MXPA02003819A - Procedimiento de obtencion de acidos nucleicos a partir de una muestra del medio ambiente, acidos nucleicos asi obtenidos y su aplicacion en la sintesis de compuestos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se relaciona con un procedimiento de preparacion de acidos nucleicos a partir de una muestra del medio ambiente, mas particularmente con un procedimiento de obtencion de una coleccion o biblioteca de acidos nucleicos a partir de una muestra. La invencion tambien es relativa a los acidos . nucleicos o a las colecciones de acidos nucleicos obtenidos de acuerdo con el procedimiento y su aplicacion en la sintesis de compuestos novedosos, especialmente de compuestos novedosos de interes terapeutico. La invencion tiene igualmente por objeto medios novedosos aplicados en el procedimiento de obtencion de acidos nucleicos anteriores, tales como los vectores novedosos y los procedimientos de preparacion novedosos de tales vectores o de incluso de las celulas huesped recombinantes que comprenden un acido nucleico de la invencion. La invencion se relaciona tambien con los procedimientos para detectar un acido nucleico de interes en el seno de una coleccion o biblioteca de acidos nucleicos obtenidos de acuerdo con el procedimiento anterior, asi como los acidos nucleicos detectados por tal procedimiento y los polipeptidos codificados por tales acidos nucleicos.

Description

PROCEDIMIENTO DE OBTENCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS A PARTIR DE UNA MUESTRA DEL MEDIO AMBIENTE, CIDOS NUCLEICOS ASI OBTENIDOS Y SU APLICACIÓN EN LA SÍNTESIS DE COMPUESTOS NOVEDOSOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un procedimiento de preparación de ácidos nucleicos a partir de una muestra del medio ambiente, más .particularmente con un procedimiento de obtención de una colección de ácidos nucleicos a partir de una muestra. La invención también es relativa a los ácidos nucleicos o a las colecciones de ácidos nucleicos obtenidos de acuerdo con el procedimiento y su aplicación en la sintesis de compuestos novedosos, especialmente compuestos novedosos de interés terapéutico.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención tiene igualmente por objeto los medios novedosos aplicados en el procedimiento de obtención de los ácidos nucleicos anteriores, tales como los vectores novedosos y los procedimientos de preparación novedosos de tales vectores o incluso de las células huésped recombinantes que comprenden un ácido nucleico de la invención.

REF: 137151 ** *** **Mfm- .f% \^M?¡ñ^^U_ ?Ajn v^ y_? La invención se relaciona incluso con los procedimientos para detectar un ácido nucleico de interés en el seno de una colección de ácidos nucleicos obtenidos de acuerdo con el procedimiento anterior, así como los ácidos nucleicos detectados por tal procedimiento y los polipéptidos codificados por tales ácidos nucleicos. La invención igualmente trata de los ácidos nucleicos obtenidos y detectados de acuerdo con los procedimientos anteriores, en particular los ácidos nucleicos que codifican para una enzima que participa en la vía de biosíntesis de antibióticos tales como las ß-lactamas, los ammoglicósidos, los nucleótidos heterocíclicos, o incluso los policétidos, así como la enzima codificada por estos ácidos nucleicos, los policétidos producidos gracias a la expresión de estos '.ácidos nucleicos, y finalmente con las composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad farmacológicamente activa de un policétido producido gracias a la expresión de tales ácidos nucleicos. Después del descubrimiento de la producción de la estreptomicina por los actinomicetos, la búsqueda de compuestos novedosos de interés terapéutico, y más particularmente de antibióticos novedosos, ha recurrido de manera incrementada a métodos de tamizado de los metabolitos producidos por los microorganismos del suelo. * ¿>*ti.

Tales métodos consisten principalmente de aislar los organismos de la microflora telúrica, cultivarlos sobre medios nutritivos especialmente adaptados, después de detectar una actividad farmacológica en los productos recuperados en los sobrenadantes del cultivo, o en los lisados celulares que hayan, dado el caso, sufrido previamente una o varias etapas de separación y/o de purificación. Así, los métodos de aislamiento y de cultivo in vitro de los organismos que constituyen la microflora telúrica permite, a la fecha actual, caracterizar aproximadamente 40,000 moléculas, donde aproximadamente la mitad presenta una actividad biológica. Los productos principales que han sido caracterizados de acuerdo con tales métodos de cultivo in vitro, tales como los antibióticos (penicilina, eritromicina, actinomicina, tetraciclina, cefalosporina) , los anticancerígenos, los anticol^sterolémicos o incluso plaguicidas . Los productos de interés terapéutico de origen microbiano conocidos a la fecha provienen principalmente (aproximadamente el 70%) del grupo de los actinomicetos, y más particularmente del género Streptomyces . Sin embargo, otros compuestos terapéuticos, tales como los teicoplaninos, la gentamicma y las espinccmas, se han aislado a partir de microorganismos de géneros más difíciles de cultivar, tales como Mi cromonospora , Actinomadura , Actinoplanes , Nocardia , Streptosporangi um , Ki tosa tosporia o incluso Sa ccharomonospora . Pero la practica ilustra el hecho de que la caracterización de los productos naturales novedosos sintetizados por los organismos de la microflora del suelo permanece limitada, en parte debido al hecho de que la etapa de cultivo in vitro conduce con más frecuencia a una selección de organismos ya conocidos anteriormente. Los métodos de separación y de cultivo in vitro de los organismos telúricos con el fin de identificar compuestos novedosos de interés, presentan por lo tanto numerosas limitantes . Los actinomicetos, P°r ejemplo, la proporción de redescubrimiento de antibióticos ya conocidos anteriormente es de aproximadamente 99%. En efecto, las técnicas de microscopía en fluorescencia han permitido enumerar más de 10i0 células bacterianas en 1 g de suelo, mientras que solamente del 0.1 al 1% de estas bacterias pueden ser aisladas después del sembrado en los medios de cultivo. Con la ayuda de técnicas de cinética de reasociación del ADN, se ha podido demostrar que entre 12,000 y 18,000 especies bacterianas pueden estar contenidas en 1 g de suelo, mientras que hasta esta fecha, solo 5,000 "-- •—-—•**"^Éfitii? üii?i - fthfr microorganismos no eucariotes han sido descritos, en cualquier habitat mezclado. Los estudios de ecología molecular han permitido amplificar y clonar numerosas secuencias novedosas de ADNr 16S a partir de ADN del medio ambiente. Los resultados de estos estudios han conducido a triplicar el número de divisiones bacterianas caracterizadas anteriormente . Hasta la fecha, las bacterias están subdivididas en 40 divisiones, ciertas de entre ellas no están constituidas más que por bacterias que no pueden ser cultivadas. Estos últimos resultados atestiguan la amplitud de la biodiversidad microbiana que permanece no explotada hasta la fecha. Los trabajos recientes han intentado sortear los numerosos obstáculos para el acceso a la biodiversidad de la microflora del suelo, donde especialmente la etapa de cultivo in vitro anterior al aislamiento y la caracterización de los compuestos de interés industrial, sobre todo de interés terapéutico. Los métodos han sido, por lo tanto, aplicados hasta el punto en que incluyen una etapa de extracción del ADN de los organismos telúricos, dado el caso después de un aislamiento previo de los organismos contenidos en la muestra de suelo.

El ADN así extraído, es después lisado de las células bacterianas sin la etapa previa de vía del cultivo in vitro, es clonado en los vectores utilizados para transfectar los organismos huéspedes, con el fin de constituir los bancos de ADN que provienen de las bacterias del suelo. Estos bancos de clones recombinantes son utilizados para detectar la presencia de genes que codifican para los compuestos de interés terapéutico, o alternativamente para detectar la producción de compuestos de interés terapéutico por estos clones recombinantes. Sin embargo, los métodos de acceso directos al ADN de la microflora del suelo, descritos en el estado de la técnica, presentan inconvenientes al momento de la aplicación de cada una de las etapas descritas anteriormente, de naturaleza que se afecta considerablemente la cantidad y la calidad del material genético obtenido y explotado . El estado de la técnica relacionado con cada una de las etapas de construcción de los bancos de ADN que proviene de la muestras de suelo, es detallado a continuación, así como los inconvenientes técnicos identificados por la solicitante y que han sido superados de acuerdo con la presente invención. ***** ******* *,*****& aí??ÍÍÍMt^*M**?u*»*é**íi*^****^**í***M*?**^ ^. * 1. Etapa de extracción del ADN de una muestra del suelo . 1.1 Extracción directa del ADN del medio ambiente Se trata esencialmente de un procedimiento que aplique las técnicas de extracción de ADN realizadas directamente sobre la muestra en el medio ambiente, con más frecuencia después de un lisado in situ previo de los organismos de la muestra. Tales técnicas han sido aplicadas sobre las muestras que provienen de medios acuáticos, ya sea de agua dulce o marina. Comprenden una primera etapa de concentración previa de las células presentes libremente o bajo forma de partículas, que consiste en general de una filtración de grandes volúmenes de agua sobre diferentes dispositivos de filtración, por ejemplo, filtración clásica sobre membrana, filtración tangencial o rotacional o incluso ultrafiltración. El tamaño de ios poros está comprendido entre 0.22 y 0.45 mm y con frecuencia necesita una prefiltración con el objeto de evitar el atascamiento debido al tratamiento de grandes volúmenes. En un segundo tiempo, las células recolectadas son usadas directamente sobre los filtros en pequeños volúmenes de soluciones, para el tratamiento enzimático y/o químico.

JifaiíJaifcifat-tokit *,*. antean Esta técnica está ilustrada, por ejemplo por los trabajos de STEIN et al., 1996, Journal of Bacteriology, Vol. 178 (3) : 591-599, que describe la clonación de genes que codifican para el ADN ribosomal y para un factor de alargamiento de la transcripción (EF 2) a partir de Archaebacteries del plancton marino. Las técnicas de extracción directa del ADN a partir de las muestras del suelo o de sedimento se han descrito igualmente, basados sobre los protocolos de lisado físico, químico o enzimático realizado in situ. Por ejemplo, la patente US No. 5,824,485 (Chromaxome Corporation) describe un lisado químico de las bacterias directamente sobre la muestra tomada, por la adición de un amortiguador de lisado caliente a base de isotiocianato de guanidinio. La solicitud internacional no. WO 99/20,799 (WISCONSIN ALUMNI Research FOUNDATION) describe una etapa de lisado de las bacterias in situ con la ayuda de un amortiguador de extracción que contiene una proteasa y el SDS. Otras técnicas han sido utilizadas igualmente, tales como la realización de varios ciclos de congelación/descongelación de la muestra, después del prensado de la muestra descongelada a alta presión. Se han utilizado igualmente técnicas de lisado de bacterias con ayuda de una sucesión de etapas de sonicación, de calentamiento por microondas y de choques térmicos (PICARD et al. (1992) . Sin embargo, las técnicas de extracción directa del ADN del estado de la técnica descritas anteriormente, tienen una eficacia muy variable desde el punto de vista cuantitativo y cualitativo. Así, los tratamientos químicos o enzimáticos in situ de la muestra, tienen la desventaja de no lisar más que ciertas categorías de microorganismos debido al hecho de las resistencia selectiva de diferentes microorganismos nativos en la etapa de lisado debido a su morfología heterogénea . Así, las bacterias Gram positivas, resisten un tratamiento con calor en detergente SDS, mientras que la casi totalidad de las células Gram negativas son usadas. Además, ciertos de los protocolos de extracción directa descritos anteriormente, favorecen la absorción de los ácidos nucleicos extraídos sobre las partículas minerales de la muestra, reduciendo así significativamente la cantidad del ADN accesible. Además, si ciertos protocolos del estado de la técnica divulgan una etapa de tratamiento mecánico para lisar los microorganismos de la muestra tomada, tal etapa de lisado mecánico es efectuado sistemáticamente en medio líquido en un amortiguador de extracción, lo que no permite una buena homogenización de la muestra de partida bajo la forma de partículas finas que permitan una accesabilidad máxima a la diversidad de los organismos presentes en la muestra. Los ensayos de trituración han sido efectuados igualmente sobre la muestra de suelo bruto con ayuda de bolas de vidrio, pero la cantidad de ADN extraído es escasa. Se ha observado de acuerdo con la invención, que una primera etapa de lisado mecánico in situ en medio líquido, tiene efectos negativos sobre la cantidad de ADN susceptible de ser extraído. La cantidad de ADN directamente utilizable para la clonación de los vectores recombinantes es igualmente tributaria de las etapas de purificación subsecuentes a su extracción . En el estado de la técnica, el ADN extraído es, a continuación purificado, por ejemplo por el uso de polivinilpolipirrolidona, por una precipitación en presencia de acetato de amonio o de potasio, por centrifugaciones sobre un gradiente de cloruro de cesio, o incluso por técnicas cromatográficas, especialmente sobre un soporte de hidroxiapatita, sobre una columna de intercambio de iones o incluso un tamizado molecular, o por técnicas de electroforesis sobre gel de agarosa. Las técnicas de purificación del ADN descritas anteriormente, sobre todo aquellas que son combinadas con I l -f íf iiÉMm**!*^*^*****^*.*.******.*^,**!,**!.*.».*.. *.*^*^*>?^^^ta*^****-*í*-^****?**Jí****^*?*^t, **-*-**•* i las técnicas de extracción de ADN del medio ambiente citadas anteriormente, son susceptibles de conducir a una copurificación del ADN como compuestos inhibidores que proviene de la muestra inicial que son difíciles de eliminar. La coextracción de los compuestos inhibidores con el ADN necesita la multiplicación de numerosas etapas de purificación, lo que conduce a pérdidas importantes del ADN extraído inicialmente, y reduce simultáneamente la diversidad del material genético contenido inicialmente en la muestra, así como su cantidad. Otro objeto de la invención, ha sido superar los inconvenientes de los protocolos de purificación anteriores y de poner a punto una etapa de purificación del ADN que permita mantener de manera óptima la diversidad del ADN de la muestra inicial, por una parte, y favorecer cuantitativamente su obtención, por otra parte. Más particularmente, las mejoras cualitativas y cuantitativas de la purificación del ADN son máximas cuando recurren a una combinación de un procedimiento de extracción directo del ADN de acuerdo con la invención, y a un procedimiento de purificación ulterior, como aquel que será descrito a continuación. 1.2 Extracción indirecta del ADN del medio ambiente . Tales técnicas recurren a una primera etapa de separación de diferentes organismos de la microflora telúrica de otros que constituyen la muestra de partida, previamente a la etapa de extracción de ADN propiamente dicho. En el estado de la técnica, la separación previa de una fracción microbiana de una muestra de suelo, comprende con más frecuencia una dispersión física de la muestra por trituración de esta última en medio líquido, por ejemplo utilizando los dispositivos del tipo Waring Blender o incluso un mortero. Se ha descrito igualmente las dispersiones químicas, por ejemplo sobre resinas intercambiadoras de iones o incluso dispers.iones con ayuda de detergentes no específicos, tales como el desoxicolato de sodio o el polietilenglicol. Cualquiera que sea el modo de dispersión, la muestra sólida debe ponerse en suspensión en agua, amortiguador de fosfato o una solución salina. La etapa de dispersión física o química puede seguirse por una centrifugación sobre un gradiente de densidad que permita la separación de las células contenidas en la muestra y de las partículas de esta última, entendiéndose que las bacterias tienen densidades inferiores a aquellas de la mayor parte de las partículas del suelo.

^^¿ La etapa de dispersión física puede también seguirse alternativamente por una etapa de centrifugación a una velocidad baja o incluso una etapa de elutriación celular . El ADN puede extraerse a continuación de las células separadas por cualquiera de los métodos de lisado disponibles y ser purificado por numerosos métodos, comprendidos los métodos de purificación descritos en el párrafo 1.1 precedente. Especialmente, la inclusión de las células de agarosa de bajo punto de fusión puede realizarse con el fin de aprovechar el lisado. Sin embargo, los métodos descritos en el estado de la técnica conocidos por la solicitante, no proporcionan satisfacción debido al hecho de la presencia, en las fracciones que contienen el ADN extraído, de constituyentes no deseables de la muestra de partida que tienen una influencia significativa sobre la calidad y la cantidad del ADN final. La presente invención se propone resolver las dificultades técnicas encontradas en el procedimiento de la técnica anterior como será descrito a continuación. 2. Caracterización molecular del ADN extraido. Cuando se desea construir un banco de ADN a partir e una muestra del medio ambiente, en partícula a partir de una muestra de suelo, es ventajoso verificar la calidad y la diversidad de la fuente de ADN extraído y purificado previamente a su inserción en los vectores apropiados. El objetivo de tal caracterización molecular del ADN extraído y purificado es obtener los perfiles que representan las proporciones de los diferentes taxones bacterianos presentes en este extracto de ADN. La caracterización molecular del ADN extraído y purificado, permite determinar si los artefactos han sido introducidos al momento de la aplicación de las diferentes etapas de extracción y de purificación y, dado el caso, si la diversidad de origen del ADN extraído y purificado es representativa de la diversidad microbiana presente inicialmente en la muestra, especialmente en la muestra de suelo. De conocimiento de la solicitante, se recurre en el estado de la técnica a los procedimientos de hibridación cuantitativa que aplican sondas oligonucleotídicas específicas de diferentes grupos bacterianos, aplicadas directamente al ADN extraído del medio ambiente. Desafortunadamente, tal enfoque es poco sensible y no permite detectar los géneros o grupos taxonómicos presentes en poca abundancia. El estado de la técnica describe también los procedimientos de PCR cuantitativa, tal como la MPN-PCR o incluso la PCR cuantitativa por competición. Sin embargo, estas técnicas presentan importantes inconvenientes. Así, la PN-PCR es de una utilización compleja debido a la multiplicación de las diluciones y a la repeticiones que la vuelven inapropiada para un gran número de muestras o de pares de cebadores. Además, la PCR cuantitativa por competición es de aplicación difícil debido a la necesidad de construir un competidor específico al ADN blanco, que además no induce un sesgo o artefacto en la competición propiamente dicha. Por lo tanto, es propuesto de acuerdo con la invención un procedimiento de pretamizado de un banco de ADN que proviene de una muestra del medio ambiente que es a la vez rápido, simple y confiable, y que permite probar la calidad del ADN previamente extraído y purificado, y de determinar así el interés de construir un banco de clones preparados a partir de este ADN purificado de partida. 3. Vectores para la clonación del ADN purificado a partir de una muestra del medio ambiente. Numerosos vectores ya han sido descritos en el estado de la técnica con el fin de clonar el ADN previamente extraído de una muestra del medio ambiente. Así, de acuerdo con la descripción de la solicitud internacional no. WO 99/20,799, pueden utilizarse vectores ^^.Ag^^4jj,.^i^,mA^^a.a¿??.,«,^.lMa^a.aa,jt^,at,jl. l.,.<^^iaa¿a»jal^^fe?aÉria^ái^'to.a^^?i?ta virales, fagos, plásmidos, fagémidos, cósmidos, fósmidos, vectores del tipo BAC (cromosoma artificial bacteriano) o incluso el bacteriófago Pl, vectores del tipo PAC (cromosoma artificial basado sobre el bacteriófago Pl), vectores del tipo YAC (cromosoma artificial de levadura) , plásmidos de levadura o cualquier otro vector capaz de mantener y expresar de manera estable un ADN genómico. El ejemplo 1 de la solicitud PCT no. WO 99/20,799, describe la construcción de un banco de ADN genómico por l r clonación en un vector del tipo BAC. De conocimiento de la solicitante, ningún banco de ADN que proviene de una muestra del medio ambiente había sido realizada efectivamente con vectores del tipo conjugativo, tal técnica es hecha accesible y reproducible por primera vez 5 para el experto en la materia gracias a las enseñanzas de la presente invención. 4. Huéspedes celulares 0 En el estado de la técnica, numerosas células huésped han sido descritas como que pueden utilizarse con el fin de hospedar los vectores que contienen los insertos de ADN que proviene del ADN extraído y purificado a partir de una muestra del medio ambiente. iirffelií tt Así, la solicitud PCT N°WO 99/20.799 cita numerosos huéspedes celulares apropiados, tales como Escherichia coli , en particular la cepa DH 10B o incluso la cepa 294 (ATCC 31446, la cepa E. coli B, E. Coli X 1776 (ATCC N°31.537), E. coli DH5 a et E . coli W3110 (ATCC n°27.325). Esta solicitud PCT cita igualmente a otras células huésped apropiadas tales como En terobacter, Erwinia , Klebsiella , Proteus, Salmonella , Serra tia , Schigella o incluso las cepas del tipo bacill us tales como B . subtilis y B . licheniformis así como las bacterias del género Pseudomonas , Streptomyces o Actinomyces . La patente US N°5,824,485 cita en particular la cepa de Streptomyces lividans TK66 o incluso las células de levadura tales como las de Sa ccharomyces pombe . 5. Caracterización de los genes de interés en los bancos de ADN que proviene de una muestra del medio ambiente La Solicitud PCT N°WO 99/20.799 describe un vector del fenotipo de diferentes clones que pertenecen al banco de ADN de B . cereus, respectivamente un clon que produce la hemolisina, un clon que hidroliza la esculina o incluso un clon que produce un pigmento anaranjado. **!**** 8?^****.****** ?*******l*******f** áüá*! Las técnicas de mutagénesis basadas en la utilización de un transposón que codifica para la enzima pho A ha permitido posteriormente aislar los clones mutados y de caracterizar las secuencias responsables de los fenotipos observados. El artículo de STEIN et al. (1996) citado anteriormente, describe la utilización de cebadores específicos de ADN ribosomal con el fin de amplificar el ADN insertado en los vectores hospedados por ciertas clonas de un banco de ADN genómico de Archaebactéries del plancton marino y la identificación de varias secuencias codificantes en el ADN así amplificado. El artículo de BORSCHERT S. et al., (1992) describe el tamizado de un banco de ADN genómico de Ba cill us subtilis con ayuda de pares de cebadores que se hibridan con las regiones conservadas de péptido sintasas conocidas con el fin de identificar uno o varios genes correspondientes en el genoma de Bacill us subtilis . Esta técnica permite detectar un fragmento de ADN cromosómico de aproximadamente 26 kb que porta una parte del operón de la biosíntesis de la surfactma. El artículo de KAH-TONG S. et al. (1997) describe el tamizado de un banco de ADN que proviene del suelo con ayuda de cebadores que se hibridan con las secuencias conservadas del operón responsable de la vía de la k??nata*. *.****** *. -' ** - *^>I**L****^*?*****I *** *..** ¿*^.¡ biosíntesis de los poiicétidos dei tipo II y muestra la identificación, en el seno de este banco de ADN, de las secuencias emparentadas con el gen PKS-ß. Este artículo describe también la construcción de casetes de expresión híbridos en los cuales la secuencia de la subunidad PKS-ß, encontrada naturalmente en el operón responsable de la biosíntesis de los policétidos, ha sido reemplazada por diferentes secuencias emparentadas encontradas en el banco de ADN. De igual modo, el artículo de HONG-FU et al., (1995) describe la construcción de casetes de expresión que contienen las diferentes fases de lectura abierta del operón responsable de la biosíntesis de los policétidos, los diferentes casetes de expresión han sido construidos artificialmente combinando las fases de lectura abierta que no son encontradas juntas naturalmente en el genoma de Streptomyces coelicolor. Este artículo muestra que la combinación, en los casetes de expresión artificiales, de los marcos de lectura abierta originarios de diferentes cepas bacterianas permite la producción de policétidos que tienen diferentes características estructurales y actividades antibióticas más o menos grandes frente a Ba cil l us subtilis y Bacill us cereus . * *.£& * *. t^^****^^**^*^*****^-****^!******* .... ***- **.- . . ?*j.\ Los policétidos forman parte de una gran familia de productos naturales de estructura variable y poseen una gran diversidad de actividades biológicas. Forman parte de los policétidos por ejemplo, las tetraciclinas y la eritromicina (antibiótico), el FK506 (inmunosupresor), la doxorrubicina (agente anticancerígeno) , la monensina (un agente cocidioestático) así como la vermectina (un agente antiparasitario) . Estas moléculas son sintetizadas gracias a las enzimas multifuncionales llamadas policétidos sintasas, que catalizan los ciclos de condensación repetidos entre los acil tioésteres (en general los acetil, propionil, malonil o metilmalonil tioésteres) . Cada ciclo de condensación conduce a la formación, sobre una cadena carbonada creciente, de un grupo ß-ceto que puede a continuación sufrir dado el caso, una o varias series de etapas reductoras. Tomando en cuenta el interés clínico importante de los policétidos, su mecanismo común de biosíntesis así como el alto grado de conservación observado entre los grupos de genes que codifican para los policétidos sintasas, se ha desarrollado un interés incrementado para el desarrollo de novedosos policétidos por ingeniería genética. Así, novedosos policétidos artificiales han sido producidos por ingeniería genética, tales como la mederodina A o la dihidrogranatirhodina . La gran mayoría de las **¡**.******t*u? ¿??ffit|g¡HjH¡lfig| itr -ni mi ?? ^ MááéM^ moléculas novedosas de policétidos obtenidas por ingeniería genética son muy diferentes, desde el punto de vista estructural, de los policétidos correspondientes naturales. Del estado de la técnica, resulta así que existe una necesidad de obtener policétidos novedosos de interés y más particularmente de policétidos de interés terapéutico que presenten especialmente, con respecto a sus homólogos naturales, un nivel incrementado de actividad antibiótica o incluso un espectro de actividad natibiótica diferente, sea más grande que aquel de los policétidos conocidos, o al contrario más selectivo. Esta necesidad es como será descrito a continuación, en parte satisfecha de acuerdo con la presente invención .

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona primeramente con un procedimiento para la construcción de bancos de ADN que proviene de una muestra de ADN, tal muestra puede ser indiferentemente un medio acuático (agua dulce o marina) , una muestra de suelo (capa superficial del suelo, subsuelo o sedimento) , o incluso una muestra de organismos eucariotes contenidos en una microflora asociada, tal como por ejemplo una muestra que proviene de plantas, de insectos, o incluso de organismos marinos y que posean una microflora asociada.

La puesta punto de un procedimiento de construcción de un banco de ADN de una muestra del medio ambiente, y más particularmente de una muestra del suelo, comprende etapas críticas donde la aplicación debe ser necesariamente optimizada para la obtención de un banco de ADN donde el contenido de ácidos nucleicos de interés responda a los objetivos inicialmente fijados. Una primera etapa crítica consiste en la extracción y la purificación ulterior de los ácidos nucleicos contenidos inicialmente en la muestra, es decir, principalmente los ácidos nucleicos contenidos en los diversos organismos que componen la microflora de esta muestra. La calidad de la purificación del ADN extraído es determinante sobre el resultado obtenido. Una segunda etapa importante de un procedimiento de construcción de un banco de ácidos nucleicos que provienen de una muestra del medio ambiente es la evaluación de la diversidad genética de los ácidos nucleicos extraídos y purificados. La aplicación ds ¡xa etapa de realización simple y confiable de pretamizado del ADN extraído y purificado con el fin de verificar que informe, al menos parcialmente, de la diversidad fiiogenética de los organismos presentes inicialmente en la muestra de partida, permite en efecto, determinar el interés o no de utilizar la fuente inicial de ADN extraído y purificado para la construcción del banco de Í********* ?**..t &** , * * *i?.*** -kié* *j** *- **- .* *ií¡?s*é?¡? *, ptiMJÉlfc*-»- ******&* ácidos nucleicos propiamente dicho, o por el contrario, de no proseguir la construcción de bancos de ácidos nucleicos debido a artefactos muy importantes introducidos al momento de la extracción y de la purificación de los ácidos nucleicos. Se ha identificado además de acuerdo con la invención, que la calidad de los insertos introducidos en los vectores para construir el banco es determinante. También se ha determinado que el uso de enzimas de restricción para separar el ADN extraído y purificado a partir de la muestra del medio ambiente, es de naturaleza que introduce artefactos o "desviaciones" en la estructura de los insertos obtenidos. En efecto, el ADN extraído del suelo o de otros medios, que proviene en su gran mayoría de organismos no cultivables, está compuestos de moléculas donde la relación de bases G y C es por definición desconocida, y además variable en función del origen de estos organismos. Una tercer etapa crítica es la inserción de los ácidos nucleicos extraídos y purificados en los vectores capaces de integrar los ácidos nucleicos de longitud elegida, por una parte, y por otra parte, permitir la transfección o incluso la integración en el genoma de los huéspedes celulares determinados así como, dado el caso, de permitir la expresión en tales huéspedes celulares. Constituyen los vectores de interés, los vectores capaces de integrar los ácidos nucleicos de gran tamaño, es decir de tamaño superior a 100 kb puesto que el objetivo perseguido consiste en una clonación y una identificación de un operón completo capaz de dirigir una vía completa de biosíntesis de un compuesto de interés industrial, en particular de un compuesto de interés farmacéutico o agronómico .

DEFINICIONES En el sentido de la presente invención, se entiende por "ácidos nucleicos", "polinucleótidos" y "oligonucleótidos", así como secuencias de ADN, ARN, las secuencias híbridas de ARN/ADN de más de dos nucleótidos, de manera indiferente bajo la forma de hebra simple o hebra doble . El término, "banco" o "colección" es utilizado en la presente descripción con referencia de manera indiferente a un conjunto de ácidos nucleicos extraídos y, dado el caso purificados, que provienen de una muestra del medio ambiente, a un conjunto de vectores recombinantes, cada uno de los vectores recombinantes del conjunto comprende un ácido nucleico que proviene del conjunto de ácidos nucleicos extraídos, y dado el caso, purificaaos citados anteriormente, así como un conjunto de células huésped recombinantes que comprenden uno o varios ácidos nucleicos que provienen del conjunto de los ácidos nucleicos extraídos y, dado el caso, ***** . ***u*.g*J*.J***********-•--- * *-** **:*"f-f- •^j*fait*1fatfc,in*fBf*Ht i purificados citados anteriormente, dichos ácidos nucleicos son portados por uno o varios vectores recombinantes, o están integrados en el genoma de la célula huésped recombinantes. Se designa por "muestra del medio ambiente" de manera indiferente una muestra de origen acuático, por ejemplo de agua dulce o salina, o una muestra telúrica que proviene de la capa superficial del suelo, de sedimentos o incluso de capas inferiores del suelo (subsuelo) , así como las muestras de organismos eucariotes, dado el caso multicelulares, de origen vegetal, que provienen de organismos marinos o incluso de insectos y que poseen una microflora asociada, esta microflora asociada constituye los organismos de interés. Se entiende por "operón" de acuerdo con la invención, un conjunto de marcos de lectura abiertos, donde la transcripción y/o la traducción es corregulada por un conjunto único de señales de regulación de la transcripción y/o de la traducción. De acuerdo con la invención, un operón puede igualmente comprender dichas señales de regulación de la transcripción y/o de la traducción. Por "vía metabólica" para los fines de la invención o incluso "vía de biosíntesis", se entiende un conjunto de reacciones bioquímicas, anabólicas o catabólicas que realizan la conversión de una primera especie química a una segunda especie química. ?** *.?. ?fi.* .* , *.** *ti***. ».-t..aai^^ t«aBjt^^J»i¿^^to^-,» »fjAA.A¡A-a a Por ejemplo, una vía de biosíntesis de un antibiótico está constituida por el conjunto de reacciones bioquímicas que convierten los metabolitos primarios en productos intermediarios de los antibióticos, después posteriormente en antibióticos. Por secuencia de repoblación colocada "en fase" (en inglés enlazada de manera operable) con respecto a una secuencia nucleotídica donde la expresión es buscada, se entiende que la o las secuencias de regulación de la transcripción están localizadas, con respecto a la secuencia nucleotídica de interés donde la expresión es buscada, de manera que permita la expresión de la secuencia de interés, la regulación de la expresión es dependiente de factores que interactúan con las secuencias nucleotídicas reguladoras. De acuerdo con otra terminología, se puede decir igualmente que la secuencia nucleotídica de interés donde se busca la expresión "bajo el control" de las secuencias nucleotídicas reguladoras de la transcripción. El término "aislado" en el sentido de la presente invención designa un material biológico que ha sido sustraído de su medio ambiente original (el medio ambiente en el cual está localizado naturalmente) . Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido presente en el estado natural en un organismo (virus, bacteria, champiñón, levadura, planta o animal) no está * J*?*í******-****l-**. *****.-M*i. É*******.*'* MtJt * aislado. El mismo polipéptido separado de su medio ambiente natural o el mismo polinucleótido separado de los ácidos nucleicos adyacentes en el seno de los cuales está insertado naturalmente en el genoma del organismo, está aislado. Tal polinucleótido puede estar incluido en un vector y/o tal polinucleótido puede estar incluido en una composición y permanecer sin embargo en el estado aislado, debido a que el vector o la composición no constituyen su medio ambiente natural. El término "purificado" no necesita más que el material esté presente bajo una forma de pureza absoluta, exclusivo de la presencia de otros compuestos. Se trata por lo tanto de una definición relativa. Un polipéptido o un polinucleótido está en el estado purificado después de la purificación del material de partida de al menos un orden de magnitud, de preferencia 2 ó 3 y de preferencia 4 ó 5 órdenes de magnitud. El "porcentaje de identidad" entre dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos, en el sentido de la presente invención, puede determinarse comparando dos secuencias alineadas de manera óptima, a través de una ventana de comparación . La parte de la secuencia nucleotídica o del polipéptido en la ventana de comparación puede así comprende adiciones o supresiones (por ejemplo "hueco") con respecto a la secuencia de referencia (que no comprende estas adiciones o supresiones) de manera que se obtiene una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje es calculado determinando el número de posiciones en las cuales una base nucleica o un residuo de aminoácido idéntico es observado para las dos secuencias (nucleico o peptídico) comparadas, después dividiendo el número de posiciones en las cuales hay identidad entre las dos bases o residuos de aminoácidos por el número total de posiciones en la ventana de comparación, después multiplicando el resultado por 100 con el fin de obtener el porcentaje de identidad de secuencia. La identidad óptima de las secuencias para la comparación puede realizarse de manera informática con ayuda de algoritmos conocidos contenidos en el paquete de la Sociedad WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor., Madison, WISCONSIN. A modo de ilustración, el porcentaje de identidad de la secuencia podrá efectuarse con la ayuda de lógico BLAST (versiones BLAST 1.4.9 de Marzo de 1996, BLA?T 2.0.4 de Febrero de 1998 y BLAST 2.0.6. de Septiembre de 1998), utilizando exclusivamente los parámetros por defecto (S.F.

Altschul et al., J. Mol. Biol. 1990 215:403-410, S. F. Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997 25:3389-3402). Blast - i i'ti tlüfaid f%i* .-,*?m **- ******-<** ** .,...,.-^aria^^^a^^^^^^aa^áh»^» i ?i^* busca las secuencias similares/homologas a una secuencia "solicitada" de referencia, con ayuda del algoritmo de Altschul et al. La secuencia solicitada y las bases de datos utilizadas pueden ser peptídicas o nucleicas, cualquier combinación es posible.

EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS QUE PROVIENEN DE UNA MUESTRA DEL MEDIO AMBIENTE 1. Extracción directa de los ácidos nucleicos Se ha mostrado de acuerdo con la presente invención que, para la obtención de un banco de ácidos nucleicos que provenga de organismos contenidos en una muestra de suelo, es importante crear condiciones en las cuales, por una parte, los diferentes organismos de la muestra se vuelvan accesibles a las etapas superiores de extracción de los ácidos nucleicos y, por otra parte, que la etapa inicial del tratamiento de la muestra del suelo permita un lisado mecánico máximo de los organismos de la muestra de naturaleza que se vuelvan directamente accesibles los ácidos nucleicos de estos organismos, principalmente el ADN genómico y plasmídico, en los amortiguadores utilizados para las etapas interiores de extracción. Se ha demostrado así, de acuerdo con la invención, que una accesibilidad máxima de los ácidos nucleicos que provienen de microorganismos de una muestra de suelo se logra **i*? ?,? ****** *t*sá*iil.**.. =cC, --,a»„a,M . ****.***.-* **.***,.. ... ..^^^j^^ *. **** * * * ***^^ ***** . . .Í* por el triturado favorecido y en seco de la muestra del suelo previamente seca con el fin de obtener las micropartículas. La solicitante ha determinado también que el secado de la muestra del suelo previamente a cualquier tratamiento posterior provoca una disminución significativa de la cohesión de la muestra del suelo bruto y favorece en consecuencia, su degradación posterior bajo la forma de micropartículas, cuando un tratamiento por triturado apropiado es operado. De manera sorprendente, la solicitante ha mostrado que las micropartículas de muestras de suelo seco que reúnen las propiedades fisicoquímicas favorables para la extracción de una cantidad óptima de ácidos nucleicos, que en su naturaleza, pueden ser representativas de la diversidad genética de los organismos presentes inicialmente en la muestra del suelo de partida. Se ha mostrado en particular que el procedimiento de extracción directa de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención permite la extracción de ADN que proviene de microorganismos raros, tales como ciertos Streptomyces raros, o microorganismos esporulados. Por "micropartícuias" de muestra de suelo, para los fines de la presente invención, se entienden partículas derivadas de la muestra que tengan una talla promedio de íí?.i i,?*á..Í*¡*^**Á.ii*L..tt**********.** aproximadamente 50 µm, es decir comprendidas en promedio entre 45 y 55 µm. De acuerdo con la invención, las micropartículas son obtenidas a partir de muestras de suero previamente secas o desecadas, después trituradas hasta la obtención de micropartículas de tamaño promedio comprendido entre 2 µm y 50 µm, antes de ponerse en suspensión en un medio amortiguador líquido de las micropartículas obtenidas. Tal medio amortiguador líquido puede consistir de un amortiguador de extracción de ácidos nucleicos, en particular un amortiguador de extracción del ADN convencional bien conocido por el experto en la materia. La trituración de la muestra del suelo en micropartículas tiene por doble función lisar mecánicamente la mayoría de los organismos presentes en la muestra del suelo inicial y volver accesibles los organismos no lisados por este tratamiento mecánico para las etapas facultativas posteriores de lisado químico y/o enzimático. Así, un primer objeto de la invención consiste en un procedimiento de preparación de una colección de ácidos nucleicos a partir de una muestra de suelo que contenga los organismos, el procedimiento comprende una primera etapa (I- (a)) de obtención de micropartículas por trituración de la muestra del suelo previamente seca o desecada, después poner en suspensión las micropartículas en un medio amortiguador líquido. De manera más preferida, la etapa de trituración se realiza con la ayuda de un dispositivo de bolas de ágata o de tungsteno o de incluso con la ayuda de un dispositivo de anillos de tungsteno. Estos dispositivos son preferidos porque la dureza del material como la ágata o el tungsteno facilita significativamente la obtención de micropartículas del tamaño especificado anteriormente. Por esta razón, uno no eligirá de manera preferida, incluso evitará, recurrir a un dispositivo de trituración de bolas de vidrio, el cual se revela un poco menos eficaz. El secado o la clasificación de la muestra de suelo puede realizarse por cualquier método conocido por el experto en la materia. Por ejemplo, la muestra de suelo bruto puede secarse a temperatura ambiente durante una duración de 24 a 48 horas. Como se indica anteriormente, el medio amortiguador líquido puede consistir en un medio de extracción del ADN presente en las micropartículas. Se utilizará de manera más preferida un amortiguador de extracción designado TENP que contenga respectivamente tris 50 mM, EDTA 20 mM, NaCl 100 mM y 1% (peso/volumen) de polivinilpolipirrolidona a un pH de 9.0.

El procedimiento de preparación de una colección de ácidos nucleicos a partir de una muestra de suelo esta caracterizado además porque la etapa de obtención de micropartículas por trituración de la muestra de suelo previamente seca o desecada esta seguida por una etapa l-(b) de extracción de los ácido nucleicos presentes en las micropartículas . Es una constante que la extracción de los ácidos nucleicos esta acompañada de una coestracción de compuestos y/o de constituyentes del suelo indeseables que necesitan la purificación posterior de los ácidos nucleicos extraídos, tal etapa de purificación posterior debe ser a la vez suficientemente selectiva para permitir la eliminación de los compuestos y/o los constituyentes del suelo indeseables, y de un rendimiento suficiente para arrastrar una pérdida escasa en cantidad del ADN previamente extraído. Se ha mostrado de acuerdo con la invención que una etapa de purificación del ADN extraído de las micropartículas de la muestra de suelo que responde a los criterios de selectividad y de rendimiento definidos anteriormente, comprende un tratamiento del ADN extraído por una combinación de dos etapas sucesivas de cromatografía, respectivamente una cromatografía sobre un tamiz molecular y una cromatografía de intercambio de iones. ^¡1.1.^11111., ^******t*** ***********t**»**?**.* ** **.. ..*> * *. *? *?r, r ¡ -»t**tr-?ÍU'am^:^ ^??^*?e?^-*^t????^^'^ De acuerdo con otra característica del procedimiento anterior, la etapa l-(b) de extracción de los ácidos nucleicos es seguida de una etapa l-(c) de purificación de los ácido nucleicos extraídos con la ayuda de dos etapas de cromatografía siguientes: - el paso de la solución que contiene los ácido nucleicos sobre un tamiz molecular, después de la recuperación de las fracciones de elución enriquecidas en ácidos nucleicos; - el paso de las fracciones de elución enriquecidas con ácidos nucleicos sobre un soporte de cromatografía de intercambio de iones, después la recuperación de las fracciones de elución que contienen los ácidos nucleicos. La naturaleza y el orden de las etapas de la cromatografía anteriores son esenciales para una buena selectividad y un excelente rendimiento de la etapa de purificación del ADN previamente extraído de las micropartículas de la muestra de suelo, previamente seca o desecada . De manera muy ventajosa, el soporte cromatográfico del tipo "tamiz molecular" de la etapa de purificación de los ácidos nucleicos anterior, consiste en un soporte cromatográfico del tipo Sephacryl© S400 HR o un soporte cromatográfico de características equivalentes.

De manera más preferida, el soporte cromatográfico de intercambio de aniones utilizado al momento de la segunda etapa de purificación del ADN extraído, es un soporte del tipo Elutip©, o un soporte cromatográfico de características equivalentes. En combinación, las etapas l-(a) de obtención de micropartículas de la muestra de suelo seco, l-(b) de extracción de los ácido nucleicos presentes en las micropartículas y l-(c) de purificación por las etapas cromatográficas descritas anteriormente, es posible de acuerdo con invención extraer directamente el ADN del suelo sin purificación previa de las células de los organismos contenidos inicialmente en la muestra, evitando la coestracción de los contaminantes del suelo, tales como por ejemplo los ácidos húmicos que se observan con los procedimientos del estado de la técnica. Los contaminantes, tales como los ácido húmicos afectan severamente los análisis y los usos subsecuentes de los ácidos nucleicos cuya purificación se busca. De acuerdo con el procedimiento anterior, es posible accede a los ácidos nucleicos contenidos en los organismos que no han sido alisados mecánicamente en el curso de la etapa l-(a) de obtención de micropartículas de la muestra de suelo, con el objeto de obtener una colección casi exhaustiva de la diversidad genética de los ácido nucleicos presentes inicialmente en la muestra de suelo. Así, las micropartículas de la muestra de suelo pueden ser el objeto de etapas posteriores de tratamiento del lisado químico, enzimático o físico, o incluso de una combinación de tratamientos químicos, enzimáticos o físicos. De acuerdo con un primer aspecto, el procedimiento de preparación de una colección de ácidos nucleicos a partir de una muestra de suelo de acuerdo con al invención, puede caracterizarse además en que la etapa 1 (a) es seguida de las etapas siguientes: • tratamiento de la suspensión del suelo en un medio amortiguador líquido por sonicación; • extracción y recuperación de las ácidos nucleicos. De manera preferida, se recurrirá, por un tratamiento por sonicación, a un dispositivo del tipo de micropunta de titanio, tal como el dispositivo 600 W Vibracell Ultrasomcator comercializado por la Sociedad Bioblock o incluso un sonicador del tipo Cup Horn. De manera más preferida, la etapa de sonificación es realizada una potencia de 15 W durante una duración de 7 a 10 minutos y comprenden ciclos sucesivos de sonicación, la sonicación propiamente dicha se realiza durante el 50% de la duración de cada ciclo.

De acuerdo con un segundo aspecto, el procedimiento anterior puede caracterizarse además en que la etapa l-(a) es seguida de las etapas siguientes: • tratamiento de la suspensión del suelo en un medio amortiguador líquido por sonicación; • incubación de la suspensión a 37 °C después de la sonicación en presencia de lisozimatica de acromopeptidasa; • adición de SDS antes de la centrifugación y precipitación de los ácido nucleicos; • recuperación de los ácido nucleicos precipitados. De preferencia, la etapa de incubación en presencia de lisozima y de acromopeptidasa será realizada una concentración final de 0.3 miligramos/ mililitros de cada una de los dos enzimas, de preferencia durante 30 minutos a 37°C. De manera preferida, el SDS será utilizado a una concentración final de 1% y durante un tiempo de incubación de una hora a la temperatura de 60°C durante la centrifugación y precipitación. De acuerdo con un tercer aspecto, el procedimiento de preparación de una colección de ácidos nucleicos a partir de una muestra de suelo anterior, está caracterizada además en que la etapa l-(a) esta seguida de las etapas siguientes: - homogeneización de la suspensión del suelo con una etapa de mezclado violento (vórtice) seguido de una etapa de simple agitación; .** -. ***&,**,..* &. ?t*. **-,**. - congelación de la suspensión homogénea seguida de una descongelación; - tratamiento por sonicación de la suspensión después de la descongelación. - incubación de la suspensión a 37°C después de la sonicación en presencia de lisozima y cromopeptidasa; - adición de SDS antes de la centrifugación y precipitación de los ácidos nucleicos; - recuperación de las ácidos nucleicos. De manera preferida, las suspensiones de micropartículas de suelo son pasadas en un vórtice después homogeneizadas por agitación suave sobre un agitador de rotación circular durante una duración de dos horas antes de ser congeladas a -20°C. De manera preferida, las suspensiones son agitadas nuevamente violentamente por el vórtice durante 10 minutos, después de la descongelación y antes de la etapa de sonicación . No hay que decir que los ácidos nucleicos extraídos por los modos de realización de extracción directa de los ácidos nucleicos descrito anteriormente, son purificados de manera preferida de acuerdo con la etapa de purificación constituida de un primer paso sobre un tamiz molecular, después un paso subsecuente de las fracciones de efusión obtenidas a la salida de la cromatosrafía sobre el tamiz *** *** ** - *..,tMt^^i^M*?iA.<A^.^ia?J^^^»^?^?ii«to?jW.». molecular sobre un soporte cromatográfico de intercambio de aniones . 2. Extracción indirecta de los ácidos nucleicos De acuerdo con un segundo modo de realización del procedimiento de preparación de una colección de ácidos nucleicos a partir de una muestra del medio ambiente, de acuerdo con la invención, la muestra del medio ambiente sufre un primer tratamiento de naturaleza que permite la separación de los organismos, contenidos en la muestra, de los otros macroconstituyentes de la muestra. Este segundo modo de realización del procedimiento de preparación de una colección de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, favorece la obtención de ácidos nucleicos de gran tamaño, que son prácticamente imposibles de obtener de acuerdo con el primer modo de realización del procedimiento de acuerdo con la invención descrita anteriormente, la etapa de lisado mecánico operada para la obtención de las micropartículas tiene igualmente por efecto romper físicamente los ácidos nucleicos de la muestra de suelo o los ácido nucleicos contenidos en los organismos de la muestra de suelo. La obtención de ácidos nucleicos de gran tamaño ha sido buscada por la solicitante con el objeto de aislar y caracterizar los ácidos nucleicos que comprenden, al menos parcialmente, el conjunto de las secuencias codificantes emparentadas a un mismo operon capaz de dirigir la biosíntesis de un compuesto de interés industrial. De manera preferida, se obtiene, aplicando el segundo modo de realización del procedimiento de preparación de una colección de ácidos nucleicos a partir de una muestra de suelo de acuerdo con la invención, ácidos nucleicos que tienen un tamaño superior a 100 kb, de preferencia superior a 200, 250 ó 300 kb, y de manera más preferida de ácidos nucleicos de un tamaño superior de 400, 500 o incluso 600 kb. Este segundo modo de realización de un procedimiento de preparación y una colección de ácidos nucleicos a partir de una muestra del medio ambiente, de acuerdo con la invención, esta constituida de una combinación de cuatro etapas sucesivas destinadas a la obtención de ácidos nucleicos que tengan las características descritas anteriormente . Cuando la muestra del medio ambiente es una muestra de suelo, se ha mostrado de acuerdo con la invención que una primera etapa de obtención de una suspensión por dispersión de la muestra de suelo en medio líquido favorece la accesibilidad de los organismos contenidos en la muestra sin provocar el lisado mecánico significativo de las células. La primera etapa de obtención de una dispersión de la muestra del suelo anterior, vuelva accesibles los -f*?í **Íx*f..*f?*?*^* *^*¿..*Í*i??*. ?¡*.***t*^ ü^^t^te tt organismos de la muestra al medio exterior y permite igualmente una disociación parcial de los organismos de la muestra y de los macroconstituyentes . Vuelve así posible una separación posterior de los organismos contenidos inicialmente en la muestra de otros constituyentes de esta última . Cuando la muestra del medio ambiente proviene por ejemplo de vegetales, de organismos marinos o de insectos, un tratamiento previo por trituración es necesario con el fin de volver a los organismos de la microflora asociada, accesibles a las etapas posteriores del procedimiento. Así, el presente procedimiento comprende una etapa de separación de los organismos de otros constituyentes minerales y/u orgánicos obtenidos anteriormente por una centrifugación sobre un gradiente de densidad. Los organismos así separados son a continuación sometidos a una etapa de lisado después de la extracción de ácidos nucleicos. La etapa de centrifugación sobre un gradiente de densidad, de manera sorprendente, permite separar las células de organismos de partículas del suelo contenidas en la suspensión de la muestra. Se podrá en efecto, esperar que una proporción de células sea arrastrada con las macropartículas en el seno de la fase del gradiente. Además, nunca ha sido demostrado hasta el presente que una centrifugación sobre un gradiente de densidad de una muestra de suelo permite recuperar, en al interfaz de la fase acuosa/ gradiente, una población de organismos representativa de la diversidad de organismos presentes en la muestra de partida, debido a que estos organismos son de volumen, densidad y forma extremadamente variables. Se puede suponer razonablemente que serán encontrados de manera indiferente en el seno de la fase acuosa, en la interfaz de la fase acuosa/ gradiente de densidad, e> igualmente en el seno del gradiente de densidad mismo. Así, el experto en la materia puede esperar que estos organismos presenten densidades más bajas o más altas que la densidad del gradiente de densidad utilizado (densidad del gradiente de densidad comprendida entre 1.2 y 1.5 gramos/ mililitros, de preferencia 1.3 gramos/mililitros) no puedan ser recuperados, lo que tendrá por efecto la introducción en una desviación en la representatividad de los organismos separados efectivamente y, por consiguiente, igualmente la diversidad de los ácidos nucleicos extraídos. Además, en un modo de realización particular del procedimiento, se realiza una etapa de germinación de las esporas, en particular de actinomicetos, lo que tiene por efecto incrementar de manera significativa la cantidad del ADN de actinomicetos recuperado. La última etapa consiste de una etapa de purificación de los ácidos nucleicos así extraídos sobre un gradiente de cloruro de cesio.

De manera sorprendente, la purificación de los ácido nucleicos sobre el gradiente de cloruro de cesio permite una eliminación sustancial, incluso completa, de las sustancias que componen el gradiente de densidad. Esta característica es determinante en lo que concierne a la utilización posterior de los ácidos nucleicos purificados puesto que el gradiente de densidad es conocido como un potente inhibidor enzimático, capaz, dado el caso de inhibir la actividad catalítica de las enzimas utilizadas para preparar la inserción de los ácidos nucleicos extraídos en los vectores. De acuerdo con este segundo modo de realización, el procedimiento de preparación de una colección de ácidos nucleicos a partir de una muestra del medio ambiente que contiene organismos de acuerdo con la invención, comprende la sucesión de etapas siguientes: i) obtención de una suspensión p?r dispersión de la muestra del medio ambiente del medio líquido, después homogeinisacion de la suspensión obtenida por agitación suave; li) separación de los organismos de otros constituyentes minerales y/u orgánicos de la suspensión homogénea obtenida en la etapa i), por centrifugación sobre un gradiente de densidad; ísáí?M M ¿oM?kji? -^- -**!•*<-* mr'? " -^¡ ^?.¡*^?^L?* át*ld**L? iii) lisado de los microorganismos separados en la etapa ii) y extracción de los ácidos nucleicos; iv) purificación de los ácidos nucleicos sobre un gradiente de cloruro de cesio. De manera preferida, la suspensión de la muestra de suelo se obtiene por dispersión de esta muestra por trituración con ayuda de un dispositivo del tipo Waring Blender o un dispositivo de características equivalentes. De manera más preferida, la suspensión de la muestra se obtiene después de tres triturados sucesivos de una duración de un minuto cada uno en un dispositivo del tipo Waring Blender. De preferencia, la muestra triturada será enfriada en hielo entre cada uno de los triturados. De manera preferida, los organismos son a continuación separados de las partículas del suelo por centrifugación sobre un colchón de densidad del tipo "Nycodenz", comercializado por la Sociedad Nycomed Pharma AS. (Oslo, Noruega) . Las condiciones preferidas de centrifugación son de 10,000 g durante 40 minutos a 4°C. Ventajosamente, en un rotor de recipientes móviles del tipo "rotor TST 28.38" comercializado por la Sociedad KONTRON. El anillo de organismos localizado, después de la centrifugación, en la interCase de la fase superior acuosa y de la fase inferior de Nycodenz es entonces tomado y lavado por centrifugación antes de volver a tomar el residuo celular en un amortiguador apropiado. La etapa (iii) de lisado de los organismos separados en la etapa (ii) descrita anteriormente, puede realizarse de cualquier manera conocida por el experto en la materia . Ventajosamente, las células son usadas en una solución de Tris 10 mM-EDTA 100 mM a un pH de 8.0 en presencia de lisozima y acromopeptidasa, de manera ventajosa durante una hora a 37°C. La extracción propiamente dicha del ADN puede realizarse ventajosamente por la adición de una solución de lauril sarcosilo (1% en peso final de la solución), en presencia de proteinaza K e incubación de la solución final a 37°C durante 30 minutos. Los ácidos nucleicos extraídos en la etapa (iii) son purificados a continuación sobre un gradiente de cloruro de cesio. De manera preferida, la etapa de purificación de los ácidos nucleicos sobre un gradiente de cloruro de cesio se realiza por centrifugación a 35,000 revoluciones/minuto durante 36 horas, por ejemplo sobre un rotor del tipo Kontron 65.13. De acuerdo con un aspecto particular del procedimiento de preparación de una colección de ácidos nucleicos a partir de una mezcla de suelo que contiene los organismos de acuerdo con la invención, dichos ácidos nucleicos están constituidos principalmente, sino que exclusivamente, de moléculas de ADN. De acuerdo con otro aspecto, los ácido nucleicos pueden ser recuperados después de la inclusión de los organismos, separados sobre un gradiente de densidad, en un bloque de agarosa y lisados, por ejemplo química y/o enzimáticamente, los organismos incluidos en el bloque de agarosa. Otro objeto de la invención consiste en una colección de ácidos nucleicos constituidos por los ácidos nucleicos contenidos en la etapa II- (iv) del procedimiento de preparación de una colección de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, o incluso obtenida en la etapa (c) o en una etapa posterior del procedimiento de preparación de una colección de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención. La invención también es relativa a un ácido nucleico caracterizado en que está contenido en una colección de ácidos nucleicos tal como la definida anteriormente. De acuerdo con un primer aspecto, tal ácido nucleico constitutivo de una colección de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, está caracterizado en que comprende una secuencia nucleotídica que codifica al menos un operón, o una parte de un operón.

De manera más preferida, tal operón codifica para la totalidad o una parte de una vía metabólica. El ejemplo 9 describe la construcción de un banco de ADN genómico a partir de una cepa de Streptomyces alboniger y su clonación respectivamente en los cósmidos satélites pOS700I y pOS7000R. Se ha mostrado, de acuerdo con la invención, que el banco de ADN realizado en el vector integrativo pOS700I nueve clones contienen las secuencias nucleotídicas emparentadas con el operón responsable de la vía de biosíntesis de la puromicina. De igual manera, se han podido identificar en el seno del banco de ADN realizado en el vector duplicativo pOS700R, doce clones que contienen las secuencias nucleotídicas del operón responsable de la vía de la biosíntesis de la puromicina. En particular, ciertos cósmidos integrativos y duplicativos de los bancos realizados actualmente, después de la digestión por las endonucleasas de restricción Clal y EcoRV, un fragmento de un tamaño de 12 kb susceptible de contener la totalidad de las secuencias del operón responsable de la vía de biosíntesis de la puromicina. Así, de acuerdo con otro aspecto, un ácido nucleico de acuerdo con la invención contiene, al menos en parte, secuencias nucleotídicas del operón responsable de la vía de biosíntesis de la puromicina. j¿. AA^»f^# -j--tt*fe*--*a-» ^--*-.-.**^.*-'**.***.**..*. *..***.i*?^^...*í*»,á*f fi^^ ^^?*.? El ejemplo 2, a continuación describe la construcción de un banco de ADN de acuerdo con un procedimiento de acuerdo con la invención en un vector pBluescript SK a partir de suelo contaminado por lindano. Los vectores recombinantes han sido transfectados en las células de Escherichia coli DH10B, después las células transformadas son cultivadas en un medio de cultivo apropiado en presencia de lindano. Un tamizado de los clones de las células transformadas del banco ha permitido mostrar que sobre 10,000 clones tamizados, 35 de entre ellos presentan un fenotipo de degradación de lindano. La presencia del gen linA en estos clones se ha podido confirmar por amplificación PCR gracias a los cebadores específicos de este gen. Así, de acuerdo con otro aspecto, la invención se relaciona igualmente con un ácido nucleico que contiene una secuencia nucleotídica de la vía metabólica que provoca la biodegradación de lindano. Esta, por lo tanto, claramente demostrado, como se describe anteriormente, que un procedimiento de preparación de una colección de ácidos nucleicos a partir de una muestra de suelo que contiene organismos de acuerdo con la invención, así como un procedimiento de preparación de una colección de vectores recombinantes que contengan los ácidos nucleicos constitutivos de la colección de ácidos nucleicos citados anteriormente, es totalmente apta para el aislamiento y la JhlÉáir irtlití''- H^^-'-'^'rtfH' •' ' * - .-^..^- ^^*^*a^-^--f^ caracterización de las secuencias nucleotídicas incluidas en un operón. Una demostración suplementaria de la aptitud de un procedimiento de acuerdo con la invención para la identificación de las secuencias nucleotídicas codificantes implicadas en una vía de biosíntesis regulada bajo la forma de un operón, se describe además posteriormente: se trata de la clonación y de la caracterización de secuencias que codifican para los policétido sintasas implicados en la vía de biosíntesis de los policétidos, que están emparentados con una familia de moléculas donde ciertos representantes son de interés terapéutico mayor, en particular antibiótico. La presente invención tiene, por lo tanto, por objeto un ácido nucleico constitutivo de una colección de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, caracterizado en que comprende la totalidad de una secuencia nucleotídica que codifica para un polipéptido. De acuerdo con un primer aspecto, un ácido nucleico constitutivo de una colección de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención es de origen procariote. De acuerdo con un segundo aspecto, un ácido nucleico constitutivo de una colección de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, proviene de una bacteria o de un virus . ***?****t***..** **?**.***^,^.í***,*, ****?..*. ? ¡-¿ i De acuerdo con un tercer aspecto, un ácido nucleico constitutivo de una colección de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención es de origen eucariote. En particular, tal ácido nucleico está 5 caracterizado en que proviene de un hongo, de una levadura, de una planta o de un animal.

CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LA COLECCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS EXTRAÍDOS DEL SUELO Ifl Con el fin de superar los numerosos inconvenientes técnicos de los métodos de caracterización de los bancos de ADN extraídos y purificados a partir de una muestra del medio ambiente, que se han descrito en la parte de la descripción relativa al estado de la técnica, la solicitante ha puesto a 15 punto un procedimiento simple y confiable que permite caracterizar cualitativamente y semicuantitativamente los ácidos nucleicos obtenidos a partir del procedimiento descrito anteriormente. El procedimiento de acuerdo con la invención, 0 consiste así de amplificar universalmente un fragmento de 700 pb localizado en el interior de una secuencia de ADN ribosomal del tipo 16 S, después hibridar el ADN amplificado con una sonda oligonucleotídica de especificidad variable, y finalmente comparar la intensidad de hibridación de la Jlgr muestra con respecto a una escala patrón externa del ADN de secuencia o de origen conocido. La amplificación previa a la hibridación con la sonda oligonucleotídica permite cuantificar los géneros o las 5 especies de microorganismos poco abundantes. Además, la amplificación por los cebadores universales permite, al momento de la hibridación, utilizar una gran serie de sondas oligonucleotídicas. Así, la invención tiene además por objeto un 10 procedimiento de determinación de la diversidad de ácidos nucleicos contenidos en una colección de ácidos nucleicos, y más particularmente de una colección de ácidos nucleicos que provienen de una muestra del medio ambiente, de preferencia una muestra del suelo, el procedimiento comprende las etapas 15 siguientes: poner en contacto los ácidos nucleicos de la colección de ácidos nucleicos a probarse con un par de cebadores oligonucleotídicos que hibpdan cualquier secuencia de ADN ribosomal 16 S bacteriana; 20 - realización de al menos tres ciclos de amplificación; detección de los ácidos amplificados con ayuda de una sonda oligonucleotídica de una pluralidad de sondas oligonucleotídicas, cada sonda se híbrida específicamente con í*??**L?ité*Á?Í*l-**.*t***. ******** una secuencia de ADN ribosomal 16 S común a un reino, orden o subclase o un género bacteriano; dado el caso, comparar los resultados de la etapa de detección anterior con los resultados de detección, con la ayuda de la sonaa o de la pluralidad de sondas de ácidos nucleicos de secuencia conocida que constituyen una escala patrón. De manera preferida, un primer par de cebadores que se hibridan con las regiones universalmente conservadas del gen del ARN ribosomal 16 S, está constituido respectivamente de los cebadores FGPS 612 (SEQ ID NO 12) y FGPS 669 (SEQ ID NO 13) . Un segundo modo de realización de un par de cebadores preferido de acuerdo con la invención, está constituido de un par de cebadores universales 63 f (SEQ ID NO 22) y 1387r (SEQ ID NO 23) . De acuerdo con un modo particular de realización de un procedimiento de determinación de los ácidos nucleicos de una colección de ácidos nucleicos, la etapa de amplificación con la ayuda de un par de cebadores universales puede realizarse sobre una colección de vectores recombinantes en cada uno de los cuales ha sido insertado un ácido nucleico de la colección de ácidos nucleicos considerada, previamente la etapa de hibridación con las sondas oligonucleotídicas específicas de un reino, un orden, una subclase o de un género bacteriano particular. Tal procedimiento de determinación de la diversidad de ácidos nucleicos contenidos en una colección es 5 particularmente aplicable a las colecciones de ácidos nucleicos obtenidas de acuerdo a las enseñanzas de la presente descripción. Así, el ejemplo 3 detalla un procedimiento de preparación de una colección de ácidos nucleicos a partir de 0 una muestra de suelo que contiene organismos, que comprende una etapa de extracción indirecta del ADN por dispersión de una muestra de suelo previamente a la separación de las células sobre un gradiente de Nycodenz, lisar las células, después la purificación del ADN sobre un gradiente de cloruro 5 de cesio. La colección de ácidos nucleicos así obtenida se utiliza tal cual o bajo la forma de insertos en los vectores del tipo cósmido en un procedimiento de amplificación con la ayuda de los cebadores universales del ADNr 16 S citados u anteriormente, después los ADN amplificados son sometidos a una etapa de detección con la ayuda de sondas oligonucleotídicas de secuencias SEQ ID NO 14 a SEQ ID NO 21 que son presentadas en al tabla 4. Los resultados muestran que un procedimiento de b preparación de una colección de ácidos nucleicos a partir de ** *** ** ***»0** **Jk*f**** * a-a..¿. **** «fcái Ja una muestra de suelo que contiene organismos de acuerdo con la invención, permite acceder al ADN de más del 14% de la microflora telúrica total, es decir 2 x 108 células por gramo de suelo, cuando la microflora total cultivable no representa más que apenas el 2% de la población microbiana total. Con el fin de determinar la diversidad filogenética de una colección de ácidos nucleicos preparados de acuerdo con la invención, 47 secuencias del ARNr 16S se han aislado y secuenciado. Estas secuencias corresponden respectivamente a las secuencias nucleotídicas SEQ ID NO 60 a SEQ ID NO 106. Los ácidos nucleicos que comprenden las secuencias SEQ ID NO 60 a SEQ ID NO 106 forman igualmente parte de la invención, así como los ácidos nucleicos que poseen al menos 99%, de preferencia 99.5% o 99.8% de identidad de ácidos nucleicos con los ácidos nucleicos que comprenden las secuencias SEQ ID NO 60 a SEQ ID NO 106. Tales secuencias pueden utilizarse especialmente como sondas para tamizar los clones de un banco de ADN e identificar así aquellos, entre los clones del banco, que contienen tales secuencias, estas secuencias son susceptibles de estar en la proximidad de las secuencias codificantes de interés, tales como las secuencias que codifican para las enzimas implicadas en la vía de biosíntesis de metabolitos antibióticos, por ejemplo los policétidos .

La comparación de las secuencias de ARNr 16S a partir de un banco de ADN realizado de acuerdo con la invención con las secuencias almacenadas en la base de datos RDP (Maidak B. L., Colé J. R. , Parker C. T., Garrity G. M., Larsen N., Li B., Lilburn T. G., McCaughey, M. J. , Olsen G. J., Overbeek R., Pramanik S., Schmidt T. M. , Tiedje J. M. , Woese C. R. (1999) "A new projet of the RDP (Ribosomal Datábase Project)" Nucleic Acids Research Vol. 27: 171-173), han permitido determinar que los ácidos nucleicos contenidos en una colección de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención provienen de a-proteobacterias, de ß-proteobacterias, de d-proteobacterias, de ?-proteobacterias, de actinomicetos, así como de un género emparentado con acidobacterium. Estos resultados, presentados en la tabla 1 , así como por el árbo.1 filogenético de la figura 7, toman en cuenta la gran diversidad filogenética de los ácidos nucleicos contenidos en un banco de ADN preparado de acuerdo con el procedimiento de acuerdo con la invención.

VECTORES DE CLONACIÓN Y/O DE EXPRESIÓN Cada uno de los ácidos nucleicos contenidos en una colección de ácidos nucleicos preparados de acuerdo con la invención, puede insertarse en un vector de clonación y/o de expresión . i**,^..**^* * * aauij ^.^^a^.^--^ttfeA^Ja^a iteiJiaafci Para este fin, todos los tipos de vectores conocidos en el estado de la técnica pueden utilizarse, tales como los vectores virales, los fagos, los plásmidos, los fagémidos, los cósmidos, los fósmidos, los vectores del tipo BAC, los bacteriófagos Pi, los vectores del tipo BAC, los vectores del tipo YAC, los plásmidos de levadura o incluso cualquier otro vector conocido del estado de la técnica por el experto en la materia. Recurriremos ventajosamente, de acuerdo con la invención, a los vectores que permitan una expresión estable de los ácidos nucleicos de un banco de ADN. Para este fin, tales vectores incluyen, de preferencia, las secuencias de regulación de la transcripción que están localizadas en fase ("enlazadas de manera operable") , con el inserto genómico de manera que permite el inicio y/o la regulación de la expresión de al menos una parte del inserto de ADN. Resulta de lo anterior, que la invención se relaciona también con un procedimiento de preparación de una colección de vectores recombinantes caracterizada en que los ácidos nucleicos obtenidos en la etapa II- (iv), o en cualquier otra etapa I-(c) posterior de un procedimiento de preparación de una colección de ácidos nucleicos a partir de una muestra de suelo, que contiene organismos de acuerdo con la invención, son insertados en un vector de clonación y/o de expresión.

Previamente a su inserción en un vector de clonación y/o de expresión, los ácidos nucleicos constitutivos de una colección de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, pueden separarse en función de su tamaño, por ejemplo por electroforesis sobre un gel de agarosa, dado el caso después de la digestión con ayuda de una endonucleasa de restricción. De acuerdo con otro aspecto, el tamaño promedio de los ácidos nucleicos constitutivos de una colección de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, puede volverse de un tamaño sensiblemente uniforme para la aplicación de una etapa de ruptura física previamente a su inserción en el vector de clonación y/o de expresión. Tal etapa de ruptura física o mecánica de los ácidos nucleicos puede consistir en pasos sucesivos de estos últimos, en solución, en un canal metálico de aproximadamente 0.4 mm de diámetro, por ejemplo, el canal de una aguja de jeringa que tenga tal diámetro. El tamaño promedio de los ácidos nucleicos puede, en este caso, estar comprendido entre 30 y 40 kb de longitud. La construcción de los vectores preferidos de acuerdo con la invención se esquematiza en las figuras 25 (cósmido integrativo conjugativo) y 26 (BAC integrativo) . Los vectores de clonación y/o de expresión que pueden ser utilizados ventajosamente para los fines de ¿^^^^^^^^^M^i ^g^iu^^^^iMd inserción de los ácidos nucleicos contenidos en una colección o banco de ADN de acuerdo con la invención, son especialmente los vectores descritos en la patente europea No. EP-0 350 341 y en la patente US No. 5 688 689, tales vectores están adaptados especialmente para la transformación de cepas de actinomicetos . Tales vectores contienen, aparte de una secuencia de ADN del inserto, una secuencia de unión att, así como una secuencia de ADN que codifica para una integrasa (secuencia int) funcional en la cepas de actinomicetos. Sin embargo, se ha observado de acuerdo con la invención, que ciertos vectores de clonación y/o de expresión presentan inconvenientes en que su capacidad funcional teórica no ha sido alcanzada en la práctica. Así, parece que el sistema de integración contenido en los vectores del estado de la técnica, y especialmente en los vectores descritos en la patente europea no. EP 0 350 41 no permiten en realidad una buena integración del inserto de ADN del banco en el seno del cromosoma bacteriano. Partiendo de la hipótesis de que los déficit funcionales de integración de tales vectores en el seno del cromosoma bacteriano se deben a una falla en la expresión del gen de la integrasa presente en estos vectores, la solicitante primero buscó aumentar la expresión del gen de la integrasa sustituyendo el promotor de la transcripción inicial con un promotor de la transcripción susceptible de aumentar significativamente el número de transcritos de la integrasa . Los resultados han sido decepcionantes, y la función de integración en el cromosoma de estos vectores no se ha mejorado. De manera sorprendente, se ha mostrado, de acuerdo con la invención que las dificultades de expresión de la integrasa contenidas en esta familia de vectores integrativos no se sitúa al nivel de la cantidad de expresión de los transcritos, sino a nivel de su estabilidad. De acuerdo con una segunda hipótesis, la solicitante ha podido mostrar que la falla en la estabilidad de los transcritos de integrasa es causada por las deficiencias en la terminación de la transcripción del ARN mensajero correspondiente., La solicitante ha entonces insertado un sitio terminador colocado corriente debajo de la secuencia que codifica para la integrasa del vector, de manera que obtiene un ARN mensajero de tamaño determinado. La inserción de una señal de terminación adicional corriente abajo de la secuencia nucleotídica que codifica para la integrasa del vector, ha permitido la obtención de una familia de vectores integrativos del tipo cósmido y del tipo BAC.

Ni rlÉ*A'i'A^^--u--"^-iiÉiíi»ií'lr?i? mi tt irrti tiitt De manera preferida, el sitio terminador está colocado corriente abajo del sitio de unión att. Además, la solicitante ha puesto a punto novedosos vectores conjugativos y novedosos vectores duplicativos del tipo cósmido y novedosos vectores conjugativos del tipo BAC que pueden utilizarse ventajosamente para la inserción de los ácidos nucleicos constitutivos de una colección de ácidos nucleicos preparados de acuerdo con el procedimiento de la invención. Cuando la inserción de los fragmentos de ADN de tamaño promedio es buscada, se utilizan de manera preferida vectores del tipo cósmido, capaces de recibir insertos que tienen un tamaño máximo de aproximadamente 50 kb . Tales vectores cosmídicos, están particularmente adaptados para la inserción de ácidos nucleicos constitutivos de una colección de ácidos nucleicos obtenida de acuerdo con el procedimiento de la invención, que comprende una primer etapa de extracción directa del ADN por lisado mecánico de los organismos contenidos en la muestra de suelo inicial. Cuando la inserción de ácidos nucleicos de gran tamaño, en particular ácidos nucleicos de un tamaño superior a 100 kb, incluso superior a 200, 300, 400, 500 ó 600 kb se busca, se recurrirá entonces de manera preferida a los vectores del tipo BAC capaces de recibir los insertos de ADN de tal tamaño.

Tales vectores del tipo BAC están particularmente adaptados para la inserción de los ácidos nucleicos constitutivos de una colección de ácidos nucleicos obtenida de acuerdo al procedimiento de acuerdo con la invención, en la cual la primera etapa está constituida de una extracción indirecta del ADN por separación previa de los organismos contenidos en la muestra del suelo inicial y la eliminación de los macroconstituyentes de dicha muestra de suelo. En particular, los vectores del tipo BAC son aplicados de manera ventajosa para la inserción de ácidos nucleicos de gran tamaño que contienen, al menos parcialmente, la secuencia nucleotídica de un operón. Así, el procedimiento de preparación de una colección de vectores recombinantes de clonación y/o de expresión de acuerdo con la invención está caracterizada además en que el vector de clonación y/o es del tipo plásmido. De acuerdo con otro aspecto, tal procedimiento está caracterizado en que el vector de clonación y/o de expresión es del tipo cósmido. De acuerdo con un primer aspecto, se puede tratar de un cósmido duplicativo en E . coli e integrativo en Streptomyces . Un vector cosmídico más preferido que responde a tal definición es el cósmido pOS7001 descrito en el ejemplo 3. - *****t* * **ia>- "- - ->« ***.***-*-*. «**«•**- **.* ***. ** De acuerdo con otro aspecto, el vector cosmídico es conjugativo e integrativo en Streptomyces . De manera general, los vectores conjungativos del tipo cósmido o del tipo BAC, que comprenden en sus secuencias nucleotídicas un motivo reconocido por la maquinaria enzimática celular llamada "origen de conjugación", son utilizados cada vez que se quiere evitar recurrir a las técnicas de transformación pesadas y poco automatizables . Por ejemplo, la transfección de los vectores inicialmente hospedados por las células de E. col i en las células de Streptomyces necesitan clásicamente una etapa de recuperación del vector recombinante contenido en las células de Escheri chia col i , y su purificación previa a la etapa de transformación de protoplastos de Streptomyces . Se admite comúnmente que una transfección de un conjunto de 1000 clones de Escheri chia coli en Streptomyces, requiere la obtención de aproximadamente 8000 clones para cada clon de E . coli que tenga una oportunidad de ser representado. A la inversa, una etapa de transfección por conjugación de un vector hospedado por E. coli hacia las células de Streptomyces, necesita el mismo número de clones de cada uno de los microorganismos, la etapa de conjugación tiene lugar "clon a clon" y no comprende además las dificultades técnicas ligadas a la etapa de transferencia del tMif~ * &f** material genético por transformación de protoplastos, por ejemplo en presencia de polietilen glicol. Con el fin de optimizar la construcción del banco de ADN en Streptomyces, se ha puesto a punto de acuerdo con la invención, en novedosos vectores conjugativos del tipo cósmido y del tipo BAC de naturaleza que permite una eficiencia máxima de la etapa de conjugación. Especialmente, los vectores novedosos conjugativos de acuerdo con la invención han sido construidos colocando un gen marcador de selección en el extremo del ADN del vector que es transferido a la bacteria receptora en último lugar. Este perfeccionamiento de los vectores conjugativos del estado de la técnica permite seleccionar positivamente únicamente las bacterias receptoras que hayan recibido la totalidad del -ADN del vector y, en consecuencia, la totalidad del ADN del inserto de interés. Los cósmidos conjugativos e integrativos en Streptomyces preferidos de acuerdo con la invención son los cósmidos pOSV303, pOSV306 y pOSV307, descritos en el ejemplo 5. De acuerdo con otro aspecto, un procedimiento de preparación de una colección de vectores recombinantes de acuerdo con la invención se aplica con la ayuda de un cósmido duplicativo a la vez en E. coli y en Streptomyces. Tal cósmido es ventajosamente el cósmido pOS 700R descrito en el ejemplo 6. De acuerdo con aún otro aspecto, el procedimiento anterior puede aplicarse con un cósmido duplicativo en E. coli y Streptomyces y conjugativo en Streptomyces . Tal cósmido duplicativo y conjugativo puede obtenerse a partir de un cósmico duplicativo de acuerdo con la invención, por inserción de un origen de transferencia apropiado, tal como el RK2, como se describe en el ejemplo 5 ara la construcción del vector pOSV303. De acuerdo con otro modo de realización ventajoso del procedimiento de preparación de una colección de vectores recombinantes de acuerdo con la invención, se recurre a un vector de clonación y/o del tipo BAC. De acuerdo con un primer aspecto el vector del tipo BAC es integratívo y conjugativo en Streptomyces . De manera más preferida, tal vector BAC integrativo y conjugativo en Streptomyces es el vector pOSV 403 descrito en el ejemplo 8, o incluso los vectores BAC pMBD-1, pMBD-2, pMBD-3, pMBD-4, pMBD-5 y pMBD-6, descritos en el ejemplo 15. La invención tiene por otro objeto un vector recombinante caracterizado en que se elige entre los vectores recombinantes siguientes: "•j"**^**f"H "f " a) un vector que comprende un ácido nucleico constitutivo de una colección de ácidos nucleicos de acuerdo con la invención; b) un vector tal como el obtenido de acuerdo con un procedimiento que elimina cualquier recurso de la acción de una endonucleasa de restricción sobre el fragmento de ADN a insertarse, tal como el descrito anteriormente. De manera más preferida, la invención es relativa igualmente con un vector elegido entre los vectores siguientes: - el cósmido pOS7001; - el cósmido pOSV303; - el cósmido pOSV306; - el cósmido pOSV307; - el cósmido pOS700R; - el vector BAC pOSV403; - el vector BAC pMBD-1; - el vector BAC pMBD-2; - el vector BAC pMBD-3; - el vector BAC pMBD-4; - el vector BAC pMBD-5; - el vector BAC pMBD-6; La invención es relativa además, con una colección de vectores recombinantes tales como los obtenidos de acuerdo ^l^A<tJ«*^^»-''--.itJ ..a,...^t...,jna«fcAi....^te . ^* **. *?*^* *** **¿v*a t t^^ lt,¡éiAti..at-.. con cualquiera de los procedimientos de acuerdo con la invención.

Procedimiento de preparación de un vector recombinante de clonación y/o de expresión de acuerdo con la invención Las técnicas convencionales de inserción de ADN en el seno de un vector con el fin de preparar un vector de clonación y/o expresión recombinante recurren de manera clásica a una primera etapa en el curso de la cual una endonucleasa de restricción es incubada a la vez con ADN a insertarse y con el vector receptor, creando así los extremos compatibles entre el ADN a insertarse y el ADN del vector que permita el montaje de los dos ADN antes de una etapa de ligación final que permite la obtención del vector recombinante . Sin embargo, tal técnica convencionalmente presenta inconvenientes notables, particularmente cuando se busca la inserción de ácidos nucleicos de gran tamaño en un vector de clonación y/o de expresión. En efecto, la acción previa de una enzima de restricción sobre los fragmentos de ADN destinados a ser insertados en un vector es susceptible de reducir notablemente el tamaño de este ADN previamente a su inserción en el vector. Basta decir que una reducción significativa del ****?*s****M»~*- i*** * *********** ** *•*************-** *.**?s****A -3 tamaño de ADN previamente a su inserción sobre un vector es una situación particularmente desfavorable cuando se busca la clonación de los fragmentos de ADN de gran tamaño, susceptibles de contener el conjunto de las secuencias codificantes y, dado el caso, igualmente las secuencias reguladoras de un operón cuya expresión constituye una vía de biosíntesis completa de un metabolito de interés industrial, y más particularmente de un compuesto de interés terapéutico. Para remediar los inconvenientes técnicos de la técnica anterior, se ha puesto a punto de acuerdo con la invención dos procedimientos de preparación de un vector recombinante de clonación y/o de expresión que no necesitan recurrir a una endonucleasa de restricción sobre el ADN a insertarse previamente a su introducción en el seno del vector. Tales procedimientos están, por consiguiente adaptados a la clonación de fragmentos largos de ADN susceptibles de contener, al menos parcialmente, el conjunto de las secuencias codificantes y, dado el caso, igualmente las secuencias reguladoras, de un operón completo responsable de una vía de biosíntesis. De acuerdo con un primer aspecto, un procedimiento de preparación de un vector recombmante de clonación y/o de expresión de acuerdo con la invención, está caracterizado en que la inserción de un ácido nucleico en el vector de clonación y/o de expresión, comprende las etapas siguientes: * *L* *s?****** *iM.?¡?*j? *jfi - abrir el vector de clonación y/o de expresión a un sitio de clonación elegido, con la ayuda de una endonucleasa de restricción apropiada; - agregar un primer ácido nucleico homopolimérico al extremo 3' libre del vector abierto,' - agregar un segundo ácido nucleico homopolimérico, de secuencia complementaria al primer ácido nucleico homopolimérico, al extremo 3' libre del ácido nucleico a insertarse en el vector; - montar el ácido nucleico del vector y el ácido nucleico por hibridación del primer y del segundo ácido nucleico homopolimérico de secuencias complementarias una por la otra; - cerrar el vector por ligación. Tal procedimiento se describe en los ejemplos 10 y 13 a continuación. De manera ventajosa, el procedimiento anterior puede comprender las características siguientes, de manera aislada o en combinación: - el primer ácido nucleico homopolimérico es de secuencia poli (A) o poli (T) ; - el segundo ácido nucleico homopoiimérico es de secuencia poli (T) o poli (A) ; De manera más preferida, los ácidos nucleicos homopoliméricos tienen una longitud comprendida entre 25 y .f**--.,:-*.*--**^^*- ****^-.***!**!*.!,..!. : ?***.**ía**m***j*. ****t?iiát*i**'f*ff¡*^ 100 bases nucleotídicas, de preferencia entre 25 y 70 bases nucleotídicas . El procedimiento de preparación de un vector recombinante de clonación y/o de expresión descrito anteriormente está adaptado particularmente para la construcción de bancos de ADN en los vectores del tipo BAC. Así, de acuerdo con un modo de realización ventajoso del procedimiento de preparación de un vector recombinante descrito anteriormente, dicho procedimiento está caracterizado además en que el tamaño del ácido nucleico a insertarse es de al menos 100 kb, y de preferencia de al menos 200, 300, 400, 500 o 600 kb. Tal procedimiento de preparación está por lo tanto, particularmente adaptado para la inserción de ácidos nucleicos contenidos en una colección de ácidos nucleicos obtenidos de acuerdo con el procedimiento de la invención. Con el fin de permitir la inserción de fragmentos de ADN de gran tamaño en los vectores de clonación y/o de expresión, se ha puesto a punto de acuerdo con la invención, un segundo procedimiento que ha permitido eliminar recurrir a la acción de una endonucleasa de restricción sobre el ADN destinado a ser insertado en el seno del vector. Tal procedimiento de preparación de un vector recombinante de clonación y/o expresión de acuerdo con la invención, está caracterizado en que la etapa de inserción de i * *&.-. <Sñn ..********************* . ****?*?*¡*t***-* -mu . , ************ un ácido nucleico en dicho vector de clonación y/o de expresión comprende las etapas siguientes: -creación de puntas libres sobre los extremos del ácido nucleico de la colección por eliminación de las secuencias 3' salientes y reemplazando las secuencia 5' salientes; -abertura del vector de clonación y/o de expresión en un sitio de clonación elegido con ayuda de una endonucleasa de restricción apropiada; -adición de adaptadores oligonucleotídicos complementarios ; -creación de puntas libres en los extremos del ácido nucleico del vector por eliminación de las secuencia 3' salientes y reemplazando las secuencia 5' salientes, después la desfosforilación de los extremos 5' con el fin de evitar una recirculación del vector; -inserción del ácido nucleico de la colección en el vector por ligación. De manera preferida, la eliminación de las secuencias 3' salientes se realiza con la ayuda de una exonucleasa, tal como la enzima de Klenow. De manera preferida, el reemplazo de las secuencia 5' salientes se realiza con la ayuda de una polimerasa, y de manera más preferida de la polimerasa T4, en presencia de cuatro nucleótidos trifosfatos. t** ^!*********** ***. !** Un procedimiento de preparación de un vector recombinante de clonación y/o expresión por eliminación de las secuencia 3' salientes y el reemplazo de las secuencia 5' salientes tal como el descrito anteriormente, está adaptado particularmente para la construcción de bancos de ADN a partir de vectores del tipo cósmido. Tal procedimiento de obtención de vectores recombinantes se describe en el ejemplo 12. En un modo particular de preparación de un vector recombinante de acuerdo con la invención, los oligonucleótidos que comprenden uno o varios sitios de restricción raros son agregados sobre el vector al nivel del sitio de clonación del ADN a insertarse, de acuerdo con las enseñanzas del ejemplo 10. Esta visión de oligonucleótidos facilita la recuperación posterior de los insertos sin la ruptura de éstos últimos.

CÉLULAS HUÉSPED Aunque cualquier tipo de células huésped puede ser utilizado para la transfección o la transformación con un ácido nucleico o un vector recombinante de acuerdo con la invención, especialmente una célula huésped procariote o. eucariote, se utilizará de preferencia células huésped cuyas características fisiológicas, bioquímicas y genéticas estén bien caracterizadas, fácilmente cultivables a gran escala y hL «A4JJM*t^. gMM <Mi<|iri|^^tJ,.,,a,„,.^„ * . i**** *»»**! * ************ ,? "donde las condiciones de cultivo para la producción de metabolitos sean bien conocidas. De manera preferida, la célula huésped receptora en un ácido nucleico o de un vector recombmante de acuerdo con la invención, está filogenéticamente próxima a los organismos donadores contenidos inicialmente en una muestra del medio ambiente de la cual los ácidos nucleicos son originarios. De manera más preferida, una célula huésped de acuerdo con la invención debe poseer un uso de los codones similar, o al menos próximo, al de los organismos donadores presentes inicialmente en la muestra del medio ambiente, particularmente la muestra de suelo. El tamaño de los fragmentos de ADN susceptible de portar las secuencias nucleotídicas de interés buscadas puede ser variable. Así, las enzimas codificadas por los genes de tamaño promedio de 1 kb podrán expresarse a través de insertos de tamaño pequeño mientras que la expresión de metabolitos secundarios necesitarán el mantenimiento en el organismo huésped de fragmentos de tamaño bien superior, por ejemplo de 40 kb a más de 100 kb, 200 kb, 300 kb, 400 kb o 600 kb. Así, las células huésped de Eschep chia coli constituyen una elección privilegiada para la clonación de grandes fragmentos de ADN. í"¡Ht-jf"H'""''~* ' *jg f '--"" « **** *-*. ***** De manera más preferida, se recurrirá al uso de la cepa de Escherichia coli designada DH10B y descrita por Shizuya et al; (1992) para- la cual los protocolos de clonación en los vectores BAC se han optimizado. Sin embargo, otras cepas de Escherichia coli pueden utilizarse ventajosamente para la construcción de un banco de ADN de acuerdo con la invención, tales como las cepas E. coli Sure, E. coli DH 5 a, o incluso E. coli 294 (ATCC N°31446). Además, la construcción de ADN por transfección de células de E. coli con los vectores recombinantes de acuerdo con la invención es igualmente posible, la expresión de genes de diversos procariotes tales como Bacill us , Thermotoga , Corynebacterium , Lactobacillus o Clostridi um, se ha descrito en la solicitud PCT N°WO 99/20799. De manera -general, las células huésped de E. coli pueden en cualquier caso, constituir los huéspedes transitorios en los cuales los vectores recombinantes de acuerdo con la invención podrán mantenerse con una gran eficacia, el material genético puede ser manipulado fácilmente y archivado de manera estable. Con el objeto de expresar la diversidad molecular más grande posible, otras células huésped podrán aplicarse de igualmente de manera ventajosa tales como las células de ******* ********l******* y-'f l^ftf^ñtÍ* ÍJ^í¿^?-t J?M^ai^ ?*l¡ Bacill us , Pseudomonas , Streptomyces , Myxococcus , Aspergill us nidulans o incluso Neurospora crassa . Se ha mostrado además, de acuerdo con la invención, que las células de Streptomyces lividans pueden utilizarse con éxito y constituyen los sistemas de expresión complementarios a Escherichia coli . Streptomyces lividans constituye un modelo para el estudio de la genética de Strepto/pyces. y se ha utilizado igualmente como un huésped de expresión heteróloga de numerosos metabolitos secundarios. Streptomyces lividans posee en común con otros actinomicetos tales como Streptomyces coeli color, Streptomyces griseus , Streptomyces fradiae, así como Streptomyces griseochromogenes, las moléculas precursoras y los sistemas de regulación necesarios para la expresión da toda o parte de las vías de biosíntesis compleja, tales como por ejemplo la vía de biosíntesis de los policétidos o incluso la vía de biosíntesis de los polipéptidos no ribosómicos que representan las clases de moléculas de estructuras muy diversas. Streptomyces lividans presenta igualmente la ventaja de aceptar el ADN extraño con eficiencias de transformación elevadas. Así, la invención se relaciona también con una célula huésped recombinante que comprende un ácido nucleico 1**1.***^ .»^.^**** ^..***,^^**,^*^^^********* de acuerdo con la invención, constitutiva de ácidos nucleicos preparada de acuerdo a un procedimiento de la invención, o incluso una célula huésped recombinante que comprende un vector recombinate tal como el definido anteriormente, De acuerdo con un primer aspecto se puede tratar de una célula huésped recombinante de origen procariote o eucariote . Ventajosamente, una célula recombinante de acuerdo con la invención es una bacteria, y de manera más preferida una bacteria elegida entre E. coli y Streptomyces . De acuerdo con otro aspecto, una células huésped recombinante de acuerdo con la invención está caracterizada en que se trata de una levadura o incluso de un hongo filamentoso. La invención trata igualmente con una colección de células huésped recombinantes, cada una de las células huésped constituye la colección que comprende un ácido nucleico que proviene de una colección de ácidos nucleicos realizada de acuerdo con un procedimiento de preparación de ácidos nucleicos a partir de una muestra de suelo que contiene los organismos, tales como los descritos anteriormente . La invención es relativa igualmente a una colección de células huésped recombinantes, cada una de las células *** ?*?a****/ --- ~*-i^^f*^**^ ^-^**^^^?.^^f^*-? . if-A-. f »i ?%- huésped constitutivas de la colección que comprende un vector recombinante de acuerdo con la invención. Debido al gran tamaño de los insertos, necesario tener una eficiencia máxima de transformación. Para este objeto, una cepa receptora de Streptomyces lividans que expresa la integrasa de pSAM2 de manera constitutiva con el fin de favorecer la integración específica del sitio del vector, se prefiere. Para esta, el gen Int bajo el control de un promotor fuerte se integra en el cromosoma. La sobreproducción de integrasa no induce los fenómenos de excisión (Raynal et al., 1998). La producción de un metabolito novedoso a partir del inserto podrá ser tóxico para Streptomyces si el inserto no contiene los genes de resistencia al antibiótico producido si este gen es poco o no expresado. La capacidad de diferentes genes que permiten a Streptomyces ambofa ciens resistir al antibiótico, se estudia (Gourmelen et al., 1998; Pernodet et al., 1999). Ciertos de estos genes que codifican los transportadores del tipo ABC susceptibles de conferir un gran espectro de resistencia. Estos genes pueden ser introducidos y sobreexpresados en la cepa huésped de Streptomyces lividans . A la inversa, una cepa hipersensible a los antibióticos puede utilizarse (Pernodet et al., 1996), con el fin de detectar en el banco la presencia de genes de ******************** *ßi* resistencia. En efecto, en los microorganismos productores de antibióticos, estos genes de resistencia están con frecuencia asociados a los genes de la vía de biosíntesis del antibiótico. La selección de clones resistentes puede 5 permitir efectuar simplemente una primera selección antes de las pruebas más complejas de detección de un metabolito novedoso producido por el clon.

AISLAMIENTO Y CARACTERIZACIÓN DE SECUENCIAS NUCLEOTIDICAS 10 NOVEDOSAS QUE CODIFICAN PARA LAS POLICETIDOS SINTASAS . De acuerdo con la invención, una colección de células huésped recombinantes se ha obtenido después de la transección de las células huésped por una colección de vectores recombinantes que contienen cada uno un incerto de 15 ácido nucleico que _ provienen de una colección de ácidos nucleicos preparada de acuerdo con el procedimiento de acuerdo con la invención. De manera más precisa, los fragmentos de ADN obtenidos de acuerdo con el procedimiento de la invención, en 20 la cual se aplica una etapa de extracción indirecta del ADN de los organismos contenidos en la muestra de suelo, se ha clonado primero, en el cosmido integrativo pOS7001. La etapa de inserción de los fragmentos de ADN en el cosmido integrativo POS7001 se ha realizado de acuerdo con 25 el procedimiento de la invención en la cual las colas de los polinucleótidos homopoliméricos poli (A) y poli (T) se han agregado al extremo 3' respectivamente del ácido nucleico del vector y los fragmentos de ADN a insertarse. Los vectores recombinantes así construidos se encasillan en las cabezas del fago lambda y los fagos obtenidos son utilizados para infectar las células de E. colli de acuerdo con las técnicas bien conocidas por el experto en la materia. Se ha obtenido un banco de aproximadamente 5000 clones de Escheri cha coli . Este banco de clones se ha tamizado con pares de cebadores específicos de una secuencia nucleotídica que codifica para una enzima implicada en la vía de biosíntesis de los policétidos, la enzima PKS del tipo 1, designada también como ß-cetoacil sintasa. Se recuerda aquí que los policétidos constituyen una clase química de una gran diversidad estructural que comprende un número importante de moléculas de interés farmacéutico tales como la tilosina, la monensina, la vermectina, la eritromicina, la doxorrubicina o incluso el FK506. Los policétidos son sintetizados por condensación de las moléculas de acetato bajo la acción de enzimas llamadas policétidos sintasas (PKS) . Existen dos tipos de policétidos sintasas. Los policétidos sintasas del tipo II están implicadas en general en la síntesis de los antibióticos aromáticos policíclicos y catalizan la condensación de unidades acetato de manera iterativa. Los policétidos sintasas del tipo I están implicadas en la síntesis de policétidos macrocíclicos o macrolidos y constituyen las enzimas moduladoras multifuncionales . Tomando en cuenta su interés terapéutico, existe una necesidad en el estado de la técnica de aislar y caracterizar los policétidos sintasas . novedosas que pueden utilizarse para la producción de compuestos farmacéuticos novedosos, especialmente compuestos farmacéuticos novedosos con actividad antibiótica. El tamizado del banco de clones recombinantes descrito anteriormente con ayuda de cebadores de PCR, amplifica selectivamente las secuencias nucleotídicas que codifican para los policétidos sintasas del tipo I, ha permitido identificar a los clones recombinantes que contienen los insertos de ADN que comprenden una secuencia nucleotídica que codifica a las policétidos sintasas novedosas. Las secuencias nucleotídicas que codifican para estas policétidos sintasas novedosas son referidas como las secuencias SEQ ID N° 33 a SEQ ID N° 44 y SEQ ID N° 115 a SEQ ID N°120.

Un objeto de la invención consiste en un acia© nucleico que codifica para una nueva policétido sintasa I, caracterizada porque comprende una de las secuencias nucleotídicas SEQ ID N° 34 a SEQ ID N° 44 y SEQ ID N° 115 a SEQ ID N° 120. e preferencia, tal ácido nucleico se presenta bajo una forma aislada y/o purificada. La invención se relaciona también con un vector recombinante que comprende un polinucleótido que comprende una de las secuencias SEQ ID N° 34 a SEQ ID N° 44 y SEQ ID N° 115 a SEQ ID N° 120. La invención trata igualmente con una célula huésped recombinante que comprende un ácido nucleico elegido entre los po inucleótidos que comprenden una de las secuencias nucleotídicas SEQ ID N° 34 a SEQ ID N° 44 y SEQ ID N° 115 a SEQ ID N° 120, así como una célula huésped recombinante que comprende un vector recombinante en el cual se inserta un polinucleótido que comprende una de las secuencias nucleotídicas SEQ ID N° 34 a SEQ ID N° 44 y SEQ ID N° 115 a SEQ ID N° 120. De manera ventajosa, los vectores recombinantes que contienen un inserto de ADN que codifican para una policétido sintasa del tipo I novedoso de acuerdo con la invención, son los vectores de clonación y de expresión.

De preferencia, una célula huésped recombinante, tal como la descrita anteriormente es una bacteria, una levadura o incluso un hongo filamentoso. Las secuencias de aminoácidos de las policétidos sintasas novedosas que provienen de organismos contenidos en una muestra de suelo' de la se han deducido las secuencias nucleotídicas SEQ ID N° 34 a SEQ ID N° 44 y SEQ ID N° 115 a SEQ ID N° 120 anteriores. Se trata de polipéptidos que comprenden una de las secuencias de aminoácidos SEQ ID N° 48 a SEQ ID N° 59 y SEQ ID N° 121 a SEQ ID N° 126. La invención se relaciona incluso con policétidos sintasas novedosas que comprenden una secuencia de aminoácidos elegida entre las secuencias SEQ ID N° 48 a SEQ ID N° 59 y SEQ ID N° 121 a SEQ ID N° 126. Forma igualmente parte de la invención la secuencia nucleotídica SEQ ID N° 114 que comprende seis marcos de lectura abiertos, que codifican respectivamente los polipéptidos de la secuencia SEQ ID N° 121 a SEQ ID N° 126. Forma igualmente parte de la invención la secuencia nucleotídica SEQ ID N° 113 del cosmido a26Gl, que contiene la secuencia complementaria de la secuencia SEQ ID N° 114. Se ha extraído y amplificado también de acuerdo con la invención el ADN genómico que proviene da las cepas bacterianas puras, tales como Streptomyces coel i col or (ATCC N° 101.478), Strepto/pyces ambofa ci ens (N R N° 2.420), Streptomyces la ctamandurans (ATTC N° 27.382), Streptomyces rimosus (ATCC N° 109.610), Bacillus subtilis (ATCC N° 6633), o incluso Ba cill us l i cheniformis y Saccharopolyspora erythrea . Una amplificación por PCR del ADN de cada una de las cepas bacterianas descritas anteriormente se efectúa con la ayuda de pares de cebadores específicos de las secuencias nucleicas de la policétido sintasa del tipo I. Así, novedosos genes de las policétido sintasas del tipo I bacterianas, han podido ser aislados y caracterizados. Se trata de las secuencias nucleicas de las secuencias SEQ ID N° 30 a SEQ ID N° 32. La invención tiene por lo tanto por objeto las secuencias nucleotídicas que codifican para las policétido sintasas novedosas del tipo I elegidas entre los polinucleótidos que comprenden una de las secuencias nucleotídicas SEQ ID N° 30 a SEQ ID N° 32. Forman igualmente parte de la invención los vectores recombmantes que comprenden las secuencias nucleotídicas que codifican para las policétidos sintasas novedosas del tipo I definidas anteriormente. La invención se relaciona también con las células huésped recobinantes caracterizadas en que contienen un ácido nucleico que codifica para una policétido sintasa novedosa del tipo I, que comprende una secuencia nucleotídica elegida entre las secuencias SEQ ID N° 30 a SEQ ID N° 32, así como t^a****.**?mt*bM****?*W***?í*^?*iít*l*M las células huésped recombinantes que comprenden un vector recombinante tal como el definido anteriormente. La invención igualmente tiene por objeto los polipétidos codificados por las secuencias que comprenden los ácidos nucleicos SEQ ID N° 30 a 32, y más precisamente los polipéptidos que comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID N° 47 a SEQ ID N° 50. La invención tiene por objeto además un procedimiento de producción de una policétido sintasa del tipo I de acuerdo con la invención, dicho procedimiento de producción comprende las etapas siguientes: —•obtención de una célula huésped recombinante que comprende un ácido nucleico que codifica para una policétido sintasa del tipo I, que comprende una secuencia nucleotídica elegida entre las secuencias SEQ ID N° 33 a SEQ ID N° 44, SEQ ID N° 30 a SEQ ID N° 32 y SEQ ID N° 115 a SEQ ID N°120; -cultivar las células huésped recombinantes en un medio de cultivo apropiada; —recuperación y, dado el caso, purificación de la policétido sintasa del tipo I a partir del sobrenadante, del cultivo o del lisado celular. Las policétido sintasas del típicamente I novedosas obtenidas de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente, pueden caracterizarse por fijación sobre una columna de cromatografía de inmunoafinidad, sobre la cual los hl i á n m ttton 11 iii ***. anticuerpos que reconocen estas policétido sintasas se han inmovilizado previamente. Las policétido sintasas del tipo I de acuerdo con la invención, y más particularmente las policétido sintasas recombinantes descritas anteriormente, pueden también ser purificadas por técnicas de cromatografía líquida de alto desempeño (CLAD) , tales como por ejemplo las técnicas de cromatrografía en fase inversa o de cromatografía de intercambio de aniones o de cationes, bien conocidos por el experto en la materia. Las policétido sintasas, recombinantes o no recombinantes, de acuerdo con la invención pueden utilizarse para la preparación de anticuerpos. De acuerdo con otro aspecto, la invención, por lo tanto tiene por . objeto un anticuerpo que reconoce específicamente una policétido sintasa del tipo I de acuerdo con la invención, o un fragmento peptídico de tal policétido sintasa . Los anticuerpos de acuerdo con la invención pueden ser monoclonales o policlonales. Los anticuerpos policlonales pueden ser preparados a partir de células de hibridoma de acuerdo con la técnica descrita por KOHLER y MILSTEIN C. (1975), Nature, Vol.256:495. Los anticuerpos policlonales pueden prepararse por inmunon sacion de un mamífero, en particular de ratón ratas o de conejos con una policétido sintasa del tipo I de acuerdo con la invención, dado el caso en presencia de un compuesto adyuvante de inmunidad, tal como el adyuvante completo de Freund, el adyuvante incompleto de Freund, el hidróxido de aluminio e incluso un compuesto de la familia de los muramil péptidos . Constituyen igualmente los "anticuerpos" en el sentido de la presente invención, los fragmentos de anticuerpos tales como los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, o incluso los fragmentos de anticuerpos de cadena simple que contienen la parte variable (ScFv) descritos por MARTINEAU et al. (1998) J. Mol. Biol., Vol. 280 (1):117-127 o incluso en la patente US 4,946,778, así como los anticuerpos humanizados descritos por REINMANN KA et . Al. (1997), AIDS Res. Hum. Retroviruses, vol. .13 (11) : 933-943 o por LEGER O.J et al. (1997), Hum. Antibodies, vol.8 (1):3-16. Las preparaciones de los anticuerpos de acuerdo con la invención son útiles especialmente en las pruebas inmunológicas cualitativas o cuantitativas que busca, ya sea simplemente detectar al presencia de una policétido sintasa del tipo I de acuerdo con la invención, o cuantificar al cantidad de esta policétido smtasa, por ejemplo en el sobrenadante del cultivo o en el lisado celular de una sepa bacteriana susceptible de producir tal enzima.

Otro método de la invención consiste de un procedimiento de detección de una policétido sintasa del tipo I de acuerdo con la invención, o un fragmento peptídico de esta enzima, en una muestra, dicho procedimiento comprende las etapas de: a) poner en contacto un anticuerpo de acuerdo con la invención con la muestra a probarse; b) detectar el complejo antígeno/anticuerpo formado eventualmente La invención se relaciona igualmente con un equipo o estuche de detección de una policétido sintasa del tipo I de acuerdo con la invención en una muestra, que comprende: a) un anticuerpo de acuerdo con la invención; b) dado el caso, los reactivos necesarios para la detección del complejo antígeno/anticuerpo eventualmente formado. Un anticuerpo dirigido contra una policétido sintasa del tipo I de acuerdo con la invención puede marcarse con al ayuda de un marcador detectable isotópico o no isotópico, de acuerdo con los procedimientos bien conocidos por el experto en la materia. El tamizado de un banco de ADN de acuerdo con la invención con la ayuda de un par de cebadores que se hibridan con las secuencias a blanco, donde la presencia es buscada, tales secuencias de la vía de biosíntesis de la puromicina, ********* **.— i-nHMüffrfr -y?tfüÉi las secuencias del gen linA implicadas en la biodegradación del lindano o incluso las secuencias que califican para las policétido sintasa del tipo I se han detallado aquí anteriormente . La invención tiene por objeto un procedimiento de detección de un ácido nucleico de una secuencia nucleotídica determinada, o de una secuencia nucleotídica estructuralmente emparentada con una secuencia nucleotídica determinada, en una colección de células huésped recombinantes de acuerdo con la invención, y caracterizado porque comprende las etapas siguientes : —p'orüer en contacto la colección de células huésped recombinar.tes con un par de cebadores que se hibridan con la secuencia nucleotídica determinada o que se hibridan con la secuencia nucleotídica estructuralmente emparentada con una secuencia nucleotídica determinada; -realizar a? menos tres ciclos de amplificación; -delectar ej_ ácido nucleico eventualmente identificado . Para las condiciones de amplificación apropiadas en función de las secuencias blanco buscadas, el experto en la materia podrá referirse ventajosamente a los ejemplo posteriores . De acuerdo con otro aspecto, la invención se relaciona también con un procedimiento de detección de un ácido nucleico, de secuencias nucleotídicas determinadas, o de secuencias nucleotídicas estructuralmente emparentadas con una secuencia nucleotídica determinada, en una colección de células huésped recobinantes de acuerdo con la invención, caracterizado porque- comprende las etapas siguientes; -poner en contacto la colección de células huésped recombinantes con una sonda que se híbrida con la secuencia nucleotídica determinada o que se híbrida con una secuencia nucleotídica estructuralmente emparentada con la secuencia nucleotídica determinada; -detectar e? híbrido formado eventualmente entre la sonda y los ácidos nucleicos comprendidos en los vectores de la colección. Para efectuar el tamizado de un banco de ADN de acuerdo con la invención en vista de detectar la presencia de un ácido nucleotídico que codifica para un polipéptido, capaz de degradar el lindano, se detectan los clones recombinantes de interés por su fenotipo correspondiente a su capacidad de degradar el lindano. Para este fin, los clones aislados y/o los conjuntos de clones de bancos de ADN preparado se ponen en cultivo en un medio de cultivo en presencia del lindano y la degradación de lindano se observa por la formación de un halo encontrado en el medio inmediato a las células. La invención se relaciona también con un procedimiento para identificar la producción de un compuesto de interés por una o varias células huésped recombinantes en una colección de células huésped recombinantes de acuerdo con la invención, caracterizado _.porque comprende las etapas siguientes : -cultivar las células huésped recombinantes de la colección en un medio de cultivo apropiado; -detección del compuesto de interés en el sobrenadante del cultivo o en lisado celular de una o varías de las células recombinantes cultivadas. La invención tiene por objeto además un procedimiento para seleccionar una célula huésped recombinante que produce un compuesto de interés en una colección de células huésped recombinantes de acuerdo con la invención, caracterizado -porque comprende las etapas siguientes: las células huésped recombinantes de la invención en un medio de cultivo apropiado; -detección del compuesto de interés en el sobrenadante del cultivo o en el lisado celular de una o varias células huésped recobinantes cultivadas; -.selección de las células huésped recobinantes que producen el compuesto de interés. La invención se relaciona también con un procedimiento para la producción de un compuesto de interés caracterizado porque comprende las etapas siguientes: «***. *************..*!»* ..«*** * m.^^^?^M?iiA.4.. —cultii'-ar una célula huésped recombinante seleccionada de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente; recuperar y, dado el caso, purificar el compuesto producido por la célula huésped recombinante. La invención también es relativa a un compuesto de interés caracterizado porque se obtiene de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. Un compuesto de interés de acuerdo con la invención puede consistir de un policétido producido gracias a la expresión de al menos una secuencia nucleotídica que compruebe una secuencia elegida entre la secuencia SEQ ID N° 33 a 44, SEQ ID N° 30 a 32 y SEQ ID N° 115 a SEQ ID N° 120. La invención se relaciona también con una composición que comprende un policétido producido gracias a la expresión de al menos una secuencia nucleotídica que comprende una secuencia elegida entre la secuencias SEQ ID N° 33 a SEQ ID N° 44, SEQ ID N° 30 a SEQ ID N° 32 y SEQ ID N° 115 a SEQ ID N° 120. Un policétido producido gracias a la expresión de al menos una secuencia nucleotídica anterior, es de manera preferida el producto de la actividad de varias secuencias codificantes incluidas en el seno de un operon funcional, donde los productos de traducción son las diferentes enzimas necesarias para la síntesis de un policétiac, una de las *. *..* **.,** J. ij-t -•- i*-* *,* -.*.**-* ! i rtririiniii - secuencias anteriores esta comprendida y expresada en el operon. Tal operon comprende una secuencia de acido nucleico de acuerdo con la invención que codifica para una policétido sitasa puede construirse por ejemplo de acuerdo con las 5 enseñanzas de Borchet et al. (1992). La invención también es relativa a una composición farmacéutica que comprende una cantidad farmacológicamente activa de un policétido de acuerdo con la invención, dado el caso en asociación con un vehículo farmacéuticamente 10 compatible. Tales composiciones farmacéuticas estarán adaptadas ventajosamente para la administración, por ejemplo por vía parenteral, de una cantidad de un policétido sintetizado por una policétido sintasa del tipo I de acuerdo con la l.r invención, que vaya_ de 1 µ/kg por día a 10 mg/kg por día, de preferencia al menos 0.01 mg/kg por día y de manera más preferida entre 0.01 y 1 rng/kg por día. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la invención pueden ser administradas de manera indiferente por 0 vía oral, rectal, parenteral, intravenosa, subcutánea o incluso intradermica . La invención se relaciona también con la utilización de un policétido obtenido gracias a la expresión de una policétido sintasa del tipo I de acuerdo con la ^ ^. &?.. íá?a? Ít¡m **?*. . - .i- ^** **,.* *-.* **»*<* & t?***í*~*** * .** ***^ »a f ?**..mií*.?,* t invención, para la fabricación de un medicamento, en particular de un medicamento con actividad antibiótica.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La invención será ilustrada, sin que por lo tanto este limitada, por las figuras y los ejemplos a continuación. La Figura 1 ilustra el esquema de las diferentes etapas de lisado efectuadas de acuerdo con los protocolos 1 , 2, 3n 4a, 4b, 5a, y 5b descritos en el ejemplo 1. La Figura 2 ilustra una electroforesis sobre gel de agarosa al 0.8% de los ADN extraídos a partir de 300 mg de suelo número 3 (Cote Satélite André) , después de diferentes tratamientos de usado (protocolos 1 a 5, células fotorreceptoras. FIG 1). M: marcador del peso molecular del fago lambda. La Figura 3 ilustra la proporción de diferentes géneros de actinomicetos cultivados después de los tratamientos 1 a 5 (células fotorreceptoras. FIG 1). El número de ufe (unidad formadora de colonia) se ha determinado sobre el medio selectivo para este grupo de bacterias. Un número total de aproximadamente 400 colonias se ha analizado. La Figura 4 ilustra la recuperación del ADN del fago lambda digerido por Hindll l adicionado en los suelos a diferentes concentraciones antes (G) o después (G*) de la trituración. Los tratamientos T (choques térmicos) y S gi^itf ^ÜÉg&^ iÉ (sonicacion) son los tratamientos adicionales del lisado. La cuantificación se ha realizado por análisis con fosfo formador de imágenes después de la hibridación en un manchado de puntos. Una muestra de cada suelo se utiliza para cada concentración del' fago lambda agregado. Las características del suelo son reproducidas en la tabla 1. Las muestras que corresponden a 10 y 15 µg de ADN agregado no han sido tratadas . La Figura 5 ilustra la amplificación por PCR de los ADN extraídos a partir del suelo número 3 de acuerdo con los protocolos 1, 2, 3, 5a y 5b. Los cebadores FGPS 122 y FGPS 350 (tabla 2) se han utilizado con el fin de dar en el blanco de los Streptosporangi um ssp indígenas. Los extractos de ADN se utilizan no diluidos o diluidos a un décimo y un centesimo. M: marcador del peso molecular 123 pb (Gibco BRL), C: control de amplificación sin ADN. La Figura 6 ilustra las cantidades de ADN extraído después de la inoculación de las esporas (a) o de micelio (b) de S. lividans OS48.3 inoculados en los suelos a diferentes concentraciones. Las cantidades de micelio agregadas en el suelo corresponde al número de esporas inoculadas en el medio de germinación. Aproximadamente 50% de las esporas han germinado, el número de las células o de genomas contenidos en los hifas de las esporas germinadas no se ha determinado. Las cantidades de esporas y de micelio inoculadas no son por t &Ui* **** -********'- "-- -=*- -*- —***> * •»* - lo tanto comparables directamente. El protocolo de extracción ha sido conducido de acuerdo al protocolo 6 (cf sección material y métodos). El símbolo (') indica que el ARN ha sido incluido en el amortiguador de extracción. El ADN blanco ha sido amplificado por PCR con los cebadores FGPS 516 y FGPS 517, la cuantificación se ha realizado por fosfoformación de imágenes después de la hibridación en manchado de puntos, utilizando las sondas FGPS 518. Una muestra de cada suelo se ha utilizado para cada concertación de hifas ° de esporas. Las características de los suelos se describen en la tabla 1. La Figura 7 representa el árbol filogenético obtenido por el algoritmo de Neighbour Joining, colocando las secuencias de ARN 16S contenidas en el banco de ADN del suelo, con respecto a las bacterias de referencia cultivadas. En gris: las secuencias procedentes de los depósitos de clones del banco. Los valores de cebado son indicados a nivel de los vínculos, después de volver a tomar las muestras de 100 repeticiones. La barra de la escala indica el número de sustituciones por tipo. El número de acceso de las secuencias en la base de datos Genbank se indica entre paréntesis. La Figura 8 representa un esquema del vector pOSint 1. La Figura 9 representa un esquema del vector pWEDl .

La Figura 10 representa un esquema del vector pWE15 (ATCC N° 37503) . La Figura 11 representa un esquema del vector pOS 7001. La Figura 12 representa un esquema del vector pOSCVOlO. La Figura 13 representa el fragmento que contiene un sitio "eos" insertado en el plásmido pOSVOlO en el curso de la construcción del vector pOSV 303. La Figura 14 representa un esquema del vector pOSV 303. La Figura 15 representa un esquema del vector pElld. La Figura 16 representa un esquema del vector pOS 700 R. La Figura 17 representa un esquema del vector pOSV 001 La Figura 18 representa un esquema del vector pOSV 002. La Figura 19 representa un esquema del vector pOSV 14 La Figura 20 representa un esquema del vector pBAC 1. Élnfuí if?irrtü Ér»~ ~ - -*--»*- -*- **" - .?*~**^f***»^** *' ^-** La Figura 21 representa un esquema del vector pOSV 403 La Figura 22 representa los geles de electroforesis del ADN del banco después de la digestión por las enzimas BamHl y Dral de los clones positivos del banco tamizado con los oligonucleótidos PKS-1. La Figura 23 ilustra la producción de puromicina por los recombinantes de S . lividans comparados con la producción de la cepa salvaje de S. alboniger . La Figura 24 ilustra la alineación de los PKS del suelo con los sitios activos conservados de otros PKS. Las referencias para cada péptido se indican. Los dominios ß- cetoacil sintasa se alinean utilizando el programa PILEUP de GCG (Wisconsm Package Versión 9.1, Genetics Computer Group, Madison, Wisc) . La Figura 25 ilustra la construcción de un cósmido integrativo conjugativo. La Figura 26 ilustra la construcción de BAC integrativo conjugativo. La Figura 27 ilustra el esquema de construcción del vector pOSV 308. La Figura 28 ilustra el esquema de construcción del vector pOSV306.

La Figura 29 ilustra el esquema de construcción del vector pOSV307. La Figura 30 ilustra el esquema de construcción del vector PMBD-1. La Figura 31 presenta una gráfica detallada del plasmido pMBD-2 así como un esquema de construcción del vector pMBD-3. La Figura 32 ilustra una gráfica detallada del plásmido pMBD-4. La Figura 33 ilustra el esquema de construcción del plásmido pMBD-5 a partir del plásmido pMBD-1. La Figura 34 ilustra una gráfica detallada del vector pBTP-3. La Figura 35 ilustra el esquema de construcción del vector pMBD-5 a partir del vector pMBD-1. La Figura 36 ilustra la gráfica del cósmido a26Gl donde el inserto de ADN contiene los marcos abiertos de lectura que codifican para varias policétido sintasas. La Figura 37 es un esquema que representa el inserto de ADN (hebra +) del cósmido a26Gl, sobre la cual están colocados los diferentes cuadros de lectura que codifican para varios policétidos sintasas.

EJEMPLOS : EJEMPLO 1 : Procedimiento de preparación de una colección de ácidos nucleicos a partir de una muestra del suelo que contiene los organismos , que contienen una etapa de extracción directa de ADN a partir de la muestra de suelo. 1. MATERIAL Y MÉTODOS 1.1 SUELOS : Las características de seis suelos utilizados en este estudio se listan en la tabla 1. El contenido de arcilla y de material orgánica va respectivamente de 9 a 47% y de 1.7 a 4.7%, el pH varía de 4.3 a 5.8. Las muestras de suelo son recolectadas a partir de la capa superficial' de 5 a 10 centímetros de profundidad. Todas las raíces visibles se eliminan y los suelos se conservan a 4° C durante algunos días si es necesario, después de lo cual son secados durante 24 horas a temperatura ambiente y tamizado (tamaño promedio de la malla de 2 mm) antes de conservarse hasta varios meses a 4°C. 1.2 CEPAS BACTERIANAS Y CONDICIONES DE CULTIVO: I El ADN extraceiular asi como las cepas bacterianas que proporcionan las células vegetales, las esporas o las hifas, utilizadas para inocular las muestras de suelo, se eligen de tal manera que su presencia pueda seguirse específicamente . Con el fin de obtener grandes cantidades de ADN extracelular, la cepa lisogénica de E . coli 1192 hfr P4X (metB) , que contiene el fago lambda C1857 Sam 7, se cultiva sobre medio Luria-Bertani (LB) , durante dos horas a 30°C, después 30 minutos a 40°C, después 3 horas a 37°C. El ADN del fago lambda se extrae de acuerdo con la técnica descrita por SAMBROOK J. et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2da, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y. La cepa virulenta de Ba cill us an thracis (STERNE 7700) se ha utilizado como inoculo de las células bacterianas. El Ba cill us an thra cis se multiplica sobre caldo de cultivo del tipo "caldo de soya tripticasa" (TSB) (Biomérieux, Lyon, Francia) durnate aproximadamente 6 horas, verificando que la DO6ú0 se mantenga por debajo de 0.6. Estas condiciones permiten el desarrollo de células vegetales sin formación de esporas (Patra et al., (1996), FEMS Immunol. Medical Microbiology, vol. 15:223-231). Las esporas de Streptomyces lividans OS48.3 (CLERC-BARDIN et al. no publicada), se eliminan mecánicamente de los cultivos del organismo sobre un medio R2YE (HOPWOOD et al. (1985), Genetic Mampulation of Streptomyces-A Laboratory Manual. The John Innes Foundation, Norwich, Reino Unido) . Las hifas de S. lividans OS48.3 se obtienen a partir de las esporas en pregerminación, por lo que se espera que el uso de las hifas cortas minimice la ruptura y la pérdida subsecuente de ADN. Las esporas se ponen en suspensión en un amortiguador TES (Acido N-Tris [hidroximetil] metil-2-aminoetansulfónico; Sigma- Aldrich Chimie, Francia) (0.05M; pH 8) (Holben WE et al., (1988), APPL. Environ. Microbiol. Vol. 54:703-711, después se somete a un choque térmico (50°C durante 10 minutos seguido de un enfriamiento bajo una corriente de aire frío, después se agregan a un volumen igual del medio de pregerminación (extraído de levadura al 1%, casaminoácidos al 1% CaCl2 0.01 M) . La solución se incuba a 37°C bajo agitación. La proporción de esporas germinadas se estima de aproximadamente 50%, de acuerdo con los resultados de HOPWOOD et al. (1985). Después de la centrifugación, los residuos son resuspendidos en un amortiguador TES, agregados a 3% del medio TSB, e incubados a 37°C hasta la obtención de un DO450 al 0.15 (HOPWOOD et al., (1985)). Streptomyces hygroscopicus SWN 736 y Streptomyces fragi l e AC1296 (Institute Pyshino, Moscú) se han cultivado de acuerdo a las técnicas descritas por HICKEY y TRESNER (1952) . El ADN de las esporas y de las hifas de S. lividans se extrae a partir de cultivos puros de acuerdo con el protocolo de lisado 6 descrito posteriormente (excepto que ningún triturado se realiza) , mientras que las esporas de S. hygroscopicus y de S. fragüe se extraen por lisado químico/enzimático (Hintermann et al., 1981). 1.3 ELECCIÓN DEL AMORTIGUADOR DE EXTRACCIÓN: Un amortiguador TENP (Tris 50 mM, EDTA 20 mM, NaCl 100 mM, 1% en peso/volumen de polivinilpolipirrolidona desarrollada por PICARD (1992) se utiliza. Otros amortiguadores similares se han utilizando anteriormente por otros autores (CLEGG et al., 1997; KUSKE et al., 1998; ZHOU et al., 1996). El Tris y el EDTA protegen al ADN de la actividad nucleasa, el NaCl aporta un efecto dispersante y la PVPP absorbe los ácidos húmicos y los otros compuestos fenólicos (HOLBEN et al. (1988).; PICARD et al., (1992). En este estudio, la eficiencia de extracción de este amortiguador está evaluado a diferentes pH (6.0-10.0), utilizando 20 suelos diferentes que tienen una gama de pH de 5.8 a 8.3, y un contenido de materia orgánica de entre 0.2 y 6.3%. Estos 20 suelos (las otras características no son indicadas) se han utilizado únicamente en esta experiencia. La cantidad de ADN se ha determinado de manera colorimétrica como se describe por RICHAR (1974) y se detalla a continuación. . . [t ^ ff***»**^,. .,***£, ¿uwMj,...imimjtiatj^A! O IN SITU Y DE EXTRACCIÓN DE ADN: Varios protocolos que utilizan un número creciente de etapas se ha probado con el fin de evaluar la eficiencia de diferentes técnicas para lisar los microbios del suelo in 5 situ. Para estas experiencias, la microflora indígena del suelo se ha tamizado en seis suelos. Se han conducido experiencias adicionales con el fin de estudiar los efectos de los tratamientos de lisado sobre el ADN liberado, analizando las cantidades y la calidad del ADN recuperado que 10 proviene de un ADN de fago lambda adicionado previamente a los suelos. Una vez que un protocolo optimizado (designado protocolo 6) se ha desarrollado, este protocolo se utiliza para cuantificar el ADN que proviene de actinomicetos 5 indígenas y el ADN gue proviene de bacterias Gram positivas inoculadas en los suelos seleccionados. En todos los casos, las muestras de suelo se han secado y pasado por un tamiz como se describe anteriormente. Después de la trituración, se agregan 0.5 ml de 0 amortiguador TENP a 200 mg en peso seco de suelo, excepto para el protocolo 1, en el cual el amortiguador se agrega a un suelo sin triturar) . Para los diferentes tratamientos de lisado (ver posteriormente), las suspensiones de suelo se pasan en un 5 Vórtice durante diez minutos y se centrifugan (4000 g durante ÉÍ?á &áátt áilM? i Itátilir- - *>**^i**^*** ^-****** . ! * MM-á * - -»"-*>-& - ~J* **^ ** * 1tÁA.i* cinco minutos), después de lo cual una fracción alícuota (25 µl) de sobrenadante se analiza por electcoforesis sobre gel (0.8% de agarosa) . Otra fracción alícuota de sobrenadante que representa un volumen conocido, generalmente de 350 µl, se precipita con isopropanol. Cinco fracciones alícuotas (que representan el ADN derivado de 1 g de suelo) se reúnen y resuspenden 100 µl de un amortiguador TE estéril (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0) antes de la purificación (protocolo D, ver posteriormente) , y se cuantifica, ya sea por hibridación (Dot Blot) del ADN total o ya sea por hibridación (Dot Blot) de los productos de amplificación PCR (ver posteriormente) . Las señales de hibridación se han cuantificado por • formación de imagen con fosfoforecencia (técnica de "fosfoformación de imágenes"), ver posteriormente. 1.5 EVALUACIÓN DE LOS MÉTODOS DE LISADO CELULAR IN SITU: La calidad y cantidad de ADN extraído después de un número creciente de etapas de tratamiento de lisado (protocolo 2-5b) , se compara con aquellas del ADN extracelular obtenido después del lavado del suelo con un ^| ^gg ^ ¡|g taatj¿fe.j '" "J Tf amortiguador de extracción (protocolo 1; ver también la Figura 1) .

Protocolo 1 : Sin tratamiento de lisado El amortiguador TENP se agrega a un suelo no triturado, se realiza una etapa de extracción de ADN como se describe anteriormente.

Protocolo 2 : Trituración de suelo seguido por una extracción de ADN Se utilizan dos tipos de dispositivos diferente para la trituración del suelo. Después de comparar su eficacia respectiva, 5 gramos del suelo seco se trituran durante 30 segundos en un triturador que contiene anillos de tungsteno o durante tiempos variados hasta 60 minutos en un triturador de suelo que contiene un mortero y bolas de ágata (20 mm de diámetro) . El amortiguador TENP es agregado a continuación y el ADN es agregado como se describe anteriormente. Los resultados de la electroforesis sobre gel muestran que una trituración de 40 minutos utilizando las bolas de ágata es necesario con el fin de obtener cantidades de ADN extraído equivalentes a aquellas obtenidas después de 30 segundos de trituración utilizando anillos de tungsteno.

La distribución del tamaño de los fragmentos de ADN es similar a cualquiera que sea el método empleado. Así, éstos tratamiento se consideran como equivalentes y aquel que será utilizado en los protocolos descritos posteriormente no será en consecuencia especificado. En los protocolos 3 a 5, la eficiencia de varios otros tratamientos de lisado posterior a la trituración del suelo se ha aprobado, ya sea de manera separada, ya sea en diferentes combinaciones.

Protocolo 3 : Este protocolo es idéntico al protocolo 2, salvo que comprende una etapa de homogenización con la ayuda de un mezclador del tipo Ultraturrax (Janker et Kunkerl, IKA Labortechnik, Alemania) ajustado a la mitad de la velocidad máxima durante 5 minutos.

PROTOCOLOS 4a y 4b: Estos protocolos son idénticos al protocolo 3 con la excepción de una etapa adicional de sonicación. Dos tipos de dispositivos sonicadores se han comparado: un sonicador con micropunta de titatnio (600W Vibracell Ultrasonicator, Bioblock, Illkirch, Francia) ¿^^^idb a^Ai^^^^.>^^a^Jglto.aa<^^.,ii.»g,.»£A.^A^~»-. '•*** **.**. *«*******t* * ? *..

(Protocolo 4a) y un sonicador del tipo Cup Horn (protocolo 4b) . La micropunta Vibracell que produce ultrasonidos está en contacto directo con la solución del suelo. En los que concierne al dispositivo del tipo Cup Horn, la solución del suelo es conservada en los tubos que son colocados en un baño de agua a través del cual pasan los ultrasonidos. Se han realizado experiencias preliminares con el fin de determinar las condiciones óptimas para los dos sonicadores (resultados no presentados) . El mejor compromiso, en términos de cantidad de ADN extraído y del tamaño de los fragmentos consiste en una sonicación con la micropunta de titanio y el sonicador del tipo Cup Horn respectivamente durante 7 y 10 minutos, regulando la potencia a 15 w y con ciclos activos a 50%.

Protocolos 5a y 5b Después de la sonicación con una punta de titanio o con un dispositivo del tipo Cup Horn (respectivamente protocolos 4a y 4b) se agrega lisozima y acromopeptidasa, cada una de las enzimas a una concentración final de 0.3 mg/ml . Las suspensiones de suelo se incuban durante 30 minutos a 37°C, después de lo cual se agrega el iauril ». ?** *^?*^**í,**?*iíél^***?i *^«*...*l, JM****.^*** sulfato a una concentración final del 1%, después las suspensiones se incuban durante 1 hora a 60°C antes de la centrifugación y precipitación como se describió anteriormente . Además de los protocolos descritos anteriormente, el efecto de la sonicacion (Cup Horn, ver protocolo 4b) y de los choques térmicos (30 segundos en nitrógeno líquido seguido de tres minutos en agua hirviendo, los tratamientos son repetidos tres veces), sobre el ADN del fago lambda digerido por Hindlll previamente agregado al suelo, se han examinado (ver a continuación) . Las choques térmicos se han sugerido en el estado de la técnica como medios de lisado celular in si tu (PICARD et al. (1992)). Sien embargo, debido al hecho de que tal tratamiento tiene un efecto perjudicial' sobre el ADN libre (ver la sección de resultados), no se ha incluido en los protocolos descritos anteriormente.

PROTOCOLO OPTIMIZADO Después de la evaluación de diferentes tratamientos de lisado, se ha definido un protocolo optimizado, designado al protocolo 6. El protocolo 6 es idéntico al protocolo 5b excepto que, antes de la sonicacion, las suspensiones del suelo son sometidas a un tratamiento por vórtice, después se agitan por rotación sobre una rueda durante 10 horas antes de ser congelados a -20°C. Después de la congelación, las -suspensiones del suelo son pasadas en un vórtice durante 10 minutos antes de la sonicacion. El protocolo 6 se utiliza en los experimentos en los cuales los suelos se han sembrado con células bacterianas, así como los experimentos en los cuales los actinomicetos nativos se han cuantificado (ver posteriormente) . 1.6 CONTEO CON EL MICROSCOPIO: La eficiencia de la trituración del suelo como método para lisar las células bacterianas se examina con el microscopio. 5 gramos de suelo bruto seco se mezclan en un dispositivo del tipo. Waring Blender con 50 mililitros de agua esterilizada ultrapura durante 1.5 minutos; simultáneamente un gramo (peso seco) del suelo triturado (protocolo número 2) se pone en suspensión en 10 mililitros con agitación durante 10 minutos. Las suspensiones de suelo se diluyen en serie y se agrega anaranjado de acridina a una concentración final de 0.001%. Después de 2 minutos, las suspensiones son filtradas a través de una membrana marca NUCLEOPORE del tipo 0.2 µm negra. Cada filtro se enjuaga con agua esterilizada lisada, se trata con 1 mililitro de isopropanol durante 1 minuto con el fin de fijar las células bacterianas, después se enjuaga nuevamente. Las células bacterianas se contabilizan con la ayuda de un microscopio con epifluorescencia del tipo Zeiss Universal con un objetivo lOOx. Para cada uno de los tipo del suelo, se cuentan tres filtros, y al menos 200 células se contabilizan sobre cada uno de los filtros. 1.7 NUMERACIÓN DE LOS ACTINOMICETOS CULTIVABLES Y EL NUMERO TOTAL DE UNIDADES QUE FORMAN COLONIAS (CFU) : Los actinomicetos que hayan sobrevivido a los tratamientos de lisado (protocolos 1-5), se examinan específicamente con el suelo número 3 (Cote Saint André, ver la tabla 1) . Después de. una dilución de 10 veces de una solución de extracto de levadura (6% peso/volumen) y de SDS (0.05%) con el fin de inducir la germinación (Hayakawa et al. (1998)), las suspensiones de suelo son diluidas en serie en agua estéril, se incuban a 40°C durante 20 minutos y se siembran sobre medio HV (Hayakawa et al., 1987). El medio HV se adiciona con actidiona (50 mg/l) y nistatma (50 mg/ml). Las colonias de actinomicetos se contabilizan después de la incubación durante 15 días a 28°C.

En total, aproximadamente 400 colonias se examinan. La identificación se realiza sobre la base de las características morfológicas macro y microscópicas, así como sobre el análisis del contenido de ácido diaminopimelico de los aislados (SHIRLING et al., 1966); STANECK et al., 1974; WILLIAMS et al., 1993) . La cantidad total de bacterias cultivables (CFU totales) , se determina igualmente para cada uno de los protocolo de lisado l a 5. Las suspensiones de suelo se diluyen en serie y se siembran por triplicado sobre un medio de agar de Bennett (WAKSMAN et al., 1961), adicionado con nistatina y actidiona (cada una a 50 miligramos/litro) . Cada agar de Petri se cubre con un filtro de nitrato de celulosa (Millipore) y se incuba durante tres días a 28 °C. Después de la numeración de las colonias sobre las membranas, los filtros se retiran y las cajas de Petri se incuben nuevamente durante 7 días a 28°C, después se contabilizan de nuevo. 1.8 RECUPERACIÓN DEL ADN DEL FAGO LAMBDA AGREGADO A LOS SUELOS: El ADN del fago lambda se digiere con Hindlll, se extrae por una mezcla de fenol-cloroformo, se precipita y después se resuspende en agua estéril ultrapura de acuerdo con los protocolos estándares (SAMBROOK et al., 1989). . í fSkí'i&hfil&l&t?i ñ JÉÉ? ' Las diluciones que corresponden respectivamente a 0, 2.5, 5, 7.5, 10 y 15 µg de ADN/gramo de peso seco de suelo, se preparan en volúmenes de 60 µl . Estas diluciones de ADN se agregan a los lotes de 5 gramos de suelo seco que posteriormente se han mezclado vigorosamente con un vórtice durante 5 minutos antes de la trituración. El ADN del fago lambda también se agrega a un suelo antes de la trituración a concentraciones que corresponden a 0, 10 y 15 µg de ADN/gramo de peso del suelo seco. Después de la trituración, el amortiguador de extracción se agrega y el ADN se extrae de acuerdo con el protocolo 2 (ver anteriormente) . 1.9 SATURACIÓN DE LOS SITIOS DE ABSORCIÓN CON EL ARN: Con el fin de determinar si la saturación de los sitios de adsorción de los ácidos nucleicos de los coloides del suelo pueden aumentar la tasa de recuperación del ADN, se incuba tierra arenosa (suelo número 4), y suelo arcilloso (suelo número 5) , con una solución de ARN antes de cualquier otro tratamiento. Al ARN comercial de Sa ccharomyces cerevisiae (BOHRINGER MANNHEIM, MEYLAN, Francia), se diluye en un amortiguador de fosfato (pH 7.1), y se agrega a las muestras de suelo seco y tamizado (2 mililitros/gramo de suelo) a l . ' * . i i 1 á •*- ? j i A li<ifrt? ÉÉi ,1 A* - -^- -t-* »*- ***.-**... *¡*tt*******^*^**** **?^^ ..^.^A^M» ************ ,á***? tiaiaJ concentraciones finales de 20, 50 y 100 miligramos de ARN/gramos de peso seco del suelo. Los tubos que contienen las suspensiones e suelo se agitan por rotación durante dos horas a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, los residuos del suelo se secan en un horno (50°C) durante la noche. El ADN del fago lambda se agrega a continuación a los suelos (0, 20 o 50 µg/g en peso seco del suelo) , con el fin de simular el tipo de ADN liberado después del lisado celular. El ADN se extrae de acuerdo con el protocolo número 2. Se determina a continuación que un efecto idéntico de la adhesión del ARN sobre la recuperación del ADN puede esperarse agregando ADN directamente al amortiguador de extracción. Este procedimiento simplificado se utiliza para el suelo arcilloso número 5 en los experimentos en los cuales los microorganismos se han inoculado en los suelos. El ARN se agrega a continuación a una concentración que corresponde a 50 miligramos de ARN/gramos de peso seco del suelo. 1.10 DETERMINACIÓN CUALITATIVA Y CUANTITATIVA DE LA EFICIENCIA DE LOS PROTOCOLOS DE EXTRACCIÓN: La calidad del ADN (ausencia de degradación) se estima sobre- la base de los tamaños de ADN o de la posición relativa de las barras de migración del ADN después de la electroforesis y de una fracción alícuota de una solución de ADN sobre un gel de agarosa al 0.8%. La intensidad de la fluorescencia permite una estimación semicuantitativa de los rendimientos de extracción. Otra fracción alícuota se utiliza para las determinaciones cuantitativas del contenido de ADN por hibridación (Dot Blot) y el análisis con el fosfoformador de imágenes. El protocolo de hibridación sobre la mancha se describe por SIMONET et al., (1990). Las membranas de hibridación (GeneScreen plus, Life Science Products, Boston, Estados Unidos de América) , se prehibridan durante al menos 2 horas en 20 mililitros de una solución que contiene 6 mililitros de 20 x SSC, 1 mililitro de solución de DENHARDT' s, 1 mililitro de SDS al 10% y 5 miligramos de ADN de esperma de salmón. La hibridación se realiza durante una .noche en la misma solución en presencia de una sonda marcada previamente con dos lavados de las membranas en un amortiguador SSC 2x durante 5 minutos a temperatura ambiente, después un tercer lavado en un amortiguador SSC 2x, SDS al 0.1% y un cuarto lavado en un amortiguador SSC lx, SDS al 0.1% durante 30 minutos a la temperatura de hibridación. ffltÉÉÍÉfÍ???l- lntfT"""-""« ^ • •' ^i~í-'- '-imtaMfctt.itiiáirl rf tl-tÉ Las señales de hibridación se cuantifican con un sistema de formación de imágenes radioanalíticos BIORAD (Molecular Analyst Software, BIORAD, Ivry S/Seine, Francia ) . Con el fin de cuantificar la cantidad total del ADN derivado de la microflora nativa, los diferentes suelos se extraen de acuerdo con los protocolos número 1 a 5. El ADN no amplificado se aplica sobre las membranas de Dot Blot y se híbrida utilizando la sonda universal FGPS431 (tabla 2) . Esta sonda, que se híbrida en las posiciones 1392- 1406 del gen del ADNr 16S de E. coli (Amann et al., (1995)) se marca en sus extremos con un ATPa32 utilizando una polinucleotido sinasa T4 (BOEHRINGER MANNHEIM, Melan, Francia) . Se prepara una curva de calibración a partir del ADN de E. coli DH5a. La conversión de los cálculos de las bacterias del suelo necesita una simplificación, partiendo de la hipótesis de que el número de copias promedio (rrn)'es de 7, como para E. coli . El ADN del fago lambda digerido por Hindlll se utiliza para cuantificar al recuperación del ADN extracelular. Los extractos no amplificados a partir de suelo, a los cuales el ADN del fago lambda se ha agregaao, se ...^«^^ lUttMB.J^^A^afc^.^.M^A «fe*,i hibridan con el ADN del fago lambda digerido por Hindlll marcado al azar utilizando el fragmento Klenow (Bóehringer Mannheim, Melan, Francia) . Las cantidades de ADN se calculan por interpolación a partir de una curva de calibración preparada con el ADN purificado. La cantidad total del ADN extraído a partir de los suelos número 1, 2, 3, 4 y 6 de acuerdo con el protocolo número 2 (trituración) se cuantifica igualmente de manera calorimétrica de acuerdo con la técnica descrita por RICHARD (1974) . Brevemente, el ADN se mezcla con HC104 concentrado (la concentración final de HC104 es de 1.5 normal). Se mezclan 2.5 volúmenes de esta solución con 1.5 volúmenes de DPA (difenilamina, Sigma-Aldrich, Francia) y se deja incubar la mezcla a la temperatura ambiente durante 18 horas, previamente la determinación de la DO a 600 nanometros. Los extractos de ADN del suelo se cuantifican con respecto a una curva estándar realizada por el ADN extraído a partir de E. coli , DH5 de acuerdo con los protocolos estándar (SAMBROOK et al., (1989) ) . 1.11 DESARROLLO DE UNA TÉCNICA DE CUANTIFICACION DE ADN UTILIZANDO LA AMPLIFICACIÓN PCR Y LA HIBRIDACIÓN: Para las amplificaciones por PCR, se utiliza ADN de Taq polimerasa (Appligene Oncor, Francia) , de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El programa PCR utilizado para todas las amplificaciones es el siguiente: desnaturalización inicial durante 3 minutos a 95°C, después 35 ciclos que consisten de 1 minuto a 95°C, 1 minuto a 55°C y 1 minuto a 72°C, seguido por una extensión final a 72°C durante 3 minutos. El ADN aislado y purificado a partir de Streptosporangi um fragüe se utiliza como testigo a concentraciones que van de 100 fg a 100 ng. Con el fin de amplificar específicamente el ADN de este genero bacteriano, se eligen los cebadores FGPS122 y FGPS350 (tabla 2), complementarios a una parte del ADNr 16S, después del alineamiento de las secuencias de ADNr 16S de actinomicetos. Su especificidad se prueba sobre una colección de cepas de actinomicetos { Streptomyces , Streptosporangi um y de otros géneros fuertemente emparentados) . Los productos de PCR se hibridan con la sonda oligonucleotídica FGPS643 (tabla 2) . Con el fin de simular el nivel de pureza obtenido de manera rutinaria con el ADN extraído a partir del suelo, los testigos de ADN puro de S . fragüe, se mezcla con los extractos de suelo obtenidos después de los tratamientos de acuerdo con los protocolos de lisado 4b y 5b, después se purifican de acuerdo con el protocolo D. Antes de la utilización, los extractos de suelo se tratan DNasa (una unidad de DNasa/mililitro, GIBCO BRL), durante 30 minutos a temperatura ambiente. La DNasa se inactiva a continuación por calentamiento a 65°C durante 10 minutos. Una verificación de la inactivación se realiza por PCR. Las concentraciones de ácido húmicos se miden por espectrofotometría (DO280nm) contra una curva estándar de ácidos húmicos comerciales (Sigma) . Las soluciones de suelo tratadas con DNasa no diluidas, diluidas a lOx y diluidas x 100 se mezclan con 100 fg a 100 ng de ADN de S . fragüe antes de la amplificación por PCR. En otra serie de experimetos, las concentraciones crecientes de ADN de Streptomyces hygroscopi cus de (100 pg a 1 µg) se agregan al ADN de S . fragüe con el fin de simular la presencia del ADN no blanco y su influencia sobre el procedimiento PCR. 1.12 PURIFICACIÓN DE LOS EXTRACTOS DEL ADN BRUTO: Se comparan cuatro métodos de purificación dei ADN. El ADN se extrae a partir de un gramo (peso seco del suelo de acuerdo »i¡fca,?i.ai<,A i¡|gAJ;^jajilfc,,.^ con el protocolo 4a, y puesto en suspensión en 100 µl de amortiguador TE8 (Tris 50 mM, EDTA 20 mM pH 8.0).

Protocolo A Elución a través de dos columnas sucesivas Elutip d (SCHLEICHER et SCHUELL, Dassel, Allemagne) (PICARD et al., (1992) ) . Protocolo B: Elución a través de una columna SEPHACRYL S200 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suéde) seguido de una elución a través de una columna Elutip d (NESME et al., (1995)).

Protocolo C: Separación con la ayuda de un sistema acuoso de dos fases con PEG 8000 - a 17.9% (peso/peso) (Merck, Darmstadt, Allemagne), y (NH4)2S04 al 14.3% (peso/peso) (ZASLAVSKY, (1995) ) . Después de un mezclado vigoroso en un vórtice, las dos fases se dejan a una temperatura ambiente para su separación. 1 mililitro de cada un adenovirus las fases se transfiere a otro tubo, se mezclan con 100 µm de la mezcla y se deja a 4°C durante una noche para permitir la separación.

La fase inferior se dialisa. durante una hora a través de una membrana Millipore en presencia de un exceso de un amortiguador TE 7.5 (Tris 10 mM, EDTA lmM a un pH de 7.5 y Mg Cl2 1 molar) con el fin de eliminar las sales en exceso.

Protocolo D: Elución a través de una columna del tipo Microspin Sephacryl S400 H 12 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suéde), seguido de una elución a través de una columna del tipo Elutip d. Cada protocolo se termina por una etapa de precipitación por etanol, el ADN se pone en suspensión en 10 µl de amortiguador TE 7.5. La eficiencia de los protocolos de purificación se verifica por amplificación PCR de las fracciones alícuotas no diluidas de las soluciones de ADN de las fracciones de alícuotas diluidas 10 y x 100 veces, utilizando los protocolos estándar (ver posteriormente) . 1.13 RECUPERACIÓN DEL ADN PARTIR DE MICROORGANISMOS INOCULADOS : Las células, esporas e hifas, se lavan dos veces y se enumeran por conteo sobre una placa o conteo microscópico directo. Los lotes de 5 gramos del suelo seco y tamizados (suelos número 2, 3 y 5) , se inoculan con 100 µl. de una suspensión de esporas e hifas de S. lividans a a * ?****..l**..***.* **^.***!^.* *..^***' **,***.t*A I concentraciones que corresponden a 0, 103, 105, 10 , 10 espora/gramo de peso seco de suelo, o con células vegetales de B.anthracis a -concentraciones que corresponden a 0, 10 y 109 células por gramo de peso seco del suelo. Las cantidades de hifas de S. lividans se calculan sobre la base del número de esporas de las cuales son originarias. Después de la adición de las suspenciones bacterianas, las muestras de suelo son mezcladas vigorosamente con un vórtice durante 5 minutos antes de la trituración. El ADN se extrae de acuerdo con el protocolo número 6 (ver posteriormente) . La amplificación PCR seguida de una hibridación sobre mancha (Dot Blot) y formación de imagen por fosfoforecencia (fosfoformaci?'n de imagen) se utiliza con el fin de cuantificar las cantidades de ADN recuperadas a partir de las células, las esporas y del micelio bacteriano inoculado en los suelos. La extracción de ADN se realiza de acuerdo con el protocolo de lisado número 6. La amplificación PCR y la hibridación de realizan como se describe anteriormente. Los cebadores y las sondas son puestas en el blanco sobre las regiones cromosómicas localizadas fuera de la región 16S , y son altamente específicas de los organismos respectivos, de manera que se evitan las señales de ruido de fondo.

Para los suelos sembrados con B. Anthracis , los cebadores R499 y R500 se utilizan (Patra et al. (1996)) y los productos de amplificación se hibridan con la sonda oligonucleotídica C501 (tabla 2) . Para lo suelos sembrados con S . lividans , las reacciones PCR se realizan utilizando los cebadores FGPS516 y FGPS517 y los productos de amplificación se hibridan con la sonda oligonucleotídica FGPS518 (tabla 2) . La región amplificada es una parte del cásete construido específicamente para obtener las cepas 0S48.3 (CLERC-BARDIN et al., no publicada). Los conteos de calibración se hacen en todos los casos obtenidos utilizando el ADN purificado del organismo blanco. 2. RESULTADOS 2.1 ELECCIÓN DEL AMORTIGUADOR DE EXTRACCIÓN: 20 suelos diferentes se utilizan con el fin de determinar el pH óptimo del amortiguador de extracción del ADN. Para todos los suelo, el rendimiento en ADN aumenta con el pH creciente del amortiguador. El rendimiento para cada pH (V- SD1 calculado como el porcentaje del valor más alto para cada uno de los suelos, es el siguiente: pH 6.0: 3lV-13; pH 7.0: 43+/- 16; pH 8.0: 60V- 14; pH 9.0: 827- 12; pH 10.0: 98V- 3.

Para 16 de los 20 suelos, el rendimiento más elevado se obtiene a un pH de 10.0, mientras que para los otros cuatro suelos, el rendimiento más _ _- alto se obtiene a un pH de 9.0. Sin embargo, un pH de 10.0 las cantidades más grandes de material único se liberan, comparadas con un pH 9.0 (resultados no presentados). En consecuencia, el pH 9.0 se elige para todos los experimentos presentados a continuación. 2.2 EFICIENCIA DE LOS PROTOCOLOS DE EXTRACCIÓN DEL ADN: El ADN total de los organismos nativos del suelo se extrae y cuantifica de manera que se evalúa la eficiencia de numerosos protocolos de la eficiencia celular ín si tu . Las muestras de los suelos 1-6 (tabla 1) se tratan de acuerdo con los protocolos número 1 a 5 descritos en la sección material y método (Figura 1) . Después de la extracción del ADN, las suspensiones de suelos se precipitan con isopropanol, y las fracciones de alícuotas de los residuos se ponen en suspensión y se analizan por electroforesis sobre gel, en una primera etapa con el fin de estimar la calidad y la cantidad del ADN liberado . Sin embargo, el color del extracto de ADN se vuelve cada vez más obscuro con forme al número creciente de etapas a üiilfifi'?Hiái ¡ ?¿r?J¿ÉíJríi i ,******* '¿¡i tánaaaaAan de lisado, debido a la coextraccion de los compuestos, tales como los ácidos húmicos, con el ADN. Cientos de estos extractos brutos de color no migran de la manera esperada en los geles de agarosa. En consecuencia, las soluciones de ADN bruto se purifican (protocolo B) antes de la cuantificación. Las electroforesis sobre gel de las soluciones purificadas obtenidas después de los diferentes tratamientos de lisado se ejemplifican sobre el suelo número 3 (Figura 2) . Una comparación visual con rayos ultravioleta de las intensidades del ADN coloreado permite una estimación semicuantitativa de la eficiencia de los tratamientos. Además, la presencia de los perfiles de emigración de tamaños múltiples de los fragmentos (bandas discretas) de ADN y la desaparición de los fragmentos largos indica que una degradación del ADN ha tenido lugar. Ningún ADN se pudo extraer del suelo arcilloso número 5. Una cuantificación más precisa del ADN de todos los suelos, extraído de acuerdo con los protocolos no. 1 a 5, se realiza por hibridación sobre manchas (Dot Blot) sin etapa de amplificación PCR previa, y utilizando una sonda oligonucleotídica complementaria de una secuencia altamente conservada de la región del ADNr 16S (sonda FGPS 431, tabla 2) . .^¡¿^¡¿1 El ADN se detecta en los extractos de todos los suelos después de cada una de las diferentes etapas de lisado, con la excepción del suelo arcilloso no. 5. Los resultados concuerdan con las estimaciones realizadas después del gel de electroforesis. Con el fin de comparar con un método independiente para la cuantificación, el ADN extraído de acuerdo con el protocolo no. 2 (todos los suelos, salvo el suelo no. 5), se cuantifica igualmente utilizando un método colorimétrico de detección del ADN (RICHARD, 1974) . Se encuentra una buena correlación (r = 0.88) entre el ADN cuantificado utilizando esta técnica colorimétrica y los resultados obtenidos por la hibridación del tipo Dot Blot/radioformación de imágenes, que confirman la hipótesis, según la cual el número de copias promedio de las bacterias del suelo (rrn) es de 7. La hibridación (Dot Blot) muestra que las cantidades de ADN extracelulares, como se determina por extracción sin tratamiento de lisado (protocolo no. 1), da de 4 µg/g para el suelo ácido (no. 6) a 36 µg/g para el suelo ácido no. 3 (tabla 3) . La trituración del suelo (protocolo no. 2) aumenta las cantidades del ADN extraído a partir de todos los suelos ilzitÍ?Íébjiz?ittdk***** *^^ (por ejemplo 26 µg/g de suelo) para el suelo no. 6 y 59 µg/g de suelo (para el suelo no. 3) (tabla 3; figura 2) . Para los dos tratamientos de trituración (ver la sección materiales y métodos), la migración discreta del ADN se detecta sobre los geles de agarosa, indicando que las moléculas de ADN se han degradado parcialmente (figura 2) . El tamaño de los fragmentos del ADN está comprendido entre 20 y 0.2 kb. La intensidad de la banda de los fragmentos más pequeños es muy escasa, indicando que la mayor parte de los fragmentos tienen un tamaño muy superior a 1 kb. El protocolo no. 3 comprende una etapa de homogenización en un dispositivo mezclador del tipo Ultraturax después de la adición del amortiguador de extracción a las muestras de suelo. Esta etapa conduce a un aumento de las cantidades del ADN extraído, como se determina por hibridación sobre machas (Dot Blot) para dos de los suelos (la tierra arenosa no. 3 y el suelo ácido no. 6), mientras que los dos suelos ricos en materia orgánica (suelos no. 1 y no. 2) conducen a la obtención de cantidades más escasas de ADN. Los protocolos no. 4a y no. 4b permiten evaluar la influencia de dos tipos de sonicación sobre los rendimientos de ADN a partir de los suelos previamente triturados y homogenizados . ..******j******a*.* ***?*i*A*?*?^* *?^*i* **., La sonicación no tiene un efecto positivo sobre el rendimiento de ADN, en comparación con el protocolo no. 3, excepto para el suelo no. 6. Sin embargo, la eficiencia del lisado de los dos tipos de sonicador difiere. Para los suelos no. 2, 3 y 4, las cantidades más grandes de ADN extraídas se obtiene utilizando la micropunta de titanio (tabla 3; figura 2), mientras que para los suelos no. 1 y no. 6, el rendimiento de ADN es superior utilizando el dispositivo Cup Horn. Se obtienen igualmente resultados contradictorios cuando se agrega una etapa de lisado enzimático/químico (protocolo no. 5a y 5b) después de la etapa de sonicación: en ciertos casos, las cantidades de ADN extraídas son más grandes que aquellas recuperadas de acuerdo con los protocolos no. 4a y 4b, mientras que en los otros casos, los rendimientos son menores (tabla 3) . 2.3 CONTEO DIRECTO DE LOS MICROORGANISMOS: Los conteos con microscopio del número total de células bacterianas después de la coloración con anaranjado de acridina se realizan para todos los suelos, antes y después de la trituración. Antes de la trituración, el número de bacterias por gramo de peso seco del suelo va de 1.4 x 109 (+/-0.4) en el suelo tropical no. 5 a 10 x 109 (+/-0.7) en el suelo que proviene de la Costa Saint-André (suelo no 3) (tabla 1) . Después de la trituración, el número de células es respectivamente de 45, 74, 75, 54, 34 y 75% de los valores iniciales para los suelos no. 1 a 6. 2.4 NUMERACIÓN DE LOS ACTINOMICETOS CULTIVABLES QUE PERTENECEN A DIFERENTES GÉNEROS: Se observa una modificación en las poblaciones de actinomicetos en el suelo no. 3 después de los diferentes tratamiento de lisado (figura 3) . Por ejemplo, las colonias de Streptomyces sp. , dominan la flora viable de actinomicetos a los cuales no se les aplica ningún tratamiento de lisado (protocolo no. 1), y representan el 65% del número total de colonias identificadas. Después de la trituración, el porcentaje de colonias de Streptomyces disminuye para alcanzar el 51%, mientras que la proporción de colonias que pertenecen al género Micromonospora a aumentado del 14% al 41%. El lisado químico/enzimático (protocolos 5a y 5b) aparece como particularmente eficaz para el lisado de los estreptomicetos . Cuando todos los tratamientos de lisado se han aplicado, comprendiendo un lisado químico/enzimático (protocolos 5a y 5b), la microflora de actmomicetos, que comprende incluso más de 10° CFU/g de suelo, está dominada por las especies que pertenecen al género Mi cromonospora , mientras que ninguna o muy pocas colonias de Streptomyces se recuperan. Los organismos que pertenecen a los géneros tales como Streptosporangium , Actinomadura , Microbispora , Dactilosporangium y Actinoplanes aparecen sobre las placas en un número escaso (2-8% del número total de colonias identificadas) después de la trituración, homogenización con el dispositivo Ultraturrax, y sonicación, pero permanecen generalmente ausentes cuando estos tratamientos son combinados con un lisado químico/enzimático. El número total de bacterias cultivables que permanece después de cada tratamiento de lisado (protocolos 2 a 5) también se busca para el suelo no. 4. Los resultados indican que el número de bacterias cultivables no disminuye con la intensidad de los tratamientos de lisado (aproximadamente 2 x 106 CFU/g de suelo en todos los casos, e igualmente cuando ningún tratamiento es aplicado, tal como de acuerdo con el protocolo no. 1). La obtención de estos valores bajos de CFU se debe probablemente al hecho de que el suelo seco se utilizó y que solo las bacterias más resistentes se multiplican sobre las placas. El número de actinomicetos que forman colonias es generalmente más grande que aquel de las CFU totales (todas las bacterias) debido a que una etapa de germinación de las **í*****?**t¡***.*. .*t*j*.?*** *-*** -tfa^t^^^^t^i^^^^AAA^^ii^ajMfcaiJ esporas, comprendida en el protocolo de detección de los actinomicetos, carece entonces del control de las bacterias totales. 2.5 RECUPERACI N DEL ADN DEL FAGO LAMBDA AGREGADO: El objeto de estos experimentos es estimar de que manera los tratamientos de lisados sucesivos pueden afectar la recuperación del ADN solo, y si estos tratamientos sucesivos de lisado contribuyen a su degradación. El ADN puede ser una fracción de ADN extracelular liberado a partir de organismos ya muertos, que pueden persistir en el suelo durante meses (WARD et al., 1990), o ya sea del ADN liberado partir de organismos lisados fácilmente durante las primeras etapas del tratamiento. Con el fin de simular esta situación el ADN del fago lambda digerido por HindIII se agrega, a diversas concentraciones, a los suelos antes y después de la trituración. Además de la trituración, se prueba una combinación de otros tratamientos de lisado, que comprende la sonicación (dispositivo Cup Horn, ver protocolo no. 4b) y choques térmicos (ver la sección Materiales y Métodos) . Después de la extracción, las fracciones alícuotas que deberían contener teóricamente del 25 a 150 ng de ADN del fago lambda se analizan por electroforesis sobre gel. Ningún fragmento de ADN específico del fago lambda pudo observarse cuando el ADN se inocula en las muestras de suelo previamente al triturado, independientemente de la dosis, o del tipo de suelo. Cuando el ADN es agregado después de la trituración, y se extrae sin una etapa de tratamiento de lisado adicional, los perfiles específicos del ADN del fago lambda se detectan en los extractos de cuatro de los cinco suelos probados. En todos los casos, se obtiene una relación directa de causa efecto entre la cantidad de ADN agregado y la intensidad de las señales sobre los geles de agarosa. Las intensidades de las señales son, sin embargo, inferiores a las intensidades de las señales esperadas si se les compara con aquellas de los estándares moleculares. Además, la banda de 23 kb está ausente en varios casos, indicando que los fragmentos largos son adsorbidos de manera preferida por las partículas del suelo, o son más sensibles ( a la degradación, comparados con los fragmentos cortos . Ninguna banda se detectó en las muestras de suelo tropical no. 5, que está caracterizado por un contenido muy alto en arcilla (tabla 1) . Para una cuantificación más precisa, la recuperación del ADN se determina sobre un dispositivo de formación de imágenes por fosforescencia (fosfoformador de r.a. A,,?^?i^^a»t^^.^.^>^ja«Í MteA.. imágenes) después de la hibridación en manchas (Dot Blot) . De acuerdo a esta técnica, el ADN se detecta sobre todas las muestras, comprendiendo aquellas que se inocularon antes de la trituración, con la excepción del suelo no. 5, en el cual ningún ADN pudo detectarse. En todos los otros suelos, la cantidad de ADN extraído aumenta con el aumento del tamaño del inoculo (figuras 4a-d) . Sin embargo, las recuperaciones del ADN del fago lambda son escasas. Cuando la trituración es el único tratamiento de lisado aplicado, las recuperaciones están comprendidas entre 0.6 y 5.9% del ADN agregado cuando este es agregado antes de la trituración, y de 3.6 a 24% del ADN agregado cuando este último se agrega después de la trituración. Los niveles más altos de recuperación se obtienen a partir del suelo no. 2. La electroforesis sobre gel de fracciones alícuotas tratadas por choque térmico y sonicación, no permite observar bandas de ADN en ninguna de las muestras, que comprenden el ensayo en el cual el ADN se agregó después de la trituración. Los experimentos de hibridación en mancha (Dot Blot) confirman estos resultados. Las señales de hioridación obtenidas a partir de suspensiones de suelo que se tratan con choques térmicos y sonicación, son, a lo mucho escasas.

La muestra que presenta la cantidad más fuerte de ADN (15 µg de ADN/g de peso seco del suelo) es la única para la cual la señal obtenida es sensiblemente diferente del nivel del ruido de fondo. Ninguna diferencia (o diferencias bajas) se observa entre las muestras tratadas por choque térmico y sonicación, indicando que los choques térmicos tienen un efecto perjudicial sobre el ADN. Las recuperaciones mejores se observan para el suelo no. 2, que tiene el contenido más fuerte de materia orgánica (tabla 1) , mientras que ningún ADN se recupera a partir del suelo arcilloso no. 5. Los experimentos adicionales se realizan con las muestras no trituradas de los suelos no. 4 y 5, que han sido sembrados con 20 y 50 µg de ADN de fago lambda por gramo de suelo. Las muestras son extraídas inmediatamente o después de un periodo de incubación de una hora a 28 °C, después los extractos de ADN se purifican y analizan por electroforesis sobre gel. La incubación del gel no. 4 durante una hora después de la inoculación no conduce a perfiles cualitativa o cuantitativamente de aquellos obtenidos sin incubación o de aquellos observados anteriormente cuando el ADN se agregó después de la trituración. ?áá,á,LÁ?,?.*í.. ******** i^ jj ftf !** ****.*, **A*** **** * .**¡**? *t*á? Estos resultados indican que la degradación enzimática por las nucleasas del suelo no estarían implicadas en la baja tasa de recuperación del ADN. Además, la ausencia e la etapa de trituración no permite un aumento de la recuperación del ADN a partir del suelo no. 5, indicando que las modificaciones de estructura del suelo debidas a la trituración no aumentan significativamente la adsorción de los ácidos nucleicos sobre los coloides. 2.6 SATURACIÓN DE LOS SITIO DE ADSORCIÓN CON EL ARN: La mayor parte de los perfiles obtenidos sobre los geles de agarosa no difieren significativamente de los perfiles precedentes en los cuales el tratamiento de ARN no se ha efectuado. Por ejemplo, ninguna banda ha sido detectada a partir del suelo rico en arcilla no. 5, independientemente de las concentraciones de ARN y de las concentraciones de ADN del fago lambda utilizadas. Además, las bandas específicas del ADN del fago lambda digeridas por HindIII permanecen indetectables en la tierra arenosa tratada por ARN (suelo no. 4) cuando el ARN es agregado antes de la trituración. La intensidad de las bandas obtenidas a partir de las muestras sembradas con ADN después de la trituración m***** t* ?ks ****?* *. - i^µ*?^****^l**i^**?*¿á**u**tlÉM aumenta con la concentración del ARN, indicando que el tratamiento podría tener un efecto positivo. Sin embargo, los resultados después de la hibridación y análisis por formación de imágenes con fosforescencia, no confirman los resultados de la electroforesis. Por ejemplo, el efecto positivo del tratamiento del ARN sobre la recuperación del ADN a partir de la tierra arcillosa, cuando el ADN se ha agregado después de la trituración, no aparece claramente, Por otro lado, se ha encontrado un efecto positivo del ARN para el suelo rico en arcilla (no. 5) , cuando el ADN se agrega después de la trituración. Si bien las señales de hibridación para las muestras control no difieren de los niveles del ruido de fondo, cantidades significativas de ADN son liberadas a partir de las muestras tratadas por el ARN, y las señales aumentan con la cantidad de ADN agregado, así como con la concentración del ARN. Sin embargo, ya sea por la concentración más fuerte de ARN (100 mg/g de peso de suelo seco) la proporción de recuperación no sobrepasa jamás el 3%.

I??AAJÍ???? ? ******* .aatA ki 2.7 PURIFICACIÓN DE LOS EXTRACTOS BRUTOS DEL ADN: En cuatro protocolos probados, la mejor amplificación de los extractos de ADN no diluidos (1 µl de extracto en 50 µl de mezcla PCR) se observa después de la elusión en las columnas del tipo Microspin S400, seguida de una elución a través de una columna del tipo Elutip d, como los muestra la electroforesis sobre gel de los productos de PCR. El ADN purificado por el sistema acuoso de doble fase (protocolo C) , ha proporcionado cantidades más bajas de los productos de PCR después de la amplificación a partir del extracto de ADN no diluido. Ningún producto de amplificación se pudo obtener a partir de los extractos no diluidos después de la amplificación, a Continuación de la aplicación de los protocolos A o B. En consecuencia, el protocolo B (ver sección Materiales y Métodos), se utiliza para todos los experimentos, en los cuales las amplificaciones por PCR y/o las hibridaciones sobre manchas (Dot Blot) se realizan. 2.8 CUANTIFICACION POR PCR E HIBRIDACIÓN: La primera etapa es determinar si las cantidades de producto de PCR son proporcionales al número de moléculas de ADN blanco inicialmente presentes en el tubo de reacción. El ADN de Streptosporangium fragile se utiliza como blanco (ver sección Materiales y Métodos). Los cebadores utilizados son los cebadores FGPS122 y FGPS350 (tabla 2) . La electroforesis sobre gel de los productos de la PCR ha mostrado que la intensidad de la banda aumenta con el incremento de la concentración de los blancos. Los productos de la PCR se hibridan con la sonda oligonucleotídica FGPS643 (tabla 2), y las señales se cuantifican por formación de imágenes por fosforescencia (fosfoformación de imágenes) . Se encuentra una buena correlación (r2 = 0.98) entre el log [número de blanco] y el log [intensidad e la señal de hibridación] . A continuación, se busca si la eficiencia de la amplificación PCR está afectada por los ácidos húmicos y el ADN no blanco. Cuando se analiza por electroforesis sobre gel, la intensidad incrementada de las bandas de los productos de la PCR, corresponden a las diferentes cantidades de ADN blanco, se conservan cuando la amplificación se realiza con soluciones de ADN a la cuales se agregaron los extractos de suelo tratados con DNasa, que contiene los ácidos únicos a concentraciones que van hasta 8 ng en la mezcla PCR de un volumen de 50 µl . Con 20 ng de ácido único en la mezcla PCR, las bandas que corresponden a los niveles más bajos de ADN blanco desaparecen, y a las concentraciones de ácido húmico de 80 ng y a concentraciones superiores, ninguna banda es visible. Las cantidades variadas de ADN blanco de S. fragüe permiten proporcionar las cantidades esperadas del producto de la PCR cuando, antes de la amplificación, el ADN de S. fragüe se mezcla con el ADN de Streptomyces hygroscopicus, y se agrega a la mezcla PCR de 50 µl en una gama de 100 pg a 1 µg con el fin de simular el ADN no blanco liberado a partir de la microflora de suelo. 2.9 CUANTIFICACION DE LOS ACTINOMICETOS NATIVOS DEL SUELO DESPUÉS DE DIFERENTES TRATAMIENTOS DE LISADO: Se aplica el protocolo de purificación D, seguido de una amplificación por PCR como se describe anteriormente, con el fin de cuantificar los actinomicetos que pertenecen al género Streptosporangi um en el suelo no. 3 después de la extracción de acuerdo a los protocolos no. 1, 2, 3, 5a y 5b (figura 5) . Después de la trituración, (protocolo no. 2) la cantidad de ADN blanco que proviene de estos actinomicetos se estima por hibridación (Dot Blot) y radioformación de imágenes como de 2.5 +/-1, 3 ng/g de peso de suelo seco. Si se postula que el contenido de ADN es de 10 fg or célula, como para Streptomyces (Gladek et al. 1984), este 8ú **** .!..**** .... *..**,** ^t*?. ***-*.*,**^á^mtM***a?*?mt^M*l**h f|MÉf|1jyi?>&.fe-A».fcA valor corresponde a aproximadamente 2.5 x 10 genomas. Valores similares se han obtenido después de otros tratamientos de lisado (respectivamente 2.6 +/-1.1 y 1.8 +/- 1.3 ng de ADN/g de suelo seco utilizando respectivamente los protocolos 3 y 4b) . 2.10 EFICIENCIA DE LA RECUPERACIÓN DEL ADN A PARTIR DE SUELOS PREVIAMENTE INOCULADOS CON BACTERIAS: Tres suelos (no. 2, 3 y 5), se inoculan con esporas o hifas de Streptomyces lividans a diferentes concentraciones (ver sección Materiales y Métodos) . La cantidad de micelio agregado al suelo (figura 6b) corresponde al número de esporas inoculadas en el medio de germinación.

Aproximadamente 50% de estas esporas germinan. El número exacto de células en las hifas de las esporas germinadas no se determina. En consecuencia, las cantidades de esporas y de micelio sembradas en los suelos no son comparables directamente. Para cada muestra de suelo, el protocolo de extracción no. 6, el método de purificación D, y la amplificación por PCR combinada con la hibridación sobre manchas (Dot Blot) y la formación de imágenes por fosforescencia (fosfoformación de imágenes), se utilizan para enumerar los ADN blanco específicos que se liberan. El ADN extraído puede distinguirse claramente del ruido de fondo solamente cuando el número de esporas agregadas sobrepasa 105, para los suelos no. 3 y no. 5 y 107 para el suelo no. 2 (figura 6a) . Cuando el micelio se agrega, el ADN extraído puede detectarse más allá de una cantidad que corresponde a 103 esporas/g de suelo para los suelos no. 2 y no. 3, y más allá de 107 esporas/g para el suelo no. 5 (figura b) . Por encima del nivel de detección, la señal de hibridación aumenta con las cantidades crecientes de las células inoculadas. Para el inoculo de las esporas, un aumento de 100 veces en el número de células sembradas conduce a un aumento de casi 100, debido al rendimiento del ADN. Este aumento es claramente inferior cuando las hifas son inoculadas, particularmente en los suelos no. 2 y no. 3 (figura 6) . Por el contrario, los resultados obtenidos con el ADN del fago lambda se utiliza como inoculo, el ADN se recupera igualmente a partir del suelo rico en arcilla (no. 5), cuando las célula bacterianas se utilizan como inoculo. Sin embargo, para este último también, el tratamiento por ARN aumenta la recuperación del ADN de Streptomyces a partir de este suelo, a la vez para las esporas y el micelio (figura 6) . El hecho de sembrar los suelos con células vegetales de Ba cill us an thracis proporciona tasas de recuperación similares a aquellas obtenidas para Streptomyces . Además, las tasas de recuperación de ADN a partir del suelo no. 5 aumentan después del tratamiento por ARN igualmente para este inoculo.

Ejemplo 2 : Construcción de un banco de ADN de bajo peso molecular (<10 kb) a partir de un suelo contaminado con lindano : clonación y expresión del gen llnA Este ejemplo describe la construcción de una biblioteca de ADN del suelo en E. coli . Permite demostrar la clonación y expresión de los genes de tamaño pequeño procedentes de una microflora no cultivable. El lindano es un plagicida organoclorado, recalcitrante a la -degradación y que persiste en el medio ambiente. En un medio aerobio, su degradación es catalizada por una deshidroclorinasa, codificada por el gen linA, que permite transformar el lindano en 1, 2, 4-triclorobenceno. El gen linA no se ha identificado más que en dos cepas aisladas del suelo: Sphingomonas pa ucimobilis, aislada en Japón (Seeno et Wada 1989, Imai et al 1991, Nagata et al 1993) y Rhodanoba cter líndani clasti cus aislada en Francia (Thomas et al 1996, Nalin et al 1999) . íiAljii ii ÉrfÉ?i}? ÍÍír?l"""--'-----iia*^a¿'-t-?f^-- ****** ****t-*~-. *.*?*^****^***' *á***?*??*t**f** *&*>!§!- Sin embargo, el potencial de degradación del lindano puesto en evidencia por la dosificación de los iones cloruros librados y la amplificación por PCR del gen linA a partir de suelos que hayan estado en contacto o no con el lindano, parece propagarse grandemente en el medio ambiente (Biesiekierska-Galguen, 1997) . 1. Extracción directa del ADN del suelo Los suelos secos son triturados durante 10 minutos en un triturador de fuerza centrífuga Restch equipado con 6 bolas de tungsteno. 10 gramos de suelo triturado son puestos en suspensión en 50 ml de amortiguador TENP a pH 9 (Tris 50 mM, EDTA 20 mM, NaCl 100 mM, polivinilpolipirrolidona al 1% peso/volumen) , y homogenizados en un vórtice durante 10 minutos. Después de la centrifugación de 5 minutos, 4000 g a 4°C, el sobrenadante se precipita con acetato de sodio (3M, pH 5.2) e isopropanol, para volverse a tomar en un amortiguador TE estéril (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8.0). El ADN extraído es purificado a continuación sobre una columna de tamizado molecular S400 (Pharmacia) , y sobre una columna intercambiadora de iones (Schleicher et Schuell), de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes, después se conserva en TE.

^Aß&á X* "S¡ r . Construcción del banco de ADN extraído del suelo en el vector pBluescript SK- El vector pBluescript SK- y el ADN extraído del suelo son cada uno digeridos por las enzimas HindIII y BamHl 5 (Roche) a razón de 10 unidades de enzimas por 1 µg de ADN (incubación de 2 horas a 37°C) . Los ADN son a continuación ligados por la acción del ADN ligasa T4 (Roche) , una noche a 15 °C, a razón de una unidad de enzima por 300 ng de ADN (aproximadamente 200 ng de ADN insertado y 100 ng de vector 10 digerido) . Las células de Escherichia coli electrocompetentes, ElectroMAX DH10B™ (Gibco BRL) son transformadas por la mezcla de ligación (2 µl) por electroporación (25 µF, 200 y 500 O, 2.5 kV) (Biorad Gene Pulser) . 15 Después de una hora de incubación en el medio LB, las células transformadas son diluidas de manera que se obtienen aproximadamente 100 colonias por caja, después son repartidas sobre medio LB (10 g/1 de Triptona, 5 g/1 de extracto de levadura, 5 g de /NaCl) adicionado con Ampicilina 20 (100 mg/l), con ?-HCH (500 mg/l), con X-gal 60 mg/l (5-bromo- 4-cloro-3-indolil-a-D-galactosido) , y IPTG 40 mg/l (isopropiltio-ß-D-galactosido) , y se incuban una noche a 37°C. El ?-hexaclorociclohexano (merck-Schuchardt ) es ínsoluble en agua, se prepara una solución de 50 g/1 en DMSO (dimetil sulfóxido) (Sigma) . Se obtiene así un banco de 10 000 clones. 3. Clonación y expresión del gen linA El tamizado de un banco se efectúa por visualización de un halo de degradación de lindano alrededor de la colonia (el lindano precipita en los medios de cultivo) . Sobre 10 000 clonas tamizadas, 35 presentan así una actividad de degradación de lindano. La presencia del gen linA en estas clonas se puede continuar por PCR gracias a los cebadores específicos, descritos por Thomas et al (1996) . Las digestiones realizadas sobre los insertos así como sobre los productos de amplificación muestran perfiles idénticos entre todos los clones tamizados y el testigo de referencia R . lindaniclasti cus . Los clones que aportan el gen linA presentan igualmente un inserto del mismo tamaño (aproximadamente 4 kb) . Puede demostrarse así que el ADN del suelo puede clonarse y expresarse en un huésped heterólogo: E. coli , y que los genes que provienen de una microflora difícilmente cultivable pueden ser expresados. Los bancos realizados a partir de la digestión parcial del ADN extraído del suelo por las enzimas de restricción tales como Sa u3Al , son por lo tanto también considerables.

EJEMPLO 3: Procedimiento de preparación de una colección de ácidos nucleicos a partir de una muestra del suelo, que comprende una etapa de extracción indirecta del ADN. 1. MATERIAL Y MÉTODOS 1.1 Extracción de la fracción bacteriana del suelo . 5 gramos del suelo son dispersados en 50 ml de NaCla al 0.8% estéril, por trituración en un Waring Blender durante 3 x 1 minuto, con enfriamiento en hielo entre cada trituración. Las células bacterianas son entonces separadas de las partículas del suelo por centrifugación sobre un colchón de densidad de Nycodenz (Nycomed Pharma AS, Oslo, Noruega). En un tubo de centrifugación, 11.6 ml de una solución de Nycodenz de densidad de 1.3 g por ml"1 (8 g de Nycodenz suspendidos en 10 ml de agua estéril) , son colocados debajo de 25 ml de la suspensión de suelo obtenida anteriormente. Después de la centrifugación a 10.000 g en un rotor de recipientes móviles (rotor TST 28.38, Kontron) durante 40 minutos a 4°C, el anillo celular, que se sitúa en la interfase de la fase acuosa y la fase de Nycodenz, se toma, se lavan 25 ml de agua estéril y se centrifuga a 10.000 g durante 20 minutos. El residuo celular es tomado a continuación a una solución de Tris 10 mM; EDTA 100 mMn, pH 8.0. Previamente la dispersión del suelo en Waring Blender, puede incluirse una etapa de enriquecimiento del suelo en una solución de extracto de levadura, con el fin de permitir especialmente la germinación de las esporas bacterianas del suelo 5 g del suelo son entonces incubados en 50 ml de una solución estéril de NaCl del 0.8% - extracto de levadura al 6%, durante 30 minutos a 40 °C. El extracto de levadura se elimina por centrifugación a 5000 rpm durante 10 minutos con el fin de evitar la formación de espuma durante la trituración. 1.2 Lisado de las células bacterianas del suelo - Lisado , de las cél ulas en medio líquido y purifica ción sobre gradien te de cloruro de cesio Son usadas en una solución de Tris 10 mM, EDTA 100 mM, pH 8.0 que contienen 5 mg por ml"1 de lisozima y 0.5 mg por ml"1 de acromopeptidasa durante 1 hora a 37 °C. Una solución de lauril sarcosilo (1% final) y de proteinasa K (2 mg por ml"1) , se agrega a continuación y se incuba a 37°C durante 30 minutos. La solución de ADN es entonces purificada sobre un gradiente de densidad de cloruro de cesio por centrifugación a 35 000 rpm durante 36 horas sobre un rotor Kontron 65.13. EL gradiente de cloruro de cesio empleado es un gradiente de 1 g/ml de CsCl, que posee un índice de refracción de 1,3860 (Sambrook et al., 1989).

- Lisado de las células después de la inclusión en un bloque de agarosa . Las células son mezcladas con un volumen igual de agarosa al 1.5% (peso/volumen) Seaplaque (Agarose Seaplaque FMC Products. TEBU, Le Perray en Yvelines, Francia), de bajo punto de fusión e incluidas en un bloque de 100 µl . Los bloques son a continuación incubados en una solución de lisado: EDTA 250 mM, sacarosa al 10.3%, lisozima 5 mg por ml"1 y acromopeptidasa 0.5 mg por ml"1 a 37 °C durante 3 horas. Los bloques son entonces lavados en una solución de Tris 10 mM -EDTA 500 mM e incubados una noche a 37° c en el EDTA 500 mM que contienen 1 mg- por ml"1 de proteinasa K y lauril sarcosilo al 1%. Después de varios lavados en Tris-EDTA, los bloques son conservados en el EDTA 500 mM: La calidad del ADN así extraído es controlada por electroforesis en campos pulsátiles. La cantidad del ADN extraído se evalúa sobre un gel de electroforesis con respecto a una escala patrón del ADN de timo de becerro. 1.3 Caracterización molecular del ADN extraído del suelo Los ADN extraídos del suelo son caracterizados por hibridación por PCR, método que consiste en amplificar en un primer tiempo los ADN con la ayuda de cebadores situados sobre las regiones universalmente conservadas del gen del ARNrl6S, después de hibridar los ADN amplificados con diferentes ondas oligonucleotídicas de especificidad conocida (tabla 4), con el objeto de cuantificar la intensidad de la señal de hibridación con respecto a una escala patrón externa del ADN genómico. Los ADN extraídos del suelo así como los ADN genómicos extraídos de los cultivos puros son amplificados con los cebadores FGPS 612-669 (tabla 1), en condiciones estándar de amplificación por PCR. Los productos de amplificación son desnaturalizados a continuación por un volumen igual de NaOH ÍN, depositados sobre una membrana de Nylon (GeneScreen Plus, Life Science Products) e hidridados con una sonda oligonucleotídica marcada en su extremo por el g32P ATP por la acción de la oligonucleótido cinasa T4. Después de la prehibpdación de la membrana de una solución de 20 ml que contiene 6 ml de SSC 20X, 1 ml de solución de Denhardt, 1 ml de SDS al 10% y 5 mg de ADN heterólogo de esperma de salmón, las hibridaciones son conducidas durante una noche a la temperatura definida para la sonda. Las membranas son lavadas dos veces en SSC 2X durante 5 minutos a temperatura ambiente, después una vez en SSC 2X SDS al 0.11% y una segunda vez en SSC IX, SDS al 0.1% durante 30 minutos a la temperatura de hibridación. Las señales de hibridación son cuantificadas con ayuda de lógico Molecular Analyst (Biorad, Ivry sur Seine, Francia) y las cantidades de ADN son estimadas por interpolación de las curvas patrón obtenidas a partir del ADN genómico. 2. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 2.1 Extracción y lisado de la fracción bacteriana del suelo La separación de las células microbianas de las partículas del suelo, previamente la extracción del ADN, es una alternativa que .presenta numerosas ventajas con respecto a los métodos de extracción directa del ADN en el suelo. En efecto, la extracción de la fracción microbiana limita la contaminación del extracto de ADN por el ADN extracelular presente libremente en el suelo o por el ADN de origen eucariote. Pero sobre todo, el ADN extraído de la fracción microbiana del suelo presenta fragmentos de tamaño más grande y una mejor integridad que el ADN extraído por lisado directo JACOBSON y RASMUSSEN (1992). Además, la separación de las partículas del suelo permiten evitar una contaminación del extracto de ADN por los compuestos húmicos y fenólicos, ^H compuestos que puedan, por lo tanto, perjudicar gravemente las eficiencias de la clonación. Una de las etapas determinantes para la extracción de las células del suelo es la dispersión de la muestra del suelo con el fin de disociar las células que se adhieren a la superficie o al interior de los agregados de partículas de suelo. Tres ciclos de trituración sucesivos de un minuto cada uno, permiten obtener una mejor eficiencia de extracción de las células, así como una cantidad más grande de ADN recuperado, con respecto a un microciclo de duración de un minuto 30. La tabla 5 reporta las eficiencias de extracción obtenidas después de la centrifugación sobre el gradiente de Nycodenz, sobre la microflora total viable (enumerada por microscopía después de la coloración con anaranjado de acridina) sobre la microflora total cultivable (enumerada sobre el medio sólido tripticasa-soya al 10%), y sobre la microflora de actinomicetos cultivables sobre el medio HV agar (después de la incubación a 40°C en una solución de extracto de levadura al 6%-SDS al 0.05%, con el fin de provocar la germinación de las esporas) . Por otra parte, el ADN extraído se cuantifica ya sea después de un lisado de las células en medio líquido (sin purificación sobre el gradiente de cloruro de cesio) , o ya sea después de un lisado de las células incluidas en un bloque de agarosa (después de la digestión de agarosa por una b-agarosa) . Los resultados muestran que más del 14% de la microflora telúrica total se recupera por este método (2 por 108 células por gramo de suelo) , y que la microflora total cultivable no representa más que apenas el 2% de la población microbiana total. Por otra parte, la cantidad de ADN extraído de las células es de 330 ng por gramo de suelo seco. Estimando el contenido de ADN por célula microbiana del suelo entre 1.6 y 2.4 fg, y tomando en cuenta la cantidad de células extraídas (2 por 108 células por gramo de suelo) , se puede estimar que la casi totalidad de las células se ha lisado, y que así, el lisado no aporta una desviación importante a este método. Las electroforesis en campos por impulsos han mostrado que el ADN del suelo extraído después del gradiente de Nicodenz y de CaCl puede alcanzar un tamaño de 150 kb y que el lisado del bloque de agarosa permite extraer fragmentos superiores a 600 kb. Estos resultados confirman el interés de este método independiente del cultivo para la construcción de bancos de ADN del medio ambiente, y se presenta como una alternativa a los métodos directos de extracción de ADN. *....*****f *fi 2.2. Caracterización molecular del ADN extraído del suelo El objeto de la caracterización molecular del ADN extraído del suelo es obtener perfiles que representen las proporciones de los diferentes taxones bacterianos presentes en el extracto de ADN. Se trata igualmente de conocer las desviaciones de extracción inducidas por la separación previa de la reacción celular del suelo, en comparación con un método de extracción directo que carece de visualización directa de la diversidad microbiana presente en los suelos. En efecto, poca información se ha reunido sobre la extracción de las células sobre un gradiente de Nicodenz en función de su estructura morfológica (diámetro de las células, formas filamentosas o esporuladas) . Los métodos hasta ahora en venta están basados sobre : - hibridaciones cuantitativas que utilizan sondas oligonucleotídicas específicas a diferentes grupos bacterianos aplicados directamente al ADN extraídos del medio ambiente. Desafortunadamente este método, no es muy sensible y no permite detectarlos géneros o los grpoe ta: n?raoos presaites en escasa abundancia AMANN (1995) . - PCR cuantitativas tales como la MPN-PCR (Número Más Probable) SYKES et al. (1992) o la PCR cuantitativa por competencia DIVIACCO et al. (1993) . Los inconvenientes ********.*****,******!**.**...* ....... ,^.l,^^.....^^^^«^-t¿*'-''''«l-«^'f^>- respectivos de cada uno de estos métodos son (i) la pesadez del uso debido a la multiplicación de las diluciones y las repeticiones que vuelve la técnica inapropiada para un gran número de muestras o de pared de cebadores, y (ii) la necesidad de construir un competidor específico del ADN blanco y que no induzca desviación en la competencia. El método expuesto en la presente invención consiste de amplificar universalmente un fragmento de 700 pb en el interior de la secuencia de ADNr 16S, e hibridar este amplificado con una sonda oligonucleotídica de especificidad variable (a nivel de reino, del orden, de la atolase o del género) y de comparar la intensidad de hibridación de la muestra con respecto a una escala patrón externa. La amplificación previa a la hibridación permite cuantificar los géneros o las especies de microorganismos poco abundante. Además, la amplificación por cebadores universales permite, al momento de la hibridación, utilizar una gran serie de sondas oligonucleotídicas. Permite comparar entre los diferentes modos de lisados (extracción directa o indirecta), sobre los grupos taxonómicos bien definidos. Los resultados son reunidos en la tabla 6. Se muestran los perfiles similares entre los dos métodos de extracción (directa e indirecta) así, parece que la extracción previa de la fracción microbiana telúrica no introduce desviaciones efectivas entre los taxones aprobados. . ********** ***** *** y*-**** ****** ***at??u?i?„- ifiri|| i- tt¿^ *****-******** ** **? _?t~**¿_m*? Al La única diferencia significativa entre los dos métodos de extracción parece ser la abundancia más grande de secuencias de ADN que pertenecen a las ? proteobacterias en el extracto por el método de extracción indirecta. Además, se observa un efecto significativo de la incubación de la muestra de suelo en una solución de extracto de levadura sobre las poblaciones esporuladas del suelo (Gram+, bajo porcentaje de GS y Actinomicetos) . Esta etapa provoca la germinación de las esporas, y permite por una parte ciertamente una mejor recuperación de este tipo de células y por otra parte una eficiencia más grande de lisado sobre las células en germinación. Este método permite un análisis semicuantitativo, dirigido sobre los principales taxones definidos a partir de microorganismos cultivados y habitualmente encontrados en los suelos. Solamente las herramientas moleculares permiten estimar la importancia de los diferentes taxones, los métodos de cultivo son muy restrictivos y dependientes de la especificidad del medio utilizado. Los resultados muestran que una gran parte de la población microbiana no está representada en los grupos filogenéticos descritos, poniendo así la evidencia la existencia de numerosos grupos compuestos de microorganismos no cultivados hasta el presente, o no cultivables. >¡f Así, las sondas novedosas pueden definirse a partir de secuencias determinadas a partir del ADN extraído del suelo (filos novedosos compuestos de microorganismos no cultivados, LUDWIG et al. (1997) con el fin de obtener una 5 imagen más exacta de la composición del extracto de ADN.

Ejemplo 4: CONSTRUCCIÓN DEL COSMIDO POS 7001 Caracteristicas de POS 7001 10 Duplicativo en E. coli Integrativo en Streptomyces Seleccionable en E. coli AmpR, HygroR y Streptomyces HygroR Las propiedades del cósmido permiten insertar 15 grandes fragmentos de ADN entre 30 y 40 kb. Comprende 1- El promotor inducible tipA de Streptomyces lividans 2- El sistema de integración específicco del 20 elemento pSAM2 3- El gen de resistencia a la higromicina 4- El cósmido pWEDl, derivado de pWED15 -***-*--** .* *l*í**¡* **u**?******Jt*¡]t?t?uut** i 1)- El promotor inducible del gen tip A de S. livxdans El gen tipA codifica una proteína de 19 kb cuya transcripción es inducida por el antibiótico triostrepton o nosiheptido. El promotor de tipA está bien regulado: inducción en fase exponencial y en fase estacionaria (200X) Murakami T. Holt TG, Thompson Cj . J. Bacteriol 1989; 171: 1459-66. 2)- El gen de resistencia a la higromicina Higromicina: antibiótico producido por S. hygroscopi cus El gen de resistencia codifica una fosfotransferasa (hph) - El gen utilizado proviene de un cásete construido por Blondelet et al y en el cual el gen hyg está bajo el control de su propio promotor y del promotor par IPTG Blondelet-Rouault et al; Gene 1997; 190:315-7. 3) El sistema de integración especifico del sitio El elemento pSAM2 se integra en el cromosoma por un mecanismo de integración específico del sitio. La recombinación tiene lugar entre dos secuencias idénticas de 58 pb presentes en el plásmido (a ttP) y sobre el cromosoma (attB) . El gen int, situado en la proximidad del sitio a ttP, está situado en la integración específica del sitio de pSAM2, y su producto presenta similitudes con las integrasas de los bacteriófagos templados de heterobacterias. Se ha demostrado que un fragmento de pSAM2 no contiene más que el sitio de unión a ttP, así como el gen int que es capaz de integrarse de la misma manera que el elemento entero. Ver la patente francesa n° 88 06638 del 18/05/1988, así como Raynal A et al. Mol Microbiol 1998 28:333-42). 4) Construcción del cósmido pOS7001 Etapa I/El promotor TipA se aisla del plásmido pPM927 sobre un fragmento (Smokvma et al. Gene 1990- 94:53- 9) de un fragmento HindIII-BamHI de 700 pares de bases y se clona el vector pUCld (Yannish-Perron et al., 1985) digerido por HindIII/BamHI. Etapa 2/Ese fragmentt HindIII-BamHI se transfiere posteriormente del pUCld al pUC19 (Yannish-Perron et al., 1985) . Etapa 3/Un inserto BamHI-BamHI de 1500 pares de bases que porta el gen int y el sitio attp de pSAM2 se aisla del plásmido pOSintl, representado en la Figura 8, (Raynal A **?*.l*^*^ á*A* *~**..* .i*e* ?i É lí. et al. Mol Microbiol 1998 28:333-42) y su clon en el sitio BamHl del vector anterior (pUCl9/TipA) , en la orientación permite poner el gen int bajo el control del promotor TipA. Etapa 4/E1 sitio BamHl situado en 5' del gen int se suprime por digestión parcial con BamHl, después del tratamiento por la enzima Klenow. Un fragmento HindIII-BamHI que porta a TipA-int-att.P se aisla así de pUC19 y se transforma en pBR322 HindIII/BamHI . Etapa 5/EL cásete de Higromicina aislado de pHP45Ohyg (Blondelet-Rouault et al., 1997) sobre el fragmento HindIII.HindIII se clona en el sitio HindIII situado en corriente arriba del promotor TipA. Etapa 6/EL sitio HindIII situado entre el cásete OHyg y el promotor TipA se suprime por tratamiento Klenow después de la digestión parcial con HindIII. Etapa 7/E1 plásmido obtenido que procede de la etapa anterior permite aislar un fragmento único HinglII-BamHI, que porta todos los elementos OHyg/TipA/int attP, que se clona después del tratamiento con Klenow en el sitio EcoRV del cósmido pWEDl . El cósmido pWEDl, representado en la Figura 9, deriva del cósmido pWE15, representado en la Figura 10 (Wahl GNM, et al. Proc Natl Acad Sci USA 1987 84:2160-4) por supresión de un fragmento Hpal-Hpal que porta el gen de Neomicma y el origen SV40.

Una gráfica del vector pOS 7001 se representa en la Figura 11 Ejemplo 5: Construcción de varios cósmidos conjugativos e integrativos en Streptoxayces los vectores pOSV 303, pOSV306 y pOSV307 5.1. Construcción del vector pOSV303. Dado que el empaquetado selecciona las clonas que tengan un tamaño superior a 30 kb, solamente del 10 al 15% de los clones no contienen inserto, por lo tanto, no es ciertamente necesario tener un sistema de selección de los recombinantes, lo que permite construir un vector más pequeño .

Construcción : Etapa 1 : el vector pOSVOOl Clonación de un fragmento de Pstl-Pstl de 800 pares de bases que porta el origen de la transferencia OriT del replicón RK2 (Guiney et al., 1983) en el plásmido pUC19 abierto por Pstl. Esta etapa de clonación permite obtener un vector transferible de E. col i a Streptomyces por conjugación. La gráfica del vector pOVS 001 se representa en la Figura 17.

Etapa 2: el vector pOSV002 Inserción del marcador de higromicina (cásete Ohyg) , y seleccionable en Streptomyces, de manera que el género que contiene la resistencia a la higromicina sea transferido al último lo que permite asegurar la transferencia completa del BAC con el inserto de ADN de suelo. Clonación del cásete de Higromicina aislado de pHP45Ohyg sobre un fragmento HindIII-HindIII que porta el gen de resistencia a la Higromicina. Este fragmento se clona en el sitio Pstl (posición 201) del vector pOSVOOl. Este sitio Pstl se elige, tomando en cuenta el sentido de la transferencia, para que el marcador Hygro sea el último transferido al momento de la conjugación. Los extremos Pstl y HindIII se vuelven compatibles después del tratamiento con el fragmento Klenow del ADN polimerasa que permite generar a las "puntas libres". La orientación del fragmento Ohyg se determina al final de la construcción. La gráfica del vector pOSV2002 se representa en la Figura 18.

Etapa 3: el vector pOSVOlO El fragmento Xbal-HindIII aislado del plásmido pOSV2002 y que contiene el marcador de resistencia a la higromicina y el origen de tr^psferencia, se clona en el plásmido pOSint 1 digerido por Xbal y HindIII. La orientación de los sitios es tal que el marcador de higromicina será siempre transferido al final. El plásmido pOSintl, representado en la Figura 8, se describe en el artículo de Raynal et al. (Raynal A et al. Mol Microbiol 1998 28:333-42). Esta construcción permite la expresión de la integrasa en E. coli y en Streptomyces .

Etapa 4: inserción del sitio "eos" El principio es insertar un sitio "eos" en el plásmido pOSVOlO, que permite el empaquetado en el plásmido pOSVOlO, representado en la Figura 12. La obtención del fragmento "eos" se representa en la Figura 13. Este fragmento se obtiene por PCR. A partir de un fragmento que porta los fragmentos cohesivos (eos), de ? (bacteriófago lambda o cósmido pHC79) , se realiza una amplificación por PCR con ayuda de los oligonucleótidos que correspondan a las secuencias -50/+130 con respecto al punto eos. Estos oligonucleótidos contienen además de los sitios de clonación Nsil, compatible Pstl, Xhol, compatible Salí, EcoRV, "punta libre".

La adición de sitios raros permite aislar Swal y Pací y/o cartografiar el inserto clonado. El fragmento PCR está limitado por un sitio Pstl en el extremo 5' y por un sitio HindII en el extremo 3' , lo que permite la clonación en el vector pOSVOlO (Figura 12) previamente digerido por las enzimas Nsil y EcoRV, lo que provoca la supresión del represor laclq. La gráfica del vector pOSV303 se representa en la Figura 14. El vector pOSV303, que contiene los sitios de clonación tales como el sitio Nsil, compatible Pstl, el sitio Xho, compatible Salí o incluso el sitio EcoRV para la obtención de "puntas libres". 5.2 Construcción del vector pOSV306 Etapa 1 : Construcción del vector pOSV308. El vector pOSV308 se construye de acuerdo con el procedimiento ilustrado en la Figura 27. Un fragmento de 643 pb que contiene la región eos se amplifica con la ayuda de un par de cebadores de las secuencias SEQ ID NO: 107 y SEQ ID NO: 108 a partir del vector cósmido pHc79 descrito por HOHM B y COLLINS (1980) . Este fragmento nucleotídico amplificado se clona directamente en el vector pGEMT, comercializado por la Sociedad PROMEGA, como se ilustra en la figura 27, con el fin de producir el vector pOSV308.

Etapa 2 : Construcción del vector pOSV306. El vector pOSVOlO se construye como se describe en la etapa 3 de construcción del vector pOSV303, como se describe en el párrafo 5.1 del presente ejemplo. El vector pOSVIO se digiere por las enzimas EcoRV y Nsil con el fin de escindir un fragmento de 7874 pb que se purifica posteriormente, como se ilustra en la figura 28. Después, el vector pOSV308 obtenido en la etapa 1) anterior, se somete a una digestión por las enzimas EcORV y Pstl con el fin de escindir un fragmento de 617 pb, que se purifica posteriormente. Después del fragmento eos de 617 pb obtenido a partir del vector pOSV308, se integra por ligación en el vector pOSVIO, con el fin de obtener el vector pOSV306 como se ilustra en la figura 28. 5.3 Construcción del vector pOSV307. El cósmido pOSV307 que contiene siempre el gen Laclq, con el fin de mejorar la estabilidad del cósmido en Streptomyces, por ejemplo en la cepa S17-1 de Streptomyces . Con el fin de contener el vector pOSV307 se somete el vector pOSVOHO a una digestión por enzima, para obtener un fragmento de 8761 pb que se purifica, después se desfosforilacidn.

A continuación, el vector pOSV308, tal como el obtenido como se describe en la etapa 1) del párrafo 5.2 anterior, se digiere por la enzima EcoRI con el fin de obtener un fragmento de 663 pb, que a continuación se purifica y trata por la enzima de Klenow. El fragmento nucleotídico así tratado se integra en el vector pOSVOlO después de la ligación con el fin de obtener el vector pOSV307, como se ilustra en la figura 29.

Ejemplo 6: Construcción del cósmido duplicativo satélite E. coli- Streptomyces pOS700R Los fragmentos del plásmido pE16 (Volff et al., 1996) representado en la Figura 15, se aislan y tratan por Klenow. Estos fragmentos contienen las secuencias necesarias para la duplicación y la estabilidad que proviene del plásmido SCP2. Estos dos fragmentos son insertados de manera separada en el sitio EcoRV del cósmido pWEDl que conduce a dos clones diferentes. El cásete de higromicma aislado de pHP45Ohyg sobre un fragmento HindIII-HindIII se clona en el sitio HindII de los cósmidos pWEDl que contiene el inserto ScP2 bajo la forma de fragmentos Pstl-EcoRi o Xbal. Confiere una resistencia a i^^a ?^?SáiU??^*»^^****^^*^*^^ '*' la higromicina seleccionable a la vez en E. coli y en Streptomyces. Transformación de S . lividans y determinación de la eficiencia de la transformación. Parece que el cósmido que contiene el inserto Xbal es menos estable que aquel que contiene el fragmento Pstl EcoRl. Es por esto que este último ha sido retenido bajo el nombre de pOS700R. La gráfica del vector pOS 700R se representa en la 0 Figura 16.

Ejemplo 7: Eficiencia de transformación de los vectores integrativos (pOS7001) y duplicativos Posibilidades 5 Hacer a la cepa de S. lividans resistente al tiostrepton por la integración del cósmido pTOl que porta el marcador de resistencia al tioestrepton. Preparación de protoplastos a partir de S . lividans cultivado en presencia de tioestrepton. 0 Con el vector pOS7001, la eficiencia de transformación es de aproximadamente 3000 transformantes por µg de ADN. El vector pOS700R, la eficiencia de transformación es de aproximadamente 30 000 por µg de ADN.

*Jsat^ ¡ ^t^^m?m* i??¡ M Ejemplo 8: Construcción de un vector BAC integrativo en Streptomyces y conjugativo Características Duplicativo en E. coli Transferible por conjugación de E. coli a Streptomyces Integrativo en Strepto/nyces Seleccionable en E. coli y Streptomyces Capaz de insertar grandes fragmentos de ADN; debe señalarse que es necesario disponer ADN del suelo cuyo tamaño es comprendido entre 100 y 300 kb y no contaminado por pequeños fragmentos. En efecto, los pequeños fragmentos son integrados de manera muy preferida. Dotar de un tamiz que permita seleccionar los plásmidos que porten un inserto. Este tamiz permite eliminar los vectores cerrados sobre ellos mismos y no digeridos para trabajar con una relación más elevada entre el vector y el ADN a insertarse, lo que permite tener una mejor eficiencia de clonación para constituir los bancos .

**?*^?.M?..*¡i t*lt¡á* . ¡**k l ******** Construcción : Etapa 1: el vector pOSVOOl Clonación de un fragmento PStl-Pstl de 800 pares de bases que portan el origen de transferencia OriT del replicón RK2 (Guiney et al., 1983) en el plásmido pUC19 abierto por Pstl. Esta etapa de clonación permite obtener un vector transferible de E. coli a Streptomyces por conjugación. La gráfica del vector pOSV 001 se representa en la Figura 17.

Etapa 2 : el vector pOSV002 Inserción del marcador de Higromicina (cásete Ohyg) , y seleccionable en Streptomyces, de manera que el gen que confiera resistencia a la higromicina sea transferido al último lo que permite asegurar la transferencia completa del BAC con el inserto de ADN del suelo. Clonación del cásete de higromicina aislado de pHP45Ohyg sobre un fragmento HindIII-HindIII que porta el gen de resistencia a la higromicina. Este fragmento se clona en el sitio Pstl (Posición 201) del vector pOSVOOl. Este sitio Pstl se elige, tomando en cuenta el sentido de la transferencia, para que el marcador Higro sea el último transferido al momento de la conjugación. Los extremos Pstl y 111 Ii i - jfirti iJaaA aaaa. ^^^ iiafcl n .fe HindIII se vuelven compatibles después del tratamiento con el fragmento Klenow del ADN polimerasa que permite generar a las "puntas libres". La orientación del fragmento Ohyg se determina al final de la construcción. La gráfica del vector pOSV002 se representa en la Figura 18.

Etapa 3: el vector pOSVOlO El fragmento Xbal-HindIII se aisla del plásmido pOSV002 y contiene el marcador de resistencia a la higromicina y el origen de la transferencia se clona en el plásmido pOSintl digerido porXbal y HindIII. La orientación de los sitios es tal que el marcador de hidromicina será siempre transferido al último. El plásmido pOSintl, representado en la Figura 8, se describe en el artículo de Raynal et al. (Raynal A et al.

Mol Microbiol 1998 28:333-42). Esta construcción permite expresión de la integrasa en E. coli y con Streptomyces .

Etapa 4 : el vector pOSV01 Adición de un "cásete" que permite al término, seleccionar en la construcción final los plásmidos que hayan sido insertados con el ADN extraño. n?^, A. . < **. *^í* ,.^.* ..*-. *************** i Este "cásete" porta el gen que codific&Ü para el represor Cl del fago ? y el gen que confiere resistencia a la tetraciclina. Este gen porta en su región 5' no codificante la secuencia blanco del represor. La inserción de ADN en el sitio HindIII situado en la secuencia codificante de ci conduce a la no producción de represor y por lo tanto la expresión de la resistencia a la tetraciclina. Es portado en el plásmido pUN99 descrito en el artículo: Nilsson et al. (Nucleics Acids Res 1983, 11:8019-30) Un fragmento PvuII-HindlII aislado de pOSVOlO que contiene las secuencias Int, attP, Higro y oriT se clona en el sitio MsCI de pUN99. La gráfica del vector pOSV014 se representa en la Figura 19.

Etapa 5: El vector pOSV 403, vector BAC integrativo y conjugativo Esta ultima etapa de clonación en pBACll (representada en la Figura 20) permite conferir al plásmido final las características de BAC (Cromosoma Artificial Bacteriano) , en particular la actitud para aceptar los insertos de ADN de gran tamaño. ****i*m**- .** . .***?* ****** L*k *****íA*i**** El fragmento pStl-Pstl del vector pOSV014 que portan el conjunto de los elementos y funciones descritas anteriormente se clona en el plásmido pBACll (pBeloBACll) digerido por Notl. Los extremos se vuelven compatibles por tratamiento con la enzima de Klenow. La gráfica del vector pOSV403 se representa sobre la Figura 21. El esquema de la Figura 21 indica la orientación retenida.

Etapa 6: El vector pOSV403 que contiene los sitios HindIII y Nsil. El sitio Nsil es bastante raro en Streptomyces y presenta la ventaja de ser compatible con Pstl. Por el contrario, el sitio Pstl es frecuente en Streptomyces y puede utilizarse para efectuar las digestiones parciales. Los clones recombinantes que portan un inserto clonado en el represor Cl, y por lo tanto inactivando este represor los hace resistentes a la tetraciclina. Puesto que los BAC no están presentes más que a razón de una copia por célula, se debe seleccionar los clones recombinantes con una dosis más baja de tetraciclma que la dosis habitual de 20 µg/ml, por ejemplo con una dosis de 5 µg/ml. En estas condiciones, no hay ningún ruido de fondo.

También es posible utilizar un sistema desarrollado y comercializado por la sociedad InVitrogen, en el cual la inserción del ADN en el vector inactiva un inhibidor de la gírasa cuya expresión es tóxica para E. coli . El fragmento se aisla de preferencia a partir del vector pZErO-2 (http: //www. invitrogen .ccrn).

Ejemplo 9: Construcción de un banco de S. alboniger en los dos cósmidos integrativos (pOS7001) y duplicativo (pOS700R) 1)- Construcción del Banco Para evaluar la eficiencia del sistema de clonación, la vía de biosíntesis de la puromicina de Streptomyces albonrger, se clona en los dos cósmidos satélites pOS7001 y pOS700R. Los genes de la vía de biosíntesis de la püromicina son portados por un fragmento de ADN BamHl de aproximadamente 15 kb. El ADN genómico de Steptomyces alboniger se aisla. 90% de este ADN posee un peso molecular comprendido entre 20 y 150 kb, determinado por electroforesis con campos de impulsos . Los dos cósmidos son digeridos por la enzima BamHl (sitio único de clonación) .

Las condiciones de digestión parcial BamHl del ADN genómico se determina (50 µg de ADN y 12 unidades de enzima, 5 minutos de digestión) . Después de la verificación del tamaño por electroforesis en gel de agarosa, el ADN parcialmente digerido se introduce en los vectores. En la ligación, 15 µg de ADN genómico + 2 µg del vector integrativo o 5 µg del vector duplicativo se utilizan. Cada mezcla de ligación se utiliza para la encapsidación in vi tro de ADN en las cabezas del bacteriófago lambda. Las mezclas de encapsidación (0.5 ml) se titulan (Vector mtegrativo pOS7001 = 7.5 x 105 cósmidos/ml, Vector duplicativo = 5 x 104 cósmidos/ml) . Los cósmidos se utilizan para transfectar E. coli y generar así dos bancos de aproximadamente 25000 resistentes a la ampicilina. El ADN del conjunto de estos clones se aisla y cuantifica. Para probar los bancos, se eligen varios clones, el ADN es purificado y digerido por BamHl, con el fin de verificar la presencia y el tamaño de los insertos. Los clones probados contienen entre 20 y 35 kb del inserto de S . alboniger. 2) - Identificación de los clones que contienen la vía de biosíntesis de la puromicina Los clones susceptibles de contener la vía completa de biosíntesis de la puromicina se identifican por hibridación con una sonda que corresponde al gen de resistencia ala puromicina, el gen pac de 1.1 kb (Lacalle et al. Gene 1989; 70, 375-80) Banco hecho en el vector integrativo pOS 7001 : Entre 2000 clones analizados, 9 clones se hibridan con la sonda y ellos contiene los insertados de aproximadamente 40 kb.

Banco hecho en el vector duplicativo pOS 700R: Entre 2000 'clones analizados, 12 clones se hibridan con la sonda, contienen los insertos de aproximadamente 40 kb. Utilizando los datos publicados por Tercero et al. (J. Bíol. Chem. 1996; 271 1579-90), los clones que contiene la totalidad de vía de biosíntesis se identifican, después de la hibridación con las sondas apropiadas. Ciertos cósmidos integrativos y duplicativos presentan después de la digestión con Clal-EcoRV un fragmento de 12360 pares de bases, lo que . **. ^Ajifa^^**^^^ hace suponer un inserto que contiene la totalidad de la vía de biosíntesis de la puromicina. 4)- Verificación de la producción de puromicina por los clones resistentes (Rhóne-Poulenc) . a) Materiales y Métodos Cepas y condiciones de cultivo: Tres clones resistentes se seleccionan para verificar la producción de puromicina. Corresponden a los recombinantes de S. lividans que contienen un inserto en el vector integrativo pOS700I (G 20) o un inserto en el vector duplícativo (G21 y G22) . Las cepas de referencia se utilizan para asegurar que los medios de cultivo utilizados permiten esta - producción. Se trata de la cepa silvestre S . alboniger ATCC 12461, productora de puromicina y la cepa recombinante de S. lividans que contiene el grupo completo de la puromicina clonada en el plásmido pRCPll (Lacalle et al, 1992, the EMBO journal, 11, 785-792) (G23). Las cepas son sembradas en un medio de cultivo cuya composición es la siguiente: Peptona bacteriológica Organotechnie 5 g/1 de medio final ?.xtracto de levadura Springer 5 iia i Extracto de carne Liebig 5 Glucosa Prolabo 15 CaC03 (1) Prolabo 3 NaCl Prolabo 5 Agar (2) Difco 1 (1) Los 3g de carbonato son mezclados con 200 ml de agua destilada y después se esteriliza aparte. La adición se hace después de la esterilización. (2) El agar es fundido previamente en 100 ml de agua destilada antes de agregarse a los otros ingredientes del medio. pH ajustado a 7.2 antes de la esterilización Esterilización 25 minutos a 121°C 50 µg/1 de .higromicina y 5 µg/1 de tioestreptón son agregados al medio después de la esterilización, de manera que se mantiene una presión de selección de los clones que contiene un inserto gracias al gen marcador presente sobre el vector (el gen de resistencia al tioestreptón es portado por el plásmido pRCPll) . 50 ml de medio de cultivo líquido, repartidos en matraces erlenmeyer de 250 ml, son sembrados con 2 ml de suspensión acuosa de esporas y de micelio de cada una de las cepas. Los cultivos son incubados durante 4 días a 28°C con una agitación de 220 revoluciones/minuto. 50 ml de medio de producción, repartidos en matraces erlenmeyer de 250 ml, son a continuación sembrados con 2 ml de estos precultivos. El medio de producción utilizado es un medio de industrial optimizado para la producción de pristinamicina (medio RPR 201). Los cultivos son incubados a 28 °C, con una agitación de 220 revoluciones/minuto. Después de diferentes tiempos de incubación, un matraz erlenmeyer de cada cultivo es llevado a pH 11, después se extrae por 2 veces con 1 volumen de diclorometano. La fase orgánica se concentra en seco bajo presión reducida, después el extracto se toma por 10 µl de metanol. 100 µl de la solución metanólica son analizados por CLAP provista con un detector con pasador de diodos en un sistema de gradiente agua-acetonitrilo 0.05% de TFA Volumen/Volumen sobre una columna C18 para la detección de la puromicina. b) Resultados Los análisis CLAP comparativos a partir de los cultivos de diferentes cepas muestran la producción de puromicina en el cultivo de la cepa silvestre a partir de 24 horas de incubación. Una producción, si bien un poco baja, es también detectada netamente a partir de 48 horas en el cultivo del clon G20 que contiene el cósmido pOS700I (figura 23) . La ouromicina se detecta iaualmente en estado de traza en el clon G23 que cont?ene el operón completo que codifica para el compuesto en el plásmido pRCPll. Sin embargo, ninguna producción se observa en los cultivos de los clones G21 y G22 que contienen el cósmido pOS700R. Los resultados son reportados en la Figura 23. c) Conclusiones Los resultados obtenidos permiten demostrar la eficiencia del sistema de clonación desarrollado en el cósmido pOS700I para expresar en un huésped heterólogo, tal como el S. lividans, una vía de biosíntesis completa bajo el control de las secuencias reguladoras que le son propias. Por otra parte, estos datos validan igualmente el tamizado de los bancos obtenidos sobre la base de la resistencia de los clones a la puromicina, lo que ha conducido a identificar entre un número pequeño de clones, un recombinante capaz de expresar la vía de biosíntesis asociada al gen de resistencia. La ausencia de producción de puromicina en los otros clones puede probablemente explicarse por la clonación de una parte solamente del operón que contiene el gen de resistencia, pero desprovisto de ciertas secuencias de regulación, transducción o transcripción necesarias para la síntesis del compuesto. . -*****.****• .'***1*'* *- EJEMPLO 10: CLONACIÓN DEL ADN DEL SUELO EN LOS VECTORES 1) Preparación del ADN del suelo a clonarse Los diferentes fragmentos de ADN deben purificarse de acuerdo a su destino: Cósmidos El tamaño de las células debe estar comprendido entre 30 y 40kb. Ahora bien, el ADN extraído del suelo es heterogéneo en tamaño y comprende moléculas que alcanzan 200 ó 300 kb. Con el fin de homogenizar los tamaños, el ADN es roto mecánicamente por el paso de la solución a través de una aguja de 0.4 mm de diámetro. Los fragmentos de un tamaño cercano a 30 kb no son afectados por estos pasos repetidos a través de una aguja, y por lo tanto no es necesario hacer una separación por tamaño, sobre todo porque el empaquetado en las partículas elimina automáticamente los insertos cortos.

BAC Preparación del ADN El ADN del suelo es preparado por electroforesis por campos impulsados (tipo CHEF) , en condiciones tales que los fragmentos comprendidos entre 100 y 300 kb son concentrados en una banda de aproximadamente 5 mm. Esto se obtiene realizando la migración en un gel de agarosa normal Í **.A.?*** **?á*U *t******A***. u ***, *.* ******, t*,Li* af*» al 0.7% o de agarosa de bajo punto de fusión al 1% con un tiempo de pulsación de 100 segundos durante 20 horas y a una temperatura de 10°C.

Recuperación del ADN Se utilizan dos métodos, su elección depende del tamaño de las moléculas que se van a aislar, ya sea a 150 kb o ya sea por encima de esto.

Hasta 150 kb La porosidad de un gel de agarosa al 0.7% permite la salida del ADN por electroelución en una condición de ausencia total de bromuro de etidio. Este ADN es manipulado a continuación con instrumentos de pipeteado con un orificio ensanchado e hidrófabo para evitar la fragmentación mecánica de las moléculas.

Entre 100 y 300 kb La banda que contiene los fragmentos de un tamaño entre 100 y 300 kb es cortada. Para la migración, se utiliza un gel de agarosa al 1% y de bajo punto de fusión. Esta propiedad permite fundir el gel a una temperatura soportable para el ADN de 65°C, y de digerirlo a continuación por agarosa (Agarosa comercializada por la sociedad Boehringer) a una temperatura de 45°C siguiendo las prescripciones del fabricante. 2) Utilización de los cósmidos integrativos pOS700I y duplicativos pOS700R Construcción por colas poliA, poliT Principio Un vector cósmido, abierto en un sitio de clonación cualquiera, se modifica en los extremos 3' agregando un polmucleótido monótono. Por otra parte, el ADN a clonarse se modifica en los extremos 3' agregando un polinucleótido monótono que puede parecerse al anterior. La asociación vector-fragmento a clonarse se hace por estos polmucleótidos, y la secuencia eos del vector permite el empaqueta'do in vi tro del ADN en los cápsidos del fago lambda.

Preparación del vector El vector utilizado es un vector autoduplicativo en E . coli e integrativo en Streptomyces . Para E . col i , la selección se hace sobre la resistencia a la ampicilina y para Streptomyces, se hace sobre la resistencia a la higromicina. „¿ g!j¡g| El cósmido está abierto en uno de 2 sitios posibles (BamHl o HindIII) y los extremos 3' son alargados por poliA con terminal transferasa en condiciones donde la proporción de la enzima suministre la adición de 50 a 100 nucleótidos.

Preparación del ADN a insertarse Los extremos 3' del ADN son arreglados por poliT con la terminal transferasa en las condiciones que proporcionen un alargamiento comparable a aquel del vector. En las condiciones experimentales descritas por el fabricante, las colas poliA, poliT son de 30 a 70 bases de largo.

Empalme de las moléculas y encapsidación in vitro. Para el empalme de las moléculas, se mezcla una molécula del vector por una molécula de ADN insertado. La concentración del ADN en masa es de 500 µg.ml"1. La mezcla es encapsidada, y la eficiencia de la transfección depende de la cepa utilizada como receptora y del ADN insertado: nula con ADN probado y la cepa DH5a, la eficiencia es comparable para las cepas SURE y DH10B; con la extracción, el rendimiento del ADN es sin embargo, más elevado con la cepa DH10B.

Construcción por desfosforilación El ADN del suelo se pone en puntas libres por la eliminación de la secuencia 3' salientes, y reemplazando las secuencias 5' salientes. Esta operación se hace con: enzima de Klenow, polimerasa T4, los 4 nucleótidos trifosfatos. El vector cosmídico se digiere por BamHl, después se trata por la enzima de Klenow para formar la punta libre, después se desfosforila para evitar que se vuelva a cerrar sobre sí mismo. Después de la ligación, la mezcla se encapsida y se transfecta como se describe anteriormente. 3) Utilización de los pBAC Principio. El plásmido pBAC conjugativo e integrativo posee los sitios HindIII y. Nsil como los sitios de clonación. La inserción de una secuencia de ADN en estos sitios inactiva el represor Cl del fago lambda que controla la expresión del gen de la resistencia a la tetraciclina. La inactivación del represor vuelve por lo tanto a la molécula resistencia este antibiótico (5 µg.ml"1) . La clonación en estos sitios se facilita por la modificación del vector y la preparación del ADN a clonarse.

,!.•!' Para que el vector no se cierre sobre el mismo, el sitio Hind III se modifica: la primera base (A) se coloca en su lugar para formar una secuencia 5' saliente, que no se puede aparear con sus semejantes. La operación se efectúa por la enzima de Klenow en presencia de dATP. El éxito de la operación se verifica efectuando una ligación del vector sobre el mismo antes y después del tratamiento con la enzima de Klenow. A una cantidad de ADN probada idéntica, se obtienen 3000 clones antes del tratamiento y 60 después del tratamiento.

Preparación del ADN (tamaño comprendido entre 100 y 300kb) . Formación de las puntas libres del ADN. El ADN se pone o forma en puntas libres por la eliminación de las secuencias 3' salientes y reemplazando las secuencias 5' salientes. Esta operación se hace con: enzima de Klenow, polimerasa T4, los 4 nucleótidos trifosfatos.

Preparación de los extremos . Ejemplo HindIII La adición del ADN sobre el vector se hace por medio de los oligonucleótidos que reconocen la secuencia HindIII modificada del vector. Contienen los sitios de ,, .*J^*^^**.^*J^?*.s^í*d^? *.****^J?té? ilAi restricción raros para permitir las clonaciones posteriores (Swal; Notl) . Esta técnica se deriva de aquella de: Elledge SJ, Mulligan JT, Ramer SW, Spottswood M, Davis RW. Proc Natl Acad Sci USA 1991 Mar 1; 88 (5) : 1731-5. Se utilizan dos oligonucleótidos complementarios: Oligo 1: 5' -GCTTATTTAAATATTAATGCGGCCGCCCGGG-3' (SEQ ID NO 25) Oligo 2: 5' -CCCGGGCGGCCGCATTAATATTTAAATA-3' (SEQ ID NO 26) Son fosforilados en 5' por la polinucleótido cinasa de T4 en presencia de ATP, después de su hibridación. Esta etapa de fosforilación puede eliminarse utilizando los oligonucleótidos ya fosforilados. La ligación de este adaptador de doble hebra con ADN a insertarse en un vector se hace por la ligasa de T4 en presencia de un exceso muy grande de adaptador (1000 moléculas de adaptador por una molécula de ADN a insertarse) , en 15 horas a 14°C. El exceso de adaptador se elimina por electroforesis sobre un gel de agarosa y las moléculas de interés son recuperadas del gel por hidrólisis de este por agarosa o por electroelución.

Ligación vector-ADN. La ligación -se hace a 14°C en 15 horas con 10 moléculas de vector por una molécula de inserto. : . ***.*. Í?* U**L ** ? *M~*L*?.>. ,rij«d ??.

Transformación $ li tt La cepa receptora es la cepa DHIOB. La transformación se hace por electroporación. Para expresar la resistencia a la tetraciclina, los transformantes son incubados a 37 °C durante 1 hora en medio sin antibiótico. La selección de los clones se hace por cultivo durante una noche, sobre medio congelado LB adicionado con tetraciclina a 5 µg.ml"1.

Ejemplo 11: CONJUGACIÓN CLON A CLON ENTRE E. COL! Y STFEPTOMYCES CONJUGACIÓN ENTRE E COLI CEPA S17.1 QUE CONTIENE PPM803 Y STREPTOMYCES LIVIDANS TK 21 Introducción Es posible efectuar las conjugaciones entre E. coli y Streptomyces (Mazodier et al, 1989) . La adaptación de este método desarrolla una técnica llamada en gota, en donde se mezclan 10 µl de un cultivo de E. coli que contiene un vector recombínate con una gota de S . lividans receptora que consiste en realizar una transformación clon a clon, asegurando que al final de la operación todo el banco construido en E. coli se introduce en S . lividans . Una transformación a granel proporcionaría de manera obligatoria una multiplicación de los clones ae Streptomyces transformantes, con el fin de esta prácticamente de que el banco en E. coli está representado completamente en S. lividans . Además, este método es fácilmente automatizable .

Ensayos preliminares Conjugación entre E. coli cepa S17.1 que contiene el vector pOSV303 y S . li vidans TK21. En estas condiciones, se mezclan 6 x 106 células de E . coli con 2 x 106 esporas pregerminadas de S. lividans en un volumen final de 20 µl .

Aplicación del método Se conoce que el AND extraído de ciertos actinomicetos está modificado, y por este hecho no puede introducirse en ciertas cepas de E . coli sin que sea restringido. La cepa de E . coli DH10B que acepta estos ADN no es capaz de transferir a Streptomyces un plásmido que no contenga más que oriT, y por lo tanto es necesario construir uno. Deberá introducirse por integración en el cromosoma un derivado de RP4 capaz de proporcionar en trans todas las funciones necesarias para asegurar la transferencia de los clones recombinantes que contienen el origen de transferencia opT. *..*j^?*í.^*^tj^M *t*Ála?*^^^^^^^^?^ ^í^?a^á Ejemplo 12: Construcción de un banco cosmidico en E. coli y Streptomyces lividans : Clonación del ADN del suelo El objetivo es la construcción de una biblioteca de ADN de gran tamaño que provenga del medio ambiente, sin una etapa previa del cultivo de los microorganismos, con el objeto de tener acceso a los genes metabólicos de las bacterias (o de cualquier otro organismo) , que no sepamos cultivar en condiciones estándar de laboratorio. El procedimiento descrito se utiliza para generar un banco de ADN en Escherichia coli utilizando el cósmido satélite E. coli -S. lividans pOS700I y del ADN extraído y purificado de la fracción bacteriana e un suelo. Este último método permite obtener un ADN de gran pureza y de un tamaño promedio de 40 kb. Así, con el fin de evitar la clonación una digestión parcial del ADN extraído, se adopta una estrategia alternativa basada sobre el uso de la enzima terminal transferasa que permite agregar colas de polinucleótidos a los extremos 3' del ADN y del vector. 5 µg del ADN se extraen de 60 mg de suelo de la "Costa de San Andrés" de acuerdo con el protocolo descrito en el ejemplo 3, y se tratan con la terminal transferasa (Pharmacia) para alargar los extremos 3' con un polinucleótido monótono (poli T) (Ejemplo 10) . .^^1^ ,^^^.,.,.^,., I|ifc .^.rf,.- ' - i*****: . t********i..**a*á****c*.*.*,****i...

El cósmido integrativo pOS700I es preparado de acuerdo con el protocolo Bl, Orsay. Después de una etapa clásica de purificación en presencia de fenol/cloroformo, el ADN y el vector son empalmados mezclando una molécula de vector y una molécula de ADN insertado. La mezcla es encapsidada a continuación en las cabezas del bacteriófago lambda (equipo Amersham) que sirve para transfectar E. coli DHIOB. Las células transfectadas son a continuación sembradas sobre el medio LB agar en presencia de ampicilina para la selección de los recombinantes resistentes a este antibiótico. Un banco de aproximadamente 5000 clones de E. coli resistentes a la ampicilina se obtiene. Cada clon es sembrado en medio LB o TB + ampicilina en un pozo de microplacas (96 pozos) y se conserva. a -80°C. La secuencia en los sitios de inserción de los fragmentos del suelo en el vector pOS700I, generados durante la construcción del banco se analiza. Para esto, 17 cósmidos de los bancos se purifican y secuencian con un cebador, seq. 5' CCGCGAATTCTCATGTTTGACCG 3', que se híbrida entre el sitio BamHl y el sitio de clonación HindIII presente en el vector. Las secuencias obtenidas permiten estimar que la longitud de las colas homopoliméricas en los puntos de unión es muy variable, entre 13 y 60 poli-dA/dT. Más allá de elastómeros colas, las secuencias de los fragmentos de suelo así áÁ?.? í*i*?**?*t.*í í .. *,*.**??*M* **.* „áá*,*,,?, . ***,*.. .*****.*.** * .¡t***** ******* ^^ *. generados poseen un porcentaje en G+C entre 53 y 70%. Los porcentajes tan elevados son inesperados, pero resultados similares se han reportado ya en la preparación bruta del ADN a partir del suelo (Chatzinotas A. et al., 1998). Una estrategia de "reunión" de 48 a 96 clonas se utiliza para el análisis de la riqueza microbiana y metabólica. El ADN cosmídico extraído a partir de estos "conjuntos" de clones se utiliza a continuación para realizar los experimentos de PCR o de hibridación.

Ejemplo 13: Diversidad del ADN ribosomico 16S en el seno del ADN clonado . a) materiales y métodos Los cósmidos del banco son extraídos a partir de conjuntos de clones por lisado alcalino, después son purificados sobre un gradiente de cloruro de cesio, con el fin de tomar la banda de ADN cosmídico bajo la forma superenrollada y con el objeto de eliminar cualquier ADN cromosómico de Eschep chia coli que pueda interferir en el estudio. Después de la linearización de los cosmidos por la acción de la nucleasa SI (50 unidades, 30 minutos a 37°C), las secuencias de ADN 16S contenidas en los conjuntos de clones son amplificadas en las condiciones estándar de *** * . ********** , ***¿? i* **.? : amplificación, a partir de cebadores universales 63f (5'- CAGGCCTAACACATGCAAGTC-3' ) y 1387r (5' -GGGCGGWGTGTACAAGGC-3' ) definidos por MARCHESI et al. (1998) . Los productos de amplificación de aproximadamente 1.5 kilobases son purificados a partir del equipo de extracción en gel (Qiagen) , después se clonan directamente en el vector pCR II (Invitrogen) en Escherichia coli TOP10, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El inserto es entonces amplificado con la ayuda de cebadores M13 hacia adelante y M13 inverso específicos al sitio de clonación del vector pCR II. Los productos de amplificación del tamaño esperado (aproximadamente 1.7 kb) son analizados por RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) con la ayuda de las enzimas Cfol, Mspl y BstUI (0.1 unidades), con el fin de seleccionar los clones a secuenciarse. Los perfiles de restricción obtenidos son separados sobre gel de agarosa Metofor al 2.5% (FMC products), que contiene 0.4 mg de bromuro de etidio por ml. Las secuencias de ADNr 16S son determinadas entonces directamente utilizando los productos de la PCR purificados por el equipo "Qiaquick extracción en gel" con la ayuda de los cebadores de secuenciamiento por Normand (1995). Los análisis efilogenéticos son obtenidos comparando las secuencias con las secuencias de ADNr 16S procariotes reunidos en la base de datos Ribosomal Datábase Project (RDP), versión 7.0 MAIDAK et al. (1999) gracias al programa SIMILITARY MATCH, que permite obtener los valores de similitud con respecto a las secuencias de la base de datos. b) Resultados Para determinar la diversidad filogenética representada en el banco, 47 secuencias de gen ARNrldS se aislan a partir de conjuntos de 288 clones y se secuencian en su casi totalidad. Los resultados son reportados en la tabla 7. El análisis de las secuencias por las interrogaciones a las bases de datos revela que la mayoría de las secuencias (>61%) presentan porcentajes de similitud inferiores o iguales a 95% con las especies bacterianas identificadas (tabla.7). Sobre las 47 secuencias analizadas, 28 secuencias tienen como vecinos más cercanos las bacterias no cultivadas, cuyas secuencias proceden directamente del ADN extraído del medio ambiente. La mayoría de estas secuencias presentan además porcentajes de similitud muy bajos (88-95%) , 17 secuencias sobre 20 difieren así más del 5% con respecto a sus vecinos más próximos . Entre las secuencias que pueden clasificarse en un grupo filético, una mayoría de las secuencias pertenecen a la subclase de las proteobactepas (18 secuencias con un porcentaje de similitud comprendido entre 89 y 99%). Un ^ité****.** ******* ?*""-*«--a' * *.** ****. * segundo grupo de secuencias esta representado por la subclase g de las proteobacterias, que comprende 9 secuencias cuyos porcentajes de similitud varían entre 84 y 99%) . Los grupos de las b-proteobacterias, d-proteobacterias, firmicutos a bajos G+C% y a altos G+C% comprenden respectivamente 1, 4, 3 y 5 secuencias. Solamente una secuencia no pudo clasificarse en el seno de los grandes grupos taxonómicos bacterianos definidos: la secuencia a22.1(19), su vecino más próximo Aerothermobacter marianas (con una similitud del 89%), es el mismo una sepa aislada del medio marino y no clasificada hasta el momento actual. Finalmente, 6 secuencias pueden clasificarse en el seno del grupo de Acidoba cteri uml Hol ophaga . Este grupo presenta la particularidad de no estar representado más que por dos bacterias cultivadas Acidobacteri um capsula tum y Holophaga foetida , el conjunto de este disco esta compuesto por bacterias donde solo el gen ARNrl6S se ha detectado por amplificación y clonación a partir del ADN extraído de la muestra del medio ambiente (principalmente del suelo), Ludwig et al (1997). Los valores más bajos de similitud entre las diferentes secuencias que componen a este grupo presagian una gran heterogeneidad y diversidad en el seno de esta grupo. El conjunto de los resultados se representa en la tabla 7.

Estos resultados muestran que las secuencias obtenidas en el banco cosmidico provendrían de microorganismos no solamente diversificados filogenéticamente sino sobre todo de microorganismos que jamas habían sido aislados hasta ahora. Los resultados del secuenciamiento del ADN amplificado permite establecer un árbol filogenético de los organismos presentes en la muestra de suelo donde las secuencias caracterizadas son originarias. El árbol filogenético representado en la Figura 7 se realiza a partir de la alineación de las secuencias por el lógico MASE (Faulner y Jurak, 1998), y corregido por el método de 2 parámetros de Kimura (1980) , con la ayuda del algoritmo Neighbour Joining (Satiou y <* Nei 1987). El análisis filogenético permite comparar las secuencias de ADNrl6S clonadas en el banco de ADN del suelo, con las secuencias de ADNrldS procariote reunidos en las bases de datos Ribosomal Datábase Project (RDP) , (versión 7.0, programa SIMILARITY-MATCH, Maidak et al 1999), y en la base GenBank gracias al lógico BLAST 2.0 (Atschul et al, 1997).

Ejemplo 14: Preselección genética del banco para la evaluación de la riqueza metabólica Para caracterizar el banco obtenido en términos de diversidad metabólica e identificar los clones que tienen los insertos que portan los genes que pueden estar implicados en las vías de biosíntesis, se ha desarrollado de acuerdo con la invención técnicas de tamizado genético basadas en los métodos de PCR, con el fin de detectar e identificar los genes PKS del tipo 1. 1 Cepas bacterianas , plásmidos y condiciones de cultivo S. coelicolor ATCC101478, S. ambofaciens NRRL2420, S . lactamandurans ATCC27382, S . rimosus ATCC109610, B. Subtilis ATCC6633 y B . licheniformis THE1856 (colección RPR) , se utiliza como fuentes de ADN para los experimentos de PCR. S . lividans TK24 es la cepa huésped utilizada para el cósmido satélite POS1700. Para la preparación del ADN genómico, de las suspenciones de esporas, de protoplastos y para la transformación de S . lividans, se han seguido los protocolos estándar descritos en Hopwood et al. (1986). Escherichia coli ToplO (INVITROGEN) se utiliza comparación huésped para la clonación de los productos de PCR y E . coli Sure (STRATAGENE) , se utiliza como huésped para el cósmido satélite pOS7001. Las condiciones de cultivo de E. coli , la preparación de los plásmidos, la digestión del ADN, ¡f . f*** .*-** I . *f******? * la electroforesis sobre gel de agarosa, se realizan siguiendo los procedimientos estándar (Sambroock et al., 1996). 2. Cebadores de PCR: Los pares de cebadores a l -al y bl-b2 se definen por el equipo de N. Bamas-Jacques y su uso se utiliza para el tamizado del ADN de las cepas puras y del banco del suelo para la búsqueda de genes que codifican el PKSI) Tabla 8: Cebadores de PCR homólogos a los genes PKSI utilizados para el tamizado del banco. al ( + ; 5' CCSCAGSAGCGCSTSTTSCTSGA3' a2 (+ ) 5' GTSCCSGTSCCGTGSGTSTCSA3' bl 5' CCSCAGSAGCGCSTSCTSCTSGA3' b2 5' GTSCCSGTSCCGTGSGCCTCSA3' Condiciones de amplificación: Para la búsqueda del PKS 1 a partir del ADN de cepas puras, la mezcla de amplificación contiene: en un volumen final de 50 µl , entre 50 y 150 ng de ADN genómico, dNTP 200 µm, MgCl 5mM final, DMSO al 7%, amortiguador lx Appligene, 0.4 µM cada cenador y 2.5U de Taq Pcli erasa lit^a^?.^?fc4^ ^ Mifaa¿?^^jL>Mia. .*<^'^ * *«» &**&f *A a Appligene. Las condiciones de amplificación utilizadas son: desnaturalización a 95°C durante 2 minutos, hibridación a 65°C durante 1 minuto, alargamiento a 72°C durante 1 minuto, para el primer ciclo, seguido por 30 ciclos donde la temperatura se disminuye hasta 58 °C como se describe en K. Seow et al., 1997. La etapa de extensión final se efectúa a 72°C durante 10 minutos. Para la búsqueda de PKS 1 a partir del ADN del banco, las condiciones de PCR son las mismas que las anteriores para el par al-a2 utilizando entre 100 y 500 ng del cósmido extraído de los conjunto de 48 clones. Para el par de cebadores bl-b2, 500 ng de cosmidos provenientes de los conjuntos de 96 clones se utilizan. La mezcla de amplificación contiene dNTP 200 µM, MgCl2 a 2.5 mM final, DMSO al 7%, amortiguador lx Quiagen, 0.4 µM de cada cebador y 2.5U de Tag polimerasa Hot-start (Qiagen). Las condiciones de amplificación utilizadas son: desnaturalización 15 minutos a 95°C seguida por 30 ciclos: un minuto de desnaturalización a 95°C + 1 minuto de hibridación a 65°C para el primer ciclo, y 62°C para los otros ciclos, 1 minuto de alargamiento a 72°C, etapa de extensión final de 10 minutos a 72°C. La identificación de los clones positivos a partir de los conjuntos de 48 o 96 clones se efectúa a partir de reproducciones de microplacas madres correspondientes sobre un medio sólido o cualquier otro método estándar de duplicación. 3 Subclonación y secuenciamiento Los productos de la PCR de los clones identificados son secuenciados de acuerdo con el protocolo siguiente: Los fragmentos son purificados sobre gel de agarosa (equipo de extracción en gel (Qiagen) ) y clonados en E. coli TOP 10 (Invitrogen) con la ayuda del equipo de clonación TOPOTA (Invitrogen) . El ADN plasmídico de los subclones se extrae por lisado alcalino sobre un Biorobot (Qiagen) y se dialisa durante 2 horas sobre una membrana " VS de 0.025 µm (Millipore). Las muestras son secuenciadas con los cebadores M13 "universal" e "inverso" sobre el secuenciador ABI 377 96 (PERKIN ELMER) . 4 Resultados Definición y validación de los cebadores PCR Dos regiones muy conservadas del PKS del tipo 1 de actinomicetos, que comprenden el sitio activo de la enzima, son puestos en el blanco por amplificación de los genes homólogos con los cebadores degenerados. Estas dos regiones corresponden a las secuencias PQQR(L) (L)LE y VE(A)HGTGT respectivamente . i^* *?* ^H**^***».**,, Los cebadores (tabla 8) se prueban con el ADN de cepas productoras o no de macrolidos: Streptomyces coeli color, Streptomyces ambofaciens, productor de espiramicina, y Sa ccharopolyspora arythraea , productor de aritromicina. Cuales quiera que sean los cebadores utilizados, los bancos que representan los fragmentos de aproximadamente 700 pb y que corresponden a la longitud de segmento esperado, se obtienen con todas las cepas. Estos resultados demuestran la especificidad de los cebadores a y b para los genes PKS I para las cepas productoras o no o de los genes silenciosos en S . coeli color. El secuenciamiento de los productos de la PCR obtenidos con el par de cebadores al-a2 permite identificar, a partir de la sepa S . ambofa ciens, la secuencia de un gen KS ya descrito (solicitud de patente europea número EP0791656) como que pertenece a la vía de biosíntesis del plantenolido, precursor macrolídico de la espiramicina, y dos secuencias jamas descritas, Stramb 9 y Stramb 12, (ver lista de secuencia) . En lo que aquí concierne, S. erythraea , el método de tamizado ha permitido la identificación de una secuencia de KS (saceryl7) idéntica a aquella de KS del módulo 1 y ya publicado en Genebank (número de acceso M63677), que codifica para la sintetasa 1 (DEBSl) del 6-desox?eptronólido B. Otra secuencia no correlacionada a ia vía de biosmtesis de la eritromicma se identifica y se trata de la secuencia SEQ ID NO: 32.

Conclusión Se ha aplicado un método para analizar la presencia de genes que codifican para los PKS del tipo 1 por PCR, a partir de diferentes microorganismos. La estructura muy conservada del dominio del acetosintetasa del tipo 1 ha permitido realizar un método de PCR basado en el uso de cebadores de generados desviados en GC para inducción de los codones . Este método muestra la posibilidad de identificar los genes agregados implicados en la vía de biosíntesis de los policétidos del tipo 1. La clonación de estos genes permite la creación de una colección que podrá a continuación utilizarse para construir los híbridos policetidos. El mismo principio puede aplicarse a otras clases de antibióticos. Los resultados obtenidos aquí muestran también la presencia de genes que pueden pertenecer a agregados silenciosos (SEQ ID NO: 30 a 32).

La presencia de agregados silenciosos ha sido documentada en S. lividans y sus expresiones son iniciadas por los reguladores específicos o pleitrópicos (Horinouchi et al.; Umeyama et al. 1996). Estos resultados sugieren que ía detección de los genes que pertenecen a las ¿fe¿ ¡¿* a?¿bA*s«éffi**ákiiÍ ÍiÉ vías llamadas silenciosas que codifican en realidad para las enzimas activas capaces de dirigir, en asociación con las otras enzimas específicas de la vía, las etapas enzimáticas necesarias para la síntesis de metabolitos secundarios.

Tamizado del banco El tamizado se efectúa en condiciones descritas en la sección materiales y métodos utilizando los pares de cebadores validados a partir de las cepas productoras. En presencia del par de cebadores al-a2, el tamaño de los productos de la PCR obtenidos a partir del ADN cosmidico extraído de los conjuntos de 48 6 96 clones es de aproximadamente 700 bp, de acuerdo por lo tanto con los resultados esperados. La intensidad de las bandas obtenidas es variable, pero una sola banda de amplificación esta presente para cada conjunto de ADN blanco. En estas condiciones, 8 grupos de ADN blanco se detectan, que corresponden a 9 clones positivos después de la duplicación. El tamizado efectuado con el segundo par de cebadores bl-b2, ha dado resultados de amplificación menos específicos, puesto que numerosas bandas satélites se han observado al lado de las banda de 700 bp. Sin embargo, se han detectado 9 grupos de .ADN blanco que corresponden a 14 clones positivos después de la duplicación a partir de estos clones positivos, el ADN se extrae para las etapas de secuenciamiento y de transformación de S . lividans .

Análisis de los cosmidos La digestión de los cosmidos identificados por PCR con la enzima Dral, que reconocen un sitio rico en AT, libera un fragmento superior a 23 kb (figura 22) . Esto sugiere que el método PCR da preferiblemente en el blanco del ADN del suelo que contiene un alto porcentaje en G+C. Este resultado es la consecuencia de la degeneración de los cebadores utilizados, desviados en GC para la acción de los codones. Los insectos, como se espera en el caso de los cosmidos, tienen un tamaño superior a 23 kb, salvo en un caso (clon a9B12), lo que podría traducirse en una cierta inestabilidad de los cosmidos. Por otra parte, entre todos los clones seleccionados, solamente dos de entre ellos, GS . Fl y GS.G11, han mostrado el mismo perfil de restricción que indican una relación baja de redundancia en el banco. Los cosmidos seleccionados se transfieren en Streptomyces lividans por transformación de protoplastos en presencia de PEG 1000. La eficiencia de transformación varía entre 30 y 1000 transformantes por µg de ADN cosmidico utilizado . **** ,******,****** **....- . ,. ,¿,¿¡, ^^ -ti-a *__****t**~***f* **** *- l»^^!^ Secuenciamiento y análisis filogenético de los genes PKS I del suelo. El método de PCR aplicado sobre las cepas puras se utiliza como se describe sobre los cosmidos del banco y 24 clonas son así identificadas. Los productos de PCR de aproximadamente 700 bp obtenidos a partir del ADN de dos conjuntos (48 clones) y de 8 clones únicos, se clonan después de la purificación sobre gel de agarosa, y se secuencian. Esto permite la identificación de 11 secuencias. La alineación de las secuencias proteicas deducidas PKS I del suelo con otros PKS I presentes en diferentes microorganismos (Figura 24) muestra la presencia de una región muy conservada que corresponde a la región consenso del sitio activo de la b-cetoacil sintetasa. El análisis de las secuencias obtenidas con el método "preferencia del codón" (Gpbskov et al., 1984; Bibb et al., 1984) revela la presencia de una fuerte desviación en el uso de los codones ricos en G+C en una sola fase de lectura. Las proteínas deducidas de acuerdo con esta fase de lectura muestran una fuerte similitud con los KSs del tipo 1 conocidos 'programa Blast). En particular, la similitud entre las secuencias de KS del suelo y KS del asícr.erado de entromi ip.a es de apr ximaaamente 533.

Después de la duplicación de un conjunto y la identificación de un clon único, la secuencia del producto de la PCR obtenido a partir de este clon se identifica con aquella del conjunto, lo que confirma la confiabilidad del método utilizado. El análisis de la secuencia del producto de la PCR de un clon ha permitido la identificación probable de 3 genes KSI diferentes. Una se estas secuencias (SEQ ID NO: 34) tiene una similitud de 98.7% con ia secuencia de otro conjunto, lo que sugiere que codifican para la misma enzima. Las otras dos secuencias son diferentes pero fuertemente homologas. Aquí, se describe por primera vez la clonación e identificación de un banco de ADN del suelo de vías de biosíntesis de metabolitos secundarios que contienen los genes que codifican los KS del tipo 1. El porcentaje elevado en G+C de las secuencias del suelo sugieren que pueden derivarse de genomas que tengan un uso de los codones similar a aquellos de los actonomicetos . Aunque los datos disponibles en la literatura son reducidos, se sabe que los genes que codifican los PKS del tipo 1 son muy diversificados por su organización física en el genoma, el tamaño y el número de módulos contenidos en cada gen . La presencia de varios dominios que provienen de un solo clon es una confirmación de su pertenencia a los agregados de policetidos asimétricos. En un solo caso, los clones parecen formar un contiguo puesto que comparten la misma secuencia para el dominio KS . El tamaño de las regiones genéticas implicadas en la síntesis del PKS I varían entre algunas kb para la penicilina aproximadamente 120 kb para la rapamicina. Las dimensiones de los insertos cosmidicos pueden por lo tanto no ser suficientes para la expresión de aglomerados más complejos . Los genes que codifican para los PKS I, capaces de trabajar de manera iterativa como lo PKS II y de controlar la síntesis de los policetidos aromáticos, se describe (Jae-Hyuk et al., 1995). El estudio de los aglomerados de PKS I del suelo podría aportar incluso, novedades en este dominio. 5. Identificación de 6 genes que codifican a las policétido sintasas se continua el tamizado del banco de cosmidos de acuerdo con los protocolos descritos en el presente ejemplo, los inventores han identificado un clon del cósmido que contiene un inserto de 34071 pb que contiene varios marcos abiertos de lectura, que codifican para los polipéptidos del tipo policetidc sintasa. Xas precisamente, el cósm do es identificado por tamizado oel banco contiene 6 marcos abiertos de lectura que codifican para los polipéptidos policetido sintasa o para los polípéptidos fuertemente emparentados, los péptidos sintasa no ribos?micos. Una gráfica detallada de este cósmido se representa en la Figura 36. La secuencia nucleotidica completa dei cósmido constituye la secuencia de SEQ ID NO: 113 del listado de secuencias. El inserto de ADN contenido en la secuencia SEQ ID NO0 3 constituye la secuencia nucleotidica complementaria (hebra -) de la secuencia nucleotidica que codifica para las diferentes policetido sintasas. La secuencia nucleotídica del inserto de ADN contenido en el cósmido de la Figura 36 que comprende los cuadros de lectura abiertos que codifican para los polipéptidos policetido sintasa (hebra +) , se esquematiza sobre la Figura 37 y esta constituida por la secuencia SEQ ID N0° 11 dei listado de secuencias. Además, una gráfica detallada de los diferentes cuadros de lectura abierto contenidos en el inserto de ADN de este cósmido esta representado en la Figura 37. Las características de las secuencias nucleotídicas que comprenden los cuadro abiertos de lectura contenidos en el inserto de ADN de este cósmido son detalladas a continuación .

Secuencia ORF1 La secuencia orfl comprende un cuadro abierto de lectura parcial de una longitud de 4615 nucleótidos. Esa secuencia constituye la secuencia SEQ ID NO 115, que inicia en el nucleótido en posición 1, y se termina en el nucleótido en la posición 4615 de la secuencia SEQ ID NO 114. La secuencia SEQ ID NO 115 codifica para el polipéptido ORF1 de 1537 aminoácidos, este polipéptido constituye la secuencia SEQ ID NO 121. El polipéptido de la secuencia SEQ ID NO 121, está emparentado con los péptidos sintasas no ribosómicos. Este polipéptido posee un grado de identidad de aminoácidos de 37% con el péptido sintasa de Anabaena sp.90, referido bajo el número de acceso « emb CACO1604.1 » en la base de datos Genbank.

Secuencia ORF2 La secuencia orf2 tiene una longitud de 8301 nucleótidos y constituye la secuencia SEQ ID NO 116, que inicia en el nucleótido en posición 4633, y se termina en el nucleótido en la posición 12933 de la secuencia SEQ ID NO 114. La secuencia ORF2 codifica para el péptido ORF2 de una longitud de 2766 aminoácidos, este polipéptido constituye la secuencia SEQ ID NO 122. l? *j ****A*. *ßát* ^t'*~ *^*fia^^M. ***********^*?**.*.* .^ *é k.* *L i^ El polipéptido de la secuencia SEQ ID NO 122, posee una identidad de secuencia de aminoácidos del 41% con la secuencia MtaD de Stigma tella auran tia ca , referida bajo el número de acceso « gb AAF 19812.1 » de la base de datos Genbank. El polipéptido ORF2 constituye una policétido sintasa.

Secuencia ORF3 La secuencia nucleotídica orf3 tiene una longitud de 5292 nucleótidos y constituye la secuencia SEQ ID NO 117. La secuencia SEQ ID NO 117 corresponde a la secuencia que inicia en el nucleótido en la posición 12936, y que se termina en el nucleótido en la posición 18227 de la secuencia SEQ ID NO 114. La secuencia nucleotídica SEQ ID NO 117 codifica para el polipéptido policétido sintasa 0RF3 de 1763 aminoácidos, este po^lipéptido constituye la secuencia SEQ ID NO 123, de acuerdo con la invención. El polipéptido ORF3 de la secuencia SEQ ID NO 123, posee una identidad del 42% de aminoácidos con la secuencia MtaB de Stigma tella a uran tiaca , referida bajo el número de acceso « gb AAF 19810.1 » de la base de datos GENBANK. .*?l *t^^ ** >^* t *tí** .*. -aA^Ar-^jyfcUJ Secuencia ORF4 La secuencia nucleotídica orf4 tiene una longitud de 6462 nucleótidos y constituye la secuencia SEQ ID NO 118 de acuerdo con la invención. La secuencia SEQ ID NO 118 corresponde a la secuencia que inicia en el nucleótido en la posición 18224, y que se termina en el nucleótido en la posición 24685 de la secuencia SEQ ID NO 114. La secuencia nucleotídica SEQ ID NO 118 codifica para el polipéptido policétido sintasa ORF4 de 2153 aminoácidos, este polipéptido constituye la secuencia SEQ ID NO 124, de acuerdo con la invención. El polipéptido ORF4 de la secuencia SEQ ID NO 124, posee una identidad de secuencia en aminoácidos del 46% con la secuencia epoD de Sorangi um cell ul osum , referida bajo el número de acceso « gb AAF62883.1 » de la base de datos GENBANK.

Secuencia ORF5 La secuencia nucleotídica orf5 tiene una longitud de 5088 nucleótidos y constituye la secuencia SEQ ID NO 119 de acuerdo con la invención. La secuencia SEQ ID NO 119 corresponde a la secuencia oue inicia en el nucleótido en la posición 24682, y que se termina en el nucleotido en la posición 29769 de la secuencia SEQ ID NO 114. La secuencia nucleotídica SEQ ID NO 119 codifica para el polipeptioc policétido smtasa 0RF5 de 1695 aminoácidos, este polipéptido constituye la secuencia SEQ ID NO 125, de acuerdo con la invención. El polipéptido policétido sintasa ORF5 de la secuencia SEQ ID NO 125, posee una identidad en aminoácidos del 43% con la secuencia epod de Sorangi um cel l ulosi um, referida bajo el número de acceso « gb AAF 62883.1 » de la base de datos GENBANK.

Secuencia ORF6 La secuencia nucleotidica orfd tiene una longitud de 4306 nucleotidos .y constituye la secuencia SEQ ID NO 120 de acuerdo con la invención. La secuencia nucleotídica SEQ ID NO 120 corresponde a la secuencia que inicia en el nucleotido en la posición 29766, y que se termina en el nucleotido en la posición 34071 de la secuencia SEQ ID NO 114. La secuencia SEQ ID NO 120 constituye un marco abierto de lectura parcial que codifica para el polipeptido ORF6 de 1434 am?noac_aos del tipo policetido smtasa, este polipeptido constituye la secuencia SEQ ID NO 126, de acuerdo , l* !**! ***^^^ !**** **^^ , El polipéptido de la secuencia SEQ ID NO 126, posee una identidad en aminoácidos del 43% con la secuencia epoD de Sorangi um cell ul osum, referida bajo el número de acceso « gb AAF 62883.1 » de la base de datos GENBANK.

EJEMPLO 15 Construcción de los vectores satélite del tipo BAC integrativos en Streptomyces Construcción de los vectores satélite del tipo BAC integrativos y conjugativos en Streptomyces 15.1 Construcción del vector pMBD-1 El vector BAC pMBD-1 se obtiene de acuerdo con las etapas siguientes: Etapa 1 : El vector pOSVOlO se somete a una digestión por las enzimas psTI y BstZ17I con el fin de obtener un fragmento nucleotidico de 6.3 kb. Etapa 2 : El vector pDNR-1 se digiere por las enzimas PstI y PvuII con el fin de obtener un fragmento nucleotídico de 4.145 kb . Etapa 3: El fragmento nucleotídico de 6.3 kb que proviene del vector pOSV017 se fusiona por ligación al fragmento de 4.15 kb que proviene del vector pDNR-1, con el fin de producir el vector pMBD-1, como se ilustra en la figura 30. .*_ i*ü, í * ¡¡^-*.*? á*,*¡_ .*.*.* ¿*?* m**^t?<ifcJ^Ja,?m, *¡ 15.2 Construcción del vector pMBD-2 El vector pMBD-2 es un vector del tipo BAC que mantiene un elemento íntegrativo « fc31 mt-Ohyg ». fc31 es un fago templado con un aspecto de huésped grande, donde el sitio de unión (attP) esta bien localizado. El fragmento fc31 int es el fragmento mínimo del actmofago fc31 capaz de inducir la integración de un plasmido en el cromosoma de Streptomyces Lividans . Ohyg es un derivado del mterposón O capaz de conferir la resistencia a la higromicina en E . coll y S . Li vi dans . Los vectores BAC que contienen el sistema de integración fc31 son descritos por SOSIO et al. (2000) y en la solicitud PCT no. '99 6734, publicada el 29 de Diciembre de 1999. El vector BAC pmBD-2 se construye de acuerdo con la etapas siguientes: Etapa 1 : Construcción de un elemento integrativo fc31?nt Oh^g en un plasmido de copias múltiples de E . col l . Primero se amplifica el fragmento fc31?nt a partir del plast?ido pOJ436 con la ayuda del par de cebadores siguientes : El cebador EVfc31I (SEQ ID NO 109) (que permite introducir un sitio EcoRV en el extremo de la secuencia 5' fc31), y el cebador BIIfc31F (SEQ ID NO 110) (que permite la introducción de un sitio BgLII en el extremo 3' de la secuencia fc31) . El fragmento Ohyg se obtiene por la digestión con ayuda de la enzima BamHl del plásmido pHP45 Ohyg descrito por BLONDELET-ROUALT (1997). Después del elemento integrativo fc31 int-Ohyg, se clona en el vector pMCS5 digerido por las enzimas BglII y EcoRV.

Etapa 2 : Construcción del vector pMBD-2 El cromosoma artificial bacteriano pBAce3.6 descrito por FRENGEN et al. (1999) se digiere por la enzima Nhel, después se trata por la enzima Eco polimerasa. Después, el vector pMCS5 fc31 int-Ohyg se digiere por las enzimas SnaBI y EcoRV con el fin de recuperar el elemento integrativo. La gráfica detallada del vector pMBD2 se representa en la figura 31. 15.3 Construcción del vector pMBD-3 El vector pMBD-3 es un vector integrativo (fc31 int) y conjugativo (OriT) del tipo B.AC, que comprende el marcador de selección Ohyg. La gráfica del vector pMBD-3, así como su procedimiento de construcción, se ilustra en la figura 31. El vector pMBD-3 se obtiene amplificando el gen OriT a partir del plásmido pOJ436 con la ayuda del par de cebadores de la secuencia SEQ ID NO 111 y SEQ ID NO 112, que contienen los sitios de restricción pací. El fragmento nucleotídico amplificado con ayuda de los cebadores SEQ ID NO 111 y SEQ ID NO 112, se clona en el vector pMBD2 previamente digerido por la enzima Pací. El esquema de construcción del vector pMBD-3 se ilustra en la figura 31. 15.4 Construcción del vector pMBD-4 La gráfica detallada del vector pMBD-4 se representa en la figura 32. El vector pMBD4 se obtiene clonando el elemento integrativo fc31 int-Ohyg en el vector pCYTAC2. -....iliálítí? -¡WftKB ¿lo 15.5 Construcción del vector pMBD-5 El esquema de construcción del vector pMBD-5 se ilustra en la figura 33. El vector pMBD-5 se construye por recombinación del fragmento nucleotídico comprendido entre los dos sitios loxP del vector pMBD-1 ilustrado en la figura 33, con el sitio Ioxp contenido en el vector BAC designado pBTP3, una gráfica detallada del plásmido pBTP3 se representa en la figura 34. 15.6 Construcción del vector pMBD-6 El vector pMBD-6 se construye recombinando el fragmento nucleotídico comprendido entre los dos sitios loxP del vector pMBD-1 a nivel del sitio loxP del vector BAC pBeloBacll, como se representa sobre la figura 35.

TABLA 1 Localización de la toma de las muestras y características de los suelos en los diferentes experimentos . Los conteos microbianos directos que utilizan la coloración con anaranj ado de acridina se utilizan antes y después de la trituración del suelo Numero Ori gen Textura Cantidad (% ) de Materia pH Número de Número de arena barro arcilla orgánica células antes células (g/kg de de la después de la suelo trituración trituración seco) a(xl09/g peso de d(xl09/g peso suelo seco) de suelo seco) Australia Arcilla 62 22 16 49.7 5.8 6.5 (0.9) 2.9 (1.3¡ arenosa Peyrat le Arcilla 61 26 13 48.2 4.9 7.3 (0.6! 5.4 (0.8) Chateau, arenosa Franca a TABLA 1 (Continuación) Localización de la toma de las muestras y características de los suelos en los diferentes experimentos. Los conteos microbianos directos que utilizan la coloración con anaranjado de acridina se utilizan antes y después de la trituración del suelo Número Origen Textura Cantidad (%) de Materia PH Número de Número de a?ena barro arcilla orgánica células antes células (g/kg de de la después de la suelo trituración trituración seco) a(xl09/g peso de a(xl09/g peso suelo seco) de suelo seco) Cote St-André, Tierra 50 41 40.6 5.6 10.0 (0.7 7.5 (1.4 Francia arenosa Chazay Tierra 34 47 19 13.9 5.8 1.1 4.2 (0.6) d'Azergue, arenosa Francia arcillosa TABLA 1 (Continuación) Localización de la toma de las muestras y características de los suelos en los diferentes experimentos . Los conteos microbianos directos que utilizan la coloración con anaranjado de acridina se utilizan antes y después de la trituración del suelo Numero Origen Textura Cantidad (%) de Materia PH Numero de Numero de arena barro arcilla orgánica células antes células (g/kg de de la después de la suelo trituración trituración seco) a(xl09/g peso de a(xl?7g peso suelo seco) de suelo seco) Guadeloupe, Arcilla 27 24 47 17.0 4.8 1.4 (0.4) 0.5 (0.1) France Dombres , Tierra 20 67 13 30.3 4.3 7.5 H0.5] 5.6 (0.9) Francia arenosa arcillosa 3n = 3; desviación estándar entre paréntesis, TABLA 2 Cebadores y sondas utilizadas para la amplificación PCR y la hibridación sobre mancha Cebador o sonda Blanco a) Secuencia (5' a 3' Referencia no.

Sonda FGPS431 Universal (1392-1406) ACGGGCGGTGTGT (A/G) C Amann et al., 1995 Cebador FGPS122 Bacterias (6-27) GGAGAGTTTGATCATGGCTCAG Amann et al . , 1995 Cebador FGPS350 Streptosporangium CCTGGAGTTAAGCCCCCAAGC Este estudio (616-635) Sonda FGPS643 Streptosporangi um GTGAGTAACCTGCCCC (T/C) GACT Este estudio (122-142) Cebador R499 Bacillus anthraci s TTAATTCACTTGCAACTGATGGG Patra et al. , 1996 Cebador R500 Bacillus anthracis AACGATAGCTCCTACATTTGGAG Patra et al. , 1996 Sonda C501 Bacillus anthracis TTGCTGATACGGTATAGAACCTGGC Patra et al. , 1996 Cebador FGPS516 S. lividans 0S48.3 TCCAGATCCTTGACCCGCAG Este estudio Cebador FGPS517 S. lividans 0S48.3 CACGACATTGCACTCCACCG Este estudio Sonda FGPS518 S. lividans 0s48.3 CCGTGAGCCGGATCAG Este estudio a) Las posiciones sobre el gen de ARNr 16S de E. coli están dadas entre paréntesis. Para B . an thráci s y S . l ividans, los cebadores y las sondas dan en el blanco de las secuencias cromosómicas específicas de los organismos respectivos. Estas secuencias no están localizadas en el gen ARNr 16 S. El cásete que contiene la región blanco de S . lividans, se describe por Clerc-Bardin et al. (no publicado).

TABLA 3 Cantidad de ADN extraído a partir de diferentes suelos a partir de los tratamientos de lisado de acuerdo con los protocolos n° 1 a 5 (µg de ADN/g de peso de suelo seco + desviación estándar)3 Suelos 1, 2, 3 y 6; n=3 ; suelo 4: n°=l Suelo Protocolo de lisado número' Numero y origen 1 2 3 4a 4b 5a 5b 1. Australia 17+/-2 52+/-2 32+/-5 16+/-3 33+/-2 59+/-1 27+/-0 2. Peyrat 29+/-2 58+/-1 40+/-2 29+/-2 18+ /3 56+/-1 15+/-1 3. Cote St-André 36+/-7 60+/-6 148+/-10 94+/-7 38+/-6 73+/-5 47+/-6 4.Chazay 9 16 ND 32 15 15 70 6. Dombes 4 + /-2 26+/-3 43+/-1 61 + /- 66+/-1 160+/-7 102+/-5 a Cuantificación por formación de imagen de fosforescencia después de la hibridación sobre mancha con la sonda universal FGPSD431 (tabla 2). bl: Ningún tratamiento; 2: trituración en seco del suelo (G) ; 3: Cr+ho ogenización Ultraturax (H) ; 4a: G+H+sonicación Microtip (MT) ; 4b: G+H+sonicación Cup Horn (CH) ; 5a: Cr+H+NT+lisado químico/enzimático. Verter bien la figura 1.

ND= No determinado. Tabla 4 Cebadores y sondas utilizados en la caracterización molecular de los ADN extraídos del suelo M NJ O Posición sobre el gen ARNrl6S de Escherichia col i Tabla 5 Eficiencias de extracción de las células bacterianas sobre el gradiente de Nycondenz y cantidades de ADN extraido . Efecto de incubación de la muestra del suelo en una solución de extracto de levadura al 6%, previamente a la dispersión y a la centrifugación del gradiente de densidad NJ Tabla 5 (continuación) Eficiencias de extracción de las células bacterianas sobre el gradiente de Nycondenz y cantidades de ADN extraído . Efecto de incubación de la muestra del suelo en una solución de extracto de levadura al 6%, previamente a la dispersión y a la centrifugación del gradiente de densidad NJ NJ a: Numeración microscópica después de la coloración con anaranjado de acridina b: Numeración sobre medio sólido de Tripcasa-Soya al 10% c: Numeración sobre medio sólido HV Agar, después del enriquecimiento 20 minutos a 40°C en una solución de extracto de levadura al 6%- SDS al 0.05%. d: La cantidad de ADN extraído se evalúa sobre un gel de electroforesis con respecto a una escala patrón de ADN de timo de becerro. e: la cuantificación se realiza después de la digestión de agarosa por la acción de una b-agarosa .

N N Tabla 6 Caracterización de los ADN extraídos en función de su proporción de a, b y g sus clases de Proteobacterias , en Gram + a bajo GC% y en Actinomicetos; la señal de hibridación con la sonda procariote sirve de referencia al 100%.

N N a. trituración en un triturador de bolas de tungsteno, con fuerza centrífuga (protocolo de extracción descrito en el artículo Frostegard et al.) YE: solución de extracto de levadura al 6% Tabla 7 : Diversidad de las secuencias de ADNrl6S contenidas en el banco cosmídico Tabla 7: (continuación) Diversidad de las secuencias de ADNrldS contenidas en el banco cosmidico N c TABLA 7 (continuación 1) Diversidad de las secuencias de ADNrl6S contenidos en el banco cosmídico TABLA 7 (continuación 1) Diversidad de las secuencias de ADNrl6S contenidos en el banco cosmidico TABLA 7 (continuación 2) Diversidad de las secuencias de ADNrlßS contenidos en el banco cosmídico N N TABLA 7 (continuación 2) Diversidad de las secuencias de ADNrl6S contenidos en el banco cosmidico N° de conjuntos Vecino más cercano % de Vecino mas cercano % de (clon n°) identificado similitud (clasificación , similitud referencia) a40-a4 L-a42 (6) Desulfivibrio aminophilus ¡5.3% Clon S-34 (d-Proteo) 86.2% G+ bajo GC% a23.1 Kurthia zopfii 97.3% a25.1 Kurthia zopfii 97.2% ald.l (22; Durthia gipsonii 94.4% G+bajo GC% no 94.8% identificado RS 19 (no publicado) TABLA 7 (continuación 3) Diversidad de las secuencias de ADNrlßS contenidos en el banco cosmidico 230 TABLA 7 (continuación 3) Diversidad de las secuencias de ADNrl6S contenidos en el banco cosmidico N N GONZÁLEZ et al (1996) -"Zhou et al (1997) - Pederson et al (1996- Godon et al (1997) - ngenholtz et Al (1998) bLudwig (1997) TABLA 9: Secuencias TABLA 9 : Secuencias TABLA 9 (continuación 1) : Secuencias áf, ¡Afei*A»fe¡&sS»í.a> ¡*.

TABLA 9 (continuación 1) : Secuencias TABLA 9 (continuación 2) : Secuencias TABLA 9 (continuación 2) : Secuencias TABLA 9 (continuación 3) Secuencias TABLA 9 (continuación 3) Secuencias i*^***. * ***** *****^** **^^ REFERENCIAS • Amann, R. I., W. Lud ig, y K.-H. Schleifer. 1995. Phyiogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev. 59 : 143-169. • Atschul S. F. , Madden T. L., Sch ffer A. A., Zhang J. , Zhang Z.,Miller . , Lipman D. J. (1997) "Gapped BLAST and PSI-BLAST : a nex generation of protein databases search programs" Nucleic Acid Researchs Vol 25:3389-3404 • Atschul SF et al., 1990, J. Mol Biol, 215:403-410. • Bakken, L. R. 1985. Separation and purification of bacteria from soil. Appl. Environ. Microbiol. 49 : 1482-1487. • Bibb MJ, Findlay PR, Johnson MW, The relationship between base composition and codon usage in bacterial genes and its use for the simple and reliable identification of protein-coding sequences., Gene 30:1-3, 157-66, ct, 1984. • Biesiekierska-Galguen M. (1997) "Atténuation biologique de contaminants xenobiotiques dans le sol-modele |Á J.a * J.A-ÉBáftfc&faa. ***aJ* ^t*, tft?i^ttiHtt-Jt*-0fe — -^^^ .^ .^^tt^^^ ¿A A,t . lindane" Diplome de DEaA National de Toxicologie, Université Claude Bernard Lyon I. • Blondelet-Rouault MH, Weiser J, Lebrihi A, Branny P, Pernodet JL. Institut de Genetique et Microbiologie, URA CNRS 2225, Universite Paris XI, Orsay, France. Gene 1997 Mayo 6; 190(2) :315-7 • Borchert S et al., 1992, Microbiology Letters, 92:175-180 • BLONDELET-ROUAULT, 1997, Gene, 315-317. • Boccard, F. , Smokvina, T. Pernodet, J. L.

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Microoiol. 62:cl6-322. i¿ ¿,i¿.j ********** ************** *****,* * LISTADO DE SECUENCIAS <110> Aventis Pharma S.A. 5 <120> Procedimiento de obtención de ácidos nucleicos a partir de una muestra del medio ambiente, ácidos nucleicos así obtenidos y su aplicación en la síntesis de compuestos novedosos 10 <130> Banco de ADN de suelo - RPR S.A. <140> <141> 15 <150> FR9915032 <151> 1999-11-29 <160> 126 20 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 15 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: sonda FGPS431 <220> <221> variación <222> :i4) <223> Base A reemplazado por G <400> acgggcggtg tgtac 15 <210> <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador FGPS122 <400> ggagagtttg atcatggctc ag 22 <210> <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador FGPS350 <400> cctggagtta agccccaagc 20 <210> <211> 24 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: sonda FGPS643 <220> <221> variación <222> (20) <223> T reemplazado por C <400> gtgagtnnna acctgcccct gact 24 <210> 5 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: sonda FGPS643-2 <400> gtgagtaacc tgcccccgac t 21 <210> <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial . ¿ &iÁ ..l. í <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador R499 <400> ttaattcact tgcaactgat ggg 23 <210> <211> 23 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador R500 <400> aacgatagct cctacatttg gag 23 <210> <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: sonda C501 <400> ttgctgatac ggtatagaac ctggc 25 <210> <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador FGPS516 <400> tccagatcct tgacccgcag 20 <210> 10 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> ,? ~ <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador FGPS517 <400> 10 cacgacattg cactccaccg 20 <210> 11 <211> 16 <212> ADN 10 <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: sonda FGPS518 15 <400> 11 ccgtgagccg gatcag 16 <210> 12 20 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: FGPS612 <220> <221> variación <222> (2) <223> Base C reemplazado por T <220> <221> variación <222> (7) <223> Base T reemplazado por C <220> <221> variación <222> (7) <223> Base T reemplazado por A <400> 12 ccaacttcgt gccagcagcc 20 <210> 13 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: FGPS669 <220> <221> variación <222> (7) <223> Base A reemplazado por G <220> <221> variación <222> (13! <223> Base A reemplazado por C <400> 13 gacgtcatcc ccaccttcct c 21 <210> 14 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial •'^^^^^«¿iiÉ»^-^.--^*.--^^^^ <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: FGPS618 <220> <221> variación <222> (5) <223> Base T reemplazado por C <400> 14 atggttgtcg tcagctcg 18 <210> 15 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: FGPS614 <400> 15 gtgtagaagt gaaattcgat t 21 <210> 16 <211> 18 -é áá±isM* L_?kí**-**í,*** **.*****-*. a*M- "*""" •""•-- - -*• ~~i ?tai¡í *.*Bi&¡s**?s* <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: FGPS615 <400: 16 cggtggatga tgtggatt 18 <210> 17 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: FGPS616 <400> 17 aggttaaaac tcaaatga 18 <210> 18 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial kdA&i **** *** *.**. .***,. .¿d^j^^^,,^.!!.!!^**^-^-^ <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: FGPS621 <400> 18 atacgtaggt ggcaagcg 18 <210> 19 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: FGPS617 <400> 19 gccggggtca actcggagg 19 <210> 20 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: FGPS680 ******* *__n*.*i-i-.A* *-*-.--. *.*********'•**••**-' ********** *** *** **.* . .**.** ií^%J,ttrA, <220> <221> variación <222> (11) <223> Base A reemplazado por C <220> <221> variación <222> (11) <223> Base A reemplazado por T <220> <221> variación <222> (13) <223> Base T reemplazado por A <400> 20 tgagtcccca actccccg 18 <210> 21 <211> 20 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: FGPS619 <400> 21 gcttggggct taactccagg 20 <210> 22 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador 63f <400> 22 caggcctaac acatgcaagt c 21 <210> 23 <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> lA.Jk *¡i*A*d.*i*á :-* **********,..*. *************»&*******: <223> Descripción de la secuencia artificial: cebador 1387r <400> 23 gggcggngtg tacaaggc 18 <210> 24 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligo-1 <400> 24 gcttatttaa atattaagcg gccgcccggg 30 <210> 25 <211> 28 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligo-2 ,*?*t i***x******* *** **¿k* A * . 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suelo <400> 77 caagcgttgt csggaattat tgggsgtaaa gagstcgtag gcggtttgtc gcgtstgctg 60 tgaaaactsg aggstsaass tsgggs tgc agtgggtacg ggsagastag agtgsggtag 120 gggtgastgg aattsstggt gtagcggtgg aatgcgcaga tatsaggagg aasassgatg 180 gsgaaggcag gtcastgggs cgcaastgas gctgaggagc gaaagsatgg ggagsgaasa 240 ggattagata ssstggtagt ssatgssgta aasgttgggs astaggtgtg gggstcattc 300 cacgagttcs gtgscgcags aaacgcatta agtgssscgc ctggggagta sggssgsaag 360 gc taaaact saaagaaatt gasgggggss sgsasaagsg gsggagsatg sggattaatt 420 sgatgcaacg sgaagaacct taccaaggct tgacatacac cggaaastts sagagatggt 480 tgssccgcaa ggtsggtgta caggtggtgc atggttgtcg tsagstsgtg tsgtgaagat 540 gttgggttaa gtsssgsaas gagsgsaass stsgtsstat gttgssagsa cgtgatggtg 600 gggastsata ggagastgcc ggggtsaact cggaggaagg tggggatgas gtsaaatsat 660 catgcccstt atgtsttggg sttsasgsat gstasaatgg ssggtasaaa gggstgsgat 720 accgcaaggt ggagsgaatc csaaaaagss ggtstcagtt cggattgggg tstgsaastc 780 gaccccatga agtcggagtc gctagtaatc gcaga 815 <210> 78 <211> 826 <212> ADN <213> Organismo Desconosido <220> <223> Origen de la sesuensia: Organismo del suelo <400> 78 tsgtaggtgg sttgtsasgt sgggtgtgaa agsttggggs ttaastssag gtstgsatts 60 atasgggst ggstagaggt aggtagggga gaacggaatt sstggtgtag sggtgaaatg 120 sgsagatats aggaggaasa ssggtggsga aggsggttst stgggsstta sctgasgstg 180 aggagcgaaa gcgtggggag sgaasaggat tagatassct ggtagtssas gstgtaaasg 240 tijLjg A?*i ,itít*L** * *j *,**c<*.Mi?- **fy-^[|- .***.-*-* *. *j *»*?**? ?** tá*bm*~- -í--J~-" ^-^l'*°*l^ ttgggsgsta ggtgtgggga ssttssasgg tttssgsgss gtagctaasg cattaagsgc 300 cscgcstggg gagtasggss gcaaggctaa aastsaaagg aattgasggg ggsssgsasa 360 agsggsggag satgttgstt aattsgacgc aasgsgaaga acsttascaa ggcttgasat 420 cgcccggaaa gcttcagaga tggagsssts ttsggactgg gtgacaggtg gtgsatggct 480 gtsgtsagst sgtgtsgtga gatgttgggt taagtcccgc aasgagsgsa asssttgttc 540 aatgttgssa gcaacatcct tsggggtggt tggggastsa ttggagactg ccggggtsaa 600 ctcggaggaa ggtggggasg asgtsaagts atcatgcccc ttatgtcttg ggctgcaaas 660 atgstacaat ggcsggtasa gagggttgsg 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Olu Trp Phe His Ala Met slu Trp Glu Pro Gln Leu Leu a Glu Ser 1250 1255 1260 Pro Thr Ala Thr Val Ser Gly Ma Trp Leu Val He Ala Asp Ala Gly 1265 1270 1275 1280 Gly He Ala Ala Ala Val Ala Arg Oly Leu Oly Thr Asn Thr Val Val 1285 1290 1295 He Ser sly Arg Asp Ala Olu He Pro Asp Gln Pro Tyr Arg Gly Val 1300 1305 1310 He His Cys Gly Ser Leu Asp Glu Thr Gln Asp Gln Thr Asp Pro Ser 1315 1320 1325 Ala Ala Gly Gly Thr Ala Cys Gln Asp He Leu Arg He Val Gln Glu 1330 1335 1340 Phe Gly Val Oly Arg He Gln Leu Thr Lys Gln Ala Ser Asp Ala Olu 1345 1350 1355 1360 Ser Gln His Pro Arg He Trp Leu He Thr Ala Gly Val His Ala Gln 1365 1370 1375 His Leu sln Met Pro Val Val Pro Ala Arg Ala Pro Val Trp Gly Leu 1380 1385 1390 Gly Arg Thr He Ala Ala Gln His Pro Gln Phe Ala Cys Thr Cys He 1395 1400 1405 Asp Leu Asp Thr Ala Gly Glu Val Glu Val Gln Ala Leu Cys Arg Olu 1410 1415 1420 He Leu Ala Gly Ser Ser Glu Arg Gln Oly 1425 1430 $ k*S*? £?.A Se hace sonstar que con relación a esta fecha, el mejor método conosido por la solisitante para llevar a la prástisa la sitada invensión, es el que resulta claro de la presente descripsión de la invensión.

Claims (81)

REIVINDICACIONES Habiéndose dessrito la invensión somo antesede, se reslama somo propiedad lo sontenido en las siguientes reivindisasiones :

1. Un prosedimiento de preparasión de una solessión de ásidos nusleisos a partir de una muestra de sol que sontiene organismos, el prosedimiento está sarasterizado porque somprende la susesión de etapas siguientes: I (a) Obtención de micropartículas por trituración de una muestra de suelo previamente seca o desecada, después de pone en suspensión las micropartísulas en un medio amortiguador líquido; y (b) extrassión de los ásidos nusleisos presentes en las misropartísulas; y (s) paso de la solusión que sontiene los ácidos nucleicos sobre un tamiz molecular, después la recuperasión de las frassiones de elusión enriquesidas son ásidos nusleisos y el paso de las frassiones de elusión enriquesidas son ásidos nusleicos sobre un soporte de cromatografía de intercambio de aniones, después la recuperasión de las frassiones de elusión que sontienen los ásidos nusleisos purifisados. Í???****? * **i* . L**. -tfjüü [- f -,- n - nii ffti

2. Un procedimiento de preparasión de una colección de ácidos nucleisos a partir de una muestra del medio ambiente que sontiene organismos, el prosedimiento está sarasterizado porque somprende la susesión de etapas siguiente: -II (i) Obtención de una suspensión por dispersión de la muestra del medio ambiente en un medio líquido, después la homogeneización de la suspensión por agitación suave; y (ii) separación de los organismos y otros constituyentes minerales y/u orgánicos de la suspensión homogénea obtenida en la etapa (i) por centrifugación sobre un gradiente de densidad; y (iii) lisar los organismos separados en la etapa (ii) y extracsión de los ásidos nusleisos; y (iv) purifisasión de los ásidos nusleisos sobre un gradiente de sloruro de cesio.

3. El procedimiento de conformidad con la reivindicasión 1, sarasterizado porque la etapa I- (a) está seguida de una etapa somplementaria de: - tratamiento de las misropartísulas en suspensión en un medio amortiguador líquido por sonicación.

4. El procedimiento de conformidad con la reivindicasión 1, saracterizado porque la etapa I- (a) está seguida de las etapas complementarias siguientes: - tratamiento de las micropartículas en suspensión en un medio amortiguador líquido por sonisasión; insubasión de la suspensión a 37°C después de la sonisasión en presensia de lisozima y de acromopeptidasa; adisión de SDS resuperasión de los ásidos nucleicos .

5. El procedimiento de conformidad con la reivindicasión 1, sarasterizado porque la etapa I- (a) está seguida de las etapas complementarias siguientes: - homogeneización de las micropartísulas son la ayuda de una etapa de mezslado violento (vórtise) , seguida de una etapa de agitasión simple; congelación de la suspensión homogénea, seguida de una descongelasión; tratamiento por sonisasión de la suspensión después de la dessongelasión; - insubasión de la suspensión á 37°C después de la sonisasión, en presensia de lisozima y de asromopeptidasa; adisión de SDS;

6. El prosedimiento de sonformidad son una de las reivindisasiones 1 a 5, sarasterizado porque los ásidos nucleicos son moléculas de ADN.

7. Un procedimiento de preparación de una colessión de vestores resombinantes , sarasterizado porque los ásidos nusleisos obtenidos por el prosedimiento de sonformidad son una de las reivindisasiones 1 a 6 son insertados en un vestor de clonación y/o de expresión. Irtiiii iliTilíiiiéil

8. El procedimiento de conformidad con la reivindicasión 7, sarasterizado porque los ásidos nucleicos son separados en función de su tamaño, previamente a su inserción en el vector de clonación y/o de expresión.

9. El procedimiento de conformidad con la reivindicasión 7, carasterizado porque el tamaño promedio de los ácidos nucleisos se vuelve sensiblemente uniforme por ruptura físisa, previamente a su insersión en el vestor de slonasión y/o de expresión.

10. El prosedimiento de sonformidad son la reivindisasión 7, sarasterizado porque el vestor de slonasión y/o de expresión es del tipo plásmido.

11. El prosedimiento de sonformidad son la reivindicación 7, carasterizado porque el vestor de slonasión y/o de expresión es del tipo cósmido.

12. El procedimiento de conformidad con la reivindicasión 11, sarasterizado porque se trata de un sósmido duplisativo en E. coli e integrativo en Streptomyces .

13. El prosedimiento de sonformidad son la reivindisasión 12, sarasterizado porque se trata de un sósmido pOS7001.

14. El prosedimiento de sonformidad son la reivindicasión 11, caracterizado porque se trata de un cósmido conjugativo e integrativo en Streptomyces .

15. El prosedimiento de sonformidad son la reivindisasión 14, sarasterizado porque el sósmido es elegido entre los sósmidos pOSV303, pOSV306 y pOSV307.

16. El procedimiento de conformidad con la 5 reivindicación 11, caracterizado porque se trata de un cósmido duplicativo a la vez en E. coli y en Streptomyces .

17. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 16, carasterizado porque se trata del cósmido pOS 700R. 0

18. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 11, carasterizado se trata de un sósmido duplisativo en E. coli y Streptomyces y sonjugativo en Streptomyces .

19. El prosedimiento de sonformidad son la 5 reivindisasión 7, sarasterizado porque el vestor de slonasión y/o de expresión es del tipo BAC.

20. El prosedimiento de sonformidad son la reivindicación 19, carasterizado porque se trata de un vector BAC integrativo y conjugativo en Streptomyces . 0

21. El procedimiento de conformidad con la reivindicasión 20, sarasterizado porque el vestor es elegido entre los vestores BAC pOSV403, pMBD-1, pMBD-2, pMBD-3, pMBD-4, pMBD-5 y pMBD-6.

22. Un proseso de preparasión de un vector recombinante de clonasión y/o de expresión, sarasterizado porque la etapa de inserción de un ácido nucleico en el vestor de clonación y/o de expresión comprende las etapas siguientes: - abrir el vector de clonasión y/o de expresión en un sitio de slonasión elegido, son la ayuda de una endonusleasa de restrissión apropiada; agregar un primer ásido nusleiso homopolimériso en el extremo 3' libre del vector abierto; - agregar un segundo ácido nucleiso homopolimériso, de sesuensia somplementaria al primer ásido nusleiso homopolimériso, en el extremo 3' libre de ásido nusleiso de la solessión a insertarse en el vestor; - empalmar el ásido nusleiso del vestor y el ásido nucleico de la colección por hibridación del primer y segundo ácido nucleico homopolimérico de secuensias somplementarias una de la otra; serrar el vestor por ligasión.

23. El prosedimiento de sonformidad son la reivindicación 22, carasterizado porque: el primer ásido nusleiso homopolimérico es de una secuencia poli (A) o poli (T) ; y el segundo ácido nucleiso homopolimériso es de una sesuensia poli (T) o poli (A) .

24. El prosedimiento de preparasión de un vector recombinante de conformidad con una de las reivindicasiones 22 ó 23, sarasterizado porque el tamaño del ácido nucleiso a insertarse es de al menos 100 kilobases, de preferencia de al menos 200 kilobases.

25. El procedimiento de preparación de un vector recombinante de conformidad con una de las reivindisasiones 22 a 24, sarasterizado porque el ásido nusleiso a insertarse está sontenido en la solessión de ásidos nusleisos obtenidos por el prosedimiento de sonformidad son una de las reivindisasiones 1 a 6.

26. Un procedimiento de preparación de un vector recombinante de clonasión y/o de expresión, sarasterizado porque la etapa de inserción de un ácido nusleiso en el vestor de clonación y/o de expresión comprende las etapas siguientes : creación de puntas libres sobre los extremos del ácido nucleico de la colección, por eliminación de las secuencias 3' salientes y el reemplazo de las secuensias 5' salientes; abertura del vector de clonasión y/o de expresión en un sitio de slonasión elegido, son la ayuda de una endonusleasa de restrissión apropiada; sreasión de puntas libres en los extremos del ácido nucleiso del vestor por eliminasión de las sesuensias 3' salientes y el reemplazo de las sesuensias 5' salientes, después la desfosforilación de los extremos 5' ; íéátéJuUt -i -fUtlfttli i I "i TilÜH - "- --**""* - k-^1J-:- ******* -** •******* *.**- .. ******** **...***,*l***.*?***. A.*, i ? A. adisión de adaptadores oligonusleotídicos complementarios; inserción del ácido nucleiso de la solección en el vestor por ligasión.

27. El prosedimiento de preparasión de un vestor resombinante de sonformidad son la reivindicación 26, carasterizado porque el tamaño del ácido nucleico a insertarse es de al menos 100 kilobases, de preferencia de al menos 200 kilobases . >

28 . El procedimiento de preparación de un vector recombinante de conformidad con una de las reivindicasiones 26 ó 27, sarasterizado porque el ásido nusleiso a insertarse está contenido en la colesción de ácidos nucleicos obtenidos por el procedimiento de conformidad con ima de las reivindisasiones 1 a 6.

29 . El prosedimiento de sonformidad son una de las reivindisasiones 22 a 28 , sarasterizado porque los ácidos nucleisos son insertados tal suales , sin tratamiento por una o varias endonusleasas de restricción , previamente a su inserción en el vector de clonasión y/o de expresión .

30 . Una colessión de ásidos nusleisos sonstituida de los ácidos nucleisos obtenidos por el prosedimiento de sonformidad son una de las reivindisasiones 1 a 6 .

31 . Un ásido nucleico carasterizado porque está contenido en la solessión de ácidos nusleisos de conformidad con la reivindicasión 30 . l¿dí &*éjáh jlF >***?~~"--** ' **' - ****ft****** v** jA**i'*>>A - **** * - Kt******.*

32. El ásido nusleiso de sonformidad son la reivindisasión 31, saracterizado porque comprende una secuencia nucleotídica que codifica al menos un operón, o una parte de un operón.

33. El ácido nucleiso de sonformidad son la reivindisación 32, saracterizado porque el operón codifica para la totalidad o una parte de una vía metabólica.

34. El ácido nucleiso de sonformidad son la reivindisasión 33, sarasterizado porque la vía metabólisa es la vía de síntesis de los polisétidos.

35. El ásido nusleiso de sonformidad son la reivindisasión 34, sarasterizado porque se elige entre los polinusleótidos que somprenden las sesuensias SEQ ID N° 30 a 44 y las SEQ ID N° 115 a 120.

36. El ásido nusleiso de sonformidad son la reivindisasión 31, sarasterizado porque somprende la totalidad de una sesuencia nucleotídisa que codifisa para un polipéptido.

37. El ásido nusleiso de sonformidad son una de las reivindisasiones 31 a 36, sarasterizado porque es de origen procariote.

38. El ácido nucleiso de sonformidad con la reivindicasión 37, sarasterizado porque proviene de una bacteria o de un virus.

39. El ásido nusleiso de sonformidad con una de las reivindicasiones 31 a 33 y 36, sarasterizado porque es de origen eucariote.

40. El ásido nusleiso de sonformidad son la reivindicación 39, carasterizado porque proviene de un hongo, de una levadura, de una planta o de un animal.

41. Un vector recombinante, carasterizado porque se elige entre los vectores recombinantes siguientes: a) un vector que comprende un ácido nusleiso de sonformidad son una de las reivindisasiones 35 a 40; b) un vestor obtenido de sonformidad son el prosedimiento de una de las reivindisasiones 22 a 25 y 29; s) un vestor obtenido de sonformidad son el prosedimiento de una de las reivindisasiones 26 a 29.

42. Un vestor, sarasterizado porque se trata del cósmido pOS 7001.

43. Un vector, carasterizado porque se trata del cósmido pOSV303.

44. Un vector, sarasterizado porque se trata del cósmido pOSV306.

45. Un vestor, sarasterizado porque se trata del sósmido pOSV307.

46. Un vestor, sarasterizado porque se trata del sósmido pOS 7OOR.

47. Un vestor, sarasterizado porque se trata del vestor BAC pOSV403.

48. Un vector, carasterizado porque se trata del vector pMBD-1.

49. Un vector, caracterizado porque se trata del vector pMBD-2

50. Un vector, carasterizado porque se trata del vector pMBD-3.

51. Un vector, carasterizado porque se trata del vector pMBD-4.

52. Un vector, carasterizado porque se trata del vector pMBD-5.

53. Un vector, carasterizado porque se trata del vector pMBD-6.

54. Una colessión de vectores recombinantes, tales como los obtenidos de conformidad con el procedimiento de una de las reivindicasiones 7 a 21, 25 y 28.

55. Un vector recombinante de clonasión y/o de expresión, sarasterizado porque está contenido en la colessión de vestores resombinantes de sonformidad son la reivindicación 54.

56. Una célula huésped recombinante, carasterizada porque somprende un ásido nusleiso de conformidad con una de las reivindicasiones 31 a 40 o un vestor resombinante de sonformidad con la reivindicasión 55. tA&^Á ^^^^ *** ** *-**-* H****** -**---.*^^ *****^SH**& .*!*****.%

57. La sélula huésped resombinante de sonformidad son la reivindisasión 56, sarasterizada porque se trata de una célula procariote o eusariote.

58. La sélula huésped resombinante de conformidad con la reivindicasión 57, sarasterizada porque se trata de una bacteria.

59. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicasión 58, sarasterizada porque se trata de una bacteria elegida entre E. coli y Streptomyces .

60. La célula huésped recombinante de conformidad con la reivindicasión 58, sarasterizada porque se trata de una levadura o de un hongo filamentoso.

61. Una solección de sélulas huésped resombinantes , caracterizada porque cada una de las células huésped constitutivas de la colessión, comprende un ácido nucleiso de la solessión de ásidos nusleisos de sonformidad con la reivindicasión 30.

62. Una solessión de sélulas huésped resombinantes, caracterizada porque cada una de las células huésped constitutivas de la colección, comprende un vector recombinante de conformidad con una de las reivindicasiones 41 ó 55.

63. Un prosedimiento de detessión de un ásido nucleico de una secuensia nusleotídisa determinada, o de una sesuensia nusleotídica estructuralmente emparentada con una secuencia nucleotídisa determinada, en una solessión de sélulas huésped resombinantes de sonformidad son una de las reivindisasiones 61 ó 62, saracterizado porque comprende las etapas siguientes: - poner en contacto la colección de células huésped recombinantes son un par de cebadores que se hibridan con la secuensia nusleotídisa determinada o que se hibridan son una sesuensia nusleotídisa estrusturalmente emparentada son la sesuensia nusleotídisa determinada; - realizar al menos tres sislos de amplifisación; detestar el ásido nusleiso eventualmente amplifisado.

64. Un prosedimiento de detessión de un ásido nucleico de una secuencia nucleotídisa determinada, o de una secuensia nusleotídisa estrusturalmente emparentada son una sesuencia nusleotídisa determinada, en una solessión de células huésped recombinantes de conformidad con una de las reivindisasiones 61 ó 62, sarasterizado porque somprende las etapas siguientes: poner en sontasto la solessión de sélulas huésped resombinantes son una sonda que se híbrida con la secuencia nucleotídisa determinada o que se híbrida son una sesuensia nusleotídisa estrusturalmente emparentada con la secuencia nucleotídisa determinada; detestar el híbrido formado eventualmente, entre la sonda y los ásidos nusleicos comprendidos en los vestores de la solessión.

65. Un prosedimiento para identifisar la produssión de un sompuesto de interés para una o varias sélulas huésped resombinantes en una solessión de sélulas huésped resombinantes, de sonformidad son una de las reivindicaciones 61 ó 62, carasterizado porque que comprende las etapas siguientes: cultivar las células huésped recombinantes de la colessión en un medio de sultivo apropiado; detessión del sompuesto de interés en el sobrenadante del sultivo o en el lisado selular de una o varias de las células huésped recombinantes cultivadas.

66. Un procedimiento para seleccionar una célula huésped recombinante que produse un sompuesto de interés en una solessión de sélulas huésped recombinantes de conformidad con una de las reivindicasiones 61 ó 62, caracterizado porque comprende las etapas siguientes: cultivar las células huésped recombinantes de la colesción en un medio de cultivo apropiado; detessión del sompuesto de interés en el sobrenadante del sultivo o en el lisado selular de una o varias de las sélulas huésped resombinantes sultivadas; selección de las sélulas huésped resombinantes que produsen el sompuesto de interés.

67. Un prosedimiento para la produssión de un sompuesto de interés, sarasterizado porque comprende las etapas siguientes: cultivar una célula huésped recombinante selecsionada de sonformidad son el prosedimiento de la reivindisasión 66 ; resuperar, y dado el saso, purifisar el sompuesto produsido por disha sélula huésped resombinante .

68. Un sompuesto de interés, sarasterizado porque se obtiene de conformidad con el procedimiento de la reivindicasión 67.

69. El sompuesto de sonformidad son la reivindisasión 68, sarasterizado porque se trata de un polisétido.

70. Un polisétido, sarasterizado porque se produse grasias a la expresión de al menos una sesuensia nusleotídisa que comprende una secuensia elegida entre las secuensias SEQ ID N° 30 a 44 y SEQ ID N° 115 a 120.

71. Una somposisión, sarasterizada porque somprende un polisétido de sonformidad son la reivindisasión 69 ó 70.

72. Una somposisión farmacéutica, carasterizada porque comprende una cantidad farmacológisamente astiva de un polisétido, de sonformidad son la reivindisasión 69 ó 70, en asosiasión son un vehísulo farmaséutisamente sompatible. H-t* TfflT *—•*-- **-**A r 'Tft'hilTr^* -nmO**!******* *.******-* ±*i -*...*..

73. Un prosedimiento de determinasión de la diversidad de los ácidos nucleisos sontenidos en una solessión de ásidos nusleisos y más partisularmente, de una solessión de ácidos nucleisos que provienen de una muestra del medio ambiente, de preferensia de una muestra del suelo, el prosedimiento está sarasterizado porque somprende las etapas siguientes: poner en sontasto los ásidos nusleisos de la solección de ácidos nucleisos a probarse son un par de cebadores oligonucleotídisos que se hibridan son toda sesuensia de ADN ribosomal 16 S basteriano; realizasión de la menos tres sislos de amplifisación; detección de los ácidos nucleisos amplifisados con la ayuda de una sonda oligonucleotídisa o de una pluralidad de sondas oligonusleotídisas, sada sonda se híbrida espesífisamente son una sesuensia de ADN ribosomal 16 S somún a un reino, un orden, una subclase o un género bacteriano; dado el caso, comparar los resultados de la etapa de detecsión anterior, son los resultados de detesción, con la ayuda de la sonda o de la pluralidad de sondas, de los ácidos nucleisos de sesuencia conocida que constituyen una escala patrón.

74. El procedimiento de conformidad con la reivindicasión 73, sarasterizado porque el par de sebadores que se hibridan a toda sesuensia de ADN ribosomal 16 S basteriano, están sonstituidos del sebador FOPS 612 (SEQ ID N°12) y el sebador FOPS 669 (SEQ ID N°13).

75. El prosedimiento de sonformidad son la reivindisasión 73, sarasterizado porque el par de sebadores que se hibridan a toda sesuensia de ADN ribosomal 16 S basteriano está constituido del cebador 63 f (SEQ ID N°22) y el cebador 1387 (SEQ ID N°23) .

76. Un ácido nucleico, carasterizado porque comprende una secuensia nusleotídisa de ADNr 16S elegida entre las secuencias que poseen al menos 99% de identidad en nucleótidos con las secuensias SEQ ID N°60 a SEQ ID N°106.

77. Un prosedimiento de producción de una policétido sintasa del tipo I, el procedimiento de producsión está caracterizado porque comprende las etapas siguientes: obtención de una célula huésped recombinante que comprende un ácido nucleico que codifisa para una polisétido sintasa del tipo I, que somprende una sesuensia nusleotídisa elegida entre las secuencias SEQ ID N°33 a SEQ ID N°44, SEQ ID N°30 A SEQ ID N°32 y SEQ ID N°115 a SEQ ID N°120. cultivo de las células huésped recombinantes en un medio de cultivo apropiado; resuperasión y, dado el saso, purificación de la policétido sintasa del tipo I, a partir de un sobrenadante del cultivo o del lisado celular. *, **** **** * *****.

78. Una policétido sintasa, caracterizada porque comprende una secuensia de aminoásidos elegida entre las sesuensias SEQ ID N°45 a 59 y SEQ ID N°121 a SEQ ID N°126.

79. Un antisuerpo dirigido sontra una polisétido smtasa de sonformidad son la reivindisasión 78.

80. Un prosedimiento de detessión de una polisétido sintasa del tipo I o de un fragmento peptídiso de esta enzima, en una muestra, el prosedimiento está sarasterizado porque somprende las etapas de : a) poner en contacto un anticuerpo de conformidad con la reivindicasión 79, son la muestra a probarse; b) detestar el somplejo antígeno/antisuerpo eventualmente formado .

81. Un estushe de detessión de una polisétido sintasa del tipo I en una muestra, sarasterizado porque somprende: a) un antisuerpo de sonformidad son la reivindisasión 79; b) dado el saso, los reactivos necesarios para la detecsión del somplejo antígeno/antisuerpo eventualmente formado. ** * *****A * *?***#. ilínlJhi!. In ¡.*...~ *******, .fet la