EP1253931A2 - Verwendung von proteinkinase-inhibitor-alpha - Google Patents

Verwendung von proteinkinase-inhibitor-alpha

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EP1253931A2
EP1253931A2 EP01905712A EP01905712A EP1253931A2 EP 1253931 A2 EP1253931 A2 EP 1253931A2 EP 01905712 A EP01905712 A EP 01905712A EP 01905712 A EP01905712 A EP 01905712A EP 1253931 A2 EP1253931 A2 EP 1253931A2
Authority
EP
European Patent Office
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beta
alpha
pki
antagonist
agonist
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP01905712A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ralph c/o Helga Schäfer KNÖLL
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Bayer Pharma AG
Original Assignee
Schering AG
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Filing date
Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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Definitions

  • the present invention relates to the use of protein kinase inhibitor-alpha (PKI-alpha), the use of inhibitors of protein kinase inhibitor-alpha and methods for screening for beta-agonists and beta-antagonists.
  • PKI-alpha protein kinase inhibitor-alpha
  • myocardial stunning was first described in 1975. This refers to the property of the myocardium to show long-lasting, reversible myocardial dysfunction after short-term ischemia as a result of coronary occlusions, ie the heart muscle does not show the expected contractility. This reversible state lasts for several hours and contradicts the prevailing view among experts that an ischemic state of more than 45 minutes is irrevocably associated with myocyte death.
  • the protein kinase A present in the heart (henceforth also referred to as PKA), which regulates myocardial contractility by means of phospholamban and phosphorylation of troponin I, is controlled by receptors which are coupled to the adenylate cyclase, which in turn is regulated by catecholamines.
  • the enzyme activity is both by protein kinase inhibitors (hereinafter referred to as PKI) and regulated by cAMP.
  • PKI protein kinase inhibitors
  • the ⁇ -form is six times more effective than the ⁇ -form.
  • a protein kinase inhibitor known in the art is the protein kinase inhibitor alpha (also referred to herein as PKI-alpha).
  • PKI-alpha has a length of 76 amino acids, whereby the part of the primary sequence that is essential for the inhibitory effect seems to be limited to the range of amino acids 14 to 22. This sequence is 100% identical in humans, pigs, chickens, rats and mice. At the level of the mRNA, the 5 'end of the total porcine mRNA shows a sequence homology of about 90% compared to that of the human, mouse, rat and chicken genome.
  • a recombinant PKI-alpha comprising only amino acids 14 to 22 of the complete PKI-alpha amino acid sequence is cell permeable and available from Calbiochem (product number # 476485).
  • the porcine PKI-alpha coding cDNA has at its 5 'end a second open reading frame which codes for a 9 amino acid polypeptide and several different poly (A) signal sequences at its 3' end (GenBank # bankit256111 AF132737)
  • the present invention has for its object to provide new uses for PKI-alpha and for an inhibitor of PKI-alpha.
  • the object is achieved by using PKI-alpha and / or its derivatives for lowering blood pressure.
  • the object is achieved according to the invention by using PKI-alpha and / or its derivatives as a beta-antagonist.
  • the object is achieved by the use of PKI-alpha and / or its derivatives for the production of a medicament for the prevention and / or treatment of diseases in which a beta-antagonist can be used.
  • the PKI-alpha is one of SEQ ID No. 2 amino acid sequence shown comprises.
  • the PKI-alpha is encoded by a nucleic acid which corresponds to the coding sequence of the sequence shown in SEQ ID No. 1 or a sequence resulting therefrom as a result of the degeneracy of the genetic code or a nucleic acid hybridizing thereon.
  • the PKI-alpha is used in a shortened form.
  • the PKI-alpha contains the amino acids 14 to 22 of the PKI-alpha sequence, in particular the sequence of PKI-alpha according to SEQ ID No.1 or SEQ ID No. 2 includes.
  • the PKI-alpha or its derivative is used for the treatment and / or prevention of diseases which are selected from the group consisting of cardiac arrhythmias, hyperkinetic cardiac syndrome, angina pectoris, myocardial infarction, acute myocardial infarction , Heart failure, arterial hypertension, essential and renal hypertension, portal hypertension, bleeding from esophageal varices, pheochromocytoma, overdosage of beta-sympathomimetics and choline receptor blockers, glaucoma simplex, hyperthyroidism, thyroid toxicity regimen, migraines, and migraines, migraines, migraines, erectile dysentery, migraines, migraines, and migraines, migraines, migraines, migraines, migraines, migraines, and migraines.
  • the PKI-alpha or its derivative is used for post-infarct medication, prophylaxis of the rein
  • the object is also achieved by using an inhibitor of PKI-alpha or a derivative thereof for increasing blood pressure.
  • the object is achieved by using an inhibitor of PKI-alpha or a derivative thereof as a beta agonist.
  • the object is achieved by using an inhibitor of the PKI-alpha or a derivative thereof for the manufacture of a medicament for the treatment and / or prevention of diseases in which a beta-agonist can be used.
  • the inhibitor influences the transcription of the PKI-alpha.
  • the PKI-alpha is a PKI-alpha as described herein.
  • the inhibitor of the PKI-alpha comprises an amino acid sequence which is selected from the group consisting of the sequences with the SEQ ID No. 3 and SEQ ID No. 4 includes.
  • the PKI-alpha inhibitor is intended to be used to treat and / or prevent diseases selected from the group consisting of heart failure, heart attack, chronic and acute heart failure and hypotension.
  • the object is achieved by a method according to the invention for screening for agents for lowering blood pressure, beta-antagonists and / or agents for the treatment and / or prevention of
  • a mixture of a beta receptor, a beta agonist of the beta receptor and a candidate beta antagonist is provided, and
  • the change in the binding behavior of the beta-agonist to the beta-receptor observed under the influence of the candidate beta-antagonist is compared with that under the influence of the beta-antagonist as described herein , observed change in the binding behavior of the beta agonist to the beta receptor.
  • the beta receptor is selected from the group comprising betal and beta2 receptors.
  • the beta agonist is a sympathomimetic, in particular one which is selected from the group comprising noradrenaline, adrenaline, dopamine and dobutamine.
  • the beta-agonist is a beta-agonist as described herein.
  • the object is achieved by a method of screening for agents for lowering blood pressure, beta-agonists and / or agents for the treatment and / or prevention of diseases in which a beta-agonist can be used, wherein
  • a candidate beta agonist is added to the transcription system and
  • the change in the transcription of the beta-antagonist observed under the influence of the candidate beta-agonist is compared with the change in the observed under the influence of the beta-agonist as described herein Transcription of the beta antagonist.
  • the beta-antagonist is one as described herein.
  • the beta-antagonist can be obtained by one of the methods according to the invention.
  • the present invention is based on the surprising finding that PKI-alpha has a negative inotropic, that is to say an effect which worsens the myocardial function.
  • This effect comes about through an inhibition of protein kinase A, which is responsible for the phosphorylation of Phospholamban and troponin is responsible (so-called beta-adrenergic signal transduction).
  • beta-adrenergic signal transduction As a result of the negative inotropic effect of PKI-alpha, inhibition of PKI-alpha in turn improves myocardial function, particularly in the case of heart failure.
  • PKI-alpha has a concentration-dependent, negative inotropic effect and is involved in beta-adrenergic signal transduction.
  • PKI-alpha can be used as a beta antagonist. The latter is due to the fact that the effect of the beta-receptors binding the catecholamines on the contractility-regulating protein kinase A can be counteracted by the protein kinase inhibitors, which thus show a beta-antagonistic effect.
  • beta-antagonistic effect of the PKI-alpha it is also suitable for the manufacture of medicaments for the treatment of diseases in which a beta-antagonist is generally used.
  • this or derivatives thereof can be used in medication in place of or in addition to the beta-antagonist (s) previously used.
  • PKI-alpha or a medicament containing it now provides a replacement for any medicament containing a beta-antagonist as pharmaceutical active ingredient.
  • PKI-alpha Since the PKI-alpha is not only expressed in muscle tissue, but also in nerve tissue, in particular in the brain, neurophysiological fields of indication for PKI-alpha and inhibitors thereof are also within the scope of the present invention.
  • the group of pharmaceutically active compounds is expanded considerably, particularly to the extent that a completely new class of compounds is introduced into this therapeutically very important indication area.
  • the use of PKI-alpha and inhibitors thereof is also advantageous in that they start very early in the cascade of beta-adrenergic signal transduction and are therefore not subject to the undesired down-regulation of the beta-receptors which is associated with various disadvantages.
  • Heart failure is one of the most important diseases in western industrialized countries due to its high prevalence (1-1.5%) and morbidity of the adult population as well as its correspondingly high costs (Sharpe N. et al .; Lancet 352 (suppi I), 3 - 7 (1998)).
  • a number of medications are used to treat them, but only a few of them are really effective, ie they will continue to be effective for many years to come.
  • the calcium antagonists e.g.
  • substance classes are increasingly sought which have their place of action further above the ß-
  • the PKI-alpha in particular amino acids 14-22 thereof, appears to belong in the desired substance class.
  • an inhibitor of PKI-alpha appears to be particularly interesting, in particular the inhibitor of PKI-alpha (PKI-alpha-1) encoded by the second open reading frame of PKI-alpha.
  • PKI-alpha-1 encoded by the second open reading frame of PKI-alpha.
  • both the beta-antagonistic and the beta-agonistic effects can be brought to bear by using PKI-alpha or an inhibitor thereof.
  • PKI-alpha The amino acid sequence of PKI-alpha is shown in SEQ ID No.1 together with the nucleic acid sequence encoding it and as an amino acid sequence as such in SEQ ID No. 2. It turns out for the person skilled in the art that the PKI-alpha is not restricted to the PKI-alpha which contains the sequences SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2 sequences shown. Rather, a PKI-alpha is understood here to mean any protein kinase inhibitor which influences the activity of protein kinase A. To this extent, the term protein kinase inhibitor is based on a functional definition.
  • nucleic acid sequence shown in SEQ ID No.1 is also only an example of a sequence coding for a protein kinase inhibitor. Other sequences result from the degeneracy of the genetic code.
  • the protein kinase inhibitor-alpha has a length of 76 amino acids in its native form. In fact, that extends to the inhibitory Effect-relevant region of the primary sequence of amino acids 14 to 22, so that shortened (“truncated") forms of protein kinase inhibitors, in particular PKI-alpha, can also be used according to the invention.
  • PKI-alpha whose Sequence is limited to amino acids 14 to 22 of the complete amino acid sequence
  • This shortened PKI-alpha is membrane-permeable or membrane-permeable, ie it can enter the intracellular space via a cytoplasmic membrane and there the intracellular compartments, in particular the sarcoplasmic reticulum and the protein kinase A, PKI-alpha and in particular a shortened form and especially amino acids 14 to 22 of the complete primary sequence of the PKI-alpha, as shown in SEQ ID No. 1 or SEQ ID No.2, can thus achieve an intracoronary, intraperitoneal form or given intravenously.
  • PKI-alpha and its inhibitor can be present in modified form. Such a modification can take place, for example, in connection with the requirements of galenics. Other modifications can affect the pharmacological and toxicological properties.
  • Formulations comprising PKI-alpha or an inhibitor thereof may include the usual pharmaceutical excipients and ingredients such as pharmaceutically acceptable carriers and buffers.
  • Beta blockers i.e. Beta-antagonists, and thus PKI-alpha and their derivatives according to the invention, are used, for example, as or for
  • Antiarrhythmic drugs (irregular heartbeat)
  • Anti-anginal drugs angina pectoris
  • Improvement of the prognosis in patients with myocardial infarction post-infarct medication
  • acute myocardial infarction and prophylaxis of the pure infarct
  • Glaucoma on the eye (Glaucoma simplex)
  • an inhibitor of PKI-alpha (hereinafter also referred to as PKI-alpha-1) is based in turn on the surprising finding that PKI-alpha has a concentration-dependent, inotropic effect and is involved in beta-adrenergic signal transduction.
  • an inhibitor of PKI-alpha can modify and reverse the effects of PKI-alpha.
  • an inhibitor of PKI-alpha can be used to increase blood pressure or a suitable medication.
  • the inhibitor of PKI-alpha After the inhibitor of PKI-alpha has been inhibited by an inhibitor of the beta adrenergic signal transmission, it acts as a beta agonist and can be used accordingly.
  • This use generally includes the use in the manufacture of a medicament for the treatment and prevention of diseases in which beta-agonists can be used: thus an inhibitor of PKI-alpha can be used in medication in addition to the beta-agonist (s) previously used become. Basically, there are no restrictions, so that the PKI-alpha inhibitor now provides a replacement for any medicament containing a beta-agonist as active pharmaceutical ingredient.
  • inhibitor of PKI-alpha is based on a functional definition.
  • An inhibitor of PKI-alpha is thus any compound which inhibits the action of PKI-alpha, irrelevant to what extent the inhibition of PKI-alpha takes place, to which chemical compound class the inhibitor of PKI-alpha can be assigned and on based on what mechanism the PKI-alpha inhibitor works.
  • a mechanism that can be the basis of the action of an inhibitor of PKI-alpha is the inhibition of the transcription of PKI-alpha.
  • the gene product of the second open reading frame of the PKI-alpha gene acts as an inhibitor in this sense. It appears from Wang X. et al .; that the gene product can be the active agent. Mol Pharm 54, 514-524 (1998).
  • the amino acid sequence of this human gene product was
  • the corresponding pork sequence is Met Trp lle Phe Val Ser Asn Asp
  • the difference between the two types of humans and pigs in the form of an amino acid exchange at position 5 of the amino acid sequence is based on an exchange at the nucleic acid level, with position 2 of the fifth codon being changed.
  • glycine is found as the fifth amino acid, whereas in the case of the pig sequence it is valine.
  • the corresponding base exchange is a change from G (human) to T (pig).
  • Beta agonists and thus inhibitors of PKI-alpha, as disclosed herein, can be used for
  • the methods according to the invention are methods by means of which compounds are determined or provided which are known as PKI-alpha, i.e. can be used as inhibitors of protein kinase A or as inhibitors thereof, in particular in connection with one or more of the diseases or indication fields disclosed herein.
  • the methods can also be directed to the fact that one or more of a number of compounds should be determined with a corresponding property (“screening”).
  • Screening A compound which may have a corresponding property is also referred to herein as "Candidate" connection referred to.
  • the receptor provided can be present as an isolated molecule, for example in solution or immobilized.
  • a biological system can be an in vitro system or an in vivo system.
  • a typical in vitro system is a translation or transcription system.
  • a typical in vivo system is a cellular system, for example a cell, in particular a myocardial or nerve cell, which contains the genetic information for PKI-alpha.
  • a cellular system can also be a cell into which, preferably by means of genetic engineering methods, a nucleic acid coding for PKI-alpha or a part thereof or its or its expression controlling nucleic acid is introduced.
  • a nucleic acid coding for PKI-alpha or a part thereof or its or its expression controlling nucleic acid is introduced.
  • the stress inducibility of PKI-alpha which is also disclosed here.
  • the effectiveness of a candidate antagonist is assessed on the basis of a comparison of the activity of PKI-alpha and its derivatives, as described herein.
  • the method according to the invention can also provide that a beta agonist as described herein is used.
  • the beta-agonist provided can be present as an isolated molecule, for example in solution or immobilized.
  • the candidate agonist is present in a biological system.
  • a biological system can be an in vitro system or an in vivo system.
  • a typical in vitro system is typically a cell-free translation or transcription system.
  • a typical in vivo system is a cellular system, for example a cell, in particular a myocardial or nerve cell, which contains the genetic information for the candidate beta-agonist.
  • a cellular system can also be a cell into which, preferably by means of genetic engineering methods, the nucleic acid coding for the candidate beta-agonist or a part thereof or its or its expression controlling nucleic acid is introduced.
  • the transcription system for a beta-antagonist used in the process according to the invention can be an in vivo system or an in vitro system.
  • a typical in vitro system is a translation or transcription system.
  • a typical in vivo system is a cellular system, for example a cell, in particular a myocardial or nerve cell, which contains the genetic information for PKI-alpha.
  • the cellular system can also be a cell into which, preferably by means of genetic engineering methods, the nucleic acid coding for PKI-alpha or a part thereof or its or its expression-controlling nucleic acid is introduced.
  • use can be made of the stress inducibility of PKI-alpha, which is also disclosed here.
  • the transcription system for a beta-antagonist also includes the candidate beta-agonist or the nucleic acid coding for it or controlling its expression.
  • beta-antagonists and beta-agonists as disclosed and described herein or that can be determined or determined as such by one of the methods disclosed herein are used therein.
  • the effectiveness of a candidate beta agonist is assessed on the basis of a comparison of the change in the transcription of the beta antagonist observed under the influence of the candidate beta agonist with that under the influence of a beta -Agonists, as described herein, observed changes in beta antagonist transcription.
  • the effectiveness of the tested compounds can be quantified at a very early stage in the screening or development process of novel beta-agonists.
  • Fig. 1 shows the function of protein kinase A and PKI-alpha in beta-adrenergic signal transduction: More precise
  • ßl and ß2 AR Signal transduction cascade of the ßl and ß2 receptors (ßl and ß2 AR) shown that activate the protein kinase A via a, ß and y-G protein subunits as well as the adenylate cyclase (AC) and cAMP increases.
  • the protein kinase A can be inhibited by the PKI-alpha, whereby the effects of the protein kinase A can be antagonized.
  • Protein kinase A phosphorylates in particular phospholamban, which explains the positive inotropic effect.
  • Fig. 2 shows the decrease in the function of the left cardiac ventricle
  • the hearts of a total of six Sprague Dawley rats weighing approximately 300 g were isolated and, as in Schulze et al. (Schulze et al .; Circulation 1990: 959-69). Hemodynamic parameters including contractility, external cardiac work (EHW), coronary artery and aortic flow were recorded approximately 15 minutes after antegrade perfusion. Cell permeable, recombinant PKI-alpha (amino acids 14 to 22, Calbiochem # 476485) was then administered. The compound was infused directly into the atrium cannula using a motor pump.
  • the infusion rate was continually adjusted to the ejection volume (the sum of aortic and coronary flow) and increased at five-minute intervals in order to reach the final PKI-alpha concentrations in the perfusate of 0.5, 1.0 and 2.0 ⁇ mol / l.
  • the results relating to the external heart volume and the course of dp / dt max under these test conditions are shown in FIG. 2.
  • the infusion of the shortened -PKI-alpha caused a pronounced, reversible, concentration-dependent (up to 2 ⁇ mol) depression of the myocardial function, which was comparable to the dysfunction observed after short coronary occlusion.
  • the protein kinase inhibitor-alpha truncated to amino acids 14 to 22, was added to cell cultures of myocytes (e.g. C9H2 cells, available from the American Type Culture Collection) and the activity of protein kinase A was determined. A dose-dependent decrease in activity was found.
  • the 9 amino acid long PKI-alpha inhibitor (the gene product of the second open reading frame of the PKI gene in humans and in pigs) was added to cell cultures of myocytes and the expression of the PKI-alpha and the activity of the protein kinase A were determined. An increase in the activity of the PKA depending on the dose of the PKI-alpha inhibitor was found.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft in einem Aspekt die Verwendung von PKI-alpha und/oder dessen Derivate zur Blutdrucksenkung, als beta-Antagonisten und zur Herstellung eines Medikaments für die Prävention und/oder Behandlung von Krankheiten, bei denen ein beta-Antagonist verwendet werden kann. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Inhibitors von PKI-alpha oder eines Derivates davon zur Blutdruckerhöhung, als beta-Agonist und zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, bei denen ein beta-Agonist verwendet werden kann.

Description

Verwendung von Proteinkinase-Inhibitor-alpha
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Proteinkinase-lnhibitor- alpha (PKI-alpha), die Verwendung von Inhibitoren von Proteinkinase- Inhibitor-alpha und Verfahren zum Screenen auf beta-Agonisten und beta- Antagonisten.
Im Jahre 1975 wurde erstmals das Phänomen des „myocardial stunning" beschrieben. Darunter versteht man die Eigenschaft des Myokards, nach kurzzeitiger Ischämie infolge koronarer Okklusionen eine lang anhaltende, reversible myokardiale Dysfunktion zu zeigen, d.h. der Herzmuskel zeigt nicht die erwartete Kontraktilität. Dieser reversible Zustand hält für mehrere Stunden an und widersprach der bis dahin in der Fachwelt verbreiteten Auffassung, daß ein ischämischer Zustand von mehr als 45 Minuten unwiderruflich mit einem Absterben der Myozyten einhergeht.
Als Pathogenitätsmechanismus für das „myocardial stunning" wurde die Bildung von Sauerstoffradikalen, Kalziumüberladung, Dysfunktion des sarkoplasmatischen Reticulums und Troponin-Proteolyse diskutiert (Bolli; Mechanism of myocardial „stunning". Circulation 1990: 723-38; und Wijns, Vatner, Camici. Hibernating myocardium. New England Journal of medicine. 1998. 173 - 81). Jeder dieser Mechanismen ist jedoch nicht geeignet, das Phänomen vollständig zu beschreiben (Duncker et al.; Myocardial stunning remainig questions. Cardiovasc Res 1998; 38: 549 - 558).
Die im Herz vorhandene Proteinkinase A (fortan auch als PKA bezeichnet), die die myokardiale Kontraktilität vermittels Phospholamban und Phosphorylierung von Troponin I reguliert, wird durch Rezeptoren gesteuert, die an die Adenylatcyclase gekoppelt sind, die wiederum durch Katecholamine reguliert wird. Die Enzymaktivität wird sowohl durch Proteinkinase-Inhibitoren (hierin im folgenden als PKI bezeichnet) als auch durch cAMP reguliert. Im Herz finden sich zwei Formen von Proteinkinase- Inhibitoren: Die alpha- und die beta-Form (PKI-alpha und PKI-beta). Beide wirken als kompetitive Inhibitoren, indem die Cα- und Cß-Untereinheiten der aktiven Proteinkinase A blockiert werden. Dabei ist die α-Form sechsmal wirksamer als die ß-Form.
Ein im Stand der Technik bekannter Proteinkinase-Inhibitor ist der Proteinkinase-Inhibitor alpha (hierin auch als PKI-alpha bezeichnet). PKI- alpha weist eine Länge von 76 Aminosäure auf, wobei der für die inhibitorische Wirkung wesentliche Teil der Primärsequenz auf den Bereich der Aminosäuren 14 bis 22 beschränkt zu sein scheint. Diese Sequenz ist beim Menschen, Schwein, Hühnchen, Ratte und Maus zu 100 % identisch. Auf der Eben der mRNA zeigt das 5'-Ende der gesamten mRNA vom Schwein eine Sequenzhomologie von etwa 90 % verglichen mit derjenigen des Genoms vom Menschen, der Maus, der Ratte und dem Hühnchen. Ein rekombinanter PKI-alpha umfassend nur die Aminosäuren 14 bis 22 der vollständigen PKI-alpha-Aminosäuresequenz ist zellpermeabel und von Calbiochem erhältlich (Produktnummer # 476485).
Die für PKI-alpha codierende cDNA vom Schwein weist an seinem 5'- Ende einen zweiten offenen Leserahmen, der für ein Polypeptid mit 9 Aminosäuren codiert, und mehrere verschiedene poly(A)-Signalsequenzen an seinem 3'- Ende auf (GenBank #bankit256111 AF132737)
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Verwendungen für PKI-alpha und für einen Inhibitor von PKI-alpha bereitzustellen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch die Verwendung von PKI- alpha und/oder dessen Derivaten zur Blutdrucksenkung.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung von PKI-alpha und/oder dessen Derivaten als beta-Antagonist. ln einem noch weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe gelöst durch die Verwendung von PKI-alpha und/oder dessen Derivate zur Herstellung eines Medikamentes für die Prävention und/oder Behandlung von Krankheiten, bei denen ein beta-Antagonist verwendet werden kann.
Bei den erfindungsgemäßen Verwendung kann vorgesehen sein, daß der PKI- alpha eine in SEQ ID No. 2 dargestellte Aminosäuresequenz umfaßt.
In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendungen wird der PKI-alpha codiert von einer Nukleinsäure, die der codierenden Sequenz der in SEQ ID No. 1 dargestellten Sequenz oder einer sich daraus infolge der Degeneriertheit des genetischen Codes ergebenden oder einer daran hybridisierenden Nukleinsäure entspricht.
Bei den erfindungsgemäßen Verwendungen kann auch vorgesehen sein, daß der PKI-alpha in einer verkürzten Form verwendet wird.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendungen kann vorgesehen sein, daß der PKI-alpha die Aminosäuren 14 bis 22 der PKI-alpha-Sequenz, insbesondere der Sequenz von PKI-alpha nach SEQ ID No.1 oder SEQ ID No. 2 umfaßt.
In besonders bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verwendungen ist vorgesehen, daß der PKI-alpha oder dessen Derivat zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten verwendet, wird, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die Herzrhythmusstörungen, hyperkinetisches Herzsyndrom, Angina pectoris, Myokardinfarkt, akuter Myokardinfarkt, Herzinsuffizienz, arterieller Hypertonus, essentielle und renale Hypertonie, Pfortaderhochdruck, Blutungen aus Oesophagusvarizen, Phäochromozytom, Überdosierung von beta-Sympathomimetika und Cholinrezeptoren-Blockem, Glaucoma simplex, Hyperthyreose, Thyreotoxikose, Migräne, essentieller Tremor, Erregungstremor und Alkohol- Entzugssyndrom umfaßt. ln weiteren besonders bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verwendungen ist vorgesehen, daß der PKI-alpha oder dessen Derivat zur Postinfarkt-Medikation, Prophylaxe der Reinfarktes und/oder als Beruhigungsmittel verwendet wird.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe auch dadurch gelöst, durch die Verwendung eines Inhibitors von PKI-alpha oder eines Derivates davon zur Blutdruckerhöhung.
In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch die Verwendung eines Inhibitors des PKI-alpha oder eines Derivates davon als beta-Agonist.
In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch die Verwendung eines Inhibitors des PKI-alpha oder eines Derivates davon zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, bei denen ein beta-Agonist verwendet werden kann.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendungen ist dabei vorgesehen, daß der Inhibitor die Transkription des PKI-alpha beeinflußt.
Bei den erfindungsgemäßen Verwendung kann weiter vorgesehen sein, daß der PKI-alpha ein PKI-alpha ist, wie er hierin beschrieben ist.
In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendungen ist vorgesehen, daß der Inhibitor des PKI-alpha eine Aminosäuresequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Sequenzen mit der SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 4 umfaßt.
Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen
Verwendungen ist vorgesehen, daß der Inhibitor des PKI-alpha zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten verwendet wird, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die Herzinsuffizienz, Herzinfarkt, chronische und akute Herzinsuffizienz und Hypotonie umfaßt. ln einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Screenen auf Mittel zur Blutdrucksenkung, beta-Antagonisten und/oder Mitteln zur Behandlung und/oder Prävention von
Krankheiten, bei denen ein beta-Antagonist verwendet werden kann, wobei vorgesehen ist, daß
eine Mischung aus einem beta-Rezeptor, einem beta-Agonisten des beta-Rezeptors und einem Kandidaten-beta-Antagonisten bereitgestellt wird, und
bestimmt wird, inwieweit sich durch den Kandidaten-beta- Antagonisten das Bindungsverhalten des beta-Agonisten an den beta-Rezeptor ändert.
In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, daß die unter dem Einfluß des Kandidaten-beta-Antagonisten beobachtete Änderung des Bindungsverhaltens des beta-Agonisten an den beta-Rezeptor verglichen wird mit der unter dem Einfluß des beta-Antagonisten, wie er hierin beschrieben ist, beobachteten Änderung des Bindungsverhaltens des beta- Agonisten an den beta-Rezeptor.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, daß der beta-Rezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe, die betal- und beta2-Rezeptoren umfaßt.
In einer noch weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, daß der beta-Agonist ein Sympathomimetikum ist, insbesondere ein solches, das ausgewählte ist aus der Gruppe, die Noradrenalin, Adrenalin, Dopamin und Dobutamin umfaßt.
Schließlich kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgesehen sein, daß der beta-Agonist ein beta-Agonist ist, wie er hierin beschrieben ist. ln einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zum Screenen auf Mittel zur Blutdrucksenkung, beta-Agonisten und/oder Mittel zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, bei denen ein beta-Agonist verwendet werden kann, wobei
- ein Transkriptionssystem für einen beta-Antagonisten bereitgestellt wird,
ein Kandidaten-beta-Agonist dem Transkriptionssystem zugesetzt wird und
bestimmt wird, inwieweit sich durch den beta-Agonisten die Transkription für den beta-Antagonisten ändert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, daß die unter dem Einfluß des Kandidaten-beta-Agonisten beobachtete Änderung der Transkription des beta-Antagonisten verglichen wird mit der unter dem Einfluß des beta-Agonisten, wie er hierin beschrieben ist, beobachteten Änderung der Transkription des beta-Antagonisten.
In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens ist vorgesehen, daß der beta-Antagonist ein solcher ist, wie er hierin beschrieben ist.
In einer noch weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, daß der beta-Antagonist erhältlich ist nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren.
Der vorliegenden Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, daß PKI-alpha eine negative inotrope, d.h. eine die Myocardfunktion verschlechternde Wirkung aufweist. Diese Wirkung kommt über eine Hemmung der Proteinkinase A zustande, die für die Phosphorylierung von Phospholamban und Troponin verantwortlich ist (sog. beta-adrenerge Signaltransduktion). Infolge der negativen inotropen Wirkung von PKI-alpha wird umgekehrt durch Hemmung des PKI-alpha die Myokardfunktion, insbesondere bei Herzinsuffizienz, verbessert.
Die erfindungsgemäßen Verwendungen beruhen alle auf der vorstehend beschriebenen Erkenntnis, daß PKI-alpha eine konzentrationsabhängige, negative inotrope Wirkung aufweist, und an der beta-adrenergen Signaltransduktion beteiligt ist. Daraus ergibt sich in einem Aspekt, daß PKI- alpha zur Blutdrucksenkung bzw. zur Herstellung eines Medikamentes hierzu verwendet werden kann. In einem anderen Aspekt ergibt sich daraus, daß PKI-alpha als beta-Antagonist verwendet werden kann. Letzteres liegt darin begründet, daß die Wirkung der Katecholamine bindenden beta-Rezeptoren an der die Kontraktilität regulierenden Proteinkinase A durch die Proteinkinase-Inhibitoren gegengesteuert werden kann, diese somit eine beta- antagonistische Wirkung zeigen.
Infolge der beta-antagonistischen Wirkung des PKI-alpha eignet sich dieser auch zur Herstellung von Medikamenten für die Behandlung von Krankheiten, bei denen allgemein ein beta-Antagonist verwendet wird. Mit anderen Worten: Aufgrund der beta-adrenergen Wirkung von PKI-alpha kann dieser bzw. Derivate hiervon an der Stelle von bzw. in Ergänzung zu dem bzw. den bisher verwendeten beta-Antagonisten in Medikamenten verwendet werden. Grundsätzlich bestehen dabei keinerlei Einschränkungen, so daß mit PKI- alpha bzw. mit einem diesen enthaltenden Medikament nun ein Ersatz für ein jegliches, einen beta-Antagonisten als pharmazeutischen Wirkstoff enthaltendes Medikament bereitgestellt wird.
Da der PKI-alpha nicht nur im Muskelgewebe, sondern auch in Nervengewebe, insbesondere im Gehirn, exprimiert wird, sind auch insbesondere neurophysiologische Indikationsfelder für den PKI-alpha und Inhibitoren desselben im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Beispielhaft sei hier auf Migräne verwiesen, zu deren Therapie beta-Antagonisten verwendet werden, die erfindungsgemäß durch PKI-alpha ersetzt werden können. Es ergibt sich für den Fachmann, daß ein jegliches Gewebe, das PKI-alpha exprimiert und pathologische oder geänderte Zustände ausbildet, erfindungsgemäß mit PKI-alpha und Inhibitoren desselben therapeutisch oder präventiv behandelt werden kann.
Mit den erfindungsgemäßen Verwendungen ergeben sich eine Reihe von Vorteilen. So wird mit der Verwendung des PKI-alpha und eines Inhibitors desselben die Gruppe der pharmazeutisch wirksamen Verbindungen erheblich erweitert, insbesondere insoweit, als daß eine vollständig neue Klasse von Verbindungen in diesen therapeutisch sehr wichtigen Indikationsgebiet eingeführt wird. Darüber hinaus ist die Verwendung von PKI- alpha und Inhibitoren davon auch insoweit von Vorteil, als daß sie sehr früh in der Kaskade der beta-adrenergen Signaltransduktion ansetzen und somit nicht der unerwünschten und mit vielfältigen Nachteilen verbundenen Down- Regulation der beta-Rezeptoren unterliegen. Diese Vorteile werden im folgenden anhand der Herzinsuffizienz weiter erläutert werden.
Die Herzinsuffizienz gehört in den westlichen Industriestaaten durch seine hohe Prävalenz (1-1,5 %) und Morbidität der erwachsenen Bevölkerung sowie seine entsprechend hohen Kosten zu den wichtigsten Erkrankungen (Sharpe N. et al.; Lancet 352 (suppi I), 3 - 7 (1998)). Zu ihrer Therapie werden eine Reihe von Medikamenten eingesetzt, von denen jedoch nur wenige wirklich, d. h. auch auf viele Jahre hinaus, effektiv sind. Hierzu zählen vor allem ß- blockierende Substanzen und ACE-Hemmer (Cleland, J; Lancet 352 (suppi I), 1 - 2 (1998)). Im Gegensatz hierzu sind die weiterhin gebräuchlichen Kalziumantagonisten (z.B. Adalat- Nifedipin) in Verruf geraten (Prescrire Int 7(35), 90 - 91 (1998); und Ishibashi, Y. et al.; Clin Exp Pharmacol Physiol 26(5 - 6), 404-10 (1999)). Vor allem ihre akuten Effekte, die die Mortalität der behandelten Patienten zu erhöhen scheinen, mahnen zur Vorsicht bei Verwendung dieser Medikamente. Im Gegensatz hierzu scheinen ß-Blocker erhebliche Vorteile, insbesondere bezüglich der Mortalität, für die betroffenen Patienten zu haben. Leider wirken diese Medikamente über die ßl- und ß2- Rezeptoren, die der sogenannten down-Regulation unterliegen und deshalb ihren Wirkort verfehlen können (Massie, B.; Lancet 352 (suppi I), 29 - 33 (1998). Es werden deshalb zunehmend Substanzklassen gesucht, die ihren Wirkort weiter oberhalb der ß-adrenergen Signältransduktionskaskade haben. Durch die Hemmung der Proteinkinase A, vor allem durch intracoronare Applikation, scheint der PKI-alpha, insbesondere die Aminosäuren 14-22 davon, in die gewünschte Substanzklasse zu gehören.
In diesem Zusammenhang besonders interessant erscheint daher ein Inhibitor des PKI-alpha, insbeosndere der vom zweiten offenen Leserahmen des PKI- alpha codierte Inhibitor des PKI-alpha (PKI-alpha-l). Es können somit, wie jeweils gewünscht, sowohl die beta-antagonistischen als auch die beta- agonistischen Wirkungen durch die Verwendung von PKI-alpha bzw. eines Inhibitors desselben zur Geltung gebracht werden.
Die Aminosäuresequenz von PKI-alpha ist in SEQ ID No.1 zusammen mit der sie codierenden Nukleinsäuresequenz dargestellt und als Aminosäuresequenz als solches in SEQ ID No. 2. Es ergibt sich für den Fachmann, daß der PKI-alpha nicht auf denjenigen PKI-alpha beschränkt ist, der die als Sequenzen SEQ ID No. 1 und SEQ ID No. 2 dargestellten Sequenzen aufweist. Vielmehr wird unter einem PKI-alpha hierin ein jeglicher die Aktivität der Proteinkinase A beeinflussender Proteinkinase-Inhibitor verstanden. Insoweit wird dem Begriff des Proteinkinase-Inhibitors hierin eine funktioneile Definition zugrunde gelegt.
Infolge der hierin verwendeten funktionellen Definition des Begriffes des Proteinkinase-Inhibitors ist auch die in SEQ ID No.1 dargestellt Nukleinsäuresequenz lediglich ein Beispiel für eine einen Proteinkinase- Inhibitor codierende Sequenz. Andere Sequenzen ergeben sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes.
Der Proteinkinase-lnhibitor-alpha weist in seiner nativen Form eine Länge von 76 Aminosäuren auf. Tatsächlich erstreckt sich der für die inhibitorische Wirkung relevante Bereich der Primärsequenz von Aminosäure 14 bis 22, so daß auch verkürzte („trunkierte") Formen von Proteinkinase-Inhibitoren, insbesondere von PKI-alpha, erfindungsgemäß verwendet werden können. Von besonderem Vorteil erscheint dabei die Verwendung von PKI-alpha, dessen Sequenz auf die Aminosäuren 14 bis 22 der vollständigen Aminosäuresequenz beschränkt ist. Dieser verkürzte PKI-alpha ist membrangängig oder membranpermeabel, d.h. er kann über eine cytoplasmatische Membran in den intrazellulären Raum gelangen und dort die intrazellulären Kompartimente, insbesondere das sarkoplasmatische Retikulum und die Proteinkinase A, erreichen. Somit kann PKI-alpha und insbesondere eine verkürzte Form und ganz besonders die die Aminosäuren 14 bis 22 der vollständigen Primärsequenz des PKI-alpha, wie dargestellt in SEQ ID No. 1 oder SEQ ID No.2, umfassende verkürzte Form intrakoronar, intraperitoneal oder auch intravenös gegeben werden.
Dabei ist es im Rahmen der Fähigkeiten des Fachmannes, daß PKI-alpha ebenso wie dessen Inhibitor in modifizierter Form vorliegen kann. Eine derartige Modifizierung kann bspw. im Zusammenhang mit den Erfordernissen der Galenik erfolgen. Andere Modifizierungen können die pharmakologischen und toxikologischen Eigenschaften betreffen.
Formulierungen, die PKI-alpha oder einen Inhibitor desselben umfassen, können die üblichen galenischen Hilfsstoffe und Bestandteile umfassen, wie pharmazeutisch akzeptable Träger und Puffer.
Beta-Blocker, d.h. beta-Antagonisten, und damit erfindungsgemäß PKI-alpha und dessen Derivate finden bspw. Anwendungen als bzw. zur bzw. bei
1. Antiarrhythmika (Herzrhythmusstörungen)
2. Hyperkinetisches Herzsyndrom
3. Antianginöse Medikamente (Angina pectoris) 4. Verbesserung der Prognose bei Patienten mit Myokardinfarkt (Postinfarkt-Medikation), akuter Myokardinfarkt und Prophylaxe des Reinfarktes
5. Therapie bei Herzinsuffizienz
6. Antihypertensiva (arterieller Hypertonus, essentielle und renale Hypertonie)
7. Pfortaderhochdruck, Blutungen aus Oesophagusvarizen
8. Phäochromozytom (erst nach vorausgegangener Alpha-Blockade anwendbar)
9. Überdosierung von ß-Sympathomimetika und m cholinozeptorenzeptoren -Blockern
10. Glaukom am Auge (Glaucoma simplex)
11. Hyperthyreose und Thyreotoxikose
12. Therapie zentralnervöser Erkrankungen wie bspw. Migräne und als Beruhigungsmittel (zentral dämpfender Effekt) (essentieller Tremor,
Erregungstremor, Alkohol-Entzugssyndrom)
Die erfindungsgemäße Verwendung eine Inhibitors des PKI-alpha (hierin im folgenden auch als PKI-alpha-l bezeichnet) beruht wiederum auf der überraschenden Erkenntnis, daß PKI-alpha eine konzentrationsabhängige, inotrope Wirkung besitzt und an der beta-adrenergen Signaltransduktion beteiligt ist. Im Lichte dieser Eigenschaften von PKI-alpha kann ein Inhibitor von PKI-alpha zu einer Modifizierung und Umkehr der Wirkungen von PKI- alpha führen. Infolge dessen kann ein Inhibitor von PKI-alpha zur Blutdruckerhöhung bzw. eines hierfür geeigneten Medikamentes verwendet werden. Nachdem der Inhibitor von PKI-alpha auf einen Inhibitor der beta- adrenergen Signalübertragung einwirkt, agiert er selbst als beta-Agonist und kann entsprechend verwendet werden. Diese Verwendung umfaßt allgemein die Verwendung zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung und Prävention von Krankheiten, bei denen beta-Agonisten verwendet werden können: Somit kann ein Inhibitor von PKI-alpha in Ergänzung zu dem bzw. den bisher verwendeten beta-Agonisten in Medikamenten verwendet werden. Grundsätzlich bestehen dabei keinerlei Einschränkungen, so daß mit dem Inhibitor von PKI-alpha nun ein Ersatz für ein jegliches, einen beta-Agonisten als pharmazeutischen Wirkstoff enthaltendes Medikament bereitgestellt wird.
Dem Begriff des Inhibitors von PKI-alpha liegt dabei wiederum eine funktionelle Definition zugrunde. Ein Inhibitor von PKI-alpha ist somit eine jegliche Verbindung, die die Wirkung von PKI-alpha inhibiert, wobei unerheblich ist, in welchem Maße die Inhibierung des PKI-alpha erfolgt, welcher chemischen Verbindungsklasse der Inhibitor des PKI-alpha zugeordnet werden kann und auf der Grundlage welches Mechanismus der Inhibitor von PKI-alpha seine Wirkung entfaltet.
Ein Mechansimus, der der Wirkung eine Inhibitors von PKI-alpha zugrunde liegen kann, ist die Inhibierung der Transkription von PKI-alpha. Als Inhibitor in diesem Sinne wirkt bspw. das Genprodukt des zweiten offenen Leserahmens des PKI-alpha-Gens. Daß dabei das Genprodukt das aktive Agens sein kann, scheint sich aus Wang X. et al.; Mol Pharm 54, 514-524 (1998) zu ergeben. Die Aminosäuresequenz dieses Genproduktes vom Menschen lautete
Met Trp He Phe Gly Ser Asn Asp
und ist als SEQ ID No. 3 zusammen mit der sie codierenden Nukleinsäuresequenz hierin aufgenommen.
Die korrespondierende Sequenz vom Schwein lautet Met Trp lle Phe Val Ser Asn Asp
und ist als SEQ ID No. 4 zusammen mit der sie codierenden Nukleinsäuresequenz hierin aufgenommen.
Der zwischen den beiden Arten Mensch und Schwein bestehende Unterschied in Form eines Aminosäureaustausches an der Position 5 der Aminosäuresequenz beruht auf einem Austausch auf Ebene der Nukleinsäure, wobei Position 2 des fünften Codons geändert ist. Im Falle der Sequenz beim Menschen findet sich Glycin als fünfte Aminosäure, wohingegen diese im Falle der Sequenz vom Schwein Valin ist. Der hierzu korrespondierende Basenaustausch ist eine Änderung von G (human) zu T (Schwein).
Für den Fachmann ist offensichtlich, daß Abweichungen von den in SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 4 offenbarten Sequenzen möglich sind, so lange das von den Sequenzen abgeleitete Derivat nach wie vor eine für PKI-alpha, insbesonder dessen Transkription, inhibitorische Wirkung aufweist.
Beta-Agonisten und damit Inhibitoren von PKI-alpha, wie hierin offenbart, können verwendet werde zur bzw. bei
1. Erhöhung der Kontraktilität des Myokards (wünschenswert bei schwerer Herzinsuffizienz oder bei Herzinfarktpatienten (chronische Herzinsuffizienz und akute Herzinsuffizienz)
2. Hypotonie
Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß die erfindungsgemäßen Verwendungen im Rahmen von therapeutischen und präventiven Behandfungen eingesetzt werden können, insbesondere an Personen, die einer solchen Behandlung bedürfen.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um Verfahren, mittels derer Verbindungen ermittelt bzw. bereitgestellt werden, die als PKI-alpha, d.h. als Inhibitoren der Proteinkinase A bzw. als Inhibitoren derselben verwendet werden können, insbesondere im Zusammenhang mit einem oder mehreren der hierin offenbarten Krankheiten oder Indikationsfelder. Dabei können die Verfahren auch darauf gerichtet sein, daß ausgehend von einer Vielzahl von Verbindungen eine oder mehrere daraus mit einer entsprechenden Eigenschaft ermittelt werden soll(en) („Screenen"). Eine Verbindung, die möglicherweise eine entsprechende Eigenschaft aufweist, wird hierin auch als „Kandidaten"- Verbindung bezeichnet.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung bzw. zum Screenen einer im weitesten Sinne beta-antagonistisch wirkenden Verbindung kann der bereitgestellte Rezeptor als isoliertes Molekül, bspw. in Lösung oder immobilisiert, vorliegen. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, daß der Rezeptor in einem biologischen System vorliegt. Ein derartiges biologisches kann ein in vitro System oder ein in vivo System sein. Ein typisches in vitro System ist dabei ein Translations- oder Transkriptionssystem. Ein typisches in vivo System ist dabei ein zelluläres System, bspw. eine Zelle, insbesondere eine Myokard- oder Nervenzelle, die die genetische Information für PKI-alpha enthält. Ein zelluläres System kann aber auch eine Zelle sein, in die, bevorzugterweise mittels gentechnologischer Methoden, eine für PKI-alpha oder einen Teil davon codierende Nukleinsäure oder dessen bzw. deren Expression steuernde Nukleinsäure eingeführt ist. Bei der Verwendung der in vivo und in vitro Systeme kann dabei von der hierin ebenfalls offenbarten Stressinduzierbarkeit des PKI-alpha Gebrauch gemacht werden. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann weiterhin vorgesehen sein, daß die Wirksamkeit eines Kandidaten-Antagonisten bewertet wird auf der Grundlage eines Vergleiches der Wirkung von PKI-alpha und seinen Derivaten, wie sie hierin beschrieben sind. Dadurch kann bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt des Screenens bzw. des Entwicklungsprozesses neuartiger beta-Antagonisten und beta-Agonisten eine Quantifizierung der Wirksamkeit der getesteten Verbindungen erfolgen. Dabei kann das erfindungsgemäße Verfahren auch vorsehen, daß ein beta-Agonist, wie er hierin beschrieben ist, verwendet wird.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung bzw. zum Screenen einer im weitesten Sinne beta-agonistisch wirkenden Verbindung kann der bereitgestellte beta-Agonist als isoliertes Molekül, bspw. in Lösung oder immobilisiert, vorliegen. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, daß der Kandidaten-Agonist in einem biologischen System vorliegt. Ein derartiges biologisches System kann ein in vitro System oder ein in vivo System sein. Ein typisches in vitro System ist dabei typischerweise ein zellfreies Translations- oder Transkriptionssystem. Ein typisches in vivo System ist dabei ein zelluläres System, bspw. eine Zelle, insbesondere eine Myokard- oder Nervenzelle, die die genetische Information für den Kandidaten-beta-Agonisten enthält. Ein zelluläres System kann aber auch eine Zelle sein, in die, bevorzugterweise mittels gentechnologischer Methoden, die für den Kandidaten-beta-Agonisten oder einen Teil davon codierende Nukleinsäure oder dessen bzw. deren Expression steuernde Nukleinsäure eingeführt ist.
Das im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Transkriptionssystem für einen beta-Antagonisten kann dabei ein in vivo System oder ein in vitro System sein. Ein typisches in vitro System ist dabei ein Translations- oder Transkriptionssystem. Ein typisches in vivo System ist dabei ein zelluläres System, bspw. eine Zelle, insbesondere eine Myokard- oder Nervenzelle, die die genetische Information für PKI-alpha enthält. Ein zelluläres System kann aber auch eine Zelle sein, in die, bevorzugterweise mittels gentechnologischer Methoden, die für PKI-alpha oder einen Teil davon codierende Nukleinsäure oder dessen bzw. deren Expression steuernde Nukleinsäure eingeführt ist. Bei der Verwendung der in vivo und in vitro Systeme kann dabei von der hierin ebenfalls offenbarten Stressinduzierbarkeit des PKI-alpha Gebrauch gemacht werden.
Es ist auch im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren, daß das Transkriptionssystem für einen beta-Antagonisten auch den Kandidaten-beta- Agonisten bzw. die für ihn codierende oder dessen Expression steuernde Nukleinsäure umfaßt. Des weiteren ist es im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren, daß beta-Antagonisten und beta-Agonisten, wie sie hierin offenbart und beschrieben sind bzw. nach einem der hierin offenbarten Verfahren ermittelt oder als solche bestimmt werden können, darin verwendet werden.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann weiterhin vorgesehen sein, daß die Wirksamkeit eines Kandidaten-beta-Agonisten bewertet wird auf der Grundlage eines Vergleiches der unter dem Einfluß des Kandidaten-beta- Agonisten beobachteten Änderung der Transkription des beta-Antagonisten mit der unter dem Einfluß eines beta-Agonisten, wie er hierin beschrieben ist, beobachteten Änderung der Transkription des beta-Antagonisten. Dadurch kann bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt des Screenens bzw. des Entwicklungsprozesses neuartiger beta-Agonisten eine Quantifizierung der Wirksamkeit der getesteten Verbindungen erfolgen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Figuren, Beispiele und das Sequenzprotokoll weiter veranschaulicht werden, woraus sich weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben können. Dabei zeigt:
Fig. 1 die Funktion der Proteinkinase A und des PKI-alpha bei der beta-adrenergen Signaltransduktion: Genauer ist die
Signaltransduktionskaskade der ßl- und ß2-Rezeptoren (ßl und ß2 AR) gezeigt, die über a-, ß- und y- G-Protein-Untereinheiten sowie die Adenylatcyclase (AC) und cAMP-Erhöhungen die Proteinkinase A aktivieren. Die Proteinkinase A kann durch den PKI-alpha inhibiert werden, wodurch die Effekte der Proteinkinase A antagonisiert werden können. Die Proteinkinase A phosphoryliert insbesondere Phospholamban, wodurch die positiv inotrope Wirkung erklärt werden kann.
Fig. 2 die Abnahme der Funktion des linken Herzventrikels nach
Verabreichung von PKI-alpha ausgedrückt als dp/dt und externe Herzarbeit (EHW).
BEISPIELE
Beispiel ^Untersuchungen zur Wirkung von PKI-alpha an einem arbeitenden Rattenherz
Die Herzen von insgesamt sechs Sprague Dawley - Ratten mit einem Gewicht von etwa 300 g wurden isoliert und wie bei Schulze et al. (Schulze et al.; Circulation 1990: 959-69) beschrieben perfundiert. Die hämodynamischen Parameter einschließlich Kontraktilität, externe Herzarbeit (EHW), Koronarund Aortenfluß, wurden etwa 15 Minuten nach antegrader Perfusion aufgezeichnet. Zellpermeabler, rekombinanter PKI-alpha (Aminosäuren 14 bis 22, Calbiochem # 476485) wurde dann verabreicht. Die Verbindung wurde direkt mittels einer Motorpumpe in die Atriumkanüle infundiert. Die Infusionsgeschwindigkeit wurde dem Auswurfvolumen (der Summe aus Aorta- und Koronarfluß) fortdauernd angepaßt und in fünfminütigen Intervallen erhöht, um die letztendlichen PKI-alpha-Konzentrationen im Perfusat von 0,5 , 1,0 und 2,0 μmol/l zu erreichen. Die Ergebnisse betreffend das externe Herzvolumen und den Verlauf von dp/dtmax unter diesen Versuchsbedingungen sind in Fig. 2 dargestellt. Die Infusion des verkürzten -PKI-alpha verursachte eine ausgeprägte, reversible, konzentrationsabhängige (bis zu 2 μMol) Depression der Myokardfunktion, die vergleichbar war der nach kurzer koronarer Okklusion beobachteten Dysfunktion. Die gemessene Verringerung der externen Herzarbeit und dp/dt-max war im gepaarten T-Test (engl.: „paired t-test") für alle getesteten Konzentrationen signifikant. Die Perfusion mit dem verkürzten PKI-alpha führte zu einer Verringerung der externen Herzarbeit um 43 % und einer Abnahme der linksventrikulären Funktion, ausgedrückt als dp/dt-max, um 53 %.
Aus diesen Untersuchungen ergibt sich, daß die verkürzte Form des PKI- alpha geeignet ist zur Blutdrucksenkung und allgemein zur Verwendung als eine neue Form bzw. Substanzklasse eines beta-Antagonisten.
Beispiel 2: Untersuchungen an Zellkulturen
Auf Zellkulturen von Myozyten (z.B. C9H2-Zellen, zu beziehen von der American Type Culture Collection) wurde der auf die Aminosäuren 14 bis 22 verkürzte Proteinkinase-lnhibitor-alpha gegeben und die Aktivität der Proteinkinase A bestimmt. Es wurde eine dosisabhängige Abnahme der Aktivität festgestellt.
Auf Zellkulturen von Myozyten wurde der 9 Aminosäuren lange PKI-alpha- Inhibitor (das Genprodukt des zweiten offenen Leserahmens der PKI-Gens beim Menschen und beim Schwein) gegeben und die Expression des PKI- alpha sowie die Aktivität der Proteinkinase A bestimmt. Es wurde eine von der Dosis des PKI-alpha-lnhibitors abhängige Zunahme der Aktivität der PKA festgestellt.
Zellkulturen von Myozyten wurden mit einem Expressionsplasmid mit der Sequenz von PKI-alpha, wie bspw. beschrieben bei Olsen (Olsen et al.; Endocrinology 5; 1246 - 1256 (1991)) transfiziert und die Expression des PKI- alpha bestimmt. Gleichzeitig wurde die Aktivität der Proteinkinase A, die spezifisch durch PKI-alpha inhibiert wird, bestimmt. (Proteinkinase A ist sowohl in quergestreiften als auch glatten Muskelzellen enthalten (Wang X. et al.; Mol Pharm 54, 514-524 (1998))). Auf diese Zellkulturen wurden verschiedene Konzentrationen des Proteinkinase-Inhibitor -alpha-lnhibitors (PKI-alpha-l) gegeben. Die Expression des PKI-alpha wurde in Abhängigkeit von der Konzentration des PKI-alpha-lnhibitors verringert.
Die Offenbarung der verschiedenen hierin zitierten Literaturstellen wird hiermit durch Bezugnahme vollständig aufgenommen.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und der Zeichnung offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebigen Kombinationen für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.

Claims

Ansprüche
1. Verwendung von PKI-alpha und/oder dessen Derivaten zur Blutdrucksenkung.
2. Verwendung von PKI-alpha und/oder dessen Derivaten als beta- Antagonist.
3. Verwendung von PKI-alpha und/oder dessen Derivate zur Herstellung eines Medikamentes für die Prävention und/oder Behandlung von Krankheiten, bei denen ein beta-Antagonist verwendet werden kann.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß PKI-alpha eine in SEQ ID No. 2 dargestellte
Aminosäuresequenz umfaßt.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der PKI-alpha codiert wird von einer Nukleinsäure, die der codierenden Sequenz der in SEQ ID No. 1 dargestellten Sequenz oder einer sich daraus infolge der
Degeneriertheit des genetischen Codes ergebenden oder einer daran hybridisierenden Nukleinsäure entspricht.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der PKI-alpha in einer verkürzten Form verwendet wird.
7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der PKI- alpha die Aminosäuren 14 bis 22 der PKI-alpha-Sequenz, insbesondereder Sequenz von PKI-alpha nach SEQ ID No.1 oder SEQ ID No. 2 umfaßt.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der PKI-alpha zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten verwendet, wird, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die Herzrhythmusstörungen, hyperkinetisches Herzsyndrom, Angina pectoris, Myokardinfarkt, akuter Myokardinfarkt, Herzinsuffizienz, arterieller Hypertonus, essentielle und renale Hypertonie, Pfortaderhochdruck, Blutungen aus Oesophagusvarizen,
Phäochromozytom, Überdosierung von beta-Sympathomimetika und Cholinrezeptoren-Blockern, Glaucoma simplex, Hyperthyreose, Thyreotoxikose, Migräne, essentieller Tremor, Erregungstremor und Alkohol-Entzugssyndrom umfaßt.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der PKI-alpha zur Postinfarkt-Medikation, Prophylaxe der Reinfarktes und/oder als Beruhigungsmittel verwendet wird.
10. Verwendung eines Inhibitors von PKI-alpha oder eines Derivates davon zur Blutdruckerhöhung.
11. Verwendung eines Inhibitors des PKI-alpha oder eines Derivates davon als beta-Agonist.
12. Verwendung eines Inhibitors des PKI-alpha oder eines Derivated davon zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, bei denen ein beta-Agonist verwendet werden kann.
13. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor die Transkription des PKI-alpha beeinflußt.
14. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis13, dadurch gekennzeichnet, daß der PKI-alpha ein PKI-alpha nach einem der Ansprüche 1 bis 9 ist.
15. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis14, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor des PKI-alpha eine Aminosäuresequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Sequenzen mit der SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 4 umfaßt.
16. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor des PKI-alpha zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten verwendet wird, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die Herzinsuffizienz, Herzinfarkt, chronische und akute Herzinsuffizienz und Hypotonie umfaßt.
17. Verfahren zum Screenen auf Mittel zur Blutdrucksenkung, beta- Antagonisten und/oder Mitteln zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, bei denen ein beta-Antagonist verwendet werden kann, dadurch gekennzeichnet, daß
eine Mischung aus einem beta-Rezeptor, einem beta-Agonisten des beta-Rezeptors und einem Kandidaten-beta-Antagonisten bereitgestellt wird, und
bestimmt wird, inwieweit sich durch den Kandidaten-beta- Antagonisten das Bindungsverhalten des beta-Agonisten an den beta-Rezeptor ändert.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die unter dem Einfluß des Kandidaten-beta-Antagonisten beobachtete Änderung des Bindungsverhaltens des beta-Agonsiten an den beta-Rezeptor verglichen wird mit der unter dem Einfluß des beta-Antagonisten nach einem der Ansprüche 1 bis 9 beobachteten Änderung des Bindungsverhaltens des beta-Agonisten an den beta-Rezeptor.
19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß der beta-Rezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe, die betal- und beta2-Rezeptoren umfaßt.
0. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß der beta-Agonist ein Sympathomimetikurn ist, insbesondere ein solches, das ausgewählte ist aus der Gruppe, die Noradrenalin, Adrenalin, Dopamin und Dobutamin umfaßt.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß der beta-Agonist ein beta-Agonist nach einem der Ansprüche 10 bis 16 ist.
22. Verfahren zum Screenen auf Mittel zur Blutdrucksenkung, beta- Agonisten und/oder Mittel zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, bei denen ein beta-Agonist verwendet werden kann, dadurch gekennzeichnet, daß
ein Transkriptionssystem für einen beta-Antagonisten bereitgestellt wird,
ein Kandidaten-beta-Agonist dem Transkriptionssystem zugesetzt wird und
bestimmt wird, inwieweit sich durch den beta-Agonisten die Transkription für den beta-Antagonisten ändert.
23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die unter dem Einfluß des Kandidaten-beta-Agonisten beobachtete Änderung der Transkription des beta-Antagonisten verglichen wird mit der unter dem
Einfluß des beta-Agonisten nach einem der Ansprüche 11 bis 16 beobachteten Änderung der Transkription des beta-Antagonisten.
24. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß der beta-Antagonist ein solcher nach einem der Ansprüche 1 bis 9 ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß der beta-Antagonist erhältlich ist nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 21.
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