EP1212360A2 - Sequences nucleotidiques issues de genes codant pour la trimethylamine n-oxyde reductase, et leurs utilisations, notamment pour la detection de bacteries - Google Patents
Sequences nucleotidiques issues de genes codant pour la trimethylamine n-oxyde reductase, et leurs utilisations, notamment pour la detection de bacteriesInfo
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- EP1212360A2 EP1212360A2 EP00966193A EP00966193A EP1212360A2 EP 1212360 A2 EP1212360 A2 EP 1212360A2 EP 00966193 A EP00966193 A EP 00966193A EP 00966193 A EP00966193 A EP 00966193A EP 1212360 A2 EP1212360 A2 EP 1212360A2
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0036—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on NADH or NADPH (1.6)
-
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
Definitions
- NUCLEOTIDE SEQUENCES FROM GENES ENCODING TRIMETHYLAMINE N-OXIDE REDUCTASE, AND USES THEREOF, IN PARTICULAR FOR DETECTION OF BACTERIA.
- the present invention relates to nucleotide sequences originating from genes coding for trimethylamine N-oxide reductase (TMAO reductase) and usable, in particular as primers, for the implementation of methods for detecting bacteria involved in the alteration the flesh of aquatic animals, and more particularly of marine animals.
- Trimethylamine N-oxide (TMAO) is one of the main components of small molecular weight in marine animals, where it can represent up to 1% of their dry weight. In anaerobic conditions, certain bacteria use TMAO as an exogenous electron acceptor for their respiration. The TMAO is then reduced to trimethylamine (TMA), a highly volatile compound, which is largely responsible for the foul odor of decomposing fish.
- TMAO reductase trimethylamine ⁇ -oxide reductase
- TMAO reductase which is responsible for 90% of the reduction in TMAO
- DMSO reductase is a 90 kDa periplasmic molybdoenzyme, which can be found as a monomer or dimer (5).
- the TMAO reductases of the various bacteria studied are all 80-100 kDa molybdoenzymes which can be found in the form of a monomer, dimer or tetramer. These proteins are all inducible anaerobically by TMAO, but also by DMSO (dimethyl sulfoxide). Finally, except in P. vulgaris, the TMAO reductases are all localized in the periplasm of the bacteria.
- TMAO reductase system The study of the TMAO reductase system at the genetic and molecular level was carried out in E. coli enterobacteria and those of the genus Rhodobacter.
- the two TMAO DMSO reductases from bacteria of the genus Rhodobacter and the inducible TMAO reductase from E. coli show homology at the level of their primary sequence (6, 7, 8).
- the overall structure of TMAO reductase from E. coli could be similar to those described for Rhodobacter sphaeroides or Rhodobacter capsulatus.
- E. coli enterobacteria The two TMAO DMSO reductases from bacteria of the genus Rhodobacter and the inducible TMAO reductase from E. coli show homology at the level of their primary sequence (6, 7, 8).
- the overall structure of TMAO reductase from E. coli could be similar to
- the genes that code for the different components of the TMAO reductase system are organized into an operon: the torCAD operon, which codes for the three proteins TorC, TorD and TorA (6).
- the genes which code for the various components of the TMAO / DMSO reductase system are also organized into operons: the operon dorCDA, which codes for three proteins DorC, DorD (also called DorB) and DorA, having homologies with respectively the proteins TorC, TorD and TorA from E. coli (9, 10).
- a phylogenetic study by sequencing of 16S rDNA was carried out on a bacterium isolated from a fish caught in the bay of Marseille, and kept at room temperature in filtered sea water.
- this bacterium which has a significant TMAO reductase activity, corresponds to a new species of the genus Shewanella, close to Shewanella putrefaciens. She was called Shewanella massilia.
- Shewanella massilia With the exception of the TorE protein, the products of the torECAD operon genes of S. massilia have strong homologies with the proteins involved in the TMAO reductase systems of E. coli and bacteria of the genus Rhodobacter (19).
- the overall structure of the TMAO reductase of S. massilia exhibits homologies with the structures already described of the TMAO / DMSO reductases of bacteria of the genus Rhodobacter (20).
- the first post-mortem changes that occur in fish flesh are not necessarily due to bacteria, but to certain autolysis reactions.
- microbial development quickly becomes the major element of spoilage, the muscle tissue of the fish constituting a substrate for bacterial growth.
- Several factors intrinsic to fish flesh can explain their very high alterability, compared to other food products: significant hydration, a high post-mortem pH (> 6), a high content of non-protein nitrogenous substances, of which TMAO forms the essential part and, a low content of supporting proteins (11, 12).
- Seafood therefore represents a highly perishable commodity, posing many conservation problems for fishing industry.
- the control of the freshness quality of these products is therefore an increasingly important concern for the entire fishing sector (producers, processors or distributors), leading for a few years manufacturers to seek new techniques making it possible to account the state of freshness of the fish in a very short time.
- total bacterial flora total bacterial flora
- the methods based on a bacteriological analysis (total bacterial flora) applicable to processed products are used more and more to assess the state of freshness of the fish.
- Direct estimation of the number of cultivable bacteria on a fish sample remains the most commonly used method: after growth on different media (for example iron citrate medium), each cell will form a visible colony on petri dishes, allowing thus a count.
- media for example iron citrate medium
- this technique is easy to use and quite sensitive, it still requires a significant incubation time for growth (3 to 5 days approximately).
- the composition of the growth medium, or the temperatures used for these tests (20-30 ° C) do not always make it possible to detect all of the spoilage bacteria.
- PCR polymerase chain reaction
- the present invention follows from the discovery by the inventors of the fact that the DNA sequences coding for a protein of the TMAO reductase system have sufficient homology within the various bacteria, in particular within the bacteria responsible for the alteration of the tissues of aquatic organisms, and more particularly within marine bacteria, to allow the implementation of methods for detecting all bacteria responsible for the alteration of tissues by their TMAO reductase activity, said methods being applicable to any aquatic animal, and especially on all marine animals.
- One of the aims of the present invention is to provide a test of the freshness quality of aquatic products, and more particularly of seafood, which is both rapid, inexpensive, and offering high reliability in terms of specificity and sensitivity.
- One of the other aims of the present invention is to provide a test for the detection, not of a bacterial type, but of all of the bacteria responsible for the deterioration of the tissues of aquatic organisms, and in particular the putrefaction of fish flesh, namely both marine bacteria, enterobacteria or bacteria isolated from brackish waters.
- Another object of the present invention is to provide a test for the detection of bacteria responsible for the alteration of the tissues of marine organisms, applicable to different species of fish from different geographic regions.
- Another object of the present invention is to provide a test for detecting bacteria responsible for the alteration of the tissues of marine organisms, sensitive enough to detect early stages of the alteration.
- the subject of the present invention is the use of nucleotide sequences chosen from those comprising a sequence coding for a protein of the trimethylamine N-oxide system. reductase (TMAO reductase) in bacteria, or a fragment of this sequence such as a probe or a primer of about 15 to about 25 nucleotides, or a sequence derived by addition, deletion, and / or substitution of one or more nucleotides of this sequence coding for a protein of the TMAO reductase system or of a fragment of the latter, said fragment and said derived sequence being capable of hybridizing, in particular under the hybridization conditions defined below, with said coding sequence for a protein of the TMAO reductase system, for the implementation of a method for detecting the presence of all bacteria involved in the process of degradation of the flesh of aquatic animals, in a host capable of carrying such bacteria.
- the nucleotide sequences coding for a protein of the system for the implementation of a method for detecting the presence
- TMAO reductase mentioned above are chosen from those corresponding to the torCAD operon or the DA gold operon mentioned above, of the TMAO reductase system in bacteria.
- sequence coding for a protein of the aforementioned TMAO reductase system is chosen from the sequences coding for TMAO reductase in bacteria, also designated protein TorA or DorA, or coding for a cytochrome type c in bacteria, also designated TorC or DorC protein.
- nucleotide sequences coding for a protein of the TMAO reductase system are chosen from those of the following bacteria: - marine bacteria, such as those of the genus Shewanella, Photobacterium or Vibrio, said sequences being chosen in particular among the following:
- enterobacteria such as those of the genus Escherichia, or Salmonella, said sequences being chosen in particular from the following: * the sequence SEQ ID NO: 9 coding for the protein TorA of Escherichia coli shown in FIG. 4,
- a more particular subject of the invention is the abovementioned use of nucleotide sequences chosen from the fragments of the sequences defined above, or from the sequences derived from these fragments, said fragments or derived sequences comprising approximately 15 to 25 nucleotides, and are used in pairs to form pairs of primers allowing the amplification of fragments of genes coding for a protein of the TMAO-reductase system of bacteria involved in the degradation of the flesh of aquatic animals, according to the PCR technique.
- nucleotide sequences are used in the form of primer pairs chosen from any one of the following three primer groups:
- the “DDN” primer group amplifying DNA fragments of the torA gene, this group comprising:
- - DDN1 + (SEQ ID NO: 12): 5 'CGG vGA yTA CTC bAC hGG TGC 3': mixture of 54 nucleotide sequences
- - DDN5 + (SEQ ID NO: 13): 5 'ATy GAT GCG ATy CTC GAA CC 3': mixture of 4 nucleotide sequences
- DDN- nucleotide sequence compositions: - DDN2- (SEQ ID NO: 14): 5'CGT Amw sGT CGA kAT CGT TrC GCT C 3 ': mixture of 32 nucleotide sequences,
- - DDN3- (SEQ ID NO: 15): 5 'GAC TCA CAy Awy TGy GAG TG 3': mixture of 16 nucleotide sequences
- - DDN4- (SEQ ID NO: 16): 5 'TGr CCd CGr kCG TTA AAG AC 3 ': mixture of 24 nucleotide sequences
- n (A, C, G, T)
- y (C, T)
- r (A, G)
- h (A, C, T)
- d (G, A, T)
- m (A, C)
- w (A, T)
- b (G, T , C)
- s (G, C)
- v (G, A, C)
- k (G, T)
- the pairs of primers being chosen such that one of the primers d 'a pair corresponds to one of the above-mentioned compositions of nucleotide sequences DDN +, BN + or BC +, while the other primer corresponds respectively to one of the above-mentioned compositions of nucleotide sequences DDN-, BN- or BC-, said pairs d primers being chosen in particular from any
- the hosts likely to be carriers of bacteria involved in the process of degradation of the flesh of aquatic animals, as described above, are aquatic organisms, in particular marine organisms such as fish and crustaceans, and more particularly the Atlantic fish such as sole, cod, or Mediterranean sea fish such as red mullet, sea bream, as well as some fresh or brackish water animals.
- a more particular subject of the invention is the aforementioned use of sequences, nucleotides described above, for the implementation of a method for detecting the presence of any bacteria involved in the degradation of the flesh of aquatic animals, in as part of a process for evaluating the state of freshness of the aquatic animals from which the test sample is taken, when the latter are extracted from their natural environment.
- the invention also relates to any nucleotide sequence corresponding to one of the following sequences:
- n (A, C, G, T)
- y (C, T)
- r (A, G)
- h (A, C, T)
- d (G, A, T)
- m (A, C)
- w (A, T)
- b (G, T, C)
- s (G, C)
- k (G, T).
- the subject of the invention is also any composition of nucleotide sequences in mixture, corresponding to one of the following compositions:
- DDN + nucleotide sequence compositions: - DDN1 +: 5 'CGG vGA yTA CTC bAC hGG TGC 5': mixture of 54 nucleotide sequences,
- DDN- nucleotide sequence compositions: - DDN2-: 5 'CGT Amw sGT CGA kAT CGT TrC GCT C i': mixture of 32 nucleotide sequences,
- BN- nucleotide sequence compositions: - BN2-: 5 'GG vyC rTA CCA bsC vCC TTC 3': mixture of 216 nucleotide sequences,
- n (A, C, G, T)
- y (C, T)
- r (A, G)
- h (A, C, T)
- d (G, A, T)
- m (A, C)
- w (A, T)
- b (GTC)
- s (G, C)
- v (G, A, C)
- k (G, T).
- the invention also relates to the pairs of primers chosen from one of the following groups of primers: (1) the “DDN” group of primers comprising:
- DDN5 + 5 'ATy GAT GCG ATy CTC GAA CC': mixture of 4 nucleotide sequences, the following “DDN-” nucleotide sequence compositions:
- - BN4- 5 'ATC Arr CCn swv GGC GTG CC i': mixture of 192 nucleotide sequences
- - BN5- 5 'GbC ACr TCd GTy TGy GG i': mixture of 72 nucleotide sequences
- n (A, C, G, T)
- y (C, T)
- d (G, A, T)
- m (A, C)
- w (A, T)
- b (G, T, C)
- s ( G, C)
- v (G AC)
- k (G, T)
- the pairs of primers being chosen such that one of the primers of a pair corresponds to one of the compositions of above-mentioned DDN +, BN + or BC + nucleotide sequences, while the other primer corresponds respectively to one of the above-mentioned compositions of DDN-, BN- or BC- nucleotide sequences, said pairs of primers being chosen in particular from any one of the following four couples:
- the subject of the invention is also a method of detecting all bacteria involved in the degradation of the flesh of aquatic animals in a host capable of carrying such bacteria, said method being carried out from a biological sample taken from this host, this biological sample corresponding in particular to a subcutaneous fragment of the flesh of the aquatic animal in question, and being characterized in that it comprises a step of hybridization of at least one nucleotide sequence as defined above , with fragments of genes coding for a protein of the TMAO-reductase system of bacteria involved in the degradation of the flesh of aquatic animals likely to be present in the biological sample taken from said host, followed by a revelation step, in particular by electrophoresis, of the possible presence in said sample of genes coding for a protein of the system TMAO-reductase, or fragments of these genes, the copy number of which has been amplified if necessary.
- the invention more particularly relates to a detection method as defined above, characterized in that it comprises the following steps:
- this treatment being carried out in particular at using a rapid DNA extraction technique based on the attachment of nucleic acids to silica beads, - the amplification of the number of copies of genes coding for the proteins of the system
- TMAO-reductase from bacteria involved in the degradation of the flesh of aquatic animals, or fragments of these genes, which may be present in this sample, using nucleotide sequences or primers mentioned above,
- the detection methods according to the invention are characterized in that the amplification of the number of genes coding for the proteins of the TMAO-reductase system comprises the following steps:
- the predenaturation of the total double-stranded DNA of the host into single-stranded DNA preferably in a buffer made up of 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KC1, 1.5 mMgCl 2 , 0.01% of gelatin, of the 4 constitutive DNA deoxynucleotides (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) at a concentration of 100 ⁇ M each, and pairs of primers, as defined above, by heating between approximately 90 ° C. and approximately 100 ° C, advantageously at 94 ° C., for approximately 1.5 minutes,
- kits for the implementation of a detection method mentioned above characterized in that they comprise:
- nucleotide sequences or primers as defined above,
- a DNA polymerase a reaction medium advantageously consisting of 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 50 mM KC1, 1.5 mM MgCl 2 , 0.01% of gelatin, of the 4 deoxynucleotides constituting DNA (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) at a concentration of 100 ⁇ M each.
- the invention also relates to any nucleotide sequence comprising: the sequence represented in FIG. 2 of the torA gene coding for the protein TorA of the marine bacterium Shewanella C,
- nucleotide sequence or of a sequence derived from the latter as defined above, said fragment preferably consisting of at least about 15 nucleotides.
- the subject of the invention is also any peptide sequence encoded by the above-mentioned nucleotide sequence shown in FIG. 2, and comprising:
- the invention also relates to any nucleotide sequence comprising:
- nucleotide sequence a sequence derived from the abovementioned nucleotide sequence, in particular by substitution, deletion or addition of one or more nucleotides, said derived sequence preferably having a homology of approximately 35% to 100% with the abovementioned nucleotide sequence shown in the figure 3
- nucleotide sequence or of a sequence derived from the latter as defined above, said fragment preferably consisting of at least about 15 nucleotides.
- the invention also relates to any peptide sequence encoded by the above-mentioned nucleotide sequence represented in FIG. 3, and comprising:
- the subject of the invention is also any nucleotide sequence comprising:
- any sequence derived from the abovementioned nucleotide sequence in particular by substitution, deletion or addition of one or more nucleotides, said derived sequence preferably having a homology of approximately 35% to 100% with the abovementioned nucleotide sequence shown in the figure 5, - or any fragment of the above-mentioned nucleotide sequence, or of a sequence derived from the latter as defined above, said fragment preferably consisting of at least about 15 nucleotides.
- the invention also relates to any peptide sequence encoded by the above-mentioned nucleotide sequence shown in FIG. 5, and comprising:
- FIG. 1 shows the alignment of the nucleotide sequences of the torA genes of Shewanella massilia (torA / S.m.), Shewanella c (torA / S.c), and Shewanella putrefaciens (torA / S.p.).
- FIG. 2 shows the complete nucleotide sequence of the torA gene encoding the TMAO reductase from Shewanella c.
- FIG. 3 represents the partial nucleotide sequence of the torA gene coding for the TMAO reductase of Photobacterium phosphoreum.
- FIG. 4 represents the alignment of the nucleotide sequences of the torA genes of Shewanella massilia (torA / Sm), of E. coli (torA / ⁇ . c), of Rhodobacter sphaeroides (TorA / Rs), and Rhodobacter capsulatus (TorA / rc).
- the arrows indicate the position of the different primers on the torA gene of the bacterium Shewanella massilia, developed from the conserved regions. More particularly, the positions of the various primers "DDN" and "BN" on the torA gene of S. massilia are as follows:
- FIG. 5 shows the partial nucleotide sequence of the torA gene coding for the TMAO reductase of Salmonella typhimurium.
- FIG. 6 shows the complete peptide sequence of TMAO reductase from
- FIG. 7 represents the alignment of the peptide sequences of the fragment of the protein TorA of Photobacterium phosphoreum (TorA / Pp), deduced from the DNA fragment amplified in P. phosphoreum using the molecular primers DDN1 + / DDN5-, with the corresponding protein regions of the TorA proteins of Shewanella massilia (TorA / Sm), of E. coli (TorA / ⁇ .c), and of Rhodobacter sphaeroides (DorA / Rs).
- FIG. 8 represents the alignment of the peptide sequences of the fragment of the TorA protein of Salmonella typhimurium (TorA / St), deduced from the DNA fragment amplified in S. typhimurium using the molecular primers DDN1 + / DDN5-, with the corresponding protein regions of the E. coli TorA protein (TorA / ⁇ . c), of the DorA protein of Rhodobacter sphaeroides (DorA / Rs), and of the TorA protein of Shewanella massilia (TorA / Sm).
- FIG. 9 represents the alignment of nucleic acid sequences of a highly conserved region of the gene which codes for the TMAO reductase of bacteria of the genus Shewanella and of E. coli, used for the development of one of the molecular primers "DDN" according to the invention.
- FIG. 10 represents the electrophoresis on agarose gel of the PCR products when the amplification is carried out from the chromosomal DNA of Shewanella massilia (tracks 1, 2, 3 and 4), of Shewanella c (tracks 5, 6, 7 and 8) and of Shewanella putrefaciens MR-1 (tracks 9, 10, 11 and 12) using the molecular primers DDN1 + / DDN5- (tracks 1, 5 and 9; expected size: 820 bp), DDN5 + / DDN2- (tracks 2, 6 and 10; expected size: 234 bp), DDN5 + / DDN3- (tracks 3, 7 and 11; expected size: 740 bp), DDN5 + / DDN4- (tracks 4, 8 and 12; size expected: 866 bp).
- Tracks M Size markers.
- FIG. 11 represents the electrophoresis on agarose gel of the PCR products when the amplification is carried out from the chromosomal DNA of Photobacterium phosphoreum using the pairs of primers DDN1 + / DDN5- (lane 1; size expected: 820 bp), DDN5 + / DDN2- (track 2; expected size: 234 bp), DDN5 + / DDN3- (track 3; expected size: 740 bp) and DDN5 + / DDN4- (track 4: expected size: 866 bp) .
- Tracks M size markers.
- FIG. 12 shows the agarose gel electrophoresis of PCR products when the amplification is carried out from the chromosomal DNA of S. massilia (lanes 1, 4, 7 and 10), of E. coli (tracks 2, 5, 8 and 11) and S. typhimurium (tracks 3, 6 and 9), using the pairs of molecular primers DDN1 + / DDN5- (tracks 1 to 3; expected size: 820 bp), DDN5 + / DDN2- (tracks 4 to 6; expected size: 234 bp), DDN5 + / DDN3- (tracks 7 to 9; expected size: 740 bp), DDN5 + / DDN4- (tracks 10 and 11; expected size: 866 bp).
- Tracks M Size markers.
- FIG. 13 represents the alignment of nucleic acid sequences of a very conserved region of the gene which codes for the TMAO reductase of bacteria of the genus Shewanella,
- Rhodobacter and E. coli used for the preparation of one of the molecular primers "BN" according to the invention.
- FIG. 14 represents the alignment of protein sequences of the cytochrome TorC of S. massilia (TorC / Sm), of E. coli (TorC / Ec) and of the cytochrome DorC of R.
- the couple BC1 + / BC2- leads to the amplification of the fragment with a size of 197 bp of the gene coding for the protein TorC in S. massilia, this fragment coding for the polypeptide of 66 amino acids delimited by the amino acids located at positions 114 and 179 of the peptide sequence of TorC of S. massilia.
- the couple BC1 + / BC3- leads to the amplification of the fragment of a size of 719 bp of the gene coding for the protein TorC in S.
- FIG. 15 represents the electrophoresis on agarose gel (2%) of the PCR products when the amplification is carried out from the chromosomal DNA of E. coli (lane 1), of S. typhimurium (lane 2), P. phosphoreum (lane 3), S. massilia (lane 4), R. sphaeroides (lane 5), or d ⁇ rwinia chrysanthemi (lane 6) using the molecular primers BC1 + and BC2-.
- the size of the expected DNA fragment (177 base pairs) is indicated by an arrow. Tracks M: Size markers.
- FIG. 16 shows the influence of fish chromosomal DNA on the specificity of the molecular primers according to the invention.
- the PCR amplification is carried out using the molecular primers DDN1 + and DDN5- in the presence of 2.5 ⁇ g (tracks 1 and 4), 5 ⁇ g (tracks 2 and 5), or 10 ⁇ g (tracks 3 and 6) d Purified chromosomal DNA from Herring.
- Lanes 4, 5 and 6 correspond to the tests carried out by adding 2.5 ⁇ l of Shewanella massilia cell suspension to the reaction mixture.
- Tracks M size markers.
- FIG. 17 shows the agarose gel electrophoresis (2%) of the PCR products when the amplification is carried out from total DNA extracted from decomposing fish flesh (cod: track 1 to 3 ; sole: track 4 to 6; sea bream: track 7 to 9 and red mullet: track 10 to 12) using primers BN6 + / BN4- (tracks 1, 4, 7 and 10, expected size: 364 bp) , primers BN6 + BN2- (tracks 2, 5, 8 and 11, expected size: 711 bp), primers DDN1 + / DDN5- (tracks 3, 6, 9 and 12, expected size: 820 bp).
- FIG. 18 represents the electrophoresis on agarose gel (2%) of the PCR products when the amplification is carried out using the molecular primers BC1 + / BC2- on two different preparations of total DNA of a red mullet in the process of putrefaction (track 1 and 2).
- the arrow indicates the amplified DNA fragment of 177 base pairs.
- FIG. 19 represents the alignment of the nucleotide sequences of the torA genes of
- Photobacterium phosphoreum (torA Pp), Shewanella putrefaciens (torA / Sp), Shewanella massilia (torA / Sm), Shewanella c (torA / S. C), and Salmonella typhimurium (torA / S. t.).
- the first stage of the study below relates to the development of molecular primers (or probes) usable for a PCR reaction, and to the study of their specificity for different bacteria involved in the alteration of fish flesh.
- the second step concerns the application of the PCR technique on fish flesh.
- nucleotide primers are critical steps for the success of a PCR test. These primers must be produced from highly conserved regions of the gene which codes for TMAO reductase in all of the bacteria responsible for the degradation of fish flesh. Several strategies were used to develop these primers.
- the molecular primers were defined from the alignment of nucleic sequences of the torA gene from different bacteria of the genus Shewanella and from E. coli ( Figure 9) " . Several DNA regions of the torA gene in these bacteria exhibit a high degree of sequence identity with very few mismatches.
- the molecular primers DDN are the molecular primers DDN1 +, DDN2-, DDN3 -
- PCR amplification involves 30 successive reaction cycles. Each cycle includes a denanitation step at 94 ° C for 30 s, a hybridization step at 45 ° C for 30 s and an elongation step at 72 ° C for 45 s. a) Use of the molecular primers DDN for the detection of the TMAO reductase system of bacteria of the genus Shewanella.
- DDN1 + / DDN3- and DDN1 + / DDN4- were deliberately discarded due to the remoteness of their positions on the torA gene.
- results reveal for the majority of the pairs of molecular primers used, the amplification of a single DNA fragment specific to the expected size.
- the pair of primers DDN5 + / DDN2- (lane 2), an additional non-specific DNA fragment of approximately 300 base pairs is amplified, the molecular primers DDN appear to be specific for the TMAO reductase system of S. massilia.
- the pairs of DDN primers were then tested on other bacteria belonging to the genus Shewanella.
- the same series of experiments was carried out using as chromosomal DNA the strain Shewanella c and S. putrefaciens MR-1.
- the set of primer pairs makes it possible to amplify a DNA fragment specific to the size expected for these two bacteria (FIG. 10).
- the different pairs of DDN primers therefore make it possible to detect all of the Shewanella bacteria tested.
- Photobacterium phosphoreum is a bacterium which, like S. putrefaciens, is in a certain number of cases made responsible for the deterioration of the flesh of marine fishes (12, 21). It belongs to the Vibrionaceae family, and has an optimal growth temperature of 15 ° C. It is a very little studied bacterium, whose putative TMAO reductase system is absolutely unknown to date.
- This protein sequence has approximately 60% identity with a region of the TMAO reductase of S. massilia. The homologies observed are high enough to conclude that the sequenced DNA fragment corresponds well to a part of the gene which codes for the TMAO reductase of P. phosphoreum.
- the results obtained are grouped in FIG. 12.
- the four pairs of molecular primers DDN1 + / DDN5-, DDN5 + / DDN2-, DDN5 + / DDN3- and DDN5 + / DDN4- allow the amplification of a specific DNA fragment in E coli (track 2, 6, 10 and 16).
- the pair of primers DDN1 + / DDN5- also allows the amplification of a DNA fragment, of 820 base pairs, compatible with a specific fragment of the system.
- the pair of primers DDN1 + / DDN5- makes it possible to detect the torA gene of marine bacteria (Shewanella and P. phosphoreum), but also of enterobacteria (E. coli and S. typhimurium).
- the bacterium R. sphaeroides has a DMSO / TMAO reductase system similar to that described in E. coli (9, 10). Although the terminal enzyme of this bacterium can reduce TMAO and DMSO indifferently, it has numerous protein sequence homologies with TMAO reductase from E. coli or S. massilia (respectively 47.5% and 45% identity).
- the nucleic sequence of the TMAO / DMSO reductase gene from bacteria of the genus Rhodobacter was integrated into the alignment carried out at from the sequences of the torA gene of bacteria of the genus Shewanella and of E. coli.
- the PCR amplification is carried out with a hybridization temperature of 55 ° C. At this temperature, only a small part of the primers present in the mixture will be able to hybridize specifically to the template DNA. For this reason, a larger quantity of molecular primers is added to the reaction mixture.
- the primers BN obtained are the primers BN1 +, BN2-, BN3 +, BN4-, BN5-, BN6 + as defined above.
- Table 1 below represents the results obtained with regard to the application of the BN molecular primers to the DNA of different bacteria.
- the amplification is carried out using 5 ng of bacterial chromosomal DNA.
- the PCR reaction involves 30 successive reaction cycles.
- BN primers therefore prove to be perfectly suitable for the detection of bacteria which have a TMAO reductase system, and which are capable of contaminating fish flesh.
- the multi-alignment of protein sequences reveals numerous protein regions conserved between the cytochromes of the TMAO reductase system of different bacteria: S. massilia, E. coli, R. sphaeroides. Some of these conserved regions correspond to the heme binding sites of type c (CxxCH motif) and are therefore found in a large number of tetrahemic cytochromes of NapC / NirT class involved in other respiratory systems (24). The cytochrome TorC nevertheless has the particularity of containing an additional carboxy-terminal domain which fixes a fifth heme (6, 19).
- the BC molecular primers are the primers BC1 +, BC2 +, BC2- and BC3- as defined above.
- the conserved protein regions were searched for among all of the NapC / NirT class cytochromes (probes BC2 + and BC2-), but also only among the TorC cytochromes (probes BC1 + and BC3-).
- the position and orientation of the four degenerate molecular primers BC are shown in Figure 14.
- the BC molecular primers are capable of hybridizing to the gene coding for the cytochrome TorC of the TMAO reductase system.
- the PCR reaction is carried out under the same conditions as those used with the BN molecular primers. It involves 30 successive reaction cycles. Each cycle consists of a denaturation step at 94 ° C for 30 s, a hybridization step at 55 ° C for 30 s and an elongation step for 45 s. About 100 pmol of each molecular primers are added to the reaction mixture (final volume 50 ⁇ l).
- the couple BC1 + / BC2- made it possible to amplify a DNA fragment to the expected size (177 pairs of bases) for all the bacteria previously tested ( Figure 15; tracks 1 to 5). This result allows us to consider the use of the pair of molecular primers BC1 + / BC2- for the PCR test.
- no DNA fragment of a size compatible with that expected for amplification from the torC gene is observed (FIG. 15, lane 6).
- the pair of primers BC1 + / BC2- therefore seems to specifically recognize the cytochrome TorC of the TMAO reductase system.
- the next step therefore consists in the direct application of the PCR test to fish flesh.
- the four pairs of primers DDN1 + / DDN5-, BN6 + / BN4-, BN6 + / BN2- and BC1 + / BC2- were chosen to carry out these tests because they allow the amplification of a specific DNA fragment for the vast majority previously tested bacteria.
- variable concentrations of chromosomal DNA purified from herring sperm were added to the PCR reaction mixture containing or not 2, 5 ⁇ l of cell suspension of the bacteria S. massilia.
- FIG. 16 obtained with the pair of primers DDN1 + / DDN5- shows that no DNA fragment is amplified in the absence of bacteria added to the reaction mixture (lane 1 to 3), regardless of the concentration of Fish chromosomal DNA. If the bacteria S. massilia is added to the reaction mixture (lanes 4 to 6) a specific DNA fragment is amplified.
- the same results were obtained for the pairs of primers BN6 + / BN2-, BN6 + / BN4- or BC1 + / BC2-, and thus make it possible to conclude that the presence of foreign DNA in the reaction mixture of the PCR does not interfere with the specificity of the molecular primers according to the invention.
- microorganism detection tests during microbiological food control, require a first step of pre-enrichment of bacteria on a selective medium.
- the technique for purifying total chromosomal DNA from fish flesh, used according to the present invention must therefore make it possible to remove all of the PCR inhibitor compounds.
- total DNA bacterial DNA + fish DNA
- decomposition kept 12 h at room temperature
- 2 species from the Mediterranean Sea red mullet and sea bream
- 2 species from the Atlantic pole and cod
- From approximately 50 mg of flesh of these fish taken from under the skin
- 1 to 4 ⁇ g of total chromosomal DNA were thus purified.
- About 25 ng of this DNA are then added to the PCR reaction mixture (final volume 50 ⁇ l).
- the hybridization temperature is brought to 55 ° C., and 100 pmol of each molecular primers are added to the reaction mixture.
- FIG. 17 groups together the results obtained using the pairs of primers DDN1 + / DDN5-, BN6 + / BN2- and BN6 + / BN4-.
- a single DNA fragment is amplified, and this with each of the primer pairs used.
- the size of the amplified DNA fragment corresponds to the size expected for amplification from the torA gene. This result indicates that the different DNA fragments were indeed amplified from the torA gene of bacteria present on fish flesh.
- pairs of molecular primers DDN1 + / DDN5-, BN6 + / BN2- and BN6 + BN4- can be envisaged for the application of the PCR test to fish flesh.
- silica bead filter is an adequate method to purify the total DNA contained in fish flesh. This technique is very fast (about an hour), and very easy to implement compared to an isoamylalcohol / chloroform extraction which requires several steps to remove the proteins contained in fish flesh (28).
- the pairs of molecular primers according to the invention therefore make it possible to detect the torA gene in marine bacteria, but also in bacteria that are relatively phylogenetically distant, namely enterobacteria and bacteria from brackish waters.
- the technique is directly linked to the freshness quality of the fish flesh and is more sensitive than conventional techniques such as ABVT.
- Shewanella c and Shewanella massilia corresponds to a red mullet (Mullus surmuletus) caught in the Mediterranean Sea off Marseille, and kept at temperature ambient for 48 hours in a sterile tube containing sea water. The sea water was previously sterilized through a millipore filter (0.45 ⁇ M).
- the Shewanella strains are cultured anaerobically or aerobically at 30 ° C in LB medium (“Luria Broth”: yeast extract 10 g / 1, bacto-peptone 5g / l and NaCl 5g / l). The E.
- the Photobacterium phosphoreum strain was obtained by ATCC (n ° 11040) and does not grow on conventional media such as LB medium. It is cultivated at 15 ° C on a marine environment (marine broth; Difco).
- Standard PCR amplifications are carried out under the conditions described in reference (6).
- the reaction mixture (50 ⁇ l) contains 10 ng of chromosomal DNA, 0.2 ⁇ g of each of the oligonucleotide probes, 100 ⁇ M of each of the four deoxyribonucleotide triphosphates (dXTPs), 10 mM of Tris / HCl (pH 8.3), 1.5 mM MgCl 2 , 50 mM KC1, 0.01 % gelatin and one unit of DNA polymerase (Taq polymerase, Boehringer Mannheim Roche).
- the reaction mixture is finally covered with 50 ⁇ l of mineral oil in order to prevent evaporation during the PCR process.
- the amplification carried out in a hermocycling device (MJ Research), involves 30 reaction cycles, a cycle comprising a denaturation step at 94 ° C for 30 seconds, a hybridization step at 55 ° C for 30 seconds and an elongation step at 72 ° C for about 45 seconds (lkb / min).
- the DNA is denatured beforehand for 1.5 min at 94 ° C. before starting the first cycle. 10 ⁇ l of each of the amplification products are then analyzed by electrophoresis on an agarose gel.
- the molecular primers according to the invention in particular the primers called “DDN”, “BN” or “BC”, are as defined above.
- MgCl 2 50 mM KC1, 0.01% gelatin and one unit of Taq polymerase.
- the PCR reaction involves 30 successive reaction cycles consisting of a denaturation step at 94 ° C for 30 seconds followed by a hybridization step at 55 ° C or 45 ° C for 30 seconds, then a step d elongation at 72 ° C for 45 seconds.
- the DNA is denatured beforehand for 1.5 min at 94 ° C. before starting the first cycle.
- chromosomal DNA of bacteria is carried out from 10 ml of culture (OD 600 > 1). After centrifugation of the cells at 10,000 rpm for 10 min, the pellet is resuspended in 1 ml of 10 mM EDTA (pH 8). Lysis of the cells is obtained by addition of SDS (0.5% final). This solution is mixed with an equal volume of isoamyl alcohol / chloroform (1:24). After centrifugation for 20 min at 7,000 rpm, the upper phase is recovered. This operation is repeated several times in order to remove the largest amount of residual proteins. The DNA is finally precipitated by adding NaCl (0.3 M final) and ethanol (2.2 Vol).
- Residual impurities are removed by two washing steps (washing buffer: 20 mM NaCl, 2 mM Tris-HCl, 80% v / v ethanol, pH 7.5). The DNA is then eluted in an elution buffer (10 mM Tris, pH 8.5). b) DNA extraction from cells by NaOH / SDS treatment
- 25 mg of fish flesh are taken from a putrefying fish (after 16 hours of incubation in a sterile tube kept at room temperature), and placed in 50 ⁇ l of a 0.05 M NaOH solution, SDS 0 , 25%. After grinding the cells, the sample is incubated for 15 min at 95 ° C. 450 ⁇ l of sterile water are added to the mixture and the cellular debris is then removed by a centrifugation step of 2 min at 8,000 g. 5 ⁇ l of the supernatant obtained are directly used for the PCR test. c) Isoamyl alcohol chloroform extraction
- Rhodopseudomonas capsulata Arch.Microbiol. 136, 300-305.
- TMAO trimethylamine N-oxide
- TorD a cytoplasmic chaperone that interacts with the unfolded trimethylamine N-oxide reductase enzyme (TorA) in Escherichia coli. J. Biol. 273, 16615-16620. (31) Graham A., Boxer D.H., Haddock B.A., Mandrand-Berthelot A.M. and Jones R.W.
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Abstract
La présente invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques choisies parmi celles comprenant une séquence codant pour une protéine du système triméthylamine N-oxyde réductase (TMAO réductase) chez les bactéries, ou un fragment ou une séquence dérivée de cette séquence, pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection de la présence de toutes bactéries impliquées dans le processus de dégradation des chairs d'animaux aquatiques, chez un hôte susceptible d'être porteur de telles bactéries. L'invention a également pour objet des séquences nucléotidiques telles que définies ci-dessus, des méthodes de détection susmentionnées ainsi que les trousses pour la mise en oeuvre de ces méthodes.
Description
SEQUENCES NUCLEOTIDIQUES ISSUES DE GENES CODANT POUR LA TRIMETHYLAMINE N-OXYDE REDUCTASE, ET LEURS UTILISATIONS, NOTAMMENT POUR LA DETECTION DE BACTERIES.
La présente invention a pour objet des séquences nucléotidiques issues de gènes codant pour la trimethylamine N-oxyde reductase (TMAO reductase) et utilisables, notamment en tant qu'amorces, pour la mise en œuvre de procédés de détection de bactéries impliquées dans l'altération des chairs d'animaux aquatiques, et plus particulièrement d'animaux marins. Le trimethylamine N-oxyde (TMAO) est un des principaux constituants de petit poids moléculaire des animaux marins, où il peut représenter jusqu'à 1% de leur poids sec. En anaérobiose, certaines bactéries utilisent le TMAO comme accepteur exogène d'électrons pour leur respiration. Le TMAO est alors réduit en trimethylamine (TMA), composé très volatil, responsable en grande partie de l'odeur nauséabonde des poissons en voie de décomposition. La réduction du TMAO en TMA a été mise en évidence chez les bactéries marines, comme celles du genre Shewanella, Photobacterium ou Vibrio (1, 2), chez des bactéries photosynthétiques isolées dans les eaux saumâtres, comme celles du genre Rhodobacter (3), mais aussi chez plusieurs entérobactéries, comme Escherichia coli, Salmonella typhimurium ou Proteus vulgaris (4). L'enzyme responsable de la réduction du TMAO en TMA, correspond à la trimethylamine Ν-oxyde reductase (TMAO reductase), dont les propriétés ont été étudiées chez différents organismes. A titre d'exemple, il existe chez E. coli deux enzymes distinctes responsables de la réduction du TMAO : la TMAO reductase et la DMSO reductase. La TMAO reductase, qui est responsable de 90% de la réduction du TMAO, est une molybdoenzyme périplasmique de 90 kDa, pouvant être trouvée sous forme de monomère ou de dimère (5). Les TMAO réductases des différentes bactéries étudiées sont toutes des molybdoenzymes de 80- 100 kDa qui peuvent être retrouvées sous forme de monomère, dimère ou tétramère. Ces protéines sont toutes inductibles en anaérobiose par le TMAO, mais aussi par le DMSO (diméthylsulfoxyde). Enfin, hormis chez P. vulgaris, les TMAO réductases sont toutes localisées dans le périplasme de la bactérie.
L'étude du système TMAO reductase au niveau génétique et moléculaire a été réalisée chez les entérobactéries E. coli et celles du genre Rhodobacter. Les deux TMAO DMSO réductases des bactéries du genre Rhodobacter et la TMAO reductase inductible d'E. coli
présentent une homologie au niveau de leur séquence primaire (6, 7, 8). La structure globale de la TMAO reductase d'E. coli pourrait se rapprocher de celles décrites pour Rhodobacter sphaeroides ou Rhodobacter capsulatus. Chez E. coli, les gènes qui codent pour les différents composants du système TMAO reductase sont organisés en opéron : l'opéron torCAD, qui code pour les trois protéines TorC, TorD et TorA (6). Chez Rhodobacter, les gènes qui codent pour les différents composants du système TMAO/DMSO reductase sont également organisés en opéron : l'opéron dorCDA, qui code pour trois protéines DorC, DorD (également appelé DorB) et DorA, possédant des homologies avec respectivement les protéines TorC, TorD et TorA d'E. coli (9, 10). Une étude phylogénétique par séquencage de l'ADNr 16S a été réalisée sur une bactérie isolée à partir d'un poisson péché dans la baie de Marseille, et gardé à température ambiante dans de l'eau de mer filtrée. Les résultats obtenus montrent que cette bactérie, qui possède une activité TMAO reductase importante, correspond à une nouvelle espèce du genre Shewanella, proche de Shewanella putrefaciens. Elle a été appelée Shewanella massilia. Excepté la protéine TorE, les produits des gènes de l'opéron torECAD de S. massilia possèdent de fortes homologies avec les protéines impliquées dans les systèmes TMAO reductase d'E. coli et des bactéries du genre Rhodobacter (19). De même, la structure globale de la TMAO reductase de S. massilia présente des homologies avec les structures déjà décrites des TMAO/DMSO réductases des bactéries du genre Rhodobacter (20). L'altération des chairs de poissons, comme de la plupart des aliments, est essentiellement due à l'activité métabolique de certaines bactéries, pouvant représenter jusqu'à 108 cellules par gramme de produit. Les premières modifications post mortem qui surviennent au niveau des chairs de poissons ne sont pas nécessairement dues aux bactéries, mais à certaines réactions d'autolyse. Cependant, le développement microbien constitue très vite l'élément majeur de l'altération, le tissu musculaire du poisson constituant un substrat pour la croissance bactérienne. Plusieurs facteurs intrinsèques aux chairs de poissons peuvent expliquer leur très grande altérabilité, comparée à d'autres produits alimentaires : une hydratation importante, un pH post mortem élevé (> 6), une forte teneur en substances azotées non protéiques, dont le TMAO forme la part essentielle et, une faible teneur en protéines de soutien (11, 12). Ces différentes caractéristiques contribuent au développement d'une flore microbienne d'altération spécifique des chairs de poissons. De façon intéressante, la diversité des espèces de poissons ne semble pas avoir d'incidence sur la nature ou le nombre de bactéries initialement présentes sur
le poisson. En revanche, la microflore bactérienne du poisson semble directement liée à l'environnement naturel où il évolue. Ainsi, la contamination de l'eau qui dépend essentiellement de la température, la salinité ou la concentration en oxygène dissous, semble jouer un rôle déterminant. L'origine des bactéries retrouvées au niveau des chairs de poissons ne provient pas uniquement de la microflore des poissons vivants : des bactéries contaminantes peuvent notamment provenir de la chaîne du froid (la glace, les récipients contenant les poissons, les étapes de transformation...). Parmi l'ensemble de la flore microbienne retrouvée au niveau des chairs de poissons, une partie seulement est rendue responsable du phénomène de putréfaction. Tandis qu'une contamination bactérienne ne rend pas nécessairement les chairs de poissons impropres à la consommation, certaines bactéries entraînent rapidement des changements désagréables dans la texture, la saveur ou l'odeur dégagée (13).
Les produits de la mer représentent donc une denrée hautement périssable, posant de nombreux problèmes de conservation aux industriels de la pêche. La maîtrise de la qualité fraîcheur de ces produits constitue ainsi une préoccupation de plus en plus importante pour l'ensemble du secteur de la pêche (producteurs, transformateurs ou distributeurs), conduisant depuis quelques années les industriels à rechercher de nouvelles techniques permettant de rendre compte de l'état de fraîcheur du poisson dans des délais très brefs.
Actuellement, la détermination de l'état de fraîcheur des produits de la mer est essentiellement fondée sur une appréciation sensorielle (aspect, odeur, saveur) qui permet au mieux de conclure à un produit frais, moyennement frais ou impropre à la consommation. Cette méthode organoleptique n'est cependant applicable qu'à des produits entiers, et des analyses plus fiables en laboratoire sont souvent indispensables.
Les méthodes basées sur une analyse bactériologique (flore bactérienne totale) applicables à des produits transformés sont de plus en plus utilisées pour apprécier l'état de fraîcheur du poisson. L'estimation directe du nombre de bactéries cultivables sur un échantillon de poisson reste la méthode la plus communément utilisée : après croissance sur différents milieux (par exemple milieu de citrate de fer), chaque cellule va former une colonie visible sur boîtes de pétri, permettant ainsi un dénombrement. Bien que cette technique soit simple d'utilisation et assez sensible, elle nécessite cependant un temps d'incubation pour la croissance important (de 3 à 5 jours environ). De plus, la composition du milieu de croissance, ou les températures retenues pour ces tests (20-30°C), ne permettent pas toujours de détecter l'ensemble des bactéries d'altération. Ainsi, la réglementation actuelle qui préconise une
température de 30°C pour réaliser ces tests (arrêté de 1979), ne permet pas de pouvoir détecter certaines bactéries d'altération comme Photobacterium phosphoreum qui ne croissent pas à cette température. Ainsi, même si la mesure non spécifique de la charge microbienne totale constitue un bon indicateur de l'état d'hygiène des poissons, elle ne permet cependant pas d'évaluer la qualité sensorielle de ce type de produit. L'examen microscopique des aliments est une technique rapide pour estimer le niveau de contamination bactérienne. Les cellules colorées à l'acridine orange sont visualisées par une technique de microscopie de fluorescence ; le principal inconvénient de cette méthode reste cependant sa faible sensibilité (entre 104 et 105 cellules). La dégradation des composants cellulaires du poisson conduit à la production de nombreuses substances qui peuvent servir d'indicateur indirect d'une contamination bactérienne. Une alternative aux méthodes énumérées ci-dessus a donc consisté à suivre par des techniques chimiques, différents produits de dégradation des chairs de poissons (14). La détermination de l'azote basique volatile total (ABVT), dont l'ammoniac (NH3) et la trimethylamine (TMA) forment la part essentielle, est une technique largement répandue à l'heure actuelle pour estimer le degré de décomposition des chairs de poissons. Le dosage de l'ABVT a l'avantage d'être simple, rapide et d'un coût de revient très faible. La détermination du taux de TMA dans l'ABVT, permet d'apporter un élément qualitatif supplémentaire au critère ABVT. Ce critère semble en effet moins dépendant de variations qui affectent généralement le taux de TMA ou d'ABVT (l'espèce du poisson, sa teneur en graisses etc...). La même méthodologie que pour l'ABVT peut être utilisée pour doser la TMA. D'autres techniques colorimétrique, enzymatique ou chromatographiques ont également été décrites pour quantifier la TMA (15, 16). Lors de la réaction de réduction dμ TMAO en TMA par les bactéries, les chairs de poissons en décomposition subissent différents changements : baisse du potentiel rédox, une augmentation du pH, de la conductivité électrique. Plusieurs études ont donc également utilisé ces différents indicateurs pour tenter de suivre indirectement le dégagement de TMA. Cependant l'ensemble de ces études n'a jamais permis d'établir une corrélation définitive entre le niveau de TMA dégagé et la qualité fraîcheur des échantillons de poissons. De nombreux autres produits de dégradation ont également été testés afin de pouvoir déterminer par des dosages chimiques le niveau d'altération du poisson : le sulfure d'hydrogène, hypoxanthine, l'indol, l'histamine et les acides aminés. Cependant, ces
différents dosages ne sont significatifs que dans certaines espèces de poissons, ou à un niveau d'altération très avancé.
La réaction de polymérisation en chaîne (PCR) est une technique moléculaire qui permet d'amplifier de grandes quantités d'une séquence d'ADN cible dans le but de la visualiser. Depuis quelques années, la technique de la PCR est de plus en plus utilisée pour la détection et l'identification de micro-organismes notamment dans le domaine de la bactériologie clinique ou celui de la sécurité des aliments (17, 18). Actuellement, les tests PCR appliqués aux produits alimentaires permettent principalement la détection de bactéries pathogènes bien déterminées (Shigella, Salmonella, Listeria ...). La présente invention découle de la mise en évidence par les inventeurs du fait que les séquences d'ADN codant pour une protéine du système TMAO reductase, ont une homologie suffisante au sein des diverses bactéries, notamment au sein des bactéries responsables de l'altération des tissus d'organismes aquatiques, et plus particulièrement au sein des bactéries marines, pour permettre la mise en oeuvre de procédés de détection de toutes bactéries responsables de l'altération des tissus par leur activité TMAO reductase, lesdits procédés étant applicables sur tout animal aquatique, et notamment sur tout animal marin.
L'un des buts de la présente invention est de fournir un test de qualité fraîcheur des produits aquatiques, et plus particulièrement des produits de la mer, à la fois rapide, peu coûteux, et offrant une fiabilité élevée en terme de spécificité et de sensibilité. L'un des autres buts de la présente invention est de fournir un test de détection non pas d'un type bactérien, mais de l'ensemble des bactéries responsables de l'altération des tissus d'organismes aquatiques, et notamment de la putréfaction des chairs de poissons, à savoir aussi bien les bactéries marines, que les entérobactéries ou les bactéries isolées au niveau des eaux saumâtres. Un autre but de la présente invention est de fournir un test de détection de bactéries responsables de l'altération des tissus d'organismes marins, applicable à différentes espèces de poissons provenant de régions géographiques différentes.
Un autre but de la présente invention est de fournir un test de détection de bactéries responsables de l'altération des tissus d'organismes marins, suffisamment sensible pour détecter des étapes précoces de l'altération.
La présente invention a pour objet l'utilisation de séquences nucléotidiques choisies parmi celles comprenant une séquence codant pour une protéine du système trimethylamine N-oxyde
reductase (TMAO reductase) chez les bactéries, ou un fragment de cette séquence telle qu'une sonde ou une amorce d'environ 15 à environ 25 nucléotides, ou une séquence dérivée par addition, suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides de cette séquence codant pour une protéine du système TMAO reductase ou d'un fragment de cette dernière, ledit fragment et ladite séquence dérivée étant capables de s'hybrider, notamment dans les conditions d'hybridation définies ci-après, avec ladite séquence codant pour une protéine du système TMAO reductase, pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection de la présence de toutes bactéries impliquées dans le processus de dégradation des chairs d'animaux aquatiques, chez un hôte susceptible d'être porteur de telles bactéries. Avantageusement, les séquences nucléotidiques codant pour une protéine du système
TMAO reductase susmentionnées, sont choisies parmi celles correspondant à l'opéron torCAD ou l'opéron dor DA mentionnés ci-dessus, du système TMAO reductase chez les bactéries.
De préférence, la séquence codant pour une protéine du système TMAO reductase susmentionnée, est choisie parmi les séquences codant pour la TMAO reductase chez les bactéries, encore désignée protéine TorA ou DorA, ou codant pour un cytochrome de type c chez les bactéries, encore désigné protéine TorC ou DorC.
Selon un mode particulièrement avantageux de l'invention, les séquences nucléotidiques codant pour une protéine du système TMAO reductase sont choisies parmi celles des bactéries suivantes : - les bactéries marines, telles que celles du genre Shewanella, Photobacterium ou Vibrio, lesdites séquences étant notamment choisies parmi les suivantes :
* la séquence SEQ ID NO : 1 codant pour la protéine TorA de Shewanella massilia représentée sur la figure 1 ,
* la séquence SEQ ID NO :2 codant pour la protéine TorA de Shewanella putrefaciens représentée sur la figure 1,
* la séquence SEQ ID NO :3 codant pour la protéine TorA de Shewanella c représentée sur la figure 2,
* la séquence partielle SEQ LO NO :4 codant pour la protéine TorA de Photobacterium phosphoreum représentée sur la figure 3, * la séquence codant pour la protéine TorC SEQ ID NO :5 de Shewanella massilia représentée sur la figure 14,
- les bactéries provenant des eaux saumâtres, telles que celles du genre Rhodobacter, ou
Roseobacter, lesdites séquences étant notamment choisies parmi les suivantes :
* la séquence SEQ ID NO : 6 codant pour la protéine DorA de Rhodobacter sphaeroides représentée sur la figure 4,
* la séquence SEQ ID NO : 7 codant pour la protéine DorA de Rhodobacter capsulatus représentée sur la figure 4,
* la séquence codant pour la protéine DorC SEQ ED NO : 8 de Rhodobacter sphaeroides représentée sur la figure 14,
- les entérobactéries, telles que celles du genre Escherichia, ou Salmonella, lesdites séquences étant notamment choisies parmi les suivantes : * la séquence SEQ ID NO : 9 codant pour la protéine TorA de Escherichia coli représentée sur la figure 4,
* la séquence partielle SEQ ID NO : 10 codant pour la protéine TorA de Salmonella typhimurium représentée sur la figure 5,
* la séquence codant pour la protéine TorC SEQ ID NO : 11 de Escherichia coli représentée sur la figure 14.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de séquences nucléotidiques choisies parmi les fragments des séquences définies ci-dessus, ou parmi les séquences dérivées de ces fragments, lesdits fragments ou séquences dérivées comprenant environ 15 à 25 nucléotides, et sont utilisés par paires pour former des couples d'amorces permettant l'amplification de fragments de gènes codant pour une protéine du système TMAO- réductase de bactéries impliquées dans la dégradation des chairs d'animaux aquatiques, selon la technique PCR.
Avantageusement, les séquences nucléotidiques susmentionnées sont utilisées sous forme de couples d'amorces choisis parmi l'un quelconque des trois groupes d'amorces suivants : (1) le groupe d'amorces « DDN » amplifiant des fragments d'ADN du gène torA, ce groupe comprenant :
* les compositions de séquences nucléotidiques « DDN+ » suivantes :
- DDN1+ (SEQ ID NO : 12) : 5 ' CGG vGA yTA CTC bAC hGG TGC 3 ' : mélange de 54 séquences nucléotidiques, - DDN5+ (SEQ ID NO : 13) : 5 ' ATy GAT GCG ATy CTC GAA CC 3 ' : mélange de 4 séquences nucléotidiques,
* les compositions de séquences nucléotidiques « DDN- » suivantes :
- DDN2- (SEQ ID NO : 14) : 5'CGT Amw sGT CGA kAT CGT TrC GCT C 3 ' : mélange de 32 séquences nucléotidiques,
- DDN3- (SEQ ID NO : 15) : 5 ' GAC TCA CAy Awy TGy GAG TG 3 ' : mélange de 16 séquences nucléotidiques, - DDN4- (SEQ ID NO : 16) : 5 ' TGr CCd CGr kCG TTA AAG AC 3 ' : mélange de 24 séquences nucléotidiques,
- DDN5- (SEQ ID NO : 17) : 5 ' CCv GGT TCG AGr ATC GCA TC 3 ' : mélange de 6 séquences nucléotidiques,
(2) le groupe d'amorces « BN » » amplifiant des fragments d'ADN du gène torA, ce groupe comprenant :
* les compositions de séquences nucléotidiques « BN+ » suivantes :
- BN1+ (SEQ ID NO : 18) : 5 ' C bGA yAT CsT rCT GCC 3 ' : mélange de 16 séquences nucléotidiques,
- BN3+ (SEQ ID NO : 19) : 5 ' GGm GAy TAy TCb ACm GGy GC 3 ' : mélange de 96 séquences nucléotidiques,
- BN6+ (SEQ ID NO : 20) : 5 ' Twy GAr CGy AAC GAy mTC GA 3 ' : mélange de 64 séquences nucléotidiques,
* les compositions de séquences nucléotidiques « BN- » suivantes :
- BN2- (SEQ ID NO : 21) : 5' GG vyC rTA CCA bsC vCC TTC 3 ' : mélange de 216 séquences nucléotidiques,
- BN4- (SEQ ID NO : 22) : 5 ' ATC Arr CCn swv GGC GTG CC 3 ' : mélange de 192 séquences nucléotidiques,
- BN5- (SEQ ID NO : 23) : 5 'GbC ACr TCd GTy TGy GG 3 ' : mélange de 72 séquences nucléotidiques, (3) le groupe d'amorces « BC » » amplifiant des fragments d'ADN du gène torC, ce groupe comprenant :
* les compositions de séquences nucléotidiques « BC+ » suivantes :
- BC1+ (SEQ ID NO : 24) : 5' ACn CCn GAr AAr TTy GAr GC 3 ' : mélange de 256 séquences nucléotidiques, - BC2+ (SEQ ID NO : 25) : 5 ' TGy ATh GAy TGy CAy AAr GG 3 ' : mélange de 96 séquences nucléotidiques, les compositions de séquences nucléotidiques « BC- » suivantes :
- BC2- (SEQ ID NO : 26) : 5' CCy TTr TGr CAr TCd ATr CA 3' : mélange de 96 séquences nucléotidiques,
- BC3- (SEQ ID NO : 27) : 5 ' TTn GCr TCr AAr TGn GC 3 ' : mélange de 128 séquences nucléotidiques, dans lesquelles n = (A,C,G,T), y = (C,T), r = (A,G), h = (A,C,T), d = (G,A,T), m = (A,C), w = (A,T), b = (G,T,C), s = (G,C), v = (G,A,C), et k = (G, T), les couples d'amorces étant choisis de telles de telle sorte que l'une des amorces d'un couple correspond à l'une des compositions de séquences nucléotidiques DDN+, BN+ ou BC+ susmentionnées, tandis que l'autre amorce correspond respectivement à l'une des compositions de séquences nucléotidiques DDN-, BN- ou BC- susmentionnées, lesdits couples d'amorces étant notamment choisis parmi l'un quelconque des quatre couples suivants :
(a) le couple DDN1+ / DDN5-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 820 paires de bases (bp), et notamment à l'amplification d'un fragment de 821 bp du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 821 bp délimité par les nucléotides situés aux positions 620 à 1450 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4,
(b) le couple BN6+ / BN2-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 710 bp, et notamment à l'amplification d'un fragment de 727 bp du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 727 bp délimité par les nucléotides situés aux positions 1657 à 2403 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4,
(c) le couple BN6+ /BN4-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 360 bp, et notamment à l'amplification d'un fragment de 355 bp du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 355 bp délimité par les nucléotides situés aux positions 1657 à 2023 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4,
(d) le couple BC1+ /BC2-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorC chez les bactéries, d'une taille d'environ 170 bp, et notamment à l'amplification d'un fragment de 197 bp du gène codant pour la protéine TorC chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 197 bp codant pour le fragment polypeptidique délimité par les acides aminés situés aux positions 114 à 179 de la protéine TorC de S. massilia
représentée sur la figure 14.
Les hôtes susceptibles d'être porteurs de bactéries impliquées dans le processus de dégradation des chairs d'animaux aquatiques, telles que décrites ci-dessus, sont des organismes aquatiques, notamment des organismes marins tels que les poissons et les crustacés, et plus particulièrement les poissons d'Atlantique tels que la sole, le cabillaud, ou les poissons de la mer Méditerranée tels que le rouget de roche, la dorade, ainsi que certains animaux des eaux douces ou saumâtres.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de séquences , nucléotidiques décrites ci-dessus, pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection de la présence de toutes bactéries impliquées dans la dégradation des chairs d'animaux aquatiques, dans le cadre d'un procédé d'évaluation de l'état de fraîcheur des animaux aquatiques sur lesquels est prélevé l'échantillon testé, lorsque ces derniers sont extraits de leur environnement naturel.
L'invention concerne également toute séquence nucléotidique correspondant à l'une des séquences suivantes :
- DDN1+ : 5 ' CGG vGA yTA CTC bAC hGG TGC 3 ',
- DDN5+ : 5 ' ATy GAT GCG ATy CTC GAA CC 3 ',
- DDN2- : 5 'CGT Amw sGT CGA kAT CGT TrC GCT C 3 ',
- DDN3- : 5 ' GAC TCA CAy Awy TGy GAG TG 3 ', - DDN4- : 5 ' TGr CCd CGr kCG TTA AAG AC 3 ',
- DDN5- : 5 ' CCv GGT TCG AGr ATC GCA TC 3 ',
- BN1+ : 5 ' C bGA yAT CsT rCT GCC 3 ',
- BN3+ : 5 ' GGm GAy TAy TCb ACm GGy GC 3 ',
- BN6+ : 5 ' Twy GAr CGy AAC GAy mTC GA 3 ', - BN2- : 5 ' GG vyC rTA CCA bsC vCC TTC 3 ',
- BN4- : 5 ' ATC Arr CCn swv GGC GTG CC 3 ',
- BN5- : 5 'GbC ACr TCd GTy TGy GG 3 ',
- BC1+ : 5 ' ACn CCn GAr AAr TTy GAr GC 3 ',
- BC2+ : 5 ' TGy ATh GAy TGy CAy AAr GG 3 ', - BC2- : 5 ' CCy TTr TGr CAr TCd ATr CA 3 ',
- BC3- : 5 ' TTn GCr TCr AAr TGn GC 3 ', dans lesquelles n = (A,C,G,T), y = (C,T), r = (A,G), h = (A,C,T), d = (G,A,T), m = (A,C),
w = (A,T), b = (G,T,C), s = (G,C), v ≈ (G,A,C), et k = (G,T).
L'invention a également pour objet toute composition de séquences nucléotidiques en mélange, correspondant à l'une des compositions suivantes :
* les compositions de séquences nucléotidiques « DDN+ » suivantes : - DDN1+ : 5 ' CGG vGA yTA CTC bAC hGG TGC 5 ' : mélange de 54 séquences nucléotidiques,
- DDN5+ : 5 ' ATy GAT GCG ATy CTC GAA CC 3 ' : mélange de 4 séquences nucléotidiques,
* les compositions de séquences nucléotidiques « DDN- » suivantes : - DDN2- : 5 'CGT Amw sGT CGA kAT CGT TrC GCT C i ' : mélange de 32 séquences nucléotidiques,
- DDN3- : 5 ' GAC TCA CAy Awy TGy GAG TG 3 ' : mélange de 16 séquences nucléotidiques,
- DDN4- : 5' TGr CCd CGr kCG TTA AAG AC ' : mélange de 24 séquences nucléotidiques,
- DDN5- : 5' CCv GGT TCG AGr ATC GCA TC 3 ' : mélange de 6 séquences nucléotidiques, les compositions de séquences nucléotidiques « BN+ » suivantes :
- BN1+ : 5 ' C bGA yAT CsT rCT GCC 3 ' : mélange de 16 séquences nucléotidiques, - BN3+ : 5 ' GGm GAy TAy TCb ACm GGy GC 5 ' : mélange de 96 séquences nucléotidiques,
- BN6+ : 5' Twy GAr CGy AAC GAy mTC GA 3 ' : mélange de 64 séquences nucléotidiques,
* les compositions de séquences nucléotidiques « BN- » suivantes : - BN2- : 5 ' GG vyC rTA CCA bsC vCC TTC 3 ' : mélange de 216 séquences nucléotidiques,
- BN4- : 5' ATC Air CCn swv GGC GTG CC 5 ' : mélange de 192 séquences nucléotidiques,
- BN5- : 5 'GbC ACr TCd GTy TGy GG 3 ' : mélange de 72 séquences nucléotidiques, * les compositions de séquences nucléotidiques « BC+ » suivantes :
- BC1+ : 5 ' ACn CCn GAr AAr TTy GAr GC 3 ' : mélange de 256 séquences nucléotidiques,
- BC2+ : 5 ' TGy ATh GAy TGy CAy AAr GG 5 ' : mélange de 96 séquences nucléotidiques, les compositions de séquences nucléotidiques « BC- » suivantes :
- BC2- : 5 ' CCy TTr TGr CAr TCd ATr CA 3 ' : mélange de 96 séquences nucléotidiques, - BC3- : 5 ' TTn GCr TCr AAr TGn GC 3 ' : mélange de 128 séquences nucléotidiques, dans lesquelles n = (A,C,G,T), y = (C,T), r = (A,G), h = (A,C,T), d = (G,A,T), m = (A,C), w = (A,T), b = (G.T.C), s = (G,C), v = (G,A,C), et k = (G,T).
L'invention concerne également les couples d'amorces choisis au sein de l'un des groupes d'amorces suivants : (1) le groupe d'amorces « DDN » comprenant :
* les compositions de séquences nucléotidiques « DDN+ » suivantes :
- DDN1+ : 5' CGG vGA yTA CTC bAC hGG TGC 3' : mélange de 54 séquences nucléotidiques,
- DDN5+ : 5 ' ATy GAT GCG ATy CTC GAA CC ' : mélange de 4 séquences nucléotidiques, les compositions de séquences nucléotidiques « DDN- » suivantes :
- DDN2- : 5 'CGT Amw sGT CGA kAT CGT TrC GCT C i' : mélange de 32 séquences nucléotidiques,
- DDN3- : 5 ' GAC TCA CAy Awy TGy GAG TG i ' : mélange de 16 séquences nucléotidiques,
- DDN4- : 5 ' TGr CCd CGr kCG TTA AAG AC i ' : mélange de 24 séquences nucléotidiques,
- DDN5- : 5 ' CCv GGT TCG AGr ATC GCA TC i ' : mélange de 6 séquences nucléotidiques, (2) le groupe d'amorces « BN » comprenant :
* les compositions de séquences nucléotidiques « BN+ » suivantes :
- BN1+ : 5 ' C bGA yAT CsT rCT GCC i ' : mélange de 16 séquences nucléotidiques,
- BN3+ : J ' GGm GAy TAy TCb ACm GGy GC i ' : mélange de 96 séquences nucléotidiques, - BN6+ : 5 ' Twy GAr CGy AAC GAy mTC GA i ' : mélange de 64 séquences nucléotidiques, les compositions de séquences nucléotidiques « BN- » suivantes :
- BN2- : 5 ' GG vyC rTA CCA bsC vCC TTC i ' : mélange de 216 séquences nucléotidiques,
- BN4- : 5 ' ATC Arr CCn swv GGC GTG CC i ' : mélange de 192 séquences nucléotidiques, - BN5- : 5 'GbC ACr TCd GTy TGy GG i ' : mélange de 72 séquences nucléotidiques,
(3) le groupe d'amorces « BC » comprenant : les compositions de séquences nucléotidiques « BC+ » suivantes :
- BC1+ : 5 ' ACn CCn GAr AAr TTy GAr GC 3 ' : mélange de 256 séquences nucléotidiques, - BC2+ : 5 ' TGy ATh GAy TGy CAy AAr GG i ' : mélange de 96 séquences nucléotidiques,
* les compositions de séquences nucléotidiques « BC- » suivantes :
- BC2- : 5 ' CCy TTr TGr CAr TCd ATr CA i ' : mélange de 96 séquences nucléotidiques,
- BC3- : 5 ' TTn GCr TCr AAr TGn GC 3 ' : mélange de 128 séquences nucléotidiques, dans lesquelles n = (A,C,G,T), y = (C,T), r - (A,G), h = (A,C,T), d = (G,A,T), m = (A,C), w = (A,T), b = (G,T,C), s = (G,C), v = (G AC), et k = (G,T), les couples d'amorces étant choisis de telles de telle sorte que l'une des amorces d'un couple correspond à l'une des compositions de séquences nucléotidiques DDN+, BN+ ou BC+ susmentionnées, tandis que l'autre amorce correspond respectivement à l'une des compositions de séquences nucléotidiques DDN-, BN- ou BC- susmentionnées, lesdits couples d'amorces étant notamment choisis parmi l'un quelconque des quatre couples suivants :
(a) le couple DDN1+ / DDN5-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 820 paires de bases (bp), et notamment à l'amplification d'un fragment de 821 bp du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 821 bp délimité par les nucléotides situés aux positions 620 à 1450 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4,
(b) le couple BN6+ / BN2-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 710 bp, et notamment à l'amplification d'un fragment de 727 bp du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 727 bp délimité par les nucléotides situés aux positions 1657 à 2403 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4,
(c) le couple BN6+ /BN4-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 360 bp, et notamment à l'amplification d'un fragment de 355 bp du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 355 bp délimité par les nucléotides situés aux positions 1657 à 2023 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4,
(d) le couple BC1+ /BC2-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorC chez les bactéries, d'une taille d'environ 170 bp, et notamment à l'amplification d'un fragment de 197 bp du gène codant pour la protéine TorC chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 197 bp codant pour le fragment polypeptidique délimité par les acides aminés situés aux positions 114 à 179 de la protéine TorC de S. massilia représentée sur la figure 14.
L'invention a également pour objet une méthode de détection de toutes bactéries impliquées dans la dégradation des chairs d'animaux aquatiques chez un hôte susceptible d'être porteur de telles bactéries, ladite méthode étant effectuée à partir d'un échantillon biologique prélevé sur cet hôte, cet échantillon biologique correspondant notamment à un fragment sous- cutané de chair de l'animal aquatique en question, et étant caractérisée en ce qu'elle comprend une étape d'hybridation d'au moins une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus, avec des fragments de gènes codant pour une protéine du système TMAO-réductase de bactéries impliquées dans la dégradation des chairs d'animaux aquatiques susceptibles d'être présentes dans l'échantillon biologique prélevé sur ledit hôte, suivie d'une étape de révélation, notamment par électrophorèse, de la présence éventuelle dans ledit échantillon de gènes codant pour une protéine du système TMAO-réductase, ou de fragments de ces gènes, dont le nombre de copies a été le cas échéant amplifié.
L'invention a plus particulièrement pour objet une méthode de détection telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes :
- le traitement d'un échantillon biologique prélevé sur cet hôte afin d'extraire l'ADN total de cet hôte et de rendre le génome de ces bactéries accessible aux séquences nucléotidiques ou amorces définies ci-dessus, ce traitement étant notamment effectué à l'aide d'une technique d'extraction rapide de l'ADN basée sur la fixation des acides nucléiques à des billes de silice, - l'amplification du nombre de copies de gènes codant pour les protéines du système
TMAO-réductase de bactéries impliquées dans la dégradation des chairs d'animaux aquatiques, ou de fragments de ces gènes, susceptibles d'être présents dans cet échantillon, à l'aide des
séquences nucléotidiques ou amorces susmentionnées,
- la détection de la présence éventuelle d'un nombre amplifié de copies de gènes codant pour une protéine du système TMAO-réductase des bactéries susmentionnées, ou de fragments de ces gènes, et donc de la présence de telles bactéries dans l'échantillon biologique étudié. Avantageusement, les méthodes de détection selon l'invention, sont caractérisées en ce que l'amplification du nombre de gènes codant pour les protéines du système TMAO-réductase comprend les étapes suivantes :
- la prédénaturation de l'ADN double brin total de l'hôte en ADN mono-brin, de préférence dans un tampon constitué de lOmM Tris-HCl pH 8,3, 50mM KC1, l,5mM MgCl2, 0,01 % de gélatine, des 4 désoxynucléotides constitutifs des ADN (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) à une concentration de 100 μM chacun, et des couples d'amorces, tels que définis ci-dessus, par chauffage entre environ 90 °C et environ 100 °C, avantageusement à 94 °C, pendant environ 1,5 minute,
- l'amplification proprement dite par addition au milieu obtenu à l'étape précédente d'ADN polymérase, par exemple la Taq polymérase, chauffage à environ 94°C pendant environ 30 secondes, ce qui correspond à l'étape de dénaturation proprement dite,
* puis chauffage entre environ 35°C à environ 60 °C, et notamment à environ 45°C ou 55°C, pendant environ 30 secondes, ce qui correspond à l'étape d'hybridation des amorces avec les gènes codant pour les protéines du système TMAO-réductase de bactéries, ou des fragments de ces gènes, susceptibles d'être présents dans l'échantillon biologique étudié, et enfin, chauffage à 72 °C, pendant environ 45 secondes, ce qui correspond à l'étape d'élongation des amorces, hybridées à l'étape précédente, l'une vers l'autre, produisant ainsi des séquences nucléotidiques complémentaires de fragments des gènes codant pour les protéines du système TMAO-réductase de bactéries, ces dernières séquences étant délimitées par les nucléotides s'hybridant avec les amorces susmentionnées,
- la répétition de l'étape d'amplification précédente entre environ 15 et environ 35 fois, avantageusement environ 30 fois.
L'invention concerne également les trousses ou kits pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection susmentionnée, caractérisés en ce qu'ils comprennent :
- une ou plusieurs séquences nucléotidiques ou amorces telles que définies ci-dessus,
- une ADN polymérase,
- un milieu réactionnel avantageusement constitué de lOmM Tris-HCl pH 8,3, 50mM KC1, l,5mM MgCl2, 0,01 % de gélatine, des 4 désoxynucléotides constitutifs des ADN (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) à une concentration de 100 μM chacun.
L'invention concerne également toute séquence nucléotidique comprenant : - la séquence représentée sur la figure 2 du gène torA codant pour la protéine TorA de la bactérie marine Shewanella C,
- ou toute séquence dérivée de la séquence susmentionnée par dégénérescence du code génétique, et codant pour la protéine TorA de Shewanella C, dont la séquence peptidique est représentée sur la figure 6, - ou toute séquence dérivée de la séquence nucléotidique susmentionnée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, ladite séquence dérivée ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence nucléotidique susmentionnée représentée sur la figure 2,
- ou tout fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ou d'une séquence dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué d'au moins environ 15 nucléotides.
L'invention a également pour objet toute séquence peptidique codée par la séquence nucléotidique susmentionnée représentée sur la figure 2, et comprenant :
- la séquence en acides aminés représentée sur la figure 6 de la protéine TorA de Shewanella c,
- ou une séquence dérivée de la séquence peptidique susmentionnée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ladite séquence dérivée ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence peptidique susmentionnée représentée sur la figure 6, - ou un fragment de la séquence peptidique susmentionnée, ou d'une séquence dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué d'au moins environ 5 acides aminés.
L'invention concerne également toute séquence nucléotidique comprenant :
- la séquence partielle représentée sur la figure 3 du gène codant pour la protéine TorA de la bactérie marine Photobacterium phosphoreum,
- ou toute séquence dérivée de la séquence susmentionnée par dégénérescence du code génétique, et codant pour le fragment de la protéine TorA de Photobacterium phosphoreum
dont la séquence peptidique est représentée sur la figure 7,
- ou toute séquence dérivée de la séquence nucléotidique susmentionnée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, ladite séquence dérivée ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence nucléotidique susmentionnée représentée sur la figure 3,
- ou tout fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ou d'une séquence dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué d'au moins environ 15 nucléotides.
L'invention concerne également toute séquence peptidique codée par la séquence nucléotidique susmentionnée représentée sur le figure 3, et comprenant :
- la séquence partielle en acides aminés représentée sur la figure 7 de la protéine TorA de Photobacterium phosphoreum,
- ou une séquence dérivée de la séquence peptidique susmentionnée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ladite séquence dérivée ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence peptidique susmentionnée représentée sur la figure 7,
- ou un fragment de la séquence peptidique susmentionnée, ou d'une séquence dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué d'au moins environ 5 acides aminés. L'invention a également pour objet toute séquence nucléotidique comprenant :
- la séquence partielle représentée sur la figure 5 du gène codant pour la protéine TorA de la bactérie marine Salmonella typhimurium,
- ou toute séquence dérivée de la séquence susmentionnée par dégénérescence du code génétique, et codant pour la protéine TorA de Salmonella typhimurium dont la séquence peptidique est représentée sur la figure 8,
- ou toute séquence dérivée de la séquence nucléotidique susmentionnée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, ladite séquence dérivée ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence nucléotidique susmentionnée représentée sur la figure 5, - ou tout fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ou d'une séquence dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué d'au moins environ 15 nucléotides.
L'invention concerne également toute séquence peptidique codée par la séquence nucléotidique susmentionnée représentée sur la figure 5, et comprenant :
- la séquence en acides aminés représentée sur la figure 8 de la protéine TorA de Salmonella typhimurium, - ou une séquence dérivée de la séquence peptidique susmentionnée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ladite séquence dérivée ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence peptidique susmentionnée représentée sur la figure 8,
- ou un fragment de la séquence peptidique susmentionnée, ou d'une séquence dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué d'au moins environ 5 acides aminés.
L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de l'obtention d'amorces de l'invention, et de leur utilisation pour la mise en oeuvre d'un procédé de détection selon l'invention. Description des figures
- la figure 1 représente l'alignement des séquences nucléotidiques des gènes torA de Shewanella massilia (torA/S.m.), de Shewanella c (torA/S.c), et de Shewanella putrefaciens (torA/S.p.).
- la figure 2 représente la séquence nucléotidique complète du gène torA codant pour la TMAO reductase de Shewanella c.
- la figure 3 représente la séquence nucléotidique partielle du gène torA codant pour la TMAO reductase de Photobacterium phosphoreum.
- la figure 4 représente l'alignement des séquences nucléotidiques des gènes torA de Shewanella massilia (torA/S.m.), de E. coli (torA/Ε. c), de Rhodobacter sphaeroides (TorA/R.s.), et Rhodobacter capsulatus (TorA/R.c). Les flèches indiquent la position des différentes amorces sur le gène torA de la bactérie Shewanella massilia, élaborées à partir des régions conservées. Plus particulièrement, les positions des différentes amorces « DDN » et « BN » sur le gène torA de S. massilia sont les suivantes :
DDN1+ : 620 BN1+ : 1628 DDN5+ : 1428 BN3+ : 621
DDN2- : 1684 BN6+ : 1657
DDN3- : 2201 BN2- : 2403
DDN4- : 2325 BN4- : 2023
DDN5- : 1450 BN5- : 946
- la figure 5 représente la séquence nucléotidique partielle du gène torA codant pour la TMAO reductase de Salmonella typhimurium. - la figure 6 représente la séquence peptidique complète de la TMAO reductase de
Shewanella c.
- la figure 7 représente l'alignement des séquences peptidiques du fragment de la protéine TorA de Photobacterium phosphoreum (TorA/P.p.), déduit du fragment d'ADN amplifié chez P. phosphoreum à l'aide des amorces moléculaires DDN1+/DDN5-, avec les régions protéiques correspondantes des protéines TorA de Shewanella massilia (TorA/S.m.), de E. coli (TorA/Ε.c), et de Rhodobacter sphaeroides (DorA/R.s.).
- la figure 8 représente l'alignement des séquences peptidiques du fragment de la protéine TorA de Salmonella typhimurium (TorA/S.t.), déduit du fragment d'ADN amplifié chez S. typhimurium à l'aide des amorces moléculaires DDN1+/DDN5-, avec les régions protéiques correspondantes de la protéine TorA de E. coli (TorA/Ε. c), de la protéine DorA de Rhodobacter sphaeroides (DorA/R.s.), et de la protéine TorA de Shewanella massilia (TorA/S.m.).
- la figure 9 représente l'alignement de séquences nucléiques d'une région très conservée du gène qui code pour la TMAO reductase des bactéries du genre Shewanella et de E. coli, utilisée pour l'élaboration d'une des amorces moléculaires « DDN » selon l'invention.
(a) Position approximative et orientation des différentes amorces DDN sur le gène torA codant pour la TMAO reductase de différentes bactéries du genre Shewanella et de E. coli,
(b) Exemple de stratégie d'élaboration d'une des amorces DDN (DDN1+); la zone encadrée correspond à une région nucléique très conservée du gène qui code pour la TMAO reductase des bactéries du genre Shewanella [Shewanella massilia (torA/S. massilia), Shewanella putrefaciens (torA/S. putrefaciens), Shewanella c (torA/S. c)] et de E. coli.
- la figure 10 représente l'électrophorèse sur gel d'agarose des produits de la PCR lorsque l'amplification est réalisée à partir de l'ADN chromosomique de Shewanella massilia (pistes 1, 2, 3 et 4), de Shewanella c (pistes 5, 6, 7 et 8) et de Shewanella putrefaciens MR-1 (pistes 9, 10, 11 et 12) en utilisant les amorces moléculaires DDN1+/DDN5- (pistes 1, 5 et 9 ; taille attendue : 820 pb), DDN5+/DDN2- (pistes 2, 6 et 10 ; taille attendue : 234 pb), DDN5+/DDN3- (pistes 3, 7 et 11 ; taille attendue : 740 pb), DDN5+/DDN4- (pistes 4, 8 et 12 ; taille attendue :
866 pb). Pistes M : Marqueurs de taille.
- la figure 11 représente l'électrophorèse sur gel d'agarose des produits de la PCR lorsque l'amplification est réalisée à partir de l'ADN chromosomique de Photobacterium phosphoreum en utilisant les couples d'amorces DDN1+/DDN5- (piste 1 ; taille attendue : 820 pb), DDN5+/DDN2- (piste 2 ; taille attendue : 234 pb), DDN5+/DDN3- (piste 3 ; taille attendue : 740 pb) et DDN5+/DDN4- (piste 4 : taille attendue : 866 pb). Pistes M : marqueurs de taille.
- la figure 12 représente l'électrophorèse sur gel d'agarose des produits de la PCR lorsque l'amplification est réalisée à partir de l'ADN chromosomique de S. massilia (pistes 1, 4, 7 et 10), de E. coli (pistes 2, 5, 8 et 11) et de S. typhimurium (pistes 3, 6 et 9), en utilisant les couples d'amorces moléculaires DDN1+/DDN5- (pistes 1 à 3 ; taille attendue : 820 pb), DDN5+/DDN2- (pistes 4 à 6 ; taille attendue : 234 pb), DDN5+/DDN3- (pistes 7 à 9 ; taille attendue : 740 pb), DDN5+/DDN4- (pistes 10 et 11 ; taille attendue : 866 pb). Pistes M : Marqueurs de taille.
- la figure 13 représente l'alignement de séquences nucléiques d'une région très conservée du gène qui code pour la TMAO reductase des bactéries du genre Shewanella,
Rhodobacter et de E. coli, utilisée pour l'élaboration d'une des amorces moléculaires « BN » selon l'invention.
(a) Position approximative et orientation des différentes amorces BN sur le gène torA codant pour la TMAO reductase de différentes bactéries du genre Shewanella, Rhodobacter et E. coli,
(b) Exemple de stratégie d'élaboration d'une des amorces BN (BN3+); la zone encadrée correspond à une région nucléique très conservée du gène qui code pour la TMAO reductase des bactéries Shewanella massilia (torA/S. massilia), de E. coli, de Rhodocbacter sphaeroides (dorAJR. sphaeroides), et de Rhodocbacter capsulatus (dorA/R. capsulatus). - la figure 14 représente l'alignement de séquences protéiques du cytochrome TorC de S. massilia (TorC/S.m.), de E. coli (TorC/E.c.) et du cytochrome DorC de R. sphaeroides (DorC/R.s.). Les flèches indiquent la position des différentes amorces sur le gène torC de la bactérie Shewanella massilia, élaborées à partir des régions conservées. A titre d'exemple, le couple BC1+/BC2- conduit à l'amplification du fragment d'une taille de 197 bp du gène codant pour la protéine TorC chez S. massilia, ce fragment codant pour le polypeptide de 66 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 114 et 179 de la séquence peptidique de TorC de S. massilia. Le couple BC1+/BC3- conduit à l'amplification du fragment d'une
taille de 719 bp du gène codant pour la protéine TorC chez S. massilia, ce fragment codant pour le polypeptide de 240 acides aminés délimité par les acides aminés siu és aux positions 114 et 353 de la séquence peptidique de TorC de S. massilia. Le couple BC2+/BC3- conduit à l'amplification du fragment d'une taille de 542 bp du gène codant pour la protéine TorC chez S. massilia, ce fragment codant pour le polypeptide de 181 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 173 et 353 de la séquence peptidique de TorC de S. massilia.
- la figure 15 représente l'électrophorèse sur gel d'agarose (2%) des produits de la PCR lorsque l'amplification est réalisée à partir de l'ADN chromosomique de E. coli (piste 1), de S. typhimurium (piste 2), de P. phosphoreum (piste 3), de S. massilia (piste 4), de R. sphaeroides (piste 5), ou dΕrwinia chrysanthemi (piste 6) en utilisant les amorces moléculaires BC1+ et BC2-. La taille du fragment d'ADN attendue (177 paires de bases) est indiquée par une flèche. Pistes M : Marqueurs de taille.
- la figure 16 représente l'influence de l'ADN chromosomique de poisson sur la spécificité des amorces moléculaires selon l'invention. L'amplification PCR est réalisée à l'aide des amorces moléculaires DDN1+ et DDN5- en présence de 2,5 μg (Pistes 1 et 4), 5 μg (Pistes 2 et 5), ou 10 μg (Pistes 3 et 6) d'ADN chromosomique purifié de Hareng. Les pistes 4, 5 et 6 correspondent aux essais réalisés en ajoutant 2,5 μl de suspension cellulaire de Shewanella massilia au mélange réactionnel. Pistes M : marqueurs de taille.
- la figure 17 représente l'électrophorèse en gel d'agarose (2%) des produits de la PCR lorsque l'amplification est réalisée à partir d'ADN total extrait à partir de chairs de poissons en décomposition (cabillaud : piste 1 à 3 ; sole : piste 4 à 6 ; dorade : piste 7 à 9 et rouget de roche : piste 10 à 12) à l'aide des amorces BN6+/BN4- (pistes 1, 4, 7 et 10, taille attendue : 364 pb), amorces BN6+ BN2- (pistes 2, 5, 8 et 11, taille attendue : 711 pb), amorces DDN1+/DDN5- (pistes 3, 6, 9 et 12, taille attendue : 820 pb). Pistes M : standard de taille (échelle 1 Kb de BRL).
- la figure 18 représente l'électrophorèse sur gel d'agarose (2%) des produits de la PCR lorsque l'amplification est réalisée à l'aide des amorces moléculaires BC1+/BC2- sur deux préparations différentes d'ADN total d'un rouget de roche en voie de putréfaction (piste 1 et 2). La flèche indique le fragment d'ADN amplifié de 177 paires de bases. - la figure 19 représente l'alignement des séquences nucléotidiques des gènes torA de
Photobacterium phosphoreum (torA P.p.), de Shewanella putrefaciens (torA/S.p.), de Shewanella massilia (torA/S.m.), de Shewanella c (torA/S. c), et de Salmonella typhimurium
(torA/S. t.).
A) METHODES D'ETUDES
Elaboration d'amorces spécifiques à partir du gène codant pour l'enzyme TMAO reductase : sondes moléculaires « DDN », « BN » et « BC ».
La première étape de l'étude ci-dessous porte sur l'élaboration d'amorces (ou sondes) moléculaires utilisables pour une réaction PCR, et sur l'étude de leur spécificité pour différentes bactéries impliquées dans l'altération des chairs de poisson. La deuxième étape porte sur l'application de la technique PCR sur des chairs de poisson.
I) Elaboration et validation d'amorces moléculaires servant à la réaction PCR.
Le choix des amorces nucléotidiques est une étape critique pour la réussite d'un test PCR. Ces amorces doivent être élaborées à partir de régions hautement conservées du gène qui code pour la TMAO reductase chez l'ensemble des bactéries responsables de la dégradation des chairs de poissons. Plusieurs stratégies ont été utilisées pour élaborer ces amorces.
(1) Amorces moléculaires élaborées à partir de régions du gène torA conservées chez les bactéries du genre Shewanella et chez E. coli : amorces « DDN ».
L'élaboration d'amorces très peu dégénérées à partir de régions protéiques conservées est très difficile en raison de la dégénérescence du code génétique.
Les amorces moléculaires, appelées « DDN », ont été définies à partir de l'alignement de séquences nucléiques du gène torA des différentes bactéries du genre Shewanella et d'E. coli (Figure 9)". En effet, plusieurs régions d'ADN du gène torA chez ces bactéries présentent un degré d'identité de séquence élevé avec très peu de mésappariements. Les amorces moléculaires DDN sont les amorces moléculaires DDN1+, DDN2-, DDN3-,
DDN4-, DDN5- et DDN5+ telles que définies ci-dessus.
Pour l'ensemble des réactions PCR, la température d'appariement est portée à 55°C afin de rendre l'amplification plus spécifique et donc de limiter l'apparition de bandes d'ADN contaminantes. Ceci est rendu possible par la faible dégénérescence des amorces nouvellement synthétisées. L'amplification PCR met enjeu 30 cycles de réactions successives. Chaque cycle comprend une étape de dénaniration à 94°C pendant 30 s, une étape d'hybridation à 45°C pendant 30 s et une étape d'élongation à 72°C pendant 45 s.
a) Utilisation des amorces moléculaires DDN pour la détection du système TMAO reductase des bactéries du genre Shewanella.
La première série d'expériences, utilisant les couples d'amorces DDN1+/DDN5-,
DDN5+/DDN2-, DDN5+/DDN3-, DDN5+/DDN4-, a été réalisée sur l'ADN chromosomique de la souche Shewanella massilia (S. massilia). Les couples d'amorces DDN1+/DDN2-,
DDN1+/DDN3- et DDN1+/DDN4- ont volontairement été écartés du fait de l'éloignement de leurs positions sur le gène torA.
Les résultats, regroupés dans la figure 10 (pistes 1 à 4), révèlent pour la majorité des couples d'amorces moléculaires utilisés, l'amplification d'un fragment unique d'ADN spécifique à la taille attendue. Bien que pour le couple d'amorces DDN5+/DDN2- (piste 2), un fragment d'ADN non spécifique, supplémentaire d'environ 300 paires de base, soit amplifié, les amorces moléculaires DDN se révèlent être spécifiques du système TMAO reductase de S. massilia.
Les couples d'amorces DDN ont ensuite été testés sur d'autres bactéries appartenant au genre Shewanella. La même série d'expériences a été réalisée en utilisant comme matrice l'ADN chromosomique de la souche Shewanella c et S. putrefaciens MR-1. L'ensemble des couples d'amorces permet d'amplifier un fragment d'ADN spécifique à la taille attendue pour ces deux bactéries (figure 10).
Les différents couples d'amorces DDN permettent donc de détecter l'ensemble des bactéries Shewanella testées. b) Utilisation des amorces moléculaires DDN pour la détection du gène codant pour la TMAO reductase chez la bactérie marine Photobacterium phosphoreum, et pour la mise en oeuvre du séquençage dudit gène.
Photobacterium phosphoreum (P. phosphoreum) est une bactérie qui comme S. putrefaciens est dans un certain nombre de cas rendue responsable de l'altération des chairs de poissons marins (12, 21). Elle appartient à la famille des Vibrionaceae, et possède une température optimale de croissance de 15°C. C'est une bactérie très peu étudiée, dont le système TMAO reductase putatif est absolument inconnu à ce jour.
Afin de vérifier la spécificité des amorces moléculaires selon l'invention sur des bactéries distinctes du groupe des Shewanella, et susceptibles de contaminer les chairs de poissons, une souche P. phosphoreum de collection a été obtenue par l'ATCC (American Type Culture
Collection n° 11040) . Les premiers essais de croissance réalisés sur cette bactérie sur milieu
marin (Difco) à 15°C ont montré que l'ajout de TMAO au milieu de culn re améliore de façon significative sa vitesse de croissance. La densité optique (DO600) obtenue après 24 heures de croissance est de 0,28 pour la souche cultivée en absence de TMAO, et de 0,47 pour la souche cultivée en présence de TMAO. Ce résultat est en accord avec la présence d'une TMAO reductase respiratoire chez P. phosphoreum. Une amplification génique a été réalisée à partir de l'ADN chromosomique de cette bactérie (préparé à partir de 10 ml de culture en milieu marin) en utilisant l'ensemble des couples d'amorces moléculaires DDN.
Les résultats, présentés dans la figure 11, montrent que les amorces DDN permettent dans tous les cas l'amplification d'un fragment d'ADN spécifique. Les différentes tailles de fragments d'ADN sont en accord avec celles obtenues pour l'amplification réalisée sur le chromosome des bactéries du genre Shewanella.
Afin de confirmer que le fragment d'ADN amplifié chez P. phosphoreum correspond bien à une partie du gène codant pour la TMAO reductase de P. phosphoreum, le séquençage dudit fragment a été réalisé. Ainsi, le séquençage d'environ 600 nucléotides du fragment amplifié à partir du couple d'amorces moléculaires DDN1+/DDN5- a été réalisé. Le produit
PCR directement purifié par Geneclean (BiolOl) a été séquence par la technique de terminaison des chaînes (22) en utilisant l'amorce moléculaire DDN1+. La séquence protéique déduite de cette séquence nucléique a été alignée avec celles de diverses TMAO réductases (figure 7).
Cette séquence protéique présente environ 60 % d'identité avec une région de la TMAO reductase de S. massilia. Les homologies observées sont suffisamment élevées pour conclure que le fragment d'ADN séquence correspond bien à une partie du gène qui code pour la TMAO reductase de P. phosphoreum.
Ces résultats mettent en évidence la présence d'un système TMAO reductase chez la bactérie P. phosphoreum, et valident la méthode de détection selon l'invention par le test PCR, puisque ce dernier permet de détecter le système TMAO-réductase chez des bactéries d'altération relativement éloignées du point de vue phylogénétique. c) Utilisation des amorces moléculaires DDN pour la détection de gènes codant pour la TMAO reductase d'entérobactéries, et pour la mise en oeuvre du séquençage desdits gènes. Afin de vérifier que le test PCR est valide pour la détection d'entérobactéries telle que E. coli ou certaines bactéries pathogènes comme Salmonella typhimurium, la même expérience
PCR que celle décrite ci-dessus a été réalisée, avec comme ADN matrice de l'ADN
chromosomique de E. coli et de S. typhimurium.
Chez S. typhimurium, la région promotrice du système TMAO reductase a pu être mise en évidence par une approche PCR (23).
Les résultats obtenus sont regroupés dans la figure 12. Les quatre couples d'amorces moléculaires DDN1+/DDN5-, DDN5+/DDN2-, DDN5+/DDN3- et DDN5+/DDN4- permettent l'amplification d'un fragment d'ADN spécifique chez E. coli (piste 2, 6, 10 et 16). Dans le cas de S. typhimurium, le couple d'amorces DDN1+/DDN5- permet également l'amplification d'un fragment d'ADN, de 820 paires de bases, compatible avec un fragment spécifique du système
TMAO reductase (piste 3). Afin de confirmer que le fragment d'ADN amplifié chez S. typhimurium correspond bien à une partie du gène codant pour la TMAO reductase de S. typhimurium, le séquençage dudit fragment a été réalisé. La séquence protéique, déduite à partir d'une partie de ce fragment d'ADN (477 nucléotides), possède d'importantes homologies avec la séquence protéique de diverses TMAO réductases (figure 8). Elle présente en outre plus de 88 % d'identité avec la séquence de la TMAO reductase d'E. coli et 45 % avec celle de l'enzyme chez S. massilia. Le fragment d'ADN amplifié à l'aide des amorces DDN1+/DDN5- correspond donc vraisemblablement à une partie du gène qui code pour la TMAO reductase de S. typhimurium. d) Conclusion
Ainsi que cela a été précédemment décrit, le couple d'amorces DDN1+/DDN5- permet de détecter le gène torA des bactéries marines (Shewanella et P. phosphoreum), mais également des entérobactéries (E. coli et S. typhimurium).
Les mêmes tests PCR ont été réalisés sur des bactéries isolées au niveau des eaux saumâtres (Rhodobacter) qui peuvent éventuellement être retrouvées au niveau des chairs de poissons. Afin de réaliser ces tests, des échantillons d'ADN chromosomique de la bactérie R. sphaeroides ont été utilisés comme ADN matrice.
La bactérie R. sphaeroides possède un système DMSO/TMAO reductase proche de celui décrit chez E. coli (9, 10). Bien que l'enzyme terminale de cette bactérie puisse réduire indifféremment le TMAO et le DMSO, elle possède de nombreuses homologies de séquences protéiques avec la TMAO reductase d'E. coli ou S. massilia (respectivement 47,5% et 45% d'identité).
Cependant, les tests PCR réalisés avec les sondes moléculaires DDN n'ont pas permis d'amplifier un fragment d'ADN correspondant au gène de la TMAO reductase de cette bactérie.
(2) Amorces moléculaires élaborées à partir de régions du gène torA conservées chez l'ensemble des bactéries étudiées : amorces « BN ».
Afin d'élargir encore le spectre de détection des amorces moléculaires du test PCR, la séquence nucléique du gène de la TMAO/DMSO reductase des bactéries du genre Rhodobacter (R. sphaeroides et R. capsulatus) a été intégrée à l'alignement réalisé à partir des séquences du gène torA des bactéries du genre Shewanella et d'E. coli.
Une nouvelle série d'amorces, dénommées « BN », a ainsi été élaborée (Figure 13).
Pour l'ensemble des expériences, l'amplification PCR est réalisée avec une température d'hybridation de 55°C. A cette température, une petite partie seulement des amorces présentes dans le mélange va pouvoir s'hybrider de manière spécifique à l'ADN matrice. Pour cette raison, une quantité plus importante d'amorces moléculaires est ajoutée au mélange réactionnel
(environ 100 pmoles dans 50 μl final).
Les amorces BN obtenues sont les amorces BN1+, BN2-, BN3+, BN4-, BN5-, BN6+ telles que définies ci-dessus. Le tableau 1 ci-dessous représente les résultats obtenus quant à l'application des amorces moléculaires BN sur l'ADN de différentes bactéries.
L'amplification est réalisée à partir de 5 ng d'ADN chromosomique bactérien. La réaction PCR met enjeu 30 cycles de réactions successives.
+ : Un fragment d'ADN spécifique à la taille attendue est amplifié - : Aucune amplification
Tableau 1
Deux couples d'amorces : BN6+/BN2- et BN6+/BN4-, permettent d'amplifier un fragment d'ADN spécifique chez l'ensemble des bactéries testées, et notamment chez R. sphaeroides.
Les amorces BN se révèlent donc parfaitement appropriées pour la détection des bactéries qui possèdent un système TMAO reductase, et qui sont susceptibles de contaminer les chairs de poissons.
D'autre part, l'utilisation lors de la PCR d'une température d'hybridation élevée (55°C), et d'une quantité plus importante d'amorces moléculaires dégénérées, a permis d'améliorer de façon significative la spécificité de l'amplification.
(3) Amorces moléculaires élaborées à partir du gène codant pour le cytochrome TorC du système TMAO reductase : amorces « BC ».
L'étude du système TMAO reductase chez différentes bactéries a permis de montrer que la chaîne de transfert d'électrons jusqu'à l'enzyme terminale TorA fait intervenir dans tous les cas un cytochrome pentahémique de type c, le cytochrome TorC (ou DorC) (6, 9, 10, 19).
Afin de mettre en évidence le système TMAO reductase chez les bactéries d'altération, des amorces nucléiques dirigées contre le gène codant pour ce cytochrome ont été élaborées.
Le multi-alignement de séquences protéiques, présenté dans la figure 14, fait apparaître de nombreuses régions protéiques conservées entre les cytochromes du système TMAO reductase de différentes bactéries : S. massilia, E. coli, R. sphaeroides. Certaines de ces régions conservées correspondent aux sites de fixation des hèmes de type c (motif CxxCH) et sont donc retrouvées dans un grand nombre de cytochromes tétrahémiques de classe NapC/NirT impliqués dans d'autres systèmes respiratoires (24). Le cytochrome TorC possède néanmoins la particularité de contenir un domaine carboxy-terminal additionnel qui fixe un cinquième hème (6, 19).
Les amorces moléculaires BC sont les amorces BC1+, BC2+, BC2- et BC3- telles que définies ci-dessus. Pour élaborer lesdites amorces, les régions protéiques conservées ont été recherchées parmi l'ensemble des cytochromes de classe NapC/NirT (sondes BC2+ et BC2-), mais aussi uniquement parmi les cytochromes TorC (sondes BC1+ et BC3-). La position et l'orientation des quatre amorces moléculaires dégénérées BC sont indiquées dans la figure 14.
Les amorces moléculaires BC sont capables de s'hybrider au gène codant pour le cytochrome TorC du système TMAO reductase.
La réaction PCR est réalisée dans les mêmes conditions que celles utilisées avec les amorces moléculaires BN. Elle met en jeu 30 cycles de réaction successives. Chaque cycle est constitué d'une étape de dénaturation à 94°C pendant 30 s, d'une étape d'hybridation à 55°C pendant 30 s et d'une étape d'élongation pendant 45 s. Environ 100 pmoles de chaque amorces moléculaires sont ajoutées au mélange réactionnel (volume final 50 μl). Parmi les trois couples d'amorces moléculaires testés (BC1+/BC2-, BC1+/BC3- et BC2+/BC3-), le couple BC1+/BC2- a permis d'amplifier un fragment d'ADN à la taille attendue (177 paires de bases) pour l'ensemble des bactéries précédemment testées (figure 15 ; pistes 1 à 5). Ce résultat nous permet d'envisager l'utilisation du couple d'amorces moléculaires BC1+/BC2- pour le test PCR.
En parallèle, la même expérience PCR a été réalisée avec le couple d'amorces
BC1+/BC2- à partir du chromosome de la bactérie Erwinia chrysanthemi, entérobactérie phytopathogène qui serait dépourvue d'un système TMAO reductase (4). Dans ce cas, aucun fragment d'ADN d'une taille compatible avec celle attendue pour une amplification à partir du gène torC n'est observé (figure 15, piste 6).
Le couple d'amorces BC1+/BC2- semble donc reconnaître spécifiquement le cytochrome TorC du système TMAO reductase.
(4) Application de la technique de la PCR aux cellules entières Pour la réalisation d'un test PCR destiné à être utilisé directement à partir d'échantillons de poissons, il est important de s'affranchir de l'étape de préparation de l'ADN chromosomique des bactéries. Pour cette raison, les expériences de PCR utilisant les couples d'amorces DDN, BN et BC" ont été reproduites à partir de bactéries entières de S. massilia. Les colonies bactériennes isolées sur boîte sont remises en suspension dans 200 μl d'eau distillée stérile (DO600 comprise entre 0,1 et 0,5). La réaction PCR est alors réalisée dans les conditions précédemment décrites avec pour matrice 2,5 μl de la suspension cellulaire (dans 50 μl de volume final). Pour l'ensemble des réactions PCR réalisées (avec les amorces DDN, BN et BC), le résultat obtenu est équivalent à celui observé avec de l'ADN chromosomique purifié. Les bactéries sont donc bien lysées au cours de la première étape de la PCR qui correspond à une incubation à 94°C des échantillons pendant 1,5 min. Ce résultat positif permet d'envisager une utilisation du test PCR directement à partir des chairs de poissons.
II) Application du test PCR-TMAO aux chairs de poissons
Après avoir vérifié la spécificité des amorces moléculaires selon l'invention sur des bactéries responsables de l'altération des produits de la mer, l'étape suivante consiste donc dans l'application directe du test PCR à des chairs de poissons. Les quatre couples d'amorces DDN1+/DDN5-, BN6+/BN4-, BN6+/BN2- et BC1+/BC2- ont été choisis pour réaliser ces tests car ils permettent l'amplification d'un fragment d'ADN spécifique pour la grande majorité des bactéries précédemment testées.
(1) Influence de l'ADN chromosomique du poisson lors de l'amplification PCR du gène de la TMAO reductase des bactéries.
Pour l'utilisation du test PCR sur des échantillons de chairs de poissons, il faut d'abord vérifier que l'ADN chromosomique du poisson ne rentre pas en compétition avec l'ADN bactérien, lors de l'hybridation des amorces moléculaires.
Afin de tester l'influence de l'ADN chromosomique du poisson sur la spécificité des amorces moléculaires selon l'invention, des concentrations variables d'ADN chromosomique purifié de sperme de hareng ont été ajoutées au mélange réactionnel de la PCR contenant ou non 2,5 μl de suspension cellulaire de la bactérie S. massilia.
La figure 16 obtenue avec le couple d'amorces DDN1+/DDN5- montre qu'aucun fragment d'ADN n'est amplifié en absence de bactérie ajoutée au mélange réactionnel (piste 1 à 3) et ceci, quelle que soit la concentration d'ADN chromosomique de poisson. Si on ajoute la bactérie S. massilia au mélange réactionnel (pistes 4 à 6) un fragment d'ADN spécifique est amplifié. Les mêmes résultats ont été obtenus pour les couples d'amorces BN6+/BN2-, BN6+/BN4- ou BC1+/BC2-, et permettent ainsi de conclure que la présence d'ADN étranger dans le mélange réactionnel de la PCR n'interfère pas avec la spécificité des amorces moléculaires selon l'invention.
Ces résultats importants permettent donc d'exclure l'éventualité d'une amplification non spécifique qui serait due à l'ADN chromosomique du poisson.
(2) Extraction de l'ADN total des chairs de poissons et validation de la technique PCR.
Traditionnellement, les tests de détection des micro-organismes, lors du contrôle microbiologique des aliments, nécessitent une première étape de pré-enrichissement des
bactéries sur un milieu sélectif.
Dans la perspective d'un test rapide de qualité fraîcheur, la technique de la PCR a été appliquée directement à des échantillons de poisson. Différentes conditions d'extraction de l'ADN total des chairs de poissons en voie d'altération (ADN bactérien + ADN du poisson) ont donc été testées.
Dans un premier temps, une technique rapide d'extraction de l'ADN des cellules a été testée en traitant les échantillons de poisson au NaOH/SDS (25). Cette technique permet la lyse cellulaire et donc l'extraction de l'ADN chromosomique total. La préparation se fait à partir d'environ 25 mg de chairs prélevés sur un poisson (rouget de roche) gardé 12 heures à température ambiante. Après 10 min d'incubation à 95°C, 5 μl du mélange de chairs de poisson homogénéisées sont utilisés directement dans le mélange réactionnel de la PCR.
Toutefois, par cette technique rapide d'extraction de l'ADN total, l'ensemble des réactions PCR réalisées avec les différentes amorces moléculaires n'a pas permis d'amplifier un fragment d'ADN spécifique. La présence de plusieurs substances inhibitrices de la PCR contenues dans les chairs de poissons pourrait expliquer ce résultat. En effet, des composés présents en grande quantité dans certains produits alimentaires (graisses, protéines...) peuvent avoir une influence sur l'efficacité de la PCR (26). Afin de vérifier cette hypothèse, les mêmes tests PCR ont été réalisés en rajoutant aux échantillons de chairs de poissons 5 ng d'ADN chromosomique de S. massilia. Toutefois, comme précédemment, aucun fragment d'ADN n'a été amplifié par PCR, quelles que soient les amorces moléculaires utilisées.
Ces résultats permettent de conclure que la réaction PCR est inhibée par certains composés contenus dans les chairs de poissons.
La technique de purification de l'ADN chromosomique total des chairs de poissons, utilisée selon la présente invention, doit donc permettre d'éliminer l'ensemble des composés inhibiteurs de la PCR.
Un kit d'extraction rapide de l'ADN (environ 1 heure), basée sur la fixation des acides nucléiques à des billes de silice, a ainsi été testé (kit commercialisé sous la dénomination
« High Pure PCR Template Préparation Kit » par Boehringer Mannheim/Roche). Après fixation de l'ADN, cette technique permet en effet d'éliminer les sels, les protéines et d'autres impuretés cellulaires par une simple étape de lavage.
L'extraction de l'ADN total (ADN bactérien + ADN de poisson) a été réalisée sur quatre espèces de poisson différentes en voie de décomposition (gardés 12 h à température ambiante) :
2 espèces de la mer Méditerranée (rouget de roche et dorade), et 2 espèces de l'Atlantique (sole et cabillaud). A partir d'environ 50 mg de chairs de ces poissons (prélevés sous la peau), 1 à 4 μg d'ADN chromosomique total ont ainsi été purifiés. Environ 25 ng de cet ADN sont alors ajoutés au mélange réactionnel de la PCR (volume final 50 μl). Pour l'ensemble des réactions PCR, la température d'hybridation est portée à 55°C, et 100 pmoles de chaque amorces moléculaires sont ajoutées au mélange réactionnel.
La figure 17 regroupe les résultats obtenus en utilisant les couples d'amorces DDN1+/DDN5-, BN6+/BN2- et BN6+/BN4-. Pour l'ensemble des espèces de poissons testées, un fragment d'ADN unique est amplifié, et ceci avec chacun des couples d'amorces utilisés. La taille du fragment d'ADN amplifié correspond à la taille attendue pour une amplification à partir du gène torA. Ce résultat indique que les différents fragments d'ADN ont bien été amplifiés à partir du gène torA des bactéries présentes sur les chairs de poisson.
De même, les tests réalisés sur deux autres espèces de poissons en voie de putréfaction (7 jours sous glace fondante), le maquereau (poisson gras) et le merlan, ont permis de mettre en évidence le gène torA des bactéries d'altération.
Ainsi, l'utilisation des couples d'amorces moléculaires DDN1+/DDN5-, BN6+/BN2- et BN6+ BN4- peut être envisagée pour l'application du test PCR à des chairs de poissons.
De plus, l'utilisation d'un filtre de billes de silice est une méthode adéquate pour purifier l'ADN total contenu dans les chairs de poissons. Cette technique est très rapide (environ une heure), et très facile à mettre en oeuvre comparativement à une extraction isoamylalcool/chloroforme qui nécessite plusieurs étapes pour éliminer les protéines contenues dans les chairs de poissons (28).
L'amplification réalisée dans les mêmes conditions avec le couple d'amorces BC1+/BC2- a également donné des résultats encourageants sur l'ADN total de chairs d'un rouget de roche en voie de putréfaction (figure 18). En effet, malgré un bruit de fond important, l'électrophorèse en gel d'agarose des produits de la PCR révèle la présence du fragment de 177 paires de bases.
L'application de la technique à un suivi d'altération de cabillaud a permis de montrer que la technique est en corrélation directe avec la qualité fraîcheur des chairs de poisson au cours de leur conservation dans le temps.
III) Conclusion
Les couples d'amorces moléculaires selon l'invention permettent donc de détecter le gène torA chez les bactéries marines, mais également chez des bactéries relativement éloignées phylogénétiquement, à savoir les entérobactéries et les bactéries des eaux saumâtres.
L'application du test PCR aux chairs de poissons donne des résultats encourageants puisque les amorces moléculaires selon l'invention permettent de détecter le gène torA de bactéries présentes sur le poisson en voie de putréfaction. L'amplification PCR ne pouvant être appliquée directement à des échantillons de chairs de poissons, une extraction de l'ADN total de ces chairs est au préalable nécessaire.
De plus, la technique est directement liée à la qualité fraîcheur des chairs de poissons et est plus sensible que les techniques classiques comme l'ABVT.
B) MATÉRIELS ET MÉTHODES
1) Isolement des souches bactériennes, milieux et conditions de croissance Le poisson utilisé pour l'isolement des souches bactériennes Shewanella c et Shewanella massilia correspond à un rouget de roche (Mullus surmuletus) péché en mer Méditerranée au large de Marseille, et gardé à température ambiante pendant 48 heures dans un tube stérile contenant de l'eau de mer. L'eau de mer a été préalablement stérilisée à travers un filtre millipore (0,45 μM). Les souches Shewanella sont cultivées en anaérobiose ou en aérobiose à 30°C dans du milieu LB (« Luria Broth » : extrait de levure 10 g/1, bacto-peptone 5g/l et NaCl 5g/l). Les bactéries E. coli et Salmonella typhimurium sont cultivées à 37°C sur milieu LB. La souche Photobacterium phosphoreum a été obtenue par l'ATCC (n° 11040) et ne pousse pas sur les milieux conventionnels tel que le milieu LB. Elle est cultivée à 15°C sur milieu marin (marine broth ; Difco).
2) Techniques de PCR a) PCR standards
Les amplifications PCR standards sont réalisées dans les conditions décrites dans la référence (6). Le mélange réactionnel (50 μl) contient 10 ng d'ADN chromosomique, 0,2 μg de chacune des sondes oligonucléotidiques, 100 μM de chacun des quatre désoxyribonucléotides triphosphates (dXTPs), 10 mM de Tris/HCl (pH 8,3), 1,5 mM de MgCl2, 50 mM de KC1, 0,01
% de gélatine et une unité d'ADN polymérase (Taq polymérase, Boehringer Mannheim Roche). Le mélange réactionnel est finalement recouvert par 50 μl d'huile minérale afin d'empêcher l'évaporation durant le processus de la PCR.
L'amplification, réalisée dans un appareil fhermocycleur (MJ Research), met en jeu 30 cycles de réactions, un cycle comprenant une étape de dénaturation à 94° C pendant 30 secondes, une étape d'hybridation à 55°C pendant 30 secondes et une étape d'élongation à 72 °C pendant environ 45 secondes (lkb/min). L'ADN est préalablement dénaturé durant 1,5 min à 94°C avant d'entamer le premier cycle. 10 μl de chacun des produits d'amplification sont ensuite analysés par électrophorèse sur un gel d'agarose.
b) Conditions PCR avec les amorces moléculaires dégénérées selon l'invention
Les amorces moléculaires selon l'invention, notamment les amorces dénommées « DDN », « BN » ou « BC », sont telles que définies ci-dessus.
Le mélange réactionnel (50 μl) contient soit 10 ng d'ADN chromosomique de la bactérie, soit 5 μl de suspension cellulaire (DO600 = 0,5-1) soit 25 ng d'ADN total extrait à partir de poisson, 100 μM de chacun des quatre désoxyribonucléotides triphosphates (dXTPs),
0,8 μg de chacun des mélanges d'amorces selon l'invention, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 mM
MgCl2, 50 mM KC1, 0,01 % de gélatine et une unité de Taq polymérase.
La réaction PCR met enjeu 30 cycles de réactions successives constituées d'une étape de dénaturation à 94° C pendant 30 secondes suivie d'une étape d'hybridation à 55°C ou 45°C pendant 30 secondes, puis d'une étape d'élongation à 72 °C pendant 45 secondes. L'ADN est préalablement dénaturé durant 1,5 min à 94°C avant d'entamer le premier cycle.
3) Préparation d'ADN chromosomique des bactéries La préparation d'ADN chromosomique des bactéries est réalisée à partir de 10 ml de culture (DO600 > 1). Après centrifugation des cellules à 10 000 rpm pendant 10 min, le culot est resuspendu dans 1 ml d'EDTA 10 mM (pH 8). La lyse des cellules est obtenue par addition de SDS (0,5 % final). Cette solution est mélangée à un volume égal d'isoamylalcool/chloroforme (1:24). Après centrifugation pendant 20 min à 7 000 rpm, la phase supérieure est récupérée. Cette opération est reproduite plusieurs fois afin d'éliminer la plus grande quantité de protéines résiduelles. L'ADN est finalement précipité par ajout de NaCl (0,3 M final) et d'éthanol (2,2 Vol).
4) Préparation de l'ADN chromosomique totale des chairs de poissons en voie de putréfaction pour la PCR a) Préparation rapide à l'aide d'un kit basé sur la fixation de l'ADN à des billes de sillice (High pure PCR template Préparation Kit, Boehringer Mannheim/Roche) 25 mg de chairs de poissons sont incubés 45 min à 55°C dans 200 μl de tampon de lyse
(urée 4 M, Tris 200 mM, NaCl 20 mM et EDTA 200 mM, pH 7,4) en présence de 40 μl de protéinase K (0,8 mg). Afin de faciliter la lyse cellulaire, l'échantillon est préalablement broyé à l'aide d'un scalpel. 200 μl de tampon de fixation (guanidine-HCl 6 M, urée 10 mM, Tris-HCl 10 mM et Triton 20% v/v, pH 4,4) sont ajoutés à l'échantillon qui est ensuite incubé pendant 10 min à 72°C. Cette solution est mélangée à 100 μl d'isopropanol puis centrifugée à 8 000 m pendant 1 min à travers un filtre à base de billes de sillice (tube High Pure Filter + tube collecteur). Les impuretés résiduelles sont éliminées par deux étapes de lavage (tampon de lavage : NaCl 20 mM, Tris-HCl 2 mM, éthanol 80% v/v, pH 7,5). L'ADN est ensuite élue dans un tampon d'élution (Tris 10 mM, pH 8,5). b) Extraction d'ADN des cellules par traitement au NaOH/SDS
25 mg de chairs de poissons sont prélevés sur un poisson en voie de putréfaction (après 16 heures d'incubation dans un tube stérile gardé à température ambiante), et placés dans 50 μl d'une solution de NaOH 0,05 M, SDS 0,25%. Après broyage des cellules, l'échantillon est incubé 15 min à 95 °C. 450 μl d'eau stérile sont ajoutés au mélange et les débris cellulaires sont alors éliminés par une étape de centrifugation de 2 min à 8 000 g. 5 μl du surnageant obtenu sont directement utilisés pour le test PCR. c) Extraction isoamylalcool chloroforme
La préparation d'ADN chromosomique totale par extraction isoamylalcool/chloroforme est réalisée à partir de 25 mg de chairs de poissons contaminées comme décrit précédemment pour l'ADN bactérien. Le nombre d'étapes d'extraction est en revanche augmenté afin de pouvoir éliminer les quantités importantes d'impuretés contenues dans les échantillons de chairs de poissons.
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Claims
1. Utilisation de séquences nucléotidiques choisies parmi celles comprenant une séquence codant pour une protéine du système trimethylamine N-oxyde reductase (TMAO reductase) chez les bactéries, ou un fragment de cette séquence telle qu'une sonde ou une amorce d'environ 15 à environ 25 nucléotides, ou une séquence dérivée par addition, suppression, et/ou substitution d'un ou plusieurs nucléotides de cette séquence codant pour une protéine du système TMAO reductase ou d'un fragment de cette dernière, ledit fragment et ladite séquence dérivée étant capables de s'hybrider avec ladite séquence codant pour une protéine du système TMAO reductase, pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection de la présence de toutes bactéries impliquées dans le processus de dégradation des chairs d'animaux aquatiques, chez un hôte susceptible d'être porteur de telles bactéries.
2. Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que la séquence codant pour une protéine du système TMAO reductase est choisie parmi les séquences codant pour la TMAO reductase chez les bactéries, encore désignée protéine TorA ou DorA, ou codant pour un cytochrome de type c, encore désigné protéine TorC ou DorC.
3. Utilisation selon la revendication 1 ou la revendication 2, caractérisée en ce que les séquences nucléotidiques codant pour une protéine du système TMAO reductase sont choisies parmi celles des bactéries suivantes :
- les bactéries marines, telles que celles du genre Shewanella, Photobacterium ou Vibrio, lesdites séquences étant notamment choisies parmi les suivantes :
* la séquence codant pour la protéine TorA de Shewanella massilia représentée sur la figure 1,
* la séquence codant pour la protéine TorA de Shewanella putrefaciens représentée sur la figure 1,
* la séquence codant pour la protéine TorA de Shewanella c représentée sur la figure 2, * la séquence partielle codant pour la protéine TorA de Photobacterium phosphoreum représentée sur la figure 3,
* la séquence codant pour la protéine TorC de Shewanella massilia représentée sur la figure 14, - les bactéries provenant des eaux saumâtres, telles que celles du genre Rhodobacter, ou Roseobacter, lesdites séquences étant notamment choisies parmi les suivantes :
* la séquence codant pour la protéine DorA de Rhodobacter sphaeroides représentée sur la figure 4, * la séquence codant pour la protéine DorA de Rhodobacter capsulatus représentée sur la figure 4,
* la séquence codant pour la protéine DorC de Rhodobacter sphaeroides représentée sur la figure 14,
- les entérobactéries, telles que celles du genre Escherichia, ou Salmonella, lesdites séquences étant notamment choisies parmi les suivantes :
* la séquence codant pour la protéine TorA de Escherichia coli représentée sur la figure 4,
* la séquence partielle codant pour la protéine TorA de Salmonella typhimurium représentée sur la figure 5, * la séquence codant pour la protéine TorC de Escherichia coli représentée sur la figure 14.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les séquences nucléotidiques sont utilisées sous forme de couples d'amorces choisis parmi l'un quelconque des trois groupes d'amorces suivants :
(1) le groupe d'amorces « DDN » comprenant :
* les compositions de séquences nucléotidiques « DDN+ » suivantes :
- DDN1+ : 5 ' CGG vGA yTA CTC bAC hGG TGC i ' : mélange de 54 séquences nucléotidiques, - DDN5+ : 5 ' ATy GAT GCG ATy CTC GAA CC i ' : mélange de 4 séquences nucléotidiques,
* les compositions de séquences nucléotidiques « DDN- » suivantes :
- DDN2- : 5 'CGT Amw sGT CGA kAT CGT TrC GCT C i ' : mélange de 32 séquences nucléotidiques, - DDN3- : 5 ' GAC TCA CAy Awy TGy GAG TG i ' : mélange de 16 séquences nucléotidiques, - DDN4- : 5 ' TGr CCd CGr kCG TTA AAG AC i ' : mélange de 24 séquences nucléotidiques,
- DDN5- : 5 ' CCv GGT TCG AGr ATC GCA TC ' : mélange de 6 séquences nucléotidiques, (2) le groupe d'amorces « BN » comprenant : les compositions de séquences nucléotidiques « BN+ » suivantes :
- BN1+ : 5 ' C bGA yAT CsT rCT GCC i ' : mélange de 16 séquences nucléotidiques,
- BN3+ : 5 ' GGm GAy TAy TCb ACm GGy GC ' : mélange de 96 séquences nucléotidiques, - BN6+ : 5 ' Twy GAr CGy AAC GAy mTC GA 3 ' : mélange de 64 séquences nucléotidiques,
* les compositions de séquences nucléotidiques « BN- » suivantes :
- BN2- : 5 ' GG vyC rTA CCA bsC vCC TTC i ' : mélange de 216 séquences nucléotidiques, - BN4- : 5 ' ATC Arr CCn swv GGC GTG CC i ' : mélange de 192 séquences nucléotidiques,
- BN5- : 5 'GbC ACr TCd GTy TGy GG i ' : mélange de 72 séquences nucléotidiques, (3) le groupe d'amorces « BC » comprenant :
* les compositions de séquences nucléotidiques « BC+ » suivantes : - BC1+ : 5 ' ACn CCn GAr AAr TTy GAr GC i ' : mélange de 256 séquences nucléotidiques,
- BC2+ : 5 ' TGy ATh GAy TGy CAy AAr GG i ' : mélange de 96 séquences nucléotidiques, les compositions de séquences nucléotidiques « BC- » suivantes : - BC2- : 5 ' CCy TTr TGr CAr TCd ATr CA i ' : mélange de 96 séquences nucléotidiques,
- BC3- : 5 ' TTn GCr TCr AAr TGn GC 3 ' : mélange de 128 séquences nucléotidiques, dans lesquelles n = (A,C,G,T), y = (C,T), r = (A,G), h = (A,C,T), d = (G,A,T), m = (A,C), w = (A,T), b = (G,T,C), s = (G,C), v = (G,A,C), et k = (G, T), les couples d'amorces étant choisis de telles de telle sorte que l'une des amorces d'un couple correspond à l'une des compositions de séquences nucléotidiques DDN+, BN+ ou BC+ susmentionnées, tandis que l'autre amorce correspond respectivement à l'une des compositions de séquences nucléotidiques DDN-, BN- ou BC- susmentionnées, lesdits couples d'amorces étant notamment choisis parmi l'un quelconque des quatre couples suivants :
(a) le couple DDN1+ / DDN5-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 820 paires de bases (bp), et notamment à l'amplification d'un fragment de 821 bp du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 821 bp délimité par les nucléotides situés aux positions 620 à 1450 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4,
(b) le couple BN6+ / BN2-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 710 bp, et notamment à l'amplification d'un fragment de 727 bp du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 727 bp délimité par les nucléotides situés aux positions 1657 à 2403 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4,
(c) le couple BN6+ /BN4-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 360 bp, et notamment à l'amplification d'un fragment de 355 bp du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 355 bp délimité par les nucléotides situés aux positions 1657 à 2023 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4,
(d) le couple BC1+ /BC2-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorC chez les bactéries, d'une taille d'environ 170 bp, et notamment à l'amplification d'un fragment de 197 bp du gène codant pour la protéine TorC chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 197 bp codant pour le fragment polypeptidique délimité par les acides aminés situés aux positions 114 à 179 de la protéine TorC de S. massilia représentée sur la figure 14.
5. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que les hôtes susceptibles d'être porteurs de bactéries impliquées dans le processus de dégradation des chairs d'animaux aquatiques, telles que décrites dans la revendication 3, sont des organismes aquatiques, notamment des organismes marins tels que les poissons et les crustacés, et plus particulièrement les poissons d'Atlantique tels que la sole, le cabillaud, ou les poissons de la mer Méditerranée tels que le rouget de roche, la dorade, ainsi que certains animaux des eaux douces ou saumâtres.
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection de la présence de toutes bactéries impliquées dans la dégradation des chairs d'animaux aquatiques, dans le cadre d'un procédé d'évaluation de l'état de fraîcheur des animaux aquatiques sur lesquels est prélevé l'échantillon testé, lorsque ces derniers sont extraits de leur environnement naturel.
7. Séquence nucléotidique correspondant à l'une des séquences suivantes :
- DDN1+ : 5 ' CGG vGA yTA CTC bAC hGG TGC i ',
- DDN5+ : 5 ' ATy GAT GCG ATy CTC GAA CC 3 ', - DDN2- 5 'CGT Amw sGT CGA kAT CGT TrC GCT C 3 ',
- DDN3- 5 ' GAC TCA CAy Awy TGy GAG TG i ',
- DDN4- 5 ' TGr CCd CGr kCG TTA AAG AC i ',
- DDN5- 5 • CCv GGT TCG AGr ATC GCA TC i ',
- BN1+ : 5 ' C bGA yAT CsT rCT GCC i ', - BN3+ : 5 ' GGm GAy TAy TCb ACm GGy GC i ',
- BN6+ : 5 ' Twy GAr CGy AAC GAy mTC GA i ',
- BN2- : 5 ' GG vyC rTA CCA bsC vCC TTC i ',
- BN4- : 5 ' ATC Arr CCn swv GGC GTG CC i ',
- BN5- : 5 'GbC ACr TCd GTy TGy GG i ', - BC1+ : 5 ' ACn CCn GAr AAr TTy GAr GC i ',
- BC2+ : 5 ' TGy ATh GAy TGy CAy AAr GG i ',
- BC2- : 5 ' CCy TTr TGr CAr TCd ATr CA i ',
- BC3- : 5 ' TTn GCr TCr AAr TGn GC i ', dans lesquelles n = (A,C,G,T), y = (C,T), r = (A,G), h = (A,C,T), d = (GAT), m = (A,C), w = (A,T), b = (G,T,C), s = (G,C), v = (GAC), et k = (G,T).
8. Composition de séquences nucléotidiques en mélange, correspondant à l'une des compositions suivantes :
* les compositions de séquences nucléotidiques « DDN+ » suivantes : - DDN1+ : 5 ' CGG vGA yTA CTC bAC hGG TGC i ' : mélange de 54 séquences nucléotidiques, - DDN5+ : 5' ATy GAT GCG ATy CTC GAA CC i ' : mélange de 4 séquences nucléotidiques, les compositions de séquences nucléotidiques « DDN- » suivantes :
- DDN2- : 5 'CGT Amw sGT CGA kAT CGT TrC GCT C i ' : mélange de 32 séquences nucléotidiques,
- DDN3- : 5' GAC TCA CAy Awy TGy GAG TG i ' : mélange de 16 séquences nucléotidiques,
- DDN4- : 5 ' TGr CCd CGr kCG TTA AAG AC i ' : mélange de 24 séquences nucléotidiques, - DDN5- : 5 ' CCv GGT TCG AGr ATC GCA TC i ' : mélange de 6 séquences nucléotidiques,
* les compositions de séquences nucléotidiques « BN+ » suivantes :
- BN1+ : 5 ' C bGA yAT CsT rCT GCC i ' : mélange de 16 séquences nucléotidiques,
- BN3+ : 5' GGm GAy TAy TCb ACm GGy GC i ' : mélange de 96 séquences nucléotidiques,
- BN6+ : 5 ' Twy GAr CGy AAC GAy mTC GA i ' : mélange de 64 séquences nucléotidiques, les compositions de séquences nucléotidiques « BN- » suivantes :
- BN2- : 5 ' GG vyC rTA CCA bsC vCC TTC i ' : mélange de 216 séquences nucléotidiques,
- BN4- : 5' ATC Arr CCn swv GGC GTG CC i ' : mélange de 192 séquences nucléotidiques,
- BN5- : 5 'GbC ACr TCd GTy TGy GG i ' : mélange de 72 séquences nucléotidiques, les compositions de séquences nucléotidiques « BC+ » suivantes : - BC1+ : 5' ACn CCn GAr AAr TTy GAr GC 3 ' : mélange de 256 séquences nucléotidiques,
- BC2+ : 5 ' TGy ATh GAy TGy CAy AAr GG i ' : mélange de 96 séquences nucléotidiques, les compositions de séquences nucléotidiques « BC- » suivantes : - BC2- : 5 ' CCy TTr TGr CAr TCd ATr CA i ' : mélange de 96 séquences nucléotidiques,
- BC3- : 5 ' TTn GCr TCr AAr TGn GC 3 ' : mélange de 128 séquences nucléotidiques, dans lesquelles n - (A,C,G,T), y - (C,T), r = (A,G), h = (A,C,T), d = (G,A,T), m = (A,C), w = (A,T), b = (G,T,C), s = (G,C), v = (G,A,C), et k = (G,T).
9. Couple d'amorces caractérisé en ce qu'il est choisi au sein de l'un des groupes d'amorces suivants :
(1) le groupe d'amorces « DDN » comprenant :
* les compositions de séquences nucléotidiques « DDN+ » suivantes :
- DDN1+: 5' CGG vGA yTA CTC bAC hGG TGCi' : mélange de 54 séquences nucléotidiques, - DDN5+ : 5' ATy GAT GCG ATy CTC GAA CCi' : mélange de 4 séquences nucléotidiques,
* les compositions de séquences nucléotidiques « DDN- » suivantes :
- DDN2- : 5 'CGT Amw sGT CGA kAT CGT TrC GCT Ci': mélange de 32 séquences nucléotidiques, - DDN3- : 5' GAC TCA CAy Awy TGy GAG TG i' : mélange de 16 séquences nucléotidiques,
- DDN4-: 5' TGr CCd CGr kCG TTA AAG AC ' : mélange de 24 séquences nucléotidiques,
- DDN5-: 5' CCv GGT TCG AGr ATC GCA TCi' : mélange de 6 séquences nucléotidiques,
(2) le groupe d'amorces « BN » comprenant : les compositions de séquences nucléotidiques « BN+ » suivantes :
- BN1+ : 5 ' C bGA yAT CsT rCT GCC i ' : mélange de 16 séqμences nucléotidiques,
- BN3+: 5' GGm GAy TAy TCb ACm GGy GCi' : mélange de 96 séquences nucléotidiques,
- BN6+: 5' Twy GAr CGy AAC GAy mTC GA 3' : mélange de 64 séquences nucléotidiques,
* les compositions de séquences nucléotidiques « BN- » suivantes :
- BN2-: 5' GG vyC rTA CCA bsC vCC TTC i' : mélange de 216 séquences nucléotidiques,
- BN4-: 5' ATC Arr CCn swv GGC GTG CCi' : mélange de 192 séquences nucléotidiques, - BN5- : 5 'GbC ACr TCd GTy TGy GG i ' : mélange de 72 séquences nucléotidiques, (3) le groupe d'amorces « BC » comprenant : les compositions de séquences nucléotidiques « BC+ » suivantes :
- BC1+ : 5 ' ACn CCn GAr AAr TTy GAr GC i ' : mélange de 256 séquences nucléotidiques,
- BC2+ : 5 ' TGy ATh GAy TGy CAy AAr GG i ' : mélange de 96 séquences nucléotidiques,
* les compositions de séquences nucléotidiques « BC- » suivantes :
- BC2- : 5 ' CCy TTr TGr CAr TCd ATr CA i ' : mélange de 96 séquences nucléotidiques, - BC3- : 5 ' TTn GCr TCr AAr TGn GC i ' : mélange de 128 séquences nucléotidiques, dans lesquelles n = (A,C,G,T), y = (C,T), r ≈ (A,G), h = (A,C,T), d = (G,A,T), m = (A,C), w = (A,T), b = (G,T,C), s = (G,C), v = (GAC), et k = (G,T), les couples d'amorces étant choisis de telles de telle sorte que l'une des amorces d'un couple correspond à l'une des compositions de séquences nucléotidiques DDN+, BN+ ou BC+ susmentionnées, tandis que l'autre amorce correspond respectivement à l'une des compositions de séquences nucléotidiques DDN-, BN- ou BC- susmentionnées, lesdits couples d'amorces étant notamment choisis parmi l'un quelconque des quatre couples suivants :
(a) le couple DDN1+ / DDN5-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 820 paires de bases (bp), et notamment à l'amplification d'un fragment de 821 bp du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 821 bp délimité par les nucléotides situés aux positions 620 à 1450 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4,
(b) le couple BN6+ / BN2-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 710 bp, et notamment à l'amplification d'un fragment de 727 bp du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 727 bp délimité par les nucléotides situés aux positions 1657 à 2403 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4,
(c) le couple BN6+ /BN4-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries, d'une taille d'environ 360 bp, et notamment à l'amplification d'un fragment de 355 bp du gène codant pour la protéine TorA chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 355 bp délimité par les nucléotides situés aux positions 1657 à 2023 du gène torA de S. massilia représenté sur la figure 4,
(d) le couple BC1+ /BC2-, conduisant à l'amplification de fragments du gène codant pour la protéine TorC chez les bactéries, d'une taille d'environ 170 bp, et notamment à l'amplification d'un fragment de 197 bp du gène codant pour la protéine TorC chez les bactéries du genre Shewanella, tel que le fragment de 197 bp codant pour le fragment polypeptidique délimité par les acides aminés situés aux positions 114 à 179 de la protéine TorC de S. massilia représentée sur la figure 14.
10. Méthode de détection de toutes bactéries impliquées dans la dégradation des chairs d'animaux aquatiques chez un hôte susceptible d'être porteur de telles bactéries, ladite méthode étant effectuée à partir d'un échantillon biologique prélevé sur cet hôte, cet échantillon biologique correspondant notamment à un fragment sous-cutané de chair de l'animal aquatique en question, et étant caractérisée en ce qu'elle comprend une étape d'hybridation d'au moins une séquence nucléotidique telle que définie dans l'une quelconque des revendications 1 à 9, avec des fragments des gènes codant pour une protéine du système TMAO-réductase de bactéries impliquées dans la dégradation des chairs d'animaux aquatiques susceptibles d'être présentes dans l'échantillon biologique prélevé sur ledit hôte, suivie d'une étape de révélation, notamment par électrophorèse, de la présence éventuelle dans ledit échantillon de gènes codant pour une protéine du système TMAO-réductase, ou de fragments de ces gènes, dont le nombre de copies a été le cas échéant amplifié.
11. Méthode de détection selon la revendication 10, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes :
- le traitement d'un échantillon biologique prélevé sur cet hôte afin d'extraire l'ADN total de cet hôte et de rendre le génome de ces bactéries accessible aux séquences nucléotidiques ou amorces définies selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, ce traitement étant notamment effectué à l'aide d'une technique d'exfraction rapide de l'ADN basée sur la fixation des acides nucléiques à des billes de silice,
- l'amplification du nombre de copies de gènes codant pour les protéines du système TMAO-réductase de bactéries impliquées dans la dégradation des chairs d'animaux aquatiques, ou de fragments de ces gènes, susceptibles d'être présents dans cet échantillon, à l'aide des séquences nucléotidiques ou amorces susmentionnées hybridant avec les gènes ou fragments de gènes susmentionnés,
- la détection de la présence éventuelle d'un nombre amplifié de copies de gènes codant pour une protéine du système TMAO-réductase des bactéries susmentionnées, ou de fragments de ces gènes, et donc de la présence de telles bactéries dans l'échantillon biologique étudié.
12. Méthode de détection selon la revendication 11, caractérisée en ce que l'amplification du nombre de gènes codant pour la TMAO-réductase comprend les étapes suivantes :
- la prédénaturation de l'ADN double brin total de l'hôte en ADN mono-brin, de préférence dans un tampon constitué de lOmM Tris-HCl pH 8,3, 50mM KC1, l,5mM MgCl2, 0,01 % de gélatine, des 4 désoxynucléotides constitutifs des ADN (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) à une concentration de 100 μM chacun, et des couples d'amorces, tels que définis dans les revendications 1 à 9, par chauffage entre environ 90 °C et environ 100 °C, avantageusement à 94 °C, pendant environ 1,5 minute,
- l'amplification proprement dite par addition au milieu obtenu à l'étape précédente d'ADN polymérase, par exemple la Taq polymérase, chauffage à environ 94°C pendant environ 30 secondes, ce qui correspond à l'étape de dénaturation proprement dite,
* puis chauffage entre environ 35°C à environ 60 °C, et notamment à environ 45°C ou 55°C, pendant environ 30 secondes, ce qui correspond à l'étape d'hybridation des amorces avec les gènes codant pour les protéines du système TMAO-réductase de bactéries, ou des fragments de ces gènes, susceptibles d'être présents dans l'échantillon biologique étudié, et enfin, chauffage à 72 °C, pendant environ 45 secondes, ce qui correspond à l'étape d'élongation des amorces, hybridées à l'étape précédente, l'une vers l'autre, produisant ainsi des séquences nucléotidiques complémentaires de fragments de gènes codant pour les protéines du système TMAO-réductase de bactéries, ces dernières séquences étant délimitées par les nucléotides s 'hybridant avec les amorces susmentionnées,
- la répétition de l'étape d'amplification précédente entre environ 15 et environ 35 fois, avantageusement environ 30 fois.
13. Kit pour la mise en oeuvre d'une méthode de détection selon l'une des revendications
10 à 12, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une ou plusieurs séquences nucléotidiques ou amorces définies dans l'une des revendications 1 à 9,
- une ADN polymérase,
- un milieu réactionnel avantageusement constitué de lOmM Tris-HCl pH 8,3, 50mM KC1, l,5mM MgCl2, 0,01 % de gélatine, des 4 désoxynucléotides constitutifs des ADN (dCTP, dATP, dGTP, dTTP) à une concentration de 100 μM chacun.
14. Séquence nucléotidique comprenant :
- la séquence représentée sur la figure 2 du gène torA codant pour la protéine TorA de la bactérie marine Shewanella c, * ou toute séquence dérivée de la séquence susmentionnée par dégénérescence du code génétique, et codant pour la protéine TorA de Shewanella c, dont la séquence peptidique est représentée sur la figure 6,
* ou toute séquence dérivée de la séquence nucléotidique susmentionnée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, ladite séquence dérivée ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence nucléotidique susmentionnée représentée sur la figure 2,
* ou tout fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ou d'une séquence dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué d'au moins environ 15 nucléotides, - la séquence partielle représentée sur la figure 3 du gène codant pour la protéine TorA de la bactérie marine Photobacterium phosphoreum,
* ou toute séquence dérivée de la séquence susmentionnée par dégénérescence du code génétique, et codant pour la protéine TorA de Photobacterium phosphoreum dont la séquence peptidique est représentée sur la figure 7, * ou toute séquence dérivée de la séquence nucléotidique susmentionnée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, ladite séquence dérivée ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence nucléotidique susmentionnée représentée sur la figure 3,
* ou tout fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ou d'une séquence dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué d'au moins environ 15 nucléotides, - la séquence partielle représentée sur la figure 5 du gène codant pour la protéine TorA de la bactérie marine Salmonella typhimurium,
* ou toute séquence dérivée de la séquence susmentionnée par dégénérescence du code génétique, et codant pour la protéine TorA de Salmonella typhimurium dont la séquence peptidique est représentée sur la figure 8,
* ou toute séquence dérivée de la séquence nucléotidique susmentionnée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs nucléotides, ladite séquence dérivée ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence nucléotidique susmentionnée représentée sur la figure 5, * ou tout fragment de la séquence nucléotidique susmentionnée, ou d'une séquence dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué d'au moins environ 15 nucléotides.
15. Séquence peptidique codée par une séquence nucléotidique selon la revendication 14, et comprenant :
- la séquence en acides aminés représentée sur la figure 6 de la protéine TorA de Shewanella c,
* ou une séquence dérivée de la séquence peptidique susmentionnée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ladite séquence dérivée ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence peptidique susmentionnée représentée sur la figure 6,
* ou un fragment de la séquence peptidique susmentionnée, ou d'une séquence dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué d'au moins environ 5 acides aminés, - la séquence partielle en acides aminés représentée sur la figure 7 de la protéine TorA de
Photobacterium phosphoreum,
* ou une séquence dérivée de la séquence peptidique susmentionnée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ladite séquence dérivée ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence peptidique susmentionnée représentée sur la figure 7,
* ou un fragment de la séquence peptidique susmentionnée, ou d'une séquence dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué d'au moins environ 5 acides aminés,
- la séquence partielle en acides aminés représentée sur la figure 8 de la protéine TorA de Salmonella typhimurium,
* ou une séquence dérivée de la séquence peptidique susmentionnée, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ladite séquence dérivée ayant de préférence une homologie d'environ 35 % à 100 % avec la séquence peptidique susmentionnée représentée sur la figure 8,
* ou un fragment de la séquence peptidique susmentionnée, ou d'une séquence dérivée de cette dernière telle que définie ci-dessus, ledit fragment étant de préférence constitué d'au moins environ 5 acides aminés.
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