EP1206544A2 - "odorant-binding" proteines humaines fixant des ligands hydrophobes: polypeptides et polynucleotides codant lesdits polypeptides et leurs applications - Google Patents

"odorant-binding" proteines humaines fixant des ligands hydrophobes: polypeptides et polynucleotides codant lesdits polypeptides et leurs applications

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Publication number
EP1206544A2
EP1206544A2 EP00958685A EP00958685A EP1206544A2 EP 1206544 A2 EP1206544 A2 EP 1206544A2 EP 00958685 A EP00958685 A EP 00958685A EP 00958685 A EP00958685 A EP 00958685A EP 1206544 A2 EP1206544 A2 EP 1206544A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
polypeptide
seq
hobpiibα
sequence
polynucleotide
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00958685A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Gilles Pitiot
Eric Lacazette
Françoise GACHON
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
PITIOT, GILLES
Universite dAuvergne
Original Assignee
Pitiot Gilles
Universite dAuvergne
Universite Clermont Auvergne
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pitiot Gilles, Universite dAuvergne, Universite Clermont Auvergne filed Critical Pitiot Gilles
Publication of EP1206544A2 publication Critical patent/EP1206544A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to the discovery of new human proteins fixing odors, hereinafter called "OBP" (Odorant Binding Proteins) as well as their applications, both therapeutically and non-therapeutically.
  • OBP Oletin binding Proteins
  • the present invention is based on the identification of a family of lipocalin genes composed of three genes and two pseudogenes on the human chromosome 9q34; the three genes correspond to the LCN 1 gene already described and to two new genes which are the subject of the present invention and called hOBPIIa and hOBPIIb.
  • the invention is based on the attribution of new functions to human lipocalins already known by the discovery of new territories of expression.
  • the OBPs according to the present invention are human OBPs which have a very large number of advantages, as will emerge from the rest of the text, compared to murine proteins.
  • OBP proteins of the lipocalin family have, for some of them, been mentioned indirectly in patent WO 99 07740, but their function of OBP has never been described until now; this also applies to the proteins LCN1, retinol-binding-protein (RBP) and Apolipoprotein D (ApoD), as will be explained more fully below.
  • RBP retinol-binding-protein
  • ApoD Apolipoprotein D
  • the lipocalin family has been enriched to now incorporate a large number of proteins, more than a hundred, in both eukaryotes and prokaryotes (Flower and al, 1995, 1996).
  • This family consists of small proteins (160-190 amino acids) containing a hydrophobic pocket and which are generally secreted (Bocskei et al, 1992; Senoo et al, 1990, Zeng et al, 1996; Miller, 1998), although in some cases are proteins that remain associated with the membrane (Nagata et al, 1991).
  • the sequence identities between the different lipocalins are around 20%, however, the sequence identities are more important for orthologous proteins, as well as for the recent paralogous genes described (Igarashi et al, 1992; Dewald and al, 1992).
  • the present invention relates to isolated OBPII polypeptides encoded by the two new isolated human OBPIIa and OBPIIb genes located at locus 9q34; the invention also relates to the corresponding polynucleotide sequences, the corresponding mRNAs, as well as the promoter regulatory sequences which determine the expression profile in the various tissues and in particular in the secretory tissues. These two genes code for at least seven different polypeptides given the existence of alternative splicing of the transcripts.
  • the OBPIIa gene codes for at least 4 different polypeptides called OBPIIa ⁇ , OBPIIa ⁇ , OBPIIa ⁇ , OBPIIas and the OBPIIb gene codes for three polypeptides different called OBPIIb ⁇ , OBPIIb ⁇ , OBPIIb ⁇ . Even if a gene is mainly expressed, all forms of messengers are found in the nasal structure.
  • the subject of the present invention is therefore an isolated polypeptide comprising an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequences SEQ ID No 2, SEQ ID No 2, SEQ ID No 2, SEQ ID No 2, SEQ ID No 2, SEQ ID No 2, SEQ ID No 2, SEQ ID No 2, SEQ ID No 2, SEQ ID No 2, SEQ ID No 2, SEQ ID No 2, SEQ ID No 2, SEQ ID No 2, SEQ ID No 2, SEQ ID No 2, SEQ ID No 2
  • the invention relates to polypeptides obtained by purification from natural sources or else obtained by recombinant techniques, as will be described in what follows; the invention also relates to the polypeptides obtained by chemical synthesis which can then comprise unnatural amino acids.
  • polypeptide will be used to also denote a protein or a peptide.
  • percentage of identity between the sequences is meant the percentage of identical amino acids between the sequences obtained with the best possible alignment of sequences. This percentage being purely statistical and the differences between the polypeptides being distributed randomly and over the entire length.
  • the present invention also relates to an isolated polypeptide characterized in that it comprises a polypeptide chosen from: a) a polypeptide of sequence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4,
  • variant polypeptide will be understood to mean all of the mutated polypeptides which may exist naturally, in particular in humans, and which correspond in particular to truncations, substitutions, deletions and / or additions of amino acid residues.
  • the variant polypeptides according to the invention conserve at least one domain for binding to a hydrophobic ligand.
  • homologous polypeptide is intended to denote the polypeptides having, with respect to the polypeptides of sequence SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 8, SEQ ID No.
  • SEQ ID N ° 12 and SEQ ID N ° 14 certain modifications such as in particular a deletion, addition or substitution of at least one amino acid, a truncation, an elongation and / or a chimeric fusion.
  • homologous polypeptides those whose amino acid sequence has at least 90% identity, preferably 95%, preferably 97%, and even more preferably 99% identity with the sequences, are preferred.
  • amino acids of the polypeptides according to the invention In the case of a substitution, one or more consecutive or non-consecutive amino acids are replaced by "equivalent amino acids".
  • equivalent amino acid is intended here to denote any amino acid capable of being substituted for one of the amino acids of the basic structure without, however, modifying the essential functional characteristics or properties of the corresponding polypeptides, their biological activities, such as, for example, the induction in vivo of antibodies capable of recognizing the polypeptide whose amino acid sequence is included in the sequence of amino acids SEQ ID N ° 2, SEQ ID N ° 4, SEQ ID N ° 6, SEQ ID N ° 8, SEQ ID N ° 10, SEQ ID N ° 12 or SEQ ID N ° 14, or one of its fragments.
  • biologically active fragment is intended to denote in particular a fragment of the amino acid sequence of a polypeptide according to the invention having at least one of the characteristics or functional properties of the polypeptides according to the invention, in particular in that: (i) it is capable of being recognized by an antibody specific for a polypeptide according to the invention or by antibodies produced by patients during an immune reaction; (ii) it presents at least one of the domains or regions as defined below; (iii) it is capable of binding a hydrophobic ligand and in particular odorous molecules, preferably pheromones; (iv) it is able to specifically bind a receptor.
  • polypeptide fragment is intended to denote a polypeptide comprising at least 15 amino acids, preferably 18 amino acids, more preferably 25 and more preferably 50 amino acids.
  • the polypeptide fragments according to the invention obtained by cleavage of said polypeptide by a proteolytic enzyme, by a chemical reagent, or alternatively by placing said polypeptide in a very acidic environment are also part of the invention.
  • the present invention relates to an isolated polypeptide selected from a polypeptide corresponding to the sequence SEQ ID No. 2 and called OBPIIa ⁇ , at the sequence SEQ ID N ° 4 and called OBPIIa ⁇ , to the sequence SEQ ID N ° 6 and called OBPII a ⁇ , to the sequence SEQ ID N ° 10 and called OBPIIb ⁇ , to the sequence SEQ ID N ° 12 and called OBPII b p.
  • polypeptides according to the invention are characterized in that they preferably comprise the Gly-Thr-Trp-Tyr domain.
  • the invention also relates to the isolated polynucleotide characterized in that it codes for a polypeptide as described above.
  • the polynucleotide according to the invention is chosen from the polynucleotide of sequence SEQ ID N ° 1, SEQ ID N ° 3, SEQ ID N ° 5, SEQ ID N ° 7, SEQ ID N ° 9, SEQ ID N ° 11 or SEQ ID No. 13.
  • the invention also relates to an isolated polynucleotide characterized in that it comprises a polynucleotide chosen from: a) a polynucleotide of sequence SEQ ID No 1, SEQ ID No 3, SEQ ID No 5, SEQ ID No 7 , SEQ ID N ° 9, SEQ ID N ° 1 1 or SEQ ID N ° 13 or whose sequence is that of the RNA corresponding to the sequence SEQ ID N ° 1, SEQ ID N ° 3, SEQ ID N ° 5 , SEQ ID No.7, SEQ ID No.9, SEQ ID No.11 or SEQ ID No.13; b) a polynucleotide whose sequence is complementary to the sequence of a polynucleotide defined in a), c) a polynucleotide whose sequence comprises at least
  • polynucleotide, oligonucleotide, polynucleotide sequence, nucleotide sequence or nucleic acid is intended to denote a DNA fragment, both a double-stranded DNA, a single-stranded DNA and transcription products of said DNAs, and / or an RNA fragment, said isolated natural or synthetic fragments, comprising or not non-natural nucleotides, designating a precise sequence of nucleotides, modified or not, making it possible to define a fragment or a region of a nucleic acid.
  • polynucleotide of complementary sequence is intended to denote any DNA whose nucleotides are complementary to those of SEQ ID No.1, SEQ ID No.3, SEQ ID No.5, SEQ ID No.7, SEQ ID No.9, SEQ ID N ° ll, SEQ ID N ° 13 or part of SEQ ID N ° 1, SEQ ID N ° 3, SEQ ID N ° 5, SEQ ID N ° 7, SEQ ID N ° 9, SEQ ID N ° 11, SEQ ID N ° 13 and whose orientation is reversed.
  • percentage identity within the meaning of the present invention means a percentage of identical bases between the polynucleotides obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two polynucleotides being distributed randomly and over their entire length.
  • hybridization under conditions of high stringency means that the conditions of temperature and ionic strength are chosen in such a way that they allow hybridization to be maintained between two complementary DNA fragments.
  • high stringency conditions of the hybridization step for the purpose of defining the polynucleotide fragments described above are advantageously as follows: DNA-DNA or DNA-RNA hybridization is carried out in two stages: (1) prehybridization at 42 ° C for 3 hours in phosphate buffer (20 mM, pH 7.5) containing 5 x SSC (1 x SSC corresponds to a 0.15 M NaCl + 0.015 M sodium citrate solution), 50% formamide, 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 10 x Denhard's, 5% dextran sulfate and 100 ⁇ g / ml of salmon sperm DNA ; (2) actual hybridization for 20 hours at a temperature depending on the size of the probe (ie: 42 ° C, for a probe of size>
  • the last washing is carried out in 0.1 x SSC + 0.1% SDS for 30 minutes at 60 ° C. for a probe of size> 100 nucleotides.
  • the high stringency hybridization conditions described above for a polynucleotide of defined size will be adapted by those skilled in the art for oligonucleotides of larger or smaller size, according to the teaching of Sambrook and ⁇ . (1989) .
  • a nucleotide fragment corresponding to the preceding definition will have at least 15 consecutive nucleotides, preferably at least 21 nucleotides, and even more preferably at least 30 consecutive nucleotides of the sequence from which it is derived.
  • the polynucleotide according to the invention is characterized in that it is labeled directly or indirectly with a radioactive compound or a non-radioactive compound.
  • the polynucleotide according to the invention is used as a primer for the amplification or polymerization of nucleic sequences; the invention also relates to the use of a polynucleotide according to the invention as a probe for the detection of nucleic acid sequences.
  • the fragments of polynucleotides which can be used as probe or as primer in methods of detection, identification, assay or amplification of nucleic sequence will have a minimum size of 9 bases, preferably 18 bases , and more preferably 36 bases.
  • the invention relates to the use of a polynucleotide according to the invention as a sense or antisense oligonucleotide to control the expression of the corresponding protein product in this case a polypeptide according to the invention.
  • the unlabeled polynucleotide sequences according to the invention can be used directly as a probe, primer or oligonucleotide; however, the sequences used are generally marked to obtain sequences which can be used for numerous applications.
  • the labeling of primers, probes, oligonucleotides according to the invention is carried out by radioactive elements or by non-radioactive molecules; among the radioactive isotopes used, mention may be made of 3 P, 33 P, 35 S, 3 H or 125 I.
  • Non-radioactive entities are selected from ligands such as biotin, avidin, streptavidin, dioxygenin, haptens, dyes, luminescent agents such as radioluminescent, chemiluminescent, bioluminescent, fluorescent, phosphorescent agents.
  • ligands such as biotin, avidin, streptavidin, dioxygenin, haptens, dyes, luminescent agents such as radioluminescent, chemiluminescent, bioluminescent, fluorescent, phosphorescent agents.
  • the invention also includes a method of detecting and / or assaying nucleic acid according to the invention, in a biological sample, characterized in that it comprises the following steps: (i) isolation of the DNA to starting from the biological sample to be analyzed, or obtaining a cDNA from the RNA of the biological sample; (ii) specific DNA amplification coding for the polypeptide according to the invention using primers; (iii) analysis of the amplification products.
  • the invention furthermore comprises a kit for the detection and / or the assay of a nucleic acid according to the invention, in a biological sample, characterized in that it comprises the following elements: (i) a pair of primers nucleic acids according to the invention, (ii) the reagents necessary to carry out a DNA amplification reaction, and optionally (iii) a component making it possible to verify the sequence of the amplified fragment, more particularly a probe according to the invention.
  • the invention also includes a method for detecting and / or assaying nucleic acid according to the invention, in a biological sample, characterized in that it comprises the following steps: (i) bringing a probe into contact according to the invention with a biological sample; (ii) detecting and / or assaying the hybrid formed between said probe and the DNA of the biological sample.
  • the invention also includes a kit for the detection and / or the assay of nucleic acid according to the invention, in a biological sample, characterized in that it comprises the following elements: (i) a probe according to the invention, (ii) the reagents necessary for carrying out a hybridization reaction, and if appropriate, (iii) a pair of primers according to the invention, as well as the reagents necessary for an amplification reaction of the DNA.
  • the invention relates particularly to the methods according to the invention and described above, for the detection and diagnosis of cells of cancerous origin and mainly cancers of the breast, uterus, ovary, prostate and lung.
  • the polynucleotides according to the invention can thus be used as a primer and / or probe in methods using works in particular the PCR (polymerase chain reaction) technique (Erlich, 1989; Innis et al, 1990, and Rolfs et al, 1991).
  • This technique requires the choice of pairs of oligonucleotide primers framing the fragment which must be amplified.
  • the amplified fragments can be identified, for example after an electrophoresis in agarose or polyacrylamide gel, or after a chromatographic technique such as gel filtration or ion exchange chromatography.
  • the specificity of the amplification can be controlled by molecular hybridization using as probe the nucleotide sequences of polynucleotides of the invention, plasmids containing these sequences or their amplification products.
  • the amplified nucleotide fragments can be used as reagents in hybridization reactions in order to demonstrate the presence, in a biological sample, of a target nucleic acid of sequence complementary to that of said amplified nucleotide fragments.
  • the invention also relates to the nucleotide fragments capable of being obtained by amplification using primers according to the invention.
  • PCR-like will be understood to mean all the methods implementing direct or indirect reproductions of the nucleic acid sequences, or else in which the labeling systems have been amplified, these techniques are of course known, in general these are of amplification of DNA by a polymerase; when the original sample is an RNA, a reverse transcription should be carried out beforehand.
  • the target polynucleotide to be detected is an RNA, for example an mRNA
  • an enzyme of reverse transcriptase type in order to obtain a cDNA from the RNA contained in the biological sample.
  • the cDNA obtained will then serve as a target for the primers or probes used in the amplification or detection method according to the invention.
  • nucleotide probes according to the invention specifically hybridize with a DNA or RNA molecule of polynucleotide according to the invention, more particularly with the sequences SEQ ID N ° 1, SEQ ID N ° 3, SEQ ID N ° 5, SEQ ID No 7, SEQ ID No 9, SEQ ID No 11 and SEQ ID No 13, under high stringency hybridization conditions as given in the form of an example above.
  • the hybridization technique can be carried out in various ways (Matthews et al, 1988).
  • the most general method consists in immobilizing the nucleic acid extracted from cells of different tissues or cells in culture on a support (such as nitrocellulose, nylon, polystyrene) and incubating, under well defined conditions, the target nucleic acid immobilized with the probe. After hybridization, the excess probe is eliminated and the hybrid molecules formed are detected by the appropriate method (measurement of radioactivity, fluorescence or enzymatic activity linked to the probe).
  • the latter can be used as a capture probe.
  • a probe called a “capture probe”
  • a probe is immobilized on a support and is used to capture by specific hybridization the target nucleic acid obtained from the biological sample to be tested and the target nucleic acid is then detected.
  • a second probe called a “detection probe”, marked by an easily detectable element.
  • the invention comprises the use of a sense or antisense oligonucleotide to control the expression of the corresponding protein product.
  • a sense or antisense oligonucleotide to control the expression of the corresponding protein product.
  • the antisense oligonucleotides that is to say the structure of which ensures, by hybridization with the target sequence, an inhibition of the expression of the corresponding product.
  • sense oligonucleotides which, by interaction with proteins involved in the regulation of the expression of the corresponding product, will induce either an inhibition or an activation of this expression.
  • the oligonucleotides according to the invention have a minimum size of 9 bases, preferably 18 bases, and more preferably 36 bases.
  • the invention relates to a recombinant vector for cloning a polynucleotide according to the invention and / or for expressing a polypeptide according to the invention, characterized in that it contains a polynucleotide according to the invention as previously described.
  • the vector according to the invention is characterized in that it comprises the elements allowing the expression of said sequences in a host cell and optionally the secretion of said sequences out of the host cell.
  • expression vector is meant both expression vectors with autonomous replication of the plasmid type and systems intended to ensure integration into cells, but these expression vectors may also be expression vectors. of the viral type or even, when it is desired to carry out, for example, gene therapy, naked DNA.
  • viral vectors those derived from adenovirus, from virus associated with adenovirus (AAV), from retroviruses, from lentiviruses, and preferably derivatives from HIV, poxviruses, from herpesvirus are preferred. in eukaryotic system.
  • naked polynucleotides such as naked DNA or naked RNA are preferred according to the technique developed by the company VICAL, artificial yeast chromosomes (YAC, yeast artificial chromosome) for expression in yeast, mouse artificial chromosomes (MAC, mou se artificial chromosome) for expression in murine cells and preferably human artificial chromosomes (HAC, human artificial chromosome) for l expression in human cells.
  • the vector according to the invention comprises elements for controlling the expression of the polypeptides; these control elements are preferably chosen from (i) the promoter sequence of the hOBPIIa gene according to the invention which corresponds to the sequence SEQ ID No. 15 and / or from the promoter sequence of the hOBPIIb gene according to the invention which corresponds to the sequence SEQ ID No. 16; (ii) a polynucleotide whose sequence is complementary to the sequence SEQ ID No. 15 and SEQ ID No.
  • the invention furthermore comprises the host cells, in particular the eukaryotic and prokaryotic cells, characterized in that they are transformed by the vectors according to the invention.
  • the host cells are transformed under conditions allowing the expression of a recombinant polypeptide according to the invention.
  • the cell host can be chosen from bacterial cells but also from yeast cells, as well as from plant and animal cells; preferably, the cell host is a mammalian cell (Edwards and Aruffo, 1993), but also an insect cell in which methods using baculoviruses can be used, for example (Luckow, 1993).
  • These cells can be obtained by introducing into host cells a nucleotide sequence inserted into a vector as defined above, then culturing said cells under conditions allowing replication and / or expression of the transfected nucleotide sequence.
  • the invention also relates to an animal or a transgenic plant which comprises host cells according to the invention.
  • the invention also relates to a method for preparing a polypeptide characterized in that it implements a vector according to the invention. More particularly, the invention relates to a method for preparing a recombinant polypeptide characterized in that cells transformed according to the invention are cultivated under conditions allowing the expression of said recombinant polypeptide and that said recombinant polypeptide is recovered.
  • the polypeptide according to the invention is capable of being obtained according to a method of the invention and according to the techniques for producing recombinant polypeptides known to those skilled in the art.
  • the present invention therefore relates to the recombinant polypeptide capable of being obtained by the method presented above.
  • the nucleic acid sequence used is placed under the control of signals allowing its expression in a cellular host.
  • An efficient system for producing a recombinant polypeptide requires a vector, for example of plasmid or viral origin, and a compatible host cell.
  • the vector must include a promoter, translation initiation and termination signals, as well as appropriate regions for transcription regulation.
  • nucleic acid sequences according to the invention can be inserted into vectors with autonomous replication within the chosen host, or vectors integrative of the chosen host.
  • vectors will be prepared according to the methods commonly used by those skilled in the art, and the resulting clones can be introduced into an appropriate host by standard methods such as, for example, calcium phosphate precipitation transfection, lipofection, electroporation, thermal shock.
  • the recombinant polypeptides obtained as indicated above can either be in glycosylated form or non-glycosylated and may or may not have the natural tertiary structure.
  • the polypeptides obtained by chemical synthesis and which may contain unnatural amino acids corresponding to said recombinant polypeptides, are also included in the invention.
  • the peptides according to the invention can also be prepared by conventional techniques, in the field of peptide synthesis. This synthesis can be carried out in homogeneous solution or in solid phase.
  • the recombinant polypeptide purification methods used are known to those skilled in the art.
  • the recombinant polypeptide can be purified from cell lysates and extracts, from the culture medium supernatant, by methods used individually or in combination, such as fractionation, chromatography methods, immunoaffinity techniques using specific mono- or polyclonal antibodies, etc.
  • a preferred variant consists in producing a recombinant polypeptide fused to a “carrier” protein (chimeric protein).
  • carrier chimeric protein
  • the present invention relates to the use of a polypeptide chosen from a hOBPIIa and hOBPIIb polypeptide according to the invention or one of their fragment and from LCN1, “retinol binding protein” (RBP) and apolipoprotein D (ApoD) as binding protein to a hydrophobic ligand, preferably a molecule fragrant.
  • RBP retinol binding protein
  • ApoD apolipoprotein D
  • the present invention also relates to the use of a polypeptide according to the invention or one of its fragments, LCN1, RBP and apolipoprotein D as a competitive inhibitor, as an agonist or antagonist of cellular lipocalin receptors.
  • the use of inhibitor of binding of lipocalins to their receptor can be used in an anti-cancer strategy; in fact, a certain number of tumors are hormone-dependent: thus breast tumors are sensitive to steroids; these steroids being transported by lipocalins, it is within the scope of the invention to provide inhibitors of binding to the polypeptides according to the invention and LCN1, OBP or APO-D to avoid the binding of steroid hormones to the receptors of the tumor cells.
  • the invention also relates to a monoclonal or polyclonal antibody and its fragments, characterized in that they specifically bind a polypeptide according to the invention.
  • Chimeric antibodies, humanized antibodies and simple antibodies chain are also part of the invention.
  • the antibody fragments according to the invention are preferably Fab or F fragments (ab12.
  • the polypeptides according to the invention make it possible to prepare monoclonal or polyclonal antibodies.
  • the monoclonal antibodies can advantageously be prepared from Tibridomas according to the technique described by Kohler and Milstein in 1975.
  • the polyclonal antibodies can be prepared, for example by immunization of an animal, in particular a mouse, with a polypeptide according to the associated invention to an adjuvant of the immune response, then purification of the specific antibodies contained in the serum of the immunized animals on an affinity column on which has been previously fixed the polypeptide having served as antigen.
  • the polyclonal antibodies according to the invention can also be prepared by purification on an affinity column, on which a polypeptide according to the invention has previously been immobilized.
  • the invention also relates to a monoclonal antibody specific for a polypeptide according to the invention and capable of inhibiting the interaction between said polypeptide and the cellular receptor to which said polypeptide specifically binds.
  • the monoclonal antibody according to the invention is capable of inhibiting the interaction between said polypeptide and its hydrophobic ligands, preferably the odorous molecules and preferably the pheromones with which said polypeptide binds.
  • the antibodies of the invention may also be labeled in the same manner as described above for the nucleic probes of the invention and preferably with labeling of the enzymatic, fluorescent or radioactive type.
  • labeled antibodies can be used for the detection of these polypeptides in a biological sample.
  • the biological sample consists of a fluid, for example serum, blood or human biopsies. They thus constitute a means of analysis of the expression of the polypeptide according to the invention, for example by immunofluorescence, gold labeling, enzyme immunoconjugates.
  • the antibodies of the invention can be advantageously used in any situation where the expression of a polypeptide according to the invention must be observed, and more particularly in immunocytochemistry, in immunohistochemistry or in “western blotting” experiments. In ELISA and RIA techniques. It is thus within the scope of the invention to provide a method of detecting and / or assaying a polypeptide according to the invention, in a biological sample, characterized in that it comprises the following stages of contacting of the biological sample with antibodies according to the invention and then of detection of the antigen-antibody complex formed.
  • kits for the detection and / or the assay of a polypeptide according to the invention in a biological sample characterized in that it comprises the following elements: (i) a monoclonal antibody or polyclonal as described above; (ii) where appropriate, the reagents for constituting the medium suitable for the immunological reaction; (iii) reagents for the detection of antigen-antibody complexes produced by the immunological reaction.
  • This kit is particularly useful for carrying out Western Blotting experiments and for immunoprecipitation experiments.
  • the hOBPII according to the present invention can be used in numerous applications.
  • the first applications of OBP are in odor control; these applications mainly concern personal hygiene (perfumery, cosmetology, pharmacy) or collective hygiene.
  • Such a method can be used in a process to control the volatilization of an odor; such a method is characterized in that it comprises a step of binding said odor with a polypeptide according to the invention or with the proteins LCN1, RBP or apolipoprotein D.
  • the OBPIIs according to the present invention will be more particularly usable in the perfumery and cosmetic industry where the OBPIIs will be used in the form of a liquid mixture intended to control the volatilization of odors after the composition has been spread. on human skin. This makes it possible to prolong the "hold” of perfumes or to enter into the composition of body deodorants in particular.
  • the term “perfume” generally encompasses the mixtures known in perfumery, based on alcohol or in aqueous form, and containing in particular essential oils.
  • the polypeptide according to the invention can also be used in the composition of retinol-based creams as an agent for transporting and protecting said retinol for cosmetological applications and in particular for preventing, erasing and treating wrinkles, fine lines of the skin. , fight against sagging skin and / or subcutaneous.
  • the method according to the invention can be used in a device aimed at deodorizing premises such as, for example, pet stores, stables.
  • a device can also be envisaged for deodorizing the air flow entering a conditioned air device; such a device would be very useful in polluted geographic areas.
  • the invention also relates to a method for screening a molecule, preferably an odor or flavor, which comprises passing the molecule onto a substrate which comprises a polypeptide according to the invention or, LCN1, RBP and the apolipoprotein D linked to said substrate, said polypeptide binding said odor or flavor and recovering said odor or flavor from the polypeptide if necessary.
  • the OBPs according to the invention could thus allow the isolation of odors or perfumes by fixing them on a support as described above but which, in this case, could for example be a chromatography column, by passing over it. this is the product on which we wish to capture odors. It is of course possible, always in this same type of application, to carry out an analysis of a complex perfume by using the differences in retention of the different products by OBP.
  • the isolation process described above can also be used to separate particular "smells", especially human pheromones.
  • the hOBPII according to the present invention can be used for food or industrial applications.
  • the OBPs according to the present invention by virtue of their characteristics can make it possible to dissolve certain lipophilic molecules by associating them with said OBPs.
  • the polypeptides according to the invention can be used in combination with edible fatty acids as a food additive.
  • the present invention relates to a method for solubilizing lipophilic molecules characterized in that it comprises the binding of said lipophilic molecule to a polypeptide according to the invention, to LCN1, RBP or to apoD.
  • OBPII, as well as LCN1, RBP and ApoD are likely to be involved in the transport of fatty acids and in the biological mechanisms allowing the detection of the fatty acid load of the food ration, particularly at the oral level.
  • the invention therefore also relates to the use of the above polypeptides in combination with fatty acids to reduce the consumption of fatty acids, in particular in hyperlipidemia or obesity.
  • the above polypeptides can therefore be used for the treatment of hyperlipidaemia and obesity.
  • these proteins participate in the detection of the fatty acid content in food intake (Gilbertson, 1998), an excess of these proteins must lead to deceive the physiological system detecting the fat load of a food ration.
  • a food portion low in fat but supplemented with OBP or ApoD or RBP or LCN1 beforehand loaded with fatty acid will be falsely identified as high in fat.
  • Another application is to supplement non-breast milk with one or more of the polypeptides described above.
  • the OBPs according to the present invention can be used in preventive and curative therapy.
  • the absence of detection of this type of protein in a biological sample using an antibody, a primer, a probe according to the invention could be an element in the diagnosis of anosmias.
  • the invention therefore relates to a method for detecting antibodies directed against human OBPII (hOBPII) in the human serum of an allergic and / or asthmatic patient using a hOBPII polypeptide according to the invention.
  • the invention relates to a method for detecting antibodies directed against human OBPII (hOBPII) in a biological fluid of a patient suffering from cancer, and in particular prostate cancer and / or cancer breast and / or uterine and / or ovarian and / or lung cancer.
  • hOBPII human OBPII
  • the proteins according to the invention are over-expressed in tumors and in particular in prostate cancer (US 5804368, WO 97 10503, CS 84 02898, CS 83 02012, CS 82 08506, CS 82 08215), breast cancer (Stoecz and Gould, 1995; Simard et al, 1992), uterine cancer, ovarian cancer , lung cancer.
  • OBPs according to the present invention can also be used in pharmaceutical compositions, this in particular in order to vectorize certain drugs.
  • lipocalins are used by mammals to transport hydrophobic molecules within biological fluids. It even seems to be the natural transporters of xenobiotics in vivo.
  • an experimental overload of xenobiotics creates tumors in the male proximal convoluted tube (TCP) in the male rat (Borghoff et al., 1990).
  • TCP male proximal convoluted tube
  • the MUP proteins only produced in the male rat, are reabsorbed by the TCP cells; after lysosomal degradation, the MUP proteins release the xenobiotics which they transported. These accumulate in these cells and lead them to a tumor pathway by mutagenesis.
  • Lipocalins therefore seem to be the ideal structure for trapping a molecule used as a medicament in their calyx, thus avoiding a general distribution thereof.
  • G. Beste and ⁇ /. (1999) and application WO 99 16873 describe a mutagenesis and screening strategy making it possible to identify variants of a lipocalin having an optimal affinity for a given ligand. It is therefore possible to create a highly specific "medicine cage”.
  • the present invention therefore relates to a polypeptide according to the invention as a targeting agent for a pharmaceutical compound.
  • targeting agent is meant the polypeptides of the invention capable of ensuring the transport and release of the ligand to which they are linked at the level of certain target tissues or cells which have receptors for said polypeptides on their surface.
  • the invention relates to the transport of medicament within the cage of a polypeptide according to the invention and the targeting of cells thanks to the ability of OBPII to bind to a specific receptor.
  • the present invention therefore relates to a polypeptide characterized in that said polypeptide is expressed in the form of a fusion protein with a protein allowing specific cell addressing.
  • proteins allowing specific cell addressing mention should be made of interleukins, cytokines, lymphokines, chemokines, growth factors, hormones, mono- or polyclonal antibodies.
  • the interleukins, cytokines and lymphokines are chosen from a group preferably composed of interleukins II-1 to 11-20, interferons ⁇ -IFN, ⁇ -IFN and ⁇ -IFN.
  • the growth factors are preferably colony stimulating factors G-CSF, GM-CSF, M-CSF and erythropoietin.
  • the hormones are preferably chosen from steroid hormones.
  • the polypeptide according to the invention as a targeting agent for a pharmaceutical compound is associated with a molecule allowing specific cell addressing.
  • a molecule allowing specific cell addressing.
  • the molecules allowing specific cell addressing mention should be made of the group of steroids, interleukins, cytokines, lymphokines, interferons, growth factors, hormones, antibodies.
  • the molecule is a steroid.
  • the association between the polypeptide according to the invention and said molecule is carried out either by a non-covalent bond using for example the avidin-biotin system or by a covalent bond by using for example bridging chemical agents.
  • Anti-cancer agents are selected from the group of antiproliferative, antineoplastic or cytotoxic agents and are used to stop the development of cancers and to induce regression and / or elimination of the tumor mass. These anticancer agents are preferably radioisotopes, and more preferably gamma ray radioisotopes such as Iodine 131 , Yttrium 90 , Gold 199 , Palladium 100 , Copper 67 , Bismuth 217 and l 'Antimony 211 . Beta and alpha emitters can also be used for therapy.
  • the non-isotopic anticancer agents linked to the polypeptide according to the invention are multiple and varied; we can cite: (i) antimetabolites such as anti-folate agents, methotrexate, (ii) analogs of purines and pyrimidines (mercaptopurine, fluorouracil, 5-azacytidine), (iii) antibiotics, (iv) lectins (ricin, abrin) and (iv) bacterial toxins (diphtheria toxin); the toxins are preferably chosen from exotoxin A from Pseudomonas, diphtheria toxin, cholera toxin, anthrox toxin from Bacillus, pertussis toxin, Shiga toxin from Shigella, toxin related to Shiga toxin, toxins from Escherichia coli, colicin A, d-endotoxin, Haemophilus A hemagglutinin
  • the invention also relates
  • the invention relates to a pharmaceutical composition as defined above for the treatment of cancer, and in particular prostate cancer, breast cancer, uterine cancer, ovarian cancer, liver cancer and lung epithelial cell carcinoma. Since the OBP called hOBPIIb, apolipoprotein D, RBP and ⁇ -1-glycoprotein acid are expressed in the prostate, the pharmaceutical composition according to the invention is intended for the treatment of prostate cancer.
  • the pharmaceutical composition according to The invention is intended for the treatment of breast cancer.
  • the invention also relates to a polypeptide according to the invention as a carrier for a pharmaceutical compound.
  • transporter is intended to denote polypeptides according to the invention capable of transporting a pharmaceutical compound into the body without said compound being released in a privileged place in the body.
  • Such a polypeptide constitutes a means of delivering said pharmaceutical compound into the body.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition according to the invention characterized in that said polypeptide constitutes a delayed form of delivery of said pharmaceutical compound in the body.
  • said pharmaceutical compound of interest linked to the OBPII polypeptide according to the invention gradually diffuses into the body as said transporter polypeptide is catabolized in the body.
  • the use of recombinant DNA techniques allows those skilled in the art to modify the half-life of the OBPII polypeptide in the body by introducing modifications into said polypeptide.
  • the invention relates to a compound characterized in that it is chosen from an antibody, a polypeptide, a ligand, a polynucleotide, an oligonucleotide or a vector according to the invention as a medicament and in particular as active drug ingredients; these compounds will preferably be in soluble form, associated with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • pharmaceutically acceptable vehicle means any type of vehicle usually used in the preparation of injectable compositions, that is to say a diluent, a suspending agent such as an isotonic or buffered saline solution.
  • these compounds will be administered by the systemic route, in particular by the intravenous route, by the intramuscular, intradermal route or by the oral route.
  • Their optimal modes of administration, dosages and dosage forms can be determined according to the criteria generally taken into account in the establishment of a treatment adapted to a patient such as for example the age or the body weight of the patient, the seriousness of his general condition, the tolerance to the treatment and the observed side effects, etc.
  • the invention also relates to a pharmaceutical composition comprising an expression vector according to the invention and a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • the present invention presents various therapeutic applications intended to treat pathologies of gestation in women.
  • one of the objects of the present invention is to use the polypeptide according to the invention for the preparation of a medicament intended for the transport of compounds across the placental barrier.
  • These compounds are preferably lipophilic molecules.
  • the polypeptide according to the invention can be used to carry out the transport of compounds from the pregnant mother to the fetus; the compounds which can be chosen from molecules of therapeutic interest, preferably lipophilic, essential fatty acids, hormones, vitamins, and more generally, small lipophilic molecules.
  • the cells of the placental villi massively secrete polypeptides according to the invention in particular OBPII.
  • these polypeptides then spread through the fetal blood and into the general bloodstream of the fetus.
  • the polypeptide according to the invention can be used to transport the compound from the fetus to the pregnant mother.
  • the fetus secretes at the level of the villi of the nasal structures of the polypeptides according to the invention which participate in the exchange of molecules between the fetus and the mother at the level of the amniotic membrane.
  • the polypeptide according to the invention can be used as a pregnancy marker.
  • the polypeptide according to the invention is present in different biological fluids of the mother such as urine, blood; measuring its concentration and / or presence is an indicator of pregnancy.
  • this marker can be used, with, or in place of, or in addition to the pregnancy marker that is human choriogonadotropin hCG; the polypeptide according to the invention and hCG are indeed molecules which are secreted by the placental trophoblastic cells.
  • the polypeptide can be used as a marker for feto-placental pathologies. It can be a marker for the rupture of the water pocket membrane.
  • FIGURE 1 Genomic organization of the LCNl / hOBPII locus
  • the top line represents the region of chromosome 9q34.
  • the double arrow indicates the interval between the location of the polymorphic markers D9S1811 and D9S67; the relative position of the markers D9S67 and D9S1826 is uncertain.
  • the level of the medium indicates the partial organization of the cosmids at 3 different loci: LCN lc, LCNlb-hOBP ⁇ b, LCNl-hOBPiia.
  • the cosmids (approximately 40 kb) are represented by horizontal lines with their name and the arms of the vectors T3 or T7 noted below the line.
  • the arrows represent the different genes or pseudogenes with their respective orientation.
  • the vertical dotted lines represent the EcoRI sites.
  • the symbol ® indicates an uncertain orientation of the locus.
  • the lower level shows the intron / exon structures of the LCN 1 and hOPBII genes: the black boxes represent the exons; the arrows represent the site of initiation of transcription; oll to ol5 represent the oligonucleotide probes used to screen the cosmids; Alu represents the presence of repeated sequences.
  • FIGURE 2 Dot Plot analysis of:
  • FIGURE 3 Nucleotide sequence of hOBPII genes.
  • the upper lines represent the sequence hOBPIIa and the lower lines the sequence hOBPIIb for which only the different nucleotides are represented; a dash indicates the absence of corresponding sequences.
  • the shaded capitals are the exonic sequences and the lower case letters are the intronic sequences.
  • the sizes indicated on the left are indicated in pb.
  • the TATA box is in bold type and the polyadenylation signal is underlined.
  • the boxes indicate the splice acceptor sites for exons 5, 5b, 5c.
  • FIGURE 4 Schematic representation of the two hOBPII genes and their corresponding mRNA.
  • the horizontal lines represent the exon / intron organization with sizes indicated in bp.
  • the shaded boxes numbered from 1 to 7 are the coding exonic sequences of the main transcripts; the letters b and c refer to supernumerary exons.
  • the different transcripts are represented using assembled boxes: the first, hOBPIIa ⁇ and hOBPIIb ⁇ correspond to the main transcripts, the others correspond to the forms resulting from an alternative splicing, j indicates a shift in the reading frame resulting from the insertion or of the deletion of an exon and * represents a stop codon.
  • the letter "a” represents a ⁇ and “b” helix of ⁇ sheets predicted by DSC software. Letters in italics are predictions obtained with the "Predator" software.
  • OBP2aaHOMS OBP2aaHOMS
  • hOBPIIb ⁇ OPB2baHOMSA
  • hOBPIIb ⁇ OPB2bbHOMSA
  • the residues in the dark gray boxes are identical and those in the light gray boxes are similar.
  • the secondary structural elements predicted with the DSC program are underlined and the amino acid residues are in italics.
  • the ⁇ sheets and the ⁇ propellers are numbered for hOPBIIa and b.
  • the expected signal peptide cleavage site is indicated by an arrow (AAA -LS) at position 15.
  • Unaligned sequences of widely divergent forms of spliced genes, hOPBa ⁇ (OPB2adHOMSA) and hOBPb ⁇ (OBP2bgHOMSA) have been added at the bottom of the alignment after analysis.
  • FIGURE 6 RT-PCR analysis
  • FIGURE 7 Tissue localization of hOBP mRNAs
  • Sections of the middle meatus (A, B), cornets (C, D), prostate (E, F), vas deferens (G, H), mammary glands (I, J) were hybridized to digoxigenin-1 1-UTP labeled hOBP riboprobes.
  • Hybridization with a sense hOBP riboprobe revealed no signal (B, D, F, H, J).
  • a specific hybridization signal is obtained with an antisense riboprobe (A, C, E, G, I).
  • the arrows indicate different structures: AC: acinar cells, EC: epithelial cells, GC: glandular cells, SD: secretory canal and L: lumen (X200).
  • FIGURE 8 Phylogenetic distance tree of vertebrate lipocalins.
  • FIGURE 9 Diagram of the evolution of the LCN1 -OBPII gene subfamily during evolution.
  • the boxes indicate the exons arranged on a line representing genomic DNA.
  • the “//” between the lines indicate that the loci are not consecutive, without it being possible to determine the order.
  • the large cross under the symbol “?” "Illustrates a partial duplication or complete duplication event with a subsequent genomic deletion for the LCN lc locus (choice indicated by the symbol” * ").
  • the smaller cross indicates the elimination of the seventh exon which appears to be specific to humans due to the many Alu repeat sequences present in this genomic region and because the rat has two VEGP genes.
  • the symbol “**” marks the exon recruitment stage based on the present data and that of the literature; this step could appear at any time after the duplication of the loci and could be sequential.
  • FIGURE 10 Analysis by RT-PCR in the oral and genital spheres of the expression of other known human lipocalins.
  • RBP retinol-binding-protein
  • ApoD apoliporotein D
  • FIGURE 11 Study of the polyclonal antibody directed against the hOBPII proteins.
  • the fusion protein is deposited in wells 1 and 3.
  • a sample of human nasal mucus is deposited in wells 2 and 4.
  • the proteins contained in wells 1 and 2 were revealed by staining with Coomassie blue.
  • the hybrid antibody on the membrane obtained by Western blotting specifically reveals the GST-hOBPIIb protein between 30 and 42 kDa (well 3) and the 18 kDa hOBPIIa and hOBPIIb (well 4) in human nasal mucus.
  • FIGURE 12 Immunohistochemistry on the tissues of the olfactory apparatus.
  • FIGURE 13 immunohistochemistry on tissues of the oral sphere These two tissues, lacrimal glands (A, B) and Von glands
  • Ebner (E, F) show a strong immunoreactivity in comparison with the results obtained thanks to the pre-immune serum (C for the lacrimal glands and D for the Von Ebner glands).
  • C for the lacrimal glands
  • D for the Von Ebner glands.
  • FIGURE 14 Immunohistochemistry on the mammary glands and lung
  • a strong immunoreactivity is visible on the sections of mammary glands (A and B) compared to the negative control (C) produced using the pre-immune serum.
  • a strong immunoreactivity is also observed on the lung sections (E and F) compared always to the negative control (D). each observation is made at X 100 magnification for A and C and at X 200 magnification for B, D, E and F.
  • Figure 15 Demonstration of hOBPII proteins in different nasal structures: Cornet (A: 200x, B: 400x), Septum (C: 300x, D 600x), Medium meatus (E: 400x, F: 600x): Detection of proteins hOBPII with a polyclonal rabbit serum revealed by a peroxidasic activity detected by DAB. AC: acinar secretory cell, P: precipitate of DAB (hOBPII detection)
  • Figure 16 Demonstration of the LCN1 protein in different nasal structures: Cornet (A: 200x, B: 500x), Septum (C: 100x, D 500x), Medium meatus (E: 200x, F: 600x):
  • FIG. 17 Demonstration of the ApoD protein in different nasal structures: Cornet (A: 500x, B: 700x), Septum (C: 300x), Medium meatus (D: 400x):
  • Figure 18 Demonstration of the hOBPII protein in different structures of the oral sphere: Lacrimal gland (A: 200x, B: 600x), Von Ebner glands (C: 100x, D: 400), Lung (E: 200x, 800x): Detection of the hOBPII protein with a polyclonal rabbit serum revealed by a peroxidasic activity detected by DAB.
  • AC acinar secretory cell
  • P precipitate of DAB (hOBPII detection).
  • Figure 19 Demonstration of hOBPII proteins in different placental structures: chorionic villi (A: 300x, B: 800x), Amniotic membrane (C: 800x), Cord (D: 600x):
  • hOBPII proteins Detection of hOBPII proteins with a polyclonal rabbit serum revealed by peroxidase activity detected by DAB.
  • L gap (contains maternal blood)
  • C fetal capillary
  • Am amniotic membrane
  • E epithelial cells derived from extraembryonic ectoblast
  • MB basement membrane
  • M mesenchymal layer
  • P DAB precipitate (hOBPII detection)
  • Figure 20 Demonstration of the LCN1 protein in different placental structures: chorionic villi (A: 200x, B: 800x), Amniotic membrane (C: 600x), Cord (D: 500x): Detection of the LCNl protein with a serum polyclonal rabbit revealed by peroxidasic activity detected by DAB.
  • L gap (contains maternal blood), C: fetal capillary, Am: amniotic membrane, E: epithelial cells derived from extraembryonic ectoblast, MB: basement membrane, M: mesenchymal layer, P: precipitate of DAB (LCN detection l)
  • Figure 21 Demonstration of the ApoD protein in different placental structures: chorionic villi (A: 100x, B: 500x), Amniotic membrane (C: 400x), Cord (D: 400x):
  • a Lambda gtl l library of human testis cDNA (Clontech) (10 7 pfu) was amplified by 30 cycles of chain polymerization (PCR) (94 ° C 45 sec, 54 ° C 45 sec, 72 ° C lmin 30 sec) with the primer oliEST58 CCTGCAGGTACATGAGCTTCC and 5 'or 3' amplimers for screening inserts located on the arms of the Lambda gt 1 1 vectors.
  • a nested PCR was then carried out with oliEST26 CGCTGTATTTGCCAGGCTCC and specific oligonucleotides of the vector arm .
  • the PCR products were subcloned into the vector pGEM-T (r), which made it possible to obtain the 5 ′ end of the cDNAs of the hOBPII gene.
  • RNA samples were collected from Caucasian individuals between the ages of 45 and 55 in accordance with current French regulations.
  • Total RNA is extracted using a one-step method using the NOW ® RNA reagent according to the manufacturer's instructions (Biogentex). 5 ⁇ g of total RNA were back transcribed into a final volume of 20 ⁇ l using 0.5 ng of oligonucleotide
  • the primers G3PDH 1: CTCTGCCCCCTCTGCTGATG and G3PDH2: CCTGCTTCACCACCTTCTTG of the G3PDH gene were used; the G3PDH gene is considered to be constitutively expressed in all cell types.
  • 32 PCR cycles (94 ° C 45 sec, 54 ° C 45 sec, 72 ° C 2 min. 30 sec.) Were carried out and the amplification products were separated on 1% agarose gel. The DNA is transferred to a Hybond N + @ membrane.
  • oligonucleotides specific for the respective genes have been synthesized: - olLCNl: GACTCAGACTCCGGAGATGA,
  • - ol4 CCGGGACGGACGACTACG specific for the hOBPIIa gene
  • - G3PDH3 CTCATGACCACAGTCCATGC
  • the oligonucleotides are labeled with ⁇ 32 P-ATP using T4 kinase (Applied Biosystem); the hybridizations of the labeled oligonucleotides are carried out at 42 ° C. The final washing is carried out in a solution of 0.1 X SSC, 0.1% SDS at 48 ° C for 20 min. The specificity of the oligonucleotide hybridization reactions is checked using digested cosmid DNA samples (p233G2 for LCN1 and hOBPIIa, P19E7 for LCN lb and hOBPIIb, P181A9 for LCN lc) and loaded onto the gel with RT- products. PCR.
  • Genotyping is carried out by PCR reactions using 100 ng of genomic DNA from 8 CEPH reference families and using oli9 oligonucleotides TGTTCGGGAACGCAGCTT and olilObis
  • the parameters of the thermal cycler consist of an initial cycle at 94 ° C for 10 min followed by 30 cycles at 94 ° C for 30 s, 55 ° C for 30 s and 70 ° C for 45 s and then a final elongation step of 10 min at 70 ° G.
  • the PCR products are then analyzed on a 3% agarose gel.
  • Information on the markers of chromosome 9 can be obtained at the following Internet address (hTTP://galton.ucl.ac.uk); the analyzes were carried out using the link study tools previously described in Lacazette et al. ( 1997).
  • the haplotypes are reconstructed manually according to the recombination events previously described in the 1362 family (Attwood et al., 1994).
  • the lipocalin proteins whose sequences are known in their entirety were aligned three times consecutively using the Clustalx software (ftp://ftp.inforbiogen.fr). Distances in the phylogenetic tree were calculated with Clustalx and drawn with Njplot.
  • RNA probes are obtained according to standard techniques using T7 or SP6 polymerase from a matrix obtained by digestion with Ncol or PstI restriction enzymes from the cDNA clone of phOBPIIaP2 and using DIG-1 1-UTP (Boehringer Mannheim) (the length of the probe is approximately 150 nucleotides ).
  • RNA polymerase SP6 The matrices digested by PstI and transcribed by T7 RNA polymerase correspond to the antisense probe and the matrices digested by Ncol transcribed by RNA polymerase SP6 correspond to the sense probe.
  • Tissue sections are fixed in 4% paraformaldehyde for 15 min and then rinsed for 5 min in 2X PBS. After acetylation (2 x 5 min in a triethanolamine buffer (TEA) pH 8, containing 0.25% v / v acetic anhydride), the tissue sections are prehybridized at 60 ° C for 15 min in 50% formamide / IX SSC.
  • TAA triethanolamine buffer
  • the labeled probes are applied to each of the sections in 50 ⁇ l of hybridization buffer (50% formamide, IX Denhardt's, 500 ⁇ g / ml total of tRNA, 10% of Dextran sulfate, 10 mM of dithiotreitol).
  • hybridization buffer 50% formamide, IX Denhardt's, 500 ⁇ g / ml total of tRNA, 10% of Dextran sulfate, 10 mM of dithiotreitol.
  • the sections are covered and then incubated in humid rooms at 50 ° C. overnight. After hybridization, the slides are immersed at 55 ° C in a washing buffer (50% formamide, IX SSC) for 2 hours.
  • Each slide is then rinsed 2 times 5 min in 2X SSC at room temperature, then treated for 30 min with 10 mg / ml of RNase at 37 ° C, and finally immersed for 2 hours at 55 ° C in a washing solution (50 % formamide, 2X SSC).
  • the slides are then placed for 15 min at 55 ° C. in 0.1 X SSC.
  • Immunological detection is carried out using an anti-DIG antibody conjugated to alkaline phosphatase (Fab fragments) according to the protocol of Boehringer Mannheim.
  • the sections are examined at different magnifications using an Axiophot microscope (Zeiss).
  • fusion proteins Two hundred and fifty ⁇ l of fusion proteins were supplied to the company Agro-Bio for the production of antibodies. Rabbits (New Zealand White SPF) are injected on days 0, 14, 28 and 42. The sera are taken on days 0, 35, 49 and 63. In order to test the antibody, the fusion protein is deposited in the tracks 1 and 3 ( Figure 11), while human nasal mucus is deposited in tracks 2 and 4. Lanes 1 and 2 as well as the track corresponding to the molecular weight scale, correspond to a revelation by Coomassie blue . Lanes 3 and 4 correspond to a detection of proteins recognized by the antibody using the Western blot technique.
  • Lanes 1 and 3 show the presence of a series of truncated recombinant proteins between 30 and 42 kDa resulting from an ineffective synthesis due to the presence of many rare codons in the bacteria within the hOBPIIb sequence. However this production of recombinant protein was sufficient to produce a good quality polyclonal antibody as indicated by the revelation in lane 4 corresponding to the nasal mucus, of an 18 kDa band specific for hOBPn proteins.
  • a DAPI solution (100 ng / ⁇ l in PBSxl) is applied for 10 min (against staining of the cell nuclei in blue).
  • the slides are mounted in glycerol water (50/50). The analysis is carried out in the presence of DAPI and FITC filters using a CDD camera using an integration time between 4 and 32 ms.
  • the tissues are frozen at -80 ° C. in the presence of OCT. Serial sections of 7 micrometers are made using a microtome. The tissues are then fixed with 4% Para-formaldehyde in PBS. The slides are incubated for 10 min in a methanol solution in the presence of 4.5% of H 2 O 2, then rinsed three times in PBS for 5 min After an incubation for 30 min in a solution of 3% of bovine serum albumin , the first antibody (diluted 1/350) is incubated overnight at room temperature (Rabbit polyclonal antibodies for hOBPII and LCN1, and mouse monoclonal for ApoD).
  • the second antibody (diluted to 1/300) (anti-rabbit for hOBPII and LCN 1, and anti-mouse for ApoD) is incubated for 3 h at room temperature.
  • a revelation with peroxidase by DAB is carried out for 2 to 10 min, using the “Vector” kit.
  • the slides are then rinsed with water, and counter-stained with Mayer's serum for 2 min.
  • the slides are dehydrated by successive drenching in ethanol solutions 70 °, 95 °, 100 °, 100 °, and finally two baths of toluene.
  • the slides are then mounted in Canada balsam, and observed using a Zeiss microscope.
  • EXAMPLE 2 IDENTIFICATION OF A GENE APPROVED WITH LCN1 LOCALIZED ON HUMAN CHROMOSOME 9
  • a library of cosmids specific for human chromosome 9 (LL09NP01) was screened with the human LCN1 cDNA probe; 26 cosmids have been identified; these were digested with EcoRI or PvuII, then hybridized successively with the DNA of
  • the cosmids are divided into 3 groups.
  • the first group (clones P32H3, P41B5, P63B6, P92H20, P109C6, P145H6, P195B4, P233G2, P233F2, P265D4, and P276H8) correspond to cosmids containing a sequence of the LCNl gene previously isolated (accession number: L 14927) formed by 7 exons (Holzfeind and Redl, 1994).
  • the second group corresponds to the homologous sequence LCNlb LCNl (clone P19E4) (accession number: Y-10826) from the promoter to the 6 th exon and then diverging.
  • a third group of cosmids contains an LCNlc region, established from the partial sequencing of clone P181A9 (accession number Y 10827), which is highly homogeneous to LCNl only from the promoter to exon 2.
  • the LCN is the only gene that has the 7 th and last exon.
  • the TATA boxes are degenerate in the promoters of the LCN lb and LCNlc genes
  • LCN revealed that the sequence LCNlc corresponded to the clone having the accession number AC002106, LCNlb with number AC002098 and LCNl with number AC000396; however, there is an insertion of 60 base pairs at position 12360 of the clone having the accession number AC000396 relative to that having the number L14927. Further analyzes revealed that these sequences are homologous over a much wider region than the LCN 1 genes.
  • P203H 12 may correspond to a 4 th duplicated region
  • the area has been tested by PCR on genomic DNA of 150 unrelated individuals using specific primers for AC000396 and L14927.
  • a single band corresponding to the length of the sequence AC000396 was detected (data not shown) thus proving that P203H 12 contains the LCN1 gene previously described.
  • the LCN lb locus has not been positioned precisely in the region as it is demonstrated by the fact that the ends AC002098 as well as the ends of the cosmids containing LCNlb do not detect any homologous sequence in the databases.
  • the comparison of AC002098 to the database revealed similarities between this sequence and the lipocalin genes.
  • the region around the position of 2150 contains sequences having similarities with the sequences coding for the binding proteins to rat odor type II, lipocalins of tears as well than for EST AA460385.
  • the comparison of the sequence AC000396 to the database revealed, in addition to the region 1 1 100 to 17 100 containing the LCN 1 gene, similarities for the same group of sequences in the region 36 600 to 37 800.
  • EST AA460385 expressed in human testes corresponds to 4 exons of the new lipocalin gene present in the clone P161A1 (AC002098).
  • a putative 50 base pair exon similar to the EST sequence is also present at the end of clone P203H12 (AC000396).
  • the inventors therefore concluded that a new lipocalin gene exists at a position distal to LCN lb.
  • the inventors have hypothesized that, following genomic duplication, a second gene orthologous to the gene coding for EST is present in the 3 'region of LCN1.
  • hOBPIIa corresponding to the gene located downstream from LCNl and hOBPIIb located downstream from LCNlb ( Figures 3 and 4), are 97.5% and 63% identical to those corresponding to the LCN1 gene.
  • the intron / exon organizations of these two genes are consistent with the lipocalin family.
  • the prediction of the secondary structures of the hOBPIIa and hOBPIIb proteins with the DSC software by performing multiple alignments with the lipocalin sequences of known structures indicates the presence of 8 strands of antiparallel ⁇ sheets which can allow the formation of a calyx followed by an ⁇ helix. and a final ⁇ sheet in accordance with the known data of the structures of lipocalins (FIG. 5).
  • the hOBPIIa and hOBPIIb genes are expressed, which confirms their previous detection in cDNA libraries.
  • the two proteins hOBPIIa and hOBPIIb are very similar over their entire sequence including in the 1.5 kb promoter region, their expression profile are different ( Figure 6B).
  • the hOBPIIa protein is strongly expressed in the nasal septum, the middle meatus, the nasal horn, the testes and the placenta and more weakly in the mammary glands, the lacrimal glands, the sweat glands, the von Ebner glands and the lung.
  • the hOBPIIb protein is expressed predominantly in the prostate, testes and mammary glands and more weakly in the submandibular glands, the nasal septum and the middle meatus.
  • RT-PCR analyzes revealed the existence of an alternative splicing of the gene transcript hOBPIIa and the hOBPIIb gene which generates four and three mRNAs respectively ( Figures 3, 4, 5 and 6).
  • Transcription of the hOBPIIa gene generates at least four mRNAs which code for four different proteins; the first mRNA codes for the hOBPIIa ⁇ protein which corresponds to the hOBPIIa protein described above.
  • the first mRNA codes for the hOBPIIa ⁇ protein which corresponds to the hOBPIIa protein described above.
  • three different splice acceptor sites have been identified for exon 5 (FIGS. 3 and 4), thus forming two other splice variants.
  • a first splicing variant presents an acceptor site for exon 5 located 49 bp before the previous one (exon 5b); this generates an mRNA of 725 nucleotides which codes for the hOBPIIa ⁇ protein of 146 amino acids.
  • This protein is identical to the 8 th putative ⁇ sheet and then different with only 16 additional amino acids.
  • a second splicing variant has an acceptor site for exon 5 located 65 bp before the previous one (exon 5c); this generates an mRNA of 741 nucleotides which codes for a hOBPIIa ⁇ protein of 228 amino acids.
  • This protein has the first eight putative ⁇ sheets identical to those of hOBPIIa ⁇ then is different in the C-terminal region ( Figure 5) because of a reading frame shift generated by this alternative splicing event; the structure of this C-terminal region predicted by Predator software is a long bent region containing a 9 th ⁇ sheet.
  • hOBPIIb In the case of the hOBPIIb gene, in addition to the hOBPIIb ⁇ mRNA previously described, a supernumerary exon of 106 bp (exon 3b) between the previous exons 3 and 4 has been identified (FIG. 3). This longer mRNA (782 nucleotides) codes for a hOBPIIb ⁇ protein of 165 amino acids. From the viewpoint of the protein structure, hOBPIIb ⁇ is identical to hOBPIIb ⁇ to the 5th sheet putative ⁇ and then differs due to a shift in the reading frame. Computer software predictions indicate that the ALWEALAIDTRLK pattern is an ⁇ helix which is just behind the fifth ⁇ sheet. Two additional ⁇ sheets may be present in the long C-terminal part.
  • MRNAs coding for hOBPIIa ⁇ and hOBPIIb ⁇ which lack the coding sequence for exon 2 and which have exon 5b and exon 5 respectively encode putative secreted proteins of 147 and 85 amino acids respectively ( Figures 4 and 5); these proteins diverge from the previous proteins from the 24 th amino acid.
  • the inventors hybridized sense and antisense ribonucleic probes labeled with digoxygenin on tissue sections (FIG. 7).
  • HOBPII mRNAs are detected in the acinar cells of the middle meatus and the nasal horns as well as the epithelial cells of the horns; this supports the idea that hOBPII proteins are involved in olfactory function.
  • mRNAs encoding hOBPII have been detected in the genital sphere, in particular in the glandular cells of the prostate, in the secretory epithelial cells. of the vas deferens. No signal was detected in the male gonads, which suggests that the expression of the hOBPII genes demonstrated in the RT-PCR experiments corresponded to the presence of additional channels in the tissue preparation (rete testis and efferent channels). .
  • hOBPIIa ⁇ , hOBPIIa ⁇ , hOBPIIa ⁇ , hOBPIIb ⁇ , hOBPIIb ⁇ five hOBPII proteins
  • hOBPIIa ⁇ , hOBPIIa ⁇ , hOBPIIa ⁇ , hOBPIIb ⁇ , hOBPIIb ⁇ five hOBPII proteins
  • hOBPIIb ⁇ and hOBPIIb ⁇ are secreted by the epithelio-glandular cells of the prostate and mammary glands.
  • the inventors have identified nine main groups of lipocalins derived from a common precursor: the family of apolipoprotein and of retinol binding protein (RBP) (group 1); the prostaglandin D-synthase group and the lipocalin precursor associated with the gelatinase of neutrophils (group 1);
  • alpha-1-microglobulin / bikunin (HC protein) subfamily group 3
  • the orosomucoid subfamily A1AG, Al AH, Al AI
  • group 4 the oral sphere subfamily 1 (OBPII-type-
  • LCN1 / VEGP, VNSP I and II, LALP, CanFl) group 5
  • the lactoglobulin subfamily group 6
  • - the subfamily of proteins secreted by the lizard epididymis group 7
  • the subfamily oral sphere 2 major urinary protein (MUP) of mice
  • group 8 the oral sphere 3 subfamily (OBP1, mouse OBPII, Aphrodisine, Probasine, BD20) (group 9).
  • the present invention relates more particularly to groups 5, 8 and 9.
  • Group 5 contains the hOBPII proteins which are evolutionarily closely linked to rat OBPII. Taken together, the present results indicate that the human hOBPII genes are orthologous to the rat OBPII gene. This group also contains LCN 1-VEGP proteins of different species.
  • the tree data illustrate the duplication event (arrow) which gives rise to the ancestral hOBPII and LCN l genes from their common lipocalin precursor ( Figure 9) . More recently, the original duplications of the 50 kb region containing hOBPII-LCNl (arrow) have generated in humans the two genes hOBPII and the gene LCN 1 and its pseudogen LCNlb.
  • the additional duplication which gave rise to the pseudogen LCN lc is partial in the human genome and does not produce a functional protein and is therefore absent from the present tree.
  • the two rat VEG proteins are more closely linked to each other in the phylogenetic tree than with the human protein LCN 1.
  • the situation is identical for the two human OBPII proteins compared to the rat OBPII protein.
  • Group 9 corresponds to the oral sphere family 3 and contains OBPs which have already been described.
  • the Aphrodisine protein has already been described as a pheromone transporter (Henzel et al, 1988) and appears to be orthologous to the rat and mouse OBP1 protein, with two paralogous OBP1 genes.
  • the olfactory lipocalins produced by the Bowman glands of rana pipens (OLFA RANPI) which are considered to be potential odor transporters in the frog's mucus, are not linked to any group of putative OBPs (groups 5, 8 and 9) thus suggesting the existence of other categories of OBP.
  • the present invention has revealed the existence of a genomic duplication at locus q34 of human chromosome 9 which harbors a family of genes of the LCN1 type; this family comprises, in addition to the LCN 1 gene, described above, two pseudogenes as well as two hOBPII genes which are paralogs to LCN1.
  • the inventors have revealed that the hOBPII-LCN1 family results from consecutive events of genomic duplications.
  • the sequences as well as the genomic organization revealed that the LCN 1 and hOBPII genes derive from a common ancestor and were generated by means of tandem duplication.
  • the inventors have shown that the hOBPII and LCN 1 genes code for proteins involved in different functions, as shown by the expression of these genes both in the oral sphere and in the genital sphere.
  • the inventors have shown by phylogenetic analysis (Example 6) that several different proteins can participate in the same function of odorant-binding protein; thus three subfamilies of lipocalins (groups 5, 8 and 9) corresponding to several proteins are found expressed in the oral sphere and in particular in the nasal and buccal glands.
  • the inventors therefore propose to include the proteins ApoD and RBP in the family of human OBP and include them in the set of claims relating to these human OBP.
  • the inventors have demonstrated that the transcription of the two hOBPII genes generates numerous alternative transcripts which code for distinct proteins whose structure is compatible with that of a hydrophobic ligand transporter.
  • the inventors have demonstrated the expression of the two hOBPII genes in the oral sphere (nasal glands, von Ebner glands, submaxillary glands, lacrimal glands, lung).
  • the inventors have also demonstrated that the hOBPII proteins according to the invention are produced by cells of the genital sphere; the hOBPII gene is mainly expressed in the prostate, vas deferens and mammary glands while the expression of the hOBPIIa gene is restricted to the vas deferens.
  • the BamH I and Xho I enzyme restriction sites located at the ends of the two oligonucleotides were used for a directional cloning in a plasmid vector of expression pGEX-6Pl, followed by a transformation by electroporation (1800V, 200 ⁇ , 25 ⁇ F) in a bacterial strain BL21.
  • the synthesis of the recombinant protein is obtained by adding dTPTG at a rate of 5 mM final for 3 h in 250 ml of culture of the strain in LB medium containing 100 ⁇ g / ml of ampicillin previously incubated at 37 ° C for 2 h. The centrifuged cultures are taken up in 25 ml of TENGN buffer.
  • the lysate is sonicated and centrifuged again.
  • the fusion protein is then purified using 4 ml of beads covalently fixing insoluble glutathione (Sigma) per 25 ml of supernatant. After 4 h of incubation, they are washed with 3 volumes of 1M NaCl and then with 10 volumes of PBS IX. The elution is obtained by bringing the beads into contact for 10 min with a glutathione solution (reduced glutathione 10 mM, Tris-HCl pH 8.0 50 mM).
  • the amount of recombinant protein produced is estimated by migration into polyacrylamide gel and staining with Coomassie blue ( Figure 11).
  • the specificity of the induction of a recombinant protein is tested by Western blot using an anti-goat GST antibody ( Figure 11), revealed with an anti-goat IgG antibody coupled to peroxidase using an ECL + plus kit (Amersham).
  • the separation of the fusion protein into two proteins is obtained by proteolysis of 100 ⁇ g of recombinant protein previously dialyzed using 2U of preScission TM protease (Pharmacia Biotech) in 10 ⁇ l final containing buffer of enzyme IX, for 4 h at 5 ° C.
  • EXAMPLE 9 DETECTION OF hOBPII, LCNl AND ApoD, WITHIN NASAL STRUCTURES BY RT-PCR, AND BY IMMUNOHISTOCHEMISTRY.
  • RT-PCRs performed using primer sets for hOBPII and for LCN 1 reveal the presence of the corresponding mRNAs in at least one of the nasal structures.
  • Immunohistochemical detection techniques both by fluorescence detection and by revelation using peroxidase and DAB, reveal the presence of the proteins hOBPII (FIG. 15) and LCNl (FIG. 16) in the epithelial cells of the acini of the nasal glands, as well than in the lumens of the secretory canals. It can also be detected on mucus stuck on tissue.
  • RT-PCRs performed using primer sets for ApolipoproteinD reveal the presence of the corresponding mRNAs in at least one of the nasal structures.
  • Revelation-based immunohistochemical detection techniques using peroxidase and DAB reveal the presence of the protein ApoD (Figure 17) in the epithelial cells of the nasal gland acini, as well as in the lumen of the secretory ducts, although the expression seems weaker and in less acini than for hOBPII.
  • RT-PCR performed using primer sets for hOBPII and for LCN1 reveal the presence of the corresponding mRNAs in the placenta.
  • the expression of the mRNAs detected by RT-PCR at the level of the placental villi indicates that these hOBPII proteins are produced by the placenta to transfer lipophilic molecules (hormones, fatty acids, vitamins, etc.) to the fetus through the circulation. fetal blood.
  • the proteins detected in the amniotic membrane could correspond to the absorption of these proteins from the amniotic fluid, knowing that the nasal structures of the fetus are bathed by this amniotic fluid.
  • the proteins hOBPII and LCNl would thus participate in the transport of small lipophilic substances from the mother to the fetus at the level of the chorionic villi via the fetal blood, and from the fetus to the mother via the amniotic fluid.
  • RT-PCRs performed using primers for the ApoD protein reveal the presence of the corresponding mRNAs in the placenta.
  • Immunohistochemical detection techniques by revelation using peroxidase and DAB reveal the presence of the ApoD protein very strongly in the vacancies of the placental villi ( Figure 21).
  • the ApoD protein is not detected in the cells of the amniotic membrane and in the underlying cells, both for the amniotic membrane and for the cord.
  • the expression of mRNAs detected by RT-PCR at the placental level indicates that the ApoD protein is produced by the placenta to transfer lipophilic molecules (hormones, fatty acids, vitamins ...) to the fetus through the fetal blood circulation .
  • the ApoD protein can also be produced by the liver of the fetus.
  • the ApoD protein would thus participate in the transport of small lipophilic substances from the mother to the fetus at the level of the chorionic villi via the fetal blood.
  • lipocalins by the placenta, such as Alpha 1 -acid Glycoprotein (A1AG), prostaglandin D-synthase (PGDS), PP14 and RBP as revealed by RT-PCR techniques indicates that these proteins with the transporter properties of hydrophobic molecules are massively recruited for mother-child relationships, for the transport of these molecules as can be steroid hormones, fatty acids, vitamins or xenobiotics and more generally detoxification products from metabolism.
  • A1AG Alpha 1 -acid Glycoprotein
  • PGDS prostaglandin D-synthase

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Abstract

L'invention concerne de nouveaux polypeptides fixant des ligands hydrophobes et notamment des odeurs, dénommés OBPII (Odorant Binding Protein), les polynucléotides codant pour lesdits polypeptides et des anticorps spécifiques dirigés contre lesdits polypeptides. L'invention concerne également les applications de ces molécules notamment pour l'hygiène corporelle, les applications agro-alimentaires, nutritionnelles et thérapeutiques.

Description

« ODORANT-BINDING » PROTEINES HUMAINES FIXANT DES
LIGANDS HYDROPHOBES : POLYPEPTIDES ET
POLYNUCLEOTIDES CODANT LESDITS POLYPEPTIDES ET LEURS
APPLICATIONS ». La présente invention concerne la mise en évidence de nouvelles protéines humaines fixant les odeurs, ci-après dénommées « OBP » (Odorant Binding Proteins) ainsi que leurs applications, tant au niveau thérapeutique que non thérapeutique. La présente invention repose sur l'identification d'une famille de gènes de lipocalines composée de trois gènes et de deux pseudogènes sur le chromosome humain 9q34 ; les trois gènes correspondent au gène LCN 1 déjà décrit et à deux nouveaux gènes faisant l'objet de la présente invention et dénommés hOBPIIa et hOBPIIb. De plus, l'invention repose sur l'attribution de nouvelles fonctions à des lipocalines humaines déjà connues par la mise en évidence de nouveaux territoires d'expression.
Bien qu'un certain nombre d'OBP ait déjà été mis en évidence (Pelosi et ah, 1996), telle l'OBP de rat par exemple (voir notamment le brevet EP-0 335 654), les OBP selon la présente invention sont des OBP humaines qui présentent un très grand nombre d'avantages, comme cela ressortira de la suite du texte, par rapport aux protéines murines.
Ces protéines OBP de la famille des lipocalines ont, pour certaines d'entre elles, été mentionnées indirectement dans le brevet WO 99 07740, mais leur fonction d'OBP n'a jamais été décrite jusqu'à présent ; il en est ainsi également des protéines LCN1, rétinol-binding-protein (RBP) et Apolipoprotéine D (ApoD), comme cela sera explicité plus complètement ci-après. Historiquement, la famille des lipocalines (Pervaiz et Brew, 1987) a été définie à partir de la protéine humaine fixant le rétinol (RBP) et à partir de 3 autres protéines : la β-lactoglobuline de boeuf, l'α2μ-globuline de rat et l'αl-microglobuline humaine. A partir de ces protéines de référence et en utilisant des homologies de séquence, la famille des lipocalines s'est enrichie pour incorporer maintenant un grand nombre de protéines, plus d'une centaine, aussi bien chez les eucaryotes que chez les procaryotes (Flower et al, 1995, 1996). Cette famille consiste en de petites protéines (160- 190 acides aminés) contenant une poche hydrophobe et qui sont généralement sécrétées (Bocskei et al, 1992 ; Senoo et al, 1990, Zeng et al, 1996 ; Miller, 1998), bien que dans certains cas il s'agisse de protéines qui restent associées à la membrane (Nagata et al, 1991). Chez les vertébrés, les identités de séquence entre les différentes lipocalines tournent autour de 20%, toutefois, les identités de séquences sont plus importantes pour les protéines orthologues, de même que pour les récents gènes paralogues décrits (Igarashi et al, 1992 ; Dewald et al, 1992).
La présente invention concerne les polypeptides isolés OBPII codés par les deux nouveaux gènes humains OBPIIa et OBPIIb isolés localisés au locus 9q34 ; l'invention concerne également les séquences polynucléotidiques correspondantes, les ARNm correspondants, ainsi que les séquences régulatrices promotrices qui déterminent le profil d'expression dans les différents tissus et notamment dans les tissus sécréteurs. Ces deux gènes codent pour au moins sept polypeptides différents étant donné l'existence d'épissage alternatif des transcrits. Le gène OBPIIa code pour au moins 4 polypeptides différents dénommés OBPIIaα , OBPIIaβ , OBPIIaγ , OBPIIas et le gène OBPIIb code pour trois polypeptides différents dénommés OBPIIbα, OBPIIbβ, OBPIIbδ. Même si un gène est principalement exprimé, toutes les formes de messagers sont retrouvées dans la structure nasale.
La présente invention a donc pour objet un polypeptide isolé comprenant une séquence en amino-acides ayant au moins 90% d'identité avec les séquences en amino-acides SEQ ID N°2, SEQ ID
N°4, SEQ ID N°6, SEQ ID N°8, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 12 ou SEQ
ID N° 14 et LCN1, ApoD et RBP.
Il doit être compris que l'invention concerne les polypeptides obtenus par purification à partir de sources naturelles ou bien obtenus par les techniques recombinantes, comme cela sera décrit dans ce qui va suivre; l'invention concerne également les polypeptides obtenus par synthèse chimique qui peuvent alors comporter des acides aminés non naturels. Dans la présente description, on utilisera le terme polypeptide pour désigner également une protéine ou un peptide.
Par pourcentage d'identité entre les séquences, on entend désigner le pourcentage d'acides aminés identiques entre les séquences obtenu avec le meilleur alignement de séquences possibles. Ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les polypeptides étant réparties au hasard et sur toute la longueur.
La présente invention concerne également un polypeptide isolé caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide choisi parmi : a) un polypeptide de séquence SEQ ID N°2, SEQ ID N°4,
SEQ ID N°6, SEQ ID N°8, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 12 ou SEQ ID N° 14; b) un polypeptide variant de polypeptide de séquences d'acides aminés défini en a) ; c) un polypeptide homologue au polypeptide défini en a) ou b) et comportant au moins 90 % d'identité avec ledit polypeptide de a) ; d) un fragment d'au moins 15 acides aminés consécutifs d'un polypeptide défini en a), b) ou c) ; e) un fragment biologiquement actif d'un polypeptide défini en a), b) ou c).
On entendra par polypeptide variant l'ensemble des polypeptides mutés pouvant exister naturellement, en particulier chez l'être humain, et qui correspondent notamment à des troncatures, substitutions, délétions et/ou additions de résidus d'amino-acides. Les polypeptides variants selon l'invention conservent au moins un domaine de fixation à un ligand hydrophobe. Par polypeptide homologue, on entendra désigner les polypeptides présentant, par rapport aux polypeptides de séquence SEQ ID N°2, SEQ ID N°4, SEQ ID N°6, SEQ ID N°8, SEQ ID N° 10, SEQ ID N° 12 et SEQ ID N° 14, certaines modifications comme en particulier une délétion, addition ou substitution d'au moins un acide aminé, une troncature, un allongement et/ou une fusion chimérique. Parmi les polypeptides homologues, on préfère ceux dont la séquence d'acides aminés présente au moins 90 % d'identité, de préférence 95 %, de manière préférée 97 %, et de manière encore préférée 99 % d'identité avec les séquences d'acides aminés des polypeptides selon l'invention. Dans le cas d'une substitution, un ou plusieurs acides aminés consécutifs ou non consécutifs, sont remplacés par des « acides aminés équivalents ». L'expression « acide aminé équivalent » vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base sans cependant modifier les caractéristiques ou propriétés fonctionnelles essentielles des polypeptides correspondants, leurs activités biologiques, telles par exemple l'induction in vivo d'anticorps capables de reconnaître le polypeptide dont la séquence d'acides aminés est comprise dans la séquence d'acides aminés SEQ ID N°2, SEQ ID N°4, SEQ ID N°6, SEQ ID N°8, SEQ ID N°10, SEQ ID N° 12 ou SEQ ID N° 14, ou l'un de ses fragments. Ces acides aminés équivalents peuvent être déterminés soit en s'appuyant sur leur homologie de structure avec les acides aminés auxquels ils se substituent, soit sur les résultats des essais d'activité biologique croisée auxquels les différents polypeptides sont susceptibles de donner lieu. A titre d'exemple, on mentionnera les possibilités de substitutions susceptibles d'être effectuées sans qu'il en résulte une modification approfondie des activités biologiques des polypeptides modifiés correspondants, les remplacements, par exemple, de la leucine par la valine ou l'isoleucine, de l'acide aspartique par l'acide glutamique, de la glutamine par l'asparagine, de l'arginine par la lysine etc., les substitutions inverses étant naturellement envisageables dans les mêmes conditions. Ainsi, on peut envisager d'introduire certaines modifications comme en particulier une délétion, addition ou substitution d'au moins un acide aminé au niveau des hélices alpha de la protéine sans détruire le calice formé par la structure composée des feuillets beta ; de la même manière, il est possible d'introduire des amino-acides équivalents qui permettent de conserver aux feuillets béta le caractère hydrophobe. Il peut également être intéressant d'introduire des modifications dans la séquence des polypeptides de l'invention pour générer des polypeptides homologues dépourvus de sites protéasiques. Par fragment biologiquement actif, on entendra désigner en particulier un fragment de séquence d'acides aminés de polypeptide selon l'invention présentant au moins une des caractéristiques ou propriétés fonctionnelles des polypeptides selon l'invention, notamment en ce que : (i) il est capable d'être reconnu par un anticorps spécifique d'un polypeptide selon l'invention ou bien par des anticorps produits par des patients au cours d'une réaction immunitaire; (ii) il présente au moins l'un des domaines ou régions tels que définis ci-après ; (iii) il est capable de lier un ligand hydrophobe et notamment des molécules odorantes, de préférence les phéromones ; (iv) il est capable de lier spécifiquement un récepteur.
Par fragment de polypeptide, on entend désigner un polypeptide comportant au minimun 15 acides aminés, de préférence 18 acides aminés, de manière préférée 25 et de manière encore préférée 50 acides aminés. Les fragments de polypeptide selon l'invention obtenus par clivage dudit polypeptide par une enzyme protéolytique, par un réactif chimique, ou encore en plaçant ledit polypeptide dans un environnement très acide font également partie de l'invention. Lorsque l'on souhaite utiliser une séquence de 15, 18, 25 ou de 50 amino-acides, il s'agit bien entendu, de préférence, des parties correspondant à des épitopes fonctionnels des polypeptides précédents, lesquels pourront être intégrés dans un polypeptide ayant une structure plus longue sous forme par exemple de protéine de fusion, ceci dépendra des applications que l'on souhaite de ces polypeptides.
Selon un mode préféré de réalisation, la présente invention concerne un polypeptide isolé sélectionné parmi un polypeptide correspondant à la séquence SEQ ID N°2 et dénommé OBPIIaα , à la séquence SEQ ID N°4 et dénommé OBPIIaβ , à la séquence SEQ ID N°6 et dénommé OBPIIaγ , à la séquence SEQ ID N° 10 et dénommé OBPIIbα, à la séquence SEQ ID N° 12 et dénommé OBPIIbp .
Les polypeptides selon l'invention se caractérisent en ce qu'ils comportent de préférence le domaine Gly-Thr-Trp-Tyr.
L'invention concerne également le polynucléotide isolé caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide tel que décrit précédemment. Le polynucléotide selon l'invention est choisi parmi le polynucléotide de séquence SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3 , SEQ ID N° 5, SEQ ID N°7, SEQ ID N°9, SEQ ID N° l l ou SEQ ID N° 13.
L'invention porte également sur un polynucléotide isolé caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide choisi parmi : a) un polynucléotide de séquence SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3 , SEQ ID N° 5, SEQ ID N°7, SEQ ID N°9, SEQ ID N° l 1 ou SEQ ID N° 13 ou dont la séquence est celle de l'ARN correspondant à la séquence SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3 , SEQ ID N° 5, SEQ ID N°7, SEQ ID N°9, SEQ ID N° l l ou SEQ ID N° 13 ; b) un polynucléotide dont la séquence est complémentaire de la séquence d'un polynucléotide défini en a), c) un polynucléotide dont la séquence comporte au moins
80% d'identité, de préférence 90 %, de manière préférée 95 %, et de manière encore préférée 97 % d'identité avec un polynucléotide défini en a) ou b), d) un polynucléotide hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence de polynucléotide défini en a), b) ou c), e) un fragment d'au moins 15 nucléotides consécutifs, de préférence 21 nucléotides consécutifs, et de manière préférée 30 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide défini en a), b), c) ou d). Dans la présente description, on entendra désigner par polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique ou acide nucléique un fragment d'ADN, aussi bien un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADN, et/ou un fragment d'ARN, lesdits fragments naturels isolés, ou de synthèse, comportant ou non des nucléotides non naturels, désignant un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique. Par polynucléotide de séquence complémentaire, on entend désigner tout ADN dont les nucléotides sont complémentaires de ceux de la SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3 , SEQ ID N° 5, SEQ ID N°7, SEQ ID N°9, SEQ ID N° l l, SEQ ID N° 13 ou d'une partie de la SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3 , SEQ ID N° 5, SEQ ID N°7, SEQ ID N°9, SEQ ID N° 11, SEQ ID N° 13 et dont l'orientation est inversée.
Par pourcentage d'identité au sens de la présente invention, on entend un pourcentage de bases identiques entre les polynucléotides obtenus après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux polynucléotides étant réparties au hasard et sur toute leur longueur.
Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie au sens de la présente invention, que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN complémentaires. A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes : L'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes: (1) préhybridation à 42°C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0, 15 M NaCl + 0,015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhard's, 5 % de dextran sulfate et 100 μg/ml d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (i.e. : 42°C, pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20°C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20°C en 0, 1 x SSC + 0, 1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0, 1 x SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60°C pour une sonde de taille > 100 nucléotides. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-avant pour un polynucléotide de taille définie, seront adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et α .(1989).
Avantageusement, un fragment nucléotidique répondant à la définition précédente aura au moins 15 nucléotides consécutifs, de préférence au moins 21 nucléotides, et encore plus préférentiellement au moins 30 nucléotides consécutifs de la séquence dont il est issu.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le polynucléotide selon l'invention se caractérise en ce qu'il est marqué directement ou indirectement par un composé radioactif ou un composé non radioactif. Le polynucléotide selon l'invention est utilisé en tant qu'amorce pour l'amplification ou la polymérisation de séquences nucléiques ; l'invention porte également sur l'utilisation d'un polynucléotide selon l'invention en tant que sonde pour la détection de séquences nucléiques. Selon l'invention, les fragments de polynucléotides pouvant être utilisés comme sonde ou comme amorce dans des procédés de détection, d'identification, de dosage ou d'amplification de séquence nucléique, présenteront une taille minimale de 9 bases, de préférence de 18 bases, et de manière plus préférée 36 bases. Enfin, l'invention porte sur l'utilisation d'un polynucléotide selon l'invention en tant que oligonucléotide sens ou antisens pour contrôler l'expression du produit protéique correspondant en l'occurence un polypeptide selon l'invention. Les séquences de polynucléotides selon l'invention non marquées peuvent être utilisées directement comme sonde, amorce ou oligonucléotide ; cependant les séquences utilisées sont généralement marquées pour obtenir des séquences utilisables pour de nombreuses applications. Le marquage des amorces, des sondes, des oligonucléotides selon l'invention est réalisé par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives ; parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 3 P, le 33P, le 35S, le 3H ou le 125I. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels la biotine, l'avidine, la streptavidine, la dioxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémiluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents.
L'invention comprend également une méthode de détection et/ou de dosage d'acide nucléique selon l'invention, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : (i) d'isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique ; (ii) d'amplification spécifique de l'ADN codant pour le polypeptide selon l'invention à l'aide d'amorces ; (iii) d'analyse des produits d'amplification.
L'invention comprend en outre un nécessaire pour la détection et/ ou le dosage d'un acide nucléique selon l'invention, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : (i) un couple d'amorces nucléiques selon l'invention, (ii) les réactifs nécessaires pour effectuer une réaction d'amplification d'ADN, et éventuellement (iii) un composant permettant de vérifier la séquence du fragment amplifié, plus particulièrement une sonde selon l'invention.
L'invention comprend aussi une méthode de détection et/ ou de dosage d'acide nucléique selon l'invention, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : (i) de mise en contact d'une sonde selon l'invention avec un échantillon biologique ; (ii) de détection et/ ou de dosage de l'hybride formé entre ladite sonde et l'ADN de l'échantillon biologique.
L'invention comprend également un nécessaire pour la détection et/ou le dosage d'acide nucléique selon l'invention, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : (i) une sonde selon l'invention, (ii) les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation, et le cas échéant, (iii) un couple d'amorces selon l'invention, ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN.
L'invention concerne particulièrement les procédés selon l'invention et décrits ci-dessus, pour la détection et le diagnostic de cellules d'origine cancéreuse et principalement cancers du sein, de l'utérus, de l'ovaire, de la prostate et du poumon.
Les polynucléotides selon l'invention peuvent ainsi être utilisés comme amorce et/ ou sonde dans des procédés mettant en oeuvre notamment la technique PCR (réaction en chaîne à la polymérase)(Erlich, 1989 ; Innis et al, 1990, et Rolfs et al, 1991). Cette technique nécessite le choix de paires d'amorces oligonucléotidiques encadrant le fragment qui doit être amplifié. On peut, par exemple, se référer à la technique décrite dans le brevet américain U.S. N° 4 683 202. Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la fïltration sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions. La spécificité de l'amplification peut être contrôlée par hybridation moléculaire en utilisant comme sonde les séquences nucléotidiques de polynucléotides de l'invention, des plasmides contenant ces séquences ou leurs produits d'amplification. Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être utilisés comme réactifs dans des réactions d'hybridation afin de mettre en évidence la présence, dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique cible de séquence complémentaire à celle desdits fragments nucléotidiques amplifiés.
L'invention vise également les fragments nucléotidiques susceptibles d'être obtenus par amplification à l'aide d'amorces selon l'invention.
D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternative à la PCR (PCR-like) à l'aide de couple d'amorces de séquences nucléotidiques selon l'invention. Par PCR-like on entendra désigner toutes les méthodes mettant en oeuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acides nucléiques, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés, ces techniques sont bien entendu connues, en général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase ; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN il convient préalablement d'effectuer une transcription inverse. Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, comme par exemple la technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin (Walker et al, 1992), la technique TAS (Transcription-based Amplification System) décrite par Kwoh et al. en 1989, la technique 3SR (Self-Sustained Séquence Replication) décrite par Guatelli et al en 1990, la technique NASBA (Nucleic Acid Séquence Based Amplification) décrite par Kievitis et al. en 1991, la technique TMA (Transcription Mediated Amplification), la technique LCR (Ligase Chain Reaction) décrite par Landegren et al en 1988 et perfectionnée par Barany et al en 1991, qui emploie une ligase thermostable, la technique de RCR (Repair Chain Reaction) décrite par Segev en 1992, la technique CPR (Cycling Probe Reaction) décrite par Duck et al en 1990, la technique d'amplification à la Q-béta-réplicase décrite par Miele et al en 1983 et perfectionnée notamment par Chu et al en 1986 et Lizardi et al en 1988, puis par Burg et al. (1996) ainsi que par Stone et al (1996).
Dans le cas où le polynucléotide cible à détecter est un ARN, par exemple un ARNm, on utilisera avantageusement, préalablement à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification à l'aide des amorces selon l'invention ou à la mise en oeuvre d'un procédé de détection à l'aide des sondes de l'invention, une enzyme de type transcriptase inverse afin d'obtenir un ADNc à partir de l'ARN contenu dans l'échantillon biologique. L'ADNc obtenu servira alors de cible pour les amorces ou les sondes mises en oeuvre dans le procédé d'amplification ou de détection selon l'invention. Les sondes nucléotidiques selon l'invention hybrident spécifiquement avec une molécule d'ADN ou d'ARN de polynucléotide selon l'invention, plus particulièrement avec les séquences SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3 , SEQ ID N° 5, SEQ ID N°7, SEQ ID N°9, SEQ ID N° l l et SEQ ID N° 13, dans des conditions d'hybridation de forte stringence telles que données sous forme d'exemple précédemment.
La technique d'hybridation peut être réalisée de manières diverses (Matthews et al, 1988). La méthode la plus générale consiste à immobiliser l'acide nucléique extrait des cellules de différents tissus ou de cellules en culture sur un support (tel que la nitrocellulose, le nylon, le polystyrène) et à incuber, dans des conditions bien définies, l'acide nucléique cible immobilisé avec la sonde. Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont détectées par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde).
Selon un autre mode de mise en oeuvre des sondes nucléiques selon l'invention, ces dernières peuvent être utilisées comme sonde de capture. Dans ce cas, une sonde, dite « sonde de capture », est immobilisée sur un support et sert à capturer par hybridation spécifique l'acide nucléique cible obtenu à partir de l'échantillon biologique à tester et l'acide nucléique cible est ensuite détecté grâce à une seconde sonde, dite « sonde de détection », marquée par un élément facilement détectable.
Dans un mode préféré de réalisation, l'invention comprend l'utilisation d'un oligonucléotide sens ou antisens pour contrôler l'expression du produit protéique correspondant. Parmi les fragments d'acides nucléiques intéressants, il faut citer en particulier les oligonucléotides anti-sens, c'est-à-dire dont la structure assure, par hybridation avec la séquence cible, une inhibition de l'expression du produit correspondant. Il faut également citer les oligonucléotides sens qui, par interaction avec des protéines impliquées dans la régulation de l'expression du produit correspondant, induiront soit une inhibition, soit une activation de cette expression. Les oligonucléotides selon l'invention présentent une taille minimale de 9 bases, de préférence de 18 bases, et de manière plus préférée 36 bases. L'invention concerne un vecteur recombinant de clonage d'un polynucléotide selon l'invention et/ ou d'expression d'un polypeptide selon l'invention caractérisé en ce qu'il contient un polynucléotide selon l'invention tel que précédemment décrit. Le vecteur selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comporte les éléments permettant l'expression desdites séquences dans une cellule hôte et éventuellement la sécrétion desdites séquences hors de la cellule hôte. Par « vecteur d'expression », on entend aussi bien des vecteurs d'expression à replication autonome du type plasmide que des systèmes destinés à assurer l'intégration dans les cellules, mais ces vecteurs d'expression pourront être également des vecteurs d'expression de type viral ou bien même, lorsque l'on souhaite réaliser par exemple de la thérapie génique, de l'ADN nu. Parmi les vecteurs viraux, on préfère ceux dérivés de l'adénovirus, du virus associé à l'adénovirus (AAV), de rétrovirus, des lentivirus, et de préférence les dérivés de HIV, des poxvirus, du virus de l'herpès pour l'expression en système eucaryote. Parmi les vecteurs non viraux, on préfère les polynucléotides nus tels que l'ADN nu ou l'ARN nu selon la technique développée par la société VICAL, les chromosomes artificiels de levure (YAC, yeast artificial chromosome) pour l'expression dans la levure, les chromosomes artificiels de souris (MAC, mou se artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules murines et de manière préféré les chromosomes artificiels d'homme (HAC, human artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules humaines.
Selon un mode particulier de réalisation, le vecteur selon l'invention comporte des éléments de contrôle de l'expression des polypeptides ; ces éléments de contrôle sont choisis de préférence parmi (i) la séquence promotrice du gène hOBPIIa selon l'invention qui correspond à la séquence SEQ ID N° 15 et/ou parmi la séquence promotrice du gène hOBPIIb selon l'invention qui correspondant à la séquence SEQ ID N° 16 ; (ii) un polynucléotide dont la séquence est complémentaire à la séquence SEQ ID N° 15 et SEQ ID N° 16 ; (iii) un polynucléotide dont la séquence comporte au moins 80% d'identité avec un polynucléotide défini en (i) ou (ii) ; (iv) un polynucléotide hybridant dans des conditions de forte stringence avec la séquence de polynucléotide définie en (i), (ii), (iii). Les outils informatiques à la disposition de l'homme du métier lui permettent aisément d'identifier les boites régulatrices promotrices nécessaires et suffisantes au contrôle de l'expression génique, notamment les boites TATA, CCAAT, GC, ainsi que les séquences régulatrices stimulatrices (« enhancer ») ou inhibitrices (« silencers ») qui contrôlent en CIS l'expression des gènes selon l'invention ; parmi ces séquences régulatrices, il convient de citer 11RE, MRE, CRE.
Il est également dans l'étendue de l'invention d'utiliser les éléments ci-dessus définis et choisis parmi la séquence SEQ ID N° 15 et/ou SEQ ID N° 16 pour contrôler l'expression de polypeptides hétérologues autres que ceux de l'invention et notamment pour diriger l'expression de polypeptides hétérologues dans les types cellulaires dans lesquels les polypeptides selon l'invention s'expriment normalement.
L'invention comprend en outre les cellules hôtes, notamment les cellules eucaryotes et procaryotes, caractérisées en ce qu'elles sont transformées par les vecteurs selon l'invention. De préférence, les cellules hôtes sont transformées dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant selon l'invention. L'hôte cellulaire peut être choisi parmi les cellules bactériennes mais également parmi les cellules de levure, de même que parmi les cellules végétales et animales ; de préférence, l'hôte cellulaire est une cellule de mammifères (Edwards et Aruffo, 1993), mais également une cellule d'insectes dans laquelle on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre des baculovirus par exemple (Luckow, 1993). Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la replication et/ ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée.
Selon un mode particulier de réalisation, l'invention porte également sur un animal ou une plante transgénique qui comporte des cellules hôtes selon l'invention.
L'invention concerne également une méthode de préparation d'un polypeptide caractérisé en ce qu'il met en œuvre un vecteur selon l'invention. Plus particulièrement, l'invention porte sur une méthode de préparation d'un polypeptide recombinant caractérisé en ce que l'on cultive des cellules transformées selon l'invention dans des conditions permettant l'expression dudit polypeptide recombinant et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.
Le polypeptide selon l'invention est susceptible d'être obtenu selon un procédé de l'invention et selon les techniques de production de polypeptides recombinants connues de l'homme du métier. La présente invention concerne donc le polypeptide recombinant susceptible d'être obtenu par la méthode ci-dessus présentée. Dans ce cas, la séquence d'acide nucléique utilisée est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. Un système efficace de production d'un polypeptide recombinant nécessite de disposer d'un vecteur, par exemple d'origine plasmidique ou virale, et d'une cellule hôte compatible. Le vecteur doit comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Il doit pouvoir être maintenu de façon stable dans la cellule et peut éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion du polypeptide traduit. Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences d'acide nucléique selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à replication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards telles par exemple la transfection par précipitation au phosphate de calcium, la lipofection, l'électroporation, le choc thermique.
Les polypeptides recombinants obtenus comme indiqué ci- dessus, peuvent aussi bien se présenter sous forme glycosylée que non glycosylée et peuvent présenter ou non la structure tertiaire naturelle.
Les polypeptides obtenus par synthèse chimique et pouvant comporter des acides aminés non naturels correspondant auxdits polypeptides recombinants, sont également compris dans l'invention. Les peptides selon l'invention peuvent également être préparés par les techniques classiques, dans le domaine de la synthèse des peptides. Cette synthèse peut être réalisée en solution homogène ou en phase solide. Les procédés de purification de polypeptide recombinant utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immuno-affinité à l'aide d'anticorps mono- ou polyclonaux spécifiques, etc. Une variante préférée consiste à produire un polypeptide recombinant fusionné à une protéine « porteuse » (protéine chimère). L'avantage de ce système est qu'il permet une stabilisation et une diminution de la protéolyse du produit recombinant, une augmentation de la solubilité au cours de la renaturation in vitro et/ ou une simplification de la purification lorsque le partenaire de fusion possède une affinité pour un ligand spécifique. La présente invention concerne l'utilisation d'un polypeptide choisi parmi un polypeptide hOBPIIa et hOBPIIb selon l'invention ou l'un de leur fragment et parmi LCN1, la « rétinol binding protein » (RBP) et l'apolipoprotéine D (ApoD) comme protéine de liaison à un ligand hydrophobe, de préférence une molécule odorante. En effet, outre les polypeptides OBPII mentionnés précédemment, la fonction OBP des lipocalines LCN1, RBP et ApoD n'a jamais été suggérée. En effet, si la présence de LCN1 dans le mucus nasal a été décrite (Redl et al., 1992), c'est en fait une autre fonction qui lui a été attribuée, à savoir une fonction d'anti- protéase, alors que la fonction principale de la protéine LCN1 semble bien être le transport de ligands hydrophobes, d'ailleurs les essais réalisés dans le cadre de la présente invention avec une protéine LCN1 recombinante n'ont pas permis de mettre en évidence une activité anti-protéase. Il en va de même pour la « rétinol- binding protein » et l'apolipoprotéine D qui n'ont jamais été présentées comme ayant une fonction OBP.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un polypeptide selon l'invention ou l'un de ses fragments, LCN1, RBP et l'apolipoprotéine D comme inhibiteur compétitif, comme agoniste ou antagoniste des récepteurs cellulaires aux lipocalines. L'utilisation d'inhibiteur de liaison des lipocalines à leur récepteur peut être utilisée dans une stratégie anti-cancéreuse ; en effet, un certain nombre de tumeurs sont hormono-dépendantes : ainsi les tumeurs du sein sont sensibles aux stéroïdes ; ces stéroïdes étant transportés par les lipocalines, il est dans l'étendue de l'invention de fournir des inhibiteurs de liaison aux polypeptides selon l'invention et LCN1, OBP ou APO-D pour éviter la fixation des hormones stéroïdes au niveau des récepteurs des cellules tumorales.
L'invention concerne également un anticorps monoclonal ou polyclonal et ses fragments, caractérisés en ce qu'ils lient spécifiquement un polypeptide selon l'invention. Les anticorps chimériques, les anticorps humanisés et les anticorps simple chaîne font également partie de l'invention. Les fragments d'anticorps selon l'invention sont de préférence des fragments Fab ou F(ab12.
Les polypeptides selon l'invention permettent de préparer des anticorps monoclonaux ou polyclonaux. Les anticorps monoclonaux pourront avantageusement être préparés à partir dTiybridomes selon la technique décrite par Kohler et Milstein en 1975. Les anticorps polyclonaux pourront être préparés, par exemple par immunisation d'un animal, en particulier une souris, avec un polypeptide selon l'invention associé à un adjuvant de la réponse immunitaire, puis purification des anticorps spécifiques contenus dans le sérum des animaux immunisés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été fixé le polypeptide ayant servi d'antigène. Les anticorps polyclonaux selon l'invention peuvent aussi être préparés par purification sur une colonne d'affinité, sur laquelle a préalablement été immobilisé un polypeptide selon l'invention.
L'invention porte également sur un anticorps monoclonal spécifique d'un polypeptide selon l'invention et capable d'inhiber l'interaction entre ledit polypeptide et le récepteur cellulaire sur lequel se lie spécifiquement ledit polypeptide. Selon un autre mode de réalisation, l'anticorps monoclonal selon l'invention est capable d'inhiber l'interaction entre ledit polypeptide et ses ligands hydrophobes, de préférence les molécules odorantes et de manière préférée les phéromones avec lesquelles ledit polypeptide se lie.
Les anticorps de l'invention pourront également être marqués de la même manière que décrit précédemment pour les sondes nucléiques de l'invention et de manière préférée avec un marquage de type enzymatique, fluorescent ou radioactif. De tels anticorps marqués pourront être utilisés pour la détection de ces polypeptides dans un échantillon biologique. De préférence, l'échantillon biologique est constitué par un fluide par exemple du sérum, du sang ou des biopsies humaines. Ils constituent ainsi un moyen d'analyse de l'expression de polypeptide selon l'invention, par exemple par immunofluorescence, marquage à l'or, immunoconjugués enzymatiques.
Plus généralement, les anticorps de l'invention peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où l'expression d'un polypeptide selon l'invention doit être observée, et plus particulièrement en immunocytochimie, en immunohistochimie ou dans des expériences de « western blotting », dans les techniques ELISA et RIA. Il est ainsi dans l'étendue de l'invention de fournir une méthode de détection et/ou de dosage d'un polypeptide selon l'invention, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes de mise en contact de l'échantillon biologique avec des anticorps selon l'invention puis de mise en évidence du complexe antigène- anticorps formé. Entre également dans le cadre de l'invention, un nécessaire pour la détection et/ ou le dosage d'un polypeptide selon l'invention dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : (i) un anticorps monoclonal ou polyclonal tel que décrit précédemment ; (ii) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique ; (iii) les réactifs permettant la détection des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique. Ce nécessaire est notamment utile à la réalisation d'expériences de Western Blotting et aux expériences d'immunoprécipitation. Les hOBPII selon la présente invention peuvent être utilisées dans de nombreuses applications.
Les premières applications des OBP résident dans le contrôle des odeurs ; ces applications concernent essentiellement l'hygiène corporelle (parfumerie, cosmétologie, pharmacie) ou collective.
Elles peuvent être utilisées dans un procédé pour contrôler la volatilisation d'une odeur ; un tel procédé se caractérise en ce qu'il comprend une étape de liaison de ladite odeur avec un polypeptide selon l'invention ou avec les protéines LCN1, RBP ou l'apolipoprotéine D.
Il est également possible de fixer l'odeur sur un support solide en utilisant une OBPII selon l'invention attachée audit support, cette fixation pouvant être aussi bien une fixation covalente que non covalente, par exemple par adsorption ou par des fixations de type avidine-biotine, si cela est nécessaire. Dans ces conditions, on obtient un support parfumé retenant les odeurs plus longtemps, libérant progressivement les odeurs et pouvant être utilisé aussi bien dans le domaine cosmétique que dans le domaine des produits d'entretiens en général. Les supports utilisés pourront être des supports de type plaque ou de type bille par exemple. Bien entendu, les OBPII selon la présente invention seront plus particulièrement utilisables dans l'industrie de la parfumerie et de la cosmétique où les OBP seront utilisées sous forme d'un mélange liquide destiné à contrôler la volatilisation des odeurs après que la composition ait été répandue sur la peau humaine. Ceci permet de prolonger la « tenue » des parfums ou d'entrer dans la composition des déodorants corporels notamment. Bien entendu, le terme « parfum » englobe de façon générale les mélanges connus en parfumerie, à base d'alcool ou sous forme aqueuse, et contenant notamment des huiles essentielles. Le polypeptide selon l'invention peut également entrer dans la composition de crèmes à base de rétinol en tant qu'agent de transport et de protection dudit rétinol pour des applications cosmétologiques et notamment pour prévenir, effacer et traiter les rides, les ridules de la peau, lutter contre le relâchement cutané et/ou sous-cutané.
Parmi les applications concernant l'hygiène collective, le procédé selon l'invention peut être utilisé dans un dispositif visant à désodoriser les locaux tels par exemple les animaleries, les étables. Un tel dispositif peut également être envisagé pour désodorisé le flux d'air entrant dans un appareil à air conditionné ; un tel dispositif serait très utile dans les zones géographiques polluées. L'invention concerne également un procédé de criblage de molécule, de préférence les odeurs ou saveurs qui comprend de passer la molécule sur un substrat qui comprend un polypeptide selon l'invention ou, LCN1, RBP et l'apolipoprotéine D lié audit substrat, ledit polypeptide liant ladite odeur ou saveur et de récupérer ladite odeur ou saveur depuis le polypeptide si nécessaire. Les OBP selon l'invention pourraient ainsi permettre l'isolement d'odeurs ou de parfums en les fixant sur un support tel que décrit précédemment mais qui, dans ce cas, pourra être par exemple une colonne de chromatographie, en faisant passer sur celle-ci le produit sur lequel on souhaite capter les odeurs. Il est bien entendu possible, toujours dans ce même type d'application, d'effectuer une analyse d'un parfum complexe en utilisant les différences de rétention des différents produits par les OBP. Le procédé d'isolement décrit précédemment peut également être utilisé pour séparer des « odeurs » particulières, notamment les phéromones humaines.
Les hOBPII selon la présente invention peuvent être utilisées pour des applications agro-alimentaires ou industrielles.
Les OBP selon la présente invention de part leurs caractéristiques peuvent permettre de solubiliser certaines molécules lipophiles en les associant avec lesdits OBP. Ainsi les polypeptides selon l'invention peuvent être utilisés en combinaison avec des acides gras alimentaires à titre d'additif alimentaire. La présente invention concerne un procédé pour solubiliser des molécules lipophiles caractérisé en ce qu'il comprend la liaison de ladite molécule lipophile à un polypeptide selon l'invention, à LCN1, RBP ou à l'apoD. Les OBPII, de même que LCN1, RBP et ApoD sont susceptibles d'être impliquées dans le transport des acides gras et dans les mécanismes biologiques permettant la détection de la charge en acides gras de la ration alimentaire, au niveau buccal notamment. L'invention concerne donc également l'utilisation des polypeptides précédents en association avec des acides gras pour diminuer la consommation d'acides gras, notamment dans les hyperlipidémies ou les obésités. Les polypeptides précédents peuvent dont être utilisés pour le traitement des hyperlipidémies et de l'obésité. En effet, ces protéines participent à la détection de la teneur en acides gras dans la prise alimentaire (Gilbertson, 1998), un excès de ces protéines doit conduire à leurrer le système physiologique détectant la charge en gras d'une ration alimentaire. Ainsi, une portion alimentaire pauvre en graisse mais supplémentée en OBP ou ApoD ou RBP ou LCN1 préalablement chargées en acide gras, sera faussement identifiée comme riche en graisse.
Une autre application est de complémenter un lait non maternel avec un ou plusieurs des polypeptides décrits précédemment.
Les OBP selon la présente invention peuvent être utilisées en thérapie préventive et curative.
Ainsi, l'absence de détection de ce type de protéines dans un prélèvement biologique en utilisant un anticorps, une amorce, une sonde selon l'invention pourrait être un élément de diagnostic des anosmies.
De même, il est possible de prévoir la détection des anticorps anti-OBPII dans un échantillon biologique d'origine humaine, la présence ou le dosage de ces anticorps pourrait être en rapport avec certains types d'allergies, notamment chez les asthmatiques. Dans ce cas, il pourrait être possible de traiter ce type d'allergie par administration de fragments de polypeptides tels que décrits, ce qui diminuerait les réactions immunitaires aux allergies externes. L'invention concerne donc un procédé de détection d'anticorps dirigé contre les OBPII humaines (hOBPII) dans le sérum humain de patient allergique et/ ou asthmatique en utilisant un polypeptide hOBPII selon l'invention.
Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection d'anticorps dirigé contre les OBPII humaines (hOBPII) dans un fluide biologique de patient atteint d'un cancer, et notamment du cancer de la prostate et/ ou du cancer du sein et/ ou du cancer de l'utérus et/ou de l'ovaire et/ou du poumon. En effet, les protéines selon l'invention sont sur-exprimées dans les tumeurs et notamment dans le cancer de la prostate (US 5804368, WO 97 10503, CS 84 02898, CS 83 02012, CS 82 08506, CS 82 08215), le cancer du sein (Stoecz et Gould, 1995 ; Simard et al, 1992), le cancer de l'utérus, le cancer de l'ovaire, le cancer du poumon.
Les OBP selon la présente invention peuvent également être utilisées dans des compositions pharmaceutiques, ceci notamment afin de vectoriser certaines drogues.
En effet, les lipocalines sont utilisées par les mammifères pour transporter des molécules hydrophobes au sein de fluides biologiques. Il semble même que ce soit les transporteurs naturels des xenobiotiques in vivo. Pour exemple, une surcharge expérimentale en xenobiotiques crée chez le rat mâle des tumeurs au niveau du tube contourné proximal (TCP) du néphron (Borghoff et al., 1990). En effet, les protéines MUP, seulement produites chez le rat mâle, sont réabsorbées par les cellules TCP ; après dégradation lysosomiale, les protéines MUP libèrent les xenobiotiques qu'elles transportaient. Ceux-ci s'accumulent dans ces cellules et les conduisent vers une voie tumorale par mutagenèse. Les lipocalines semblent donc être la structure idéale pour piéger en leur calice une molécule utilisée comme médicament, évitant ainsi une distribution générale de celui-ci. Ainsi, G. Beste et α/.( 1999) et la demande WO 99 16873 décrivent une stratégie de mutagenèse et de criblage permettant d'identifier des variants d'une lipocaline ayant une affinité optimale pour un ligand donné. Il est donc possible de créer une « cage à médicament » hautement spécifique.
La présente invention concerne donc un polypeptide selon l'invention en tant qu'agent de ciblage de composé pharmaceutique. Par agent de ciblage, on entend désigner les polypeptides de l'invention capables d'assurer le transport et la libération du ligand auxquels ils sont liés au niveau de certains tissus ou cellules cibles qui possèdent à leur surface des récepteurs auxdits polypeptides. Ainsi, l'invention concerne le transport de médicament au sein de la cage d'un polypeptide selon l'invention et du ciblage de cellules grâce à la capacité de l'OBPII à se fixer à un récepteur spécifique.
Il est également dans l'étendue de l'invention de développer des protéines de fusion ou des protéines chimériques comportant la cage correspondant aux lipocalines selon l'invention associées à une protéine permettant un adressage cellulaire spécifique généralement différent de celui naturel des OBPII. La présente invention a donc pour objet un polypeptide caractérisé en ce que ledit polypeptide est exprimé sous la forme d'une protéine de fusion avec une protéine permettant un adressage cellulaire spécifique. Parmi les protéines permettant un adressage cellulaire spécifique, il convient de citer les interleukines, les cytokines, les lymphokines, les chémokines, les facteurs de croissance, les hormones, les anticorps mono- ou polyclonal. Les interleukines, cytokines et lymphokines sont choisies dans un groupe composé de préférence des interleukines II- 1 à 11-20, des interférons α-IFN, β-IFN et γ-IFN. Les facteurs de croissance sont de préférence les facteurs stimulateurs des colonies (colony stimulating factors) G-CSF, GM- CSF, M-CSF et l'érythropoïétine. Les hormones sont choisies de préférence parmi les hormones stéroïdiennes.
Selon un autre mode de réalisation, le polypeptide selon l'invention en tant qu'agent de ciblage de composé pharmaceutique est associé à une molécule permettant un adressage cellulaire spécifique. Parmi, les molécules permettant un adressage cellulaire spécifique, il convient de citer le groupe des stéroïdes, des interleukines, des cytokines, des lymphokines, des interférons, des facteurs de croissance, des hormones, des anticorps. De préférence, la molécule est un stéroïde. L'association entre le polypeptide selon l'invention et ladite molécule est réalisée soit par une liaison non covalente en utilisant par exemple le système avidine-biotine ou soit par une liaison covalente en utilisant par exemple des agents chimiques pontants.
Parmi les composés pharmaceutiques que peut transporter et cibler le polypeptide selon l'invention, il convient de citer les médicaments et notamment les agents anticancéreux. Les agents anti-cancéreux sont sélectionnés parmi le groupe des agents antiprolifératifs, antinéoplastiques ou cytotoxiques et sont utilisés pour arrêter le développement des cancers et pour induire une régression et/ ou une élimination de la masse tumorale. Ces agents anticancéreux sont de préférence des radioisotopes, et de manière encore préférée des radioisotopes émetteurs de rayons gamma tels que l'Iode131, l'Yttrium90, l'Or199, le Palladium100, le Cuivre67, le Bismuth217 et l'Antimoine211. Les radioisotopes émetteurs de rayons beta et alpha peuvent également être utilisés pour la thérapie. Les agents anticancéreux non isotopiques liés au polypeptide selon l'invention sont multiples et variés; on peut citer: (i) les antimétabolites telles les agents anti-folate, le méthotrexate, (ii) les analogues des purines et des pyrimidines (mercaptopurine, fluorouracile, 5-azacytidine), (iii) les antibiotiques, (iv) les lectines (ricine, abrine) et (iv) les toxines bactériennes (toxine diphtérique) ; les toxines sont choisies de préférence parmi l'exotoxine A de Pseudomonas, la toxine diphtérique, la toxine cholérique, la toxine anthrox de Bacillus, la toxine Pertussis, la toxine Shiga de Shigella, la toxine apparentée à la toxine Shiga, les toxines d 'Escherichia coli, la colicine A, la d-endotoxine, lTiémagglutinine d'Haemophilus A. L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un composé pharmaceutique lié au moins à un polypeptide selon l'invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Il est également dans l'étendue de l'invention d'augmenter la capacité de fixation par mutagenèse de cette même protéine. L'invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie précédemment pour le traitement du cancer, et notamment le cancer de la prostate, le cancer du sein, le cancer de l'utérus, le cancer de l'ovaire, le cancer du foie et le carcinome des cellules épithéliales pulmonaires. Etant donné que l'OBP dénommée hOBPIIb, l'apolipoprotéine D, la RBP et l'α-1-acide glycoprotéine sont exprimées dans la prostate, la composition pharmaceutique selon l'invention est destinée au traitement du cancer de la prostate. De même, étant donné qu'il a été démontré que l'ARNm des protéines ApoD, RBP et LCNl est produit dans la glande mammaire en plus de la production de hOBPIIb déjà décrit dans la demande WO 99 07740, la composition pharmaceutique selon l'invention est destinée au traitement du cancer du sein.
L'invention porte aussi sur un polypeptide selon l'invention en tant que transporteur de composé pharmaceutique. Par transporteur, on entend désigner des polypeptides selon l'invention capable de véhiculer dans l'organisme un composé pharmaceutique sans que ledit composé ne soit libéré à un endroit privilégié dans l'organisme. Un tel polypeptide constitue un moyen de délivrance dudit composé pharmaceutique dans l'organisme.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique selon l'invention caractérisé en ce que ledit polypeptide constitue une forme retard de délivrance dudit composé pharmaceutique dans l'organisme. En effet le composé pharmaceutique d'intérêt lié au polypeptide OBPII selon l'invention diffuse progressivement dans l'organisme à mesure que ledit polypeptide transporteur est catabolisé dans l'organisme. L'utilisation des techniques de l'ADN recombinant permet à l'homme de l'art de modifier la durée de demi-vie du polypeptide OBPII dans l'organisme en introduisant des modifications dans ledit polypeptide. Ainsi, il peut être intéressant de développer un polypeptide homologue selon l'invention pour lequel les sites de coupures protéasiques ont été mutés afin d'augmenter la demi-vie dudit polypeptide dans l'organisme. Il peut être également intéressant de développer un polypeptide multimérique, exprimé par exemple sous la forme d'une protéine de fusion, afin d'éviter une « fuite glomérulaire » (clearance rénale) et ainsi d'augmenter la demi- vie dudit polypeptide dans l'organisme. Selon un autre aspect, l'invention concerne un composé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi un anticorps, un polypeptide, un ligand, un polynucléotide, un oligonucléotide ou un vecteur selon l'invention à titre de médicament et notamment en tant que principes actifs de médicament ; ces composés seront préférentiellement sous forme soluble, associés à un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Par véhicule pharmaceutiquement acceptable, on entend désigner tout type de véhicule employé habituellement dans la préparation de compositions injectables, c'est-à-dire un diluant, un agent de suspension tel une solution saline isotonique ou tamponnée. De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique ou par voie orale. Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés, etc. L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un vecteur d'expression selon l'invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Il est également possible d'utiliser la propriété d'expression dans des sites particuliers de ces protéines afin d'assurer une imagerie et/ ou un diagnostic de certains types de cancer.
Enfin, compte tenu de la forte expression des polypeptides selon l'invention dans le placenta (cf. figure 10), la présente invention présente différentes applications thérapeutiques destinées à traiter des pathologies de la gestation chez la femme. Ainsi, un des objets de la présente invention est d'utiliser le polypeptide selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au transport de composés à travers la barrière placentaire. Ces composés sont de préférence des molécules lipophiles. Le polypeptide selon l'invention peut être utilisé pour réaliser le transport de composés de la mère gestante vers le fœtus ; les composés pouvant être choisis parmi les molécules d'intérêt thérapeutique, de préférence lipophiles, les acides gras essentiels, les hormones, les vitamines, et de manière plus générale, les petites molécules lipophiles. En effet, il a été démontré que les cellules des villosités placentaires sécrètent massivement des polypeptides selon l'invention, notamment des OBPII. Ces polypeptides se répandent ensuite dans le sang fœtal et vers la circulation sanguine générale du foetus. Egalement, le polypeptide selon l'invention peut être utilisé pour réaliser le transport de composé du fœtus vers le mère gestante. En effet, le fœtus sécrète au niveau des villosités des structures nasales des polypeptides selon l'invention qui participent aux échanges de molécules entre le fœtus et la mère au niveau de la membrane amniotique. C'est donc également un objet de la présente invention de fournir au fœtus des polypeptides selon l'invention pour permettre le transport de composés présents dans le fœtus, par exemple des xenobiotiques, vers le placenta et/ou vers la membrane amniotique, pour permettre la détoxification du fœtus.
Selon un autre aspect de l'invention, le polypeptide selon l'invention peut être utilisé comme marqueur de grossesse. En effet, le polypeptide selon l'invention est présent dans différents liquides biologiques de la mère tels l'urine, le sang ; la mesure de sa concentration et/ ou de sa présence constitue un indicateur de grossesse. A ce titre, ce marqueur pourra être utilisé, avec, ou à la place du, ou en complément du marqueur de grossesse que constitue la choriogonadotrophine humaine hCG ; le polypeptide selon l'invention et la hCG sont en effet des molécules qui sont sécrétées par les cellules placentaires trophoblastiques.
Enfin, selon un autre aspect de l'invention, le polypeptide peut être utilisé comme marqueur de pathologies fœto-placentaires. Il peut constituer un marqueur de la rupture de la membrane de la poche des eaux.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci-après. FIGURE 1 : Organisation génomique du locus LCNl /hOBPII
La ligne du haut représente la région du chromosome 9q34. La double flèche indique l'intervalle entre la localisation des marqueurs polymorphes D9S1811 et D9S67 ; la position relative des marqueurs D9S67 et D9S1826 est incertaine.
Le niveau du milieu indique l'organisation partielle des cosmides à 3 loci différents : LCN lc, LCNlb-hOBPπb, LCNl-hOBPiia. Les cosmides (approximativement 40 kb) sont représentés par des lignes horizontales avec leur nom et les bras des vecteurs T3 ou T7 notés au-dessous de la ligne. Les flèches représentent les différents gènes ou pseudogènes avec leur orientation respective. Dans les cosmides, les lignes en pointillés verticales représentent les sites EcoRI. Le symbole ® indique une orientation incertaine du locus. Le niveau inférieur montre les structures intron/exon des gènes LCN l et hOPBII : les boîtes noires représentent les exons ; les flèches représentent le site d'initiation de la transcription ; oll à ol5 représentent les sondes d'oligonucléotides utilisées pour cribler les cosmides ; Alu représente la présence de séquences répétées.
FIGURE 2 : Analyse "Dot Plot" de :
(A) séquence locus LCNl-hOBPIIa (AC000396+ACXXXXX) contre locus LCNlb-hOBPIIb (AC002098) ;
(B) séquence locus LCNl-hOBPIIa (AC000396+ACXXXXX) contre séquence locus LCNlc ;
(C) séquence locus LCNlb-hOPBIIb (AC002098) contre séquence locus LCNlc (AC002106). Des séquences génomiques ont été filtrées pour les séquences répétitives à l'aide de « Repeatmasker » (REF), puis comparées et « dotplotted » avec le logiciel gcg en utilisant une taille de fenêtre de 25, et un critère de 20 avec une homologie de 80%.
FIGURE 3 : Séquence nucléotidique de gènes hOBPII.
Les lignes supérieures représentent la séquence hOBPIIa et les lignes inférieures la séquence hOBPIIb pour laquelle seuls les nucléotides différents sont représentés ; un tiret indique l'absence de séquences correspondantes. Les capitales ombrées sont les séquences exoniques et les lettres minuscules les séquences introniques. Les tailles indiquées sur la gauche sont indiquées en pb. La boîte TATA est en caractères gras et le signal de polyadénylation est souligné. Les boîtes indiquent les sites accepteurs d'épissage pour les exons 5, 5b, 5c.
FIGURE 4 : Représentation schématique des deux gènes hOBPII et de leur ARNm correspondants. Les lignes horizontales représentent l'organisation exon/intron avec des tailles indiquées en pb. Les boîtes ombrées numérotées de 1 à 7 sont les séquences exoniques codantes des principaux transcrits ; les lettres b et c font référence à des exons surnuméraires. Les différents transcrits sont représentés à l'aide de boîtes assemblées : les premières, hOBPIIaα et hOBPIIbα correspondent aux transcrits principaux, les autres correspondent aux formes issues d'un épissage alternatif, j indique un décalage du cadre de lecture résultant de l'insertion ou de la délétion d'un exon et * représente un codon stop. La lettre « a » représente une hélice α et « b » des feuilles β prédis par le logiciel DSC. Les Lettres en italique sont des prédictions obtenues avec le logiciel "Predator".
FIGURE 5 : Alignement des séquences des protéines issues des deux gènes hOPBIIa et hOBPIIb humains (hOBPIIaα = OBP2aaHOMS, hOBPIIbα = OPB2baHOMSA, hOBPIIbβ = OPB2bbHOMSA, hOBPIIaγ = OBP2agHOMSA, hOBPIIaβ = OBP2abHOMSA), des lipocalines des larmes humaines (LCNl_HOMSA), d'OBPII de rat (OBP2_RATNO), de lactoglobuline bovine BLG (LACB_BOSTA), de MUP de souris (MUP6_MUSMU), de RBP humaine (RBP_HOMSA), d'OBP bovine (OBP_BOSTA), de MUP de rat (MUP_RATNO), d'OBP porcine (OPB_SUSSC).
Les résidus dans les boîtes gris foncé sont identiques et ceux dans les boîtes gris claires sont similaires. Les éléments de structure secondaire prédits avec le programme DSC sont soulignés et les résidus d'amino-acides sont en italiques. Les feuillets β et les hélices α sont numérotées pour hOPBIIa et b. Le site de clivage prévu du peptide signal est indiqué par une flèche (AAA -LS) en position 15. Des séquences non alignées de formes très divergentes de gènes épissés, hOPBaδ (OPB2adHOMSA) et hOBPbγ (OBP2bgHOMSA) ont été ajoutées au bas de l'alignement après l'analyse.
FIGURE 6 : Analyse RT-PCR
(A) Détection des produits RT-PCR LCN l, LCNlb, LCN lc avec leurs sondes spécifiques, et (B) Détection des produits RT-PCR hOBPIIa et hOBPIIb avec leurs sondes spécifiques. (C) ARN G3PDH contrôle. Les tailles sont indiquées en pb. FIGURE 7 : Localisation tissulaire des ARNm hOBP
Des sections du méat moyen (A,B), des cornets (C,D), de la prostate (E,F), des canaux déférents (G,H), des glandes mammaires (I, J) ont été hybridées à des ribosondes de hOBP marquées à la digoxigénine- 1 1-UTP. L'hybridation avec une ribosonde hOBP sens n'a pas révélé de signal (B,D,F,H, J). Un signal d'hybridation spécifique est obtenu avec une ribosonde antisens (A,C,E,G, I). Les flèches indiquent des structures différentes : AC : cellules acineuses, EC : cellules épithéliales, GC : cellules glandulaires, SD : canal sécrétoire et L : lumen (X200).
FIGURE 8 : Arbre de distance phylogénétique des lipocalines des vertébrés.
Les abréviations usuelles des lipocalines ont été employées. Après le symbole "_" sont indiquées les trois premières lettres du genre suivies des deux premières lettres de l'espèce.
FIGURE 9 : Schéma de l'évolution de la sous-famille de gène LCNl -OBPII au cours de l'évolution. Les boîtes indiquent les exons disposés sur une ligne représentant l'ADN génomique. Les « // » entre les lignes indiquent que les loci ne sont pas consécutifs, sans qu'il soit possible de déterminer l'ordre. La large croix sous le symbole « ? » illustre un événement de duplication partielle ou de complète duplication avec une délétion génomique ultérieure pour le locus LCN lc (choix indiqué par le symbole « * »). La croix plus petite indique l'élimination du septième exon qui semble être spécifique de l'homme à cause des nombreuses séquences répétées Alu présentent dans cette région génomique et parce que le rat a deux gènes VEGP. Le symbole « ** » marque l'étape de recrutement d'exons basée sur les données présentes et celles de la littérature ; cette étape a pu apparaître à n'importe qu'elle moment après les duplications des loci et a pu être séquentielle.
FIGURE 10 : Analyse par RT-PCR dans la sphère orale et la sphère génitale de l'expression des autres lipocalines humaines connues.
Définition de nouvelles fonctions OBP et VEGP pour les protéines RBP (retinol-binding-protein) et ApoD (apoliporotéine D).
FIGURE 11 : Etude de l'anticorps polyclonal dirigé contre les protéines hOBPII.
La protéine de fusion est déposée dans les puits 1 et 3. Un échantillon de mucus nasal humain est déposé dans les puits 2 et 4. Les protéines contenues dans les puits 1 et 2 ont été révélées par coloration au bleu de Coomassie. L'anticorps hybride sur la membrane obtenue par Western-blotting révèle spécifiquement la protéine GST-hOBPIIb entre 30 et 42 kDa (puit 3) et les hOBPIIa et hOBPIIb (puit 4) de 18 kDa dans le mucus nasal humain.
FIGURE 12 : Immunohistochimie sur les tissus de l'appareil olfactif.
Une forte immunoréactivité est repérable sur la coupe de septum (coloration verte, A) sur les deux coupes de cornet (C et D) et sur la coupe de méat moyen (F). Les témoins négatifs réalisés pour le septum (B) et pour le cornet (E) et pour le méat moyen (G) ne montrent aucune réactivité. Les noyaux des cellules sont repérés par une coloration au DAPI (coloration bleue). Les grossissements utilisés sont de X 100 pour les coupes A, B, C, E et G et de X 200 pour les coupes D et F.
FIGURE 13 : immunohistochimie sur tissus de la sphère orale Ces deux tissus, glandes lacrymales (A, B) et glandes de Von
Ebner (E, F) montrent une forte immunoréactivité en comparaison des résultats obtenus grâce au sérum pré-immun (C pour les glandes lacrymales et D pour les glandes de Von Ebner). Grossissement X200.
FIGURE 14 : Immunohistochimie sur les glandes mammaires et poumon
Une forte immunoréactivité est visible sur les coupes de glandes mammaires (A et B) comparé au témoin négatif ( C ) réalisé grâce au sérum-pré immun. Une forte immunoréactivité est également observée sur les coupes de poumon (E et F) comparée toujours au témoin négatif (D). chaque observation est faite à un grossissement X 100 pour A et C et à un grossissement X 200 pour B, D, E et F.
Figure 15 : Mise en évidence des protéines hOBPII dans différentes structures nasales : Cornet (A : 200x, B : 400x), Septum (C : 300x, D 600x), Méat moyen (E : 400x, F : 600x) : Détection des protéines hOBPII avec un sérum polyclonal de lapin révélé par une activité peroxidasique détecté par DAB. AC : cellule acineuse sécrétrice, P : précipité de DAB (détection hOBPII) Figure 16 : Mise en évidence de la protéine LCNl dans différentes structures nasales : Cornet (A : 200x, B : 500x), Septum (C : 100x, D 500x), Méat moyen (E : 200x, F : 600x) :
Détection de la protéine LCN l avec un sérum polyclonal de lapin révélé par une activité peroxidasique détecté par DAB. AC : cellules acineuse sécrétrice, P : précipité de DAB (détection LCNl)
Figure 17 : Mise en évidence de la protéine ApoD dans différentes structures nasales : Cornet (A : 500x, B : 700x), Septum (C : 300x), Méat moyen (D : 400x) :
Détection de la protéine ApoD avec un anticorps monoclonal de souris révélé par une activité peroxidasique détecté par DAB. AC : cellule acineuse sécrétrice, P : précipité de DAB (détection ApoD)
Figure 18 : Mise en évidence de la protéine hOBPII dans différentes structures de la sphère orale : Glande Lacrymale (A : 200x, B : 600x), Glandes de Von Ebner (C : lOOx, D : 400), Poumon (E : 200x, 800x) : Détection de la protéine hOBPII avec un sérum polyclonal de lapin révélé par une activité peroxidasique détecté par DAB. AC : cellule acineuse sécrétrice, P : précipité de DAB (détection hOBPII) .
Figure 19 : Mise en évidence des protéines hOBPII dans différentes structures placentaires : villosités choriales (A : 300x, B : 800x), Membrane Amniotique (C : 800x), Cordon (D : 600x) :
Détection des protéines hOBPII avec un sérum polyclonal de lapin révélé par une activité peroxidasique détecté par DAB. L : lacune (contient sang maternel), C : capillaire fœtal, Am : membrane amniotique, E : cellules épithéliales dérivées de l'ectoblaste extraembryonnaire, MB : membrane basale, M : couche mesenchymateuse, P : précipité de DAB (détection hOBPII)
Figure 20 : Mise en évidence de la protéine LCNl dans différentes structures placentaires : villosités choriales (A : 200x, B : 800x), Membrane Amniotique (C : 600x), Cordon (D : 500x) : Détection de la protéine LCNl avec un sérum polyclonal de lapin révélé par une activité peroxidasique détecté par DAB. L : lacune (contient sang maternel), C : capillaire fœtal, Am : membrane amniotique, E : cellules épithéliales dérivées de l'ectoblaste extraembryonnaire, MB : membrane basale, M : couche mesenchymateuse, P : précipité de DAB (détection LCN l)
Figure 21 : Mise en évidence de la protéine ApoD dans différentes structures placentaires : villosités choriales (A : lOOx, B : 500x), Membrane Amniotique (C : 400x), Cordon (D : 400x) :
Détection de la protéine ApoD avec un anticorps monoclonal de souris révélé par une activité peroxidasique détecté par DAB. L : lacune (contient sang maternel), C : capillaire fœtal, Am : membrane amniotique, E : cellules épithéliales dérivées de l'ectoblaste extra-embryonnaire, MB : membrane basale, M : couche mesenchymateuse, P : précipité de DAB (détection ApoD) EXEMPLES
EXEMPLE 1 : MATERIELS ET METHODES
l.A. Banque de cosmides du chromosome 9 humain
Une copie de la banque de cosmides spécifiques du chromosome 9 humain LL09NC01P construite par le Dr. J. AUmeman (Biochemical Sciences Division, Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, CA USA) sous l'égide du National Gène Library Project supporté financièrement par le département américain de l'Energie a été utilisée. Le criblage de la banque et l'analyse des clones ont été réalisés tel que décrit précédemment (Lacazette et al, 1997).
l.B. Clonage et analyse de séquence
Une banque Lambda gtl l d'ADNc de testicules humains (Clontech) ( 107 p.f.u.) a été amplifiée par 30 cycles de polymérisation en chaîne (PCR) (94°C 45 sec, 54 °C 45 sec, 72°C lmin 30 sec) avec l'amorce oliEST58 CCTGCAGGTACATGAGCTTCC et des amplimères 5' ou 3' de criblage d'inserts situés sur les bras du vecteurs Lambda gt 1 1. Une PCR nichée a ensuite été réalisée avec oliEST26 CGCTGTATTTGCCAGGCTCC et des oligonucléotides spécifiques du bras du vecteur. Les produits PCR ont été sous- clonés dans le vecteur pGEM-T(r), ce qui a permis d'obtenir l'extrémité 5' des ADNc du gène hOBPII.
Les séquences obtenues en utilisant l'oligonucléotide standard pGEM-T (r) et en utilisant un mixe réactionnel prêt à l'emploi de séquençage à base de colorant terminateur (Applied Biosystems) ont été séparées par électrophorèse en utilisant un séquençeur automatique ABI PRISM 377 (Perkin Elmer) puis ont été analysées avec le logiciel Séquence Navigator 1.0.1. (Perkin Elmer). Des clones d'ADNc pleine longueur de hOBPIIa (hOBPIIa α, hOBPIIa β, hOBPIIa δ, hOBPIIa γ) et hOBPIIb (hOBPIIb α, hOBPIIb β, hOBPIIb γ) ont été obtenus à partir de la RT-PCR par purification des bandes d'intérêt selon les instructions du fabricant (gel extraction kit de Qiagen) ou en sous-clonant dans un vecteur pGEM-T(r) les produits de la PCR nichée pour les formes alternatives faiblement exprimées.
1C. Analyse par RT-PCR
Des échantillons de tissus ont été collectés chez des individus caucasiens âgés de 45 à 55 ans en accord avec la réglementation française en vigueur. L'ARN total est extrait selon une méthode en une seule étape utilisant le réactif ARN NOW® selon les instructions du fabricant (Biogentex). 5 μg d'ARN total ont été rétro-transcrits dans un volume final de 20 μl en utilisant 0,5 ng d'oligonucléotide
GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT avec le système de préamplification Superscript® (Gibco BRL). Trois μl de ces réactions sont ensuite utilisés pour les PCR suivantes. L'expression des ARNm spécifiques a été déterminée par PCR en utilisant : les amorces TL : CCTCTCCCAGCCCCAGCAAG et AP : GACTCGAGTCGACATCG pour les gènes de type LCNl (LCN l, LCN lb, LCNlc) et pour les gènes de type hOBPII, les amorces DE : CGCCCAGTGACCTGCCGAGGTC, et FI :
CTTTATTTGGAGTCAGGTGGGTG. Comme contrôle de qualité des ARN, les amorces G3PDH 1 : CTCTGCCCCCTCTGCTGATG et G3PDH2 : CCTGCTTCACCACCTTCTTG du gène G3PDH ont été utilisées ; le gène G3PDH est considéré comme étant constitutivement exprimé dans tous les types cellulaires. 32 cycles de PCR (94° C 45 sec, 54° C 45 sec, 72° C 2 min. 30 sec.) ont été réalisés et les produits d'amplification ont été séparés sur gel d'agarose à 1%. L'ADN est transféré sur une membrane Hybond N+@.
Pour la détection de l'expression des différents gènes, plusieurs oligonucléotides spécifiques des gènes respectifs ont été synthétisés : - olLCNl : GACTCAGACTCCGGAGATGA,
- olLCNlb : AACTCAGACACCAGAGATGA,
- olLCN lc : GACTCAGATCCCGGAGATGA,
- ol5 : CCAGGAGGGACCACTACA spécifique du gène hOBPIIb,'
- ol4 : CCGGGACGGACGACTACG spécifique du gène hOBPIIa, - G3PDH3 : CTCATGACCACAGTCCATGC,
Les oligonucléotides sont marqués au γ32P-ATP en utilisant de la T4 kinase (Applied Biosystem) ; les hybridations des oligonucléotides marqués sont réalisées à 42° C. Le lavage final est réalisé dans une solution de 0, 1 X SSC, 0, 1% SDS à 48° C pendant 20 min. La spécificité des réactions d'hybridation des oligonucléotides est contrôlée en utilisant des échantillons d'ADN cosmidique digéré (p233G2 pour LCNl et hOBPIIa, P19E7 pour LCN lb et hOBPIIb, P181A9 pour LCN lc) et chargés sur le gel avec des produits de RT-PCR.
l.D. Génotypage et analyse de liaison
Le génotypage est réalisé par des réactions PCR en utilisant 100 ng d'ADN génomique provenant de 8 familles de référence du CEPH et utilisant les oligonucléotides oli9 TGTTCGGGAACGCAGCTT et olilObis
TGCCGCTGTCCCCACGTCGG. Les paramètres du thermocycleur consistent en un cycle initial à 94° C pendant 10 min suivi par 30 cycles à 94° C pendant 30 s, 55° C pendant 30 s et 70° C pendant 45 s puis en une étape d'élongation finale de 10 min à 70° G. Les produits PCR sont ensuite analysés sur un gel d'agarose à 3%. Les informations concernant les marqueurs du chromosome 9 peuvent être obtenues à l'adresse Internet suivante (hTTP://galton.ucl.ac.uk) ; les analyses ont été réalisées en utilisant les outils d'études de liaison préalablement décrites dans Lacazette et al. ( 1997). Les haplotypes sont reconstruits manuellement selon les événements de recombinaison préalablement décrits dans la famille 1362 (Attwood et al., 1994).
l.E. Prédictions de structures secondaires
Un alignement multiple des protéines lipocalines pour lesquelles les structures cristallographiques ont déjà été décrites (Monaco et al, 1992 ; Spinelli et al, 1998) avec les protéines hOBPIIa et hOBPIIb a été obtenu en utilisant le logiciel Clustalx (ftp.infobiogen.fr). Les structures secondaires putatives ont été déterminées avec le programme DSC (Discrimination of protein Secondary structure Class) développé par R.D. King et M.J.E. Sternberg (http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/dsc-simple.html) . Les structures secondaires des protéines correspondantes aux formes alternativement épissées sont supposées identiques aux formes traditionnelles avant le décalage du cadre de lecture; après ce décalage la prédiction de structure est effectuée avec une seule séquence et est réalisée en utilisant le logiciel Predator (http://pbil.ibcp.fr/cgi-bin). l.F. L'analyse phylogénétique
Les protéines lipocalines dont les séquences sont connues dans leur totalité ont été alignées trois fois consécutivement en utilisant le logiciel Clustalx (ftp://ftp.inforbiogen.fr). Des distances dans l'arbre phylogénétique ont été calculées avec Clustalx et dessinées avec Njplot.
l.G. Hybridation in situ
Des coupes sériées réalisées au cryostat (8 μm d'épaisseur) sont collectées sur des lames SuperFrost® Plus (Menzel Glazer) et stockées à - 80° C. Des sondes ARN antisens et sens sont obtenues selon les techniques standard en utilisant la T7 ou la SP6 polymérase à partir d'une matrice obtenue par digestion avec des enzymes de restriction Ncol ou PstI du clone cDNA de phOBPIIaP2 et en utilisant du DIG- 1 1-UTP (Boehringer Mannheim) (la longueur de la sonde est approximativement de 150 nucléotides). Les matrices digérées par PstI et transcrites par l'ARN polymérase de T7 correspondent à la sonde antisens et les matrices digérées par Ncol transcrites par l'ARN polymérase SP6 correspondent à la sonde sens. Des sections de tissus sont fixées dans du paraformaldéhyde 4% pendant 15 min puis rincées pendant 5 min dans du PBS 2X. Après acétylation (2 x 5 min dans un tampon de triéthanolamine (TEA) pH 8, contenant 0,25% v/v d'anhydride acétique), les sections tissulaires sont préhybridées à 60° C pendant 15 min dans de la formamide 50%/ IX SSC. Les sondes marquées sont appliquées sur chacune des sections dans 50 μl de tampon d'hybridation (50% formamide, IX Denhardt's, 500 μg/ml total d'ARNt, 10% de Dextran sulfate, 10 mM de dithiotréitol). Les sections sont recouvertes puis incubées dans des chambres humides à 50° C pendant la nuit. Après hybridation, les lames sont immergées à 55° C dans un tampon de lavage (50% formamide, IX SSC) pendant 2 heures. Chaque lame est ensuite rincée 2 fois 5 min dans du 2X SSC à température ambiante, puis traitée pendant 30 min avec 10 mg/ml de RNase à 37° C, et enfin immergée 2 heures à 55° C dans une solution de lavage (50% formamide, 2X SSC). Les lames sont ensuite placées pendant 15 min à 55° C dans du 0, 1 X SSC. La détection immunologique est réalisée en utilisant un anticorps anti- DIG conjugué à la phosphatase alkaline (fragments Fab) selon le protocole de Boehringer Mannheim. Les sections sont examinées à des grossissements différents utilisant un microscope Axiophot (Zeiss).
l.H. Obtention d'un anticorps polyclonal dirigé contre les protéines hOBPπ
Deux cent cinquante μl de protéines de fusion ont été fournis à la société Agro-Bio pour la production d'anticorps. Des lapins (New Zealand White SPF) sont injectés aux jours 0, 14, 28 et 42. Les serums sont prélevés aux jours 0, 35, 49 et 63. Afin de tester l'anticorps, la protéine de fusion est déposée dans les pistes 1 et 3 (Figure 11), alors que du mucus nasal humain est déposé dans les pistes 2 et 4. Les pistes 1 et 2 ainsi que la piste correspondant à l'échelle de poids moléculaire, correspondent à une révélation par le bleu de Coomassie. Les pistes 3 et 4 correspondent à une détection des protéines reconnues par l'anticorps à l'aide de la technique de Western blot. Les pistes 1 et 3 montrent la présence d'une série de protéines recombinantes tronquées entre 30 et 42 kDa issues d'une synthèse peu efficace due à la présence de nombreux codons rares chez la bactérie au sein de la séquence de hOBPIIb. Toutefois cette production de protéine recombinante fût suffisante pour produire un anticorps polyclonal de bonne qualité comme indiqué par la révélation dans la piste 4 correspondant au mucus nasal, d'une bande de 18 kDa spécifique des protéines hOBPn.
1.1. immunohistochimie
1.1.1. Des coupes sériées de 8 μm de différents tissus sont fixées au para-formaldéhyde (5min), et rincées trois fois au PBS xl ( 15 min) puis incubées 30 min dans une solution 3% de BSA en PBSxl, avant d'être incubées durant la nuit en présence de l'anticorps antiprotéine de fusion en solution PBSxl. Après trois rinçage en PBSxl ( 15 min), un anticorps anti-IgG de lapin couplé au FITC (coloration verte en fluorescence) en solution de PBSxl est placé 3 heures au contact des lames. Après un rinçage en PBSxl, une solution de DAPI ( 100 ng / μl en PBSxl) est appliquée pendant 10 min (contre coloration des noyaux cellulaires en bleu). Après trois rinçages en PBSxl (15 min), les lames sont montées dans de l'eau glycérinée (50/50). L'analyse est réalisée en présence de filtres DAPI et FITC à l'aide d'une caméra CDD en utilisant un temps d'intégration entre 4 et 32 ms.
1.1.2. Les tissus sont congelés à -80°C en présence d'OCT. Des coupes sériées de 7micromètres sont réalisées à l'aide d'un microtome. Les tissus sont ensuite fixés à la Para-Formaldéhyde 4% en PBS. Les lames sont incubées pendant 10 min dans une solution de méthanol en présence de 4,5% de H202 , puis rincées trois fois en PBS pendant 5 min Après une incubation pendant 30 min dans une solution de 3% d'albumine de sérum de bœuf, le premier anticorps (dilué au 1/350) est incubé une nuit à température ambiante (Anticorps polyclonaux de lapin pour hOBPII et LCNl , et monoclonal de souris pour ApoD). Puis, après trois rinçages de 15 min en PBS, le deuxième anticorps (dilué au 1/300) (anti-lapin pour hOBPII et LCN l, et anti- souris pour ApoD) est incubé 3 h à température ambiante. Après trois rinçages en PBS pendant 15 min, une révélation à la péroxidase par le DAB est réalisé pendant 2 à 10 min, à l'aide du kit « Vector ». Les lames sont ensuite rincées à l'eau, et contre colorées à lliématoxyline de Mayer pendant 2 min. Après deux rinçages à l'eau, les lames sont déshydratées par bassinage successif dans des solutions d'éthanol 70°, 95°, 100°, 100°, et finalement deux bains de toluène. Les lames sont ensuite montées en baume du Canada, et observées à l'aide d'un microscope Zeiss.
EXEMPLE 2 : IDENTIFICATION D'UN GENE HOMOLOGUE A LCNl LOCALISE SUR LE CHROMOSOME 9 HUMAIN
L'identification de l'ADN complémentaire de LCN l codant pour la lipocaline des larmes humaines (Lassagne et Gachon, 1993) a préalablement été rapportée, ainsi que la localisation du gène sur le chromosome 9q34 (Lassagne et al, 1993 ; Lacazette et al, 1997). Les deux gènes codant pour les protéines des glandes de von Ebner 1 et 2 (Kock et al, 1994) correspondent aux protéines homologues de LCN l chez le rat ; ceci pose la question de savoir s'il existe d'autres gènes codant pour une protéine LCNl dans le génome humain. Les expériences d'hybridation in situ (Lassagne et al, 1993) ainsi que les analyses avec des hybrides somatiques (Lassagne et al, 1995) indiquent que, s'ils existent, ces gènes humains additionnels doivent se trouver localisés dans la région chromosomique 9q34.
Une banque de cosmides spécifiques du chromosome 9 humain (LL09NP01) a été criblée avec la sonde d'ADNc LCNl humaine ; 26 cosmides ont été identifiés ; ceux-ci ont été digérés par EcoRI ou PvuII, puis hybrides successivement avec l'ADN de
LCNl et différents oligonucléotides (figure 1).
Les cosmides sont divisés en 3 groupes. Le premier groupe (clones P32H3, P41B5, P63B6, P92H20, P109C6, P145H6, P195B4, P233G2, P233F2, P265D4, et P276H8) correspond aux cosmides contenant une séquence du gène LCNl préalablement isolé (numéro d'accession : L 14927) formé par 7 exons (Holzfeind et Redl, 1994). Le second groupe (clone P19E4, P19E7, P42H9, P98H5 et P142H8) correspond à la séquence LCNlb homologue à LCNl (clone P19E4) (numéro d'accession : Y 10826) depuis le promoteur jusqu'au 6ême exon puis qui diverge ensuite. Un troisième groupe de cosmides (clone P110C1, P174E4, P174E5, P181A9, P181B6, P211A7, P238C6 et P291E1) contient une région LCNlc, établi à partir du séquençage partiel du clone P181A9 (numéro d'accession Y 10827), qui est fortement homogue à LCNl seulement à partir du promoteur jusqu'à l'exon 2. Ainsi, LCN l est le seul gène qui possède le 7éme et dernier exon. De plus, les boîtes TATA sont dégénérées dans les promoteurs des gènes LCN lb et LCNlc
EXEMPLE 3 : IDENTIFICATION DE DUPLICATIONS
GENOMIQUES CONTENANT LES GENES DE LIPOCALINES ET CARTOGRAPHIE DE LA REGION CHROMOSOMIQUE 9Q34 Au cours de la période d'identification de la famille de gène LCN l , un vaste projet de cartographie physique a conduit à l'identification de contigs de cosmides couvrant partiellement la région chromosomique 9q34 (Nahmias et al, 1994, Van Slegtenhorst et al, 1995, Hornigold et al, 1997) ; le séquençage des clones correspondants a été réalisé par un groupe du Massachusset Institute of Technology (Boston, USA).
Des analyses de comparaison de séquences dans les banques de données de LCN l, LCNlb et LCNlc ont révélé des homologies fortes entre le gène LCN l préalablement décrit (numéro d'accession L14927) et les trois séquences cosmides : P161A1 ayant le numéro d'accession AC002098, P203H 12 avec le numéro d'accession AC000396 et P161G2 avec le numéro d'accession AC002106. Une analyse très fine notamment de la région 3' des gènes
LCN l a révélé que la séquence LCNlc correspondait au clone ayant le numéro d'accession AC002106, LCNlb au numéro AC002098 et LCNl au numéro AC000396 ; il existe cependant une insertion de 60 paires de base à la position 12360 du clone ayant le numéro d'accession AC000396 par rapport à celui ayant le numéro L14927. Des analyses complémentaires ont révélé que ces séquences sont homologues sur une région beaucoup plus large que les gènes LCN l . Comme illustré par les analyses en dot plot (figure 2), ces trois cosmides correspondent à des régions génomiques dupliquées ; les cosmides P161A1 (AC002098) et P203H12 (AC000396) sont homologues sur la totalité de leurs séquences ; le cosmide P161G2 (AC002106) n'est homologue à la séquence uniquement pour des séquences situés en amont de l'intron 3 du gène LCNl. Les positions relatives de ces régions dupliquées du chromosome 9 humain ont été analysées. Les résultats ont été comparés avec la carte physique établie dans le cadre du projet de cartographie physique par des analyses de restriction des cosmides (Hornigold et al, 1997) en utilisant la même banque LLN09NC01P. Approximativement les mêmes cosmides ont été trouvés dans les deux recherches pour le locus LCN lc ; la comparaison de séquence du cosmide P181A9 révèle que son extrémité T3 contient le gène Surf 5 (figure 1). De plus, AC002106 est localisé dans un contig de séquence entre ABO et le locus Surfeit confirmant la localisation de LCNlc. P161A1 et P203H 12 ont des localisations moins précises en utilisant les données de Hornigold et de ses collaborateurs à cause de la limite de la stratégie de cartographie de restriction pour les régions dupliquées. P203H 12 (AC000396) semble correspondre au gène LCN l qui a été préalablement localisé près du marqueur D9S1826 (Lacazette et al. 1997) à i'exception d'une insertion de 60 paires de bases.
Pour tester si P203H 12 peut correspondre à une 4ème région dupliquée, la région a été testée par PCR sur de l'ADN génomique de 150 individus non apparentés en utilisant des amorces spécifiques pour AC000396 et L14927. Une bande unique correspondant à la longueur de la séquence AC000396 a été détectée (donnée non montrée) prouvant ainsi que P203H 12 contient le gène LCNl préalablement décrit. Le locus LCN lb n'a pas été positionné précisément dans la région comme il est démontré par le fait que les extrémités AC002098 ainsi que les extrémités des cosmides contenant LCNlb ne détectent aucune séquence homologue dans les banques de données. L'analyse des séquences a permis d'identifier, un minisatellite putatif à la position 3177-3724 du cosmide correspondant à AC002098 (Figure 1) ; un polymorphisme rare a ainsi été mis en évidence dans une population de 20 individus non apparentés (PIC = 0,05). Ce nouveau marqueur polymorphe n'est informatif que dans la seule famille 1362 sur les 8 familles de référence du CEPH testées.
L'analyse de liaison a révélé des lod-scores à deux points supérieurs à 3 à téta = 0 pour les marqueurs D9S275 et D9S 1818. La reconstruction de l'haplotype a confirmé la localisation du gène
LCNlb entre les marqueurs D9S181 1 et D9S67 dans le chromosome 9q34 (Figure 1).
EXEMPLE 4 : IDENTIFICATION DE DEUX NOUVEAUX GENES
DE LIPOCALINE
Les analyses de séquences ont révélé des données nouvelles.
La comparaison de AC002098 à la banque de données a révélé des similarités entre cette séquence et les gènes de lipocalines. En plus de la région 21000 à 27000 qui contient le gène LCNlb, la région autour de la position de 2150 contient des séquences présentant des similitudes avec les séquences codant pour les protéines de liaison aux odeurs de rat de type II, des lipocalines des larmes ainsi que pour l'EST AA460385. Parallèlement, la comparaison de la séquence AC000396 à la banque de données a révélé en plus de la région 1 1 100 à 17100 contenant le gène LCN l, des similitudes pour le même groupe de séquences dans la région 36600 à 37800. L'EST AA460385 exprimée dans les testicules humains correspond à 4 exons du nouveau gêne de lipocaline présent dans le clone P161A1 (AC002098). Un exon putatif de 50 paires de bases similaire à la séquence EST est également présent à l'extrémité du clone P203H12 (AC000396).
Les inventeurs ont donc conclu a l'existence d'un nouveau gène de lipocaline à une position distale de LCN lb. Les inventeurs ont émis l'hypothèse, que suite à une duplication génomique, un second gène orthologue au gène codant pour l'EST est présent dans la région 3' de LCNl .
Le séquençage du cosmide P233G2 contenant cette région (Figure 1) avec des oligonucléotides définis à partir d'EST a en effet révélé la présence d'un autre gène de lipocaline à un locus distant de 20 kb distal du gène de LCN l. Pour identifier les premiers exons des deux nouveaux gènes, des PCR nichées sur des clones cDNA provenant d'une banque de testicules ont été réalisées entre les oligonucléotides localisés dans la région 5' de l'EST et les bras du vecteur. Les produits PCR sont clones et leur séquence a révélé trois exons additionnels d'après la séquence génomique (Figure 1). Une boîte TATA est présente en amont du premier exon dans les deux cas (Figure 3). Les deux ARNm, hOBPIIa correspondant au gène localisé en aval de LCNl et hOBPIIb localisé en aval de LCNlb (Figures 3 et 4), sont identiques à 97,5% et 63 % à ceux correspondant au gène LCNl. Les organisations intron/exon de ces deux gènes sont consistantes avec la famille des lipocalines.
De plus, les séquences protéiques déduites (170 amino acides) confirment l'appartenance à la famille des lipocalines. Les deux protéines matures putatives hOBPIIa (MW = 17,8 kDa) et hOBPIIb (MW = 18,0 kDa) sont identiques à 89%. Ces ' deux nouvelles protéines possèdent un peptide signal putatif de 15 amino acides (Figure 5), les résidus conservés GXWY à la position 27 à 30 et deux cystéines susceptibles d'être impliquées dans un pont disulfure (position 74 à 166). Cependant, les comparaisons de séquences par paire avec les autres lipocalines indiquent une faible conservation des résidus acides aminés ( 15 à 25%) à l'exception de TL/VEG humain codé par le gène LCN l (valeur moyenne 43 % sur 155 amonoacides) et l'OBPII de rat (valeur moyenne 45,5 %). Par ailleurs, les points isoélectriques calculés de hOBPIIa et de hOBPIIb sont respectivement de 7,85 et de 8,72 alors que ceux des lipocalines sont acides (aux environs de 4,5) à l'exception de l'OBPII de rat (PI = 9,01). La prédiction des structures secondaires des protéines hOBPIIa et hOBPIIb avec le logiciel DSC en effectuant des alignements multiples avec les séquences de lipocalines de structures connues indique la présence de 8 brins de feuillets β antiparallèles pouvant permettre la formation d'un calice suivi par une hélice α et un feuillet β final en accord avec les données connues des structures des lipocalines (Figure 5).
EXEMPLE 5 : ETUDE DE L'EXPRESSION DES GENES DE LIPOCALINES IDENTIFIES
Pour préciser si LCN lb, LCN lc, hOBPIIa et hOBPIIb sont des gènes exprimés, des analyses de RT-PCR ont été réalisées sur 18 tissus humains différents connus pour produire des lipocalines (Figure 6).
Deux couples d'amorces ont été synthétisés ; l'un reconnaît les ARNm de type LCN l et l'autre les ARNm de type hOBPII. L'hybridation des oligonucléotides spécifiques des gènes sur des membranes sur lesquelles sont immobilisés les produits de RT-PCR après transfert par la technique de Southern, puis le sous-clonage des produits hybrides ont révélés que LCN lb et LCN lc ne sont exprimés dans aucun des produits testés, alors que les ARNm de LCN l sont détectés dans la glande lacrymale, les glandes sudoripares, les glandes de von Ebner, le septum nasal, l'épithélium du cornet nasal , tout comme le placenta et les glandes mammaires (Figure 6A). Ces données et les informations de séquences qui indiquent que la boite TATA et le dernier exon ont été perdus permettent d'affirmer que LCN lb et LCN lc sont des pseudogènes qui ne participent pas à la formation des protéines LCN l humaines.
A l'inverse, les gènes hOBPIIa et hOBPIIb sont exprimés, ce qui confirme leur détection précédente dans les banques d'ADNc De manière surprenante, bien que les deux protéines hOBPIIa et hOBPIIb soient très similaires sur la totalité de leur séquence y compris dans la région promotrice de 1,5 kb, leur profil d'expression sont différents (Figure 6B). La protéine hOBPIIa est fortement exprimée dans le septum nasal, le méat moyen, le cornet nasal, les testicules et le placenta et plus faiblement dans les glandes mammaires, les glandes lacrymales, les glandes sudoripares, les glandes de von Ebner et le poumon. A l'inverse, la protéine hOBPIIb est exprimée de manière prédominante dans la prostate, les testicules et les glandes mammaires et plus faiblement dans les glandes sous-maxillaires, le septum nasal et le méat moyen.
De plus, les analyses de RT-PCR ont révélé l'existence d'un épissage alternatif du produit de transcription du gène hOBPIIa et du gène hOBPIIb qui génère respectivement quatre et trois ARNm (Figures 3, 4, 5 et 6).
La transcription du gène hOBPIIa génère au moins quatre ARNm qui codent pour quatre protéines différentes; le premier ARNm code pour la protéine hOBPIIaα qui correspond à la protéine hOBPIIa décrite précédemment. Dans le gène hOBPIIa, trois sites accepteur d'épissage différents ont été identifiés pour l'exon 5 (figure 3 et 4) formant ainsi deux autres variants d'épissage. Un premier variant d'épissage présente un site accepteur pour l'exon 5 localisé 49 pb avant le précédent (exon 5b) ; ceci génère un ARNm de 725 nucléotides qui code pour la protéine hOBPIIaβ de 146 aminoacides. Cette protéine est identique jusqu'au 8ème feuillet β putatif puis différente ensuite avec seulement 16 aminoacides additionnels. Un second variant d'épissage présente un site accepteur pour l'exon 5 localisé 65 pb avant le précédent (exon 5c) ; ceci génère un ARNm de 741 nucléotides qui code pour une protéine hOBPIIaγ de 228 aminoacides. Cette protéine possède les huit premiers feuillets β putatifs identiques à ceux de hOBPIIaα puis est différente dans la région C-terminale (figure 5) à cause d'un décalage de cadre de lecture généré par cet événement d'épissage alternatif ; la structure de cette région C-terminale prédite par le logiciel Predator est une longue région coudée contenant une 9ème feuillet β.
Dans le cas du gène hOBPIIb, en plus de l'ARNm hOBPIIbα préalablement décrit, un exon surnuméraire de 106 pb (exon 3b) entre les précédents exons 3 et 4 a été identifié (figure 3). Cet ARNm plus long (782 nucléotides) code pour une protéine hOBPIIbβ de 165 amino-acides. Du point de vue de la structure protéique, hOBPIIbβ est identique à hOBPIIbα jusqu'au 5éme feuillet β putatif puis diffère ensuite à cause d'un décalage du cadre de lecture. Les prédictions des logiciels informatiques indiquent que le motif ALWEALAIDTRLK est une hélice α qui est juste derrière le cinquième feuillet β. Deux feuillets β additionnels peuvent être présents dans la longue partie C-terminale.
Aucun des variants d'épissage alternatifs pour un gène n'est détecté symétriquement pour l'autre gène bien que les sites d'épissage accepteur et donneur putatifs puissent être présents (figure 3). En plus de ces motifs protéiques qui conservent la structure traditionnelle d'une lipocaline, nous avons démontré, pour les deux gênes hOBPIIa et hOBPIIb, l'existence d'une faible quantité d'ARNm ayant subi un épissage alternatif et codant pour des protéines dont la séquence n'est pas directement liée aux lipocalines. Des ARNm codant pour hOBPIIaδ et hOBPIIbγ auxquels ils manquent la séquence codant pour l'exon 2 et qui possèdent respectivement l'exon 5b et l'exon 5 codent pour des protéines putatives sécrétées de 147 et de 85 amino-acides respectivement (figures 4 et 5) ; ces protéines divergent des protéines précédentes à partir du 24éme amino-acide. Pour identifier les cellules exprimant les gènes hOBPII, les inventeurs ont hybride des sondes ribonucléiques sens et anti-sens marquées à la digoxygénine sur des sections tissulaires (figure 7). Les ARNm hOBPII sont détectés dans les cellules acineuses du méat moyen et des cornets nasaux ainsi que des cellules épithéliales des cornets ; ceci soutient l'idée que les protéines hOBPII sont impliquées dans la fonction olfactive. En plus de la production dans la sphère orale, des ARNm codant pour hOBPII ont été détectés dans la sphère génitale, notamment dans les cellules glandulaires de la prostate, dans les cellules secrétrices épithéliales du canal déférent. Aucun signal n'a été détecté dans les gonades mâles, ce qui suggère que l'expression des gènes hOBPII mise en évidence dans les expériences de RT-PCR correspondait à la présence de canaux additionnels dans la préparation tissulaire (rete testis et canaux efférents). En combinant ces résultats de la détection de l'ensemble des ARNm codant pour hOBPII avec ceux de l'approche RT-PCR, il est apparu que cinq protéines hOBPII (hOBPIIaα, hOBPIIaβ, hOBPIIaγ, hOBPIIbα, hOBPIIbβ) sont sécrétées par les cellules épithéliales des canaux des gonades mâles, ainsi que des cellules acineuses du méat moyen et des cornets nasaux ; dans ces cellules les ARNm codant pour hOBPIIa sont hautement prédominant. Seules les deux protéines hOBPIIb (hOBPIIbα et hOBPIIbβ) sont sécrétées par les cellules épithélio- glandulaires de la prostate et des glandes mammaires.
EXEMPLE 6 : ANALYSE PHYLOGENETIQUE ET
CLASSIFICATION DES LIPOCALINES
L'analyse en dotplot (figure 2) ainsi que les duplications génomiques que nous avons révélées indiquent une origine commune des gènes LCN l et hOBPII. Pour clarifier les relations entre les membres de la famille des lipocalines et pour vérifier que nous avons identifié le gène humain orthologue de OBPII de rat (Dear et al, 1991), nous avons construit un arbre de distance phylogénétique avec les lipocalines des vertébrés (figure 8).
Les inventeurs ont mis en évidence neuf groupes principaux de lipocalines issus d'un précurseur commun : la famille de l'apolipoprotéine et de la protéine de liaison au rétinol (RBP) (groupe 1) ; le groupe de la prostaglandine D-synthase et du précurseur de lipocaline associé à la gélatinase des neutrophiles (groupe
2) ; la sous-famille de l'alpha- 1-microglobuline/bikunin (protéine HC) (groupe 3) ; la sous-famille orosomucoïde (A1AG, Al AH, Al AI) (groupe 4) la sous-famille de la sphère orale 1 (OBPII-type-
LCN1/VEGP, VNSP I et II, LALP, CanFl) (groupe 5) ; la sous-famille de la lactoglobuline (groupe 6) ; - la sous-famille des protéines sécrétées par l'épididyme de lézard (groupe 7) ; la sous-famille la sphère orale 2 (protéines urinaires majeures (MUP) de souris) (groupe 8) ; la sous-famille de la sphère orale 3 (OBP1, OBPII de souris, Aphrodisine, Probasine, BD20) (groupe 9).
La présente invention concerne plus particulièrement les groupes 5, 8 et 9.
Le groupe 5 contient les protéines hOBPII qui sont étroitement liées d'un point de vue évolutif à l'OBPII de rat. Pris dans leur ensemble, les présents résultats indiquent que les gènes hOBPII humains sont orthologues du gène OBPII de rat. Ce groupe contient également les protéines LCN 1-VEGP de différentes espèces. En prenant en considération l'organisation génomique des gènes hOBPII-LCNl, les données de l'arbre illustrent l'événement de duplication (flèche) qui donne naissance aux gènes ancestraux hOBPII et LCN l à partir de leur précurseur lipocaline commun (Figure 9). Plus récemment, les duplications originelles de la région de 50 kb contenant hOBPII-LCNl (flèche) ont généré chez l'homme les deux gènes hOBPII et le gène LCN l et son pseudogène LCNlb. La duplication additionnelle ayant donné lieu au pseudogène LCN lc est partielle dans le génome humain et ne produit pas de protéine fonctionnelle et est donc absente du présent arbre. De plus, les deux protéines VEG du rat sont plus étroitement liées l'une à l'autre dans l'arbre phylogénétique qu'avec la protéine humaine LCN l . La situation est identique pour les deux protéines humaines OBPII par rapport à la protéine OBPII de rat. Ces résultats sont en faveur d'un processus de conversion génique pour au moins certains gènes des lipocalines. Ceci peut également être corrélé au fait que ces gènes se situent sur le même bras chromosomique.
Le groupe 9 correspond à la famille de la sphère orale 3 et contient des OBP qui ont déjà été décrites. La protéine Aphrodisine a déjà été décrite comme un transporteur de phéromone (Henzel et al, 1988) et apparaît être orthologue à la protéine OBP1 de rat et de souris, avec deux gènes OBP1 paralogues. Finalement, les lipocalines olfactives produites par les glandes de Bowman de rana pipens (OLFA RANPI) qui sont considérées comme des transporteurs d'odeurs potentiels dans le mucus de la grenouille, ne sont liées à aucun groupe d'OBP putatif (groupes 5, 8 et 9) suggérant ainsi l'existence d'autres catégories d'OBP.
Certaines lipocalines ont été décrites comme allergènes. L'allergène majeur du chien, la protéine CanFl majoritairement exprimée dans les glandes de von Ebner (Konieczny et al, 1997), apparaît dans l'arbre être la protéine VEG du chien. Ce résultat montrant que LCN l peut être allergénique, pousse les inventeurs à proposer l'implication des protéines OBPII dans les processus allergiques. De la même manière, l'allergène majeur du cheval EquCl exprimé dans le foie, dans les glandes salivaires (Grégoire et al, 1996) apparaît être orthologue à un membre de la protéine MUP (groupe 3). L'allergène majeure de la vache (BD20 BOSTA) qui est présent dans la famille de la sphère orale 2 (groupe 4) est davantage lié à la probasine. CanF2 principalement exprimée dans la glande parotide (Konieczny et al, 1997) ne semble pas être orthologue à une lipocaline préalablement décrite.
La présente invention a permis de révélé l'existence d'une duplication génomique au locus q34 du chromosome 9 humain qui recèle une famille de gène du type LCNl ; cette famille comporte outre le gène LCN l , précédemment décrit, deux pseudogênes ainsi que deux gènes hOBPII qui sont paralogues à LCNl. Les inventeurs ont révélé que la famille hOBPII-LCNl résulte d'événements consécutifs de duplications génomiques. Les séquences ainsi que l'organisation génomique ont révélé que les gènes LCN l et hOBPII dérivent d'un ancêtre commun et ont été généré au moyen de duplication en tandem. Les comparaisons de séquences ont démontré que les protéines hOBPIIaα et hOBPIIbα sont les formes de protéines des hOBPII les plus proches de LCN l; ceci est corroboré par le fait que la taille de l'exon 5 de LCN l est de 121 pb, ce qui correspond à la taille de l'exon 5a de la protéine hOBPII et par le fait qu'aucun exon 3b n'ait été trouvé dans la protéine LCN l. Des résultats similaires sont obtenus lorsque cette comparaison est effectuée avec les sept autres exons des lipocalines. Ces données sont en faveur d'une acquisition de la diversité des protéines hOBPII à travers l'intégration de d'ADN génomique additionnel environnant au niveau du site accepteur d'épissage amont pour l'exon 5 de hOBPIIa ou à travers le recrutement d'un exon surnuméraire (exon 3b) pour la protéine hOBPIIb. L'hypothèse d'un recrutement d'exons plutôt qu'une réduction de la taille des exons ou qu'une perte d'exons est plus probable.
Les inventeurs ont montré que les gènes hOBPII et LCN l codent pour des protéines impliquées dans différentes fonctions, comme le montre l'expression de ces gènes à la fois dans la sphère orale et dans la sphère génitale. De plus, les inventeurs ont montré par l'analyse phylogénétique (exemple 6) que plusieurs protéines différentes pouvaient participer à la même fonction d'odorant- binding protéine ; ainsi trois sous-familles de lipocalines (les groupes 5, 8 et 9) correspondant à plusieurs protéines sont retrouvées exprimées dans la sphère orale et notamment dans les glandes nasales et buccales.
Cette analyse montrant que plusieurs lipocalines participent à une même fonction physiologique et qu'une même protéine pouvait participer à différentes fonctions, a conduit les inventeurs à analyser l'expression des autres lipocalines humaines dans l'ensemble des tissus étudiés (Figure 10). Ceci a conduit à montrer que le gène codant pour l'apolipoprotéine D est exprimé dans les glandes du cornet nasal et du méat moyen, en faisant ainsi une potentielle odorant-binding protéine. De même la rétinol-binding protéine (RBP) est exprimée par l'épithélium nasal et pourrait aussi participer à cette fonction.
Les inventeurs proposent donc d'inclure les protéines ApoD et RBP dans la famille des OBP humaines et les incluent dans l'ensemble des revendications portant sur ces OBP humaines.
Les inventeurs ont démontré que la transcription des deux gènes hOBPII génère de nombreux transcrits alternatifs qui codent pour des protéines distinctes dont la structure est compatible avec celle d'un transporteur de ligand hydrophobe. Les inventeurs ont mis en évidence l'expression des deux gènes hOBPII dans la sphère orale (glandes nasales, glandes de von Ebner, glandes sous-maxillaires, glandes lacrymales, poumon). Les inventeurs ont également démontré que les protéines hOBPII -selon l'invention sont produites par les cellules de la sphère génitale ; le gène hOBPII est majoritairement exprimé dans la prostate, le canal déférent et les glandes mammaires alors que l'expression du gène hOBPIIa est restreinte au canal déférent. Les analyses in situ ont révélé que l'ARNm est produit par les cellules glandulaires de la prostate et des cellules sécrétrices épithéliales du canal déférent supportant l'idée d'une sécrétion des protéines correspondantes dans le fluide séminal. Les protéines selon l'invention sont donc susceptibles d'être impliquées dans la fonction de reproduction, mais également dans toutes les autres fonctions habituellement attribuées aux lipocalines.
EXEMPLE 7 : FABRICATION D'UNE PROTEINE
RECOMBINANTE HOBPIIBα DANS UN SYSTEME PROCARYOTE.
Une PCR sur l'ADN plasmidique d'un clone de hOBPIIbα à l'aide des amorces Blla/b (5' GTC GGA TCC CTG TCC TTC ACC CTG GAG G 3'), oligonucléotide sens démarrant 45 bases après l'ATG initiant la protéine, et Xllb ( 5' GTC CTC GAG GTG TTC GGG AAC GCA GCT TC 3'), oligonucléotide antisens précédant le codon stop de la protéine hOBPIIbα, a permis d'amplifier la totalité de l'ADN codant pour la protéine hOBPIIbα sécrétée. Les sites de restriction enzymatique BamH I et Xho I situés aux extrémités des deux oligonucléotides (bases soulignées), furent utilisés pour un clonage directionnel dans un vecteur plasmidique d'expression pGEX-6Pl, suivi d'une transformation par électroporation ( 1800V, 200Ω, 25μF) dans une souche bactérienne BL21. La synthèse de la protéine recombinante est obtenue par ajout dTPTG à raison de 5 mM final pendant 3 h dans 250 ml de culture de la souche en milieu LB contenant 100 μg/ml d'ampicilline préalablement incubée à 37°C pendant 2 h. Les cultures centrifugées sont reprises dans 25 ml de tampon TENGN. Le lysat est soniqué et centrifugé à nouveau. La protéine de fusion est alors purifiée à l'aide de 4 ml de billes fixant de façon covalente du glutathion insoluble (Sigma) pour 25 ml de surnageant. Après 4 h d'incubation, elles sont lavées avec 3 volumes de NaCl 1M puis par 10 volumes de PBS IX. L'élu tion est obtenue par mise en contact des billes pendant 10 min avec une solution de glutathion (Glutathion réduit 10 mM, Tris-HCl pH 8,0 50 mM).
La quantité de protéine recombinante produite est estimée par migration en gel de polyacrylamide et coloration au bleu de Coomassie (Figure 1 1). La spécificité de l'induction d'une protéine recombinante est testée par Western blot à l'aide d'un anticorps anti-GST de chèvre (Figure 1 1), révélé avec un anticorps anti-IgG de chèvre couplé à la peroxydase en utilisant un kit ECL+plus (Amersham). La séparation de la protéine de fusion en deux protéines est obtenue par protéolyse de 100 μg de protéine recombinante préalablement dialysée à l'aide de 2U de preScission™ protéase (Pharmacia Biotech) dans 10 μl final contenant du tampon de l'enzyme IX, pendant 4 h à 5°C.
EXEMPLE 8 : DETECTION DES hOBPII DANS DIFFERENTS TISSUS PAR IMMUNOHISTOCHIMIE. La localisation des protéines hOBPii au sein des structures nasales (figures 12 et 15), des structures buccales et des glandes lachrymales (figures 13 et 18), des glandes mammaires et des poumons (figures 14 et 18) est révélée par immunohistochimie.
EXEMPLE 9 : DETECTION DES hOBPII, LCNl ET ApoD, AU SEIN DES STRUCTURES NASALES PAR RT-PCR, ET PAR IMMUNOHISTOCHIMIE. Les RT-PCR réalisées à l'aide des jeux d'amorces pour les hOBPII et pour LCN l révèlent la présence des ARNm correspondants dans au moins une des structures nasales. Les techniques de détection immunohistochimiques tant par détection de fluorescence que par révélation à l'aide de péroxidase et de DAB, révèlent la présence des protéines hOBPII (figure 15) et LCNl (figure 16) dans les cellules épithéliales des acini des glandes nasales, ainsi que dans les lumières des canaux sécréteurs. On peut également en détecter sur du mucus collé sur les tissus.
Les RT-PCR réalisées à l'aide des jeux d'amorces pour l'ApolipoprotéineD révèlent la présence des ARNm correspondants dans au moins une des structures nasales. Les techniques de détection immunohistochimiques par révélation à l'aide de péroxidase et de DAB, révèlent la présence de la protéine ApoD (figure 17) dans les cellules épithéliales des acini des glandes nasales, ainsi que dans les lumières des canaux sécréteurs, bien que l'expression semble plus faible et dans moins d'acini que pour les hOBPII. EXEMPLE 10 : DETECTION DES hOBPII, LCNl, ApoD DANS LE PLACENTA PAR RT-PCR ET PAR
IMMUNOHISTOCHIMIE.
Les RT-PCR réalisées à l'aide des jeux d'amorces pour les hOBPII et pour LCNl révèlent la présence des ARNm correspondants dans le placenta. Les techniques de détection immunohistochimiques par révélation à l'aide de péroxidase et de DAB, révèlent la présence des protéines hOBPII (figure 19) et LCN l (figure 20) très fortement au niveau des lacunes des villosités placentaires et beaucoup plus faiblement et de façon très diffuse au niveau des cellules épithéliales de la membrane amniotique et de cellules sous jacentes tant pour la membrane amniotique que pour le cordon. L'expression des ARNm détectés par RT-PCR au niveau des villosités placentaires indique que ces protéines hOBPII sont produites par le placenta pour transférer des molécules lipophiles (hormones, acides gras, vitamines...) vers le fœtus par le biais de la circulation sanguine fœtale. Les protéines détectées au niveau de la membrane amniotique pourraient correspondre à l'absorption de ces protéines à partir du liquide amniotique, sachant que les structures nasales du fœtus sont baignées par ce liquide amniotique. Les protéines hOBPII et LCNl participeraient ainsi au transport de substances lipophiliques de petite taille de la mère vers le fœtus au niveau des villosités choriales par l'intermédiaire du sang foetal, et du fœtus vers la mère par l'intermédiaire du liquide amniotique.
Les RT-PCR réalisées à l'aide des jeux d'amorces pour la protéine ApoD révèlent la présence des ARNm correspondants dans le placenta. Les techniques de détection immunohistochimiques par révélation à l'aide de péroxidase et de DAB, révèlent la présence de la protéine ApoD très fortement au niveau des lacunes des villosités placentaires (figure 21). La protéine ApoD n'est pas détectée au niveau des cellules de la membrane amniotique et de cellules sous jacentes tant pour la membrane amniotique que pour le cordon. L'expression des ARNm détectés par RT-PCR au niveau placentaire indique que la protéine ApoD est produite par le placenta pour transférer des molécules lipophiles (hormones, acides gras, vitamines...) vers le fœtus par le biais de la circulation sanguine fœtale. La protéine ApoD peut également être produite par le foie du fœtus. La protéine ApoD participerait ainsi au transport de substances lipophiliques de petite taille de la mère vers le fœtus au niveau des villosités choriales par l'intermédiaire du sang foetal.
Plus généralement, l'expression de lipocalines par le placenta, telles que l'Alpha 1 -acid Glycoprotéine (A1AG), la prostaglandine D-synthase (PGDS), PP14 et RBP comme révélée par les techniques de RT-PCR indique que ces protéines aux propriétés de transporteur de molécules hydrophobes sont massivement recrutées pour les relations mère-enfant, pour les transports de ces molécules comme peuvent être des hormones stéroïdes, des acides gras, des vitamines ou des xenobiotiques et plus généralement des produits de détoxification issus du métabolisme.
REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Polypeptide isolé comprenant une séquence en aminoacides ayant au moins 90% d'identité avec les séquences en amino- acides SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 4, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 12 ou SEQ ID N° 14.
2. Polypeptide isolé caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide choisi parmi : a) un polypeptide de séquence SEQ ID N° 2, SEQ ID N° 4,
SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 8, SEQ ID N° 12 ou SEQ ID N° 14; b) un polypeptide variant de polypeptide de séquences d'acides aminés défini en a) ; c) un polypeptide homologue au polypeptide défini en a) ou b) et comportant au moins 90 % d'identité avec ledit polypeptide de a) ; d) un fragment d'au moins 15 acides aminés consécutifs d'un polypeptide défini en a), b) ou c) ; e) un fragment biologiquement actif d'un polypeptide défini en a), b) ou c).
3. Polypeptide isolé sélectionné parmi un polypeptide correspondant à la séquence SEQ ID N°2 et dénommé OBPIIaα , à la séquence SEQ ID N°4 et dénommé OBPIIap , à la séquence SEQ ID N°6 et dénommé OBPIIaγ, à la séquence SEQ ID N° 12 et dénommé OBPIIbp .
4. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il comporte au moins le domaine Gly-Thr- Trp-Tyr.
5. Polynucléotide isolé caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
6. Polynucléotide selon la revendication 5 de séquence SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3 , SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 1 1 ou SEQ ID N° 13.
7. Polynucléotide isolé caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide choisi parmi : a) un polynucléotide de séquence SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3 , SEQ ID N° 5, SEQ ID N°7, SEQ ID N° l l ou SEQ ID N° 13 ou dont la séquence est celle de l'ARN correspondant à la séquence SEQ ID N° 1, SEQ ID N° 3 , SEQ ID N° 5, SEQ ID N°7, SEQ ID N° l 1 ou SEQ ID N° 13 ; b) un polynucléotide dont la séquence est complémentaire de la séquence d'un polynucléotide défini en a), c) un polynucléotide dont la séquence comporte au moins 80% d'identité, avec un polynucléotide défini en a) ou b), d) un fragment d'au moins 15 nucléotides consécutifs, de préférence 21 nucléotides consécutifs, et de manière préférée 30 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide défini en a), b), c) ou d).
8. Polynucléotide selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'il est marqué directement ou indirectement par un composé radioactif ou un composé non radioactif.
9. Utilisation d'un polynucléotide selon la revendication 8 en tant que sonde pour la détection de séquences nucléiques.
10. Utilisation d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 5 à 8 en tant qu'amorce pour l'amplification ou la polymérisation de séquences nucléiques.
11. Utilisation d'un polynucléotide selon la revendication 8 en tant que oligonucléotide sens ou antisens pour contrôler l'expression du produit protéique correspondant.
12. Vecteur recombinant de clonage d'un polynucléotide selon l'une des revendications 5 à 8 et/ ou d'expression d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il contient un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 5 à 8.
13. Vecteur selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il comporte les éléments permettant l'expression éventuellement la sécrétion dudit polypeptide dans une cellule hôte.
14. Vecteur selon l'une quelconque des revendications 12 à 13 caractérisé en ce que les éléments permettant l'expression dudit polypeptide sont choisis parmi : a) le polynucléotide isolé de séquence SED ID N° 15 et SEQ
ID N° 16; b) un polynucléotide dont la séquence est complémentaire de la séquence du polynucléotide défini en a) ; c) un polynucléotide dont la séquence comporte au moins 80% d'identité avec un polynucléotide défini en a) ou en b) ; d) un polynucléotide hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence du polynucléotide défini en a), b) ou c).
15. Vecteur selon les revendications 13 et 14 pour l'expression dans les cellules eucaryotes sélectionnés parmi l'ADN viral et l'ADN nu.
16. Cellule hôte, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur selon l'une des revendications 12 à 15.
17. Procédé de préparation d'un polypeptide recombinant caractérisé en ce que l'on cultive une cellule hôte selon la revendication 16 dans des conditions permettant l'expression et éventuellement la sécrétion dudit polypeptide recombinant et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.
18. Polypeptide recombinant susceptible d'être obtenu par un procédé selon la revendication 17.
19. Utilisation d'un polypeptide choisi parmi un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 18 ou l'un de ses fragments, comme protéine de liaison à un ligand hydrophobe de préférence une molécule odorante.
20. Utilisation d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 18, ou du polypeptide hOBPIIbα de séquence SEQ ID N° 10, un polypeptide variant dudit polypeptide hOBPIIbα, un polypeptide homologue audit polypeptide hOBPIIbα comportant au moins 90% d'identité avec ledit polypeptide hOBPIIbα ou l'un de ses fragments, comme inhibiteur compétitif comme, agoniste ou antagoniste des récepteurs cellulaires aux lipocalines.
21. Anticorps monoclonal ou polyclonal et ses fragments caractérisé en ce qu'il est dirigé spécifiquement contre un polypeptide isolé selon l'une des revendications 1 à 4 et 18.
22. Utilisation d'un anticorps selon la revendication 21 pour la mise en évidence de la présence d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4 et 18 dans un échantillon biologique.
23. Procédé de détection d'anticorps dirigé contre hOBPII dans le sérum humain de patient allergique et/ ou asthmatique en utilisant un polypeptide hOBPII.
24. Procédé pour contrôler la volatilisation d'une "odeur caractérisé en ce qu'il comprend une étape de liaison de ladite odeur avec un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 18, ou avec le polypeptide hOBPIIbα de séquence SEQ ID N° 10, un polypeptide variant dudit polypeptide hOBPIIbα, un polypeptide homologue audit polypeptide hOBPIIbα comportant au moins 90% d'identité avec ledit polypeptide hOBPIIbα-
25. Procédé selon la revendication 24 caractérisé en ce que le polypeptide est lié à un support solide.
26. Procédé selon la revendication 24 caractérisé en ce que le polypeptide est dans une composition liquide.
27. Procédé selon la revendication 26 caractérisé en ce que ladite composition est une composition parfumée pour la peau.
28. Procédé de criblage de molécule, de préférence les odeurs ou saveurs qui comprend de passer la molécule sur un substrat qui comprend un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 18, ou le polypeptide hOBPIIbα de séquence SEQ ID N° 10, un polypeptide variant dudit polypeptide hOBPIIbα, un polypeptide homologue audit polypeptide hOBPIIbα comportant au moins 90% d'identité avec ledit polypeptide hOBPIIbα, lié audit substrat, ledit polypeptide liant ladite odeur ou saveur et récupérer ladite odeur ou saveur depuis le polypeptide si nécessaire.
29. Procédé selon la revendication 28 caractérisé en ce que les molécules sont des phéromones humaines.
30. Procédé pour solubiliser des molécules lipophiles caractérisé en ce qu'il comprend la liaison de ladite molécule à un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 18, ou au polypeptide hOBPIIbα de séquence SEQ ID N° 10, un polypeptide variant dudit polypeptide hOBPIIbα, un polypeptide homologue audit polypeptide hOBPIIbα comportant au moins 90% d'identité avec ledit polypeptide hOBPIIbα.
31. Application des polypeptides selon l'une des revendications 1 à 4 et 18, ou du polypeptide hOBPIIbα de séquence SEQ ID N° 10, d'un polypeptide variant dudit polypeptide hOBPIIbα, d'un polypeptide homologue audit polypeptide hOBPIIbα comportant au moins 90% d'identité avec ledit polypeptide hOBPIIbα en combinaison avec des acides gras alimentaires, à titre d'additif alimentaire.
32. Application selon la revendication 31 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des hyperlipidémies et de l'obésité.
33. Application selon la revendication 31 pour complémenter les laits non-maternels.
34. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 18, ou le polypeptide hOBPIIbα de séquence SEQ ID N° 10, un polypeptide variant dudit polypeptide hOBPIIbα, un polypeptide homologue audit polypeptide hOBPIIbα comportant au moins 90% d'identité avec ledit polypeptide hOBPIIbα en tant qu'agent de ciblage de composé pharmaceutique.
35. Polypeptide selon la revendication 34 caractérisé en ce que ledit polypeptide est exprimé sous la forme d'une protéine de fusion avec une protéine permettant un adressage cellulaire spécifique.
36. Polypeptide selon la revendication 35 caractérisé en ce que ladite protéine permettant un adressage cellulaire spécifique est choisie dans le groupe composé des interleukines, des cytokines, des lymphokines, des interférons, des facteurs de croissance, des hormones, des anticorps.
37. Polypeptide selon la revendication 34 caractérisé en ce que ledit polypeptide est associé à une molécule permettant un adressage cellulaire spécifique.
38. Polypeptide selon la revendication 37 caractérisé en ce que ladite molécule permettant un adressage cellulaire spécifique est choisie dans le groupe composé des stéroïdes, des interleukines, des cytokines, des lymphokines, des interférons, des facteurs de croissance, des hormones, des anticorps.
39. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 18, ou le polypeptide hOBPIIbα de séquence SEQ ID N° 10, un polypeptide variant dudit polypeptide hOBPIIbα, un polypeptide homologue audit polypeptide hOBPIIbα comportant au moins 90% d'identité avec ledit polypeptide hOBPIIbα en tant que transporteur de composé pharmaceutique.
40. Composition pharmaceutique comprenant un composé pharmaceutique lié au moins à un polypeptide selon l'une des revendications 34 à 39 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
41. Composition pharmaceutique selon la revendication 40 caractérisée en ce que le composé pharmaceutique est choisi dans le groupe des agents anticancéreux.
42. Composition pharmaceutique selon la revendication 41 caractérisée en ce que ledit agent anticancéreux est un isotope radioactif choisi parmi le groupe : l'Iode131, l'Yttrium90, l'Or199, le Palladium100, le Cuivre67, le Bismuth2^ et l'Antimoine211.
43. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 40 à 42 caractérisée en ce que ledit polypeptide selon l'une quelconque des revendications 34 à 39 constitue une forme retard de délivrance dudit composé pharmaceutique dans l'organisme.
44. Composition pharmaceutique comprenant un vecteur d'expression selon les revendications 12 ou 13 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
45. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 40 à 44 pour le traitement du cancer choisi de préférence parmi le cancer du sein, le cancer de l'utérus, le cancer de la prostate, le cancer du foie, du carcinome des cellules épithéliales pulmonaires.
46. Utilisation d'un polypeptide choisi parmi le polypeptide hOBPIIbα de séquence SEQ ID N° 10, un polypeptide variant dudit polypeptide hOBPIIbα, un polypeptide homologue audit polypeptide hOBPIIbα comportant au moins 90% d'identité avec ledit polypeptide hOBPIIb , pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du cancer de l'utérus, du cancer de la prostate, du cancer du foie, du cancer des cellules épithéliales pulmonaires.
47. Utilisation du polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 18, ou le polypeptide hOBPIIbα de séquence SEQ ID N° 10, ou un polypeptide variant dudit polypeptide hOBPIIbα, ou un polypeptide homologue audit polypeptide hOBPIIbα comportant au moins 90% d'identité avec ledit polypeptide hOBPIIbα pour la préparation d'un médicament destiné au transport de composé à travers la barrière placentaire.
48. Utilisation selon la revendication 47 caractérisée en ce que ledit transport est réalisé de la mère gestante vers le fœtus et que ledit composé est choisi parmi les hormones, les acides gras essentiels, les médicaments lipophiles, les vitamines.
49. Utilisation selon la revendication 47 caractérisée en ce que ledit transport est réalisé du fœtus vers la mère et est destiné à la détoxifixation du fœtus.
50. Polypeptide selon les revendications 1 à 4 et 18, ou le polypeptide hOBPIIbα de séquence SEQ ID N° 10, un polypeptide variant dudit polypeptide hOBPIIb , un polypeptide homologue audit polypeptide hOBPIIbα comportant au moins 90% d'identité avec ledit polypeptide hOBPIIbα en tant que marqueur de grossesse.
51. Polypeptide selon les revendications 1 à 4 et 18, ou le polypeptide hOBPIIbα de séquence SEQ ID N° 10, un polypeptide variant dudit polypeptide hOBPIIbα, un polypeptide homologue audit polypeptide hOBPIIbα comportant au moins 90% d'identité avec ledit polypeptide hOBPIIbα en tant que marqueur de pathologie fœto-placentaire.
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