EP1253914A2 - Verwendung von gangliosiden und anderen substanzen zur modulation von sphingolipid-cholesterin-mikrodomänen - Google Patents

Verwendung von gangliosiden und anderen substanzen zur modulation von sphingolipid-cholesterin-mikrodomänen

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Publication number
EP1253914A2
EP1253914A2 EP00964258A EP00964258A EP1253914A2 EP 1253914 A2 EP1253914 A2 EP 1253914A2 EP 00964258 A EP00964258 A EP 00964258A EP 00964258 A EP00964258 A EP 00964258A EP 1253914 A2 EP1253914 A2 EP 1253914A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cholesterol
gangliosides
microdomains
cells
proteins
Prior art date
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Ceased
Application number
EP00964258A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Mikael Simons
Tim Friedrichson
Kai Simons
Teymuras Kurzchalia
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
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Filing date
Publication date
Application filed by Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV filed Critical Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Publication of EP1253914A2 publication Critical patent/EP1253914A2/de
Ceased legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7032—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a polyol, i.e. compounds having two or more free or esterified hydroxy groups, including the hydroxy group involved in the glycosidic linkage, e.g. monoglucosyldiacylglycerides, lactobionic acid, gangliosides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/575—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids substituted in position 17 beta by a chain of three or more carbon atoms, e.g. cholane, cholestane, ergosterol, sitosterol

Definitions

  • the invention relates to the use of gangliosides and other substances for the preparation of an agent for modulating sphingolipid cholesterol Mi domains.
  • Sphingolipid-cholesterol microdomains which are also called sphingolipid-cholesterol rafts, are lateral arrangements of specific lipids, in particular sphingolipids including gangliosides and cholesterol, and proteins in cell membranes (K. Simons et al., Nature, Vol. 387 (1,997), 569-572; T. Friedrichson et al., Nature, Vol. 394 (1,998), 802-805). They are small and highly dynamic structures that are formed by the attractive forces between sphingolipids and cholesterol.
  • GPI-APs glycosyl-phosphatidyl anchor proteins
  • Src family kinases proteins associated with the sphingolipid-choiesterin rafts
  • HA influenza virus hemagglutinin
  • caveolin-1 proteins associated with the sphingolipid-choiesterin rafts
  • Most of the proteins associated with the sphingolipid-choiesterin rafts contain post-translational lipid modifications, with GPI-anchored proteins anchored in the cell membrane via a lipid unit, whereas kinases of the Src family, NO synthases (NOS), HA and caveolin are acylated
  • the proteins associated with the rafts are usually poorly soluble in cold, non-ionic detergents such as Triton X-100, which may be due to their lipophilic nature.
  • Triton-insoluble complexes have been defined in terms of their function as rafts that are specifically enriched in certain lipids, particularly sphingolipids including gangliosides, and cholesterol, while other lipids, such as glycerophospholipids, in the Triton extracts selectively absent (Brown et al., Trends Cell Biol. 2 (1,992), 338-343; Fiedler et al., Biochemistry 32 (1,993), 6365-6373).
  • sphingolipid-cholesterol microdomains or rafts in living cells in particular the existence of microdomains of GPI-anchored proteins in living cells, which can be influenced by the administration of cholesterol, has recently been established by a chemical cross-linking approach (Friedrichson et al. , supra) and a fluorescence energy transfer method (Varma et al., Nature 394 (1 998), 798 - 802). It has also been postulated that rafts play an important role in membrane transport and signaling properties as platforms to which proteins can bind.
  • This object is achieved according to the invention by using gangliosides and other substances to produce an agent for modulating sphingolipid-cholesterol microdomains.
  • proteins associated with sphingolipid cholesterol microdomains are present in the microdomains in the form of crosslinked clusters on the surface of living cells.
  • gangliosides and other substances such as cholesterol sulfate, inhibits the crosslinking of proteins associated with the rafts, in particular GPI-anchored, and also increases their solubility in detergents.
  • the administration of gangliosides and other substances thus leads to a change in the structural structure of the microdomains, so that they can be used to modulate sphingolipid-cholesterol microdomains and the processes taking place there.
  • gangliosides and other substances displaces proteins, in particular GPI-anchored proteins, from the sphincolipid-cholesterol microdomains by disrupting the attractive forces between the anchor group and the surrounding lipids.
  • proteins present in the sphingolipid cholesterol microdomains are removed from their lipid environment when gangliosides and other substances are added and are no longer associated with the rafts.
  • GH-DAF growth hormone (GH; growth hormone) linked to the GPI anchor of DAF (Decay accelerating factor)
  • GH-DAF growth hormone
  • DAF Decay accelerating factor
  • GPI-anchored proteins are essentially insoluble in non-ionic detergents (Brown et al., Cell 68 (1 992), 533-544), while a reduction in the cholesterol content in the cells detergent solubility of GPI -APs increased (Cerneus et al., J. Biol. Chem. 268 (1 993), 31 50-31 55; Hanada et al., J.
  • the modulation of the microdomains by the gangliosides is preferably specific and reversible, i.e. when the gangliosides and other substances are removed, the original, unchanged structure of the microdomains is restored.
  • the use of gangliosides therefore preferably influences the localization of proteins on sphingolipid cholesterol microdomains, in particular the localization of anchor proteins, acylated proteins, Src kinases and / or cholesterol or GPI-anchored proteins.
  • the addition of gangliosides changes the arrangement of proteins present in sphingolipid-cholesterol microdomains, which leads to a modulation and / or change in the structure or / and structure of the sphingolipid-cholesterol microdomains. Cluster degradation of the proteins is particularly preferably effected.
  • the gangliosides used according to the invention are preferably selected from bovine brain gangiiosides, GM 1 f GD 1 a, GD 1 b, GD3, GM2, GM3, GQ1 a, GQ1 b or / and globosides.
  • Exogenous gangliosides and their derivatives such as unsaturated sphingosine or ceramide with short or unsaturated fatty acids, which are already part of the sphingolipid-cholesterol microdomains to be treated, are particularly preferably used. Cholesterol sulfate and other cholesterol derivatives can also be used.
  • ganglioside or ganglioside derivatives include in particular glycolipids that occur as building blocks of Zeil membranes in nerve tissue.
  • the gangliosides or ganglioside derivatives preferably contain several monosaccharide units per molecule. Suitable monosaccharide units which may be contained in the gangliosides or ganglioside derivatives are, for example, D-galactose, N-acetyl-D-galactosamine, D-glucose and N-acetyl-neuraminic acid.
  • Gangliosides which are derivatives of sphingosine (2-amino-4-octadecen-1, 3-diol, sphing-4-enyne) are particularly preferred, sugar residues in particular being attached to the C-1 via the oxygen and to the C -2 a short (especially C 2 -C 18 ) fatty acid is bound, which can be saturated or unsaturated. Also preferred are gangliosides, which are a derivative of a ceramide. Ceramides are lipophilic amides of the general formula
  • R 1 is a long-chain fatty acid residue, in particular a C 6 -C 30 -, more preferably a C 8 -C 24 -fatty acid residue
  • R 2 is a long-chain alkyl residue, in particular a C 6 -C 30 -, more preferably a C 8 -C 24 is alkyl
  • R 3 is H.
  • R 3 is preferably replaced by sugar residues (glycosides).
  • ganglioside derivatives preferably include ceramide and its derivatives and related compounds including sphingosines and gangliosides and their derivatives, it also being possible for one of the following functional groups to be substituted or added to the backbone, in particular the ceramide backbone: a halide atom bonded to an alkyl or alkenyl -, alkynyl or aryl, an alcohol group (primary, secondary or tertiary), an ether group, a carbonyl function (e.g.
  • a carboxylic acid group a carboxylic anhydride group, a carbamoyl group, a haloformyl group, a cyano group, an ester group, including a lactone group , a benzyl, phenyl, tolyl, tosyl, a sulfonyl group, an amino group (primary, secondary or tertiary), an isocyanate, a cyanate, a thioisocyanate, a thiocyanate, a carbamate, an azide, a diazo group or a quinone group.
  • oligopeptide comprising two to 20, preferably 8 to 12, in particular 8, 10 or 12, amino acid residues, an oligonucleotide, individual amino acids, monosaccharides, disaccharides or polysaccharides.
  • cholesterol derivatives includes all substances that have been formed by substitution or addition of groups from cholesterol.
  • cholesterol derivatives are understood to be compounds which are formed from cholesterol in only one reaction step and have a close chemical relationship to cholesterol.
  • Cholesterol derivatives include cholesterol sulfate, cholesterol thiosulfate and all cholesterol derivatives where organic
  • Suitable substituted or added groups include: a halide atom attached to an alkyl, alkenyl, alkynyl or aryl group, one
  • Alcohol group (primary, secondary or tertiary), an ether group, a carbonyl function (e.g. aldehyde or ketone), a carboxylic acid group, one
  • Carboxylic acid anhydride group a carbamoyl group, a haloformyl group, a cyano group, an ester group including a lactone group Benzyl, phenyl, tolyl, tosyl, a sulfonyl group, an amino group (primary, secondary or tertiary), an isocyanate, a cyanate, a thioisocyanate, a thiocyanate, a carbamate, an azide, a diazo group or a quinone group.
  • oligopeptide comprising two to 20, preferably 8 to 12, in particular 8, 10 or 12 amino acid residues, an oligonucleotide, individual amino acids, monosaccharides, disaccharides or polysaccharides.
  • Preferred cholesterol derivatives are, for example, cholesterol sulfate and cholesterol molecules which are derivatized on the OH function.
  • the present invention provides a method with which the targeting and processing of the active substances mentioned, i.e. the gangliosides, ganglioside derivatives and cholesterol derivatives, can be followed and observed by adding a detectable group, for example a fluorescent group, to one of the compounds listed above, for example by substitution or addition.
  • a detectable group for example a fluorescent group
  • modulation includes any structural and chemical change in the microdomains, in particular a change in the structural structure and / or in the composition of the individual
  • Cholesterol microdomains in turn, preferably cause a change in the m e m b r a n t r a n s p o rt, S i g n a l u b e rt r a g u n g s - and d / or the cell adhesion properties and / or a change in the enzymatic
  • Substances signal transmission properties are influenced.
  • the sphingolipid cholesterol microdomains thus represent platforms for various processes, in particular for signal transmission processes, which according to the invention can be influenced by modulating the microdomains with gangliosides. Modulation of the sphingolipid cholesterol microdomains can also prevent phagocytosis of bacteria and parasites in mammalian cells. Modulation of the sphingolipid-cholestesrin microdomains can also prevent the uptake of viruses in mammalian cells and their transport and release.
  • GPI-anchored proteins associate e.g. with tyrosine kinases from the Src family (Brown, Trends Cell Biol. 2 (1 992), 338-342).
  • cell signaling proteins are concentrated in the caveolae, plasma membrane indentations involved in sequestering and organizing raft lipid domains.
  • Many signaling molecules are associated with sphingolipid cholesterol rafts or caveolae, such as PDGF (platelet derived growth factor), EGF (epidermal growth factor), protein kinase C and the insulin receptor.
  • PDGF platelet derived growth factor
  • EGF epidermal growth factor
  • protein kinase C protein kinase C
  • the signal transmission pathways mediated by these molecules can be inhibited by the exogenous addition of gangliosides and other substances. It has now been found that gangliosides modulate these signal transmission paths, e.g. a cluster degradation of protein-containing microdomains, in particular of G
  • Signal transmission processes depend on the arrangement of lipid and protein components in the rafts. Modulation, in particular degradation of rafts by exogenous administration of gangliosides can e.g. B. can be effected to antagonize a microdomain-dependent signal transmission.
  • These signal transmission processes include an antibody-induced patching of GPI-anchored PLAP (placental alkaline phosphatase), which leads to a Accumulation of the Src-like tyrosine kinase leads (Härder et al., J. Cell. Biol. 141 (1 998), 929-942).
  • GPI-anchored PLAP placental alkaline phosphatase
  • GPI-anchored proteins leads to the activation of T-lymphocytes (Thomas et al., J. Biol. Chem. 267 (1 992), 1 231 7 - 1 2322) and the cross-linking of the IgE receptor FceRI causes an allergic reaction, including histamine secretion in mast cells (Holowka et al., Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25 (1 996), 73-80; Field et al., J. Biol. Chem. 272 (1,997), 4276-4280).
  • Gangliosides can also be used to treat diseases that are associated with cell movement, such as combating tumors or metastases.
  • Tumor cells use the above mechanism to escape the immune response. Processes mediated by rafts can thus be influenced by gangliosides, such as T cell activation in the presence of tumor cells.
  • gangliosides and other substances according to the invention makes it possible to modulate functions which are influenced by sphingolipid-cholesterol microdomains and thus to influence them in a targeted manner.
  • the gangliosides and other substances can be used as agents to elucidate the pathogenesis of diseases associated with activities on sphingolipid cholesterol microdomains. For example, it has recently been shown that a reduction in the cholesterol of hippocampal neurons inhibits the secretion of the ⁇ -amyloid peptide, with the result that the sphingolipid cholesterol microdomains play an important role in the proteolytic processing of the amyloid precursor protein (APP) in Alzheimer's disease (Simons et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 (1 998), 6460-6464).
  • APP amyloid precursor protein
  • the transformation of the GPI-anchored prion protein to the scrapie protein isoform has also been associated with sphingolipid-cholestehn microdomains (Taraboulos et al., J. Cell Biol. 1 29 (1 995), 1 21 - 1 32).
  • the gangliosides are therefore preferably used in such a way that the modulation of the sphingolipid cholesterol microdomains causes a change in the proteolysis of the amyloid precursor protein of Alzheimer's disease or a modification of a prion protein.
  • the modulation of sphingolipid cholesterol microdomains according to the invention can be of interest both for therapeutic, preventive and diagnostic purposes.
  • the gangliosides are preferably administered in a dose of 3, preferably at least 5 to 30 and preferably up to 20 mg per kg per day.
  • the dose used experimentally to elicit a response is 1 mg / ml for about 1 0 to 1 2 hours. Taking into account the buffering effect of blood, plasma and cells in animals or humans, this results in a dose range of 3 to 30 mg / kg per day.
  • FIG. 1 shows that gangliosides inhibit the crosslinking of GPI-anchored proteins, in particular GH-DAF, in living cells.
  • MDCK GH-DAF cells MDCK: dog, Cocker Dog, kidney
  • MDCK GH-DAF cells were treated with 0, 10, 50 and 100 ⁇ W ⁇ GM, (A) or with 10, 50 and 100 ⁇ N ⁇ bbG (B) for 1 hour incubated at 37 ° C.
  • CHO FR-GPI cells were incubated with 1 00 ⁇ M bbG or with 1 00 // M GM T for 1 hour at 37 ° C.
  • the cells were then with Cross-linked BS 3 .
  • the proteins were separated with 5-1 5% SDS-PAGE and detected after Western blotting with an anti-GH antibody, followed by ECL (electrochemiluminescence).
  • the autoradiographs were scanned and the intensity of the immunoreactive signal is given as the relative optical density (ROD) for 0 // M GM, (A, upper curve), O ⁇ M bbG (B, upper curve), 1 00 vM GM, (A, lower curve) and 1 00 ⁇ M bbG (B, lower curve).
  • ROD relative optical density
  • Figure 2 shows that gangliosides inhibit cross-linking of FR-GPI in CHO cells.
  • CHO FR-GPI cells were incubated with 1 00 ⁇ M bbG or with 1 00 ⁇ M GM for 1 hour at 37 ° C.
  • the cells were then cross-linked with BS 3 .
  • the proteins were separated with 5-1 5% SDS-PAGE and detected after Western blotting with an anti-folate receptor antibody, followed by ECL (electrochemiluminescence).
  • FIG. 3 shows the incorporation of GM into the plasma membrane of MDCK GH-DAF-
  • Figure 4 shows the increase in detergent solubility of GH-DAF by gangliosides.
  • MDCK were GH-DAF cells with 1 00 ⁇ M bbG for 1 hour 37 ° C or with 1 00 M NBD-C 6 -HPC for 1 hour at 8 ° C; loaded with 1 00 ⁇ M GM, for 1 hour at 37 ° C or with 1 00 ⁇ M bbG for 1 hour, followed by a 6 hour incubation with DMEM-containing serum (A) or a treatment with 1 0 mM methyl-ß-cyclodextrin for 1 Hour at 37 ° C or incubation with anti-GH for 1 hour at 12 ° C, followed by incubation with a secondary antibody (B).
  • the cells were extracted with Triton X-1 1 4 for 30 minutes at 4 ° C, centrifuged and the GH-DAF in the soluble (S) and insoluble (! Fraction was detected as described below.
  • Figure 5 shows that the effect of octyl glucoside on sphingolipid cholesterol microdomains is different from the effect of gangliosides.
  • MDCK GH-DAF cells were incubated for 1 hour with 5 and 10 mM octyl glucoside and cross-linked with BS 3 . A slight decrease in cross-linking was only observed when using 1 mM mM octyl glucoside. The membranes remained intact at all concentrations examined.
  • FIG. 6 shows that the inhibition of the crosslinking of GH-DAF is a specific property of gangliosides.
  • A MDCK GH-DAF cells were incubated with 0, 10, 50 or 100 ⁇ M NBD-C 6 -HPC for 30 minutes at 8 ° C. before they were cross-linked with BS 3 . SDS-PAGE, Western blotting and detection were carried out as described in FIG. 1.
  • B MDCK GH-DAF cells were incubated with 0 or 100 ⁇ M bbG for 1 hour, followed by an incubation with medium-containing serum (DMEM / FCS) for one hour. The cells were cross-linked, followed by SDS-PAGE, Western blotting and detection as detailed in Figure 1.
  • DMEM / FCS medium-containing serum
  • Figure 7 shows that ganglioside treatment does not change the immunofluorescence pattern of GH-DAF.
  • MDCK GH-DAF cells were incubated for 1 hour at 37 ° C. without (A, D), with 1 00 M bbG (B) or with 1 0 mM CD (C). The cells were fixed and labeled with an anti-GH antibody followed by a Cy3-conjugated anti-sheep IgG (A, B and C) or crosslinked antibody-induced before fixation.
  • Figure 8 shows that loading MDCK GH-DAF cells with gangliosides changes the autophosphorylation status.
  • MDCK GH-DAF cells were loaded with bbG or GM for 1 hour at 37 ° C. or cross-linked with 0.5 mM BS 3 for 45 minutes at 4 ° C. After lysis, aliquots of the samples were separated on a 5-1 5% gel and the in-gel assay for protein kinase activity was performed. Bands in which the intensity increased during ganglioside treatment are marked with an arrow. Bands that were only visible after ganglioside loading are marked with an arrow head.
  • FIG. 9 shows the inhibition of copatching of influenza HA and GH-DAF by gangliosides.
  • MDCK GH-DAF cells were infected with the influenza HA virus and then incubated with DMEM (AF) or 100 ⁇ M GM, in DMEM (GL) for 1 hour at 37 ° C.
  • DMEM DMEM
  • the patching was carried out using labeled secondary Cy-3 anti-sheep (red) - and FITC- Anti-mouse (green) - antibodies detected.
  • the panels in the left column show the distribution of GH, in the middle column the distribution of HA and in the right column the combination of both signals.
  • the panels DF each show a detail of the panels AC, whereas the panels JL show a detail of the panels Gl.
  • the lines in F and L correspond to 2 ⁇ M, those in C and I 8 ⁇ M. Examples
  • an MDCK cell line was used which permanently expresses GH fused to the GPI anchor of the decay accelerating factor (GH-DAF) (Friedrichson et al., Nature 394 ( 1 998), 802 - 805).
  • the MDCK GH-DAF cells were stored at 37 ° C. in 5% CO 2 in DMEM, supplemented with 10% FCS and antibiotics. The experiments were carried out on confluent or sub-confluent cells grown in plastic switches.
  • CHO cells that permanently express the GPI-anchored folate receptor were treated in the same way.
  • the CHO FR-GPI cells were grown in a folate-free Hams F-12 medium containing 5% FCS, hygromycin (100 ⁇ g / ml), penicillin (100 U / ml) and streptomycin (100 ⁇ g / ml) contained.
  • Cross-linking of CHO FR-GPI cells with BS 3 leads to the appearance of cross-linked products of FR-GPl, a cross-linking efficiency of 28% ⁇ 3% being observed.
  • GM was extracted, purified according to known methods (Tettamanti et al., Biochim. Biophys. Acta 296 (1 973), 1 60-170) and radiolabeled on the C-3 of the long-chain base group (Sonnino et al., J. Lipid Res. 25 (1 984), 620-629).
  • the homogeneity of the radioactive compound 3 H-GM was over 99% and its specific radioactivity was 1.31 Ci / mmol.
  • the cells were incubated for 1 hour in DMEM containing 1 ⁇ Ci / ml of GM containing tritium at a final ganglioside concentration of 100 ⁇ M, washed with PBS / BSA and then incubated for 0 to 45 minutes with PBS / BSA at 37 ° C , The cells were then treated with 1 ml of PBS containing 0.1% trypsin for 5 minutes at 37 ° C. The cell lysates were analyzed for radioactive ganglioside content with a liquid scintillation counter (Beckmann Instruments, CA). The protein was determined using a Protein Assay Reagent (BCA; Pierce, UK). Only about 0.7% of the exogenously added ganglioside associated with the cells.
  • the trypsin-stable pool from GM contained the fraction which was resistant to extraction with Triton X-100 at 4 ° C. After incubation of cells with GM containing 100 ⁇ M tritium, 3.74 nmoles GM (per mg protein) were found in the detergent-insoluble fraction, while 1.26 nmoles GM were obtained from the soluble fraction, which shows that exogenous GM accumulates in the rafts.
  • MßCD Cholesterol sulfate-methyl-ß-cyclodextrin
  • the dried inclusion complex was finally dissolved in 300 ul water to give a 10 mM stock solution with respect to cholesterol sulfate.
  • MDCK GH-DAF cells (1 0 6 ) were inoculated into a 35 mm culture dish and the cells were grown to high density overnight. After rinsing twice with PBS, the cells were incubated with cholesterol sulfate MßCD inclusion complexes in DMEM for 1 hour at 37 ° C. The cells were washed three times with ice-cold PBS (phosphate buffered saline) / BSA (bovine serum albumin) (PBS containing 2 mg / ml BSA) to remove inclusion complexes and the cells were chilled on ice for 5 minutes before being cross-linked.
  • PBS phosphate buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • the membrane-permeable cross-linker bis- (sulfosuccinimidyl) suberate (BS 3 ) diluted to 0.5 to 1 mM in PBS is routinely used.
  • Cells were incubated with a BS 3 solution for 45 minutes at 4 ° C. Unreacted cross-linking agent was quenched with 1 mM glycine dissolved in PBS for 15 minutes at 4 ° C.
  • the cells were then triton X-1 1 4 containing buffer lysed and a detergent-rich phase was prepared to enrich GPI anchor proteins. The proteins were precipitated from the detergent-rich phase, separated on an SDS-PAGE gradient gel, plotted on nitrocellulose and GH-DAF was visualized with anti-GH antibodies, HRP-conjugated secondary antibodies and ECL.
  • a frequently used criterion for examining the association of a protein with microdomains is its resistance to extraction against non-ionic detergents, such as Triton X-100 at 4 ° C. (Brown et al., Cell 68 (1 992), 533-544).
  • the detergent solubility of GH-DAF was therefore investigated after loading the cells with ganglioside. It was found that the solubility of GH-DAF in TX-1 1 4 was significantly increased from 51 ⁇ 4% to 83% ⁇ 1 0% and 76% ⁇ 8% in cells loaded with GM and bbG (Fig 4A).
  • GPI-APs are displaced from the rafts by loading MDCK-GH-DAF cells with gangliosides.
  • n-octyl-ß-D-glucopyranoside OG
  • This detergent is chemically similar to gangliosides (for example, it contains a carbohydrate head group) and is known to fully solubilize GPI-APs when used above the critical micelle concentration (20-25 mM).
  • MDCK GH-DAF cells were incubated with different concentrations of OG and cross-linked with BS 3 .
  • lipid that is not part of the sphingolipid-cholesterol microdomains should not have any influence on the cross-linking and the solubility of GH-DAF.
  • phosphatidylcholine molecules should be used for such a control experiment, such as those that occur in cell membranes. However, these lipids cannot be introduced into the membrane by exogenous addition.
  • MDCK GH-DAF cells were therefore incubated with a partially water-soluble fluorescence-labeled analogue of phosphatidylcholine (NBD-C 6 -HPC).
  • NBD-C 6 lipids quickly reach the plasma membrane at low temperature and their accumulation in the plasma membrane can easily be observed by immunofluorescence microscopy (Kean et al., J. Cell. Biol. 1 23 (1 993), 1 403-1 41 9).
  • the detergent insolubility of NBD-C 6 -HPC has now been investigated. Cells were loaded with NBD-C 6 -HPC and detergent extraction was carried out at 4 ° C with Triton X-1 14. Over 99% of the NBD-C 6 -HPC was recovered from the detergent-soluble fraction, indicating that the lipid is not associated with the microdomains. No change in the cross-linking pattern was observed after incubation with different concentrations of NBD-C 6 -HPC.
  • the cross-linking efficiency was 73% ⁇ 5% in cells treated with 100 ⁇ M NBD-C 6 -HPC compared to 73% ⁇ 6% in control cells (FIG. 6A).
  • the solubility of GH-DAF (54% ⁇ 2% soluble) was not changed by NBD-C 6 -HPC ( Figure 4A).
  • MDCK GH-DAF cells were loaded with 100 ⁇ M bbG and then incubated for 6 hours in a medium containing serum before the crosslinking. As shown in Figure 6B, 6 hours of incubation with serum-containing medium was sufficient to almost completely restore the GH-DAF cross-linking pattern.
  • the cross-linking efficiency was 6% ⁇ 1% lower than that of control cells.
  • This example shows that the inhibition of cross-linking of GH-DAF with gangliosides is specific and reversible.
  • Sphingolipid cholesterol microdomains or rafts are small, highly dynamic structures that cannot be resolved by conventional microscopic techniques. It was investigated whether loading the cells with gangliosides leads to a global rearrangement of the plasma membrane and thus the GPI-APs.
  • the distribution of GH-DAF on MDCK cells with or without bbG loading was analyzed by immunofluorescent labeling. To prevent redistribution of GH-DAF after fixation, a Formaldehyde fixation combined with a subsequent methanol fixation used (Härder et al., J. Cell Biol. 141 (1998), 929-942).
  • Loading the cells with gangliosides changes the autophosphorylation state of protein kinases
  • Sphingolipid cholesterol microdomains are small and highly dynamic structures that cannot be resolved by conventional microscopic techniques. It was investigated whether loading the cells with gangliosides leads to a redistribution of GPI-APs.
  • the distribution of GH-DAF on MDCK cells with or without bbG loading was analyzed by immunofluorescent labeling. To prevent redistribution of GH-DAF after fixation, formaldehyde fixation was used in combination with subsequent methanol fixation (Härder et al., J. Cell. Biol. 1 41 (1 998) 929-942).
  • the cells were incubated simultaneously with a monoclonal anti-HA mAb and a polyclonal anti-GH Ab at 4 ° C., followed by an incubation with the respective secondary antibodies.
  • Microscopic analysis showed copatching of HA and GH-DAF in the majority of the cells (60% copatching, 35% partial overlap and 5% random distribution) (FIG. 9A-F).
  • FIG. 9A-F When the cells were incubated for 1 hour with 100 ⁇ M GM, before the antibody-induced cross-linking, only partial coclustering of HA and GH-DAF was observed in most cells (31% coclustering, 50% partial overlap and 19% random distribution) (Figure 9 GL).
  • bovine brain gangliosides (bbG) or GM, (1 - 10 mM) were prepared in PBS. The cells were loaded with 1 0-100 ⁇ M gangliosides in DMEM for 1 hour at 37 ° C. (Masserini et al., Biochemistry 29
  • NBD-C 6 -HPC The insertion of NBD-C 6 -HPC in membranes was carried out with 1 0-100 M NBD-C 6 -HPC for 1 hour at 8 ° C.
  • CD methyl- ⁇ -cyclodextrin
  • MDCK GH-DAF cells were incubated for 1 hour at 37 ° C. with various concentrations of octyl glucoside dissolved in DMEM.
  • Detergent extraction The cells were washed with cold PBS and extracted with 1 ml of TX-1 1 4-lysis buffer at 4 ° C. for 30 minutes. The cells were scraped and samples centrifuged for 30 minutes at 1500 g at 4 ° C. The supernatant (soluble fraction) was removed, the pellet (insoluble fraction) was resuspended in 1 ml lysis buffer. Soluble and insoluble fractions were precipitated with 10% TCA on ice for 1 hour and centrifuged for 15 minutes at 1500 g at 4 ° C. The pellets were washed with acetone (-20 ° C) and processed further with SDS-PAGE and Western blotting.
  • Cross-linking, electrophoresis and Western blotting The cross-linking protocol was used as previously described (Friedrichson et al., Nature 394 (1 998), 802-805). In short, cells were washed twice with cold PBS. Cross-linking was carried out with 0.5 mM BS 3 for 45 minutes at 4 ° C. Unreacted cross-linker was quenched with 50 mM glycine for 15 minutes at 4 ° C. The cells were cultured for 20 minutes at 4 ° C. and 10 minutes at 37 ° C.
  • TX-1 1 4 lysis buffer (1 50 mM NaCl, 1 0 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 1% Triton-X-1 1 4 and protease inhibitors) lysed.
  • the lysates were briefly on Ice-cooled and clarified by centrifugation at 1, 5,000 g for 1 ⁇ minute.
  • the supernatants were subjected to a temperature-induced phase separation for 5 minutes at 37 ° C.
  • Aqueous and detergent-enriched phases were separated by centrifugation for 3 minutes at 1300 rpm at room temperature (RT).
  • the aqueous phases were discarded and 0.9 ml of TX-1 14 washing buffer (1 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA, 0.06% Triton-X-114 and Protease inhibitors) were added to the detergent phases. After centrifugation at 1500 g for 1 ⁇ at 4 ° C., the samples were subjected to a further phase separation. Finally, the detergent phases were precipitated with cold acetone (-20 ° C) and cooked at 95 ° C for 5 minutes in a Lämmli sample buffer. The proteins were separated with a 5-1 5% SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose.
  • Immunoreactive bands were quantified by densitometric scanning of films or a LAS-1000 luminescence image analyzer (Fujifilm, Germany). The data for each condition was averaged and the change was expressed as a standard deviation. The experiments were carried out 3 to 6 times. For some gels, the corresponding X-ray films were scanned using Photoshop software and the optical density of the immunoreactive bands was determined and printed out using MacBas (version 2.0).
  • the coverslips were embedded in Moviol and images were taken with a high resolution digital camera C 4742-95 (Hamamatsu Photonics KK, Japan) and the digital deconvolution was carried out using the digital confocal routine Openlab (Version 1 .7.7) (Improvision, UK) ,
  • the anti-GH antibody and the Cy3-conjugated anti-sheep IgG were diluted in DMEM.
  • the cells were incubated for 20 minutes at 37 ° C with the anti-GH antibody, washed with DMEM and incubated for 20 minutes at 37 ° C with Cy3-conjugated anti-sheep IgG.
  • the cells were fixed and embedded in Moviol as described above.
  • Cells grown in 6-well dishes were loaded with gangliosides or cross-linked with BS 3 as described above, cooled on ice, washed 3 times with ice-cold PBS and in 400 ⁇ l lysis buffer (20 mM Tris acetate, pH 7.0, 0 , 1 mM EDTA, 1 M EGTA, 1 mM sodium orthovanadate, 10 mM ⁇ -glycerophosphate, 50 mM sodium fluoride, 5 M sodium pyrophosphate, 1% TX-1 00, 1 mM benzamidine, 2 ⁇ g / ml leupeptin, 0.1% ⁇ -Mercaptoethanol, 0.27 M sucrose and 0.2 mM PMSF) lysed for 30 minutes at 4 ° C and scraped off with a rubber wiper.
  • lysis buffer 20 mM Tris acetate, pH 7.0, 0 , 1 mM EDTA, 1 M EGTA, 1 mM sodium orthovana
  • the virus was in an infection medium (MEM, 50 mM Hepes, pH 7.3, penicillin (1 00 U / ml) / streptomycin (1 00 ⁇ g / ml), 0.2% BSA) and virus adsorption was carried out for 1 hour. The infection continued for another 2.5 hours. 100 ⁇ M GM, diluted in DMEM, was added to some cells during the last hour. For antibody-induced patching of HA and GH-DAF, the cells were incubated with a polyclonal anti-GH antibody and a monoclonal anti-HA-PR8 (H 1 7L10), diluted 1: 3000 and 1:50 in DMEM.
  • MEM infection medium
  • H 1 7L10 monoclonal anti-HA-PR8
  • the invention thus relates in particular to the use of gangliosides and other substances for modulating sphingolipid cholesterol microdomains. It can e.g. are used to develop active substances which influence membrane transport, signal transmission, cell adhesion and / or enzymatic processes in mammalian cells. The modulation can also prevent bacteria, pathogens and viruses from entering the cells.

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Abstract

Es wird die Verwendung von Gangliosiden und anderen Substanzen zur Herstellung eines Mittels zur Modulation von Sphingolipid-Cholesterin-Mikrodomänen beschrieben.

Description

Verwendung von Gangliosiden und anderen Substanzen zur Modulation von Sphingolipid-Cholesterin-Mikrodomänen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Gangliosiden und anderen Substanzen zur Herstellung eines Mittels zur Modulation von Sphingolipid- Cholesterin-Mi rodomänen.
Bei Sphingolipid-Cholesterin-Mikrodomänen, die auch Sphingolipid- Cholesterin-Flöße genannt werden, handelt es sich um laterale Anordnungen von spezifischen Lipiden, insbesondere Sphingolipiden einschließlich Gangliosiden und Cholesterin sowie Proteinen in Zellmembranen (K. Simons et al. , Nature, Vol. 387 ( 1 997), 569 - 572; T. Friedrichson et al., Nature, Vol. 394 ( 1 998), 802 - 805) . Es sind kleine und hochdynamische Strukturen, die durch Anziehungskräfte zwischen Sphingolipiden und Cholesterin gebildet werden. Mit den Sphingolipid-Cholesterin-Strukturen sind verschiedene Proteine assoziiert, einschließlich GPI-APs (Glykosyl- Phosphatidyl-Ankerproteine), Kinasen der Familie Src, Influenza Virus Hämagglutinin (HA) und Caveolin-1 . Die meisten der mit den Sphingolipid- Choiesterin-Flößen assoziierten Proteine enthalten post-translationale Lipidmodifikationen, wobei GPI-verankerte Proteine in der Zellmembran über eine Lipideinheit verankert sind, wohingegen Kinasen der Familie Src, NO- Synthasen (NOS), HA und Caveolin acyliert sind. Die mit den Flößen assoziierten Proteine sind üblicherweise in kalten, nicht-ionischen Detergenzien, wie etwa Triton X-1 00, nur schlecht löslich, was möglicherweise auf ihren lipophilen Charakter zurückzuführen ist. In Triton unlösliche Komplexe wurden bezüglich ihrer Funktion als Flöße definiert, die spezifisch an bestimmten Lipiden, insbesondere Sphingolipiden einschließlich Gangliosiden, und Cholesterin, angereichert sind, während andere Lipide, wie etwa Glycerophospholipide, in den Triton-Extrakten selektiv fehlen (Brown et al., Trends Cell Biol. 2 ( 1 992) , 338 - 343; Fiedler et al., Biochemistry 32 ( 1 993), 6365 - 6373) .
Die Existenz von Sphingolipid-Cholesterin-Mikrodomänen bzw. Flößen in lebenden Zellen, insbesondere die Existenz von Mikrodomänen von GPI- verankerten Proteinen in lebenden Zellen, die durch die Verabreichung von Cholesterin beeinflußt werden können, wurde kürzlich durch einen chemischen Quervernetzungsansatz (Friedrichson et al. , supra) und ein Fluoreszenz-Energietransfer-Verfahren (Varma et al. , Nature 394 ( 1 998) , 798 - 802) gezeigt. Weiterhin wurde postuliert, dass die Flöße als Plattformen, an die Proteine binden können, eine wichtige Rolle bei Membrantransport- und Signalübertragungseigenschaften spielen.
Eine Aufgabe der Erfindung war es deshalb, ein Mittel zur Modulation von Sphingolipid-Cholesterin-Mikrodomänen bereitzustellen (und zwar insbesondere deren Aufbau oder/und Eigenschaften) , um auf die durch diese Mikrodomänen beeinflussten Vorgänge gezielt einwirken zu können.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung von Gangliosiden und anderen Substanzen zur Herstellung eines Mittels zur Modulation von Sphingolipid-Cholesterin-Mikrodomänen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung konnte festgestellt werden, dass mit Sphingolipid-Cholesterin-Mikrodomänen assoziierte Proteine, insbesondere GPI-verankerte Proteine, in den Mikrodomänen in Form von quervernetzten Clustern auf der Oberfläche von lebenden Zellen vorliegen. Durch die Zugabe von Gangliosiden und anderen Substanzen, wie Cholesterinsulfat, wird die Quervernetzung von mit den Flößen assoziierten, insbesondere GPI- verankerten Proteinen gehemmt und darüber hinaus deren Löslichkeit in Detergenzien erhöht. Die Verabreichung von Gangliosiden und anderen Substanzen führt somit zu einer Veränderung des strukturellen Aufbaus der Mikrodomänen, sodass diese zur Modulation von Sphingolipid-Cholesterin-Mikrodomänen und den dort stattfindenden Vorgängen eingesetzt werden können.
Es wird angenommen, dass durch die Verabreichung von Gangliosiden und anderen Substanzen Proteine, insbesondere GPI-verankerte Proteine, aus den Sphiπgolipid-Cholesterin-Mikrodomänen verdrängt werden, indem die Anziehungskräfte zwischen der Ankergruppe und den umgebenden Lipiden gestört werden. Dies hat zur Folge, dass die in den Sphingolipid-Cholesterin- Mikrodomänen vorliegenden Proteine bei Zugabe von Gangliosiden und anderen Substanzen aus ihrer Lipidumgebung herausgelöst werden und nicht mehr mit den Flößen assoziiert vorliegen.
Als Folge davon verändert die Zugabe von exogenen Gangliosiden z.B. die Löslichkeit von GH-DAF (Wachstumshormon (GH; growth-hormone) verknüpft mit dem GPI-Anker des DAF (Decay accelerating factor)), einer Glykosyl-Phosphatidylinositol-verankerten Wachstumshormon-Form, in Detergenzien. Es ist bekannt, dass GPI-verankerte Proteine in nicht- ionischen Detergenzien im wesentlichen unlöslich sind (Brown et al., Cell 68 ( 1 992), 533 - 544), während eine Verringerung des Cholesteringehalts in den Zellen die Detergenz-Solubilität von GPI-APs erhöht (Cerneus et al. , J. Biol. Chem. 268 ( 1 993) , 31 50 - 31 55; Hanada et al., J. Biol. Chem. 270 ( 1 995) , 6254 - 6260) . Dies bedeutet, dass die Wechselwirkungskräfte zwischen den Lipidbestandteilen und den Proteinen der Mikrodomänen größer als die Lösekräfte durch nicht-ionische Detergenzien sind. Werden jedoch die Mikrodomänen durch Herausnahme des Bestandteils Cholesterin verändert oder zerstört, dann werden die Wechselwirkungskräfte zwischen den Lipiden und den Proteinen verringert und die Proteine können durch nicht-ionische Detergenzien aus den Flößen herausgelöst werden. Überraschenderweise wurde nun gefunden, dass bei Zugabe von Gangliosiden und anderen Substanzen, die bevorzugt ebenfalls einen Lipidbestandteil der Flöße darstellen, das Gegenteil zutrifft, dass also die Zugabe von Gangliosiden zu Zellen die Detergenz-Solubilität von GH-DAF erhöht. Diese Feststellung ist unerwartet, da man annehmen würde, dass eine Erhöhung der Konzentration eines in den Sphingolipid-Cholesterin- Mikrodomänen vorkommenden Lipids eine Stabilisierung dieser Domänen bewirken würde. Tatsächlich stört die Zugabe von Gangliosiden jedoch das Quervernetzen der Proteine und erhöht die Detergenz-Solubilität von GH- DAF. Ganglioside bewirken somit eine Modulation der Mikrodomänen, insbesondere eine Verdrängung von Proteinen, insbesondere GPI-APs aus den Flößen.
Dies wird dadurch bestätigt, dass Ganglioside das Copatching von HA und GH-DAF stören. Das Copatching von zwei Mikrodomänkomponenten ist eine Folge der Koaleszenz einer gemeinsamen Lipidmikrodomäne.
Die Modulation der Mikrodomänen durch die Ganglioside erfolgt bevorzugt spezifisch und reversibel, d.h. bei Wegnahme der Ganglioside und anderen Substanzen wird wieder die ursprüngliche, unveränderte Struktur der Mikrodomänen erhalten.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird also durch die Verwendung von Gangliosiden die Lokalisierung von Proteinen auf Sphingolipid-Cholesterin- Mikrodomänen beeinflusst, insbesondere die Lokalisierung von Ankerproteinen, acylierten Proteinen, Src-Kinasen oder/und Cholesterin-oder GPI-verankerten Proteinen. Durch die Zugabe von Gangliosiden wird die Anordnung von in Sphingolipid-Cholesterin-Mikrodomänen vorliegenden Proteinen verändert, was zu einer Modulation oder/und Veränderung der Struktur oder/und des Aufbaus der Sphingolipid-Cholesterin-Mikrodomänen führt. Besonders bevorzugt wird ein Clusterabbau der Proteine bewirkt. Die erfindungsgemäß verwendeten Ganglioside werden bevorzugt ausgewählt aus Rinderhirngangiiosiden, GM1 f GD 1 a, GD 1 b, GD3, GM2, GM3, GQ1 a, GQ1 b oder/und Globosiden. Besonders bevorzugt werden exogene Ganglioside und deren Derivate, wie z.B. ungesättigtes Sphingosin oder Ceramid mit kurzen oder ungesättigten Fettsäuren, verwendet, die bereits Bestandteil der zu behandelnden Sphingolipid-Cholesterin- Mikrodomänen sind . Aber auch Cholesterinsulfat und andere Cholesterin- Derivate können eingesetzt werden.
Die Begriffe Gangliosid bzw. Gangliosid-Derivate, wie hierin verwendet, umfassen insbesondere Glykolipide, die als Bausteine von Zeil-Membranen im Nervengewebe auftreten. Die Ganglioside bzw. Gangliosid-Derivate enthalten bevorzugt mehrere Monosaccharideinheiten pro Molekül. Geeignete Monosaccharideinheiten, die in den Gangliosiden bzw. Gangliosid-Derivaten enthalten sein können, sind beispielsweise D- Galactose, N-Acetyl-D-Galactosamin, D-Glucose und N-Acetyl- Neuraminsäure. Besonders bevorzugt sind Ganglioside, die Derivate von Sphingosin (2-Amino-4-octadecen- 1 ,3-diol, Sphing-4-enin) sind, wobei insbesondere über den Sauerstoff am C-1 Zuckerreste angebunden sind und über den Stickstoff am C-2 eine kurze (insbesondere C2-C18-) Fettsäure gebunden ist, welche gesättigt oder ungesättigt sein kann. Weiterhin bevorzugt sind Ganglioside, die ein Derivat eines Ceramids sind . Ceramide sind lipophile Amide der allgemeinen Formel
HN-CO-R1 R30-CH?- CH-CH-CH=CH-R2 2 I
OH
wobei R1 ein langkettiger Fettsäurerest, insbesondere ein C6-C30-, mehr bevorzugt ein C8-C24-Fettsäurerest ist, R2 ein langkettiger Alkylrest, insbesondere ein C6-C30-, mehr bevorzugt ein C8-C24-Alkylrest ist und R3 H ist. In den Ceramid enthaltenden Gangliosiden wird R3 bevorzugt durch Zuckerreste ersetzt (Glycoside) . Somit umfassen Gangliosid-Derivate bevorzugt Ceramid und dessen Derivate und verwandte Verbindungen einschließlich Sphingosine und Ganglioside und deren Derivate, wobei auch eine der folgenden funktionalen Gruppen an das Grundgerüst, insbesondere das Ceramidgrundgerüstsubstituiert oder addiert sein kann: ein Halogenidatom, gebunden an einen Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl- oder Arylrest, eine Alkoholgruppe (primär, sekundär oder tertiär), eine Ethergruppe, eine Carbonylfunktion (z.B. Aldehyd oder Keton), eine Carbonsäuregruppe, eine Carbonsäureanhydridgruppe, eine Carbamoylgruppe, eine Haloformylgruppe, eine Cyanogruppe, eine Estergruppe, einschließlich einer Lactongruppe, ein Benzyl, Phenyl, Tolyl, Tosyl, eine Sulfonylgruppe, eine Aminogruppe (primär, sekundär oder tertiär), ein Isocyanat, ein Cyanat, ein Thioisocyanat, ein Thiocyanat, ein Carbamat, ein Azid, eine Diazogruppe oder eine Quinongruppe. Weitere Gruppen, die an die Cholesterineinheit gebunden sein können, umfassen ein Oligopeptid umfassend zwei bis 20, bevorzugt 8 bis 12, insbesondere 8, 10 oder 12 Aminosäurereste, ein Oligonukleotid, einzelne Aminosäuren, Monosaccharide, Disaccharide oder Polysaccharide.
Unter den Begriff Cholesterinderivate fallen alle Substanzen, die durch Substitution oder Addition von Gruppen aus Cholesterin gebildet worden sind. Insbesondere werden als Cholesterin-Derivate Verbindungen verstanden, die aus Cholesterin in nur einem Reaktionsschritt gebildet werden und zu Cholesterin in einem engen chemischen Verwandschaftsgrad stehen. Cholesterinderivate umfassen Cholesterinsulf at, Cholesterinthiosulfat und alle Cholesterinderivate, bei denen organische
Gruppen an die Cholesterineinheit substituiert oder addiert sind. Geeignete substituierte oder addierte Gruppen umfassen: ein Halogenidatom, gebunden an einen Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl- oder Arylrest, eine
Alkoholgruppe (primär, sekundär oder tertiär), eine Ethergruppe, eine Carbonylfunktion (z.B. Aldehyd oder Keton), eine Carbonsäuregruppe, eine
Carbonsäureanhydridgruppe, eine Carbamoylgruppe, eine Haloformylgruppe, eine Cyanogruppe, eine Estergruppe, einschließlich einer Lactongruppe, ein Benzyl, Phenyl, Tolyl, Tosyl, eine Sulfonylgruppe, eine Aminogruppe (primär, sekundär oder tertiär), ein Isocyanat, ein Cyanat, ein Thioisocyanat, ein Thiocyanat, ein Carbamat, ein Azid, eine Diazogruppe oder eine Quinongruppe. Weitere Gruppen, die an die Cholesterineinheit gebunden sein können, umfassen ein Oligopeptid umfassend zwei bis 20, bevorzugt 8 bis 1 2, insbesondere 8, 1 0 oder 1 2 Aminosäurereste, ein Oligonukleotid, einzelne Aminosäuren, Monosaccharide, Disaccharide oder Polysaccharide.
Bevorzugte Cholesterinderivate sind beispielsweise Cholesterinsulfat, sowie Cholesterinmoleküle, die an der OH-Funktion derivatisiert sind.
Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, mit dem die Zielrichtung und Verarbeitung der genannten Wirkstoffe, also der Ganglioside, Gangliosidderivate und Cholesterinderivate verfolgt und beobachtet werden kann, indem man eine nachweisbare Gruppe, beispielsweise eine fluoreszierende Gruppe an eine der zuvor aufgeführten Verbindungen, beispielsweise durch Substitution oder Addition anbringt.
Unter den Begriff "Modulation" fällt erfindungsgemäß jede strukturelle und chemische Veränderung der Mikrodomänen, insbesondere eine Veränderung im strukturellen Aufbau oder/und in der Zusammensetzung der einzelnen
Bestandteile der Mikrodomänen. Die Modulation der Sphingolipid-
Cholesterin-Mikrodomänen ihrerseits bewirkt bevorzugt eine Veränderung d e r M e m b r a n t r a n s p o rt- , S i g n a l ü b e rt r a g u n g s - u n d / o d e r Zeiladhäsionseigenschaften und/oder eine Veränderung von enzymatischen
Prozessen. Diese Wirkungen werden durch die Verwendung von
Gangliosiden und anderen Substanzen zur Modulation, also insbesondere zur
Veränderung der Struktur von Sphingolipid-Cholesterin-Mikrodomänen hervorgerufen. So können durch eine Veränderung der Sphingolipid- Cholesterin-Flöße durch exogen zugegebene Ganglioside und andere
Substanzen Signalübertragungseigenschaften beeinflusst werden. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Zugabe von Gangliosiden zu Zellen den Autophosphorylierungsgrad vieler Kinasen verändert. Die Sphingolipid- Cholesterin-Mikrodomänen stellen somit Plattformen für verschiedene Prozesse, insbesondere für Signalübertragungsvorgänge dar, die erfindungsgemäß durch Modulation der Mikrodomänen mit Gangliosiden beeinflusst werden können. Die Modulation der Sphingolipid-Cholesterin- Mikrodomänen kann auch die Phagozytose von Bakterien und Parasiten in Säugerzellen verhindern. Die Modulation der Sphingolipid-Cholestesrin- Mikrodomänen kann auch die Aufnahme von Viren in Säugerzellen sowie deren Transport und Freisetzung verhindern.
GPI-verankerte Proteine assoziieren z.B. mit Tyrosinkinasen der Src-Familie (Brown, Trends Cell Biol. 2 ( 1 992) , 338 - 342) . Zusätzlich sind in den Caveolae, Plasmamembraneinbuchtungen, die beim Sequestern und Organisieren von Floß-Lipiddomänen involviert sind, Zellsignalproteine konzentriert. Viele Signalübertragungsmoleküle sind mit Sphingolipid- Cholesterin-Flößen oder Caveolae assoziiert, wie etwa PDGF (platelet derived growth factor), EGF (epidermal growth factor), Proteinkinase C und der Insulinrezeptor. Die durch diese Moleküle vermittelten Signalübertragungswege können durch die exogene Zugabe von Gangliosiden und anderen Substanzen gehemmt werden. Es wurde nun festgestellt, dass durch Ganglioside diese Signalübertragungswege moduliert werden, indem z.B. eine ein Clusterabbau von Protein enthaltenden Mikrodomänen, insbesondere von GPI-AP enthaltenden Mikrodomänen bewirkt wird.
Von der Anordnung von Lipid- und Proteinkomponenten in den Flößen hängen noch weitere Signalübertragungsvorgänge ab. Eine Modulation, insbesondere ein Abbau von Flößen durch exogene Verabreichung von Gangliosiden kann z. B. bewirkt werden, um eine Mikrodomänen-abhängige Signalübertragung zu antagonisieren. Zu diesen Signalübertragungsvorgängen gehören u.a. ein Antikörper induziertes Patching von GPI- verankerter PLAP (placental alkaline phosphatase), was zu einer Akkumulation der Src-ähnlichen Tyrosinkinase fyn führt (Härder et al. , J. Cell. Biol. 141 ( 1 998), 929 - 942) . Weiterhin wurden physiologische Reaktionen, die durch Mikrodomänen-Cluster induziert werden, für Lymphozyten beschrieben (Brown, Curr. Opin. Immunol. 5 ( 1 993) , 349 - 354) . So führt ein Antikörper-induziertes Quervernetzen von GPI- verankerten Proteinen zur Aktivierung von T-Lymphozyten (Thomas et al., J. Biol. Chem. 267 ( 1 992), 1 231 7 - 1 2322) und das Quervernetzen des IgE-Rezeptors FceRI verursacht eine allergische Reaktion einschließlich einer Sekretion von Histamin in Mastzellen (Holowka et al. , Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 25 ( 1 996), 73 - 80; Field et al. , J. Biol. Chem. 272 ( 1 997) , 4276 - 4280) . Weiterhin können Ganglioside zur Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden, die mit einer Zellbewegung in Zusammenhang stehen, wie etwa die Bekämpfung von Tumoren bzw. Metastasen. Tumorzellen nutzen den oben genannten Mechanismus, um der Immunantwort zu entkommen. Durch Flöße vermittelte Prozesse können somit durch Ganglioside beeinflusst werden, wie etwa die T-Zellen- Aktivierung in Gegenwart von Tumorzellen. Durch den erfindungsgemäßen Einsatz von Gangliosiden und anderen Substanzen ist es möglich, Funktionen, die von Sphingolipid-Cholesterin-Mikrodomänen beeinflusst werden, zu modulieren und damit gezielt zu beeinflussen.
Weiterhin wurde festgestellt, dass bei der Zugabe von Gangliosiden zu Zellen ein Anstieg der Autophosphorilierung von verschiedenen Proteinkinasen beobachtet werden kann.
Darüber hinaus können die Ganglioside und anderen Substanzen als Mittel zur Aufklärung der Pathogenese von Erkrankungen verwendet werden, die mit Aktivitäten an Sphingolipid-Cholesterin-Mikrodomänen assoziiert sind . So wurde kürzlich gezeigt, dass eine Verringerung des Cholesterins von Hippocampus-Neuronen die Sekretion des ß-Amyloidpeptids hemmt, woraus sich ergibt, dass die Sphingolipid-Cholesterin-Mikrodomänen eine wichtige Rolle bei der proteolytischen Verarbeitung des Amyloidvorläuferproteins (APP) bei der Alzheimer'schen Erkrankung spielen (Simons et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 95 ( 1 998) , 6460 - 6464) . Die Transformation des GPI- verankerten Prionproteins zur Scrapie-Proteinisoform wurde ebenfalls mit Sphingolipid-Cholestehn-Mikrodomänen in Verbindung gebracht (Taraboulos et al., J . Cell Biol. 1 29 ( 1 995), 1 21 - 1 32) . Bevorzugt werden deshalb die Ganglioside derart verwendet, dass die Modulation der Sphingolipid- Cholesterin-Mikrodomänen eine Veränderung der Proteolyse des Amyloid- Vorläuferproteins der Alzheimer-Erkrankung oder eine Modifikation eines Prionproteins bewirkt.
Die erfindungsgemäße Modulation von Sphingolipid-Cholesterin- Mikrodomänen kann sowohl für therapeutische, präventive als auch diagnostische Zwecke von Interesse sein . Die Ganglioside werden dabei bevorzugt in einer Dosis von 3, bevorzugt von mindestens 5 bis zu 30 und bevorzugt bis zu 20 mg pro kg pro Tag verabreicht.
In einem in vitro System (Zellkultur) beträgt die Dosis, die experimentell verwendet wird, um eine Reaktion hervorzurufen 1 mg/ml für etwa 1 0 bis 1 2 Stunden. Unter Berücksichtigung der Pufferwirkung von Blut, Plasma und Zellen in Tieren oder Menschen ergibt sich daraus ein Dosisbereich von 3 bis 30 mg/kg pro Tag.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und die beigefügten Figuren weiter erläutert.
Figur 1 zeigt, dass Ganglioside das Quervernetzen von GPI-verankerten Proteinen, insbesondere von GH-DAF in lebenden Zellen hemmen. MDCK GH-DAF- Zellen (MDCK: dog, Cocker Spaniel, kidney) wurden mit 0, 1 0, 50 und 1 00 μW\ GM, (A) oder mit 10, 50 und 100 μN\ bbG (B) für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. CHO FR-GPI-Zellen wurden mit 1 00 μM bbG oder mit 1 00 //M GM T für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden anschließend mit BS3 quervernetzt. Die Proteine wurden mit 5 - 1 5 % SDS-PAGE getrennt und nach Western Blotten mit einem Anti-GH-Antikörper, gefolgt von ECL (Elektrochemolumineszenz) nachgewiesen. Die Autoradiographen wurden gescannt und die Intensität des immunoreaktiven Signals ist als relative optische Dichte (ROD) für 0 //M GM, (A, obere Kurve), O μM bbG (B, obere Kurve) , 1 00 vM GM, (A, untere Kurve) und 1 00 μM bbG (B, untere Kurve) dargestellt.
Figur 2 zeigt, dass Ganglioside das Quervernetzen von FR-GPI in CHO-Zellen hemmen. CHO FR-GPI-Zellen wurden mit 1 00 μM bbG oder mit 1 00 μM GM, für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden anschließend mit BS3 quervernetzt. Die Proteine wurden mit 5 - 1 5 % SDS-PAGE getrennt und nach Western Blotten mit einem Anti-Folatrezeptor-Antikörper, gefolgt von ECL (Elektrochemolumineszenz) nachgewiesen.
Figur 3 zeigt die Inkorporation von GM, in die Plasmamembran von MDCK GH-DAF-
Zellen. In (A) wurden MDCK GH-DAF-Zellen mit 1 μCi/ml Tritium enthaltendem GM, bei einer Gangliosid-Endkonzentration von 1 00 μM für 1 Stunde bei 37°C inkubiert und anschließend mit BSA (Rinderserumalbumin) für 0, 1 0, 20, 30 oder 45 Minuten (schraffierte Balken) gewaschen. Die additive Wirkung einer Behandlung mit 0, 1 % Trypsin für 5 Minuten bei 37 °C nach dem Waschen mit BSA ist als ausgefüllte Balken gezeigt. In (B) wurde das Quervernetzen nach Inkubieren von GM,-beladenen Zellen mit BSA für 0, 10, 20, 30 oder 45 Minuten durchgeführt. SDS-PAGE, Western-Blotting und Nachweis wurden wie in Figur 1 beschrieben durchgeführt.
Figur 4 zeigt den Anstieg der Detergenz-Solubilität von GH-DAF durch Ganglioside. In (A) wurden MDCK GH-DAF-Zellen mit 1 00 μM bbG für 1 Stunde bei 37 °C oder mit 1 00 M NBD-C6-HPC für 1 Stunde bei 8 ° C; mit 1 00 μM GM, für 1 Stunde bei 37 °C oder mit 1 00 μM bbG für 1 Stunde beladen, gefolgt von einer 6stündigen Inkubation mit DMEM enthaltendem Serum (A) oder einer Behandlung mit 1 0 mM Methyl-ß-cyclodextrin für 1 Stunde bei 37 °C oder einer Inkubation mit Anti-GH für 1 Stunde bei 1 2 °C, gefolgt von einer Inkubation mit einem sekundären Antikörper (B) . Die Zellen wurden mit Triton X-1 1 4 für 30 Minuten bei 4° C extrahiert, zentrifugiert und das GH- DAF in der löslichen (S) und unlöslichen (!) Fraktion wurde wie unten beschrieben nachgewiesen.
Figur 5 zeigt, dass die Wirkung von Octylglukosid auf Sphingolipid-Cholesterin- Mikrodomänen von der Wirkung von Gangliosiden verschieden ist. MDCK GH-DAF-Zellen wurden für 1 Stunde mit 5 und 1 0 mM Octylglukosid inkubiert und mit BS3 quervernetzt. Eine leichte Abnahme der Quervernetzung wurde nur bei der Verwendung von 1 0 mM Octylglukosid beobachtet. Bei allen untersuchten Konzentrationen blieben die Membranen intakt.
Figur 6 zeigt, dass die Hemmung der Quervernetzung von GH-DAF eine spezifische Eigenschaft von Gangliosiden ist. In (A) wurden MDCK GH-DAF-Zellen mit 0, 1 0, 50 oder 1 00 μM NBD-C6-HPC für 30 Minuten bei 8 °C inkubiert, bevor sie mit BS3 quervernetzt wurden. SDS-PAGE, Western-Blotting und Nachweis wurden wie in Figur 1 beschrieben durchgeführt. In (B) wurden MDCK GH-DAF-Zellen mit 0 oder 1 00 μM bbG für 1 Stunde inkubiert, gefolgt von einer östündigen Inkubation mit einem Medium enthaltenden Serum (DMEM/FCS) . Die Zellen wurden quervernetzt, gefolgt von SDS- PAGE, Western-Blotting und Nachweis, wie in Figur 1 ausgeführt.
Figur 7 zeigt, dass eine Gangliosidbehandlung das Immunofluoreszenzmuster von GH-DAF nicht verändert. MDCK GH-DAF-Zellen wurden ohne (A, D), mit 1 00 M bbG (B) bzw. mit 1 0 mM CD (C) für 1 Stunde bei 37 ° C inkubiert. Die Zellen wurden fixiert und mit einem Anti-GH-Antikörper gefolgt von einem Cy3-konjugierten Anti-Schaf-IgG (A, B und C) markiert oder vor der Fixierung Antikörper-induziert quervernetzt.
Figur 8 zeigt, dass die Beladung von MDCK GH-DAF-Zellen mit Gangliosiden den Autophosphorylierungsstatus verändert. MDCK GH-DAF-Zellen wurden mit bbG oder GM, für 1 Stunde bei 37 ° C beladen oder mit 0, 5 mM BS3 für 45 Minuten bei 4°C quervernetzt. Nach einer Lyse wurden Aliquots der Proben auf einem 5 - 1 5 % Gel getrennt und es wurde der In-Gel-Assay für die Proteinkinaseaktivität durchgeführt. Banden, bei denen die Intensität bei der Gangliosidbehandlung anstieg, sind mit einem Pfeil markiert. Banden, die nur nach einer Gangliosidbeladung sichtbar wurden, sind mit einem Pfeilkopf markiert.
Figur 9 zeigt die Hemmung des Copatching von Influenza HA und GH-DAF durch Ganglioside. MDCK GH-DAF-Zellen wurden mit dem Influenza HA-Virus infiziert und dann mit DMEM (A-F) oder 1 00 μM GM, in DMEM (G-L) für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Nach einer anschließenden Behandlung mit einem Gemisch von monoklonalen Anti-HA-Maus- und polyklonalen Anti-GH- Schaf-Antikörpern bei 4 °C wurde das Patching unter Verwendung von markierten sekundären Cy-3-Anti-Schaf (rot)- und FITC-Anti-Maus (grün)- Antikörpern nachgewiesen. Die Panelen in der linken Spalte zeigen die Verteilung von GH, in der mittleren Spalte die Verteilung von HA und in der rechten Spalte die Kombination beider Signale. Die Panelen D-F zeigen jeweils ein Detail der Panelen A-C, wohingegen die Panelen J-L ein Detail der Panelen G-l zeigen. Die Striche in F und L entsprechen 2 μM, die in C und I 8 μM. Beispiele
Beispiel 1
Inhibition der Quervernetzung von GPI-verankerten Proteinen durch exogene
Verabreichung von Gangliosiden
Zur Analyse der Organisation von GPI-verankerten Proteinen auf der Oberfläche wurde eine MDCK-Zelllinie verwendet, die permanent GH, fusioniert an den GPI-Anker des Zerfallbeschleunigungsfaktors (GH-DAF; decay accelerating factor) exprimiert (Friedrichson et al., Nature 394 ( 1 998) , 802 - 805) . Die MDCK GH-DAF-Zellen wurden bei 37 °C in 5 % C02 in DMEM, ergänzt mit 1 0 % FCS und Antibiotika gelagert. Die Experimente wurden auf konfluenten oder subkonfluenten Zellen durchgeführt, die in Kunststoffschalten gezüchtet wurden. Wenn MDCK GH-DAF-Zellen chemisch mit Bis(sulfosuccinimidyl)suberat (BS3) quervernetzt wurden, wurde eine deutliche Bande bei 46 kDa (Dimer) und eine verschmierte Bande, die von 60 kDa bis zu 300 kDa reichte, durch Western-Blotten nachgewiesen (Figur 1 A) .
Um den Einfluss von Gangliosiden auf Sphingolipid-Cholesterin-Flöße zu untersuchen, wurden MDCK GH-DAF-Zellen mit verschiedenen
Konzentrationen von GM, für 1 Stunde in einem serumfreien Medium bei
37 °C beladen und mit BS3 quervernetzt. Wie man in Figur 1 A sehen kann, verringerte eine Behandlung von MDCK GH-DAF-Zellen mit GM, die Menge an quervernetztem GH-DAF signifikant. Die Quantifizierung der immunoreaktiven Banden ergab, dass 73 % ± 6 % von GH-DAF Oligomere in unbehandelten Zellen bildete, während 65 % ± 7 %, 57 % ± 7 % und
49 % ± 7 % von GH-DAF in quervernetzten Spezies in Zellen gefunden, die mit 1 0, 50 bzw. 1 00 μM GM, behandelt wurden. Eine Inkubation der Zellen mit Rinderhirngangliosiden (bbG) inhibierte ebenfalls effizient die Bildung von GH-DAF-Oligomeren (Figur 1 B) . Bei der Verwendung von 1 00 μM bbG betrug die Quervernetzungseffizienz 51 % ± 5 %, verglichen mit 73 % ±
6 % in unbehandelten Zellen. Um festzustellen, ob die Fähigkeit von Gangliosiden GPI-AP enthaltende Flöße aufzulösen, unabhängig vom Zelltyp ist, wurden CHO-Zellen, die permanent den GPI-verankerten Folatrezeptor (FR-GPl) exprimieren, in der gleichen Weise behandelt. Die CHO FR-GPI-Zellen wurden in einem Folat- freien Hams F-1 2-Medium gezüchtet, das 5 % FCS, Hygromycin ( 1 00 μg/ml) , Penicillin ( 1 00 U/ml) und Streptomycin ( 1 00 μg/ml) enthielt. Das Quervernetzen von CHO FR-GPI-Zellen mit BS3 führt zum Auftreten von quervernetzten Produkten von FR-GPl, wobei eine Quervernetzungseffizienz von 28 % ± 3 % beobachtet wurde. Wenn CHO FR-GPI-Zellen mit 1 00 μM GM, oder 1 00 μM bbG vor dem Quervernetzen beladen wurden, wurde die Quervernetzungseffizienz auf 2,7 % ± 2,5 % bzw. 3,3 % ± 2 % verringert (siehe Figur 2) .
Um die Menge an GM, zu quantifizieren, die in die Plasmamembran inkorporiert wird, wurden MDCK GH-DAF-Zellen mit 1 μCi/ml Tritium enthaltnedem GM, bei einer Gangliosidendkonzentration von 1 00 μM für 1 Stunde inkubiert. Hierzu wurde GM, extrahiert, gemäß bekannten Verfahren gereinigt (Tettamanti et al. , Biochim. Biophys. Acta 296 ( 1 973) , 1 60 - 1 70) und am C-3 der Langkettenbasengruppe radiomarkiert (Sonnino et al., J. Lipid Res. 25 ( 1 984), 620 - 629) . Die Homogenität der radioaktiven Verbindung 3H-GM, betrug über 99 % und ihre spezifische Radioaktivität betrug 1 ,31 Ci/mmol. Die Zellen wurden für 1 Stunde in DMEM, das 1 μCi/ml des Tritium enthaltenden GM, bei einer Gangliosidendkonzentration von 100 μM enthielt, inkubiert, mit PBS/BSA gewaschen und anschließend für 0 bis 45 Minuten mit PBS/BSA bei 37 °C inkubiert. Die Zellen wurden dann für 5 Minuten bei 37 °C mit 1 ml PBS, das 0, 1 % Trypsin enthielt, behandelt. Die Zelllysate wurden hinsichtlich des radioaktiven Gangliosidgehalts mit einem Flüssigkeitsszintillationszähler (Beckmann Instruments, CA) analysiert. Das Protein wurde unter Verwendung eines Protein Assay Reagents (BCA; Pierce, UK) bestimmt. Nur etwa 0,7 % des exogen zugegebenen Gangliosids assoziierte mit den Zellen. Etwa 35 % des gesamten assoziierten GM, konnte durch Inkubation der Zellen mit einer BSA-Lösung entfernt werden (Figur 3A) . Durch eine nachfolgende Behandlung der Zellen mit Trypsin konnten zwei Pools von assoziiertem GM, nachgewiesen werden. Etwa 30 % des verbleibenden GM, wurde durch eine Trypsinbehandlung freigesetzt (Trypsin-Iabiler Pool) und etwa 70 % war beständig (Trypsin-stabiler Pool) (Figur 3A) . Es wird angenommen, dass der Trypsin-stabile Pool von GM, den Molekülen entspricht, die in die Plasmamembran eingefügt sind, wohingegen der Trypsin-Iabile Pool aus Gangliosiden besteht, die mit Proteinen wechselwirken, die aus der Plasmamembran herausstehen (vgl . Masserini et al. , Biochemistry 29 ( 1 990) , 697 - 701 ; Saqr et al., J. Neurochem. 61 ( 1 993) , 495 - 41 1 ) . Der Trypsin-stabile Pool von GM, enthielt diejenige Fraktion angereichert, die gegenüber einer Extraktion mit Triton X-1 00 bei 4 °C beständig war. Nach einer Inkubation von Zellen mit 1 00 μM Tritium enthaltendem GM, wurden 3,74 nMol GM, (pro mg Protein) in der Detergenz-unlöslichen Fraktion gefunden, während 1 ,26 nMol GM, aus der löslichen Fraktion gewonnen wurden, was zeigt, dass sich exogenes GM, in den Flößen ansammelt.
Um auszuschließen, dass die Inhibition der Quervernetzung von GH-DAF aufgrund der Wirkung von lose mit der Oberfläche assoziierten Gangliosiden stattfindet, wurde das Quervernetzen an GM,-beladenen Zellen vor und nach der Inkubation mit BSA durchgeführt. Die Quervernetzungseffizienz blieb unter diesen zwei Bedingungen die gleiche (siehe Figur 3B, die Variation der Effizienz war kleiner als 5 % bei allen Bedingungen) . Somit sind Ganglioside, die mit der Membran fest assoziiert sind, für die Inhibition der Quervernetzung verantwortlich. Es wurde festgestellt, dass 70 % des fest assoziierten GM, in die Doppelschicht inkorporiert wurden gemäß dem von anderen Autoren verwendeten Kriterium (Kanda et al. , J. Biochem. (Tokyo) 91 ( 1 982), 1 707 - 1 71 8; Schwarzmann et al., Biochemistry 22 ( 1 983) , 5041 - 5048) . Der Anteil des Trypsin-Iabilen Pools am Quervernetzen ist somit, falls er überhaupt auftritt, sehr gering, insbesondere da die Löslichkeit von GH-DAF in TX-1 1 4 durch Ganglioside beträchtlich erhöht wurde. Dieses Verhalten kann mit an hervorstehenden Proteine bindenden Gangliosidmicellen nicht erklärt werden.
Beispiel 1 A
Zerbrechen von Cholesterin-reichen Mikrodomänen in MDCK-Zellen mit
Cholesterinsulfat
Cholesterinsulfat-metyhl-ß-cyclodextrin (MßCD)-Einschlusskomplexe wurden im Wesentlichen wie von Klein et al. ( 1 995), Biochemistry 34, S. 1 3784 beschrieben, hergestellt. 5 ml einer wässrigen MßCD-Lösung ( 1 0 mg/ml) wurden konstant bei 60°C auf einem Wasserbad gerührt und es wurden 0, 1 5 ml einer Cholesterinsulfat (CS)-Lösung ( 1 0 mg/ml in Isopropanol) in kleinen Portionen zugegeben. Die Lösung wurde für 1 0 Minuten bei 40°C ultraschallbehandelt, für 1 0 Minuten bei 1 00.000 g zentrifugiert und lyophilisiert. Der getrocknete Einschlusskomplex wurde schließlich in 300 μl Wasser gelöst, um eine 1 0 mM Vorratslösung bezüglich Cholesterinsulfat zu ergeben. MDCK GH-DAF-Zellen ( 1 06) wurden in eine 35 mm Kulturschale geimpft und die Zellen über Nacht zu hoher Dichte gezüchtet. Nach zweimaligem Spülen mit PBS wurden die Zellen mit Cholesterinsulfat-MßCD- Einschlusskomplexen in DMEM für 1 Stunde bei 37 ° C inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit eiskaltem PBS (phosphatgepufferte Salzlösung)/BSA (Rinderserumalbumin) (PBS enthaltend 2 mg/ml BSA) gewaschen, um Einschlusskomplexe zu entfernen und die Zellen wurden auf Eis für 5 Minuten gekühlt, bevor sie einem Quervernetzen unterzogen wurden. Routinemäßig wird beim Standardquervernetzungsprotokoll der membranimpermeable Quervernetzer bis-(Sulfosuccinimidyl)suberat (BS3) verdünnt auf 0,5 bis 1 mM in PBS verwendet. Zellen wurden mit einer BS3- Lösung für 45 Minuten bei 4°C inkubiert. Nicht umgesetztes Quervernetzungsmittel wurde mit 1 mM Glycin, gelöst in PBS für 1 5 min bei 4°C gequencht. Anschließend wurden die Zellen mit einem Triton X- 1 1 4 enthaltenden Puffer lysiert und es wurde eine Detergenz-reiche Phase hergestellt, um GPI-Ankerproteine anzureichern. Die Proteine wurden aus der Detergenz-reichen Phase präzipitiert, auf einem SDS-PAGE- Gradientengel aufgetrennt, auf Nitrocellulose geplottet und GH-DAF wurde mit Anti-GH-Antikörpern, HRP-konjugierten Sekundärantikörpern und ECL sichtbar gemacht.
Ähnlich wie bei der GM 1 -Behandlung war die Quervernetzung von GH-DAF signifikant vermindert.
Beispiel 2
Veränderung der Detergenz-Solubilität von GH-DAF durch Ganglioside
Ein oftmals verwendetes Kriterium zur Untersuchung der Assoziation eines Proteins an Mikrodomänen ist seine Extraktionsbeständigkeit gegenüber nicht-ionischen Detergenzien, wie etwa Triton X-1 00 bei 4°C (Brown et al., Cell 68 ( 1 992), 533 - 544). Es wurde deshalb die Detergenz-Solubilität von GH-DAF nach einer Gangliosidbeladung der Zellen untersucht. Es wurde gefunden, dass die Löslichkeit von GH-DAF in TX-1 1 4 signifikant von 51 ± 4 % auf 83 % ± 1 0 % bzw. 76 % ± 8 % in mit GM, bzw. bbG beladenen Zellen erhöht wurde (Figur 4A) .
Durch diese Ergebnisse wurde gezeigt, dass Ganglioside, die in die Plasmamembran eingefügt werden, GPI-APs aus Lipidmikrodomänen verdrängen. Eine Beeinflussung, insbesondere Hemmung der Quervernetzung durch sterische Hinderung durch Ganglioside, die an aus der Oberfläche der Plasmamembran hervorstehende Proteine gebunden sind, tritt somit nicht oder nur zu einem sehr geringen Teil auf. Es ist bekannt, dass eine Verringerung des Cholesterins in Zellmembranen die Löslichkeit von GPI-APs in nicht-ionischen Detergenzien erhöht (Cerneus et al., J. Biol. Chem. 268 ( 1 993), 31 50 - 31 55; Hanada et al., J. Biol. Chem. 270 ( 1 995), 6254 - 6260; Scheiffele et al. , EMBO J. 1 6 ( 1 997), 5501 - 5508) . Die Löslichkeit von GH-DAF wurde bei einer TX- 1 1 4 Extraktion auf 80 % ± 7 % nach einer Extraktion des Membrancholesterins mit CD verschoben (Figur 4B) . Im Gegensatz dazu verringert eine Stabilisierung der Mikrodomänen durch ein Antikörper-induziertes Quervernetzen die Solubilität von GH-DAF auf 34 % ± 7 % (Figur 4B) .
Die Ergebnisse zeigen, dass eine Modulation oder Veränderung des Lipidgehalts der zellulären Membran durch Verwendung von exogenen Gangliosiden sowohl das Clusterverhalten von GPI-APs als auch die Solubilisierung in TX-1 14 bei 4°C moduliert.
Beispiel 3
Wirkung von Gangliosiden auf Mikrodomänen
Wie oben gezeigt wurde, werden GPI-APs durch Beladen von MDCK-GH- DAF-Zellen mit Gangliosiden aus den Flößen verdrängt. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass diese Wirkung teilweise aufgrund von detergenzartigen Eigenschaften von Gangliosiden auftreten, wurde n-Octyl-ß-D- glukopyranosid (OG) eingesetzt. Dieses Detergenz ähnelt chemisch den Gangliosiden (es enthält beispielsweise eine Kohlenhydrat-Kopfgruppe) und es ist bekannt, dass es GPI-APs vollständig solubilisiert, wenn es oberhalb der kritischen Mizellenkonzentration (20 - 25 mM) verwendet wird. MDCK GH-DAF-Zellen wurden mit verschiedenen Konzentrationen von OG inkubiert und mit BS3 quervernetzt. Unter Verwendung der gleichen Konzentrationen von OG wie von den Gangliosiden ( 1 0 - 1 00 μM) wurde kein Einfluss auf das Quervernetzen von GH-DAF beobachtet. Selbst wenn Zellen mit einer 100fach höheren Konzentration an OG (10 mM) inkubiert wurden, wurde nur eine geringfügige Inhibition der Quervernetzung beobachtet (Figur 5; die Inhibition betrug 3,5 % ± 0,7 %) . Bemerkenswerterweise blieben selbst unter dieser Bedingung die Membranen intakt, da Caveolin-1 , ein Proteinmembran, das sowohl N- als auch C-Termini zum Cytoplasma hin angeordnet aufweist, nicht quervernetzt wurde. Nur wenn OG oberhalb seiner kritischen Mizellkonzentration (20 mM) verwendet wurde, wurde Caveolin- 1 als quervernetztes Produkt mit hohem Molekulargewicht gefunden. Die Behandlung der MDCK GH-DAF-Zellen mit 1 00 μM GM, führte nicht zum Quervernetzen von Caveolin- 1 . Diese Daten zeigen, dass die Inhibition der Quervernetzung von GH-DAF durch Ganglioside nicht aufgrund einer Solubilisierung der Membran durch detergenzartige Eigenschaften der Ganglioside auftritt.
Beispiel 4 Inhibition der Quervernetzung von GH-DAF mit Gangliosiden
In diesem Beispiel wird gezeigt, dass die Inhibition des Clusterns von GPI- verankerten Proteinen eine spezifische Eigenschaft von Gangliosiden ist. Ein Lipid, das kein Bestandteil der Sphingolipid-Cholesterin-Mikrodomänen ist, sollte keinen Einfluss auf das Quervernetzen und die Löslichkeit von GH- DAF zeigen. Günstigerweise sollten für einen solchen Kontrollversuch Phosphatidylcholinmoleküle verwendet werden, wie etwa solche die in Zellmembranen vorkommen. Diese Lipide können jedoch nicht durch exogene Zugabe in die Membran eingebracht werden. Für diesen Zweck wurden deshalb MDCK GH-DAF-Zellen mit einem partiell wasserlöslichen fluoreszenzmarkierten Analogon von Phosphatidylcholin (NBD-C6-HPC) inkubiert. Es ist bekannt, dass NBD-C6-Lipide bei geringer Temperatur schnell zur Plasmamembran gelangen und ihre Akkumulation in der Plasmamembran kann durch Immunofluoreszenzmikroskopie leicht beobachtet werden (Kean et al., J . Cell. Biol. 1 23 ( 1 993) , 1 403 - 1 41 9) . Es wurde nun die Detergenzunlöslichkeit von NBD-C6-HPC untersucht. Zellen wurden mit NBD-C6-HPC beladen und es wurde eine Detergenzextraktion bei 4°C mit Triton X-1 1 4 durchgeführt. Mehr als 99 % des NBD-C6-HPC wurde aus der Detergenz-Iöslichen Fraktion gewonnen, was anzeigt, dass das Lipid nicht mit den Mikrodomänen assoziiert vorliegt. Es wurde keine Veränderung im Quervernetzungsmuster nach Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen an NBD-C6-HPC beobachtet. Die Quervernetzungseffizienz betrug 73 % ± 5 % in mit 1 00 μM NBD-C6-HPC behandelten Zellen im Vergleich zu 73 % ± 6 % in Kontrollzellen (Figur 6A) . Auch die Löslichkeitkeit von GH-DAF (54 % ± 2 % löslich) wurde durch NBD-C6-HPC nicht verändert (Figur 4A) .
Um festzustellen, ob die Hemmung der Quervernetzung von GH-DAF durch Ganglioside reversibel ist, wurden MDCK GH-DAF-Zellen mit 1 00 μM bbG beladen und anschließend für 6 Stunden in einem Serum enthaltenden Medium vor dem Quervernetzen inkubiert. Wie in Figur 6B gezeigt, waren 6 Stunden Inkubation mit einem Serum enthaltenden Medium ausreichend, um nahezu vollständig das Quervernetzungsmuster von GH-DAF wieder herzustellen. Die Quervernetzungseffizienz war 6 % ± 1 % geringer als bei Kontrollzellen.
Die Detergenzunlöslichkeit von GH-DAF in TX- 1 14 wurde durch Inkubation von bbG-beladenen Zellen mit einem Serum enthaltenden Medium für 6 Stunden ebenfalls wieder hergestellt (61 % ± 4 % löslich) (Figur 4A) .
Dieses Beispiel zeigt, dass die Inhibition der Quervernetzung von GH-DAF mit Gangliosiden spezifisch und reversibel ist.
Beispiel 5
Die Verteilung von GH-DAF wird durch Ganglioside nicht verändert
Bei Sphingolipid-Cholesterin-Mikrodomänen oder Flößen handelt es sich um kleine und hochdynamische Strukturen, die durch herkömmliche mikroskopische Techniken nicht aufgelöst werden können. Es wurde untersucht, ob ein Beladen der Zellen mit Gangliosiden zu einer globalen Umordnung der Plasmamembran und somit der GPI-APs führt. Die Verteilung von GH-DAF auf MDCK-Zellen mit oder ohne Beladung mit bbG wurde durch Immunofluoreszenzmarkierung analysiert. Um eine Umverteilung von GH-DAF nach der Fixierung zu verhindern, wurde eine Formaldehγdfixierung kombiniert mit einer anschließenden Methanolfixierung verwendet (Härder et al., J. Cell Biol. 141 (1998), 929 - 942). Die Inkubation der Zellen mit 100μM bbG für 1 Stunde vor der Fixierung und die Antikörpermarkierung hatten keinen Einfluss auf die diffuse Verteilung von GH-DAF auf der Zelloberfläche (Figur 7A und B). Die intrazelluläre Färbung stammt von der Anordnung des Proteins im Golgi und/oder der endosomalen Anordnung. Eine Verringerung des Membrancholesterins mit 10 mM CD führte ebenfalls nicht zu nachweisbaren Veränderungen in der Verteilung von GH-DAF (Figur 7C). Im Vergleich hierzu führte die Zugabe von Antikörpern gegen GH-DAF vor der Fixierung zu einer fleckenartigen Verteilung des lmmunofluoreszenzsignals (Figur 7D). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Inhibition der Quervernetzung durch Ganglioside nicht aufgrund einer Umlagerung der Membran auftritt.
Beispiel 6
Beladen der Zellen mit Gangliosiden verändert den Autophosphorylierungszustand von Proteinkinasen
Dieses Beispiel zeigt, dass eine Korrelation zwischen der Verabreichung von Gangliosiden zu MDCK GH-DAF-Zellen und Zellsignalübertragungsvorgängen besteht. Als Anzeige einer Signalübertragung wurde der
Autophosphorylierungszustand von Zellproteinkinasen nach einer
Gangliosidbeladung von Zellen unter Verwendung eines In-Gel-Assays gemessen. Die Bedingungen für die Gangliosidbeladung waren die gleichen wie für die Untersuchungen zur Quervernetzung. Wie man aus Figur 8 sehen kann, stieg nach Zugabe von Gangliosiden die Intensität von verschiedenen Banden signifikant an (Pfeil), während andere Banden nur nach einer Gangliosidbehandlung sichtbar wurden (Pfeilköpfe). Hier ist zu beachten, dass ein chemischen Quervernetzen mit BS3 alleine nicht zu signifikanten Veränderungen des Autophosphorylierungszustands führt.
Diese Versuche zeigen, dass Ganglioside neben einer Modulation der Assoziation von GPI-verankerten Proteinen an Mikrodomänen Signalübertragungsvorgänge in MDCK-Zellen induzieren können.
Beispiel 7 Inhibition des Copatching von Influenza HA und GH-DAF durch Ganglioside
Bei Sphingolipid-Cholesterin-Mikrodomänen handelt es sich um kleine und hochdynamische Strukturen, die durch herkömmliche mikroskopische Techniken nicht aufgelöst werden können. Es wurde untersucht, ob ein Beladen der Zellen mit Gangliosiden zu einer Umverteilung von GPI-APs führt. Die Verteilung von GH-DAF auf MDCK-Zellen mit oder ohne Beladung mit bbG wurde durch Immunofluoreszenzmarkierung analysiert. Um eine Umverteilung von GH-DAF nach der Fixierung zu verhindern, wurde eine Formaldehydfixierung kombiniert mit einer anschließenden Methanolfixierung verwendet (Härder et al. , J. Cell. Biol. 1 41 ( 1 998) 929-942) . Die Inkubation der Zellen mit 1 00 μM bbG für 1 Stunde vor der Fixierung und die Antikörpermarkierung hatten keinen Einfluss auf die difuse Verteilung von GH-DAF auf der Zelloberfläche (Figur 8, Panelen A und B) . Die intrazelluläre Färbung stammt von der Anordnung des Proteins im Goigi und/oder der endosomalen Anordnung. Eine Verringerung des Membrancholesterins mit 1 0 mM CD führte ebenfalls nicht zu nachweisbaren Veränderungen in der Verteilung von GH-DAF (Figur 7 C) . Im Vergleich dazu führte die Zugabe von Antikörpern gegen GH-DAF vor der Fixierung zu einer Patch-artigen Verteilung des Immunofluoreszenzsignals (Figur 7 D) .
Das gleichzeitige Inkubieren von lebenden Zellen mit Antikörpern gegen mit den Mikrodomänen assoziierten Proteinen führt zur Umverteilung der unabhängig quervernetzten Komponenten in überlappende Patches. Ein Copatching wird aber nur für Floßmarker-Paare beobachtet, nicht für Paare bestehend aus einem Floß-Marker und einem nicht-Floß-Marker, woraus man schließen kann, daß Anziehungskräfte in der gemeinsamen Lipidumgebung von Floß-Proteinen vorhanden sind. Es wurde nun untersucht, ob die exogene Verabreichung von Gangliosiden die physikalische Verbindung von GH-DAF an Lipidmikrodomänen stört. Als einen mit den Mikrodomänen assoziierten Proteinmarker wurde das trimere Transmembranprotein Influenza Hämagglutinin (HA) in MDCK GH-DAF- Zellen exprimiert.
Die Zellen wurden gleichzeitig mit einem monoklonalen Anti-HA mAb und einem polyklonalen Anti-GH Ab bei 4 °C inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit den jeweiligen sekundären Antikörpern. Eine Mikroskopanalyse zeigte ein Copatching von HA und GH-DAF in der Hauptzahl der Zellen (60 % Copatching, 35 % teilweise Überlappung und 5 % zufällige Verteilung) (Figur 9A-F) . Wenn die Zellen für 1 Stunde mit 1 00 μM GM, vor dem Antikörper-induzierten Quervernetzen inkubiert wurden, wurde in den meisten Zellen nur ein partielles Coclustern von HA und GH- DAF beobachtet (31 % Coclustern, 50 % teilweise Überlappung und 1 9 % zufällige Verteilung) (Figur 9 G-L) . Diese Ergebnisse zeigen, dass die Anziehungskräfte zwischen Patches von HA und GH-DAF durch Verabreichung von Gangliosiden gestört werden, was zeigt, dass GPI-APs aus den Lipidmikrodomänen verdrängt werden.
Beispiel 8
Experimentelle Vorgehensweisen
In den vorstehenden Beispielen wurden die folgenden Vorgehensweisen verwendet:
Insertion von Lipiden, Verringerung des Cholesteringehalts und Octylglukosidbehandlung von Zellen:
Vorratslösungen von Rinderhirngangliosiden (bbG) oder GM, ( 1 - 1 0 mM) wurden in PBS hergestellt. Die Zellen wurden mit 1 0 - 1 00 μM Gangliosiden in DMEM für 1 Stunde bei 37 °C beladen (Masserini et al., Biochemistry 29
( 1 990), 697 - 701 ; Saqr et al., J. Neurochem. 61 ( 1 993), 395 - 41 1 ) . Um überschüssiges Lipid zu entfernen, wurden Zellen gründlich mit PBS gewaschen, das 2 mg/ml entfettetes BSA (PBS/BSA) enthielt. Eine ethanolische 0,5 %ige Vorratslösung von 2-(6-(7-Nitrobenz-2-oxa- 1 ,3- diazol-4-yl)amino)hexanoyl- 1 -hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (NBD-C6-HPC) wurde unter heftigem Vortexen in PBS injiziert, um eine 1 mM Lösung zu ergeben. Die Insertion von NBD-C6-HPC in Membranen wurde mit 1 0 - 1 00 M NBD-C6-HPC für 1 Stunde bei 8 °C durchgeführt. Um MDCK GH-DAF-Zellen von Cholesterin zu befreien, wurden sie für 1 Stunde bei 37 °C mit 1 0 mM Methyl-ß-cyclodextrin (CD) inkubiert. Für die Octylglukosidbehandlung wurden MDCK GH-DAF-Zellen für 1 Stunde bei 37 °C mit verschiedenen Konzentrationen an in DMEM gelöstem Octylglukosid inkubiert.
Detergenzextraktion: Die Zellen wurden mit kaltem PBS gewaschen und mit 1 ml TX- 1 1 4- Lysepuffer bei 4°C für 30 Minuten extrahiert. Die Zellen wurden abgeschabt und Proben für 30 Minuten bei 1 5.000 g bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand (lösliche Fraktion) wurde entfernt, das Pellet (unlösliche Fraktion) wurde in 1 ml Lysepuffer resuspendiert. Lösliche und unlösliche Fraktionen wurden mit 1 0 % TCA für 1 Stunde auf Eis präzipitiert und für 1 5 Minuten mit 1 5.000 g bei 4°C zentrifugiert. Die Pellets wurden mit Aceton (-20°C) gewaschen und mit SDS-PAGE und Western Blotting weiter verarbeitet.
Quervernetzen, Elektrophorese und Western Blotting: Das Quervernetzungsprotokoll wurde, wie kürzlich beschrieben, verwendet (Friedrichson et al., Nature 394 ( 1 998) , 802 - 805) . Kurz, Zellen wurden zweimal mit kaltem PBS gewaschen. Das Quervernetzen wurde mit 0, 5 mM BS3 für 45 Minuten bei 4° C durchgeführt. Nicht umgesetzter Quervernetzter wurde mit 50 mM Glycin für 1 5 Minuten bei 4° C gequenscht. Die Zellen wurden 20 Minuten bei 4° C und 1 0 Minuten bei 37 °C in einem TX- 1 1 4- Lysepuffer ( 1 50 mM NaCI, 1 0 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA, 1 % Triton-X-1 1 4 und Proteaseinhibitoren) lysiert. Die Lysate wurden kurz auf Eis gekühlt und durch eine 1 δminütige Zentrifugation bei 1 5.000 g geklärt. Die Überstände wurden einer temperaturinduzierten Phasenseparation für 5 Minuten bei 37 ° C unterzogen. Wässrige und Detergenz-angereicherte Phasen wurden durch Zentrifugation für 3 Minuten mit 1 3.000 U/min bei Raumtemperatur (RT) getrennt. Die wässrigen Phasen wurden verworfen und 0,9 ml TX- 1 1 4 Waschpuffer ( 1 50 mM NaCI, 1 0 mM Tris-HCI, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,06 % Triton-X- 1 1 4 und Proteaseinhibitoren) wurden den Detergenzphasen zugegeben. Nach einer I δminütigen Zentrifugation mit 1 5.000 g bei 4° C wurden die Proben einer weiteren Phasenseparation unterzogen. Schließlich wurden die Detergenzphasen mit kaltem Aceton (-20°C) präzipitiert und bei 95 °C für 5 Minuten in einem Lämmli- Probepuffer gekocht. Die Proteine wurden mit einer 5 - 1 5 % SDS-PAGE getrennt und auf Nitrozellulose überführt. Polyklonale Antikörper gegen GH und den Folatrezeptor gefolgt von den entsprechenden sekundären Antikörpern und ECL wurden verwendet, um GH-DAF und FR-GPl nachzuweisen. Immunreaktive Banden wurden durch densitometrisches Scannen von Filmen oder einen Lumineszenz-Image-Analysator LAS- 1 000 (Fujifilm, Deutschland) quantifiziert. Die Daten für jede Bedingung wurden gemittelt und die Veränderung als Standardabweichung ausgedrückt. Die Experimente wurden 3 bis 6 mal durchgeführt. Für einige Gelen wurden die entsprechenden Röntgenstrahlfilme unter Verwendung einer Fotoshop- Software gescannt und die optische Dichte der immunoreaktiven Banden wurde bestimmt und unter Verwendung von MacBas (Version 2.0) ausgedruckt.
Immunofluoreszenz:
Auf Deckgläsern gezüchtete Zellen wurden 3 mal mit PBS gewaschen und für 6 Minuten mit 3,7 % Paraformaldehyd in PBS bei 8 ° C und für 1 0 Minuten mit Methanol bei -20 °C fixiert. Anschließend wurden die Zellen für 30 Minuten bei Raumtemperatur mit einem Anti-GH-Antikörper in PBS inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit Cy3-konjugiertem Anti-Schaf-IgG für 30 Minuten bei Raumtemperatur. Nach jeder der obigen Inkubationen wurden drei Waschschritte mit PBS durchgeführt. Die Deckgläser wurden in Moviol eingebettet und es wurden Abbildungen mit einer hochauflösenden Digitalkamera C 4742-95 (Hamamatsu Photonics K. K., Japan) aufgenommen und die digitale Dekonvolution wurde unter Verwendung der digitalen konfokalen Routine Openlab (Version 1 .7.7) (Improvision, U K) durchgeführt.
Für die Antikörper-induzierten Quervernetzungsexperimente wurden der Anti-GH-Antikörper und das Cy3-konjugierte Anti-Schaf-IgG in DMEM verdünnt. Die Zellen wurden für 20 Minuten bei 37 ° C mit dem Anti-GH- Antikörper inkubiert, mit DMEM gewaschen und für 20 Minuten bei 37 °C mit Cy3-konjugiertem Anti-Schaf-IgG inkubiert. Die Zellen wurden fixiert und wie oben beschrieben in Moviol eingebettet.
In-Gel-Proteinkinase-Assay:
In Schalen mit 6 Vertiefungen gezüchtete Zellen wurden mit Gangliosiden beladen oder mit BS3, wie oben beschrieben, quervernetzt, auf Eis gekühlt, 3 mal mit eiskaltem PBS gewaschen und in 400 μl Lysepuffer (20 mM Tris- Acetat, pH 7,0, 0, 1 mM EDTA, 1 M EGTA, 1 mM Natriumorthovanadat, 1 0 mM ß-Glycerophosphat, 50 mM Natriumfluorid, 5 M Natriumpyrophosphat, 1 % TX-1 00, 1 mM Benzamidin, 2 μg/ml Leupeptin, 0, 1 % ß-Mercaptoethanol, 0,27 M Sucrose und 0,2 mM PMSF) für 30 Minuten bei 4°C lysiert und mit einem Gummiwischer abgekratzt. Die Lysate wurden für 1 δ Minuten bei I δ.OOO g geklärt und Aliquots wurden mit 5 x Probepuffer für 5 Minuten bei 95 °C gekocht. Die Proben wurden auf 5 - 1 δ % Gelen, die mit 5 mg/ml BSA polymerisiert waren, aufgetrennt. Der In-Gel-Proteinkinase-Assay wurde gemäß dem von van Dam beschriebenen Verfahren durchgeführt (van Dam et al., EMBO J. 1 4 ( 1 995), 1 798 - 1 81 1 ) , außer dass 65 μCi -32P-ATP in 3 ml Puffer K pro Gel verwendet wurden. Virale Infektion und Antikörper-induziertes Patching:
Für eine Infektion mit dem HA-Influenza-Virus wurde das Virus in einem Infektionsmedium (MEM, 50 mM Hepes, pH 7,3, Penicillin ( 1 00 U/ml)/Streptomycin ( 1 00 μg/ml), 0,2 % BSA) verdünnt und es wurde für 1 Stunde eine Virusadsorption durchgeführt. Die Infektion wurde weitere 2,5 Stunden fortgesetzt. 1 00 μM GM, , verdünnt in DMEM, wurden zu einigen Zellen während der letzten Stunde zugegeben. Für ein Antikörper-induziertes Patching von HA und GH-DAF wurden die Zellen mit einem polyklonalen Anti-GH-Antikörper und einem monoklonalen Anti-HA-PR8 (H 1 7L10), verdünnt 1 :3000 bzw. 1 :50 in DMEM inkubiert. Die Inkubation wurde für 1 Stunde bei 4 °C durchgeführt. Nach einem kurzen Waschen mit PBS/0,2 % BSA wurden die Zellen mit den entsprechenden FITC und Cy-3- gekoppelten sekundären Antikörpern für 1 Stunde bei 4 °C inkubiert. Die Zellen wurden fixiert, eingebettet und Abbildungen wie oben beschrieben genommen. Für die Quantifizierung wurden 60 zufällig ausgewählte Zellen aus zwei verschiedenen Experimenten als digitale Abbildungen gespeichert. Die Zellen wurden in drei verschiedene Kategorien gemäß dem Ausmaß der Überlappung zwischen den Patches eingeteilt: ( 1 ) Coclustern (mehr als 70 % Überlappung); (2) teilweises Coclustern; (3) zufällige Verteilung.
Die Erfindung betrifft somit insbesondere die Verwendung von Gangliosiden und anderen Substanzen zur Modulation von Sphingolipid-Cholesterin- Microdomänen. Sie kann z.B. zur Entwicklung von Wirkstoffen eingesetzt werden, die den Membrantransport, die Signalübertragung, die Zelladhäsion oder/und enzymatische Vorgänge in Säugerzellen beeinflussen. Die Modulation kann auch den Eintritt von Bakterien, Pathogenen und Viren in die Zellen verhindern.

Claims

Patentansprüche
1 . Verwendung von Gangliosiden, Gangliosidderivaten oder/und Cholesterinderivaten zur Herstellung eines Mittels zur Modulation von Sphingolipid-Cholesterin-Mikrodomänen.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel die Lokalisierung von Komponenten und deren Funktion aufden Sphingolipid-Cholesterin-Mikrodomänen beeinflusst.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel die Lokalisierung von Proteinen auf den Sphingolipid- Cholesterin-Mikrodomänen beeinflusst.
4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel die Lokalisierung von Ankerproteinen, acylierten Proteinen, Src-Kinasen oder/und Cholesterin-verankerten Proteinen und anderen Raftproteinen beeinflusst.
5. Verwendung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel auf Glykosyl-Phosphatidylinositol-Ankerproteine,
Kinasen der Familie Src, Influenza Virus Hämagglutin und andere Virusproteine oder/und Caveolin-1 , 2 oder 3 in der Sphingolipid- Cholesterin-Mikrodomäne wirkt.
6. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel einen Clusterabbau der Proteine bewirkt.
7. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gangliosid äuge wählt wird aus Rinderhirngangliosiden, GM, , GD 1 a, GD 1 b, GD3, GM2, GM3, GQ1 a, GQ1 b oder/und Globosiden und deren Derivaten, insbesondere ungesättigten Sphingosinen oder
Ceramiden mit ungesättigten oder kurzen Fettsäuren.
8. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Cholesterinderivate, insbesondere Cholesterinsulfat, eingesetzt werden.
9. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Modulation der Sphingolipid-Cholesterin-Mikrodomänen eine
Veränderung der Membrantransport-, Signalübertragungs- und/oder Zelladhäsionseigenschaften oder/und von enzymatischen Prozessen bewirkt.
1 0. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Modulation der Sphingolipid-Cholesterin-Mikrodomänen eine Veränderung der Proteolyse des Amyloidvorläuferproteins der Alzheimer Erkrankung oder eine Modifikation eines Prionproteins bewirkt.
1 1 . Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Modulation der Phingolipid-Cholestesrin-Mikrodomänen die Phagozytose von Bakterien und Parasiten in Säugerzellen verhindert.
1 2. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Modulation der Phingolipid-Cholesterin-Mikrodomänen die Aufnahme von Viren in Säugerzellen oder/und deren Transport und Freisetzung verhindert.
1 3. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel als Therapeutikum eingesetzt wird.
14. Verwendung von Gangliosiden, Galgiosidderivaten oder/und Cholesterinderivaten zur Modulation von Shingolipid-Cholesterin- Mikrodomänen.
1 5. Verfahren zur Modulation von Shingolipid-Cholesterin-Mikrodomänen, wobei einem Patienten Ganglioside, Gangliosidderivate oder/und
Cholesterinderivate in einer Dosis von 3 mg bis 30 mg pro kg pro Tag verabreicht werden.
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