation (Dot Blot) et analyse au phospho-lmager. Le protocole d'hybridation sur tache a été décrit par SIMONET et al. (1990).
Les membranes d'hybridation (GeneScreen plus, Life Science Products, Boston, Etats-Unis d'Amérique) ont été préhybridees pendant au moins 2 heures dans 20 ml d'une solution contenant 6 ml de 20 x SSC, 1 ml de solution de DENHARDT's, 1 ml de SDS à 10% et 5 mg d'ADN de sperme de saumon.
L'hybridation a été réalisée pendant une nuit dans la même solution en présence d'une sonde marquée préalablement à deux lavages des membranes dans un tampon SSC 2 x pendant 5 minutes à température ambiante, puis un troisième lavage dans du tampon SSC 2 x, SDS 0,1% et un quatrième lavage dans du tampon SSC 1 x, SDS 0,1% pendant 30 minutes à la température d'hybridation. Les signaux d'hybridation ont été quantifiés avec un système d'imagerie radioanalytique BIORAD (Molecular Analyst Software, BIORAD, Ivry S/Seine, France).
Afin de quantifier la quantité totale d'ADN dérivée de la microflore indigène, les différents sols ont été extraits selon les protocoles n°1 à 5. L'ADN non amplifié a été appliqué sur les membranes de Dot Blot et hybride en utilisant la sonde universelle
FGPS431 (tableau 2).
Cette sonde, qui hybride aux positions 1392-1406 du gène de l'ADNr 16S de E.coli (Amann et al. (1995)) a été marquée à ses extrémités avec un ATPα32P en utilisant une polynucléotide kinase T4(BOEHRINGER MANNHEIM, Melan, France).
Une courbe de calibration a été préparée à partir de l'ADN de E.coli DH5α. La conversion des calculs aux bactéries du sol a nécessité une simplification, partant de l'hypothèse que le nombre de copies moyen (rm) est de 7, comme pour E.coli.
L'ADN de phage lambda digéré par Hindlll a été utilisé pour quantifier la récupération de l'ADN extracellulaire. Des extraits non amplifiés à partir de sols, auxquels de l'ADN de phage lambda avait été ajouté, ont été hybrides avec de l'ADN de phage lambda digéré par Hindlll marqué au hasard en utilisant le fragment Klenow (Bôehringer Mannheim, Melan, France).
Les quantités d'ADN ont été calculées par interpolation à partir d'une courbe de calibration préparée avec l'ADN purifié.
La quantité totale d'ADN extrait à partir des sols n°1 , 2, 3, 4 et 6 selon le protocole n°2 (broyage) a également été quantifiée de manière colorimétrique selon la technique décrite par RICHARD (1974).
Brièvement, de l'ADN a été mélangé avec du HCIO4 concentré
(la concentration finale de HCIO était de 1 ,5 N). On a mélangé 2,5 volumes de cette solution avec 1 ,5 volumes de DPA (diphénylamine, Sigma-AIdrich, France) et laissé incuber le mélange à la température ambiante pendant 18 heures, préalablement à la détermination de la DO à 600 nn. Les extraits d'ADN du sol ont été quantifiés par rapport à une courbe standard réalisée par l'ADN extrait à partir de E.coli DH5α selon les protocoles standards (SAMBROOK et al., (1989)).
1.11 DEVELOPPEMENT D'UNE TECHNIQUE DE QUANTIFICATION D'ADN EN UTILISANT L'AMPLIFICATION PCR ET L'HYBRIDATION:
Pour les amplifications par PCR, de l'ADN polymérase Taq (Appligene Oncor, France) a été utilisé selon les instructions du fabricant. Le programme PCR utilisé pour toutes les amplifications est le suivant: dénaturation initiale pendant 3 minutes à 95°C, puis 35 cycles consistant en 1 minute à 95°C, 1 minute à 55°C et 1 minute à 72°C, suivie par une extension finale à 72°C pendant 3 minutes.
L'ADN isolé et purifié à partir de Streptosporangium fragile a été utilisé comme témoin à des concentrations allant de 100 fg à 100 ng.
Afin d'amplifier spécifiquement l'ADN de ce genre bactérien, on a choisi les amorces FGPS122 et FGPS350 (tableau 2), complémentaires à une partie de l'ADNr 16S, après alignement des séquences d'ADNr 16S d'actynomycètes. Leur spécificité a été testée sur une collection de souches d'actynomycètes (Streptomyces, Streptosporangium et d'autres genres fortement apparentés).
Les produits de PCR ont été hybrides avec la sonde oligonucléotidique FGPS643 (tableau 2). Afin de simuler le niveau de pureté obtenu en routine avec de l'ADN extrait à partir du sol, des témoins d'ADN pur de S. fragile ont été mélangés avec les extraits de sol obtenus après des traitements selon les protocoles de lyse 4b et 5b puis purifiés selon le protocole D.
Avant utilisation, les extraits de sol ont été traités avec de la DNase (une unité de DNase/ml, GIBCO BRL) pendant 30 minutes à température ambiante. La DNase a ensuite été inactivée par chauffage à 65°C pendant 10 minutes. Une vérification de l'inactivation a été réalisée par PCR. Les concentrations d'acides humiques ont été mesurées par spectrophotométrie (DO2sonm) contre une courbe standard d'acides humiques commerciaux (Sigma). Des solutions de sol traitées à la Dnase non diluées, diluées 10x et diluées x 100 ont été mélangées de 100. fg à 100ng d'ADN de S. fragile avant l'amplification par PCR. Dans une autre série d'expériences, les concentrations croissantes d'ADN de Streptomyces hygroscopicus de (100 pg à 1 μg) ont été ajoutées à l'ADN de S. fragile afin de simuler la présence d'ADN non-cible et son influence sur le procédé PCR.
1.12 PURIFICATION DES EXTRAITS D'ADN BRUT: Quatre méthodes de purification d'ADN ont été comparées. L'ADN a été extrait à partir de 1g (poids sec de sol selon le protocole 4a et remis en suspension dans 100 μl de tampon TE8 (5O mM Tris, 20 mM (EDTA, pH 8,0).
Protocole A
Elution à travers deux colonnes successives Elutip d (SCHLEICHER et SCHUELL, Dassel, Allemagne) (PICARD et al., (1992)).
Protocole B:
Elution à travers une colonne SEPHACRYL S200 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suède) suivie d'une elution à travers une colonne Elutip d (NESME et al. (1995)).
Protocole C:
Séparation à l'aide d'un système aqueux à deux phases avec 17,9% (poids/poids) de PEG 8000 (Merck, Darmstadt, Allemagne) et 14,3% (poids/poids) de (NH4)2SO4(ZASLAVSKY,(1995)).
Après un mélange vigoureux au vortex, les deux phases ont été laissées à température ambiante pour leur séparation.
1 ml de chacune des phases a été transféré dans un autre tube, mélangé avec 100μl de l'échantillon et laissé à 4°C pendant une nuit pour permettre la séparation. La phase inférieure a été dialysée pendant une heure à travers une membrane Millipore en présence d'un excès d'un tampon TE 7,5 (10 mM Tris, 1 mM EDTA à pH 7,5 et 1 M Mg Cl2) afin d'éliminer les sels en excès.
Protocole D:
Elution à travers une colonne de type Microspin Sephacryl S400 HR (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suède) , suivie d'une elution à travers une colonne de type Elutip d.
Chaque protocole est terminé par une étape de précipitation à l'éthanol, et l'ADN est remis en suspension dans 10 μl de tampon TE 7,5. L'efficacité des protocoles de purification a été vérifiée par amplification PCR de fractions aliquotes non diluées des solutions d'ADN et de fractions aliquotes diluées 10 et x 100 fois, en utilisant des protocoles standard (voir ci-dessous).
1.13 RECUPERATION DE L'ADN A PARTIR DE MICROORGANISMES INNOCULES: Les cellules, spores et hyphae ont été lavées deux fois et dénombrées par comptage sur plaque ou comptage microscopique direct. Des lots de 5g de sol sec et tamisé (sols n°2, 3 et 5) ont été inoculés avec 100 μl d'une suspension de spores et d'hyphae de S. lividans à des concentrations correspondant à 0,103, 105, 107 et 109 spores/g de poids sec de sol, ou avec des cellules végétatives de B. anthracis à des concentrations correspondant à 0,107 et 109 cellules par gramme de poids sec du sol.
Les quantités de hyphae de S. lividans ont été calculées sur la base du nombre de spores desquelles elles sont originaires. Après addition des suspensions bactériennes, les échantillons de sol sont mélangés vigoureusement par vortex pendant 5 minutes avant broyage. L'ADN est extrait selon le protocole n°6 (voir ci-dessous).
L'amplification PCR suivie d'une hybridation sur tache (Dot Blot) et imagerie par phosphorescence (phospho-imaging) a été utilisée afin de quantifier les quantités d'ADN récupérées à partir des cellules, des spores et du mycélium bactérien inoculé dans les sols.
L'extraction d'ADN a été réalisée selon le protocole de lyse n°6. L'amplification PCR et l'hybridation ont été réalisées comme décrit ci- dessus. Les amorces et les sondes sont ciblées sur des régions chromosomiques localisées en dehors de la région 16S, et sont hautement spécifiques des organismes respectifs, de manière à éviter des signaux de bruit de fond.
Pour les sols ensemencés avec β. anthracis, les amorces R499 et R500 ont été utilisées (Patra et al. (1996)) et les produits d'amplification ont été hybrides avec la sonde oligonucléotidique C501 (tableau 2).
Pour les sols ensemencés avec S. lividans , les réactions PCR ont été réalisées en utilisant les amorces FGPS516 et FGPS517, et les produits d'amplification ont été hybrides avec la sonde oligonucléotidique FGPS518 (tableau 2).
La région amplifiée est une partie de la cassette construite spécifiquement pour obtenir la souche OS48.3 (CLERC-BARDIN et al., non publié). Les comptes de calibration ont été dans tous les cas obtenus en utilisant l'ADN purifié de l'organisme cible.
2. RESULTATS
2.1 CHOIX DU TAMPON D'EXTRACTION:
20 sols différents ont été utilisés afin de déterminer le pH optimal du tampon d'extraction d'ADN. Pour tous les sols, le rendement en ADN augmente avec les pH croissants du tampon. Le rendement pour chaque pH (+/- sd), calculé comme le pourcentage de la valeur la plus haute pour chacun des sols, est le suivant: pH 6,0 : 31 +/- 13; pH 7,0: 43 +/- 16; pH 8,0: 60 +/- 14; pH 9,0: 82 +/- 12; pH 10,0: 98 +/- 3.
Pour 16 des 20 sols, le rendement le plus élevé a été obtenu à pH 10,0, alors que pour les quatre autres sols le plus haut rendement a été obtenu à pH 9,0. Cependant, à pH 10,0, des quantités plus grandes de matériel humique ont été libérées, comparées à pH 9,0 (résultats non présentés). En conséquence, le pH 9,0 a été choisi pour toutes les expériences présentées ci-dessous.
2.2 EFFICACITE DES PROTOCOLES D'EXTRACTION D'ADN:
L'ADN total des organismes indigènes du sol a été extrait et quantifié de manière à évaluer l'efficacité de nombreux protocoles de lyse cellulaire in situ. Des échantillons des sols 1-6 (tableau 1) ont été traités selon les protocoles n°1 à 5 décrits dans la section Matériel et Méthodes (figure
D-
Après l'extraction d'ADN, les suspensions de sols ont été précipitées avec de l'isopropanol, et des fractions aliquotes des culots remis en suspension ont été analysées par électrophorèse sur gel , dans une première étape, afin d'estimer la qualité et la quantité de l'ADN libéré.
Cependant, la couleur de l'extrait d'ADN devenait de plus en plus sombre au fur et à mesure du nombre croissant d'étapes de lyse, du fait de la co-extraction de composés, tels que les acides humiques, avec l'ADN.
Certains de ces extraits bruts de couleur sombre ne migrent pas de la manière attendue dans les gels d'agarose.
En conséquence, les solutions d'ADN brut ont été purifiées (protocole B) avant quantification. Les électrophorèses sur gel des solutions purifiées obtenues après les différents traitements de lyse sont exemplifiées sur le sol n°3 (figure 2).
Une comparaison visuelle au rayonnement ultra-violet des intensités de l'ADN coloré a permis une estimation semi-quantitative de l'efficacité des traitements. De plus, la présence de profils de migration de tailles multiples de fragments (bandes discrètes) d'ADN et la disparition des fragments longs indique qu'une dégradation de l'ADN a eu lieu.
Aucun ADN n'a pu être extrait du sol argileux n°5. Une quantification plus précise de l'ADN de tous les sols, extrait selon les protocoles n°1 à 5, a été réalisée par hybridation sur tache (Dot
Blot) sans étape d'amplification PCR préalable et en utilisant une sonde oligonucléotidique complémentaire d'une séquence hautement conservée de la région d'ADNr 16S (sonde FGPS 431 , tableau 2).
L'ADN a été détecté dans les extraits de tous les sols après chacune des différentes étapes de lyse, à l'exception du sol argileux n°5.
Les résultats concordent avec les estimations réalisées après gel d'électrophorèse. Afin de comparer avec une méthode indépendante pour la quantification, l'ADN extrait selon le protocole n°2 (tous les sols sauf le sol n°5) a été également quantifié en utilisant une méthode colorimétrique de détection de l'ADN (RICHARD, 1974).
On a trouvé une bonne corrélation (r = 0,88) entre l'ADN quantifié en utilisant cette technique colorimétrique et les résultats obtenus par hybridation de type Dot Blot/radio-imagerie, confirmant l'hypothèse selon laquelle le nombre de copies moyen des bactéries du sol (rrn) est de 7.
L'hybridation (Dot Blot) a montré que les quantités d'ADN extracellulaires, comme déterminé par extraction sans traitement de lyse (protocole n°1), allait de 4μg/g pour le sol acide (n°6) à 36 μg/g pour le sol n°3 (tableau 3).
Le broyage du sol (protocole n°2 ) a augmenté les quantités d'ADN extrait à partir de tous les sols (p. ex. 26 μg/g de sol) pour le sol n°6 et 59 μg/g de sol (pour le sol n°3) (tableau 3; figure 2).
Pour les deux traitements de broyage (voir la section Matériel et Méthodes) la migration discrète d'ADN a été détectée sur les gels d'agarose, indiquant que les molécules d'ADN ont été partiellement dégradées (figure 2). La taille des fragments d'ADN est comprise entre 20 et 0,2 kb.
L'intensité de bande des fragments les plus petits est très faible, indiquant que la majeure partie des fragments ont une taille bien supérieure à 1 kb.
Le protocole n°3 comprend une étape d'homogénéisation dans un dispositif mixeur de type Ultraturax après l'addition du tampon d'extraction aux échantillons de sol. Cette étape conduit à une augmentation des quantités d'ADN extrait, comme déterminé par hybridation sur tache (Dot Blot) pour deux des sols (le terreau sablonneux n°3 et le sol acide n°6), alors que les deux sols riches en matière organique (sols n°1 et n°2) ont conduit à l'obtention de quantités plus faibles d'ADN.
Les protocoles n°4a et n°4b ont permis d'évaluer l'influence de deux types de sonication sur les rendements en ADN à partir de sols préalablement broyés et homogénéisés . La sonication n'a pas eu d'effet positif sur le rendement en
ADN, comparé au protocole n°3, excepté pour le sol n°6. Toutefois, l'efficacité de lyse des deux types de sonicateur diffèrent. Pour les sols n°2, 3 et 4, les quantités d'ADN extraits les plus grandes ont été obtenues en utilisant la micropointe de titane (tableau 3; figure 2), alors que pour les sols n°1 et n°6, le rendement en ADN était supérieur en utilisant le dispositif Cup Horn.
Des résultats contradictoires ont été également obtenus lorsque l'on a ajouté une étape de lyse enzymatique/chimique (protocoles n°5a et 5b) après l'étape de sonication: dans certains cas, les quantités d'ADN extraites ont été plus grandes que celles récupérées selon les protocoles n°4a et 4b, alors que dans d'autres cas les rendements étaient moindres (tableau 3).
2.3 COMPTAGE DIRECT DES MICRO-ORGANISMES:
Des comptes au microscope du nombre total de cellules bactériennes après coloration à l'acridine orange ont été réalisés pour tous les sols, avant et après broyage.
Avant broyage, le nombre de bactéries par gramme de poids sec du sol allait de 1 ,4 x 109 (+/- 0,4) dans le sol tropical n°5 à 10 x 109
(+/- 0,7) dans le sol provenant de la Côte Saint-André (sol n°3) (tableau
D-
Après broyage, les nombres de cellules ont été respectivement de 45, 74, 75, 54, 34 et 75% des valeurs initiales pour les sols n°1 à 6. 2.4 NUMERATION DES ACTINOMYCETES CULTIVABLES APPARTENANT A DIFFERENTS GENRES:
Une modification dans les populations d'actinomycètes dans le sol n°3 a été remarquée après les différents traitements de lyse (figure 3).
Par exemple, les colonies de Streptomyces sp. dominaient la flore viable d'actinomycètes lorsqu'aucun traitement de lyse n'est appliqué (protocole n°1), et représentaient 65% du nombre total de colonies identifiées. Après broyage, le pourcentage de colonies de Streptomyces a diminué pour atteindre 51%, alors que la proportion de colonies appartenant au genre Micromonospora a augmenté de 14% à 41%.
La lyse chimique/enzymatique (protocoles 5a et 5b) est apparue comme particulièrement efficace pour la lyse des streptomycètes. Lorsque tous les traitements de lyse ont été appliqués, y compris une lyse chimique/enzymatique (protocoles 5a et 5b), la microflore d'actinomycètes, qui comprenait encore plus de 106 CFU/g de sol, était dominée par les espèces appartenant au genre Micromonospora, alors qu'aucune ou très peu de colonies de Streptomyces ont été récupérées.
Les organismes appartenant aux genres tels que Streptosporangium, Actinomadura, Microbispora, Dactilosporangium et Actinoplanes sont apparus sur les plaques en faible nombre (2-8% du nombre total de colonies identifiées) après broyage, homogénéisation avec le dispositif Ultraturrax, et sonication, mais étaient généralement absents lorsque ces traitements étaient combinés avec une lyse chimique/enzymatique.
Le nombre total de bactéries cultivables restant après chaque traitement de lyse (protocoles 2 à 5) a été aussi recherché pour le sol n°4. Les résultats indiquent que le nombre de bactéries cultivables ne décroît pas avec l'intensité des traitements de lyse (environ 2 x 106 CFU/g de sol dans tous les cas, et également lorsqu'un traitement n'est appliqué, tel que selon le protocole n°1).
L'obtention de ces faibles valeurs de CFU est probablement due au fait que du sol sec a été utilisé et que seules les bactéries les plus résistantes se sont multipliées sur les plaques. Le nombre d'actinomycètes formant colonies était généralement plus grand que celui des CFU total (toutes les bactéries) du fait qu'une étape de germination de spores, comprise dans le protocole de détection des actynomycètes, manquait lors du contrôle des bactéries totales.
2.5 RECUPERATION DE L'ADN DU PHAGE LAMBDA AJOUTE:
Le but de ces expériences était d'estimer de quelle manière des traitements de lyse successifs pouvaient affecter la récupération d'ADN nu , et si ces traitements successifs de lyse contribuaient à sa dégradation.
L'ADN pouvait être soit une fraction d'ADN extracellulaire libérée à partir d'organismes déjà morts, qui peuvent persister dans le sol pendant des mois (WARD et al., 1990), soit de l'ADN libéré à partir d'organismes lysés facilement pendant les premières étapes du traitement. Afin de simuler cette situation, de l'ADN de phage lambda digéré par Hindlll a été ajouté, à diverses concentrations, aux sols avant et après broyage. En plus du broyage, une combinaison des autres traitements de lyse a été testée, y compris la sonication (dispositif Cup
Horn, voir protocole n°4b) et des chocs thermiques (voir la section
Matériel et Méthodes).
Après extraction, des fractions aliquotes qui devraient théoriquement contenir de 25 à 150 ng d'ADN de phage lambda ont été analysées par électrophorèse sur gel. Aucun fragment d'ADN spécifique du phage lambda n'a pu être observé lorsque l'ADN a été inoculé dans les échantillons de sol préalablement au broyage, indépendamment de la dose ou du type de sol.
Lorsque l'ADN a été ajouté après broyage, et extrait sans étape de traitement de lyse additionnelle, les profils spécifiques d'ADN de phage lambda ont été détectés dans les extraits de quatre des cinq sols testés.
Dans tous ces cas, une relation directe de cause à effet a été obtenue entre la quantité d'ADN ajoutée et l'intensité des signaux sur les gels d'agarose. Les intensités des signaux étaient, cependant, inférieures aux intensités de signaux attendues si on les compare à celles des standards moléculaires.
De plus, la bande à 23 kb était absente dans plusieurs cas, indiquant que les longs fragments étaient préférentiellement adsorbés aux particules du sol, ou étaient plus sensibles à la dégradation, comparés aux fragments courts.
Aucune bande n'a été détectée dans les échantillons de sol tropical n°5 qui est caractérisé par une très haute teneur en argile (tableau 1). Pour une quantification plus précise, la récupération d'ADN a été déterminée sur un dispositif d'imagerie par phosphorescence (phospho-imager) après hybridation en tache (Dot Blot). Selon cette technique, l'ADN a été détecté dans tous les échantillons, y compris ceux qui avaient été inoculés avant broyage, à l'exception du sol n°5 dans lequel aucun ADN n'a pu être détecté.
Dans tous les autres sols, la quantité d'ADN extrait augmente avec l'augmentation de taille de l'inoculum (figures 4a-d).
Cependant, les récupérations d'ADN de phage lambda étaient faibles. Lorsque le broyage était le seul traitement de lyse appliqué, les récupérations étaient comprises entre 0,6 et 5,9% de l'ADN ajouté lorsque celui-ci était ajouté avant broyage, et de 3,6 à 24% de l'ADN ajouté lorsque ce dernier était ajouté après broyage. Les plus hauts niveaux de récupération ont été obtenus à partir du sol n°2.
L'électrophorèse sur gel de fractions aliquotes d'échantillons traités par choc thermique et sonication n'a permis d'observer des bandes d'ADN dans aucun des échantillons, y compris l'essai dans lequel l'ADN avait été ajouté après broyage. Les expériences d'hybridation en tache (Dot Blot) ont confirmé ces résultats.
Les signaux d'hybridation obtenus à partir de suspensions de sol qui ont été traitées par chocs thermiques et sonication ont été, tout au plus, faibles.
L'échantillon présentant la plus forte quantité d'ADN (15 μg d'ADN/g de poids sec du sol) était le seul pour lequel le signal obtenu était sensiblement différent du niveau du bruit de fond. Aucune différence, ( ou de faibles différences) n'a été observée entre les échantillons traités par choc thermique et ceux traités par chocs thermiques et sonication, indiquant que les chocs thermiques ont un effet préjudiciable sur l'ADN. Les récupérations les meilleures ont été observées pour le sol n°2, qui a la plus forte teneur en matière organique (tableau 1), alors qu'aucun ADN n'a été récupéré à partir du sol argileux n°5.
Des expériences additionnelles ont été réalisées avec des échantillons non broyés de sols n°4 et n°5, qui ont été ensemencés avec 20 et 50 μg d'ADN de phage lambda par gramme de sol.
Les échantillons ont été extraits immédiatement ou après une période d'incubation d'une heure à 28°C, puis les extraits d'ADN ont été purifiés et analysés par électrophorèse sur gel.
L'incubation du sol n°4 pendant une heure après l'inoculation n'a pas conduit à des profils qualitativement ou quantitativement différents de ceux obtenus sans incubation ou de ceux observés antérieurement lorsque l'ADN avait ajouté après broyage.
Ces résultats indiquent que la dégradation enzymatique par les nucléases du sol ne seraient pas impliquée dans le faible taux de récupération d'ADN. De plus, l'absence d'étape de broyage ne permet pas une augmentation de la récupération de l'ADN à partir du sol n°5, indiquant que les modifications de structure du sol dues au broyage n'augmentent pas significativement l'adsorption des acides nucléiques sur les colloïdes.
2.6 SATURATION DES SITES D'ADSORPTION AVEC L'ARN:
La plupart des profils obtenus sur les gels d'agarose ne diffèrent pas significativement des profils précédents dans lesquels le traitement d'ARN n'a pas été effectué.
Par exemple, aucune bande n'a été détectée à partir du sol riche en argile n°5, indépendamment des concentrations d'ARN et des concentrations d'ADN de phage lambda utilisées. De plus, les bandes spécifiques d'ADN de phage lambda digérées par Hindlll restaient indétectables dans le terreau sablonneux traité par l'ARN (sol n°4) lorsque l'ARN est ajouté avant le broyage.
L'intensité des bandes obtenues à partir d'échantillons ensemencés avec l'ADN après broyage augmente avec la concentration d'ARN, indiquant que le traitement pourrait avoir un effet positif.
Cependant, les résultats après hybridation et analyse par imagerie à phosphorescence n'ont pas confirmé les résultats de l'électrophorèse. Par exemple, l'effet positif du traitement d'ARN sur la récupération d'ADN à partir du terreau argileux, lorsque l'ADN a été ajouté après broyage, n'apparaît pas clairement.
•t
D'un autre côté, un effet positif de l'ARN a été trouvé pour le sol riche en argile (n°5) lorsque l'ADN a été ajouté après broyage.
Bien que les signaux d'hybridation pour les échantillons contrôle ne diffèrent pas des niveaux de bruit de fond, des quantités significatives d'ADN ont été libérées à partir des échantillons traités par l'ARN, et les signaux ont augmenté avec la quantité d'ADN ajoutée ainsi qu'avec la concentration d'ARN.
Cependant, même pour la plus forte concentration d'ARN (100 mg/g de poids de sol sec) le taux de récupération n'a jamais dépassé 3%.
2.7 PURIFICATION DES EXTRAITS BRUTS D'ADN:
Des quatre protocoles testés, la meilleure amplification des extraits d'ADN non dilués (1 μl d'extrait dans 50 μl de mélange PCR) a été observée après l'élution à travers des colonnes de type Microspin S400 suivie d'une elution à travers une colonne de type Elutip d, comme le montre l'électrophorèse sur gel des produits PCR. L'ADN purifié par le système aqueux double phase (protocole
C) a donné des quantités plus faibles de produits PCR après amplification à partir d'extrait d'ADN non dilué.
Aucun produit d'amplification n'a pu être obtenu à partir des extraits non dilués après amplification à la suite de la mise en oeuvre des protocoles A ou B. En conséquence, le protocole B (voir section Matériels et Méthodes) a été utilisé pour toutes les expériences dans lesquelles les amplifications PCR et/ou les hybridations sur tâche (Dot Blot) ont été réalisées.
2.8 QUANTIFICATION PAR PCR ET HYBRIDATION:
La première étape était de déterminer si les quantités de produit PCR étaient proportionnelles au nombre de molécules d'ADN cibles initialement présentes dans le tube réactionnel. De l'ADN de Streptosporangium fragile a été utilisé comme cible (voir section Matériels et Méthodes).
Les amorces utilisées ont été les amorces FGPS122 et FGPS350 (tableau 2). L'électrophorèse sur gel des produits PCR a montré que l'intensité de bande augmente avec l'accroissement de la concentration des cibles. Les produits PCR ont été hybrides avec la sonde oligonucléotidique FGPS643 (tableau 2), et les signaux ont été quantifiés par imagerie par phosphorescence (phospho-imaging).
On a trouvé une bonne corrélation (i^≈ 0,98) entre le logfnombre de cibles] et le log[intensité du signal d'hybridation]. On a ensuite recherché si l'efficacité de l'amplification PCR était affectée par les acides humiques et l'ADN non cible. Lorsqu'on l'analyse par électrophorèse sur gel, l'intensité accrue des bandes des produits PCR, correspondant aux différentes quantités d'ADN cible, était conservée lorsque l'amplification était réalisée avec des solutions d'ADN auxquelles on avait ajouté des extraits de sol traités à la DNase, contenant des acides humides à des concentrations allant jusqu'à 8ng dans le mélange PCR d'un volume de 50 μl.
Avec 20 ng d'acide humique dans le mélange PCR, les bandes correspondant aux faibles niveaux d'ADN cible ont disparu, et à des concentrations d'acide humique de 80 ng et à des concentrations supérieures, aucune bande n'était visible .
Les quantités variées d'ADN cible de S.fragile ont permis de fournir les quantités attendues de produit PCR lorsque, avant amplification, l'ADN de S. fragile a été mélangé avec de l'ADN de Streptomyces hygroscopicus et ajouté au mélange PCR de 50 μl dans une gamme de 100 pg à 1 μg afin de simuler l'ADN non-cible libéré à partir de la microflore du sol.
2.9 QUANTIFICATION DES ACTINOMYCETES INDIGENE DU SOL APRES DIFFERENTS TRAITEMENTS DE LYSE:
On a appliqué le protocole de purification D suivi d'une amplification par PCR comme décrit ci-dessus afin de quantifier les actinomycètes appartenant au genre Streptosporangium dans le sol n°3 après extraction conformément aux protocoles n°1 , 2, 3, 5a et 5b (figure 5).
Après broyage, (protocole n°2) la quantité d'ADN cible provenant de cet actinomycète a été estimée par hybridation (Dot Blot) et radio-imagerie comme étant de 2,5 +/- 1 ,3 ng /g de poids de sol sec. Si l'on postule que le contenu en ADN est de 10 fg par cellule, comme pour Streptomyces (Gladek et al. 1984), cette valeur correspond à approximativement 2,5 x 105 génomes. Des valeurs similaires ont été obtenues après les autres traitements de lyse (respectivement 2,6 +/-1.1 et 1 ,8 +/- 1 ,3 ng d'ADN/g de sol sec en utilisant respectivement les protocoles 3 et 4b).
2.10 EFFICACITE DE LA RECUPARATION D'ADN A PARTIR DE SOLS PREALABLEMENT INOCULES AVEC DES BACTERIES:
Trois sols (n°2, 3 et 5) ont été inoculés avec des spores ou des hyphae de Streptomyces lividans à différentes concentrations (voir section Matériel et Méthodes). Les quantités de mycélium ajoutées au sol (figure 6b) correspondent au nombre de spores inoculées dans le milieu de germination. Approximativement 50% de ces spores ont germé. Le nombre exact de cellules dans les hyphae des spores germinées n'a pas été déterminé. En conséquence, les quantités de spores et de mycélium ensemencées dans les sols ne sont pas directement comparables.
Pour chaque échantillon de sol, le protocole d'extraction n°6, la méthode de purification D, et l'amplification PCR combinée avec l'hybridation sur tache (Dot Blot) et l'imagerie par phosphorescence (phospho-imaging) ont été utilisés pour dénombrer les ADNs cibles spécifiques qui avaient été libérés. L'ADN extrait peut être clairement distingué du bruit de fond seulement lorsque le nombre de spores ajoutées dépasse 105 pour les sols n°3 et n°5 et 107 pour le sol n°2 (figure 6a). Lorsque le mycélium est ajouté, l'ADN extrait peut être détecté au-delà d'une quantité correspondant à 103 spores/g de sol pour les sols n°2 et n°3, et au-delà de 107 spores/g pour le sol n°5 (figure b).
Au-dessus du niveau de détection, le signal d'hybridation augmente avec des quantités croissantes des cellules inoculées. Pour l'inoculum de spores, une augmentation de 100 fois dans le nombre de cellules ensemencées conduit à une augmentation de presque 100 du rendement d'ADN. Cette augmentation est clairement inférieure lorsque les hyphae sont inoculées, particulièrement dans les sols n°2 et n°3 (figure 6). Au contraire, les résultats obtenus lorsque l'ADN de phage lambda a été utilisé comme inoculum, l'ADN a également été récupéré à partir du sol riche en argile (n°5) lorsque les cellules bactériennes ont été utilisées comme inoculum. Cependant, pour ce dernier aussi, le traitement par l'ARN a augmenté la récupération d'ADN de Streptomyces à partir de ce sol à la fois pour les spores et le mycélium (figure 6).
Le fait d'ensemencer des sols avec des cellules végétatives de Bacillus anthracis a fourni des taux de récupération similaires à ceux obtenus pour Streptomyces. De plus, les taux de récupération d'ADN à partir du sol n°5 ont augmenté après traitement par l'ARN également pour cet inoculum.
Exemple 2 : Construction d'une banque d'ADN de faible poids moléculaire (<10 kb) à partir d'un sol contaminé par du lindane : clonage et expression du gène linA
Cet exemple décrit la construction d'une librairie d'ADN du sol dans E. coli. Il permet de démontrer le clonage et l'expression de gènes de petite taille issus d'une microflore non cultivable . Le lindane est un pesticide organochloré, récalcitrant à la dégradation et persistant dans l'environnement. En aérobie, sa biodégradation est catalysée par une déhydrochlorinase, codée par le gène linA, permettant de transformer le lindane en 1 ,2,4- trichlorobenzène. Le gène linA n'a été identifié que parmi deux souches isolées du sol : Sphingomonas paucimobilis, isolé au Japon (Seeno et Wada 1989, Imai et al 1991 , Nagata et al 1993) et Rhodanobacter lindaniclasticus isolé en France (Thomas et al 1996, Nalin ét al 1999).
Pourtant le potentiel de dégradation du lindane, mis en évidence par dosage des ions chlorures libérés et amplification par PCR du gène linA à partir de sols ayant été en contact ou non avec du lindane, semble être répandu plus largement dans l'environnement (Biesiekierska-
Galguen, 1997).
1. Extraction directe d'ADN de sol
Les sols secs sont broyé pendant 10 minutes dans un broyeur à force centrifuge Restch équipé 6 billes de tungstène. 10 grammes de sol broyé sont mis en suspension dans 50 ml de tampon TENP pH 9 (Tris 50 mM, EDTA 20 mM, NaC1 100 mM, polyvinylpolypirrolidone 1% w/v), et homogénéisés au vortex pendant 10 min.
Après centrifugation de 5 minutes, 4000 g à 4°C, le surnageant est précipité à l'acétate de sodium (3M, pH 5.2) et à l'isopropanol, pour être repris dans du tampon TE stérile (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0). L'ADN extrait est ensuite purifié sur colonne de tamisage moléculaire S400 (Pharmacia) et sur colonne échangeuse d'ions Elutip d (Schleicher et Schuell), selon les instructions des fabricants, puis conservé dans du TE.
2. Construction de la banque d'ADN extrait du sol dans le vecteur pBluescript SK-
Le vecteur pBluescript SK- et l'ADN extrait du sol sont chacuns digérés par les enzymes Hind\\\ et BamHI (Roche), à raison de 10 unités d'enzymes pour 1 μg d'ADN (incubation 2 heures à 37°C). Les ADN sont ensuite ligués par action de la T4 DNA ligase (Roche), une nuit à 15°C, à raison d'une unité d'enzyme pour 300 ng d'ADN (environ 200 ng d'ADN insert et 100 ng de vecteur digéré). Les cellules d'Escherichia coli électrocompétentes, ElectroMAX DH10B ™ (Gibco BRL) sont transformées par le mélange de ligation (2 μl) par électroporation (25 μF, 200 et 500 Ω, 2,5 kV) (Biorad Gène Puiser).
Après une heure d'incubation dans le milieu LB, les cellules transformées sont diluées de façon à obtenir environ 100 colonies par boîte puis sont étalées sur milieu LB (10 g/l Tryptone, 5 g/l extrait de levure, 5 g/ NaCI) additionné d'Ampiciline (100 mg/l), de γ-HCH (500 mg/l), de X-gal 60 mg/l (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-galactoside), et d'IPTG 40 mg/l (isopropylthio-β-D-galactoside), et incubées une nuit à 37°C. Le γ-hexachlorocyclohexane (Merck-Schuchardt) étant insoluble dans l'eau, une solution à 50 g/l est préparée dans du DMSO (dimethyl sulfoxyde) (Sigma).
Une banque de 10 000 clones a ainsi été obtenue.
3.Clonage et expression du gène linA
Le criblage de la banque s'effectue par visualisation d'un halo de dégradation du lindane autour de la colonie (le lindane précipitant dans les milieux de culture). Sur 10 000 clones criblés, 35 présentaient ainsi une activité de dégradation du lindane. La présence du gène linA chez ces clones a pu être confirmée par PCR grâce à des amorces spécifiques, décrites par Thomas et al (1996). Des digestions réalisées sur les inserts ainsi que sur les produits d'amplification ont montré des profils identiques entre tous les clones criblés et le témoin de référence, R. lindaniclasticus. Les clones portant le gène linA présentaient également un insert de même taille (environ 4 kb).
Il ainsi pu être démontré que l'ADN du sol pouvait être clone et exprimé chez un hôte hétérologue : E. coli, et que des gènes issus d'une microflore difficilement cultivable pouvaient être exprimés. Des banques réalisées à partir de digestion partielle d'ADN extrait du sol par des enzymes de restriction telles que Sau3A\ sont donc aussi envisageables. EXEMPLE 3:
Procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol, comprenant une étape d'extraction indirecte de l'ADN.
1. MATERIEL ET METHODES.
1.1 Extraction de la fraction bactérienne du sol.
5g de sol sont dispersés dans 50 ml de NaCI 0.8% stérile, par broyage au Waring Blender pendant 3 x 1 minute, avec refroidissement dans la glace entre chaque broyage, les cellules bactériennes sont alors séparées des particules du sol par centrifugation sur un coussin de densité de Nycodenz (Nycomed Pharma AS, Oslo, Norvège). Dans un tube à centrifugation, 11 ,6 ml d'une solution de Nycodenz de densité de 1.3 g. ml"1 (8g de Nycodenz suspendu dans 10 ml d'eau stérile) sont placés en dessous de 25 ml de la suspension de sol précédemment obtenue. Après centrifugation à 10.000 g dans un rotor à godets mobiles (rotor TST 28.38, Kontron) pendant 40 minutes à 4°C, l'anneau cellulaire, se situant à l'interphase de la phase aqueuse et de la phase Nycodenz, est prélevé, lavé dans 25 ml d'eau stérile et centrifugé à 10.000 g pendant 20 minutes. Le culot cellulaire est ensuite repris dans une solution Tris 10 mM; EDTA 100 mMn pH 8.O. Préalablement à la dispersion du sol au Waring Blender, une étape d'enrichissement du sol dans une solution d'extrait de levure peut être incluse afin de permettre notamment la germination des spores bactériennes du sol. 5 g de sol sont alors incubés dans 50 ml d'une solution stérile de NaCI 0.8% - extrait de levure 6%, pendant 30 minutes à 40°C. L'extrait de levure est éliminé par centrifugation à 5000 rpm pendant 10 minutes afin d'éviter la formation de mousse durant le broyage.
1.2 Lyse des cellules bactériennes du sol. - Lyse des cellules en milieu liquide et purification sur gradient de chlorure de césium.
Les cellules sont lysées dans une solution Tris 10 mM, EDTA 100 mM, pH 8.0 contenant 5 mg.ml'1 de lysozyme et 0.5 mg.ml"1 d'achromopeptidase pendant 1 heure à 37°C . Une solution de lauryl sarcosyl (1 % final) et de protéinase K (2 mg.ml"1) est ensuite ajoutée et incubée à 37°C pendant 30 minutes. La solution d'ADN est alors purifiée sur un gradient de densité de chlorure de césium par centrifugation à 35 000 rpm pendant 36 heures sur un rotor Kontron 65.13. Le gradient de chlorure de césium employé est un gradient à 1g/ml de CsCI, possédant un indice de réfraction de 1,3860 (Sambrook et al., 1989).
- Lyse des cellules après inclusion dans un bloc d'agarose.
Les cellules sont mélangées à un volume égal d'agarose à 1.5% (poids/volume) Seaplaque (Agarose Seaplaque FMC Products. TEBU, Le Perray en Yvelines, France), à bas point de fusion et coulées dans un bloc de 100 μl. Les blocs sont ensuite incubés dans une solution de lyse : EDTA 250 mM, saccharose 10.3%, lysozyme 5 mg.ml"1 et achromopeptidase 0.5 mg.ml"1 à 37°C pendant 3 heures. Les blocs sont alors lavés dans une solution de Tris 10 mM - EDTA 500 mM et incubés une nuit à 37°C dans de l'EDTA 500 mM contenant 1 mg.ml'1 de protéinase K et du lauryl sarcosyl 1 %. Après plusieurs lavages dans du Tris-EDTA, les blocs sont conservés dans de l'EDTA 500 mM.
La qualité des ADN ainsi extraits est contrôlée par électrophorèse en champs puisés. La quantité d'ADN extrait a été évaluée sur gel d'électrophorèse par rapport à une gamme étalon d'ADN de thymus de veau.
1.3 Caractérisation moléculaire de l'ADN extrait du sol.
Les ADN extraits du sol sont caractérisés par hybridation PCR, méthode qui consiste à amplifier dans un premier temps les ADNs à l'aide d'amorces situées sur des régions universellement conservées du gène de l'ARNr16S, puis à hybrider les ADNs amplifiés avec différentes sondes oligonucléotidiques de spécificité connue (tableau 4), dans le but de quantifier l'intensité du signal d'hybridation par rapport à une gamme étalon externe d'ADN génomique.
Les ADN extraits du sol ainsi que les ADN génomiques extraits de cultures pures sont amplifiés avec les amorces FGPS 612-669 (tableau 1) dans les conditions standard d'amplification par PCR. Les produits d'amplification sont ensuite dénaturés par un volume égal de NaOH 1N, déposés sur une membrane de Nylon (GeneScreen Plus, Life Science Products) et hybrides avec une sonde oligonucléotidique marquée à son extrémité par du g32P ATP par action de la T4 polynucléotide kinase. Après préhybridation de la membrane dans une solution de 20 ml contenant 6 ml de SSC 20X, 1 ml de solution de Denhardt, 1 ml de SDS 10% et 5 mg d'ADN hétérologue de sperme de saumon, les hybridations sont conduites durant une nuit à la température définie par la sonde. Les membranes sont lavées deux fois dans du SSC 2X pendant 5 minutes à température ambiante, puis une fois dans du SSC 2X SDS 0,1% et une seconde fois dans du SSC 1X, SDS 0,1% pendant 30 minutes à la température d'hybridation. Les signaux d'hybridation sont quantifiés à l'aide du logiciel Molecular Analyst (Biorad, Ivry sur Seine, France) et les quantités d'ADN sont estimées par interpolation des courbes étalons obtenues à partir des ADN génomiques.
2. RESULTATS ET DISCUSSION
2.1 Extraction et lyse de la fraction bactérienne du sol.
La séparation des cellules microbiennes des particules du sol, préalablement à l'extraction de l'ADN, est une alternative présentant de nombreux avantages par rapport aux méthodes d'extraction directe de l'ADN dans le sol. En effet, l'extraction de la fraction microbienne limite la contamination de l'extrait d'ADN par de l'ADN extracellulaire présent librement dans le sol ou par de l'ADN d'origine eucaryote. Mais surtout, l'ADN extrait de la fraction microbienne du sol présente des fragments de plus longue taille et une meilleure intégrité que l'ADN extrait par lyse directe JACOBSON et RASMUSSEN (1992). De plus, la séparation des particules de sol permet d'éviter une contamination de l'extrait d'ADN par des composés humiques et phénoliques, composés pouvant, par la suite, nuire gravement aux efficacités de clonage.
Une des étapes déterminantes pour l'extraction des cellules du sol est la dispersion de l'échantillon de sol afin de dissocier les cellules adhérant à la surface ou à l'intérieur des agrégats de particules de sol. Trois cycles de broyage successifs d'une minute chacun permettent d'obtenir une meilleure efficacité d'extraction des cellules ainsi qu'une plus grande quantité d'ADN récupéré, par rapport à un unique cycle de broyage d'une minute 30.
Le tableau 5 rapporte les efficacités d'extraction obtenues après centrifugation sur gradient de Nycodenz , sur la microflore totale viable (dénombrée par microscopie après coloration à l'acridine orange), sur la microflore totale cultivable (dénombrée sur milieu solide Trypticase-Soja 10%), et sur la microflore d'actinomycètes cultivables sur milieu HV agar (après incubation à 40°C dans une solution d'extrait de levure 6% -SDS 0,05% afin de provoquer la germination des sprores). D'autre part, l'ADN extrait a été quantifié soit après une lyse des cellules en milieu liquide (sans purification sur gradient de chlorure de césium) soit après une lyse des cellules incluses dans un bloc d'agarose (après digestion de l'agarose par une b-agarase).
Les résultats montrent que plus de 14% de la microflore tellurique totale est récupéré par cette méthode (soit 2 108 cellules par gramme de sol), et que la microflore totale cultivable ne représente qu'à peine 2% de la population microbienne totale.
D'autre part, la quantité d'ADN extrait des cellules est de 330 ng par gramme de sol sec. En estimant le contenu d'ADN par cellule microbienne du sol entre 1.6 et 2.4 fg, et compte tenu de la quantité de cellules extraites (2 108 cellules par gramme de sol), on peut estimer que la quasi-totalité des cellules ont été lysées et qu'ainsi la lyse n'apporte pas d'important biais à cette approche.
Les électrophorèses en champs puisés ont montré que l'ADN du sol extrait après gradient de Nycodenz et de CsCI pouvait atteindre une taille de 150 kb et que la lyse en bloc d'agarose permettait d'extraire des fragments supérieurs à 600kb. Ces résultats confirment l'intérêt de cette approche indépendante de la culture pour la construction de banques d'ADN de l'environnement, en se présentant comme une alternative aux méthodes directes d'extraction d'ADN.
2.2 Caractérisation moléculaire de l'ADN extrait du sol.
Le but de la caractérisation moléculaire de l'ADN extrait du sol est d'obtenir des profils représentant les proportions des différents taxons bactériens présents dans l'extrait d'ADN. Il s'agissait également de connaître les biais d'extraction induits par la séparation préalable de la réaction cellulaire du sol, en comparaison avec une méthode d'extraction directe faute de visualisation directe de la diversité microbienne présente dans les sols. En effet, peu d'informations ont été rassemblées sur l'extraction des cellules sur gradient de Nycodenz en fonction de leur structure morphologique (diamètre des cellules, formes filamenteuses ou sporulées).
Les méthodes jusqu'ici en place étaient basées sur des: hybridations quantitatives utilisant des sondes oligonucléotidiques spécifiques à différents groupes bactériens, appliqués directement d'ADN extrait de l'environnement. Malheureusement, cette approche n'est pas très sensible et ne permet pas de détecter des genres ou des groupes taxonomiques présents en faible abondance AMANN (1995). - PCR quantitatives telles que la MPN-PCR (Most Probable
Number) SYKES et al. (1992) ou la PCR quantitative par compétition DIVIACCO et al. (1993). Les inconvénients respectifs de chacune de ces approches sont (i) la lourdeur d'utilisation du fait de la multiplication des dilutions et des répétitions qui rend la technique inappropriée pour un grand nombre d'échantillons ou de couples d'amorces, et (ii) la nécessité de construire un compétiteur spécifique à l'ADN cible et n'induisant pas de biais dans la compétition.
La méthode mise en place selon la présente invention consiste à amplifier universellement un fragment de 700 pb à l'intérieur de la séquence d'ADNr 16S, à hybrider cet amplifiât avec une sonde oligonucléotidique de spécificité variable (au niveau du règne, de l'ordre, de la sous classe ou du genre) et à comparer l'intensité d'hybridation de l'échantillon par rapport à une gamme étalon externe. L'amplification préalable à l'hybridation permet de quantifier des genres ou des espèces de micro-organismes peu abondants. De plus, l'amplification par des amorces universelles permet, lors de l'hybridation, d'utiliser une large série de sondes oligonucléotidiques. Elle permet de comparer entre eux différents modes de lyse (extraction directe ou indirecte) sur des groupes taxonomiques bien définis. Les résultats sont rassemblés dans le tableau 6.
Ils montrent des profils similaires entre les deux méthodes d'extraction (directe et indirecte). Ainsi, il apparaît que l'extraction préalable de la fraction microbienne tellurique n'introduit pas de réels biais parmi les taxons testés. La seule différence significative entre les deux approches d'extraction semblerait être la plus grande abondance de séquences d'ADNr appartenant aux γ protéobactéries dans l'extrait par la méthode d'extraction indirecte.
De plus, un effet significatif de l'incubation de l'échantillon de sol dans une solution d'extrait de levure est observé sur les populations sporulées du sol (Gram+, bas pourcentage de GC et Actinomycètes).
Cette étape provoque la germination des spores, et permet d'une part certainement une meilleure récupération de ce type de cellules et d'autre part une plus grande efficacité de la lyse sur des cellules en germination.
Cette approche permet une analyse semi-quantitative, ciblée sur les principaux taxons définis à partir de micro-organismes cultivés et habituellement retrouvés dans les sols. Seuls des outils moléculaires permettent d'estimer l'importance des différents taxons, les méthodes de mise en culture étant trop restrictives et dépendantes de la spécificité du milieu utilisé. Les résultats montrent qu'une grande part de la population microbienne n'est pas représentée dans les groupes phylogénétiques décrits, mettant ainsi en évidence l'existence de nouveaux groupes composés de micro-organismes non cultivés jusqu'à présent, ou non cultivables. Ainsi, de nouvelles sondes peuvent être définies à partir de séquences déterminées à partir d'ADN extrait du sol (nouveaux phylums composés de micro-organismes non cultivés, LUDWIG et al. (1997) afin d'obtenir une image plus exacte de la composition de l'extrait d'ADN.
Exemple 4 : - CONSTRUCTION DU COSMIDE POS 700I Caractéristiques de POS 700I:
Réplicatif chez E. coli I ntég ratif chez Streptomyces
Sélectionnable chez E. coli AmpR, HygroR et Streptomyces HygroR
Les propriétés du cosmide permettent d'insérer de grands fragments d'ADN entre 30 et 40kb. II comprend
1 - Le promoteur inductible tipA de Streptomyces lividans
2 - Le système d'intégration spécifique de l'élément pSAM2
3 - Le gène de résistance à l'hygromycine 4- le cosmide pWED1 , dérivé de pWED15
1) - Le promoteur inductible du gène tip A de S. lividans
Le gène tipA code une protéine de 19 KD dont la transcription est induite par l'antibiotique thiostrepton ou nosiheptide. Le promoteur de tipA est bien régulé: induction en phase exponentielle et en phase stationnaire (200X) Murakami T, Holt TG, Thompson CJ. J. Bacteriol
1989 ;171 :1459-66
2) - Le gène de résistance à l'hygromycine
- Hygromycine: antibiotique produit par S. hygroscopicus
- Le gène de résistance code une phosphotransfèrase (hph)
- Le gène utilisé provient d'une cassette construite par Blondelet et al dans laquelle le gène hyg est sous contrôle de son propre promoteur et du promoteur plac inductible par l'IPTG Blondelet-Rouault et al ; .
3) - Le système d'intégration site-spécifique
L'élément pSAM2 s'intègre dans le chromosome par un mécanisme d'intégration site-spécifique. La recombinaison a lieu entre deux séquences identiques de 58 pb présentes sur le plasmide (attP) et sur le chromosome (atfB). Le gène int, situé à proximité du site aftP, est impliqué dans l'intégration site-spécifique de pSAM2, et son produit présente des similitudes avec les intégrases des bactériophages tempérés d'entérobactéries. Il a été démontré qu'un fragment de pSAM2 ne contenant que le site d'attachement attP ainsi que le gène int était capable de s'intégrer de la même manière que l'élément entier. Voir brevet français n°88 06638 du 18/05/1988, ainsi que Raynal A et al. Mol Microbiol 1998 28 :333-42).
4) - Construction du cosmide pOS700l
Etape 1/ Le promoteur TipA a été isolé du plasmide pPM927 (Smokvina et al. Gène 1990; 94:53-9 ) sur un fragment Hindlll-BamHI de 700 paires de bases et clone dans le vecteur pUC18 (Yannish-Perron et al., 1985) digéré par Hindlll/BamHI
Etape 2/ Ce fragment Hindlll-BamHI a ultérieurement été transféré de pUC18 à pUC19 (Yannish-Perron et al., 1985).
Etape 3/ Un insert BamHI-BamHI de 1500 paires de bases portant le gène int et le site attP de pSAM2 a été isolé du plasmide pOSintl , représenté à la Figure 8, (Raynal A et al. Mol Microbiol 1998 28 :333-42) et clone au site BamHI du vecteur précédent (pUC19/TipA), dans l'orientation permettant de mettre le gène int sous contrôle du promoteur TipA. Etape 4/ Le site BamHI situé en 5' du gène int a été supprimé par digestion partielle BamHI puis traitement par l'enzyme Klenow. Un fragment Hindlll-BamHI portant TipA-int-attP a ainsi été isolé de pUC19 et transféré dans pBR322 Hindlll/BamHI.
Etape 5/ La cassette Hygromycine isolée de pHP45Ωhyg (Blondelet- Rouault et al., 1997) sur un fragment Hindlll-Hindlll a été clonée au site Hindlll situé en amont du promoteur TipA.
Etape 6/ Le site Hindlll situé entre la cassette ΩHyg et le promoteur TipA a été supprimé par traitement Klenow après digestion partielle Hindlll.
Etape7/ Le plasmide obtenu à l'issue de l'étape précédente permet d'isoler un fragment unique Hindlll-BamHI, portant tous les éléments ΩHyg/TipA/int attP, qui a été clone après traitement Klenow au site EcoRV du cosmide pWED Le cosmide pWED1 , représenté à la Figure 9, dérive du cosmide pWE15, représenté à la Figure 10 (Wahl GM, et al. . Proc Natl Acad Sci U S A 1987 84:2160-4) par délétion d'un fragment Hpal-Hpal portant le gène Neomycine et l'origine SV40.
Une carte du vecteur pOS 700I est représentée à la Figure 11.
Exemple 5 : Construction de plusieurs cosmides conjugatifs et intégratifs chez Streptomyces, les vecteur pOSV 303. POSV306 et POSV307
5.1 Construction du vecteur pOSV303.
Etant donné que l'empaquetage sélectionne les clones ayant une taille supérieure à 30kb, seuls 10 à 15% des clones ne contiennent pas d'insert, il n'est donc pas vraiment nécessaire d'avoir un système de sélection des recombinants, ce qui permet de construire un vecteur plus petit. Construction:
Etape 1 : le vecteur pOSVOOl
Clonage d'un fragment Pstl-Pstl de 800 paires de bases portant l'origine de transfert OriT du réplicon RK2 (Guiney et al., 1983), dans le plasmide pUC19 ouvert par PstI. Cette étape de clonage permet d'obtenir un vecteur transférable de E. coli à Streptomyces par conjugaison.
La carte du vecteur pOSV 001 est représentée à la Figure 17.
Etape 2 : le vecteur pOSV002
Insertion du marqueur Hygromycine (cassette Ωhyg), et sélectionnable chez Streptomyces, de sorte que le gène conférant la résistance à l'hygromycine soit transféré en dernier ce qui permet de s'assurer du transfert complet du BAC avec l'insert d'ADN du sol. Clonage de la cassette Hygromycine isolée de pHP45Ωhyg sur un fragment Hindlll-Hindlll portant le gène de résistance à l'Hygromycine.. Ce fragment est clone au site PstI (position 201) du vecteur pOSVOOl . Ce site PstI a été choisi, compte tenu du sens du transfert, pour que le marqueur Hygro soit le dernier transféré lors de la conjugaison. Les extrémités PstI et Hindlll sont rendues compatibles après traitement par le fragment Klenow de l'ADN polymérase permettant de générer des "bouts francs". L'orientation du fragment Ωhyg est déterminée en fin de construction.
La carte du vecteur pOSV002 est représentée à la Figure 18.
Etape 3 : le vecteur pOSV010
Le fragment Xbal-Hindlll isolé du plasmide pOSV002 et contenant le marqueur de résistance à l'hygromycine et l'origine de transfert est clone dans le plasmide pOSintl digéré par Xbal et Hindlll. L'orientaion des sites est telle que le marqueur hygromycine sera toujours transféré en dernier.
Le plasmide pOSintl , représenté à la Figure 8, a été décrit dans l'article de Raynal et al.( Raynal A et al. Mol Microbiol 1998 28 :333-42).
Cette construction permet l'expression de l'intégrase chez E. coli et chez Streptomyces. Etape 4 : insertion du site " cos "
Le principe est d'insérer un site " cos " dans le plasmide pOSV010 permettant l'empaquetage dans le plasmide pOSV010, représenté à la Figure 12.
L'obtention du fragment " cos " est représentée à la Figure 13.
Ce fragment est obtenu par PCR. A partir d'un fragment portant les extrémités cohésives (cos) de λ (bactériophage lambda ou cosmide pHC79), une amplification par PCR est réalisée à l'aide des oligonucléotides correspondant aux séquences -50/+130 par rapport au site cos. Ces oligonucléotides contiennent en outre les sites de clonage Nsil, compatible PstI, Xhol, compatible Sali, EcoRV, " bout franc ".
L'addition des sites rares Swal et Pacl permet d'isoler et/ou de cartographier l'insert clone.
Le fragment PCR est borné par un site PstI à l'extrémité 5' et par un site Hincll à l'extrémité 3', permettant le clonage dans le vecteur pOSV010 (Figure 12) prélablement digéré par les enzymes Nsil et EcoRV, provoquant la délétion du répresseur laclq. La carte du vecteur pOSV303 est représentée sur la Figure 14.
Le vecteur pOSV303, contient des sites de clonage tels que le site Nsil, . compatible PstI, le site Xhol, compatible Sali ou encore le site EcoRV pour l'obtention de " bouts francs ".
5.2 Construction du vecteur pOSV306
Etape 1: Construction du vecteur POSV308.
Le vecteur pOSV308 a été construit selon le procédé illustré à la figure 27. Un fragment de 643 pb contenant la région cos a été amplifié à l'aide du couple d'amorces de séquences SEQ ID N°107 et
SEQ ID N°108 à partir du vecteur cosmide pHc79 décrit par HOHM B and COLLINS (1980). Ce fragment nucléotidique amplifié a été clone directement dans le vecteur pGEMT-easy commercialisé par la Société PROMEGA, comme illustré à la figure 27 afin de produire le vecteur pOSV308.
Etape 2: Construction du vecteur pOSV306.
Le vecteur pOSV010 a été construit comme décrit à l'étape 3 de construction du vecteur pOSV303, comme décrit au paragraphe 5.1 du présent exemple. Le vecteur pOSVIO a été digéré par les enzymes EcoRV et Nsil afin d'exciser un fragment de 7874 pb qui a été ultérieurement purifié, comme cela est illustré à la figure 28.
Puis, le vecteur pOSV308 obtenu à l'étape 1) ci-dessus a été soumis à une digestion par les enzymes EcORV et PstI afin d'exciser un fragment de 617 pb, qui a été ultérieurement purifié.
Puis, le fragment cos de 617 pb obtenu à partir du vecteur pOSV308 a été intégré par ligation dans le vecteur pOSVI O, afin d'obtenir le vecteur pOSV306, comme cela est illustré à la figure 28.
5.3 Construction du vecteur POSV307.
Le cosmide pOSV307 contient toujours le gène Laclq, afin d'améliorer la stabilité du cosmide dans Streptomyces, par exemple dans la souche S17-1 de Streptomyces. Afin de construire le vecteur pOSV307, on a soumis le vecteur pOSV010 à une digestion par l'enzyme Pvull, pour obtenir un fragment de 8761 pb qui a été purifié, puis déphosphorylé.
Ensuite, le vecteur pOSV308, tel qu'obtenu comme décrit à l'étape 1) du paragraphe 5.2 ci-dessus, a été digéré par l'enzyme EcoRI afin d'obtenir un fragment de 663 pb, qui a été ensuite purifié et traité par l'enzyme de Klenow.
Le fragment nucléotidique ainsi traité a été intégré dans le vecteur pOSV010 après ligation afin d'obtenir le vecteur pOSV307, comme illustré à la figure 29. Exemple 6 : - Construction du cosmide réplicatif navette E. coli- Streptomvces pOS700R.
Les fragments du plasmide pEI16 (Volff et al., 1996) représenté à la Figure 15 ont été isolés et traités par Klenow. Ces fragments contiennent les séquences nécessaires à la replication et à la stabilité provenant du plasmide SCP2.
Ces deux fragment sont insérés séparément dans le site
EcoRV du cosmide pWED1 conduisant à 2 clones différents. La cassette Hygromycine isolée de pHP45Ωhyg sur un fragment Hindlll-Hindlll a été clonée au site Hindlll des cosmides pWED1 contenant l'insert ScP2 sous forme de fragments Pstl-EcoRI ou
Xbal. Elle confère une résistance à l'Hygromycine sélectionnable à la fois chez E. coli et chez Streptomyces. Transformation de S. lividans et détermination de l'efficacité de transformation.
Il est apparu que le cosmide contenant l'insert Xbal était moins stable que celui contenant le fragment PstI EcoRI. C'est donc ce dernier qui a été retenu sous le nom de pOS700R. La carte du vecteur pOS 700R est représentée sur la Figure 16.
Exemple 7: Efficacité de transformation des vecteurs intégratifs (POS700I. et réplicatifs
Possibilités
Rendre la souche de S. lividans résistante au thiostrepton par intégration du plasmide pTO1 portant le marqueur de résistance au thiostrepton
Préparation de protoplastes à partir de S. lividans cultivée en présence de thiostrepton
Avec le vecteur pOS700l, l'efficacité de transformation est d'environ 3000 transformants par μg d'ADN.
Avec le vecteur pOS700R, l'efficacité de transformation est d'environ 30 000 transformants par μg d'ADN. Exemple 8 : Construction d'un vecteur BAC intégratif chez
Streptomyces et conjugatif
Caractéristiques:
Réplicatif chez E. coli
Transférable par conjugaison de E. coli aux Streptomyces
Intégratif chez Streptomyces
Sélectionnable chez E. coli et Streptomyces Capable d'insérer de grands fragments d'ADN ; il faut souligner qu'il est nécessaire de disposer d'ADN du sol dont la taille est comprise entre
100 et 300kb et non contaminé par des petits fragments. En effet les petits fragments sont très préférentiellement intégrés.
Doté d'un crible permettant de sélectionner les plasmides portant un insert. Ce crible permet en éliminant les vecteurs refermés sur eux même et non digérés de travailler avec un rapport plus élevé entre vecteur et DNA à insérer ce qui permet d'avoir une meilleure efficacité de clonage pour constituer des banques.
Construction:
Etape 1 : le vecteur pOSVOOl
Clonage d'un fragment Pstl-Pstl de 800 paires de bases portant l'origine de transfert OriT du replicon RK2 (Guiney et al., 1983), dans le plasmide pUC19 ouvert par PstI. Cette étape de clonage permet d'obtenir un vecteur transférable de E. coli à Streptomyces par conjugaison.
La carte du vecteur pOSV 001 est représentée à la Figure 17.
Etape 2 : le vecteur pOSV002
Insertion du marqueur Hygromycine (cassette Ωhyg), et sélectionnable chez Streptomyces, de sorte que le gène conférant la résistance à l'hygromycine soit transféré en dernier ce qui permet de s'assurer du transfert complet du BAC avec l'insert d'ADN du sol.
Clonage de la cassette Hygromycine isolée de pHP45Ωhyg sur un fragment Hindlll-Hindlll portant le gène de résistance à l'Hygromycine.. Ce fragment est clone au site PstI (position 201) du vecteur pOSVOOl . Ce site PstI a été choisi, compte tenu du sens du transfert, pour que le marqueur Hygro soit le dernier transféré lors de la conjugaison. Les extrémités PstI et Hindlll sont rendues compatibles après traitement par le fragment Klenow de l'ADN polymérase permettant de générer des "bouts francs". L'orientation du fragment Ωhyg est déterminée en fin de construction.
La carte du vecteur pOSV002 est représentée à la Figure 18.
Etape 3 : le vecteur pOSVOIQ
Le fragment Xbal-Hindlll isolé du plasmide pOSV002 et contenant le marqueur de résistance à l'hygromycine et l'origine de transfert est clone dans le plasmide pOSintl digéré par Xbal et Hindlll.
L'orientation des sites est telle que le marqueur hygromycine sera toujours transféré en dernier.
Le plasmide pOSintl , représenté à la Figure 8, a été décrit dans l'article de Raynal et al.( Raynal A et al. Mol Microbiol 1998 28 :333-42). Cette construction permet l'expression de l'intégrase chez E. coli et chez Streptomyces.
Etape 4 : le vecteur POSV014
Addition d'une "cassette" permettant à terme de sélectionner dans la construction finale les plasmides ayant insérés de l'ADN étranger.
Cette "cassette" porte le gène codant pour le répresseur Cl du phage λ et le gène conférant la résistance à la tétracycline. Ce gène porte dans sa région 5' non codante la séquence cible du répresseur. L'insertion d'ADN dans le site Hindlll situé dans la séquence codante de Cl conduit à la non production du répresseur et donc à l'expression de la résistance à la tétracycline.
Elle est portée par le plasmide pUN99 décrit dans l'article : Nilsson et al . (Nucleic Acids Res 1983, 11 :8019-30)
Un fragment Pvull-Hindlll isolé de pOSV010 et contenant les séquences
Int, attP, Hygro et oriT est clone au site Mscl de pUN99 .
La carte du vecteur pOSV014 est représentée sur la Figure 19.
Etape 5 : le vecteur pOSV 403, vacteur BAC intégratif et conjugatif
Cette dernière étape de clonage dans pBAC11 (représenté à la Figure. 20) permet de conférer au plasmide final des caractéristiques de BAC (Bacterial Artificial Chromosome), en particulier l'aptitude à accepter des inserts d'ADN de très grande taille.
Le fragment Pstl-Pstl du vecteur pOSV014 portant l'ensemble des éléments et fonctions décrits précédemment est clone dans le pasmide pBAC11 (pBeloBACH) digéré par Notl. Les extrémités sont rendues compatibles pat traitement avec l'enzyme de Klenow. La carte du vecteur pOSV403 est représentée sur la Figure 21. Le schéma de la Figure 21 indique l'orientation retenue.
Etape 6 :
Le vecteur pOSV403 contient les sites Hindlll et Nsil. Le site Nsil est assez rare chez Streptomyces et présente l'avantage d'être compatible avec PstI. En revanche, le site PstI est fréquent chez
Streptomyces et peut être utilisé pour effectuer des digestions partielles.
Les clones recombinants portant un insert clone dans le répresseur Cl, et donc inactivant ce répresseur deviennent résistants à la tétracycline. Etant donné que les BACs ne sont présents qu'à raison d'une copie par cellule, il faut sélectionner les clones recombinants avec une dose plus faible de tétracycline que la dose habituelle de 20 μg/ml, par exemple avec une dose de 5 μg/ml. Dans ces conditions il n'y a aucun bruit de fond. Il est aussi possible d'utiliser un système développé et commercialisé par la société InVitrogen, dans lequel l'insertion d'ADN dans le vecteur inactive un inhibiteur de la gyrase dont l'expression est toxique pour E. coli. Le fragment est préférentiellement isolé à partir du vecteur pZErO-2 (http://www.invitrogen.com/).
Exemple 9 : Construction d'une bangue de S. alboniger dans les 2 cosmides intégratif (pOS700l) et réplicatif .pOS700R_
1) - Construction de la Banque
Pour évaluer l'efficacité du système de clonage, la voie de biosynthèse de la puromycine de Streptomyces alboniger, a été clonée dans les deux cosmides navettes pOS700l et pOS700R. Les gènes de la voie de biosynthèse de la puromycine sont portés par un fragment d'ADN BamHI d'environ 15 Kb.
L'ADN génomique de Streptomyces alboniger a été isolé. 90% de cet
ADN possède un poids moléculaire compris entre 20 et 150 Kb, déterminé par électrophorèse en champ puisé. Les deux cosmides ont été digérés par l'enzyme BamHI (site unique de clonage).
Les conditions de digestion partielle BamHI de l'ADN génomique ont été déterminées (50 μg d'ADN et 12 unités d'enzyme, 5 minutes de digestion). Après vérification de la taille par électrophorèse en gel d'agarose, l'ADN partiellement digéré a été introduit dans les vecteurs. Dans la ligation, 15 μg d'ADN génomique + 2 μg du vecteur intégratif ou 5 μg du vecteur réplicatif ont été utilisés.
Chaque mélange de ligation a été utilisé pour l'encapsidation in vitro de l'ADN dans les têtes de bactériophage lambda. Les mélanges d'encapsidation (0,5ml) ont été titrés (Vecteur intégratif pOS700l = 7,5 x
105 cosmides/ml, Vecteur réplicatif≈ 5 x 104 cosmides/ml).
Les cosmides ont été utilisés pour transfecter E. coli et générer ainsi deux banques d'environ 25000 clones résistant à l'ampicilline.
L'ADN de l'ensemble de ces clones a été isolé et quantifié. Pour tester les banques, plusieurs clones ont été choisis, l'ADN purifié et a été digéré par BamHI, afin de vérifier la présence et la taille des inserts. Les clones testés contiennent entre 20 et 35 Kb d'insert de S. alboniger.
2) - Identification des clones contenant la voie de biosynthèse de la puromycine
Les clones susceptibles de contenir la voie complète de biosynthèse de la puromycine ont été identifiés par hybridation avec une sonde correspondant au gène de résistance à la puromycine, le gène pac de 1 ,1 kb. (Lacalle et al. Gène 1989;79, 375-80 )
Banque faite dans le Vecteur Intégratif pOS 7001:
Parmi 2000 clones analysés, 9 clones ont hybride avec la sonde et ils contiennent des inserts d'environ 40 kb.
Banque faite dans le Vecteur réplicatif pOS 700R:
Parmi 2000 clones analysés, 12 clones ont hybride avec la sonde; ils contiennent des inserts d'environ 40 kb.
En utilisant les données publiées par Tercero et al. (J Biol Chem. 1996; 271, 1579-90), les clones contenant la totalité de la voie de biosynthèse ont été identifiés, après hybridation avec des sondes appropriées. Certains cosmides intégratifs et replicatifs présentent après digestion Clal-EcoRV un fragment de 12360 paires de bases, ce qui laisse supposer un insert contenant la totalité de la voie de biosynthèse de la puromycine.
4) - Vérification de la production de puromycine par les clones résistants (Rhône-Poulenc). a) Matériels et Méthodes
Souches et conditions de culture :
Trois clones résistants ont été sélectionnés pour vérifier la production de puromycine. Ils correspondent aux recombinants de S. lividans contenant un insert dans le vecteur intégratif pOS700l (G 20) ou un insert dans le vecteur réplicatif (G21 et G22).
Des souches de référence ont été utilisées pour s'assurer que les milieux de culture utilisés permettaient cette production. Il s'agit de la souche sauvage S. alboniger ATCC 12461 , productrice de puromycine et de la souche recombinante S. lividans contenant le cluster complet de la puromycine clone dans le plasmide pRCP11 (Lacalle et al, 1992, the EMBO journal, 11 , 785-792) (G23).
Les souches sont ensemencés dans un milieu de culture dont la composition est la suivante : Peptone bactériologique Organotechnie 5 g/l de milieu final
Extrait de levure Springer 5
Extrait de viande Liebig 5
Glucose Prolabo 15
CaCO3 (1) Prolabo 3 NaCI Prolabo 5
Agar (2) Difco 1
(1) Les 3g de carbonate sont mélangés à 200ml d'eau distillée puis stérilisés à part. L'addition se faisant après stérilisation. (2) L'agar est préalablement fondu dans 100ml d'eau distillée avant d'être ajouté aux autres ingrédients du milieu
pH ajusté à 7,2 avant stérilisation stérilisation 25 minutes à 121 °C 50 μg/l d'hygromycine et 5 μg/l de thiostrepton sont ajoutés au milieu après stérilisation de façon à maintenir une pression de sélection des clones contenant un insert grâce au gène marqueur présent sur le vecteur ( le gène de résistance au thiostrepton étant porté par le plasmide pRCP11).
50 ml de milieu de culture liquide, répartis en erlenmeyers de 250 ml, sont ensemencés avec 2 ml de suspension aqueuse de spores et de mycélium de chacune des souches. Les cultures sont incubées pendant 4 jours à 28°C avec une agitation de 220 trs/mn.50 ml de milieux de production, répartis en erlenmeyers de 250 ml, sont ensuite ensemencés avec 2 ml de ces pré-cultures. Le milieu de production utilisé est un milieu industriel optimisé pour la production de pristinamycine (milieu RPR 201). Les cultures sont incubées à 28°C, avec une agitation de 220trs/mn. Après différents temps d'incubation, un erlenmeyer de chaque culture est amené à pH 11 puis extrait par 2 fois 1 volume de dichlorométhane. La phase organique est concentrée à sec sous pression réduite, puis l'extrait est repris par 10 μl de méthanol. 100 μl de la solution méthanolique sont analysés en CLHP munie d'un détecteur à barrette de diodes dans un système gradient eau-acétonitrile 0,05% TFA VA sur colonne C18 pour la détection de la puromycine.
b) Résultats
Les analyses HPLC comparatives à partir des cultures des différentes souches montrent la production de puromycine dans la culture de la souche sauvage à partir de 24 h d'incubation. Une production, bien que plus faible, est aussi nettement détectée à partir de 48 h dans la culture du clone G20 contenant le cosmide pOS700l (figure 23). La puromycine a également été détecté à l'état de trace dans le clone G23 contenant l'opéron complet codant pour le composé dans le plasmide pRCPH . Néanmoins, aucune production n'a été observée dans les cultures des clones G21 et G22 contenant le cosmide pOS700R. Les résultats sont reportés sur la Figure 23. c) Conclusions
Les résultats obtenus permettent de démontrer l'efficacité du système de clonage développé dans le cosmide pOS700l pour exprimer chez un hôte hétérologue tel que S. lividans une voie de biosynthèse complète sous le contrôle de séquences régulatrices qui lui sont propres.
D'autre part, ces données valident également le criblage des banques obtenues sur la base de la résistance des clones à la puromycine puisqu'il a conduit à identifier parmi un petit nombre de clones, un recombinant capable d'exprimer la voie de biosynthèse associée au gène de résistance. L'absence de production de puromycine chez les autres clones peut probablement s"expliquer par le clonage d'une partie seulement de l'opéron contenant le gène de résistance mais dépourvue de certaines séquences de régulation, transduction ou transcription nécessaires à la synthèse du composé.
EXEMPLE 10 : - CLONAGE D'ADN DU SOLDANS DES VECTEURS 1) - Préparation de l'ADN du sol à cloner
Les différents fragments d'ADN doivent être purifiées selon leur destination :
Cosmides
La taille des molécules doit être comprise entre 30 et 40kb. Or , l'ADN extrait du sol est hétérogène en taille et comprend des molécules atteignant 200 ou 300kb. Afin d'homogénéiser les tailles, l'ADN est cassé mécaniquement par passage de la solution à travers une aiguille de 0,4mm de diamètre. Les fragments d'une taille voisine de 30kb ne sont pas affectés par ces passages répétés à travers une aiguille et il n'est donc pas nécessaire de faire une séparation par la taille surtout que l'empaquetage dans les particules élimine automatiquement les inserts courts. BACs
Préparation de l'ADN
L'ADN du sol est séparé par électrophorèse en champ puisé (type CHEF) dans des conditions telles que les fragments compris entre
100 et 300kb sont concentrés dans une bande d'environ 5mm. Ceci est obtenu en réalisant la migration dans un gel à 0,7% d'agarose normal ou 1% d'agarose à bas point de fusion avec un temps de pulsation de 100 secondes pendant 20 heures et à une température de 10°C.
Récupération de l'ADN
Deux méthodes sont utilisées, leur choix dépend de la taille des molécules que l'on veut isoler, soit jusqu'à 150kb soit au dessus.
- Jusqu'à 150kb
La porosité d'un gel à 0,7% d'agarose permet la sortie de l'ADN par électroélution à condition d'absence totale de bromure d'ethidium.
Cet ADN est ensuite manipulé avec des instruments de pipetage à orifice agrandi et hydrophobe pour éviter la fragmentation mécanique des molécules. - Entre 100 et 300 kb
La bande contenant les fragments d'une taille entre 100 et 300kb est découpée. Pour la migration un gel d'agarose à 1 % et à bas point de fusion est utilisé. Cette propriété permet de fondre le gel à une température supportable pour l'ADN de 65°C et de le digérer ensuite par l'agarase (Agarase commercialisée par la société Bôehringer) à une température de 45°C suivant les prescriptions du fournisseur. 2) - Utilisation des cosmides intégratifs pOS700l et replicatifs POS700R
Construction par queues polyA polvT Principe
Un vecteur cosmide, ouvert à un site de clonage quelconque, est modifié aux extrémités 3' en ajoutant un polynucléotide monotone. D'autre part, l'ADN à cloner est modifié aux extrémités 3' en ajoutant un polynucléotide monotone pouvant s'apparier au précédent.
L'association vecteur-fragment à cloner se fait par ces polynucléotides et la séquence cos du vecteur permet l'empaquetage in vitro de l'ADN dans des capsides de phage Lamda.
Préparation du vecteur
Le vecteur utilisé est un vecteur autoréplicatif chez E. coli et intégratif chez Streptomyces.
Pour E. coli, la sélection se fait sur la résistance à l'ampicilline et pour Streptomyces, elle se fait sur la résistance à l'hygromycine . Le cosmide est ouvert à l'un des 2 sites possibles (BamHI ou Hindlll) et les extrémités 3' sont rallongées par du polyA avec de la terminale transferase dans les conditions où le fournisseur de l'enzyme prévoit l'addition de 50 à 100 nucléotides.
Préparation de l'ADN à insérer.
Les extrémités 3' de l'ADN sont rallongées par du polyT avec de la terminale transferase dans les conditions fournissant un allongement comparable à celui du vecteur. Dans les conditions expérimentales décrites par le fabricant les queues polyA polyT sont longues de 30 à 70 bases Assemblage des molécules et encapsidation in vitro.
Pour l'assemblage des molécules, on mélange une molécule de vecteur pour une molécule d'ADN inséré. La concentration de l'ADN en masse est de 500 μg.ml"1.
Le mélange est encapsidé et T'efficacité de transfection dépend de la souche utilisée comme réceptrice et de l'ADN inséré : nulle avec l'ADN test et la souche DH5α, l'efficacité est comparable pour les souches SURE et DH10B ; à l'extraction le rendement en ADN est cependant plus élevé avec la souche DH10B.
Construction par déphosphorylation
L'ADN du sol est mis en bouts francs par élimination des séquences 3' sortantes et remplissage des séquences 5' sortantes. Cette opération est faite avec : enzyme de Klenow, T4 polymérase, les 4 nucléotides triphosphates. Le vecteur cosmidique est digéré par BamHI, puis traité par l'enzyme de Klenow pour le rendre bout franc puis déphosphorylé pour éviter qu'il ne se referme sur lui même. Après ligation, le mélange est encapsidé et transfecté comme précédemment décrit.
3) - Utilisation des pBAC Principe.
Le plasmide pBAC conjugatif et intégratif possède les sites Hindlll et Nsil comme sites de clonage. L'insertion d'une séquence d'ADN à ces sites inactive le répresseur Cl du phage Lambda qui contrôle l'expression du gène de la résistance à la tétracycline. L'inactivation du répresseur rend donc la cellule résistante à cet antibiotique (δμg.ml"1). Le clonage à ces sites est facilité par la modification du vecteur et la préparation de l'ADN à cloner. Préparation du vecteur. Exemple Hindlll
Pour que le vecteur ne se referme pas sur lui-même, le site Hind III est modifié : la première base (A) est remise en place pour former une séquence 5' sortante, qui ne peut pas s'apparier avec ses semblables. L'opération est effectuée par l'enzyme de Klenow en présence de dATP.
Le succès de l'opération est vérifié en effectuant une ligation du vecteur sur lui-même avant et après traitement à l'enzyme de Klenow. A quantité d'ADN testé identique, on obtient 3000 clones avant traitement et 60 après traitement.
Préparation de l'ADN (taille comprise entre 100 et 300kb). Mise en bouts francs de l'ADN.
L'ADN est mis en bouts francs par élimination des séquences 3' sortantes et remplissage des séquences 5' sortantes. Cette opération est faites avec : enzyme de Klenow, T4 polymérase, les 4 nucléotides triphosphates.
Préparation des extrémités-Exemple Hindlll
L'addition de l'ADN sur le vecteur se fait au moyen d'oligo- nucléotides reconnaissant la séquence Hindlll modifiée du vecteur. Ils contiennent des sites de restriction rares pour permettre les clonages ultérieurs (Swal ; Notl). cette technique est dérivée de celle de : Elledge SJ, Mulligan JT, Ramer SW, Spottswood M, Davis RW. Proc Natl Acad Sci U S A 1991 Mar 1 ;88(5):1731-5 Deux oligonucléotides complémentaires sont utilisés : Oligo 1 : 5'-GCπATTTAAATATTAATGCGGCCGCCCGGG-3'
(SEQ ID N°25)
Oligo 2 : 5'-CCCGGGCGGCCGCATTAATATTTAAATA-3' (SEQ ID N°26) Ils sont phosphorylés en 5' par la polynucléotide kinase de T4 en présence d'ATP, après leur hybridation. Cette étape de phosphorylation peut être éliminée en utilisant les oligo-nucléotides déjà phosphorylés. La ligation de cet adaptateur double brin avec l'ADN à insérer dans un vecteur est faite par la ligase de T4 en présence d'un très grand excès d'adaptateur (1000 molécules d'adaptateur pour une molécule d'ADN à insérer), en 15 heures à 14°C. L'excès d'adaptateur est éliminé par électrophorèse sur un gel d'agarose et les molécules d'intérêt sont récupérées du gel par hydrolyse de celui-ci par de l'agarase ou par électroélution.
Ligation vecteur- ADN .
La ligation se fait à 14°C sur 15 heures avec 10 molécules de vecteur pour une molécule d'insert.
Transformation.
La souche réceptrice est la souche DH10B. La transformation se fait par électroporation. Pour exprimer la résistance à la tétracycline, les transformants sont incubés à 37 °C pendant 1 heure en milieu sans antibiotique. La sélection des clones se fait par culture pendant une nuit , sur milieu gélose LB additionné de tétracycline à δμg.ml*1.
Exemple 11 : CONJUGAISON CLONE A CLONE ENTRE E. COLI ET STREPTOMYCES
CONJUGAISON ENTRE E COLI SOUCHE S17.1 CONTENANT PPM803 ET
STREPTOMYCES LIVIDANS TK 21
Introduction
Il est possible d'effectuer des conjugaisons entre E. coli et Streptomyces
(Mazodier et al, 1989). L'adaptation de cette méthode en développant une technique dite en goutte où l'on mélange 10 μl d'une culture de E. coli contenant un vecteur recombinant à une goutte de S. lividans récepteur consiste à réaliser une transformation de clone à clone en s'assurant qu'à la fin de l'opération toute la banque construite dans E. coli est introduite dans S. lividans. Une transformation en vrac amènerait obligatoirement à une multiplication des clones de Streptomyces transformants afin d'être pratiquement sûr que la banque dans E. coli est complètement représentée dans S. lividans. De plus cette méthode est facilement automatisable.
Essais préliminaires
Conjugaison entre E. coli souche S17.1 contenant le vecteur pOSV303 et S. lividans TK21.
Dans ces conditions, on mélange 6 x 106 cellules de E. coli avec 2 x 106 spores pré-germées de S. lividans dans un volume final de 20 μl.
Mise au point de la méthode
Il est connu que l'ADN extrait de certains actinomycètes est modifié et de ce fait ne peut être introduit dans certaines souches de E. coli sans qu'il soit restreint. La souche de E. coli DH10B qui accepte ces ADN n'est pas capable de transférer à Streptomyces un plasmide ne contenant que oriT, et il est donc nécessaire d'en construire une. Il faudrait y introduire par intégration dans le chromosome un dérivé de RP4 capable de fournir en trans toutes les fonctions nécessaires pour assurer le transfert des clones recombinants contenant l'origine de transfert oriT.
Exemple 12 : Construction d'une bangue cosmidique dans E. coli et Streptomyces lividans : Clonage de l'ADN du sol
L'objectif est la construction d'une librairie d'ADN de grande taille issue de l'environnement, sans étape préalable de culture.des microorganismes, dans le but d'accéder aux gènes métaboliques de bactéries (ou de tout autre organisme) que l'on ne sait pas cultiver dans des conditions standard de laboratoire. La procédure décrite a été utilisée pour générer une banque d'ADN dans Escherichia coli utilisant le cosmide navette E. coli-S. lividans pOS700l et de l'ADN extrait et purifié de la fraction bactérienne d'un sol . Cette dernière méthode permet d'obtenir de l'ADN d'une grande pureté et d'une taille moyenne de 40 kb. Aussi, afin d'éviter pour le clonage une digestion partielle de l'ADN extrait, a été adoptée une stratégie alternative basée sur l'utilisation de l'enzyme terminale tranférase qui permet d'ajouter des queues de polynucléotides aux extrémités 3' de l'ADN et du vecteur.
5 μg d'ADN ont été extraits de 60 mg de sol de " la Côte Saint André " selon le protocole décrit à l'exemple 3 et traités avec de la terminale transferase (Pharmacia) pour rallonger les extrémités 3' avec un polynucléotide monotone (poly T) (Exemple 10). Le cosmide intégratif pOS700l est préparé selon le protocole
B1 , Orsay. Après une étape classique de purification en présence de phénol/chloroforme, l'ADN et le vecteur sont assemblés en mélangeant une molécule de vecteur et une molécule d'ADN inséré. Le mélange est ensuite encapsidé dans les têtes de bactériophages lambda (kit Amersham) qui servent à transfecter E. coli DH10B. Les cellules transfectées sont ensuite ensemencées sur milieu LB agar en présence d'ampicilline pour sélection des recombinants résistants à cet antibiotique.
Une banque d'environ 5000 clones d'E. coli résistants à l'ampicilline a été obtenue. Chaque clone a été ensemencé en milieu LB ou TB + ampicilline dans un puits de microplaque (96 puits) et conservé à -80°C .
La séquence aux sites d'insertions des fragments du sol dans le vecteur, pOS700l, générés pendant la construction de la banque a été analysée. Pour cela 17 cosmides de la banques ont été purifié et séquence avec une amorce, seq.5' CCGCGAATTCTCATGTTTGACCG 3', qui hybride entre les site BamHI et le site de clonage Hindlll présente dans le vecteur. Les séquences obtenues ont permis d'estimer que la longueur des queues homopolymériques aux points de jonctions est très variable, entre 13 et 60 poly-dA/dT. Au-delà des queues, les séquences des fragments du sol ainsi générées possèdent un pourcentage en G+C entre 53 et 70 %. Des pourcentages si élevés étaient inattendus, mais des résultas similaires ont été déjà reportés sur des préparation brut d'ADN à partir de sol (Chatzinotas A. et al., 1998).
Une stratégie de " pooling " de 48 ou 96 clones à été utilisée pour l'analyse de la richesse microbienne et métabolique. L'ADN cosmidique extrait à partir de ces " pools " de clones à été utilisé ensuite pour réaliser des expériences de PCR ou d'hybridation.
Exemple 13 : Diversité de l'ADN ribosomigue 16S au sein de l'ADN clone.
a) Matériels et méthodes Les cosmides de la banque sont extraits à partir de pools de clones par lyse alcaline puis sont purifiés sur gradient de chlorure de césium, afin de prélever la bande d'ADN cosmidique sous forme superenroulée et dans le but d'éliminer tout ADN chromosomique d' Escherichia coli pouvant interférer dans l'étude. Après linéarisation des cosmides par action de la nucléase S1
(50 unités, 30 minutes à 37°C), les séquences d'ADNr 16S contenues dans les pools de clones sont amplifiées dans les conditions standard d'amplification, à partir des amorces universelles 63f (5'- CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3') et 1387r (5'- GGGCGGWGTGTACAAGGC-3') définies par MARCHESI et al.(1998). Les produits d'amplification d'environ 1.5 kilobases sont purifiés à partir du kit Qiaquik gel extraction (Qiagen) puis directement clones dans le vecteur pCR II (Invitrogen) chez Escherichia coli TOP10, selon les instructions du fabricant. L'insert est alors amplifié à l'aide des amorces M13 Forward et M13 reverse spécifiques au site de clonage du vecteur pCR II. Les produits d'amplification de taille attendue (environ 1,7 kb) sont analysés par RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) à l'aide des enzymes Cfol, Mspl et BstUI (0,1 unités) afin de sélectionner les clones à séquencer. Les profils de restriction obtenus sont séparés sur gel d'agarose Métaphore 2.5% (FMC Products) contenant 0,4 mg de bromure d'éthidium par ml.
Les séquences d'ADNr 16S sont alors déterminées directement en utilisant les produits PCR purifiés par le kit " Qiaquick gel extraction " à l'aide des amorces de séquençage définies par Normand (1995). Les analyses phylogénétiques sont obtenues en comparant les séquences avec les séquences d'ADNr 16S procaryotes rassemblées dans la base de données Ribosomal Database Project (RDP), version 7,0 MAIDAK et al.(1999) grâce au programme SIMILARITY MATCH, permettant d'obtenir les valeurs de similarité par rapport aux séquences de la base de données.
b) Résultats
Pour déterminer la diversité phylogénétique représentée dans la banque, 47 séquences du gène ARNM6S ont été isolées à partir de pools de 288 clones et ont été séquencées dans leur quasi-totalité. Les résultats sont rapportés dans le tableau 7.
L'analyse des séquences par interrogations des bases de données révèle que la majorité des séquences (>61%) présentent des pourcentages de similarité inférieurs ou égaux à 95% avec des espèces bactériennes identifiées (tableau 7). Sur les 47 séquences analysées, 28 séquences ont pour plus proches voisins des bactéries non cultivées, dont les séquences ont été directement issues d'ADN extrait de l'environnement. La majorité de ces séquences présentent par ailleurs des pourcentages de similarité très faibles (88-95%), 17 séquences sur 28 diffèrent ainsi de plus de 5% par rapport à leurs voisins les plus proches.
Parmi les séquences pouvant être classées dans un groupe phylétique, une majorité de séquences appartiennent à la sous classe a des proteobactéries (18 séquences avec un pourcentage de similarité compris entre 89 et 99%). Un second groupe de séquences est représenté par la sous classe g des proteobactéries, comprenant 9 séquences dont les pourcentages de similarité varient entre 84 et 99%). Les groupes des b-protéobactéries, d-protéobactéries, firmicutes à bas G+C% et à haut G+C% comprennent respectivement 1 , 4, 3 et 5 séquences. Seule une séquence n'a pu être classée au sein des grands groupes taxonomiques bactériens définis : la séquence a22.1(19), son plus proche voisin Aerothermobacter marianas (avec une similarité de 89%) étant lui même une souche isolée de l'environnement marin et non classifiée à l'heure actuelle. Enfin, 6 séquences peuvent être classées au sein du groupe des Acidobacteriuml Holophaga. Ce groupe présente la particularité de n'être représenté que par deux bactéries cultivées Acidobacterium capsulatum et Holophaga foetida, l'ensemble de ce groupe étant composé par des bactéries dont seul le gène ARNM6S a été détecté par amplification et clonage à partir d'ADN extrait d'échantillon de l'environnement (principalement de sol), Ludwig et al (1997). Les faibles valeurs de similarité entre les différentes séquences composant ce groupe laisse présager une grande hétérogénéité et diversité au sein de ce groupe. L'ensemble des résultats est représenté sur le tableau 7.
Ces résultats montrent que les séquences contenues dans la banque cosmidique proviendraient de micro-organismes non seulement diversifiés phylogénétiquement mais surtout de micro-organismes n'ayant jamais été isolés jusqu'à ce jour. Les résultats du séquençage des ADN amplifiés ont permis d'établir un arbre phylogénétique des organismes présents dans l'échantillon de sol dont les séquences caractérisées sont originaires.
L'arbre phylogénétique représenté à la figure 7 a été réalisé à partir de l'alignement des séquences par le logiciel MASE (Faulner et Jurak, 1988) etcorrigé par la méthode des 2 paramètres de Kimura (1980), et à l'aide de l'algorithme Neighbour Joining (Saitou et Nei 1987). L'analyse phylogénétique a permis de comparer les séquences ADNr 16S clonées dans la banque d'ADN du sol, avec les séquences d'ADNr 16S procaryotes rassemblées dans les bases de données Ribosomal Database Project (RDP), (version 7.0, programme SIMILARITY-MATCH, Maidak et al 1999), et dans la base GenBank grâce au logicel BLAST 2.0 (Atschul et al, 1997).
Exemple 14 : Présélection génétique de la banque pour l'évaluation de la richesse métabolique
Pour caractériser la banque obtenue en terme de diversité métabolique et identifier les clones contenant des inserts portant des gènes pouvant être impliqués dans des voies de biosynthèse, il a été développé selon l'invention des techniques de criblage génétique basées sur des méthodes PCR afin de détecter et d'identifier des gènes PKS de type I.
1 Souches bactériennes, plasmides et conditions de culture
S. coelicolor ATCC101478, S. ambofaciens NRRL2420, S. lactamandurans ATCC27382, S. rimosus ATCC109610, B. Subtilis ATCC6633 et B. licheniformis THE1856 (collection RPR) ont été utilisés comme sources d'ADN pour les expériences de PCR. S. lividans TK24 est la souche hôte utilisée pour le cosmide navette POSI700.
Pour la préparation d'ADN génomique, de suspensions de spores, de protoplastes et pour la transformation de S. lividans, on a suivi les protocoles standard décrits dans Hopwood et a/.(1986).
Escherichia coli Top10 (INVITROGEN) a été utilisé comme hôte pour le clonage des produits PCR et E. coli Sure (STRATAGENE) a été utilisé comme hôte pour le cosmide navette pOS700l. Les conditions de culture de E. coli, la préparation de plasmides, la digestion de l'ADN, l'électrophorèse sur gel d'agarose ont été réalisées suivant les procédures standard (Sambroock et al., 1996).
2. Amorces PCR:
Les couples d'amorces a1-a2 et b1-b2 ont été définis par l'équipe de N. Bamas-Jacques et leur utilisation a été optimisée pour le criblage de l'ADN des souches pures et de la banque du sol pour la recherche de gènes codant PKSI)
Tableau 8 : Amorces PCR homologues aux gènes PKSI utilisées pour le criblage de la banque..
Conditions d'amplification :
Pour la recherche de PKS I à partir de l'ADN de souches pures, le mélange d'amplification contenait : dans un volume final de 50 μl, entre 50 et 150 ng d'ADN génomique, 200 μM de dNTP, 5mM de MgCI2 final, 7% de DMSO, tampon 1x Appligene, 0,4 μM de chaque primer et 2,5U de Taq Polymérase Appligene. Les conditions d'amplification utilisées sont : dénaturation à 95°C pendant 2 minutes, hybridation à 65°C pendant 1 minute, élongation à 72°C pendant 1 minute, pour le premier cycle, suivi par 30 cycles où la température est diminuée jusqu'à 58°C comme décrit dans K. Seow et al., 1997. L'étape d'extension finale s'effectue à 72°C pendant 10 minutes.
Pour la recherche de PKS I à partir de l'ADN de la banque, les conditions PCR sont les mêmes que ci-dessus pour le couple a1-a2 en utilisant entre 100 et 500 ng de cosmide extrait de pools de 48 clones.
Pour le couple d'amorces b1-b2 , 500ng de cosmides issus de pools de
96 clones ont été utilisés. Le mélange d'amplification contenait 200 μM de dNTP, 2,5mM de MgCI2 final, 7% de DMSO, tampon 1x Quiagen, 0,4 μM de chaque primer et 2,5U de Taq polymérase Hot-start (Qiagen). Les conditions d'amplification utilisées sont : dénaturation 15' à 95°C suivie par 30 cycles : l' de dénaturation à 95°C + l' d'hybridation à 65°C pour le premier cycle et 62°C pour les autres cycles, l' d'élongation à 72°C, étape d'extension finale de 10' à 72°C.
L'identification des clones positifs à partir des pools de 48 ou 96 clones est effectuée à partir des répliques des microplaques mères correspondantes sur milieu solide ou toute autre méthode standard de réplication.
3 Sous-clonage et séquençage
Les produits PCR des clones identifiés ont été séquences selon le protocole suivant :
Les fragments sont purifiés sur gel d'agarose (Gel Extraction Kit (Qiagen))et clones dans E.coli TOP 10 (Invitrogen) à l'aide du kit TOPO TA cloning kit (Invitrogen). L'ADN plasmidique de sous-clones est extrait par lyse alcaline sur un Biorobot (Qiagen) et dialyse durant 2 h sur membrane VS 0,025μm (Millipore). Les échantillons sont séquences avec les amorces M13 " Universal " et " Reverse " sur le séquenceur ABI 377 96( PERKIN ELMER).
4) Résultats
Définition et validation des amorces PCR
Deux régions très conservées de PKS du type I d'actinomycètes, comprenant le site actif de l'enzyme, ont été ciblées pour l'amplification de gènes homologues avec des amorces dégénérées. Ces deux régions correspondent aux séquences PQQR(L)(L)LE et VE(A)HGTGT respectivement.
Des amorces (tableau 8) ont été testées avec l'ADN de souches productrices ou non de macrolides: Streptomyces coelicolor, Streptomyces ambofaciens, producteur de spiramycine, et Saccharopolyspora erythraea, producteur de l'erythromycine. Quelles que soient les amorces utilisées, des bandes représentant des fragments d'environ 700 pb et correspondant à la longueur du fragment attendu, ont été obtenues avec toutes les souches.
Ces résultats démontrent la spécificité des amorces a et b pour les gènes PKS I de souches productrices ou de gènes silencieux chez S. coelicolor.
Le séquençage des produits PCR obtenus avec le couple d'amorces a1-a2 a permis d'identifier, à partir de la souche S. ambofaciens, la séquence d'un gène KS déjà décrite (Demande de brevet européen n° EP0791656) comme appartenant à la voie de biosynthèse du planténolide, précurseur macrolidique de la spiramycine, et deux séquences jamais décrites, Stramb 9 et Stramb12, (voir liste séquences).
En ce qui concerne, S. erythraea, la méthode de criblage a permis l'identification d'une séquence de KS (sacen/17) identique à celle du KS du module 1 déjà publiée dans Genebank (Numéro d'accès M63677), codant pour la synthétase 1 (DEBS1) du 6- deoxyérythronolide B. Une autre séquence non corrélée à la voie de biosynthèse de l'erythromycine a été identifiée et il s'agit de la séquence SEQ ID N° 32.
Conclusion
Une méthode pour analyser la présence de gènes codant pour les PKS du type I par PCR à partir de différents micro-organismes a été mise au point. La structure très conservée du domaine de la keto- synthétase du type I a permis de réaliser une méthode PCR basée sur l'utilisation d'amorces dégénérées biaisées en GC pour le choix des codons.
Cette approche montre la possibilité d'identifier des gènes ou clusters impliqués dans la voie de biosynthèse des polykétides du type I. Le clonage de ces gènes permet la création d'une collection qui pourra ensuite être utilisés pour construire des hybrides polykétides. Le même principe peut être appliqué à d'autres classes d'antibiotiques.
Les résultats obtenus ici montrent aussi la présence de gènes pouvant appartenir à des clusters silencieux (SEQ ID N° 30 à 32). La présence de clusters silencieux a été déjà documentée dans
S. lividans et leurs expressions sont déclenchées par des régulateurs spécifiques ou pleiotropiques (Horinouchi et al. ;Umeyama et al. 1996) . Ces résultats suggèrent que la détection de gènes appartenant à des voies dites silencieuses codent en réalité pour des enzymes actives capable de diriger, en association avec les autres enzymes spécifiques de la voie, les étapes enzymatiques nécessaires pour la synthèse des métabolites secondaires.
Criblage de la bangue
Le criblage a été effectué dans les conditions décrites dans la section Matériels et Méthodes en utilisant les couples d'amorces validées à partir de souches productrices.
En présence du couple d'amorces a1-a2 , la taille des produits PCR obtenus à partir de l'ADN cosmidique extrait de pools de 48 ou 96 clones était d'environ 700 bp, donc en accord avec les résultats attendus.
L'intensité des bandes obtenues était variable, mais une seule bande d'amplification était présente pour chaque pool d'ADN cible. Dans ces conditions, 8 groupes d'ADN cible ont été détectés, correspondant à 9 clones positifs après déréplication. Le criblage effectué avec le second couple d'amorces, b1-b2, a donné des résultats d'amplification moins spécifiques puisque de nombreuses bandes satellites étaient observées à côté de la bande de 700 bp. Néanmoins, 9 groupes d'ADN cible ont été détectés, correspondant à 14 clones positifs après déréplication à partir de ces clones positifs, l'ADN a été extrait pour les étapes de séquençage et de transformation de .S. lividans. Analyse des cosmides
La digestion des cosmides identifiés par PCR avec l'enzyme Dral, reconnaissant un site riche en AT, libère un fragment supérieur à 23 kb (figure 22). Ceci suggère que la méthode PCR cible préférentiellement l'ADN du sol contenant un haut pourcentage en G+C. Ce résultat est la conséquence de la dégénérescence des amorces utilisées, biaisées en GC pour le choix des codons. Les inserts, comme attendu dans le cas de cosmides, ont une taille supérieure à 23 kb, sauf dans un cas ( clone a9B12), ce qui pourrait traduire une certaine instabilité des cosmides. D'autre part, parmi tous les clones sélectionnés, seulement deux d'entre eux, GS.F1 et GS.G1 1 , ont montré le même profil de restriction indiquant un faible taux de redondance dans la banque. Les cosmides sélectionnés ont été transférés dans
Streptomyces lividans par transformation de protoplastes en présence de PEG 1000. L'efficacité de transformation varie entre 30 et 1000 transformants par μg d'ADN cosmidique utilisé.
Séguencage et analyse phylogénétique des gènes PKS I du sol
La méthode de PCR mise à point sur les souches pures a été utilisée comme décrite sur les cosmides de la banque et 24 clones ont ainsi été identifiés. Les produits de PCR d'environ 700 bp obtenus à partir de l'ADN de deux pools (48 clones) et de 8 clones uniques, ont été clones, après purification sur gel d'agarose , et séquences. Cela a permis l'identification de 11 séquences.
L'alignement des séquences protéiques déduites PKSs I du sol avec d'autres PKSs I présentes dans différents micro-organismes (figure 24) montre la présence d'une région très conservée qui correspond à la région consensus du site active de la b-kétoacyl synthétase. L'analyse des séquences obtenues avec la méthode " Codonpreference " (Gribskov et al., 1984 ; Bibb et al., 1984) a révélé la présence d'un fort biais dans l'usage des codons riches en G+C dans une seule phase de lecture. Les protéines déduites selon cette phase de lecture montrent une forte similarité avec des KSs du type I connus ( programme Blast). En particulier, la similarité entre les séquences de KSs du sol et des KSs du cluster de l'erythromycine est d'environ 53%.
Après déréplication d'un pool et identification du clone unique, la séquence du produit PCR obtenu à partir de ce clone est identique à celle du pool ce qui confirme la fiabilité de la méthode utilisée.
L'analyse de la séquence du produit PCR d'un clone a permis l'identification probable de 3 gènes KSI différents. Une de ces séquences (SEQ ID N° 34) a une similarité de 98,7% avec la séquence d'un autre pool, suggérant qu'elles codent pour la même enzyme. Les deux autres séquences sont différentes mais fortement homologues.
Ici, il est décrit pour la première fois le clonage et l'identification dans une banque d'ADN du sol de voies de biosynthèse de métabolites secondaires contenant des gènes codant des KS du type I.
Le pourcentage élevé en G+C des séquences du sol suggère qu'elles puissent dériver de génomes ayant un usage des codons similaire à ceux d'actinomycètes.
Même si les données disponibles dans la littérature sont réduites, on sait que les gènes codant des PKS du type I sont très diversifiés de par leur organisation physique dans le génome, la taille et le nombre de modules contenus dans chaque gène.
La présence de plusieurs domaines provenant d'un seul clone est une confirmation de leur appartenance à des clusters de polykétides assymétriques. Dans un seul cas, deux clones semblent former un contigue puisqu'ils partagent la même séquence pour le domaine KS. La taille des régions génétiques impliquées dans la synthèse des
PKSI varie entre quelques kb pour la pénicilline à environ 120 kb pour la rapamycine. La dimension des inserts cosmidiques peut donc ne pas être suffisante pour l'expression des clusters les plus complexes.
Des gènes codant pour des PKSs I, capables de travailler de façon itérative comme les PKS II et de contrôler la synthèse de polykétides aromatiques, ont été décrits (Jae-Hyuk et al., 1995). L'étude des clusters des PKSs I du sol pourrait apporter encore des nouveautés dans ce domaine.
5. Identification de 6 gènes codant des polykétides synthases .
On poursuivant le criblage de la banque de cosmides selon les protocoles décrits dans le présent exemple, les inventeurs ont identifiés un clone de cosmide contenant un insert de 34071 pb contenant plusieurs cadres ouverts de lecture codant pour des polypeptides du type polykétide synthase.
Plus précisément, le cosmide ainsi identifié par criblage de la banque contient six cadres ouverts de lecture codant pour des polypeptides polykétide synthase ou pour des polypeptides fortement apparentés, des peptides synthase non ribosomiques. Une carte détaillée de ce cosmide est représentée à la figure 36.
La séquence nucléotidique complète du cosmide constitue la séquence SEQ ID N°113 du listage de séquences. L'insert d'ADN contenu dans la séquence SEQ ID N°113 constitue la séquence nucléotidique complémentaire (brin - ) de la séquence nucléotidique codant pour les différents polykétides synthases.
La séquence nucléotidique de l'insert d'ADN contenue dans le cosmide de la figure 36 qui comprend les cadres de lecture ouverts codant pour les polypeptides polykétides synthases (brin +) est schématisée sur la figure 37 et constitue la séquence SEQ ID N°114 du listage de séquences.
De plus, une carte détaillée des différents cadres de lecture ouverts contenus dans l'insert d'ADN de ce cosmide est représentée à la figure 37.
Les caractéristiques des séquences nucléotidiques comprenant des cadres ouverts de lecture contenus dans l'insert d'ADN de ce cosmide sont détaillées ci-après. Séquence ORF1
La séquence orfl comprend un cadre ouvert de lecture partielle d'une longueur de 4615 nucléotides. Cette séquence constitue la séquence SEQ ID N°115, qui débute au nucléotide en position 1 et se termine au nucléotide en position 4615 de la séquence SEQ ID N°114.
La séquence SEQ ID N°1 15 code pour le polypeptide ORF1 de 1537 acides aminés, ce polypeptide constituant la séquence SEQ ID N°121. Le polypeptide de séquence SEQ ID N°121 est apparenté aux peptides synthases non ribosomiques. Ce polypeptide possède un degré d'identité en acides aminés de 37% avec le peptide synthase de Anabaena sp.90 référencé sous le numéro d'accès « emb CACO1604.1 » dans la base de données Genbank.
Séquence ORF2
La séquence nucléotidique orf2 a une longueur de 8301 nucléotides et constitue la séquence SEQ ID N°1 16, qui débute au nucléotide en position 4633 et se termine au nucléotide en position 12933 de la séquence SEQ ID N°114.
La séquence ORF2 code pour le peptide ORF2 d'une longueur de 2766 acides aminés, ce polypeptide constituant la séquence SEQ ID N°122. Le polypeptide de séquence SEQ ID N°122 possède une identité de séquence en acides aminés de 41% avec la séquence MtaD de Stigmatella aurantiaca référencée sous le numéro d'accès « gb AAF 19812.1 » de la base de données GENBANK.
Le polypeptide ORF2 constitue une polykétide synthase.
Séquence ORF3
La séquence nucléotidique orf3 a une longueur de 5292 nucléotides et constitue la séquence SEQ ID N°117. La séquence SEQ ID N°117 correspond à la séquence qui débute au nucléotide en position 12936 et qui se termine au nucléotide en position 18227 de la séquence SEQ ID N°114.
La séquence nucléotidique SEQ ID N°117 code pour le polypeptide polykétide synthase ORF3 de 1763 acides aminés, ce polypeptide constituant la séquence SEQ ID N°123 selon l'invention.
Le polypeptide ORF3 de séquence SEQ ID N°123 possède une identité de 42% en acides aminés avec la séquence MtaB de Stigmatella aurantiaca référencée sous le n° d'accès « gb AAF 19810.1 » de la base de données GENBANK.
Séquence ORF4
La séquence nucléotidique orf4 a une longueur de 6462 nucléotides et constitue la séquence SEQ ID N°118 selon l'invention. La séquence nucléotidique SEQ ID N°118 correspond à la séquence débutant au nucléotide en position 18224 et se terminant au nucléotide en position 24685 de la séquence nucléotidique SEQ ID N°114.
La séquence nucléotidique SEQ ID N°118 code pour le polypeptide polykétide synthase ORF4 de 2153 acides aminés, ce polypeptide constituant la séquence SEQ ID N°124 selon l'invention.
Le polypeptide ORF4 de séquence SEQ ID N°124 possède une identité de séquence en acides aminés de 46% avec la séquence epoD de Sorangium cellulosum référencée sous le n° d'accès « gb AAF62883.1 de la base de données GENBANK.
Séquence ORF5
La séquence nucléotidique orfδ a une longueur de 5088 nucléotides et constitue la séquence SEQ ID N°119 selon l'invention.
La séquence SEQ ID N°119 correspond à la séquence débutant au nucléotide en position 24682 et se terminant au nucléotide en position 29769 de la séquence nucléotidique SEQ ID N°114. La séquence nucléotidique SEQ ID N°119 code pour le polypeptide polykétide synthase ORF5 de 1695 acides aminés, ce polypeptide constituant la séquence SEQ ID N°125 selon l'invention.
Le polypeptide polykétide synthase ORF5 de séquence SEQ ID N°125 possède une identité en acides aminés de 43% avec la séquence epod de Sorangium cellulosium référencé sous le n° d'accès « gb AAF 62883.1 » de la base de données GENBANK.
Séquence ORF6
La séquence nucléotidique oifδ a une longueur de 4306 nucléotides, et constitue la séquence SEQ ID N°120 selon l'invention. La séquence nucléotidique SEQ ID N°120 correspond à la séquence débutant au nucléotide en position 29766 et se terminant au nucléotide en position 34071 de la séquence SEQ ID ID N°1 14.
La séquence SEQ ID N°120 contient un cadre ouvert de lecture partielle codant pour le polypeptide ORF6 de 1434 acides aminés du type polykétide synthase, ce polypeptide constituant la séquence SEQ ID N°126 selon l'invention. Le polypeptide de séquence SEQ ID N°126 possède une identité en acides aminés de 43% avec la séquence epoD de Sorangium cellulosum référencée sous le numéro d'accès « gb AAF 62883.1 » de la base de données GENBANK.
EXEMPLE 15: Construction de vecteurs navettes de type BAC intégratifs chez Streptomyces
Construction de vecteurs navettes du type BAC intégratifs et conjugatifs chez Streptomyces
15.1 Construction du vecteur pMBD-1
Le vecteur BAC pMBD-1 a été obtenu selon les étapes suivantes: Etape 1 : Le vecteur pOSVO10 a été soumis à une digestion par les enzymes PsTI et BstZ17l afin d'obtenir un fragment nucléotidique de 6,3 kb.
Etape 2: Le vecteur pDNR-1 a été digéré par les enzymes PstI et Pvull afin d'obtenir un fragment nucléotidique de 4,145 kb.
Etape 3: Le fragment nucléotidique de 6,3 kb provenant du vecteur pOSV017 a été fusionné par ligation au fragment de 4,15 kb provenant du vecteur pDNR-1 , afin de produire le vecteur pMBD-1 , comme cela est illustré à la figure 30.
15.2 Construction du vecteur pMBD-2
Le vecteur pMBD-2 est un vecteur du type BAC contenant une boîte intégrative « φc31 int-Ωhyg ». φc31 est un phage tempéré à spectre d'hôte large dont le site d'attachement (attP) est bien localisé. Le fragment φc31 int est le fragment minimal de l'actinophage φc31 capable d'induire l'intégration d'un plasmide dans le chromosome de Streptomyces Lividans.
Ωhyg est un dérivé de l'interposon Ω capable de conférer la résistance à l'hygromicine chez E.coli et S. Lividans.
Des vecteurs BAC contenant le système d'intégration φc31 sont décrits par SOSIO et al. (2000) et dans la demande PCT n°99 6734 publiée le 29 Décembre 1999.
Le vecteur BAC pmBD-2 a été construit selon les étapes suivantes:
Etape 1 : Construction d'une boîte intégrative φc31 int Ωhyg dans un plasmide multicopies de E.coli. On a tout d'abord amplifié le fragment φc31 int à partir du plasmide pOJ436 à l'aide du couple d'amorces suivant:
- L'amorce EVφc31 l (SEQ ID N°109) (qui permet d'introduire un site EcoRV à l'extrémité 5' de la séquence φc31) et l'amorce Bllφc31 F (SEQ ID N°110) (qui permet l'introduction d'un site BgLII à l'extrémité 3' de la séquence φc31). Le fragment Ωhyg a été obtenu par digestion à l'aide de l'enzyme BamHI du plasmide pHP45 Ωhyg décrit par BLONDELET- ROUAULT (1997).
Puis la boîte intégrative φc31 int-Ωhyg a été clonée dans le vecteur pMCS5 digéré par les enzymes Bglll et EcoRV.
Etape 2: Construction du vecteur pMBD-2.
Le chromosome artificiel bactérien pBAce3.6 décrit par FRENGEN et al. (1999) a été digéré par l'enzyme Nhel puis traité par l'enzyme Eco polymérase.
Puis, le vecteur pMCS5 φc31 int-Ωhyg a été digéré par les enzymes SnaBI et EcoRV afin de récupérer la boîte intégrative.
La carte détaillée du vecteur pMBD2 est représentée à la figure 31.
15.3 Construction du vecteur pMBD-3.
Le vecteur pMBD-3 est un vecteur intégratif (φc31 int) et conjuguatif (OriT) du type BAC, qui comprend le marqueur de sélection Ωhyg.
La carte du vecteur pMBD-3 ainsi que son procédé de construction sont illustrés à la figure 31.
Le vecteur pMBD-3 a été obtenu en amplifiant le gène OriT à partir du plasmide pOJ436 à l'aide du couple d'amorces de séquences SEQ ID N° 111 et SEQ ID N°112 qui contiennent des sites de restriction pacl.
Le fragment nucléotidique amplifié à l'aide des amorces SEQ ID N°111 et SEQ ID N°112 a été clone dans le vecteur pMBD2 préalablement digéré par l'enzyme Pacl. Le schéma de construction du vecteur pMBD-3 est illustré à la figure 31. 15.4 Construction du vecteur DMBD-4
La carte détaillée du vecteur pMBD-4 est représentée à la figure 32. Le vecteur pMBD4 a été obtenu en clonant la boîte intégrative φc31 int-Ωhyg dans le vecteur pCYTAC2.
15.5 Construction du vecteur pMBD-5
Le schéma de construction du vecteur pMBD-5 est illustré à la figure 33.
Le vecteur pMBD-5 a été construit par recombinaison du fragment nucléotidique compris entre les deux sites loxP du vecteur pMBD-1 illustré à la figure 33 avec le site loxp contenu dans le vecteur BAC désigné pBTP3, une carte détaillée du plasmide pBTP3 étant représentée à la figure 34.
15.6 Construction du vecteur pMBD-6
Le vecteur pMBD-6 a été construit en recombinant le fragment nucléotidique compris entre les deux sites loxP du vecteur pMBD-1 au niveau du site loxP du vecteur BAC pBeloBad 1 , comme représenté sur la figure 35.
TABLEAU 1 Localisation des prélèvements d'échantillon et caractéristiques des sols utilisés dans les différentes expériences. Les comptes microbiens directs en utilisant la coloration à l'acridine orange ont été réalisés avant et après broyage du sol
a n=3; déviation standard entre parenthèses.
TABLEAU 2
Amorces et sondes utilisées pour l'amplification PCR et l'hybridation sur tâche
4-r
a) Les positions sur le gène de l'ARNr 16S de E.coli sont données entre parenthèses. Pour β. anthracis et S. lividans, les amorces et les sondes ciblent des séquences chromosomiques spécifiques des organismes respectifs. Ces séquences ne sont pas localisées dans le gène de l'ARNr 16S. La cassette contenant la région cible de S. lividans est décrite par Clerc-Bardin et al. (non publié).
TABLEAU 3
Quantité d'ADN extrait à partir de différents sols après des traitements de lyse selon les protocoles n°1 à 5 (μg ADN/g de poids de sol sec ± déviation standard)3
Solsl, 2, 3 et 6; n= 3; sol 4: n=1.
Sol Protocole de Ivse numéro13
Numéro et origine 1 2 3 4a 4b 5a 5b
1. Australie 17+/-2 52+/- 2 32+/-5 16 +/-3 33+/- 2 59+/-1 27+/-0
2. Peyrat 29+/-2 58+/-1 40+/-2 29+/-2 18+/3 56+/-1 15+/-1
3.Côte St-André 36+/-7 60+/- 6 148+/-10 94+/-7 38+/-6 73+/-5 47+/-6
4. Chazay 9 16 ND 32 15 15 70
6. Dombes 4+/- 2 26+/- 3 43+/-1 61+/- 66+/-1 160+/-7 102+/- 5
3 Quantification par imagerie de phosphorescence après hybridation sur tâche avec la sonde universelle FGPS431
(tableau 2). b1: Aucun traitement; 2:broyage à sec du sol (G); 3: Cr + homogénéisation Ultraturax (H);
4a: G + H + sonication Microtip (MT); 4b: G + H+ sonication Cup Horn (CH); 5a: Cr + H + NT + lyse chimique/ enzymatique. Voir aussi figure 1. c ND = Non déterminé.
Tableau 4 :
Amorces et sondes utilisées dans la caractérisation moléculaire des ADN extraits du sol
position sur le gène ARN 6S d'Escherichia coli
Tableau 5 :
Efficacités d'extraction des cellules bactériennes sur gradient de Nycodenz et quantités d'ADN extrait.
Effet de l'incubation de l'échantillon de sol dans une solution d'extrait de levure 6%,
-J
b : Dénombrement sur milieu solide Trypcase-Soja 10% c : Dénombrement sur milieu solide HV Agar, après enrichissement 20 minutes à 40°C dans une solution d'extrait de levure
6% - SDS 0,05%. d : La quantité d'ADN extrait a été évaluée sur gel d'électrophorèse par rapport à une gamme étalon d'ADN de thymus de veau. e : La quantification a été réalisée après digestion de l'agarose par action d'une b-agarase
Tableau 6 : Caractérisation des ADN extraits en fonction de leur proportion en a, b, et g sous classes des Proteobactéries, en Gram + à bas GC% et en Actinomycètes ; le signal d'hybridation avec la sonde procaryote servant de référence 100%.
c
a : broyage dans un broyeur à billes de tungstène, à force centrifuge (protocole d'extraction décrit dans article Frostegard et al.)
YE : solution d'extrait de levure à 6%
Tableau 7: Diversité des séquences d'ADN βS contenues dans la banque cosmidique
sO
TABLEAU 7 (suite 1)
Diversité des séquences d'ADN ΘS contenues dans la banque cosmidique
O
TABLEAU 7 (suite 2)
Diversité des séquences d'ADN ΘS contenues dans la banque cosmidique
Ludwig (1997)
TABLEAU 9 : Séquences
TABLEAU 9 (suite 1):Séquences
TABLEAU 9 (suite 2):Séquences
TABLEAU 9 (suite 3) Séquences
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de sol contenant des organismes, ledit procédé comprenant la succession d'étapes suivante :
- 1 (a) Obtention de micro-particules par broyage d'un échantillon de sol préalablement séché ou dessique , puis mise en suspension des micro-particules dans un milieu tampon liquide ; et
(b) extraction des acides nucléiques présents dans les micro- particules ; et
(c)- passage de la solution contenant les acides nucléiques sur un tamis moléculaire, puis récupération des fractions d'élution enrichies en acides nucléiques et passage des fractions d'élution enrichies en acides nucléiques sur un support de chromatographie d'échange d'anions, puis récupération des fractions d'élution contenant les acides nucléiques purifiés.
2. Procédé de préparation d'une collection d'acides nucléiques à partir d'un échantillon de l'environnement contenant des organismes, ledit procédé comprenant la succession d'étapes suivante :
- Il (i) Obtention d'une suspension par dispersion de l'échantillon de l'environnement en milieu liquide puis homogénisation de la suspension par agitation douce; et
(ii) séparation des organismes et des autres constituants minéraux et/ou organiques de la suspension homogène obtenue à l'étape (i) par centrifugation sur un gradient de densité ; et
(iii) lyse des organismes séparés à l'étape (ii) et extraction des acides nucléiques; et
(iv) purification des acides nucléiques sur un gradient de chlorure de césium.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape I- (a) est suivie d'une étape complémentaire de :
- traitement des micro-particules en suspension dans un milieu tampon liquide par sonication ;
4. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'étape l-(a) est suivie des étapes complémentaires suivantes :
- traitement des micro-particules en suspension dans un milieu tampon liquide par sonication ;
- incubation de la suspension à 37°C après sonication en présence de lysozyme et d'achromopeptidase;
- addition de SDS
- récupération des acides nucléiques.
5. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'étape I- (a) est suivie des étapes complémentaires suivantes :
- homogénéisation des micro-particules à l'aide d'une étape de mixage violent (vortex) suivie d'une étape de simple agitation ;
- congélation de la suspension homogène suivie d'une décongélation ;
- traitement par sonication de la suspension après décongélation ;
- incubation de la suspension à 37°C après sonication en présence de lysozyme et d'achromopeptidase;
- addition de SDS;
6 .Procédé selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé en ce que les acides nucléiques sont des molécules d'ADN.
7. Procédé de préparation d'une collection de vecteurs recombinants, caractérisé en ce que les acides nucléiques obtenus par le procédé selon l'une des revendications 1 à 6 sont insérés dans un vecteur de clonage et/ou d'expression.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que les acides nucléiques sont séparés en fonction de leur taille préalablement à leur insertion dans le vecteur de clonage et/ou d'expression.
9. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que la taille moyenne des acides nucléiques est rendue sensiblement uniforme par rupture physique, préalablement à leur insertion dans le vecteur de clonage et/ou d'expression.
10. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le vecteur de clonage et/ou d'expression est du type plasmide.
11. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le vecteur de clonage et/ou d'expression est du type cosmide.
12. Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un cosmide réplicatif chez E. coli et intégratif chez Streptomyces.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce qu'il s'agit du cosmide pOS700l.
14. Procédé selon la revendication 11 , caractérisé en ce qu'il s'agit d'un cosmide conjugatif et intégratif chez Streptomyces.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que le cosmide est choisi parmi les cosmides pOSV303, pOSV306 et pOSV307.
16. Procédé selon la revendication 11 , caractérisé en ce qu'il s'agit d'un cosmide réplicatif à la fois chez E. coli et chez Streptomyces.
17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il s'agit du cosmide pOS 700R.
18. Procédé selon la revendication 11 , caractérisé en ce qu'il s'agit d'un cosmide réplicatif chez E. coli et Streptomyces et conjugatif chez Streptomyces.
19. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le vecteur de clonage et/ou d'expression est du type BAC.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un vecteur BAC intégratif et conjugatif chez Streptomyces.
21. Procédé selon la revendication 20, caractérisé en ce que le vecteur est choisi parmi les vecteurs BAC pOSV403, pMBD-1 , pMBD-2, pMBD-3, pMBD-4, pMBD-5 et pMBD-6.
22. Procédé de préparation d'un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce que l'étape d'insertion d'un acide nucléique dans le vecteur de clonage et/ou d'expression comprend les étapes suivantes :
- ouvrir le vecteur de clonage et/ou d'expression à un site de clonage choisi, à l'aide d'une endonucléase de restriction appropriée ;
- ajouter un premier acide nucléique homopolymérique à l'extrémité 3' libre du vecteur ouvert ;
- ajouter un second acide nucléique homopolymérique, de séquence complémentaire au premier acide nucléique homopolymérique, à l'extrémité 3' libre de l'acide nucléique de la collection à insérer dans le vecteur;
- assembler l'acide nucléique du vecteur et l'acide nucléique de la collection par hybridation du premier et du second acide nucléique homopolymérique de séquences complémentaires l'une de l'autre;
- refermer le vecteur par ligation.
23. Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que :
- le premier acide nucléique homopolymérique est de séquence poly(A) ou poly (T) ; et
- le second acide nucléique homopolymérique est de séquence poly(T) ou poly(A).
24. Procédé de préparation d'un vecteur recombinant selon l'une des revendications 22 ou 23, caractérisé en ce que la taille de l'acide nucléique à insérer est d'au moins 100 kilobases, préférentiellement d'au moins 200 kilobases.
25. Procédé de préparation d'un vecteur recombinant selon l'une des revendications 22 à 24, caractérisé en ce que l'acide nucléique à insérer est contenu dans la collection d'acides nucléiques obtenus par le procédé selon l'une des revendications 1 à 6.
26. Procédé de préparation d'un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression, caractérisé en ce que l'étape d'insertion d'un d'acide nucléique dans le vecteur de clonage et/ou d'expression comprend les étapes suivantes :
- création de bouts francs sur les extrémités de l'acide nucléique de la collection par élimination des séquences 3' sortantes et remplissage des séquences 5' sortantes ;
- ouverture du vecteur de clonage et/ou d'expression à un site de clonage choisi, à l'aide d'une endonucléase de restriction appropriée ;
- création de bouts francs aux extrémités de l'acide nucléique du vecteur par élimination des séquences 3' sortantes et remplissage des séquences 5' sortantes, puis déphosphorylation des extrémités 5' ;
- Addition d'adaptateurs oligonucléotidiques complémentaires ;
- insertion de l'acide nucléique de la collection dans le vecteur par ligation.
27. Procédé de préparation d'un vecteur recombinant selon la revendication 26, caractérisé en ce que la taille de l'acide nucléique à insérer est d'au moins 100 kilobases, préférentiellement d'au moins 200 kilobases.
28. Procédé de préparation d'un vecteur recombinant selon l'une des revendications 26 ou 27, caractérisé en ce que l'acide nucléique à insérer est contenu dans la collection d'acides nucléiques obtenus par le procédé selon l'une des revendications 1 à 6.
29. Procédé selon l'une des revendications 22 à 28, caractérisé en ce que les acides nucléiques sont insérés tels quels, sans traitement par une ou plusieurs endonucléases de restriction préalablement à leur insertion dans le vecteur de clonage et/ou d'expression.
30. Collection d'acides nucléiques constituée des acides nucléiques obtenus par le procédé selon l'une des revendications 1 à 6.
31. Acide nucléique caractérisé en ce qu'il est contenu dans la collection d'acides nucléiques selon le revendication 30.
32. Acide nucléique selon le revendication 31 , caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléotidique codant au moins un opéron, ou une partie d'un opéron.
33. Acide nucléique selon la revendication 32, caractérisé en ce que l'opéron code pour la totalité ou une partie d'une voie métabolique.
34. Acide nucléique selon la revendication 33, caractérisé en ce que la voie métabolique est la voie de synthèse des polykétides.
35 Acide nucléique selon la revendication 34, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les polynucléotides comprenant les séquences SEQ ID N° 30 à 44 et SEQ ID N° 115 à 120.
36. Acide nucléique selon la revendication 31 , caractérisé en ce qu'il comprend la totalité d'une séquence nucléotidique codant pour un polypeptide
37. Acide nucléique selon l'une des revendications 31 à 36, caractérisé en ce qu'il est d'origine procaryote.
38. Acide nucléique selon la revendication 37, caractérisé en ce qu'il provient d'une bactérie ou d'un virus.
39. Acide nucléique selon l'une des revendications 31 à 33 et 36, caractérisé en ce qu'il est d'origine eucaryote.
40. Acide nucléique selon la revendication 39, caractérisé en ce qu'il provient d'un champignon, d'une levure, d'une plante ou d'un animal.
41. Vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les vecteurs recombinants suivants : a) un vecteur comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 35 à 40; b) un vecteur obtenu selon le procédé de l'une des revendications 22 à 25 et 29; c) un vecteur obtenu selon le procédé de l'une des revendications 26 à 29.
42 Vecteur caractérisé en ce qu'il s'agit du cosmide pOS 700I.
43. Vecteur caractérisé en ce qu'il s'agit du cosmide pOSV303.
44. Vecteur caractérisé en ce qu'i s'agit du cosmide pOSV306.
45. Vecteur caractérisé en ce qu'i s'agit du cosmide pOSV307.
46. Vecteur caractérisé en ce qu'i s'agit du cosmide pOS 700R.
47. Vecteur caractérisé en ce qu'i s'agit du vecteur BAC pOSV403.
48. Vecteur caractérisé en ce qu'i s'agit du vecteur pMBD-1.
49. Vecteur caractérisé en ce qu'i s'agit du vecteur pMBD-2
50. Vecteur caractérisé en ce qu'i s'agit du vecteur pMBD-3.
51. Vecteur caractérisé en ce qu'i s'agit du vecteur pMBD-4.
52. Vecteur caractérisé en ce qu'i s'agit du vecteur pMBD-5.
53. Vecteur caractérisé en ce qu'i s'agit du vecteur pMBD-6.
54. Collection de vecteurs recombinants tels qu'obtenus selon le procédé de l'une des revendications 7 à 21 , 25 et 28.
55. Vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression caractérisé en ce qu'il est contenu dans la collection de vecteurs recombinants selon la revendication 54.
56 Cellule hôte recombinante comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 31 à 40 ou un vecteur recombinant selon la revendication 55.
57. Cellule hôte recombinante selon la revendication 56, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une cellule procaryote ou eucaryote.
58. Cellule hôte recombinante selon la revendication 57, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une bactérie.
59. Cellule hôte recombinante selon la revendication 58, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une bactérie choisie parmi E. coli et Streptomyces.
60. Cellule hôte recombinante selon la revendication 58, caractérisée en ce qu'il s'agit d'une levure ou d'un champignon filamenteux.
61. Collection de cellules hôtes recombinantes, chacune des cellules hôtes constitutives de la collection comprenant un acide nucléique de la collection d'acides nucléiques selon la revendication 30.
62. Collection de cellules hôtes recombinantes, chacune des cellules hôtes constitutives de la collection comprenant un vecteur recombinant selon l'une des revendications 41 ou 55.
63. Procédé de détection d'un acide nucléique de séquence nucléotidique déterminée, ou de séquence nucléotidique structurellement apparentée à une séquence nucléotidique déterminée, dans une collection de cellules hôtes recombinantes selon l'une des revendications 61 ou 62, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- mettre en contact la collection de cellules hôtes recombinantes avec un couple d'amorces hybridant avec la séquence nucléotidique déterminée ou hybridant avec la séquence nucléotidique structurellement apparentée à une séquence nucléotidique déterminée ;
- réaliser au moins trois cycles d'amplification ;
- détecter l'acide nucléique éventuellement amplifié..
64. Procédé de détection d'un acide nucléique de séquence nucléotidique déterminée, ou de séquence nucléotidique structurellement apparentée à une séquence nucléotidique déterminée, dans une collection de cellules hôtes recombinantes selon l'une des revendications 61 ou 62, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- mettre en contact la collection de cellules hôtes recombinantes avec une sonde hybridant avec la séquence nucléotidique déterminée ou hybridant avec une séquence nucléotidique structurellement apparentée à la séquence nucléotidique déterminée ;
- détecter l'hybride éventuellement formé entre la sonde et les acides nucléiques compris dans les vecteurs de la collection.
65. Procédé pour identifier la production d'un composé d'intérêt par une ou plusieurs cellules hôtes recombinantes dans une collection de cellules hôtes recombinantes selon l'une des revendications 61 ou 62, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- culture des cellules hôtes recombinantes de la collection dans un milieu de culture approprié ;
- détection du composé d'intérêt dans le surnageant de culture ou dans le lysat cellulaire d'une ou plusieurs des cellules hôtes recombinantes cultivées.
66 Procédé pour sélectionner une cellule hôte recombinante produisant un composé d'intérêt dans une collection de cellules hôtes recombinantes selon l'une des revendications 61 ou 62, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- culture des cellules hôtes recombinantes de la collection dans un milieu de culture approprié ;
- détection du composé d'intérêt dans le surnageant de culture ou dans le lysat cellulaire d'une ou plusieurs des cellules hôtes recombinantes cultivées.
- sélection des cellules hôtes recombinantes produisant le composé d'intérêt.
67. Procédé pour la production d'un composé d'intérêt caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- cultiver d'une cellule hôte recombinante sélectionnée selon le procédé de la revendication 66;
- récupérer et, le cas échéant, purifier, le composé produit par ladite cellule hôte recombinante.
68. Composé d'intérêt caractérisé en ce qu'il est obtenu selon le procédé de la revendication 67.
69. Composé selon la revendication 68, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un polykétide.
70. Polykétide caractérisé en ce qu'il est produit grâce à l'expression d'au moins une séquence nucléotidique comprenant une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N°30 à 44 et SEQ ID N°115 à 120.
71. Composition comprenant un polykétide selon la revendication 69 ou 70.
72. Composition pharmaceutique comprenant une quantité pharmacologiquement active d'un polykétide selon la revendication 69 ou 70, en association avec un véhicule pharmaceutiquement compatible.
73. Procédé de détermination de la diversité des acides nucléiques contenus dans une collection d'acides nucléiques et tout particulièrement d'une collection d'acides nucléiques provenant d'un échantillon de l'environnement, préférentiellement d'un échantillon du sol, ledit procédé comprenant les étapes suivantes:
- mise en contact des acides nucléiques de la collection d'acides nucléiques à tester avec un couple d'amorces oligonucléotidiques hybridant à toute séquence d'ADN ribosomal 16 S bactérien;
- réalisation d'au moins trois cycles d'amplification;
- détection des acides nucléiques amplifiés à l'aide d'une sonde oligonucléotidique ou d'une pluralité de sondes oligonucléotidiques, chaque sonde hybridant spécifiquement avec une séquence d'ADN ribosomal 16 S commune à un règne, un ordre, une sous-classe ou un genre bactérien;
- le cas échéant, comparer les résultats de l'étape de détection précédente avec les résultats de détection, à l'aide de la sonde ou de la pluralité de sondes, d'acides nucléiques de séquence connue constituant une gamme étalon.
74. Procédé selon la revendication 73, caractérisé en ce que le couple d'amorces hybridant à toute séquence d'ADN ribosomal 16 S bactérien est constitué de l'amorce FGPS 612 (SEQ ID N°12) et de l'amorce FGPS 669 (SEQ ID N°13).
75. Procédé selon la revendication 73, caractérisé en ce que le couple d'amorces hybridant à toute séquence d'ADN ribosomal 16 S bactérien est constitué de l'amorce 63 f (SEQ ISD N°22) et de l'amorce 1387 (SEQ ID N°23).
76. Acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique d'ADNr 16S choisie parmi les séquences possédant au moins 99% d'identité en nucléotides avec les séquences SEQ ID N° 60 à SEQ ID N° 106.
77. Procédé de production d'une polykétide synthase de type I, ledit procédé de production comprenant les étapes suivantes:
- obtention d'une cellule hôte recombinante comprenant un acide nucléique codant pour une polykétide synthase de type I comprenant une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID N°33 à SEQ ID N°44, SEQ ID N°30 à SEQ ID N°32 et SEQ ID N° 115 à SEQ ID N°120. - culture des cellules hôtes recombinantes dans un milieu de culture approprié;
- récupération et, le cas échéant, purification de la polykétide synthase de type I à partir du surnageant de culture ou du lysat cellulaire.
78. Polykétide synthase comprenant une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID N°45 à 59 et SEQ ID N° 121 à SEQ ID N°126.
79. Anticorps dirigé contre une polykétide synthase selon la revendication 78.
80. Procédé de détection d'une polykétide synthase de type I ou d'un fragment peptidique de cette enzyme, dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de: a) mettre en contact un anticorps selon la revendication 79 avec l'échantillon à tester; b) détecter le complexe antigène/anticorps éventuellement formé.
81. Nécessaire de détection d'une polykétide synthase de type I dans un échantillon comprenant: a) un anticorps selon la revendication 79; b) le cas échéant, des réactifs nécessaires à la détection du complexe antigène/anticorps éventuellement formé.
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