JP2000502339A

JP2000502339A - 細胞内イノシトールトリスリン酸濃度の調節用組成物およびその用途

Info

Publication number: JP2000502339A
Application number: JP9523023A
Authority: JP
Inventors: ローゼンバーグ，アブラハム
Original assignee: アユルコア，インコーポレーテッド
Priority date: 1995-12-21
Filing date: 1996-12-23
Publication date: 2000-02-29
Also published as: EP0944309A1; EP0944309A4; US6083920A; WO1997022251A1; CA2241004A1; AU1467097A

Abstract

(57)【要約】ニューロンにおける異常なイノシトールトリスリン酸濃度の調節用の組成物と方法が開示されている。イノシトールトリスリン酸はニューロン内のカルシウムイオン濃度の増大を刺激する。このカルシウムイオン濃度は、調節されないと、脳の発作、および脳の無酸素症／虚血のような障害に続いて急性神経毒性を起こし得、またアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症のような疾患における慢性の神経毒性を生じ得る。イノシトールトリスリン酸の産生が阻害されるとカルシウムイオンレベルが異常に低くなり、ニューロンのアポトーシスが起こる。図はホスフィチジルイノシトール４，５-ビスリン酸からジアシルグリセロールとイノシトールトリスリン酸への変換を示している。

Description

【発明の詳細な説明】細胞内イノシトールトリスリン酸濃度の調節用組成物およびその用途発明の背景本発明はニューロン内のイノシトールトリスリン酸（ＩｎｓＰ₃）濃度の調節に係る。神経系内において、情報はニューロン細胞膜を横切るカルシウムイオンなどのイオンの流れによって発生する電気シグナルによりニューロンからニューロンへと伝達される。ある種の細胞表面受容体が結合を受けると、カルシウムは、選択的チャンネルを介して細胞内に入り、また細胞内貯蔵部位から放出されることもある。関与する細胞表面受容体としては、グルタミン酸などのような興奮性アミノ酸と結合するものがある。グルタミン酸およびその他のアゴニスト（後述）はＧタンパク質と共役する代謝調節型受容体に結合することにより、細胞内貯蔵部位からのカルシウムの放出を引き起こす生化学的カスケードを刺激する。代謝型グルタミン酸受容体には免疫学的に異なる７種のサブタイプがある（Ｍ１〜Ｍ７）。これらの受容体サブタイプのうちの２種、すなわちＭ１とＭ５は結合したときにホスホイノシチド特異的ホスホリパーゼＣ（以後「ホスホリパーゼＣ」という）を刺激することによって第二メッセンジャーＩｎｓＰ₃を産生する。このホスホリパーゼＣは、形質膜に存在する脂質であるホスファチジルイノシトールビスリン酸をジアシルグリセロールとＩｎｓＰ₃に変換する（この反応は図１に示されている）。代謝調節型受容体はＬ−グルタミン酸の他に、Ｌ−アルパラギン酸によっても、また薬理学的アゴニストのキスカル酸、イボテン酸およびトランス-ＡＣＰＤ（トランス- （＋−１）-１-アミノ-１，３-シクロペンタンジカルボン酸、Sch oeppet al.，Trends Pharmacol．Sci.，11:508-515，1990）によっても活性化される。また、Ｌ−アスパラギン酸およびアスパラギン酸アナログは、脳内のニューロンによって発現される代謝調節型受容体に対するアゴニストとしても機能する(Porter e t al.，Neurosci．Lett.，144:87-89，1992)。キスカル酸とイボテン酸は、代謝調節型受容体を刺激する他に、イオンチャンネルと共役するイオノトロピック受容体も刺激する(Watkins et al.，Trends Pharmacol．Sci.，11:25-33，1993)。したがって、興奮性アミノ酸受容体アゴニストのうち、トランス-ＡＣＰＤがホスホイノシチド結合代謝調節型受容体に対する選択性が高いと思われる(Desai a nd Conn，Neurosci．Lett.，109:157-162，1990)。薬理学的試験でも、Ｌ-トランス-ピロリジン-２，４-ジカルボン酸とＤ，Ｌ-ホモシステエイト(homocysteat e)がラットの脳組織における受容体共役ホスホイノシチド加水分解を刺激することも示されている(Li and Jope，Biochem．Pharmacol.，38:2781-2787，1989)。いくつかの神経障害の過程で代謝調節型受容体の過剰刺激(overstimulation) が起こると考えられる。この過剰刺激、そしてその結果としてのＩｎｓＰ₃産生増大により細胞内カルシウムのレベルが上昇して、重大な機能亢進欠陥(hyper-f unctional defect)（たとえば、Thomsen et al.，J．Neurochem.，62:2492-2495 ，1994参照）を生じ、最終的には神経毒性そして死に至るようなレベルになる(B erridge，Nature，361:315-325，1993; Choi and Rothman，Ann．Rev．Neurosci .，13:171-182， 1990)。脳内の代謝型グルタミン酸受容体の過剰刺激と関連のある特定の障害としては、大脳辺縁系の発作(Tiziano et al.，Neurosci．Lett. ，162:12-16，1993)、ならびにアルツハイマー病、ハンチントン病、パーキンソン病および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ、より一般的にはルーゲーリッヒ病(Lou Gehrig'sDisease)といわれている）などのような慢性の神経変性障害がある。プログラムされた細胞死またはアポトーシスといわれる別のタイプのニューロン細胞死は、代謝型グルタミン酸受容体の活性低下の影響を受けるようである(C opaniet al.，J．Neurochem.，64:101-108，1995)。同様に、ＩｎｓＰ₃の抑制は、細胞内カルシウムを低減することによってニューロンのアポトーシスを媒介すると考えられる。発明の概要本明細書に記載した研究は、活動亢進状態の機能およびニューロン細胞死と関連のある神経障害を治療するためにＩｎｓＰ₃の濃度を調節機構を変更することを目的としたものである。したがって、本発明はニューロン中のＩｎｓＰ₃の濃度を調節するための方法と組成物を提供する。（直接的または間接的のいずれかで）グルタミン酸興奮毒性(excitotoxicity)と関連のある障害が本発明の組成物と方法で処置するのに特に適している。図面の簡単な説明図１は、ホスファチジルイノシトール４，５-ビスリン酸（ＰＩＰ₂）のジアシルグリセロール及びイノシトールトリスリン酸（ＩｎｓＰ₃）への変換を示す図である。図２は、（リゾ）スフィンゴ脂質のスフィンゴシン、リゾスフィンゴミエリンおよびリゾセレブロシドの構造を示す図である。図３は、ＰＣ−１２細胞においてスフィンゴシン及びサイコシン（リゾセレブロシド）が基底(basal)およびブラジキニン刺激ホスホイノシチドシグナリングに及ぼす影響を示す棒グラフである。棒Ａは処理しなかった細胞を示し、棒Ｂは１０μMのブラジキニンに３０分間曝露した細胞を示し、棒Ｃは興奮毒性剤で処理する前に１００μg／mlのスフィンゴシンに30分間曝露した細胞を示す。図４は、ＰＣ−１２細胞におけるブラジキニン刺激ホスホイノシチドシグナリングのサイコシン抑制の濃度効果を示すグラフである。図５Ａと５Ｂは、２２５ナノモルのキスカル酸の注入から７日後の海馬のＣＡ１野の低倍率（図５Ａ）と高倍率（図５Ｂ）の走査画像である。図６Ａと６Ｂは、生理食塩水の注入から７日後の海馬のＣＡ１野の低倍率（図６Ａ）と高倍率（図６Ｂ）の走査画像である。図７Ａと７Ｂは、１２５ナノモルのサイコシンで処理し、次いで２２５ナノモルのキスカル酸に曝露した７日後の海馬のＣＡ１野の低倍率（図７Ａ）と高倍率（図７Ｂ）の走査画像である。図８は、４群の処置動物における痙攣又は痙縮の平均数（±ＳＥＭ）を示す棒グラフである。Ｑ＝キスカル酸、Ｐ＝サイコシン、ＳＰ＝リゾスフィンゴミエリン。図９は、３種の行動、すなわち歯をがたがた鳴らす(teeth chatter)、無動(ak inesia)および参集(mobilizing)の平均持続時間（分）（±ＳＥＭ）を示す棒グラフである。Ｑ＝キスカル酸、Ｐ＝サイコシン、ＳＰ＝リゾスフィンゴミエリン。詳細な説明スフィンゴ脂質は、末端のヒドロキシル基がホスホリル基、グリコシル基、その他の基で置換された長鎖の両親媒性アミノアルコールスフィンゴシンの脂肪酸含有化合物の誘導体に与えられた名称である。親のスフィンゴ脂質化合物の脂肪酸成分を欠く陽イオン性のスフィンゴ脂質はリゾスフィンゴ脂質といわれる。置換されてない遊離のスフィンゴシンならびにスフィンゴシンの末端が置換された誘導体であるリゾスフィンゴミエリン（スフィンゴシルホスホリルコリン）、リゾセレブロシド（グリコシルスフィンゴシンまたはサイコシンともいう）、リゾスルファチドおよびリゾガングリオシドはすべてリゾスフィンゴ脂質である。本明細書に開示されているように、非毒性の生理学的レベルで、天然に存在するスフィンゴシンは脳のニューロンにおいてＩｎｓＰ₃の産生を促進するが、天然に存在するリゾスフィンゴ脂質のうちリゾセレブロシドとリゾスフィンゴミエリンはＩｎｓＰ₃を強く抑制する（しかしこれ以外の天然のリゾスフィンゴ脂質にはこの性質がない）。また、リゾスフィンゴミエリンとリゾセレブロシドは、ニューロンが興奮性アミノ酸又は、アナログアゴニスト（たとえばイボテン酸やキスカル酸）に曝露されたときに誘発されるＩｎｓＰ₃の増大を強力かつ特異的に抑制することが開示されている。リゾスフィンゴミエリン及びリゾセレブロシドによるＩｎｓＰ₃の抑制はスフィンゴシンによるＩｎｓＰ₃の刺激と競合する。本発明は、異常な濃度のＩｎｓＰ₃と関連のある障害をもっているかまたはもっていると疑われる哺乳動物のニューロン細胞におけるＩｎｓＰ₃濃度を調節する方法を提供する。本方法は、ＩｎｓＰ₃の濃度を調節する単離された化合物及び製薬上許容される担体とを含有する組成物をその動物に投与する工程を包含する。この方法で達成される調節により、（リゾセレブロシドやリゾスフィンゴミエリンのような化合物によって引き起こされ得るように）ＩｎｓＰ₃の産生の低下、または（スフィンゴシンのような化合物によって引き起こされ得るように）ＩｎｓＰ₃の産生の増大がもたらされ得る。担体は、クエン酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、酢酸緩衝剤および重炭酸緩衝剤のような緩衝剤、アミノ酸、尿素、アルコール類、アスコルビン酸、リン脂質、血清アルブミンのようなタンパク質、ゼラチン、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、ポリビニルピロリドン、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、プロピレングリコール、およびポリエチレングリコール（たとえば、PEG-4000やPEG-8000）を包含する賦形剤から成り得る。接触させるニューロンは抹消神経系または中枢神経系内に存在し得る。脳内のニューロンが好ましい。上記組成物は熟練した薬理学者に公知のあらゆる経路で投与することができる。投与経路は、たとえば動脈内、脳内、肺内または経粘膜とすることができる。皮下注射、筋肉内注射または腹膜組織内注射による投与が好ましく、静脈内注射が最も好ましい。必要であれば、本発明の化合物または本発明の方法によって発見（送達？）される化合物を修飾して、血液脳関門を通過する効率を高めることができる。これらの化合物が血液脳関門を通過できるようにするためには、カプセル化した細胞移植物(encapsulated cell implant)（たとえば、CytoTherapeutics，Inc.、Pro vidence RIが製造しているもの。Bioworld Today 7:6，December 2，1996参照）として送達することができる。薬物の脳への送達はまたＲＭＰ−７^TM技術（Alke rmes，Inc.，Cambridge，MA。Business Wire,“Third Major Agreement for Pro lease SustainedRelease Drug Delivery System″(December 2，1996)参照）または薬物を含有する移植可能なウエハー（PR Newswire,“Implantable Wafer is First Treatment toDeliver Chemotherapy Directly to Tumor Site″Septembe r 24，1996参照）を用いても達成できる。また、本組成物は、鞘液内に直接投与するための移植可能なポンプ（たとえばMedtronic，Minneapolis，MN 作成のもの;Genetic Engineering News，“Neurobiotechnology Companies Focus Progra ms on Pain and Neuroprotection″,November 1，1996参照）を用いても投与できる。投与経路とタンパク質の送達量は熟練技術者の評価能力の範囲内の要因によって決定される。さらに、熟練技術者が知っているように、治療用物質の投与経路と投与量は治療投与量レベルが得られるまで所定の患者により変化し得る。投与量と処置の長さは、病気の種類と重篤度に依存すること、また年齢、体重、性別および全般的健康状態ならびに投与する化合物、投与の時間と経路、さらには同時に投与される他の薬物によって患者ごとに変化することが知られている。熟練技術者は適切な治療法を決定する際に、たとえばGregoriadis(Drug Carriers in Biology and Medicine，Academic Press)やGoodman and Gilman(The Pharmacol ogical Basis of Th erapeutics，6th Edition)を参照するであろう。さらに、熟練技術者は正確な治療投与量を決定する際に、実施例VIIIに開示されているように行動評価基準を評価したり、あるいは患者の認識能力または運動能力の標準的な試験を実施したりすることができる。一般に、本明細書に記載したＩｎｓＰ₃調節用物質の投与量は体重１kg当たり０．０１〜１００mgの範囲である。スフィンゴシン、リゾスフィンゴミエリンおよびリゾセレブロシドのようなスフィンゴ脂質は各々の化合物につき体重１kg当たり約０．５mg〜１．５mgの範囲で投与する方がより好ましい。患者の生存中ずっと規則的にＩｎｓＰ₃調節用化合物を投与する必要があると予想される。あるいは、ニューロンを in vitro で接触させてもよい。哺乳動物のニューロン組織でＩｎｓＰ₃を調節する化合物と製薬上許容される担体とを含有する薬剤組成物は本発明のもうひとつの態様である。この組成物は脳内のニューロンのようなニューロン内のＩｎｓＰ₃の濃度を、異常なＩｎｓＰ₃ の産生と関連のある障害を治療するのに充分な濃度に増大または低減することによってＩｎｓＰ₃の濃度を調節することができる。細胞内ＩｎｓＰ₃の増大が望まれる場合、本発明の単離された化合物はスフィンゴシンなどのリゾスフィンゴ脂質であるが限定されることはない。細胞内ＩｎｓＰ₃の低減が望まれる場合、本発明の単離された化合物はリゾスフィンゴミエリンやリゾセレブロシドなどのリゾスフィンゴ脂質であるが限定されることはない。本発明の組成物がイノシトールトリスリン酸濃度を調節するメカニズムはホスホイノシチダーゼ特異的ホスホリパーゼＣの活性を調節するものが好ましい。本組成物はニューロン内のＩｎｓＰ₃を in vitro または in vivo で調節するのに使用することができる。本発明によって製薬上許容できる担体中にリゾスフィンゴ脂質を含有する組成物が提供される場合、そのリゾスフィンゴ脂質はＤ−エリスロ異性体であって、（１）トランス-４二重結合、（２）正味で正の電荷、（３）８個以上の炭素原子が連続して結合した脂肪族鎖、および炭素原子１の酸素原子上の正味で中性の電荷の置換基を有することを特徴とするものが好ましい。この置換基は水素、単糖、二糖、三糖、多糖、ホスホリルコリンおよびホスホリルエタノールアミンのいずれでもよく、またこれらに限定されることもない。好ましくは、これらのパラメーターに合致しタンパク質１mg当たり ng という生理学的なレベルで存在するもの(Kol esnick，J．Biol．Chem.，264:7617，1989)は天然に存在するリゾスフィンゴ脂質のスフィンゴシン、サイコシンおよびリゾスフィンゴミエリンである。スフィンゴシンの二重結合を水素化によって飽和すると、膜挿入電位(membrane insert ion potential)がスフィンゴシンの１／３未満のスフィンガニンという化合物が生成する。アミノ基がアミド化され非イオン性にされているＮ-アセチルスフィンゴシンまたはセラミドのような化合物はこの系において生理学的効果をほとんどまたはまったくもっていないようである。陽イオン性の遊離の塩基である４- トランスエン性(4-trans-enic)の両親媒性物質は生理学的な活性を提供する。イオン的に中性な１-Ｏ-置換は阻害活性をもたらす。ＩｎｓＰ₃の産生を、好ましくはニューロンにおいて、調節する化合物を同定する方法も本発明によって提供される。この方法では、ＩｎｓＰ₃の産生を調節するのに充分な条件下でニューロンをある化合物およびイノシトール（たとえばトリチウム標識したイノシトール）と in vitro または in vivo で接触させる。その後イノシトールトリスリン酸の生成量を測定する。ＩｎｓＰ₃の濃度変化は当業者に公知の標準的な技術によって測定することができる。たとえば、予め標識した出発物質のイノシトールから生成した放射標識ＩｎｓＰ₃の量を追跡することができる。あるいは、神経障害のある哺乳動物の症状を追跡することができる。本発明のこの方法で同定される化合物はＩｎｓＰ₃産生の増大または低減を調節することができる。また、ニューロンのイノシトールトリスリン酸濃度を調節する化合物を同定する本方法では、そのニューロンを、ＩｎｓＰ₃を調節する第二の化合物と接触させる工程も包含し得る。また本発明は、ＩｎｓＰ₃の産生を調節するのに充分な条件下でニューロンと接触する第一の化合物および第二の化合物も提供する。神経系は、ニューロンに加えて、神経系中で修復過程に関係しニューロンを支持するアストロサイト、シュワン細胞およびミクログリアのような神経グリアも含んでいる。神経グリアとニューロンは表現型が異なる細胞型である。たとえば、アストロサイトは主要なアドレナリン（興奮性アミノ酸よりむしろ）代謝調節型受容体をもっており、これらの細胞におけるＩｎｓＰ₃の産生はスフィンゴシンによって高められ、サイコシンによって抑制される(Ritchie et al.，Biochem．Biophy s．Res．Commun.，186:790-795,1992)。また、アストロサイト内でＩｎｓＰ₃がカルシウムイオン濃度およびシグナリングを調節する仕方は、脳ニューロン内のものと異なっている。すなわち、アストロサイトにおいては、スフィンゴ脂質によるＩｎｓＰ₃産生の調節は、ＩｎｓＰ₃産生のα-アドレナリン刺激によって、百日咳毒素での処理によって抑制されるＧタンパク質中間体を介して生起する（ Ritchie ら、上掲）。さらに、アストロサイトで産生されたＩｎｓＰ₃はギャップ結合を通して他の細胞に連絡されるが、一方ニューロンにおいてはＩｎｓＰ₃ はそれがＣａ²⁺の濃度を調節する細胞の内部に止まる。本出願人らは、スフィンゴシンが任意のアゴニストによる興奮性アミノ酸受容体の刺激とは独立して脳ニューロン内のＩｎｓＰ₃の基本レベルを増大する（スフィンゴシンの効果は興奮性アミノ酸受容体の下流で起こる）ことを示した。興奮性アミノ酸類似体は構造上および機能上スフィンゴ脂質とは関連しない（これらの作用がシグナリング経路の異なる点で起こることによって反映される）ので、これらの類似体から本発明は予測されない。薬剤のクロールプロマジン（１０-（３-ジメチルアミノプロピル）-２-クロロフェノチアジン）はラットのＣ６グリオーマ細胞内でＩｎｓＰ₃のレベルを上昇させる(Leli and Hauser．Biochem．Biophys．Res．Commun.，135:465-472，198 6)。しかし、クロールプロマジンは本発明のスフィンゴ脂質組成物とは構造上および機能上関連がないので、本発明を予測させるものではない。スフィンゴシンおよびいくつかのスフィンゴシン誘導体は、リンパ球、好中球、顆粒球、チャイニーズハムスター卵巣細胞および血小板のような非ニューロン性細胞型においてジアシルグリセロールやホルボールエステルによって活性化されるプロテインキナーゼＣアイソフォームを阻害する(Hannum and Bell，Trends Biochem． Sci.，20:73-77，1987; Grove and Maestro，Biochem．Biophys．Re s．Commun.，151:94-99，1988)。しかし、本明細書に開示されているように、スフィンゴシンの脳ニューロンに対する効果はプロテインキナーゼＣ阻害とは独立している。すなわち、プロテインキナーゼＣ阻害剤であるスタウロスポリンは、興奮性アミノ酸に応答する脳ニューロン内でのＩｎｓＰ₃産生に対するスフィンゴシン、リゾセレブロシドまたはリゾスフィンゴミエリンの効果に影響を与えない。その結果、ニューロン内のカルシウムイオン濃度を調節するためのプロテインキナーゼＣ媒介経路とホスホリパーゼＣ媒介経路とは独立である。したがって、プロテインキナーゼＣ経路に影響する化合物は、本発明のスフィンゴ脂質のような化合物のホスホリパーゼＣ経路調節に及ぼす効果を予測させるものではない。アミノ酸グリシンの合成類似体（（Ｓ）-４-カルボキシ-３-ヒドロキシフェニルグリシン）は代謝調節型（イオンチャンネル型ではない）アミノ酸受容体をブロック（遮断）し、そのため発作に対する保護を与えると考えられる（Thomsen ら、上掲）。しかし、治療薬グルタミン酸アンタゴニストによるグルタミン酸応答性代謝調節型受容体の遮断は、これらのアンタゴニストが一般に毒性であるためほとんど実際的ではない(Michel and Agid，J．Neurosci．Res.，40:764-775 ，1995)。対照的に、本発明の組成物と方法は細胞表面受容体の下流で作用する天然のリゾスフィンゴ脂質を含有する。これらの物質は毒性の危険性が低下している。本発明の顕著な効果は、天然に存在する化合物を非毒性の生理範囲で使用するので、非天然の合成薬剤化合物による治療に伴なって起こり得る患者に対する危険および望ましくない副作用が制限されるということである。リゾスフィンゴ脂質は代謝され、合成受容体遮断薬の場合のように患者に危険なレベルまで蓄積されることがない。また、本発明で使用するリゾスフィンゴ脂質は肝臓による解毒作用や腎臓による排泄作用に依存しないので、肝臓や腎臓に対する障害の危険も最小限に抑えられる。加えて、受容体の遮断は正常な脳の機能を乱すが、これはホスホリパーゼＣをターゲッティング化し受容体の機能がニューロンのイオンバランスを調節できるようにすることで回避することができる。本発明の別の効果は、本発明の天然に存在する化合物が入手容易であるので、合成薬剤を使用するより本発明を利用する方が患者にとってずっと安上がりであり得るということである。本発明の目的は、哺乳動物におけるグルタミン酸の興奮毒性と関連のある症状を処置するのに使用することができる方法と組成物を提供することである。これらの症状としては、脳の無酸素症または虚血、脳の発作活動(seizure activity) から生じる急性症状、ならびにアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病および筋萎縮性側索硬化症などのような慢性症状があるが、これらに限られるわけではない。本発明の他の特徴と利点は以下の詳細な説明および請求の範囲の記載から明らかとなろう。本明細書に記載した方法および材料と類似または等価なものも本発明を実施または試験する際に使用することができるが、好ましい方法と材料について以下に述べる。リゾスフィンゴ脂質がＩｎｓＰ₃の産生に影響を与え、この産生がニューロン内のカルシウムイオンの濃度を調節するという知見によって、さまざまなニューロンの障害における異常なＩｎｓＰ₃の産生を調節するための本明細書に記載した組成物と方法が実現された。本発明を実施するのに使用することができる組成物と方法の非限定例を以下に記載する。実施例１：ニューロンの細胞培養物の調製発生８日目の白色レグホンニワトリの胚の終脳からニューロンの初代培養物を調製した(Rosenberg et al.，J．Biol．Chem.，267:10601-10612，1992)。このニューロンを、Ｌ−ポリリシンを塗布した２４ウェルのプラスチック組織培養プレートに播種した。ニューロンの密度はウェル当たり細胞１０⁵個であり、これを５００ng/Lの亜セレン酸ナトリウム、５００μg/Lのトランスフェリンおよび１６５ピコモル/LのＥＧＦを含有するダルベッコ改良イーグル培地／ハム(Ham) 高グルコースＦ−１２培地（１：１、容量／容量）で培養した。培養を３７℃でＣＯ₂ ５％の空気中に４日間維持したところ、その時までに細胞は神経突起を有する表層顆粒ニューロン(cortical granulocytic neuron)に分化していた。これらの成熟胚ニューロンの培養物をホスホイノシチド加水分解アッセイ（実施例２に記載）に使用した。ラット副腎褐色細胞腫細胞株由来のＰＣ１２細胞を末梢神経系由来のニューロンのモデルとして使用した。これらの細胞は共通の実験室細胞培養ストックから得、５％の熱不活化ウマ血清と１０％の熱不活化ウシ胎仔血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を入れたプラスチック培養フラスコで増殖させた（ＰＣ１２細胞はAmerican Type Culture Collectionから受託番号第ＣＲＬ１７２１号として入手することもできる）。細胞を３７℃でＣＯ₂ ５％の空気中でコンフルエントな単層が形成されるまで増殖させた。細胞を２４ウェルのプラスチック組織培養プレートにウェル当たり細胞１０⁵個の密度で分散させ、ホスホイノシチド加水分解アッセイ（実施例２に記載）に使用した。実施例２：ホスホイノシチド加水分解アッセイによるイノシトールトリスリン酸産生の測定以下の手順により、ホスホイノシチドの受容体に刺激された加水分解と刺激されてない基底の加水分解とを測定した。細胞のホスホイノシチドを代謝的に標識するために、ニワトリの皮質ニューロンの初代培養物（実施例１に記載）を、ウェル当たり１μCiの［³Ｈ］ミオイノシトールを含有するダルベッコ改変イーグル培地０.５mlと共に一晩インキュベートした。次に細胞をダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１mlで二回洗浄し、４．５g/Lのグルコースを含有するＰＢＳを０．５ml添加した。次いで、水に溶解した塩化水素塩として調製したスフィンゴシン、サイコシン、リゾスルファチドまたはリゾスフィンゴミエリンを加えて特定のウェルで所望の細胞外濃度とし、そして２４ウェルプレートを２３℃で１時間ロータリーシェーカーにより穏やかに回転させた。次に細胞を１ml のＰＢＳで二回洗浄し、１０mMのＬｉＣｌを含有する０．５mlのＰＢＳと共に３７℃で１５分間プレインキュベートし、試験しようとする化合物を加えた。３０分後、実験を終了させるために、各ウェルに氷冷メタノールを１ml加え、各ウェルの中味を水０．４mlとクロロホルム１mlを含有するポリプロピレンチューブに移した。このチューブを充分にボルテックス後、５００×ｇで５分間遠心して水相とクロロホルム相とを分離した。各々のサンプルにつき上（水）層の試料１．５mlを、BioRad AG1X8 樹脂（ギ酸形態）を含有する小さいカラムにアプライした。遊離の［³Ｈ］イノシトールと［³Ｈ]グリセロホスホイノシトールを、５mM ホウ酸ナトリウムと６０mMギ酸ナトリウムを含有する溶液５mlと共にカラムへ通して洗浄した。１．０Ｍギ酸アンモニウム／０．１Ｍギ酸３mlを用いて、放射シンチレーションスペクトル分析用に全ホスホリル化［³Ｈ］イノシトール画分をカラムから溶出した。また、脂質に結合した［³Ｈ］ミオイノシトールの量を決定するために、各サンプルの下（クロロホルム）層の試料０．５mlをシンチレーションスペクトル測定によって放射分析した。ホスホリパーゼＣによるホスホイノシチド加水分解の評価は［³ 4Ｈ］イノシトールリン酸の生成量に基づいており、遊離および構成成分としての［³Ｈ］イノシトールの全体（ｄｐｍギ酸アンモニウム画分＋ｄｐｍクロロホルム画分）に対する生成［³Ｈ］イノシトール量の割合（％）として表す。実施例３：ニューロンにおけるＩｎｓＰ₃の産生Ａ．ＰＣ１２細胞におけるイノシトールトリスリン酸の産生ＰＣ１２細胞は、実際の痛みを生じるアゴニストであるブラジキニンに対して強いホスホリパーゼＣ結合代謝調節型受容体応答を示す。他のニューロン細胞と同様に、スフィンゴシンはＰＣ１２細胞におけるＩｎｓＰ₃産生の刺激されてない基本レベルを強壮的にアップレギュレーションした。サイコシンとリゾスフィンゴミエリンはＰＣ１２細胞におけるＩｎｓＰ₃の産生を強く抑制し、比較的中程度のレベルでもブラジキニンに対するＰＣ１２細胞の感受性を全体としてブロックすることができる。これらの知見結果を図３に示す。ＩｎｓＰ₃の抑制程度は、固定された曝露時間に対するサイコシン濃度の対数の関数である（図４）。ＰＣ１２細胞を５０μMの外因性サイコシンに３０分間曝露すると、１０μMのブラジキニンに対する代謝調節型応答を最大値の半分に下げるのに充分であった。Ｂ．培養したニューロンにおけるＩｎｓＰ₃の産生予め［³Ｈ］ミオイノシトールで標識した初代培養ニワトリ皮質ニューロンを用いて、グルタミン酸、アスパラギン酸を含む各種アゴニストならびに代謝調節型Ｍ１／Ｍ５受容体アゴニストであるイボテン酸およびキスカル酸に応答してＩｎｓＰ₃シグナリングが上昇したどうか検査した。表１に示した通り、スフィンゴシン、リゾセレブロシドおよびリゾスフィンゴミエリンは、ＩｎｓＰ₃シグナリングを有効に調節した。リゾスルファチドはこの系では抑制効果を示さなかった。すなわち、スフィンゴシンは皮質ニューロンにおいて刺激されてない基底のＩｎｓＰ₃レベルを有効に高めたが、サイコシンとリゾスフィンゴミエリンはこの高揚効果（スフィンゴシンによって起こされたにせよ、代謝型グルタミン酸受容体アゴニストによるものにせよ）を遮断した。ａ.１００μMアゴニスト、２０分。ｂ.PtdIns-P-nスプリットから計算し対照値に規格化した値（３．５０±０．０２％＝１．００）。ｃ．ニューロンは２０μ Mサイコシンまたは２０μMリゾスフィンゴミエリンと共に３０分間プレインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、アゴニストで処理した。ｄ．２０μMサイコシン＋２０μMスフィンゴシン、２０μMリゾスフィンゴミエリン＋２０μMスフィンゴシン。ｅ．Studentのｔ試験によってアゴニストのない対照と比較した。ｐ＝０．５。ｆ．ｐ＜１０-5（ｎ＝９）。実施例４：ニューロンのリゾスフィンゴ脂質含量のモニター代謝調節型受容体にアゴニストが結合するとニューロンの膜内のリゾスフィンゴ脂質のレベルに影響がある。しかし、培養したニューロン内のリゾスフィンゴ脂質含量の測定に利用できる便利な手法はない。そこで蛍光分析による追跡する感度のよい方法を考案した。以下にこの方法について述べる。培養したニューロンにおけるリゾスフィンゴ脂質含量の測定は、Nozowa らによってJ．Neurochem. ，59:607-609，1992に記載された４-フルオロ，７-ニトロベンゾフラン（ＮＢＤＺＦ）を用いた安定な蛍光タグ付け法に基づいている。この方法を、休止期のニューロン、１００μMの代謝調節型受容体アゴニストに１時間曝露したニューロン、リゾスフィンゴ脂質が外因的に富化された休止期のニューロン、および、リゾスフィンゴ脂質が外因的に富化され代謝調節型受容体アゴニストに１時間曝露したニューロンに適用した。これらのニューロンを１０⁷のバッチで掻き取り（直径が約８cmのペトリ皿１つが膜タンパク質２mgと等価である）、分析にかけた。ニューロンのサンプルからクロロホルム：メタノール（２：１、容量／容量）による抽出を繰り返して全脂質を取り出した。Van Veldhoven らの段階的クロマトグラフ法(Anal．Biochem.，183:177-189，1989)によって、ニューロンの全脂質からリゾスフィンゴ脂質を９０±５％の回収率（ｎ＝１０）で分離した。回収したリゾスフィンゴ脂質をNozowa ら（上掲）の迅速な方法によってＮＢＤＺＦで安定にタグ付けした。蛍光タグ付けしたニューロンリゾスフィンゴ脂質を、アセトニトリル：水（１０：０．５、容量／容量）による高性能シリカゲル薄層クロマトグラフィープレートで参照標準物質のＮＢＤＺＦ−Ｓｐｈ、ＮＢＤＺＦ− ＰｓｙおよびＮＢＤＺＦ−Ｌｓｍと並列に分離した。充分に分離した蛍光の強いバンドをプレートから掻き取った。蛍光タグ付けしたリゾスフィンゴ脂質を掻き取ったシリカゲルからメタノール：１ＮＨＣｌ（１：０．０２、容量／容量）で溶出する。この蛍光タグ付したリゾスフィンゴ脂質溶出液をPerkin-Elmer LS- 5 Fluorescence Spectrometerによる蛍光測定によって参照標準物質に対して定量した。休止期の刺激されてないニューロンはタンパク質１mg当たりスフィンゴシンを１１３±１３ピコモル、リゾセレブロシドを５０±１０ピコモル、リゾスフィンゴミエリンを５±０．２ピコモル含有していた（ｎ＝９）。Ｌ−グルタミン酸アゴニスト、たとえば１００μMのイボテン酸で１時間刺激したニューロンは、タンパク質１mg当たりスフィンゴシンを８５±３ピコモル、リゾセレブロシドを８０±５ピコモル、リゾスフィンゴミエリンを５２±２ピコモル含有していた（ｎ＝６）。アゴニストに対する曝露を延長すると抑制性のリゾスフィンゴ脂質が補償的に増大するように思われる。スフィンゴシンは、シス−ゴルジ(Burger and DeMeer，Trends CellBiol.，2:332-337，1992)の細胞質面において、グルコシルトランスフェラーゼ：リゾセレブロシド（サイコシン）シンターゼの作用によりＵＤＰ−グルコースのグルコシル残基がスフィンゴシンの１-Ｏ-位に移動することによってリゾセレブロシドに変換可能である(Schwarzmann and Sandhoff，Met hods in Enzymology，138:319-341，1987)。ＣＤＰ−コリンのホスホリルコリン残基の移動によるリゾスフィンゴミエリンの合成にも類似の系が存在する。ニューロンは大量のスフィンゴ脂質を合成し、全細胞スフィンゴ脂質の９２質量％は形質膜の外側の脂質二重層に存在する。シアロ糖スフィンゴ脂質は細胞タンパク質１mg当たり４０．８±１．９μgのレベルで存在し、スフィンゴミエリンは細胞タンパク質１mg当たり１２．１±３．０μgで存在する。スフィンゴシン、リゾセレブロシドおよびリゾスフィンゴミエリンに曝露したニューロンのスフィンゴ脂質含量を以下のようにして調べた。約１０⁷のニューロンを含有するペトリ皿を３mlのＤＭＥＭ中で５μCiの［³Ｈ］ミオ−Ｉｎｓと共に一晩インキュベートしてＩｎｓＰ₃が含有し得るホスホイノシチドを予め標識した。ニューロンをＰＢＳで洗浄し、４．５g／ｌのグルコースを含有する３m lのＰＢＳを添加した。スフィンゴシン、リゾセレブロシド、リゾスフィンゴミエリンの製剤(Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO)および各々の組合せをＰＢＳに溶解した塩酸塩として調製した。これらのリゾスフィンゴ脂質をペトリ皿に加えて０〜１５０μMの濃度範囲とした。皿を０．５時間、１時間または２時間室温に保持した後、ＰＢＳで洗浄し、グルコース／ＰＢＳ中のトリプシン５ユニットと共に３７℃で４時間インキュベートした。トリプシン処理によって、細胞外形質膜タンパク質ドメインに接着し得る非特異的に結合したリゾスフィンゴ脂質を除去する。リゾスフィンゴ脂質の陽イオン性ミセルとニューロンの糖衣との非特異的接着は臨界ミセル濃度を下回るリゾスフィンゴ脂質濃度で実験することによって回避される。ニューロンのリゾスフィンゴ脂質含量を前記のようにして分析した。５０μMのスフィンゴシンに１時間曝露した後、ニューロンのスフィンゴシン含量はタンパク質１mg当たり４３０±７０ピコモルであった（ｎ＝９）。５０μ Mのリゾセレブロシドに曝露した後のスフィンゴシン含量はタンパク質１mg当たり２２０±４５ピコモルであり（ｎ＝２０）、５０μMのリゾスフィンゴミエリンに曝露した後スフィンゴシンはタンパク質１mg当たり１０５±０．１５ピコモルであった（ｎ＝９）。実施例５：代謝調節型受容体機能のモニターリゾスフィンゴ脂質によるカルシウムイオンシグナリングの調節をアッセイすることによってインタクトなニューロンにおける代謝調節型受容体機能を検査した。約１×１０⁶個の皮質ニューロンを方形のＬ−ポリリシンコートカバースリップ上で培養し、リゾセレブロシドまたはリゾスフィンゴミエリンをタンパク質１mg 当たり１５０±２０ピコモルのレベルまで加えた。これらのニューロンを完全Ha m高グルコース培地／ＤＭＥＭ（１：１、容量／容量）にもどし、５μMのfura 2 /AM(Molecular Probes，Eugene，OR)を浸潤させた。fura 2は、カルシウムイオンとの結合の際その蛍光吸収の短波長側へのシフトがインタクトな細胞で測定可能であるカルシウムキレート剤である。ニューロン内カルシウムイオン濃度の変化を蛍光スペクトルの変化としてモニターした。ニューロンを３７℃で１０μMのグルタミン酸アゴニスト（たとえばイボテン酸）に３０分間曝露した。次に、カバースリップを、石英キュベットに移し２５０μMのsulfinpyrazone を含有する培地内に入れて fura 2/AM の拡散を防止した。Perkin-Elmer LS-5 Fluorescence Spectrometer（サーモスタットで３７℃ に設定、励起波長３４０nmおよび３８０nm、発光測定５００nm）で蛍光比を記録した。アゴニストで刺激したニューロンにおけるカルシウムイオンシグナリングは、イボテン酸に曝露したニューロンの場合に３．０±０．２任意単位(arbitra ry unit)であった。リゾスフィンゴミエリンまたはリゾセレブロシドを添加したニューロンにおいてアゴニストは対照に対して測定できる程のカルシウムシグナリングを引き出さなかったが、これは抑制性のリゾスフィンゴ脂質によってアゴニスト活性を有効にブロックすることができることを示している。実施例６：リゾスフィンゴ脂質の存在下におけるホスホリパーゼＣ活性のモニターＡ．溶液中の遊離のホスホリパーゼＣ活性のモニタースフィンゴシン、リゾセレブロシドおよびリゾスフィンゴミエリンが、免疫学的に単離された純粋なホスホリパーゼＣアイソフォームβ、δおよびγ（これらは市販されている）の速度論に及ぼす影響を検査した。各アイソフォームにつき、１ml当たり１μgのホスホリパーゼＣアイソフォーム、１００μMのホスファチジルイノシトールビスリン酸トリアンモニウム塩を含有する Tris-リンゴ酸緩衝液（５０mM、ｐＨ７．０）、０．０１μCiのトリチウム標識したホスファチジルイノシトールビスリン酸、１００mMのＮａＣｌ、１０mMのＣａＣｌ₂および５mM の２-メルカプトエタノールから成る反応媒体に１０μMのスフィンゴシンを加えた。このスフィンゴシンは、Ｖmax の約２倍の増大、最適な活性に必要とされるカルシウムイオン濃度の低減を誘発したが、基質のホスファチジルイノシトールビスリン酸に対するＫ_Mにはまったく効果を示さなかった。逆に、１０μMのリゾセレブロシドまたは５μMのリゾスフィンゴミエリンは、Ｖmax の６０％±１０％の低下、最適な活性に必要とされるカルシウムイオン濃度の５倍の増大を誘発したが、Ｋ_Mにはまったく変化をもたらさなかった。これらの観察結果は、リゾスフィンゴ脂質がカルシウムのホスホリパーゼＣを活性化する能力に影響を与え、この酵素の調節ドメインに作用することを示している。Ｂ．インタクトな膜におけるホスホリパーゼＣ活性のモニター生理学的に活性なホスホリパーゼＣは形質膜の内面部(endofacial portion)に存在する。その活性をインタクトな膜において検査する方法が提供される。以下に記載するニューロン膜調製物はインタクトな膜におけるホスファチジルイノシトールキナーゼ活性とホスホリパーゼＣ活性とに対するリゾスフィンゴ脂質の効果を決定するのに有用である。１００枚のペトリ皿の培養皮質ニューロンを培地１mL当たり５０μCiの［³Ｈ］ミオ-イノシトールと共に一晩インキュベートした。培養したニューロンの１０枚のペトリ皿のサンプル（１×１０⁸ニューロン、２３±２mgタンパク質、ｎ＝１５）をプールして、以下の手順により形質膜２．４±０．２mgを生成した。集めたニューロンを５mLの０．３２Ｍスクロース中でホモジナイズし、１０００×ｇで１５分間遠心した。上清を２mlの１．２Ｍスクロースの頂部に重層し、３００，０００×ｇで２０分間遠心した。沈降したペレットを１０秒間超音波処理して０．３μMのＣａＣｌ₂、１mMのＭｇＣｌ₂および０．０１％のアスコルビン酸を含有する５０mMのTris緩衝液（ｐＨ７．４）に再懸濁させた。懸濁させた形質膜調製物を２５０μｌのサンプルに分けた。各々が約１００μ ｇの膜タンパク質を提供する。スフィンゴシン、サイコシンおよびリゾスフィンゴミエリンを各形質膜サンプルに加えた。これらのサンプルを室温に３時間保ち、３００，０００×ｇで３０分遠心し、上清を捨てた。蛍光タグ付けにより、サンプルのリゾスフィンゴ脂質負荷量(loading)（すなわち、外因性スフィンゴ脂質に曝露後の膜リゾスフィンゴ脂質含量）を分析した。表２に、形質膜サンプルを１０μMのリゾスフィンゴ脂質に曝露した結果を示す。値は、形質膜タンパク質１mg当たりのリゾスフィンゴ脂質のピコモル数で示す。単離した形質膜およびインタクトなニューロンで得られた値を比較して示す。ニューロンアゴニストの存在下における形質膜サンプルでのホスホリパーゼＣ活性を以下のようにして決定する。［³Ｈ］ミオイノシトールで予め標識した対照とリゾスフィンゴ脂質負荷ニューロン形質膜調製物の一連の反復サンプルを、ホスファチジルイノシトールリン酸加水分解およびイノシトールリン酸放出に関して分析する。２５０μｌの緩衝液（０．３μMのＣａＣｌ₂、１mMのＭｇＣｌ₂ 、０．０１％のＬ−アスコルビン酸および１μMのＡＴＰを含有する５０mMのTri s緩衝液（ｐＨ７．４））中１００μgの膜タンパク質に相当する膜サンプルを３７℃で、各種濃度のニューロンアゴニストのグルタミン酸（０〜１００μM）、イボテン酸またはキスカル酸中でインキュベートする。各サンプルに１mlの氷冷メタノールの添加および２mlの氷冷クロロホルムの添加によって反応を停止する。ホスファチジルイノシトールリン酸の低減およびイノシトールリン酸の放出はホスホイノシチジルキナーゼ活性分析に関して記載したようにして薄層クロマトグラフィーで分析評価する。イノシトールリン酸の放出を形質膜調製物におけるタンパク質１mg当たりのリゾスフィンゴ脂質μgに対してプロットし、Fisherの最小自乗差テスト(Least Square Dif ference test)によって解析する。これらのデータにより、ニューロンの形質膜におけるホスホリパーゼＣ活性のリゾスフィンゴ脂質による調節を評価する。Ｃ．ニューロン形質膜におけるホスファチジルイノシトールキナーゼ活性のモニター細胞内でＩｎｓＰ₃産生を介してカルシウムイオンレベルを調節するのに使用される候補化合物を、それらが影響する酵素的過程によって評価する。ホスファチジルイノシトールキナーゼとホスホリパーゼＣという酵素はどちらも細胞質から形質膜の内面脂質二重層へ移動して生理活性を発揮する。形質膜調製物におけるホスファチジルイノシトールキナーゼ活性の影響を制御するために、ホスホリパーゼＣ活性をモニターする方法と共にホスファチジルイノシトールキナーゼの活性をモニターする方法が本発明により提供される。また、候補化合物の存在下でこれらの酵素の活性をモニターする方法も以下に提供される。以下の実施例においては天然に存在するリゾスフィンゴ脂質を試験する。ホスファチジルイノシトールキナーゼ（対照）およびリゾスフィンゴ脂質を負荷したニューロン形質膜サンプルを使用してホスファチジルイノシトールキナーゼ活性を試験する。リゾスフィンゴ脂質の含量を（リゾスフィンゴ脂質を負荷した膜において）外因性のリゾスフィンゴ脂質に曝露することにより増大させた。各サンプルの含量は１００μgの膜タンパク質に相当していた。膜サンプルをペレット化し、５秒間超音波処理することにより２５０μｌの緩衝液（０．３μM のＣａＣｌ₂、１mMのＭｇＣｌ₂および０．０１％のアスコルビン酸を含有する５０mMのTris緩衝液（ｐＨ７．４））に再懸濁させる。次にこれを０℃に冷却し、［³²Ｐ］−ＡＴＰ(DuPont NEN、１ＴＢｅｑ／ミリモル）を１μMまで加える。次いでサンプルを２０℃で１分間インキュベートし、氷浴に入れてホスホリル化を停止させる。サンプルを１mlの氷冷したメタノール：濃ＨＣｌ（２０：１、容量：容量）と共にボルテックスする。連続的にボルテックスしながら２mlの氷冷クロロホルムと１mlの水を加える。サンプルを２０００×ｇで１０分間遠心し、下層を取り出す。ホスファチジルイノシトールキナーゼ活性の尺度として、サンプルのホスファチジルイノシトールおよびそのモノリン酸誘導体とビスリン酸誘導体を分析する。各試験サンプルの試料、ならびにホスファチジルイノシトールおよびモノリン酸誘導体とビスリン酸誘導体の参照標準物質(Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO)を、たとえば薄層クロマトグラフィーで検定する。試料を、メタノール：水（１：１、容量：容量）に溶解した１％シュウ酸カリウムに前もって漬けておいたシリカゲルＧ薄層プレート(Merck)のクロマトグラフィーにかけ、１２０℃で１時間乾燥する。このプレートを、溶媒：クロロホルム：メタノール：酢酸：水の４０：１５：１２：１３：８（容量：容量）の混合物で展開する。展開したプレートに、脂質に結合したホスホリル基を可視化するモリブデンブルー試薬(Sigma)を噴霧する。ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルイノシトールモノリン酸およびホスファチジルイノシトールビスリン酸の含量を、BioRad 1-D分析プログラムと組合せた BioRad ビデオデンシトメーターの６２０型で走査することによって、膜タンパク質に対して分析する。次にバンドを掻き取り、Beckman LS 5 800 シンチレーションスペクトロメーターで放射能を分析する。膜タンパク質１mg当たりのリゾスフィンゴ脂質pgに対してｔ_1/2（１分）におけるホスホリル化標識をプロットすることによって、対照の活性とリゾスフィンゴ脂質を負荷した形質膜の活性とを比較する。データは、Fisher の保護最小有為差テスト(Fisher's protected least significant difference test)によって分析する。実施例７：神経障害を治療するためにニューロンにおけるイノシトールトリスリン酸の産生を in vivo で調節する方法異常なＩｎｓＰ₃産生と関連のある神経障害の症状を呈している哺乳動物に天然に存在するリゾスフィンゴ脂質のような化合物を投与することによってイノシトールトリスリン酸の産生を in vivo で調節する。ＩｎｓＰ₃産生の望ましくない増大と関連のある障害は先に概説したが、急性の脳無酸素症／虚血および脳発作が含まれ、一方慢性の障害としてはアルツハイマー病、ハンチントン病および筋萎縮性側索硬化症が挙げられる。ＩｎｓＰ₃産生の望ましくない低下と関連のある障害はニューロンのアポトーシスまたはプログラムされた細胞死である。化合物の投与は、この障害の症状が所望のレベルまで制御されるかまたは軽減されるような条件下で実施する。 in vivo でIｎｓＰ₃産生を調節するのに使用される候補化合物は、異常なＩｎｓＰ₃産生と関連のある神経障害を呈している動物にその候補化合物を投与することによってスクリーニングされる。そのような試験動物の例としては、聴原発作をもっているＤＢＡ／２マウス（Thomsen ら、J．Neurochem.，62:2492-2495，1 994。特に、神経活性化合物を動物に投与する方法を本明細書に包含させるために、参考として本明細書中に援用する）があるが、これに限られることはない。もうひとつ別の in vivo スクリーニングモデルでは、脳の虚血／無酸素症を引き起こすように外科的に総頸動脈が閉塞されているアレチネズミを使用する(Mat esik et al.，J．Neurochem.，63:1012，1994)。また、巣状虚血ラットモデル(Z obrist et al.，Stroke,24:2002，1994)およびβ-アミロイドペプチドで処理したアルツハイマー病モデルの成熟マウス(Hartmann et al.,Biochem．Biophys．R es．Commun.,194:1216,1993)も in vivo スクリーニングモデルとして参考に援用する。実施例８：in vivo 研究特定の代謝型グルタミン酸受容体アゴニストであるキスカル酸を脳の側脳室に適用（投与）すると、ラットで用量依存性の行動応答と海馬ニューロンの損失が生じる。高投与量（動物１頭当たり２５０ナノモル）の場合、キスカル酸はひどい痙攣および死をもたらした。中程度の量（動物当たり２２５ナノモル）ではキスカル酸は試験した動物の６０％で中程度の痙攣と死を引き起こす。低用量（動物当たり１５０ナノモル）の場合、動物は活動が活発になり、歯をがたがた鳴らす。適用の７日後、中用量と高用量のキスカル酸では海馬のニューロンが大幅に失われる。これらの動物を１２５ナノモルのリゾセレブロシド（サイコシン）またはリゾスフィンゴミエリンで前もって処置したところ、キスカル酸によって引き起こされる行動的・組織学的変化はなかった。このことから、リゾセレブロシドまたはリゾスフィンゴミエリンは in vivo で代謝型グルタミン酸興奮毒性を予防することができると結論された。さらに、これらの化合物は動物当たり１２５ナノモルもの高用量でも行動効果も神経毒効果も示さなかった。この実験で使用した動物は雄のＦ３４４ラット(Charles River Breeding Labo ratories)である。動物を個別に収容し、１２時間の明暗サイクルに曝露し、食物と水を自由に与えた。これらの動物の体重は各実験の開始時は約２５０ｇであり、毎日測定した。さらに、これらの動物は各実験の前に手で扱うことに慣れさせておいた。各種化合物を投与する前に動物をペントバルビタールナトリウム（５０mg／kg 、ｉ．ｐ．）で麻酔し、sterotaxic 器に入れた。２６ゲージのカニューレを、ブレグマの１．０mm後方、正中線から１．５mm外側、そして新皮質の背面の下４．０mmの位置で大脳の脳室に挿入した。カニューレに蓋をし、歯科用セメントで正しい位置に固定した。カニューレ挿入の１週間後、各治療薬１０μｌをマイクロポンプを介して、１０μｌ／分の速度でＩＣＶ（すなわち脳の脳室内に）注入した。この手順の間、動物は軽く束縛され、麻酔から覚めた。化合物の投与後注入用カニューレを１分間その位置に保持し、その後永久 in situ カニューレに蓋をした。投与した化合物は市販業者(Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO)から入手し、注射に先立って生理食塩水に溶かした。これらの化合物は、キスカル酸（１０ μｌ当たり１００ナノモル〜１マイクロモルの範囲の投与量で注射）、リゾセレブロシド、およびリゾスフィンゴミエリン（１０μｌ当たり２５ナノモル〜１５０ナノモルの用量で注射した）であった。Ａ．組織学的分析化合物を投与した７日後、中和した緩衝化１０％ホルマリン-生理食塩水を心臓に潅流させて(transcardial perfusion)動物を屠殺した。脳を取り出し、１０％ホルマリン-生理食塩水で一晩、後固定(post-fix)し、凍結ミクロトームで冠状面(coronal plane)に沿って（５０μmの厚みの切片に）薄切りした。これらの切片をクレジルバイオレットで染色して細胞の破壊の程度を決定した。各群のサブセットの動物を４％パラホルムアルデヒドの心臓潅流によって殺した。これらの動物の脳を取り出し、４８時間４％パラホルムアルデヒドで後固定し、ＰＢＳに入れ、パラフィンに包埋し、室温で冠状面に沿って６μmの厚さの切片に薄切りした。高濃度の代謝調節型受容体が海馬に存在し、海馬は虚血症や無酸素症を含むさまざまな発作の影響を特に受けやすいとして、この領域でグルタミン酸興奮毒性に起因するニューロン変性の証拠を検査した。クレジルバイオレット染色を用いた脳切片の組織学的分析により、ＩＣＶ注射したキスカル酸（２２５ナノモル）では生理食塩水を注射した対照（図６Ａ、６Ｂ）と比較して、海馬のＣＡ１錘体ニューロンが顕著に損失されること（図５Ａ、５Ｂ）、およびサイコシン（１２５ナリモル）による前処理でキスカル酸によるニューロン損失が抑えられること（図７Ａ、７Ｂ）が確認される。Ｂ．行動分析パイロット研究により、代謝調節型受容体の過大な活性化を示すのに使用することができる特定の行動尺度がいくつか同定された（表３）。これらの行動には痙攣、痙縮、歯をがたがた鳴らすこと、無動、および運動活動が含まれる。以下の実験は、本発明の化合物の投与後２時間にわたるこれらの行動の分析に基づいている。行動観察は、お互いに独立に働いており実験群に関して予備知識のない２人の訓練した観察者によって行なった。痙攣・痙縮の頻度、ならびに歯をがたがた鳴らす、無動および参集の持続時間を、本発明の化合物の投与前２０分と処置後２時間の間連続的に記録した。頻度と持続時間の平均は、注入後の平均から注入前の平均を差し引くことによって計算した。最初に行なった実験のうちのいくつかは、行動及び組織学的変化を生み出すのに必要とされるキスカル酸の量とこれら変化の影響を効果的に防止または逆にすることができるリゾスフィンゴ脂質の量を決定するために実施したものである。表３に、（上記のようにして注射した）キスカル酸の各種投与量に対するラットの行動応答および関連する組織学的変化の概要をまとめて示す。行動は起こった日付順に示す。四肢のクラスプ(clasp)および反射試験は皮質剥離の程度を示す。四肢クラスプまたは配置スコア０は正常を、スコア３は極めて異常である。キスカル酸の有効投与量は２２５ナノモルと決定され、リゾセレブロシドは１２５ナノモルと決定され、リゾスフィンゴミエリンは１２５ナノモルまたは１５０ナノモルと決定された（パイロット試験では高い方の投与量の方が信頼性があるようであった）。表４に示すデータは、キスカル酸の注入３０分前に脳の側脳室に直接注入したリゾスフィンゴ脂質の（行動に対する）影響を決定するためのパイロット試験の観察結果を表している。ＩＣＶカニューレ挿入の１週間後に実験を始めた。動物（１群のｎ＝６匹）を次の８つの処置グループのいずれかにランダムに割り当てた。（１）生理食塩水、（２）キスカル酸２２５ナノモル、（３）サイコシン１２５ナノモル、（４）リゾスフィンゴミエリン１２５ナノモル、（５）リゾスフィンゴミエリン１５０ナノモル、（６）キスカル酸２２５ナノモルおよびサイコシン１２５ナノモル、（７）キスカル酸２２５ナノモルおよびリゾスフィンゴミエリン１２５ナノモル、及び（８）キスカル酸２２５ナノモルおよびリゾスフィンゴミエリン１５０ナノモル。ベースライン観察期の後、２つのＩＣＶ注入のひとつ目を動物に施した（注入はいずれも、１０μｌの容量を１分間にわたって投与した）。上記の最初の５つのグループに対して、これは生理食塩水（１０μL／分）からなり、次の３つのグループに対しては、注入はそれぞれサイコシン１２５ナノモル、リゾスフィンゴミエリン１２５ナノモル、またはリゾスフィンゴミエリン１５０ナノモルであった。３０分後、すべての動物に二度目の注入をした。すなわち、上記最初の５つのグループに対しては、それぞれ生理食塩水、キスカル酸２２５ナノモル、サイコシン１２５ナノモル、リゾスフィンゴミエリン１２５ナノモル、及びリゾスフィンゴミエリン１５０ナノモルを注入した。残りの３つのグループにはキスカル酸２２５ナノモルを注入した。第二の注入後、動物をそれらのケージに戻し、その後２時間にわたって連続的に観察した。この観察期の間に２つの行動分析を行なった。ひとつは痙攣・痙縮の頻度、二つ目は歯をがたがた鳴らす、無動および運動活動の持続時間であった。図８に、主要な処置グループのうちの４つ（キスカル酸２２５ナノモル＋生理食塩水、キスカル酸２２５ナノモル＋サイコシン１２５ナノモル、キスカル酸２２５ナノモル＋リゾスフィンゴミエリン１２５ナノモル、およびキスカル酸２２５ナノモル＋リゾスフィンゴミエリン１５０ナノモル）に対する痙攣または痙縮の平均数を示す。残りの４つの対照グループ（生理食塩水、サイコシン１２５ナノモル、リゾスフィンゴミエリン１２５ナノモル、リゾスフィンゴミエリン１５０ナノモル）は図に示してない。これらの処置グループの動物は痙攣挙動を示さなかったからである。ツーウェイＡＮＯＶＡ(two way ANOVA)、すなわち痙攣または痙縮の平均数に対するグループＸの応答は有為なグループ効果（Ｆ（７．２４＝９．７５，ｐ＜．０５）を示していた。Bonferroni 調節を用いた多重比較によって、他の全てのグループと比較してキスカル酸のみを２２５ナノモル注射したグループでは痙攣／痙縮が有為（ｐ．＜０１）に多いことが分かった。サイコシン（１２５ナノモル）またはリゾスフィンゴミエリン（１２５ナノモルまたは１５０ナノモル）で前処理すると、痙攣または痙縮の数が有為（ｐ＜０１）に減衰したが、３つの処置グループ間で顕著な違いはなかった。二つ目の分析は歯をがたがた鳴らす、無動および参集の持続時間に関して行なった。図９に、３つの行動の各々の平均持続時間を示す。ツーウェイＡＮＯＶＡ、グループＸ行動は有為なグループ効果（Ｆ（７．３４）＝４．６６，ｐ＝０．０１）と有為な行動効果（Ｆ（２．６８）＝３．９８，ｐ＝０．０２３）を示していた。グループ効果に関するBonferroni 調節を用いた多重比較によって、キスカル酸のみを注射した動物は、リゾスフィンゴ脂質のみ（サイコシン１２５ナノモル、リゾスフィンゴミエリン１２５ナノモルまたは１５０ナノモル）を注射した動物やキスカル酸２２５ナノモルとリゾスフィンゴミエリン１５０ナノモルを注射した動物よりも３つの行動に関与していた時間が有為（ｐ＜．０１）に長いことが判明した。行動効果に関する多重比較によって歯をがたがた鳴らすことに比べて参集する時間の方が有為（ｐ＜．０５）に長いことが分かった。現状で好ましい態様に関連して本発明を説明したが、本発明の思想から逸脱することなくさまざまな修正をすることができるものと理解されたい。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 25/16 Ａ６１Ｋ 31/00 ６２６Ｆ 25/14 ６２６ＥＡ６１Ｋ 31/66 31/66 31/7004 31/70 ６０１ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．異常な濃度のイノシトールトリスリン酸と関連のある障害を有するかまたは有すると疑われる哺乳動物のニューロン細胞におけるイノシトールトリスリン酸濃度を調節する方法であって、細胞表面受容体の下流で作用することによりイノシトールトリスリン酸濃度を調節する単離された化合物と製薬上許容される担体とを含む組成物を該動物に投与する工程を包含する方法。２．前記調節がイノシトールトリスリン酸産生の低減である、請求項１記載の方法。３．前記化合物がリゾセレブロシドおよびリゾスフィンゴミエリンからなる群から選択される、請求項１記載の方法。４．前記調節がイノシトールトリスリン酸産生の増大である、請求項１記載の方法。５．前記化合物がスフィンゴシンである、請求項４記載の方法。６． in vivo で接触を起こさせる、請求項１記載の方法。７．前記ニューロンが中枢神経系のニューロンである、請求項１記載の方法。８．前記ニューロンが脳のニューロンである、請求項７記載の方法。９．前記ニューロンが末梢神経系のニューロンである、請求項１記載の方法。１０．ニューロンのイノシトールトリスリン酸濃度を調節する化合物を同定する方法であって、以下の工程：ａ）イノシトールトリスリン酸の産生を調節するのに充分な条件下でニューロンをイノシトールおよびある化合物と接触させる工程、ｂ）生成したイノシトールトリスリン酸の量を測定する工程を包含する方法。１１．前記化合物がイノシトールトリスリン酸の増大を調節する、請求項１０記載の方法。１２．前記化合物がイノシトールトリスリン酸の低減を調節する、請求項１０記載の方法。１３．前記ニューロンを、イノシトールトリスリン酸濃度を調節する第二の化合物と接触させる工程をさらに含む、請求項１０記載の方法。１４．ａ）哺乳動物のニューロン組織においてイノシトールトリスリン酸濃度を調節する単離された化合物、及びｂ）製薬上許容される担体を含む薬剤組成物。１５．前記調節が in vivo で起こる、請求項１４記載の組成物。１６．前記の単離された化合物がホスホイノシチダーゼ特異的ホスホリパーゼＣの活性を調節することによってイノシトールトリスリン酸濃度を調節する、請求項１４記載の組成物。１７．前記化合物がスフィンゴ脂質である、請求項１４記載の組成物。１８．前記スフィンゴ脂質のスフィンゴシン残基が、Ｄ-エリスロ異性体形であり、かつａ）トランス-４二重結合、ｂ）正味の正電荷、ｃ）炭素原子１の酸素上にある置換基、ここで該置換基は中性の正味電荷を有する、及びｄ）連続して結合した８個以上の炭素原子を含む脂肪族鎖を有することを特徴とする、請求項１７記載の組成物。１９．炭素原子１の酸素上にある置換基が、水素、単糖、二糖、三糖、多糖、ホスホリルコリンおよびホスホリルエタノールアミンからなる群から選択される、請求項１８記載の組成物。２０．前記組成物がイノシトールトリスリン酸の産生の増大を調節する、請求項１４記載の組成物。２１．前記化合物がスフィンゴシンである、請求項２０記載の組成物。２２．前記組成物がイノシトールトリスリン酸濃度の減少を調節する、請求項１４記載の組成物。２３．前記化合物がリゾセレブロシドおよびリゾスフィンゴミエリンからなる群から選択される、請求項２２記載の組成物。