FR2797447A1 - "odorant-binding" proteines humaines fixant des ligands hydrophobes:polypeptides et polynucleotides codant lesdits polypeptides et leurs applications - Google Patents
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Abstract
L'invention concerne de nouveaux polypeptides fixant des ligands hydrophobes et notamment des odeurs, dénommés OBPII (Odorant Binding Protein), les polynucléotides codant pour lesdits polypeptides et des anticorps spécifiques dirigés contre lesdits polypeptides. L'invention concerne également les applications de ces molécules notamment pour l'hygiène corporelle, les applications agroalimentaires, nutritionnelles et thérapeutiques.
Description
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La présente invention concerne la mise en évidence de nouvelles protéines humaines fixant les odeurs, ci-après dénommées OBP (Odorant Binding Proteins) ainsi que leurs applications, tant au niveau thérapeutique que non thérapeutique.
La présente invention repose sur l'identification d'une famille de gènes de lipocalines composée de trois gènes et de deux pseudogènes sur le chromosome humain 9q34 ; les trois gènes correspondent au gène LCN1déjà décrit et à deux nouveaux gènes faisant l'objet de la présente invention et dénommés hOBPIIa et hOBPIIb. De plus, l'invention repose sur l'attribution de nouvelles fonctions à des lipocalines humaines déjà connues par la mise en évidence de nouveaux territoires d'expression.
Bien qu'un certain nombre d'OBP ait déjà été mis en évidence (Pelosi et al., 1996), telle l'OBP de rat par exemple (voir notamment le brevet EP-0 335 654), les OBP selon la présente invention sont des OBP humaines qui présentent un très grand nombre d'avantages, comme cela ressortira de la suite du texte, par rapport aux protéines murines.
Ces protéines OBP de la famille des lipocalines ont, pour certaines d'entre elles, été mentionnées indirectement dans le brevet WO 99 07740, mais leur fonction d'OBP n'a jamais été décrite jusqu'à présent ; il en est ainsi également des protéines LCN1, rétinol-binding- protein (RBP) et Apolipoprotéine D (ApoD), comme cela sera explicité plus complètement ci-après.
Historiquement, la famille des lipocalines (Pervaiz et Brew, 1987) a été définie à partir de la protéine humaine fixant le rétinol (RBP) et à partir de 3 autres protéines : la p-lactoglobuline de boeuf, l'[alpha]2 -globuline de rat et l'al-microglobuline humaine. A partir de ces protéines de référence et en utilisant des homologies de séquence, la famille des lipocalines s'est enrichie pour incorporer maintenant un grand nombre de protéines, plus d'une centaine, aussi bien chez les
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eucaryotes que chez les procaryotes (Flower et al., 1995,1996). Cette famille consiste en de petites protéines (160-190 acides aminés) contenant une poche hydrophobe et qui sont généralement sécrétées (Bocskei et al., 1992 ; Senoo et al., 1990, Zeng et al., 1996 ; Miller, 1998), bien que dans certains cas il s'agisse de protéines qui restent associées à la membrane (Nagata et al., 1991). Chez les vertébrés, les identités de séquence entre les différentes lipocalines tournent autour de 20%, toutefois, les identités de séquences sont plus importantes pour les protéines orthologues, de même que pour les récents gènes paralogues décrits (Igarashi et al., 1992 ; Dewald et al., 1992) .
La présente invention concerne les polypeptides isolés OBPII codés par les deux nouveaux gènes humains OBPIIa et OBPIIb isolés localisés au locus 9q34 ; l'invention concerne également les séquences polynucléotidiques correspondantes, les ARNm correspondants, ainsi que les séquences régulatrices promotrices qui déterminent le profil d'expression dans les différents tissus et notamment dans les tissus sécréteurs. Ces deux gènes codent pour au moins sept polypeptides différents étant donné l'existence d'épissage alternatif des transcrits.
Le gène OBPIIa code pour au moins 4 polypeptides différents dénommés OBPIIa[alpha], OBPIIap , OBPIIa[gamma], OBPIIa# et le gène OBPIIb code pour trois polypeptides différents dénommés OBPIIba, OBPIIbp, OBPIIb#.
Même si un gène est principalement exprimé, toutes les formes de messagers sont retrouvées dans la structure nasale.
La présente invention a donc pour objet un polypeptide isolé comprenant une séquence en amino-acides ayant au moins 90% d'identité avec les séquences en amino-acides SEQ ID N 2, SEQ ID N 4, SEQ ID N 6, SEQ ID N 8, SEQ ID N 10, SEQ ID N 12 ou SEQ ID N 14 et LCN1, ApoD et RBP.
Il doit être compris que l'invention concerne les polypeptides obtenus par purification à partir de sources naturelles ou bien obtenus par les techniques recombinantes, comme cela sera décrit dans ce qui
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va suivre ; concerne également les polypeptides obtenus par synthèse chimique qui peuvent alors comporter des acides aminés non naturels. Dans la présente description, on utilisera le terme polypeptide pour désigner également une protéine ou un peptide.
Par pourcentage d'identité entre les séquences, on entend désigner le pourcentage d'acides aminés identiques entre les séquences obtenu avec le meilleur alignement de séquences possibles. Ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les polypeptides étant réparties au hasard et sur toute la longueur.
La présente invention concerne également un polypeptide isolé caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide choisi parmi : a) un polypeptide de séquence SEQ ID N 2, SEQ ID N 4, SEQ ID N 6, SEQ ID N 8, SEQ ID N 10, SEQ ID N 12 ou SEQ ID N 14; b) un polypeptide variant de polypeptide de séquences d'acides aminés défini en a) ; c) un polypeptide homologue au polypeptide défini en a) ou b) et comportant au moins 90 % d'identité avec ledit polypeptide de a) ; d) un fragment d'au moins 15 acides aminés consécutifs d'un polypeptide défini en a), b) ou c) ; e) un fragment biologiquement actif d'un polypeptide défini en a), b) ou c).
On entendra par polypeptide variant l'ensemble des polypeptides mutés pouvant exister naturellement, en particulier chez l'être humain, et qui correspondent notamment à des troncatures, substitutions, délétions et/ou additions de résidus d'amino-acides. Les polypeptides variants selon l'invention conservent au moins un domaine de fixation à un ligand hydrophobe.
Par polypeptide homologue, on entendra désigner les polypeptides présentant, par rapport aux polypeptides de séquence SEQ ID N 2, SEQ ID N 4, SEQ ID N 6, SEQ ID N 8, SEQ ID N 10, SEQ ID N 12 et SEQ ID N 14, certaines modifications comme en particulier
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une délétion, addition ou substitution d'au moins un acide aminé, une troncature, un allongement et/ou une fusion chimérique. Parmi les polypeptides homologues, on préfère ceux dont la séquence d'acides aminés présente au moins 90 % d'identité, de préférence 95 %, de manière préférée 97 %, et de manière encore préférée 99 % d'identité avec les séquences d'acides aminés des polypeptides selon l'invention.
Dans le cas d'une substitution, un ou plusieurs acides aminés consécutifs ou non consécutifs, sont remplacés par des acides aminés équivalents . L'expression acide aminé équivalent vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base sans cependant modifier les caractéristiques ou propriétés fonctionnelles essentielles des polypeptides correspondants, leurs activités biologiques, telles par exemple l'induction in vivo d'anticorps capables de reconnaître le polypeptide dont la séquence d'acides aminés est comprise dans la séquence d'acides aminés SEQ ID N 2, SEQ ID N 4, SEQ ID N 6, SEQ ID N 8, SEQ ID N 10, SEQ ID N 12 ou SEQ ID N 14, ou l'un de ses fragments. Ces acides aminés équivalents peuvent être déterminés soit en s'appuyant sur leur homologie de structure avec les acides aminés auxquels ils se substituent, soit sur les résultats des essais d'activité biologique croisée auxquels les différents polypeptides sont susceptibles de donner lieu. A titre d'exemple, on mentionnera les possibilités de substitutions susceptibles d'être effectuées sans qu'il en résulte une modification approfondie des activités biologiques des polypeptides modifiés correspondants, les remplacements, par exemple, de la leucine par la valine ou l'isoleucine, de l'acide aspartique par l'acide glutamique, de la glutamine par l'asparagine, de l'arginine par la lysine etc., les substitutions inverses étant naturellement envisageables dans les mêmes conditions. Ainsi, on peut envisager d'introduire certaines modifications comme en particulier une délétion, addition ou substitution d'au moins un acide aminé au niveau des hélices alpha de
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la protéine sans détruire le calice formé par la structure composée des feuillets bêta ; de la même manière, il est possible d'introduire des amino-acides équivalents qui permettent de conserver aux feuillets béta le caractère hydrophobe. Il peut également être intéressant d'introduire des modifications dans la séquence des polypeptides de l'invention pour générer des polypeptides homologues dépourvus de sites protéasiques.
Par fragment biologiquement actif, on entendra désigner en particulier un fragment de séquence d'acides aminés de polypeptide selon l'invention présentant au moins une des caractéristiques ou propriétés fonctionnelles des polypeptides selon l'invention, notamment en ce que : (i) il est capable d'être reconnu par un anticorps spécifique d'un polypeptide selon l'invention ou bien par des anticorps produits par des patients au cours d'une réaction immunitaire ; (ii) il présente au moins l'un des domaines ou régions tels que définis ci-après ; (iii) il est capable de lier un ligand hydrophobe et notamment des molécules odorantes, de préférence les phéromones ; (iv) il est capable de lier spécifiquement un récepteur.
Par fragment de polypeptide, on entend désigner un polypeptide comportant au minimun 15 acides aminés, de préférence 18 acides aminés, de manière préférée 25 et de manière encore préférée 50 acides aminés. Les fragments de polypeptide selon l'invention obtenus par clivage dudit polypeptide par une enzyme protéolytique, par un réactif chimique, ou encore en plaçant ledit polypeptide dans un environnement très acide font également partie de l'invention. Lorsque l'on souhaite utiliser une séquence de 15,18, 25 ou de 50 amino- acides, il s'agit bien entendu, de préférence, des parties correspondant à des épitopes fonctionnels des polypeptides précédents, lesquels pourront être intégrés dans un polypeptide ayant une structure plus longue sous forme par exemple de protéine de fusion, ceci dépendra des applications que l'on souhaite de ces polypeptides.
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Selon un mode préféré de réalisation, la présente invention concerne un polypeptide isolé sélectionné parmi un polypeptide correspondant à la séquence SEQ ID N 2 et dénommé OBPIIaa , à la séquence SEQ ID N 4 et dénommé OBPIIap , à la séquence SEQ ID N 6 et dénommé OBPIIaY , à la séquence SEQ ID N 10 et dénommé OBPIIba, à la séquence SEQ ID N 12 et dénommé OBPIIbp .
Les polypeptides selon l'invention se caractérisent en ce qu'ils comportent de préférence le domaine Gly-Thr-Trp-Tyr.
L'invention concerne également le polynucléotide isolé caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide tel que décrit précédemment. Le polynucléotide selon l'invention est choisi parmi le polynucléotide de séquence SEQ ID N 1, SEQ ID N 3 , SEQ ID N 5, SEQ ID N 7, SEQ ID N 9, SEQ ID N 11ou SEQ ID N 13.
L'invention porte également sur un polynucléotide isolé caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide choisi parmi : a) un polynucléotide de séquence SEQ ID N 1, SEQ ID N 3 , SEQ ID N 5, SEQ ID N 7, SEQ ID N 9, SEQ ID N 11ou SEQ ID N 13 ou dont la séquence est celle de l'ARN correspondant à la séquence SEQ ID N 1, SEQ ID N 3 , SEQ ID N 5, SEQ ID N 7, SEQ ID N 9, SEQ ID N 11ou SEQ ID N 13 ; b) un polynucléotide dont la séquence est complémentaire de la séquence d'un polynucléotide défini en a), c) un polynucléotide dont la séquence comporte au moins 80% d'identité, de préférence 90 %, de manière préférée 95 %, et de manière encore préférée 97 % d'identité avec un polynucléotide défini en a) ou b), d) un polynucléotide hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence de polynucléotide défini en a), b) ou c), e) un fragment d'au moins 15 nucléotides consécutifs, de préférence 21 nucléotides consécutifs, et de manière préférée 30 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide défini en a), b), c) ou d).
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Dans la présente description, on entendra désigner par polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique ou acide nucléique un fragment d'ADN, aussi bien un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADN, et/ou un fragment d'ARN, lesdits fragments naturels isolés, ou de synthèse, comportant ou non des nucléotides non naturels, désignant un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique.
Par polynucléotide de séquence complémentaire, on entend désigner tout ADN dont les nucléotides sont complémentaires de ceux de la SEQ ID N 1, SEQ ID N 3 , SEQ ID N 5, SEQ ID N 7, SEQ ID N 9, SEQ ID N 11, SEQ ID N 13 ou d'une partie de la SEQ ID N 1, SEQ ID N 3 , SEQ ID N 5, SEQ ID N 7, SEQ ID N 9, SEQ ID N 11, SEQ ID N 13 et dont l'orientation est inversée.
Par pourcentage d'identité au sens de la présente invention, on entend un pourcentage de bases identiques entre les polynucléotides obtenus après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux polynucléotides étant réparties au hasard et sur toute leur longueur.
Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie au sens de la présente invention, que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN complémentaires. A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes :
L'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation à 42 C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (1x SSC correspond à
L'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation à 42 C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (1x SSC correspond à
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une solution 0,15 M NaCl + 0,015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhard's, 5 % de dextran sulfate et 100 g/ml d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (i.e. : 42 C, pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20 C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20 C en 0,1x SSC + 0,1% SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1x SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60 C pour une sonde de taille > 100 nucléotides. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-avant pour un polynucléotide de taille définie, seront adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al.(1989).
Avantageusement, un fragment nucléotidique répondant à la définition précédente aura au moins 15 nucléotides consécutifs, de préférence au moins 21 nucléotides, et encore plus préférentiellement au moins 30 nucléotides consécutifs de la séquence dont il est issu.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le polynucléotide selon l'invention se caractérise en ce qu'il est marqué directement ou indirectement par un composé radioactif ou un composé non radioactif. Le polynucléotide selon l'invention est utilisé en tant qu'amorce pour l'amplification ou la polymérisation de séquences nucléiques ; l'invention porte également sur l'utilisation d'un polynucléotide selon l'invention en tant que sonde pour la détection de séquences nucléiques. Selon l'invention, les fragments de polynucléotides pouvant être utilisés comme sonde ou comme amorce dans des procédés de détection, d'identification, de dosage ou d'amplification de séquence nucléique, présenteront une taille minimale de 9 bases, de préférence de 18 bases, et de manière plus préférée 36 bases. Enfin, l'invention porte sur l'utilisation d'un polynucléotide selon l'invention en tant que oligonucléotide sens ou
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antisens pour contrôler l'expression du produit protéique correspondant en l'occurence un polypeptide selon l'invention.
Les séquences de polynucléotides selon l'invention non marquées peuvent être utilisées directement comme sonde, amorce ou oligonucléotide ; cependant les séquences utilisées sont généralement marquées pour obtenir des séquences utilisables pour de nombreuses applications. Le marquage des amorces, des sondes, des oligonucléotides selon l'invention est réalisé par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives ; parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 32P, le 33P, le 35S, le 3H ou le 1251.
Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels la biotine, l'avidine, la streptavidine, la dioxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémiluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents.
L'invention comprend également une méthode de détection et/ou de dosage d'acide nucléique selon l'invention, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : (i) d'isolement de l'ADN à partir de l'échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN de l'échantillon biologique ; (ii) d'amplification spécifique de l'ADN codant pour le polypeptide selon l'invention à l'aide d'amorces ; (iii) d'analyse des produits d'amplification.
L'invention comprend en outre un nécessaire pour la détection et/ou le dosage d'un acide nucléique selon l'invention, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : (i) un couple d'amorces nucléiques selon l'invention, (ii) les réactifs nécessaires pour effectuer une réaction d'amplification d'ADN, et éventuellement (iii) un composant permettant de vérifier la séquence du fragment amplifié, plus particulièrement une sonde selon l'invention.
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L'invention comprend aussi une méthode de détection et/ou de dosage d'acide nucléique selon l'invention, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : (i) de mise en contact d'une sonde selon l'invention avec un échantillon biologique ; (ii) de détection et/ou de dosage de l'hybride formé entre ladite sonde et l'ADN de l'échantillon biologique.
L'invention comprend également un nécessaire pour la détection et/ou le dosage d'acide nucléique selon l'invention, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : (i) une sonde selon l'invention, (ii) les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation, et le cas échéant, (iii) un couple d'amorces selon l'invention, ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN.
L'invention concerne particulièrement les procédés selon l'invention et décrits ci-dessus, pour la détection et le diagnostic de cellules d'origine cancéreuse et principalement cancers du sein, de l'utérus, de l'ovaire, de la prostate et du poumon.
Les polynucléotides selon l'invention peuvent ainsi être utilisés comme amorce et/ou sonde dans des procédés mettant en oeuvre notamment la technique PCR (réaction en chaîne à la polymérase)(Erlich, 1989 ; Innis et al., 1990, et Rolfs et al., 1991).
Cette technique nécessite le choix de paires d'amorces oligonucléotidiques encadrant le fragment qui doit être amplifié. On peut, par exemple, se référer à la technique décrite dans le brevet américain U.S. N 4 683 202. Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions. La spécificité de l'amplification peut être contrôlée par hybridation moléculaire en utilisant comme sonde les séquences nucléotidiques de polynucléotides de l'invention, des plasmides contenant ces séquences
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ou leurs produits d'amplification. Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être utilisés comme réactifs dans des réactions d'hybridation afin de mettre en évidence la présence, dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique cible de séquence complémentaire à celle desdits fragments nucléotidiques amplifiés.
L'invention vise également les fragments nucléotidiques susceptibles d'être obtenus par amplification à l'aide d'amorces selon l'invention.
D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternative à la PCR (PCR-like) à l'aide de couple d'amorces de séquences nucléotidiques selon l'invention. Par PCR-like on entendra désigner toutes les méthodes mettant en oeuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acides nucléiques, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés, ces techniques sont bien entendu connues, en général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase ; l'échantillon d'origine est un ARN il convient préalablement d'effectuer une transcription inverse. Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, comme par exemple la technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin (Walker et al., 1992), la technique TAS (Transcription-based Amplification System) décrite par Kwoh et al. en
1989, la technique 3SR (Self-Sustained Sequence Replication) décrite par Guatelli et al. en 1990, la technique NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) décrite par Kievitis et al. en 1991, la technique TMA (Transcription Mediated Amplification), la technique LCR (Ligase Chain Reaction) décrite par Landegren et al. en 1988 et perfectionnée par Barany et al. en 1991, qui emploie une ligase thermostable, la technique de RCR (Repair Chain Reaction) décrite par Segev en 1992, la technique CPR (Cycling Probe Reaction) décrite par Duck et al. en
1989, la technique 3SR (Self-Sustained Sequence Replication) décrite par Guatelli et al. en 1990, la technique NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) décrite par Kievitis et al. en 1991, la technique TMA (Transcription Mediated Amplification), la technique LCR (Ligase Chain Reaction) décrite par Landegren et al. en 1988 et perfectionnée par Barany et al. en 1991, qui emploie une ligase thermostable, la technique de RCR (Repair Chain Reaction) décrite par Segev en 1992, la technique CPR (Cycling Probe Reaction) décrite par Duck et al. en
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1990, la technique d'amplification à la Q-béta-réplicase décrite par Miele et al. en 1983 et perfectionnée notamment par Chu et al. en 1986 et Lizardi et al. en 1988, puis par Burg et al. (1996) ainsi que par Stone et al. (1996).
Dans le cas où le polynucléotide cible à détecter est un ARN, par exemple un ARNm, on utilisera avantageusement, préalablement à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification à l'aide des amorces selon l'invention ou à la mise en oeuvre d'un procédé de détection à l'aide des sondes de l'invention, une enzyme de type transcriptase inverse afin d'obtenir un ADNc à partir de l'ARN contenu dans l'échantillon biologique. L'ADNc obtenu servira alors de cible pour les amorces ou les sondes mises en oeuvre dans le procédé d'amplification ou de détection selon l'invention.
Les sondes nucléotidiques selon l'invention hybrident spécifiquement avec une molécule d'ADN ou d'ARN de polynucléotide selon l'invention, plus particulièrement avec les séquences SEQ ID N 1, SEQ ID N 3 , SEQ ID N 5, SEQ ID N 7, SEQ ID N 9, SEQ ID N 11 et SEQ ID N 13, dans des conditions d'hybridation de forte stringence telles que données sous forme d'exemple précédemment.
La technique d'hybridation peut être réalisée de manières diverses (Matthews et al., 1988). La méthode la plus générale consiste à immobiliser l'acide nucléique extrait des cellules de différents tissus ou de cellules en culture sur un support (tel que la nitrocellulose, le nylon, le polystyrène) et à incuber, dans des conditions bien définies, l'acide nucléique cible immobilisé avec la sonde. Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont détectées par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde).
Selon un autre mode de mise en oeuvre des sondes nucléiques selon l'invention, ces dernières peuvent être utilisées comme sonde de capture. Dans ce cas, une sonde, dite sonde de capture , est
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immobilisée sur un support et sert à capturer par hybridation spécifique l'acide nucléique cible obtenu à partir de l'échantillon biologique à tester et l'acide nucléique cible est ensuite détecté grâce à une seconde sonde, dite sonde de détection , marquée par un élément facilement détectable.
Dans un mode préféré de réalisation, l'invention comprend l'utilisation d'un oligonucléotide sens ou antisens pour contrôler l'expression du produit protéique correspondant. Parmi les fragments d'acides nucléiques intéressants, il faut citer en particulier les oligonucléotides anti-sens, c'est-à-dire dont la structure assure, par hybridation avec la séquence cible, une inhibition de l'expression du produit correspondant. Il faut également citer les oligonucléotides sens qui, par interaction avec des protéines impliquées dans la régulation de l'expression du produit correspondant, induiront soit une inhibition, soit une activation de cette expression. Les oligonucléotides selon l'invention présentent une taille minimale de 9 bases, de préférence de 18 bases, et de manière plus préférée 36 bases.
L'invention concerne un vecteur recombinant de clonage d'un polynucléotide selon l'invention et/ou d'expression d'un polypeptide selon l'invention caractérisé en ce qu'il contient un polynucléotide selon l'invention tel que précédemment décrit. Le vecteur selon l'invention est caractérisé en ce qu'il comporte les éléments permettant l'expression desdites séquences dans une cellule hôte et éventuellement la sécrétion desdites séquences hors de la cellule hôte.
Par vecteur d'expression , on entend aussi bien des vecteurs d'expression à réplication autonome du type plasmide que des systèmes destinés à assurer l'intégration dans les cellules, mais ces vecteurs d'expression pourront être également des vecteurs d'expression de type viral ou bien même, lorsque l'on souhaite réaliser par exemple de la thérapie génique, de l'ADN nu. Parmi les vecteurs viraux, on préfère ceux dérivés de l'adénovirus, du virus associé à
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l'adénovirus (AAV), de rétrovirus, des lentivirus, et de préférence les dérivés de HIV, des poxvirus, du virus de l'herpes pour l'expression en système eucaryote. Parmi les vecteurs non viraux, on préfère les polynucléotides nus tels que l'ADN nu ou l'ARN nu selon la technique développée par la société VICAL, les chromosomes artificiels de levure (YAC, yeast artificial chromosome) pour l'expression dans la levure, les chromosomes artificiels de souris (MAC, mouse artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules murines et de manière préféré les chromosomes artificiels d'homme (HAC, human artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules humaines.
Selon un mode particulier de réalisation, le vecteur selon l'invention comporte des éléments de contrôle de l'expression des polypeptides ; ces éléments de contrôle sont choisis de préférence parmi (i) la séquence promotrice du gène hOBPIIa selon l'invention qui correspond à la séquence SEQ ID N 15 et/ou parmi la séquence promotrice du gène hOBPIIb selon l'invention qui correspondant à la séquence SEQ ID N 16 ; (ii) un polynucléotide dont la séquence est complémentaire à la séquence SEQ ID N 15 et SEQ ID N 16 ; (iii) un polynucléotide dont la séquence comporte au moins 80% d'identité avec un polynucléotide défini en (i) ou (ii) ; (iv) un polynucléotide hybridant dans des conditions de forte stringence avec la séquence de polynucléotide définie en (i), (ii), (iii). Les outils informatiques à la disposition de l'homme du métier lui permettent aisément d'identifier les boites régulatrices promotrices nécessaires et suffisantes au contrôle de l'expression génique, notamment les boites TATA, CCAAT, GC, ainsi que les séquences régulatrices stimulatrices ( enhancer ) ou inhibitrices ( silencers Il) qui contrôlent en CIS l'expression des gènes selon l'invention ; parmi ces séquences régulatrices, il convient de citer l'IRE, MRE, CRE.
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Il est également dans l'étendue de l'invention d'utiliser les éléments ci-dessus définis et choisis parmi la séquence SEQ ID N 15 et/ou SEQ ID N 16 pour contrôler l'expression de polypeptides hétérologues autres que ceux de l'invention et notamment pour diriger l'expression de polypeptides hétérologues dans les types cellulaires dans lesquels les polypeptides selon l'invention s'expriment normalement.
L'invention comprend en outre les cellules hôtes, notamment les cellules eucaryotes et procaryotes, caractérisées en ce qu'elles sont transformées par les vecteurs selon l'invention. De préférence, les cellules hôtes sont transformées dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant selon l'invention. L'hôte cellulaire peut être choisi parmi les cellules bactériennes mais également parmi les cellules de levure, de même que parmi les cellules végétales et animales ; de préférence, l'hôte cellulaire est une cellule de mammifères (Edwards et Aruffo, 1993), mais également une cellule d'insectes dans laquelle on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre des baculovirus par exemple (Luckow, 1993). Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci- dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée.
Selon un mode particulier de réalisation, l'invention porte également sur un animal ou une plante transgénique qui comporte des cellules hôtes selon l'invention.
L'invention concerne également une méthode de préparation d'un polypeptide caractérisé en ce qu'il met en #uvre un vecteur selon l'invention. Plus particulièrement, l'invention porte sur une méthode de préparation d'un polypeptide recombinant caractérisé en ce que l'on cultive des cellules transformées selon l'invention dans des conditions
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permettant l'expression dudit polypeptide recombinant et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.
Le polypeptide selon l'invention est susceptible d'être obtenu selon un procédé de l'invention et selon les techniques de production de polypeptides recombinants connues de l'homme du métier. La présente invention concerne donc le polypeptide recombinant susceptible d'être obtenu par la méthode ci-dessus présentée. Dans ce cas, la séquence d'acide nucléique utilisée est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire. Un système efficace de production d'un polypeptide recombinant nécessite de disposer d'un vecteur, par exemple d'origine plasmidique ou virale, et d'une cellule hôte compatible. Le vecteur doit comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Il doit pouvoir être maintenu de façon stable dans la cellule et peut éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion du polypeptide traduit. Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences d'acide nucléique selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi. De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards telles par exemple la transfection par précipitation au phosphate de calcium, la lipofection, l'électroporation, le choc thermique.
Les polypeptides recombinants obtenus comme indiqué ci- dessus, peuvent aussi bien se présenter sous forme glycosylée que non glycosylée et peuvent présenter ou non la structure tertiaire naturelle.
Les polypeptides obtenus par synthèse chimique et pouvant comporter des acides aminés non naturels correspondant auxdits
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polypeptides recombinants, sont également compris dans l'invention.
Les peptides selon l'invention peuvent également être préparés par les techniques classiques, dans le domaine de la synthèse des peptides.
Cette synthèse peut être réalisée en solution homogène ou en phase solide.
Les procédés de purification de polypeptide recombinant utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immuno-affinité à l'aide d'anticorps mono- ou polyclonaux spécifiques, etc. Une variante préférée consiste à produire un polypeptide recombinant fusionné à une protéine porteuse (protéine chimère). L'avantage de ce système est qu'il permet une stabilisation et une diminution de la protéolyse du produit recombinant, une augmentation de la solubilité au cours de la renaturation in vitro et/ou une simplification de la purification lorsque le partenaire de fusion possède une affinité pour un ligand spécifique.
La présente invention concerne l'utilisation d'un polypeptide choisi parmi un polypeptide hOBPIIa et hOBPIIb selon l'invention ou l'un de leur fragment et parmi LCN 1, la rétinol binding protein (RBP) et l'apolipoprotéine D (ApoD) comme protéine de liaison à un ligand hydrophobe, de préférence une molécule odorante. En effet, outre les polypeptides OBPII mentionnés précédemment, la fonction OBP des lipocalines LCN1, RBP et ApoD n'a jamais été suggérée. En effet, si la présence de LCNdans le mucus nasal a été décrite (Redl et al., 1992), c'est en fait une autre fonction qui lui a été attribuée, à savoir une fonction d'anti-protéase, alors que la fonction principale de la protéine LCN1semble bien être le transport de ligands hydrophobes, d'ailleurs les essais réalisés dans le cadre de la présente invention avec une protéine LCN1recombinante n'ont pas permis de mettre en évidence
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une activité anti-protéase. Il en va de même pour la rétinol- binding protein et l'apolipoprotéine D qui n'ont jamais été présentées comme ayant une fonction OBP.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un polypeptide selon l'invention ou l'un de ses fragments, LCN1, RBP et l'apolipoprotéine D comme inhibiteur compétitif, comme agoniste ou antagoniste des récepteurs cellulaires aux lipocalines. L'utilisation d'inhibiteur de liaison des lipocalines à leur récepteur peut être utilisée dans une stratégie anti-cancéreuse ; en effet, un certain nombre de tumeurs sont hormono-dépendantes : ainsi les tumeurs du sein sont sensibles aux stéroïdes; ces stéroïdes étant transportés par les lipocalines, il est dans l'étendue de l'invention de fournir des inhibiteurs de liaison aux polypeptides selon l'invention et LCN1, OBP ou APO-D pour éviter la fixation des hormones stéroïdes au niveau des récepteurs des cellules tumorales.
L'invention concerne également un anticorps monoclonal ou polyclonal et ses fragments, caractérisés en ce qu'ils lient spécifiquement un polypeptide selon l'invention. Les anticorps chimériques, les anticorps humanisés et les anticorps simple chaîne font également partie de l'invention. Les fragments d'anticorps selon l'invention sont de préférence des fragments Fab ou F(ab')2.
Les polypeptides selon l'invention permettent de préparer des anticorps monoclonaux ou polyclonaux. Les anticorps monoclonaux pourront avantageusement être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par Kohler et Milstein en 1975. Les anticorps polyclonaux pourront être préparés, par exemple par immunisation d'un animal, en particulier une souris, avec un polypeptide selon l'invention associé à un adjuvant de la réponse immunitaire, puis purification des anticorps spécifiques contenus dans le sérum des animaux immunisés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été fixé le polypeptide ayant servi d'antigène. Les
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anticorps polyclonaux selon l'invention peuvent aussi être préparés par purification sur une colonne d'affinité, sur laquelle a préalablement été immobilisé un polypeptide selon l'invention.
L'invention porte également sur un anticorps monoclonal spécifique d'un polypeptide selon l'invention et capable d'inhiber l'interaction entre ledit polypeptide et le récepteur cellulaire sur lequel se lie spécifiquement ledit polypeptide. Selon un autre mode de réalisation, l'anticorps monoclonal selon l'invention est capable d'inhiber l'interaction entre ledit polypeptide et ses ligands hydrophobes, de préférence les molécules odorantes et de manière préférée les phéromones avec lesquelles ledit polypeptide se lie.
Les anticorps de l'invention pourront également être marqués de la même manière que décrit précédemment pour les sondes nucléiques de l'invention et de manière préférée avec un marquage de type enzymatique, fluorescent ou radioactif. De tels anticorps marqués pourront être utilisés pour la détection de ces polypeptides dans un échantillon biologique. De préférence, l'échantillon biologique est constitué par un fluide par exemple du sérum, du sang ou des biopsies humaines. Ils constituent ainsi un moyen d'analyse de l'expression de polypeptide selon l'invention, par exemple par immunofluorescence, marquage à l'or, immunoconjugués enzymatiques.
Plus généralement, les anticorps de l'invention peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où l'expression d'un polypeptide selon l'invention doit être observée, et plus particulièrement en immunocytochimie, en immunohistochimie ou dans des expériences de western blotting , dans les techniques ELISA et RIA. Il est ainsi dans l'étendue de l'invention de fournir une méthode de détection et/ou de dosage d'un polypeptide selon l'invention, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes de mise en contact de l'échantillon
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biologique avec des anticorps selon l'invention puis de mise en évidence du complexe antigène-anticorps formé.
Entre également dans le cadre de l'invention, un nécessaire pour la détection et/ou le dosage d'un polypeptide selon l'invention dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants : (i) un anticorps monoclonal ou polyclonal tel que décrit précédemment ; (ii) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique ; (iii) les réactifs permettant la détection des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique. Ce nécessaire est notamment utile à la réalisation d'expériences de Western Blotting et aux expériences d'immunoprécipitation.
Les hOBPII selon la présente invention peuvent être utilisées dans de nombreuses applications.
Les premières applications des OBP résident dans le contrôle des odeurs ; ces applications concernent essentiellement l'hygiène corporelle (parfumerie, cosmétologie, pharmacie) ou collective.
Elles peuvent être utilisées dans un procédé pour contrôler la volatilisation d'une odeur ; un tel procédé se caractérise en ce qu'il comprend une étape de liaison de ladite odeur avec un polypeptide selon l'invention ou avec les protéines LCN1, RBP ou l'apolipoprotéine D.
Il est également possible de fixer l'odeur sur un support solide en utilisant une OBPII selon l'invention attachée audit support, cette fixation pouvant être aussi bien une fixation covalente que non covalente, par exemple par adsorption ou par des fixations de type avidine-biotine, si cela est nécessaire. Dans ces conditions, on obtient un support parfumé retenant les odeurs plus longtemps, libérant progressivement les odeurs et pouvant être utilisé aussi bien dans le domaine cosmétique que dans le domaine des produits d'entretiens en général. Les supports utilisés pourront être des supports de type
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plaque ou de type bille par exemple. Bien entendu, les OBPII selon la présente invention seront plus particulièrement utilisables dans l'industrie de la parfumerie et de la cosmétique où les OBP seront utilisées sous forme d'un mélange liquide destiné à contrôler la volatilisation des odeurs après que la composition ait été répandue sur la peau humaine. Ceci permet de prolonger la tenue des parfums ou d'entrer dans la composition des déodorants corporels notamment.
Bien entendu, le terme parfum englobe de façon générale les mélanges connus en parfumerie, à base d'alcool ou sous forme aqueuse, et contenant notamment des huiles essentielles. Le polypeptide selon l'invention peut également entrer dans la composition de crèmes à base de rétinol en tant qu'agent de transport et de protection dudit rétinol pour des applications cosmétologiques et notamment pour prévenir, effacer et traiter les rides, les ridules de la peau, lutter contre le relâchement cutané et/ou sous-cutané.
Parmi les applications concernant l'hygiène collective, le procédé selon l'invention peut être utilisé dans un dispositif visant à désodoriser les locaux tels par exemple les animaleries, les étables. Un tel dispositif peut également être envisagé pour désodorisé le flux d'air entrant dans un appareil à air conditionné ; un tel dispositif serait très utile dans les zones géographiques polluées.
L'invention concerne également un procédé de criblage de molécule, de préférence les odeurs ou saveurs qui comprend de passer la molécule sur un substrat qui comprend un polypeptide selon l'invention ou, LCN l, RBP et l'apolipoprotéine D lié audit substrat, ledit polypeptide liant ladite odeur ou saveur et de récupérer ladite odeur ou saveur depuis le polypeptide si nécessaire. Les OBP selon l'invention pourraient ainsi permettre l'isolement d'odeurs ou de parfums en les fixant sur un support tel que décrit précédemment mais qui, dans ce cas, pourra être par exemple une colonne de chromatographie, en faisant passer sur celle-ci le produit sur lequel on souhaite capter les
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odeurs. Il est bien entendu possible, toujours dans ce même type d'application, d'effectuer une analyse d'un parfum complexe en utilisant les différences de rétention des différents produits par les OBP.
Le procédé d'isolement décrit précédemment peut également être utilisé pour séparer des odeurs particulières, notamment les phéromones humaines.
Les hOBPII selon la présente invention peuvent être utilisées pour des applications agro-alimentaires ou industrielles.
Les OBP selon la présente invention de part leurs caractéristiques peuvent permettre de solubiliser certaines molécules lipophiles en les associant avec lesdits OBP. Ainsi les polypeptides selon l'invention peuvent être utilisés en combinaison avec des acides gras alimentaires à titre d'additif alimentaire. La présente invention concerne un procédé pour solubiliser des molécules lipophiles caractérisé en ce qu'il comprend la liaison de ladite molécule lipophile à un polypeptide selon l'invention, à LCN1, RBP ou à l'apoD.
Les OBPII, de même que LCN1, RBP et ApoD sont susceptibles d'être impliquées dans le transport des acides gras et dans les mécanismes biologiques permettant la détection de la charge en acides gras de la ration alimentaire, au niveau buccal notamment. L'invention concerne donc également l'utilisation des polypeptides précédents en association avec des acides gras pour diminuer la consommation d'acides gras, notamment dans les hyperlipidémies ou les obésités. Les polypeptides précédents peuvent dont être utilisés pour le traitement des hyperlipidémies et de l'obésité. En effet, ces protéines participent à la détection de la teneur en acides gras dans la prise alimentaire (Gilbertson, 1998), un excès de ces protéines doit conduire à leurrer le système physiologique détectant la charge en gras d'une ration alimentaire. Ainsi, une portion alimentaire pauvre en graisse mais supplémentée en OBP ou ApoD ou RBP ou LCN1 préalablement
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chargées en acide gras, sera faussement identifiée comme riche en graisse.
Une autre application est de complémenter un lait non maternel avec un ou plusieurs des polypeptides décrits précédemment.
Les OBP selon la présente invention peuvent être utilisées en thérapie préventive et curative.
Ainsi, l'absence de détection de ce type de protéines dans un prélèvement biologique en utilisant un anticorps, une amorce, une sonde selon l'invention pourrait être un élément de diagnostic des anosmies.
De même, il est possible de prévoir la détection des anticorps anti-OBPII dans un échantillon biologique d'origine humaine, la présence ou le dosage de ces anticorps pourrait être en rapport avec certains types d'allergies, notamment chez les asthmatiques. Dans ce cas, il pourrait être possible de traiter ce type d'allergie par administration de fragments de polypeptides tels que décrits, ce qui diminuerait les réactions immunitaires aux allergies externes.
L'invention concerne donc un procédé de détection d'anticorps dirigé contre les OBPII humaines (hOBPII) dans le sérum humain de patient allergique et/ou asthmatique en utilisant un polypeptide hOBPII selon l'invention.
Selon un autre mode de réalisation, l'invention concerne un procédé de détection d'anticorps dirigé contre les OBPII humaines (hOBPII) dans un fluide biologique de patient atteint d'un cancer, et notamment du cancer de la prostate et/ou du cancer du sein et/ou du cancer de l'utérus et/ou de l'ovaire et/ou du poumon. En effet, les protéines selon l'invention sont sur-exprimées dans les tumeurs et notamment dans le cancer de la prostate (US 5804368, WO 97 10503, CS 84 02898, CS 83 02012, CS 82 08506, CS 82 08215), le cancer du sein (Stoecz et Gould, 1995 ; et al., 1992), le cancer de l'utérus, le cancer de l'ovaire, le cancer du poumon.
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Les OBP selon la présente invention peuvent également être utilisées dans des compositions pharmaceutiques, ceci notamment afin de vectoriser certaines drogues.
En effet, les lipocalines sont utilisées par les mammifères pour transporter des molécules hydrophobes au sein de fluides biologiques.
Il semble même que ce soit les transporteurs naturels des xénobiotiques in vivo. Pour exemple, une surcharge expérimentale en xénobiotiques crée chez le rat mâle des tumeurs au niveau du tube contourné proximal (TCP) du néphron (Borghoff et al., 1990). En effet, les protéines MUP, seulement produites chez le rat mâle, sont réabsorbées par les cellules TCP ; après dégradation lysosomiale, les protéines MUP libèrent les xénobiotiques qu'elles transportaient. Ceux- ci s'accumulent dans ces cellules et les conduisent vers une voie tumorale par mutagenèse. Les lipocalines semblent donc être la structure idéale pour piéger en leur calice une molécule utilisée comme médicament, évitant ainsi une distribution générale de celui-ci. Ainsi, G. Beste et al.(1999) et la demande WO 99 16873 décrivent une stratégie de mutagenèse et de criblage permettant d'identifier des variants d'une lipocaline ayant une affinité optimale pour un ligand donné. Il est donc possible de créer une cage à médicament hautement spécifique.
La présente invention concerne donc un polypeptide selon l'invention en tant qu'agent de ciblage de composé pharmaceutique.
Par agent de ciblage, on entend désigner les polypeptides de l'invention capables d'assurer le transport et la libération du ligand auxquels ils sont liés au niveau de certains tissus ou cellules cibles qui possèdent à leur surface des récepteurs auxdits polypeptides. Ainsi, l'invention concerne le transport de médicament au sein de la cage d'un polypeptide selon l'invention et du ciblage de cellules grâce à la capacité de l'OBPII à se fixer à un récepteur spécifique.
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Il est également dans l'étendue de l'invention de développer des protéines de fusion ou des protéines chimériques comportant la cage correspondant aux lipocalines selon l'invention associées à une protéine permettant un adressage cellulaire spécifique généralement différent de celui naturel des OBPII. La présente invention a donc pour objet un polypeptide caractérisé en ce que ledit polypeptide est exprimé sous la forme d'une protéine de fusion avec une protéine permettant un adressage cellulaire spécifique. Parmi les protéines permettant un adressage cellulaire spécifique, il convient de citer les interleukines, les cytokines, les lymphokines, les chémokines, les facteurs de croissance, les hormones, les anticorps mono- ou polyclonal. Les interleukines, cytokines et lymphokines sont choisies dans un groupe composé de préférence des interleukines Il-1à 11-20, des interférons a-IFN, p-IFN et Y-IFN. Les facteurs de croissance sont de préférence les facteurs stimulateurs des colonies (colony stimulating factors) G-CSF, GM-CSF, M-CSF et l'érythropoïétine. Les hormones sont choisies de préférence parmi les hormones stéroïdiennes.
Selon un autre mode de réalisation, le polypeptide selon l'invention en tant qu'agent de ciblage de composé pharmaceutique est associé à une molécule permettant un adressage cellulaire spécifique.
Parmi, les molécules permettant un adressage cellulaire spécifique, il convient de citer le groupe des stéroïdes, des interleukines, des cytokines, des lymphokines, des interférons, des facteurs de croissance, des hormones, des anticorps. De préférence, la molécule est un stéroïde. L'association entre le polypeptide selon l'invention et ladite molécule est réalisée soit par une liaison non covalente en utilisant par exemple le système avidine-biotine ou soit par une liaison covalente en utilisant par exemple des agents chimiques pontants.
Parmi les composés pharmaceutiques que peut transporter et cibler le polypeptide selon l'invention, il convient de citer les médicaments et notamment les agents anticancéreux. Les agents anti-
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cancéreux sont sélectionnés parmi le groupe des agents antiprolifératifs, antinéoplastiques ou cytotoxiques et sont utilisés pour arrêter le développement des cancers et pour induire une régression et/ou une élimination de la masse tumorale. Ces agents anticancéreux sont de préférence des radioisotopes, et de manière encore préférée des radioisotopes émetteurs de rayons gamma tels que l'Iode131, l'Yttrium90, l'Or199, le Palladium 100, le Cuivre67, le Bismuth217 et l'Antimoine211. Les radioisotopes émetteurs de rayons beta et alpha peuvent également être utilisés pour la thérapie. Les agents anticancéreux non isotopiques liés au polypeptide selon l'invention sont multiples et variés ; peut citer : (i)les antimétabolites telles les agents anti-folate, le méthotrexate, (ii) les analogues des purines et des pyrimidines (mercaptopurine, fluorouracile, 5-azacytidine), (iii) les antibiotiques, (iv) les lectines (ricine, abrine) et (iv) les toxines bactériennes (toxine diphtérique) ; les toxines sont choisies de préférence parmi l'exotoxine A de Pseudomonas, la toxine diphtérique, la toxine cholérique, la toxine anthrox de Bacillus, la toxine Pertussis, la toxine Shiga de Shigella, la toxine apparentée à la toxine Shiga, les toxines d'Escherichia coli, la colicine A, la d-endotoxine, l'hémagglutinine d'Haemophilus A.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un composé pharmaceutique lié au moins à un polypeptide selon l'invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Il est également dans l'étendue de l'invention d'augmenter la capacité de fixation par mutagenèse de cette même protéine. L'invention concerne une composition pharmaceutique telle que définie précédemment pour le traitement du cancer, et notamment le cancer de la prostate, le cancer du sein, le cancer de l'utérus, le cancer de l'ovaire, le cancer du foie et le carcinome des cellules épithéliales pulmonaires. Etant donné que l'OBP dénommée hOBPIIb, l'apolipoprotéine D, la RBP et l'a-1-acide glycoprotéine sont
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exprimées dans la prostate, la composition pharmaceutique selon l'invention est destinée au traitement du cancer de la prostate. De même, étant donné qu'il a été démontré que l'ARNm des protéines ApoD, RBP et LCN1est produit dans la glande mammaire en plus de la production de hOBPIIb déjà décrit dans la demande WO 99 07740, la composition pharmaceutique selon l'invention est destinée au traitement du cancer du sein.
L'invention porte aussi sur un polypeptide selon l'invention en tant que transporteur de composé pharmaceutique. Par transporteur, on entend désigner des polypeptides selon l'invention capable de véhiculer dans l'organisme un composé pharmaceutique sans que ledit composé ne soit libéré à un endroit privilégié dans l'organisme. Un tel polypeptide constitue un moyen de délivrance dudit composé pharmaceutique dans l'organisme.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique selon l'invention caractérisé en ce que ledit polypeptide constitue une forme retard de délivrance dudit composé pharmaceutique dans l'organisme.
En effet le composé pharmaceutique d'intérêt lié au polypeptide OBPII selon l'invention diffuse progressivement dans l'organisme à mesure que ledit polypeptide transporteur est catabolisé dans l'organisme. L'utilisation des techniques de l'ADN recombinant permet à l'homme de l'art de modifier la durée de demi-vie du polypeptide OBPII dans l'organisme en introduisant des modifications dans ledit polypeptide. Ainsi, il peut être intéressant de développer un polypeptide homologue selon l'invention pour lequel les sites de coupures protéasiques ont été mutés afin d'augmenter la demi-vie dudit polypeptide dans l'organisme. Il peut être également intéressant de développer un polypeptide multimérique, exprimé par exemple sous la forme d'une protéine de fusion, afin d'éviter une fuite
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glomérulaire (clearance rénale) et ainsi d'augmenter la demi-vie dudit polypeptide dans l'organisme.
Selon un autre aspect, l'invention concerne un composé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi un anticorps, un polypeptide, un ligand, un polynucléotide, un oligonucléotide ou un vecteur selon l'invention à titre de médicament et notamment en tant que principes actifs de médicament ; ces composés seront préférentiellement sous forme soluble, associés à un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Par véhicule pharmaceutiquement acceptable, on entend désigner tout type de véhicule employé habituellement dans la préparation de compositions injectables, c'est-à-dire un diluant, un agent de suspension tel une solution saline isotonique ou tamponnée. De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique ou par voie orale. Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés, etc.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un vecteur d'expression selon l'invention et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Il est également possible d'utiliser la propriété d'expression dans des sites particuliers de ces protéines afin d'assurer une imagerie et/ou un diagnostic de certains types de cancer.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci-après.
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FIGURES FIGURE 1 : Organisation génomique du locus LCNl/hOBPII
La ligne du haut représente la région du chromosome 9q34. La double flèche indique l'intervalle entre la localisation des marqueurs polymorphes D9S 1811 et D9S67 ; position relative des marqueurs D9S67 et D9S 1826 est incertaine.
La ligne du haut représente la région du chromosome 9q34. La double flèche indique l'intervalle entre la localisation des marqueurs polymorphes D9S 1811 et D9S67 ; position relative des marqueurs D9S67 et D9S 1826 est incertaine.
Le niveau du milieu indique l'organisation partielle des cosmides à 3 loci différents : LCNlc, LCN1b-hOBPIIb, LCNl-hOBPna. Les cosmides (approximativement 40 kb) sont représentés par des lignes horizontales avec leur nom et les bras des vecteurs T3 ou T7 notés au- dessous de la ligne. Les flèches représentent les différents gènes ou pseudogènes avec leur orientation respective. Dans les cosmides, les lignes en pointillés verticales représentent les sites EcoRI. Le symbole # indique une orientation incertaine du locus.
Le niveau inférieur montre les structures intron/exon des gènes LCNet hOPBII : les boîtes noires représentent les exons ; les flèches représentent le site d'initiation de la transcription ; oll à ol5 représentent les sondes d'oligonucléotides utilisées pour cribler les cosmides ; Alu représente la présence de séquences répétées.
FIGURE 2 : Analyse "Dot Plot" de : (A) séquence locus LCN1-hOBPIIa (AC000396+ACXXXXX) contre locus LCNlb-hOBPIIb (AC002098) ; (B) séquence locus LCNl-hOBPIIa (AC000396+ACXXXXX) contre séquence locus LCNlc ; (C) séquence locus LCNlb-hOPBIIb (AC002098) contre séquence locus LCNlc (AC002106).
Des séquences génomiques ont été filtrées pour les séquences répétitives à l'aide de Repeatmasker (REF), puis comparées et
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dotplotted avec le logiciel gcg en utilisant une taille de fenêtre de 25, et un critère de 20 avec une homologie de 80%.
FIGURE 3 : Séquence nucléotidique de gènes hOBPII.
Les lignes supérieures représentent la séquence hOBPIIa et les lignes inférieures la séquence hOBPIIb pour laquelle seuls les nucléotides différents sont représentés ; un tiret indique l'absence de séquences correspondantes. Les capitales ombrées sont les séquences exoniques et les lettres minuscules les séquences introniques. Les tailles indiquées sur la gauche sont indiquées en pb. La boîte TATA est en caractères gras et le signal de polyadénylation est souligné. Les boîtes indiquent les sites accepteurs d'épissage pour les exons 5, 5b, 5c.
FIGURE 4 : Représentation schématique des deux gènes hOBPII et de leur ARNm correspondants.
Les lignes horizontales représentent l'organisation exon/intron avec des tailles indiquées en pb. Les boîtes ombrées numérotées de 1 à 7 sont les séquences exoniques codantes des principaux transcrits ; les lettres b et c font référence à des exons surnuméraires. Les différents transcrits sont représentés à l'aide de boîtes assemblées : les premières, hOBPIIa[alpha] et hOBPIIba correspondent aux transcrits principaux, les autres correspondent aux formes issues d'un épissage alternatif. 1 indique un décalage du cadre de lecture résultant de l'insertion ou de la délétion d'un exon et * représente un codon stop. La lettre a représente une hélice a et b des feuilles P prédis par le logiciel DSC. Les lettres en italique sont des prédictions obtenues avec le logiciel "Predator".
FIGURE 5 : Alignement des séquences des protéines issues des deux gènes hOPBIIa et hOBPIIb humains (hOBPIIaa =
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OBP2aaHOMS, hOBPIIba = OPB2baHOMSA, hOBPIIbp OPB2bbHOMSA, hOBPIIay = OBP2agHOMSA, hOBPIIap OBP2abHOMSA), des lipocalines des larmes humaines (LCN1~HOMSA), d'OBPII de rat (OBP2~RATNO), de lactoglobuline bovine BLG (LACB~BOSTA), de MUP de souris (MUP6~MUSMU), de RBP humaine (RBP~HOMSA), d'OBP bovine (OBP~BOSTA), de MUP de rat (MUP-RATNO), d'OBP porcine (OPB~SUSSC).
Les résidus dans les boîtes gris foncé sont identiques et ceux dans les boîtes gris claires sont similaires. Les éléments de structure secondaire prédits avec le programme DSC sont soulignés et les résidus d'amino-acides sont en italiques. Les feuillets P et les hélices a sont numérotées pour hOPBIIa et b. Le site de clivage prévu du peptide signal est indiqué par une flèche (AAALS) en position 15. Des séquences non alignées de formes très divergentes de gènes épissés, hOPBaô (OPB2adHOMSA) et hOBPby (OBP2bgHOMSA) ont été ajoutées au bas de l'alignement après l'analyse.
FIGURE 6 : Analyse RT-PCR (A) Détection des produits RT-PCR LCN1, LCNlb, LCNlc avec leurs sondes spécifiques, et (B) Détection des produits RT-PCR hOBPIIa et hOBPIIb avec leurs sondes spécifiques. (C) ARN G3PDH contrôle. Les tailles sont indiquées en pb.
FIGURE 7 : Localisation tissulaire des ARNm hOBP
Des sections du méat moyen (A, B), des cornets (C, D), de la prostate (E, F), des canaux déférents (G, H), des glandes mammaires (I, J) ont été hybridées à des ribosondes de hOBP marquées à la digoxigénine-11-UTP. L'hybridation avec une ribosonde hOBP sens n'a pas révélé de signal (B, D,F,H, J). Un signal d'hybridation spécifique est obtenu avec une ribosonde antisens (A, C,E,G, I). Les flèches indiquent
Des sections du méat moyen (A, B), des cornets (C, D), de la prostate (E, F), des canaux déférents (G, H), des glandes mammaires (I, J) ont été hybridées à des ribosondes de hOBP marquées à la digoxigénine-11-UTP. L'hybridation avec une ribosonde hOBP sens n'a pas révélé de signal (B, D,F,H, J). Un signal d'hybridation spécifique est obtenu avec une ribosonde antisens (A, C,E,G, I). Les flèches indiquent
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des structures différentes : AC : cellules acineuses, EC : cellules épithéliales, GC : cellules glandulaires, SD : canal sécrétoire et L : lumen (X200).
FIGURE 8 : de distance phylogénétique des lipocalines des vertébrés.
Les abréviations usuelles des lipocalines ont été employées. Après le symbole "~" sont indiquées les trois premières lettres du genre suivies des deux premières lettres de l'espèce.
FIGURE 9 :Schéma de l'évolution de la sous-famille de gène LCN1- OBPII au cours de l'évolution.
Les boites indiquent les exons disposés sur une ligne représentant l'ADN génomique. Les // entre les lignes indiquent que les loci ne sont pas consécutifs, sans qu'il soit possible de déterminer l'ordre. La large croix sous le symbole ? illustre un événement de duplication partielle ou de complète duplication avec une délètion génomique ultérieure pour le locus LCNlc (choix indiqué par le symbole * ). La croix plus petite indique l'élimination du septième exon qui semble être spécifique de l'homme à cause des nombreuses séquences répétées Alu présentent dans cette région génomique et parce que le rat a deux gènes VEGP. Le symbole ** marque l'étape de recrutement d'exons basée sur les données présentes et celles de la littérature ; cette étape a pu apparaître à n'importe qu'elle moment après les duplications des loci et a pu être séquentielle.
FIGURE 10 : Analyse par RT-PCR dans la sphère orale et la sphère génitale de l'expression des autres lipocalines humaines connues.
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Définition de nouvelles fonctions OBP et VEGP pour les protéines RBP (retinol-binding-protein) et ApoD (apoliporotéine D).
FIGURE 11 : Etude de l'anticorps polyclonal dirigé contre les protéines hOBPII.
La protéine de fusion est déposée dans les puits 1 et 3. Un échantillon de mucus nasal humain est déposé dans les puits 2 et 4. Les protéines contenues dans les puits 1 et 2 ont été révélées par coloration au bleu de Coomassie. L'anticorps hybridé sur la membrane obtenue par Western-blotting révèle spécifiquement la protéine GST-hOBPIIb entre 30 et 42 kDa (puit 3) et les hOBPIIa et hOBPIIb (puit 4) de 18 kDa dans le mucus nasal humain.
FIGURE 12: Immunohistochimie sur les tissus de l'appareil olfactif.
Une forte immunoréactivité est repérable sur la coupe de septum (coloration verte, A) sur les deux coupes de cornet (C et D) et sur la coupe de méat moyen (F). Les témoins négatifs réalisés pour le septum (B) et pour le cornet (E) et pour le méat moyen (G) ne montrent aucune réactivité. Les noyaux des cellules sont repérés par une coloration au DAPI (coloration bleue). Les grossissements utilisés sont de X 100 pour les coupes A, B, C, E et G et de X 200 pour les coupes D et F.
FIGURE 13 : immunohistochimie sur tissus de la sphère orale
Ces deux tissus, glandes lacrymales (A, B) et glandes de Von
Ebner (E, F) montrent une forte immunoréactivité en comparaison des résultats obtenus grâce au sérum pré-immun (C pour les glandes lacrymales et D pour les glandes de Von Ebner). Grossissement X200.
Ces deux tissus, glandes lacrymales (A, B) et glandes de Von
Ebner (E, F) montrent une forte immunoréactivité en comparaison des résultats obtenus grâce au sérum pré-immun (C pour les glandes lacrymales et D pour les glandes de Von Ebner). Grossissement X200.
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FIGURE 14 : Immunohistochimie sur les glandes mammaires et poumon Une forte immunoréactivité est visible sur les coupes de glandes mammaires (A et B) comparé au témoin négatif ( C ) réalisé grâce au sérum-pré immun. Une forte immunoréactivité est également observée sur les coupes de poumon (E et F) comparée toujours au témoin négatif (D). chaque observation est faite à un grossissement X 100 pour A et C et à un grossissement X 200 pour B, D, E et F.
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EXEMPLES Exemple 1 :Matériels et Méthodes
1.A. Banque de cosmides du chromosome 9 humain
Une copie de la banque de cosmides spécifiques du chromosome 9 humain LL09NC01P construite par le Dr. J. Allmeman (Biochemical Sciences Division, Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, CA USA) sous l'égide du National Gene Library Project supporté financièrement par le département américain de l'Energie a été utilisée.
1.A. Banque de cosmides du chromosome 9 humain
Une copie de la banque de cosmides spécifiques du chromosome 9 humain LL09NC01P construite par le Dr. J. Allmeman (Biochemical Sciences Division, Lawrence Livermore National Laboratory, Livermore, CA USA) sous l'égide du National Gene Library Project supporté financièrement par le département américain de l'Energie a été utilisée.
Le criblage de la banque et l'analyse des clones ont été réalisés tel que décrit précédemment (Lacazette et al., 1997). l.B. Clonage et analyse de séquence
Une banque Lambda gt11 d'ADNc de testicules humains (Clontech) (107 p.f.u.) a été amplifiée par 30 cycles de polymérisation en chaîne (PCR) (94 C 45 sec, 54 C 45 sec, 72 C 1min 30 sec) avec l'amorce oliEST58 CCTGCAGGTACATGAGCTTCC et des amplimères 5' ou 3' de criblage d'inserts situés sur les bras du vecteurs Lambda gtl 1.
Une banque Lambda gt11 d'ADNc de testicules humains (Clontech) (107 p.f.u.) a été amplifiée par 30 cycles de polymérisation en chaîne (PCR) (94 C 45 sec, 54 C 45 sec, 72 C 1min 30 sec) avec l'amorce oliEST58 CCTGCAGGTACATGAGCTTCC et des amplimères 5' ou 3' de criblage d'inserts situés sur les bras du vecteurs Lambda gtl 1.
Une PCR nichée a ensuite été réalisée avec oliEST26 CGCTGTATTTGCCAGGCTCC et des oligonucléotides spécifiques du bras du vecteur. Les produits PCR ont été sous-clonés dans le vecteur pGEM-T (r), ce qui a permis d'obtenir l'extrémité 5' des ADNc du gène hOBPII.
Les séquences obtenues en utilisant l'oligonucléotide standard pGEM-T (r) et en utilisant un mixe réactionnel prêt à l'emploi de séquençage à base de colorant terminateur (Applied Biosystems) ont été séparées par électrophorèse en utilisant un séquençeur automatique ABI PRISM 377 (Perkin Elmer) puis ont été analysées avec le logiciel Sequence Navigator 1.0.1. (Perkin Elmer). Des clones d'ADNc pleine longueur de hOBPIIa (hOBPIIa a, hOBPIIa ss, hOBPIIa 5,
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hOBPIIa y) et hOBPIIb (hOBPIIb a, hOBPIIb ss, hOBPIIb y) ont été obtenus à partir de la RT-PCR par purification des bandes d'intérêt selon les instructions du fabricant (gel extraction kit de Qiagen) ou en sous-clonant dans un vecteur pGEM-T(r) les produits de la PCR nichée pour les formes alternatives faiblement exprimées.
1C. Analyse par RT-PCR
Des échantillons de tissus ont été collectés chez des individus caucasiens âgés de 45 à 55 ans en accord avec la réglementation française en vigueur. L'ARN total est extrait selon une méthode en une seule étape utilisant le réactif ARN NOW# selon les instructions du fabricant (Biogentex). 5 g d'ARN total ont été rétro-transcrits dans un volume final de 20 l en utilisant 0,5 ng d'oligonucléotide GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT avec le système de préamplification Superscript (Gibco BRL). Trois l de ces réactions sont ensuite utilisés pour les PCR suivantes. L'expression des ARNm spécifiques a été déterminée par PCR en utilisant : les amorces TL : CCTCTCCCAGCCCCAGCAAG et AP : GACTCGAGTCGACATCG pour les gènes de type LCN1(LCN1, LCNlb, LCNlc) et pour les gènes de type hOBPII, les amorces DE : et FI : CTTTATTTGGAGTCAGGTGGGTG. Comme contrôle de qualité des ARN, les amorces G3PDH1 : CTCTGCCCCCTCTGCTGATG et G3PDH2 : CCTGCTTCACCACCTTCTTG du gène G3PDH ont été utilisées ; le gène G3PDH est considéré comme étant constitutivement exprimé dans tous les types cellulaires. 32 cycles de PCR (94 C 45 sec., 54 C 45 sec., 72 C 2 min. 30 sec.) ont été réalisés et les produits d'amplification ont été séparés sur gel d'agarose à 1%. L'ADN est transféré sur une membrane Hybond N+#.
Des échantillons de tissus ont été collectés chez des individus caucasiens âgés de 45 à 55 ans en accord avec la réglementation française en vigueur. L'ARN total est extrait selon une méthode en une seule étape utilisant le réactif ARN NOW# selon les instructions du fabricant (Biogentex). 5 g d'ARN total ont été rétro-transcrits dans un volume final de 20 l en utilisant 0,5 ng d'oligonucléotide GACTCGAGTCGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTT avec le système de préamplification Superscript (Gibco BRL). Trois l de ces réactions sont ensuite utilisés pour les PCR suivantes. L'expression des ARNm spécifiques a été déterminée par PCR en utilisant : les amorces TL : CCTCTCCCAGCCCCAGCAAG et AP : GACTCGAGTCGACATCG pour les gènes de type LCN1(LCN1, LCNlb, LCNlc) et pour les gènes de type hOBPII, les amorces DE : et FI : CTTTATTTGGAGTCAGGTGGGTG. Comme contrôle de qualité des ARN, les amorces G3PDH1 : CTCTGCCCCCTCTGCTGATG et G3PDH2 : CCTGCTTCACCACCTTCTTG du gène G3PDH ont été utilisées ; le gène G3PDH est considéré comme étant constitutivement exprimé dans tous les types cellulaires. 32 cycles de PCR (94 C 45 sec., 54 C 45 sec., 72 C 2 min. 30 sec.) ont été réalisés et les produits d'amplification ont été séparés sur gel d'agarose à 1%. L'ADN est transféré sur une membrane Hybond N+#.
Pour la détection de l'expression des différents gènes, plusieurs oligonucléotides spécifiques des gènes respectifs ont été synthétisés : - olLCN1 : GACTCAGACTCCGGAGATGA,
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- olLCN1b : AACTCAGACACCAGAGATGA, - olLCN1c : GACTCAGATCCCGGAGATGA, - ol5 : CCAGGAGGGACCACTACA spécifique du gène hOBPIIb, - ol4 : CCGGGACGGACGACTACG spécifique du gène hOBPIIa, - G3PDH3 : CTCATGACCACAGTCCATGC, Les oligonucléotides sont marqués au y32P-ATP en utilisant de la T4 kinase (Applied Biosystem) ; les hybridations des oligonucléotides marqués sont réalisées à 42 C. Le lavage final est réalisé dans une solution de 0,1X SSC, 0,1% SDS à 48 C pendant 20 min. La spécificité des réactions d'hybridation des oligonucléotides est contrôlée en utilisant des échantillons d'ADN cosmidique digéré (p233G2 pour LCN1 et hOBPIIa, P19E7 pour LCNlb et hOBPIIb, P181A9 pour LCN1c) et chargés sur le gel avec des produits de RTPCR. l.D. génotypage et analyse de liaison
Le génotypage est réalisé par des réactions PCR en utilisant 100 ng d'ADN génomique provenant de 8 familles de référence du CEPH et utilisant les oligonucléotides oli9 TGTTCGGGAACGCAGCTT et olilObis TGCCGCTGTCCCCACGTCGG. Les paramètres du thermocycleur consistent en un cycle initial à 94 C pendant 10 min suivi par 30 cycles à 94 C pendant 30 s, 55 C pendant 30 s et 70 C pendant 45 s puis en une étape d'élongation finale de 10 min à 70 C. Les produits PCR sont ensuite analysés sur un gel d'agarose à 3%. Les informations concernant les marqueurs du chromosome 9 peuvent être obtenues à l'adresse Internet suivante (hTTP.//galton ucl ac uk) ; les analyses ont été réalisées en utilisant les outils d'études de liaison préalablement décrites dans Lacazette et al. (1997). Les haplotypes sont reconstruits manuellement selon les événements de recombinaison préalablement décrits dans la famille 1362 (Attwood et al., 1994).
Le génotypage est réalisé par des réactions PCR en utilisant 100 ng d'ADN génomique provenant de 8 familles de référence du CEPH et utilisant les oligonucléotides oli9 TGTTCGGGAACGCAGCTT et olilObis TGCCGCTGTCCCCACGTCGG. Les paramètres du thermocycleur consistent en un cycle initial à 94 C pendant 10 min suivi par 30 cycles à 94 C pendant 30 s, 55 C pendant 30 s et 70 C pendant 45 s puis en une étape d'élongation finale de 10 min à 70 C. Les produits PCR sont ensuite analysés sur un gel d'agarose à 3%. Les informations concernant les marqueurs du chromosome 9 peuvent être obtenues à l'adresse Internet suivante (hTTP.//galton ucl ac uk) ; les analyses ont été réalisées en utilisant les outils d'études de liaison préalablement décrites dans Lacazette et al. (1997). Les haplotypes sont reconstruits manuellement selon les événements de recombinaison préalablement décrits dans la famille 1362 (Attwood et al., 1994).
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l.E. Prédictions de structures secondaires
Un alignement multiple des protéines lipocalines pour lesquelles les structures cristallographiques ont déjà été décrites (Monaco et al., 1992 ; Spinelli et al., 1998) avec les protéines hOBPIIa et hOBPIIb a été obtenu en utilisant le logiciel Clustalx (ftp infobiogen fr). Les structures secondaires putatives ont été déterminées avec le programme DSC (Discrimination of protein Secondary structure Class) développé par R. D. King et M.J.E. Sternberg (http.//bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/dsc- simple.html). Les structures secondaires des protéines correspondantes aux formes alternativement épissées sont supposées identiques aux formes traditionnelles avant le décalage du cadre de lecture ; ce décalage la prédiction de structure est effectuée avec une seule séquence et est réalisée en utilisant le logiciel Predator (http://pbil.ibcp fr/cgi-bin).
Un alignement multiple des protéines lipocalines pour lesquelles les structures cristallographiques ont déjà été décrites (Monaco et al., 1992 ; Spinelli et al., 1998) avec les protéines hOBPIIa et hOBPIIb a été obtenu en utilisant le logiciel Clustalx (ftp infobiogen fr). Les structures secondaires putatives ont été déterminées avec le programme DSC (Discrimination of protein Secondary structure Class) développé par R. D. King et M.J.E. Sternberg (http.//bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/dsc- simple.html). Les structures secondaires des protéines correspondantes aux formes alternativement épissées sont supposées identiques aux formes traditionnelles avant le décalage du cadre de lecture ; ce décalage la prédiction de structure est effectuée avec une seule séquence et est réalisée en utilisant le logiciel Predator (http://pbil.ibcp fr/cgi-bin).
1.F. L'analyse phylogénétique
Les protéines lipocalines dont les séquences sont connues dans leur totalité ont été alignées trois fois consécutivement en utilisant le logiciel Clustalx (ftp://ftp.inforbiogen.fr). Des distances dans l'arbre phylogénétique ont été calculées avec Clustalx et dessinées avec Njplot. l.G. Hybridation in situ
Des coupes sériées réalisées au cryostat (8 m d'épaisseur) sont collectées sur des lames SuperFrost Plus (Menzel Glazer) et stockées à - 80 C. Des sondes ARN antisens et sens sont obtenues selon les techniques standard en utilisant la T7 ou la SP6 polymérase à partir d'une matrice obtenue par digestion avec des enzymes de restriction Ncol ou PstI du clone cDNA de phOBPIIaP2 et en utilisant du DIG-11UTP (Boehringer Mannheim) (la longueur de la sonde est approximativement de 150 nucléotides). Les matrices digérées par PstI
Les protéines lipocalines dont les séquences sont connues dans leur totalité ont été alignées trois fois consécutivement en utilisant le logiciel Clustalx (ftp://ftp.inforbiogen.fr). Des distances dans l'arbre phylogénétique ont été calculées avec Clustalx et dessinées avec Njplot. l.G. Hybridation in situ
Des coupes sériées réalisées au cryostat (8 m d'épaisseur) sont collectées sur des lames SuperFrost Plus (Menzel Glazer) et stockées à - 80 C. Des sondes ARN antisens et sens sont obtenues selon les techniques standard en utilisant la T7 ou la SP6 polymérase à partir d'une matrice obtenue par digestion avec des enzymes de restriction Ncol ou PstI du clone cDNA de phOBPIIaP2 et en utilisant du DIG-11UTP (Boehringer Mannheim) (la longueur de la sonde est approximativement de 150 nucléotides). Les matrices digérées par PstI
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et transcrites par l'ARN polymérase de T7 correspondent à la sonde antisens et les matrices digérées par NcoI transcrites par l'ARN polymérase SP6 correspondent à la sonde sens. Des sections de tissus sont fixées dans du paraformaldéhyde 4% pendant 15 min puis rincées pendant 5 min dans du PBS 2X. Après acétylation (2 x 5 min dans un tampon de triéthanolamine (TEA) pH 8, contenant 0,25% v/v d'anhydride acétique), les sections tissulaires sont préhybridées à 60 C pendant 15 min dans de la formamide 50%/ 1X SSC. Les sondes marquées sont appliquées sur chacune des sections dans 50 l de tampon d'hybridation (50% formamide, IX Denhardt's, 500 g/ml total d'ARNt, 10% de Dextran sulfate, 10 mM de dithiotréitol). Les sections sont recouvertes puis incubées dans des chambres humides à 50 C pendant la nuit. Après hybridation, les lames sont immergées à 55 C dans un tampon de lavage (50% formamide, IX SSC) pendant 2 heures. Chaque lame est ensuite rincée 2 fois 5 min dans du 2X SSC à température ambiante, puis traitée pendant 30 min avec 10 mg/ml de RNase à 37 C, et enfin immergée 2 heures à 55 C dans une solution de lavage (50% formamide, 2X SSC). Les lames sont ensuite placées pendant 15 min à 55 C dans du 0,1 X SSC. La détection immunologique est réalisée en utilisant un anticorps anti-DIG conjugué à la phosphatase alkaline (fragments Fab) selon le protocole de Boehringer Mannheim. Les sections sont examinées à des grossissements différents utilisant un microscope Axiophot (Zeiss). l.H. Obtention d'un anticorps polyclonal dirigé contre les protéines hOBPn
Deux cent cinquante l de protéines de fusion ont été fournis à la société Agro-Bio pour la production d'anticorps. Des lapins (New Zealand White SPF) sont injectés aux jours 0, 14, 28 et 42. Les serums sont prélevés aux jours 0,35, 49 et 63. Afin de tester l'anticorps, la protéine de fusion est déposée dans les pistes 1 et 3 (Figure 11), alors
Deux cent cinquante l de protéines de fusion ont été fournis à la société Agro-Bio pour la production d'anticorps. Des lapins (New Zealand White SPF) sont injectés aux jours 0, 14, 28 et 42. Les serums sont prélevés aux jours 0,35, 49 et 63. Afin de tester l'anticorps, la protéine de fusion est déposée dans les pistes 1 et 3 (Figure 11), alors
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que du mucus nasal humain est déposé dans les pistes 2 et 4. Les pistes 1 et 2 ainsi que la piste correspondant à l'échelle de poids moléculaire, correspondent à une révélation par le bleu de Coomassie.
Les pistes 3 et 4 correspondent à une détection des protéines reconnues par l'anticorps à l'aide de la technique de Western blot. Les pistes 1 et 3 montrent la présence d'une série de protéines recombinantes tronquées entre 30 et 42 kDa issues d'une synthèse peu efficace due à la présence de nombreux codons rares chez la bactérie au sein de la séquence de hOBPIIb. Toutefois cette production de protéine recombinante fût suffisante pour produire un anticorps polyclonal de bonne qualité comme indiqué par la révélation dans la piste 4 correspondant au mucus nasal, d'une bande de 18 kDa spécifique des protéines hOBPn.
1.1. immunohistochimie
Des coupes sériées de 8 m de différents tissus sont fixées au para-formaldéhyde (5min), et rincées trois fois au PBS xl (15 min) puis incubées 30 min dans une solution 3% de BSA en PBSxl, avant d'être incubées durant la nuit en présence de l'anticorps anti-protéine de fusion en solution PBSxl. Après trois rinçage en PBSxl (15 min), un anticorps anti-IgG de lapin couplé au FITC (coloration verte en fluorescence) en solution de PBSxl est placé 3 heures au contact des lames. Après un rinçage en PBSxl, une solution de DAPI (100 ng / l en PBSxl) est appliquée pendant 10 min (contre coloration des noyaux cellulaires en bleu). Après trois rinçages en PBSxl(15 min), les lames sont montées dans de l'eau glycérinée (50/50). L'analyse est réalisée en présence de filtres DAPI et FITC à l'aide d'une caméra CDD en utilisant un temps d'intégration entre 4 et 32 ms.
Des coupes sériées de 8 m de différents tissus sont fixées au para-formaldéhyde (5min), et rincées trois fois au PBS xl (15 min) puis incubées 30 min dans une solution 3% de BSA en PBSxl, avant d'être incubées durant la nuit en présence de l'anticorps anti-protéine de fusion en solution PBSxl. Après trois rinçage en PBSxl (15 min), un anticorps anti-IgG de lapin couplé au FITC (coloration verte en fluorescence) en solution de PBSxl est placé 3 heures au contact des lames. Après un rinçage en PBSxl, une solution de DAPI (100 ng / l en PBSxl) est appliquée pendant 10 min (contre coloration des noyaux cellulaires en bleu). Après trois rinçages en PBSxl(15 min), les lames sont montées dans de l'eau glycérinée (50/50). L'analyse est réalisée en présence de filtres DAPI et FITC à l'aide d'une caméra CDD en utilisant un temps d'intégration entre 4 et 32 ms.
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Exemple 2 : Identification d'un gène homologue à LCN1 localisé sur le chromosome 9 humain
L'identification de l'ADN complémentaire de LCN1codant pour la lipocaline des larmes humaines (Lassagne et Gachon, 1993) a préalablement été rapportée, ainsi que la localisation du gène sur le chromosome 9q34 (Lassagne et al, 1993 ; Lacazette et al, 1997). Les deux gènes codant pour les protéines des glandes de von Ebner 1 et 2 (Kock et al, 1994) correspondent aux protéines homologues de LCN1 chez le rat ; ceci pose la question de savoir s'il existe d'autres gènes codant pour une protéine LCN1 dans le génome humain. Les expériences d'hybridation in situ (Lassagne et al, 1993) ainsi que les analyses avec des hybrides somatiques (Lassagne et al, 1995) indiquent que, s'ils existent, ces gènes humains additionnels doivent se trouver localisés dans la région chromosomique 9q34.
L'identification de l'ADN complémentaire de LCN1codant pour la lipocaline des larmes humaines (Lassagne et Gachon, 1993) a préalablement été rapportée, ainsi que la localisation du gène sur le chromosome 9q34 (Lassagne et al, 1993 ; Lacazette et al, 1997). Les deux gènes codant pour les protéines des glandes de von Ebner 1 et 2 (Kock et al, 1994) correspondent aux protéines homologues de LCN1 chez le rat ; ceci pose la question de savoir s'il existe d'autres gènes codant pour une protéine LCN1 dans le génome humain. Les expériences d'hybridation in situ (Lassagne et al, 1993) ainsi que les analyses avec des hybrides somatiques (Lassagne et al, 1995) indiquent que, s'ils existent, ces gènes humains additionnels doivent se trouver localisés dans la région chromosomique 9q34.
Une banque de cosmides spécifiques du chromosome 9 humain (LL09NP01) a été criblée avec la sonde d'ADNc LCN1humaine ; 26 cosmides ont été identifiés ; ceux-ci ont été digérés par EcoRI ou PvuII, puis hybridés successivement avec l'ADN de LCN et différents oligonucléotides (figure 1).
Les cosmides sont divisés en 3 groupes. Le premier groupe (clones P32H3, P41B5, P63B6, P92H20, P109C6, P145H6, P195B4, P233G2, P233F2, P265D4, et P276H8) correspond aux cosmides contenant une séquence du gène LCN1préalablement isolé (numéro d'accession : L14927) formé par 7 exons (Holzfeind et Redl, 1994). Le second groupe (clone P19E4, P19E7, P42H9, P98H5 et P142H8) correspond à la séquence LCNlb homologue à LCN1 (clone P19E4) (numéro d'accession : Y 10826) depuis le promoteur jusqu'au 6ème exon puis qui diverge ensuite. Un troisième groupe de cosmides (clone P110C1, P174E4, P174E5, P181A9, P181B6, P211A7, P238C6 et P291E1) contient une région LCNlc, établi à partir du séquençage partiel du clone P181A9 (numéro d'accession Y10827), qui est fortement
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homogue à LCN1seulement à partir du promoteur jusqu'à l'exon 2.
Ainsi, LCN1 est le seul gène qui possède le 7ème et dernier exon. De plus, les boîtes TATA sont dégénérées dans les promoteurs des gènes LCNlb et LCNlc.
Exemple 3 : Identification de duplications génomiques contenant les gènes de lipocalines et cartographie de la région chromosomique 9q34
Au cours de la période d'identification de la famille de gène LCN1, un vaste projet de cartographie physique a conduit à l'identification de contigs de cosmides couvrant partiellement la région chromosomique 9q34 (Nahmias et al, 1994, Van Slegtenhorst et al., 1995, Hornigold et al, 1997) ; le séquençage des clones correspondants a été réalisé par un groupe du Massachusset Institute of Technology (Boston, USA).
Au cours de la période d'identification de la famille de gène LCN1, un vaste projet de cartographie physique a conduit à l'identification de contigs de cosmides couvrant partiellement la région chromosomique 9q34 (Nahmias et al, 1994, Van Slegtenhorst et al., 1995, Hornigold et al, 1997) ; le séquençage des clones correspondants a été réalisé par un groupe du Massachusset Institute of Technology (Boston, USA).
Des analyses de comparaison de séquences dans les banques de données de LCN1, LCN lb et LCNlc ont révélé des homologies fortes entre le gène LCN1 préalablement décrit (numéro d'accession L14927) et les trois séquences cosmides : P161A1 ayant le numéro d'accession AC002098, P203H12 avec le numéro d'accession AC000396 et P161G2 avec le numéro d'accession AC002106.
Une analyse très fine notamment de la région 3' des gènes LCN 1 a révélé que la séquence LCNlc correspondait au clone ayant le numéro d'accession AC002106, LCN lb au numéro AC002098 et LCN1 au numéro AC000396 ; existe cependant une insertion de 60 paires de base à la position 12360 du clone ayant le numéro d'accession AC000396 par rapport à celui ayant le numéro L14927. Des analyses complémentaires ont révélé que ces séquences sont homologues sur une région beaucoup plus large que les gènes LCN 1. Comme illustré par les analyses en dot plot (figure 2), ces trois cosmides correspondent à des régions génomiques dupliquées ; les cosmides P161A1
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(AC002098) et P203H 12 (AC000396) sont homologues sur la totalité de leurs séquences ; le cosmide P161G2 (AC002106) n'est homologue à la séquence uniquement pour des séquences situés en amont de l'intron 3 du gène LCN1.
Les positions relatives de ces régions dupliquées du chromosome 9 humain ont été analysées. Les résultats ont été comparés avec la carte physique établie dans le cadre du projet de cartographie physique par des analyses de restriction des cosmides (Homigold et al, 1997) en utilisant la même banque LLN09NC01P. Approximativement les mêmes cosmides ont été trouvés dans les deux recherches pour le locus LCNlc ; la comparaison de séquence du cosmide P181A9 révèle que son extrémité T3 contient le gène Surf 5 (figure 1). De plus, AC002106 est localisé dans un contig de séquence entre ABO et le locus Surfeit confirmant la localisation de LCNlc. P161A1 et P203H12 ont des localisations moins précises en utilisant les données de Homigold et de ses collaborateurs à cause de la limite de la stratégie de cartographie de restriction pour les régions dupliquées. P203H 12 (AC000396) semble correspondre au gène LCN1 qui a été préalablement localisé près du marqueur D9S 1826 (Lacazette et al.
1997) à l'exception d'une insertion de 60 paires de bases.
Pour tester si P203H 12 peut correspondre à une 4ème région dupliquée, la région a été testée par PCR sur de l'ADN génomique de
150 individus non apparentés en utilisant des amorces spécifiques pour AC000396 et L14927. Une bande unique correspondant à la longueur de la séquence AC000396 a été détectée (donnée non montrée) prouvant ainsi que P203H12 contient le gène LCN1 préalablement décrit. Le locus LCNlb n'a pas été positionné précisément dans la région comme il est démontré par le fait que les extrémités AC002098 ainsi que les extrémités des cosmides contenant LCNlb ne détectent aucune séquence homologue dans les banques de données.
150 individus non apparentés en utilisant des amorces spécifiques pour AC000396 et L14927. Une bande unique correspondant à la longueur de la séquence AC000396 a été détectée (donnée non montrée) prouvant ainsi que P203H12 contient le gène LCN1 préalablement décrit. Le locus LCNlb n'a pas été positionné précisément dans la région comme il est démontré par le fait que les extrémités AC002098 ainsi que les extrémités des cosmides contenant LCNlb ne détectent aucune séquence homologue dans les banques de données.
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L'analyse des séquences a permis d'identifier, un mini-satellite mtatif à la position 3177-3724 du cosmide correspondant à AC002098 Figure 1) ; un polymorphisme rare a ainsi été mis en évidence dans une population de 20 individus non apparentés (PIC = 0,05). Ce iouveau marqueur polymorphe n'est informatif que dans la seule àmille 1362 sur les 8 familles de référence du CEPH testées.
L'analyse de liaison a révélé des lod-scores à deux points supérieurs à 3 à téta = 0 pour les marqueurs D9S275 et D9S 1818. La -econstruction de l'haplotype a confirmé la localisation du gène LCN 1 b ntre les marqueurs D9S1811 et D9S67 dans le chromosome 9q34 Figure 1).
Exemple 4 : Identification de deux nouveaux gènes de lipocaline
Les analyses de séquences ont révélé des données nouvelles.
Les analyses de séquences ont révélé des données nouvelles.
La comparaison de AC002098 à la banque de données a révélé les similarités entre cette séquence et les gènes de lipocalines. En plus :le la région 21000 à 27000 qui contient le gène LCNlb, la région autour de la position de 2150 contient des séquences présentant des similitudes avec les séquences codant pour les protéines de liaison aux odeurs de rat de type II, des lipocalines des larmes ainsi que pour ['EST AA460385.
Parallèlement, la comparaison de la séquence AC000396 à la banque de données a révélé en plus de la région 11100 à 17100 contenant le gène LCN1, des similitudes pour le même groupe de séquences dans la région 36600 à 37800.
L'EST AA460385 exprimée dans les testicules humains correspond à 4 exons du nouveau gène de lipocaline présent dans le clone P161A1 (AC002098). Un exon putatif de 50 paires de bases similaire à la séquence EST est également présent à l'extrémité du clone P203H 12 (AC000396).
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Les inventeurs ont donc conclu a l'existence d'un nouveau gène de lipocaline à une position distale de LCNlb. Les inventeurs ont émis l'hypothèse, que suite à une duplication génomique, un second gène orthologue au gène codant pour l'EST est présent dans la région 3' de LCN1.
Le séquençage du cosmide P233G2 contenant cette région (Figure 1) avec des oligonucléotides définis à partir d'EST a en effet révélé la présence d'un autre gène de lipocaline à un locus distant de 20 kb distal du gène de LCN1. Pour identifier les premiers exons des deux nouveaux gènes, des PCR nichées sur des clones cDNA provenant d'une banque de testicules ont été réalisées entre les oligonucléotides localisés dans la région 5' de l'EST et les bras du vecteur. Les produits PCR sont clonés et leur séquence a révélé trois exons additionnels d'après la séquence génomique (Figure 1). Une boîte TATA est présente en amont du premier exon dans les deux cas (Figure 3). Les deux ARNm, hOBPIIa correspondant au gène localisé en aval de LCN1et hOBPIIb localisé en aval de LCNlb (Figures 3 et 4), sont identiques à 97,5% et 63 % à ceux correspondant au gène LCN1. Les organisations intron/exon de ces deux gènes sont consistantes avec la famille des lipocalines.
De plus, les séquences protéiques déduites (170 amino acides) confirment l'appartenance à la famille des lipocalines. Les deux protéines matures putatives hOBPIIa (MW = 17,8 kDa) et hOBPIIb (MW
18,0 kDa) sont identiques à 89%. Ces deux nouvelles protéines possèdent un peptide signal putatif de 15 amino acides (Figure 5), les résidus conservés GXWY à la position 27 à 30 et deux cystéines susceptibles d'être impliquées dans un pont disulfure (position 74 à
166).
18,0 kDa) sont identiques à 89%. Ces deux nouvelles protéines possèdent un peptide signal putatif de 15 amino acides (Figure 5), les résidus conservés GXWY à la position 27 à 30 et deux cystéines susceptibles d'être impliquées dans un pont disulfure (position 74 à
166).
Cependant, les comparaisons de séquences par paire avec les autres lipocalines indiquent une faible conservation des résidus acides aminés (15 à 25%) à l'exception de TL/VEG humain codé par le gène
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LCN1(valeur moyenne 43 % sur 155 amonoacides) et l'OBPII de rat [valeur moyenne 45,5 %). Par ailleurs, les points isoélectriques calculés de hOBPIIa et de hOBPIIb sont respectivement de 7,85 et de 8,72 alors que ceux des lipocalines sont acides (aux environs de 4,5) à l'exception de l'OBPII de rat (PI = 9,01). La prédiction des structures secondaires des protéines hOBPIIa et hOBPIIb avec le logiciel DSC en effectuant des alignements multiples avec les séquences de lipocalines de structures connues indique la présence de 8 brins de feuillets (3 antiparallèles pouvant permettre la formation d'un calice suivi par une hélice a et un feuillet ss final en accord avec les données connues des structures des lipocalines (Figure 5).
Exemple 5 : Etude de l'expression des gènes de lipocalines identifiés
Pour préciser si LCNlb, LCNlc, hOBPIIa et hOBPIIb sont des gènes exprimés, des analyses de RT-PCR ont été réalisées sur 18 tissus humains différents connus pour produire des lipocalines (Figure 6).
Pour préciser si LCNlb, LCNlc, hOBPIIa et hOBPIIb sont des gènes exprimés, des analyses de RT-PCR ont été réalisées sur 18 tissus humains différents connus pour produire des lipocalines (Figure 6).
Deux couples d'amorces ont été synthétisés ; l'un reconnaît les ARNm de type LCN1et l'autre les ARNm de type hOBPII. L'hybridation des oligonucléotides spécifiques des gènes sur des membranes sur lesquelles sont immobilisés les produits de RT-PCR après transfert par la technique de Southern, puis le sous-clonage des produits hybridés ont révélés que LCNlb et LCNlc ne sont exprimés dans aucun des produits testés, alors que les ARNm de LCN1 sont détectés dans la glande lacrymale, les glandes sudoripares, les glandes de von Ebner, le septum nasal, l'épithélium du cornet nasal , tout comme le placenta et les glandes mammaires (Figure 6A). Ces données et les informations de séquences qui indiquent que la boite TATA et le dernier exon ont été perdus permettent d'affirmer que LCNlb et LCN lc sont des
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pseudogènes qui ne participent pas à la formation des protéines LCN1 Humaines.
A l'inverse, les gènes hOBPIIa et hOBPIIb sont exprimés, ce qui confirme leur détection précédente dans les banques d'ADNc. De manière surprenante, bien que les deux protéines hOBPIIa et hOBPIIb soient très similaires sur la totalité de leur séquence y compris dans la région promotrice de 1,5 kb, leur profil d'expression sont différents [Figure 6B). La protéine hOBPIIa est fortement exprimée dans le septum nasal, le méat moyen, le cornet nasal, les testicules et le placenta et plus faiblement dans les glandes mammaires, les glandes lacrymales, les glandes sudoripares, les glandes de von Ebner et le poumon. A l'inverse, la protéine hOBPIIb est exprimée de manière prédominante dans la prostate, les testicules et les glandes mammaires et plus faiblement dans les glandes sous-maxillaires, le septum nasal et le méat moyen.
De plus, les analyses de RT-PCR ont révélé l'existence d'un épissage alternatif du produit de transcription du gène hOBPIIa et du gène hOBPIIb qui génère respectivement quatre et trois ARNm (Figures 3,4, 5 et 6).
La transcription du gène hOBPIIa génère au moins quatre ARNm qui codent pour quatre protéines différentes ; premier ARNm code pour la protéine hOBPIIaa qui correspond à la protéine hOBPIIa décrite précédemment. Dans le gène hOBPIIa, trois sites accepteur d'épissage différents ont été identifiés pour l'exon 5 (figure 3 et 4) formant ainsi deux autres variants d'épissage. Un premier variant d'épissage présente un site accepteur pour l'exon 5 localisé 49 pb avant le précédent (exon 5b) ; ceci génère un ARNm de 725 nucléotides qui code pour la protéine hOBPIIass de 146 aminoacides. Cette protéine est identique jusqu'au 8ème feuillet ss putatif puis différente ensuite avec seulement 16 aminoacides additionnels. Un second variant d'épissage présente un site accepteur pour l'exon 5 localisé 65 pb avant le
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précédent (exon 5c) ; ceci génère un ARNm de 741nucléotides qui code pour une protéine hOBPIIay de 228 aminoacides. Cette protéine possède les huit premiers feuillets ss putatifs identiques à ceux de hOBPIIaa puis est différente dans la région C-terminale (figure 5) à cause d'un décalage de cadre de lecture généré par cet événement d'épissage alternatif ; la structure de cette région C-terminale prédite par le logiciel Predator est une longue région coudée contenant une 9ème feuillet ss.
Dans le cas du gène hOBPIIb, en plus de l'ARNm hOBPIIba. préalablement décrit, un exon surnuméraire de 106 pb (exon 3b) entre les précédents exons 3 et 4 a été identifié (figure 3). Cet ARNm plus long (782 nucléotides) code pour une protéine hOBPIIbp de 165 amino- acides. Du point de vue de la structure protéique, hOBPIIbp est identique à hOBPIIba jusqu'au Sème feuillet ss putatif puis diffère ensuite à cause d'un décalage du cadre de lecture. Les prédictions des logiciels informatiques indiquent que le motif ALWEALAIDTRLK est une hélice a qui est juste derrière le cinquième feuillet ss. Deux feuillets ss additionnels peuvent être présents dans la longue partie C-terminale.
Aucun des variants d'épissage alternatifs pour un gène n'est détecté symétriquement pour l'autre gène bien que les sites d'épissage accepteur et donneur putatifs puissent être présents (figure 3). En plus de ces motifs protéiques qui conservent la structure traditionnelle d'une lipocaline, nous avons démontré, pour les deux gènes hOBPIIa et hOBPIIb, l'existence d'une faible quantité d'ARNm ayant subi un épissage alternatif et codant pour des protéines dont la séquence n'est pas directement liée aux lipocalines. Des ARNm codant pour hOBPIIaÔ et hOBPIIby auxquels ils manquent la séquence codant pour l'exon 2 et qui possèdent respectivement l'exon 5b et l'exon 5 codent pour des protéines putatives sécrétées de 147 et de 85 amino-acides respectivement (figures 4 et 5) ; protéines divergent des protéines précédentes à partir du 24ème amino-acide.
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Pour identifier les cellules exprimant les gènes hOBPII, les inventeurs ont hybridé des sondes ribonucléiques sens et anti-sens marquées à la digoxygénine sur des sections tissulaires (figure 7). Les ARNm hOBPII sont détectés dans les cellules acineuses du méat moyen et des cornets nasaux ainsi que des cellules épithéliales des cornets ; ceci soutient l'idée que les protéines hOBPII sont impliquées dans la fonction olfactive. En plus de la production dans la sphère orale, des ARNm codant pour hOBPII ont été détectés dans la sphère génitale, notamment dans les cellules glandulaires de la prostate, dans les cellules secrétrices épithéliales du canal déférent. Aucun signal n'a été détecté dans les gonades mâles, ce qui suggère que l'expression des gènes hOBPII mise en évidence dans les expériences de RT-PCR correspondait à la présence de canaux additionnels dans la préparation tissulaire (rete testis et canaux efférents). En combinant ces résultats de la détection de l'ensemble des ARNm codant pour hOBPII avec ceux de l'approche RT-PCR, il est apparu que cinq protéines hOBPII (hOBPIIaa, hOBPIIap, hOBPIIay, hOBPIIba, hOBPIIbp) sont sécrétées par les cellules épithéliales des canaux des gonades mâles, ainsi que des cellules acineuses du méat moyen et des cornets nasaux ; dans ces cellules les ARNm codant pour hOBPIIa sont hautement prédominant. Seules les deux protéines hOBPIIb (hOBPIIba et hOBPIIbp) sont sécrétées par les cellules épithélioglandulaires de la prostate et des glandes mammaires.
Exemple 6 : Analyse phylogénétique et classification des lipocalines
L'analyse en dotplot (figure 2) ainsi que les duplications génomiques que nous avons révélées indiquent une origine commune des gènes LCN et hOBPII. Pour clarifier les relations entre les membres de la famille des lipocalines et pour vérifier que nous avons
L'analyse en dotplot (figure 2) ainsi que les duplications génomiques que nous avons révélées indiquent une origine commune des gènes LCN et hOBPII. Pour clarifier les relations entre les membres de la famille des lipocalines et pour vérifier que nous avons
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identifié le gène humain orthologue de OBPII de rat (Dear et al., 1991), nous avons construit un arbre de distance phylogénétique avec les lipocalines des vertébrés (figure 8).
Les inventeurs ont mis en évidence neuf groupes principaux de lipocalines issus d'un précurseur commun : - la famille de l'apolipoprotéine et de la protéine de liaison au rétinol (RBP) (groupe 1) ; - le groupe de la prostaglandine D-synthase et du précurseur de lipocaline associé à la gélatinase des neutrophiles (groupe
2) ; - la sous-famille de l'alpha-1-microglobuline/bikunin (protéine
HC) (groupe 3) ; - la sous-famille orosomucoïde (A1AG, A1AH, A1AI) (groupe 4) - la sous-famille de la sphère orale 1 (OBPII-type-LCN1/VEGP,
VNSP I et II, LALP, CanFl) (groupe 5) ; - la sous-famille de la lactoglobuline (groupe 6) ; - la sous-famille des protéines sécrétées par l'épididyme de lézard (groupe 7) ; - la sous-famille la sphère orale 2 (protéines urinaires majeures (MUP) de souris) (groupe 8) ; - la sous-famille de la sphère orale 3 (OBP1, OBPII de souris,
Aphrodisine, Probasine, BD20) (groupe 9).
2) ; - la sous-famille de l'alpha-1-microglobuline/bikunin (protéine
HC) (groupe 3) ; - la sous-famille orosomucoïde (A1AG, A1AH, A1AI) (groupe 4) - la sous-famille de la sphère orale 1 (OBPII-type-LCN1/VEGP,
VNSP I et II, LALP, CanFl) (groupe 5) ; - la sous-famille de la lactoglobuline (groupe 6) ; - la sous-famille des protéines sécrétées par l'épididyme de lézard (groupe 7) ; - la sous-famille la sphère orale 2 (protéines urinaires majeures (MUP) de souris) (groupe 8) ; - la sous-famille de la sphère orale 3 (OBP1, OBPII de souris,
Aphrodisine, Probasine, BD20) (groupe 9).
La présente invention concerne plus particulièrement les groupes 5,8 et 9.
Le groupe 5 contient les protéines hOBPII qui sont étroitement liées d'un point de vue évolutif à l'OBPII de rat. Pris dans leur ensemble, les présents résultats indiquent que les gènes hOBPII humains sont orthologues du gène OBPII de rat. Ce groupe contient également les protéines LCN1-VEGP de différentes espèces. En prenant en considération l'organisation génomique des gènes hOBPII-LCNl, les données de l'arbre illustrent l'événement de duplication (flèche) qui
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donne naissance aux gènes ancestraux hOBPII et LCN à partir de leur précurseur lipocaline commun (Figure 9). Plus récemment, les duplications originelles de la région de 50 kb contenant hOBPII-LCNl (flèche) ont généré chez l'homme les deux gènes hOBPII et le gène LCN1et son pseudogène LCNlb. La duplication additionnelle ayant donné lieu au pseudogène LCNlc est partielle dans le génome humain et ne produit pas de protéine fonctionnelle et est donc absente du présent arbre. De plus, les deux protéines VEG du rat sont plus étroitement liées l'une à l'autre dans l'arbre phylogénétique qu'avec la protéine humaine LCN1. La situation est identique pour les deux protéines humaines OBPII par rapport à la protéine OBPII de rat. Ces résultats sont en faveur d'un processus de conversion génique pour au moins certains gènes des lipocalines. Ceci peut également être corrélé au fait que ces gènes se situent sur le même bras chromosomique.
Le groupe 9 correspond à la famille de la sphère orale 3 et contient des OBP qui ont déjà été décrites. La protéine Aphrodisine a déjà été décrite comme un transporteur de phéromone (Henzel et al.,
1988) et apparaît être orthologue à la protéine OBP1 de rat et de souris, avec deux gènes OBP1 paralogues. Finalement, les lipocalines olfactives produites par les glandes de Bowman de rana pipens (OLFA RANPI) qui sont considérées comme des transporteurs d'odeurs potentiels dans le mucus de la grenouille, ne sont liées à aucun groupe d'OBP putatif (groupes 5,8 et 9) suggérant ainsi l'existence d'autres catégories d'OBP.
1988) et apparaît être orthologue à la protéine OBP1 de rat et de souris, avec deux gènes OBP1 paralogues. Finalement, les lipocalines olfactives produites par les glandes de Bowman de rana pipens (OLFA RANPI) qui sont considérées comme des transporteurs d'odeurs potentiels dans le mucus de la grenouille, ne sont liées à aucun groupe d'OBP putatif (groupes 5,8 et 9) suggérant ainsi l'existence d'autres catégories d'OBP.
Certaines lipocalines ont été décrites comme allergènes.
L'allergène majeur du chien, la protéine CanFl majoritairement exprimée dans les glandes de von Ebner (Konieczny et al., 1997), apparaît dans l'arbre être la protéine VEG du chien. Ce résultat montrant que LCN peut être allergénique, pousse les inventeurs à proposer l'implication des protéines OBPII dans les processus allergiques. De la même manière, l'allergène majeur du cheval EquCl
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exprimé dans le foie, dans les glandes salivaires (Grégoire et al., 1996) apparaît être orthologue à un membre de la protéine MUP (groupe 3).
L'allergène majeure de la vache (BD20 BOSTA) qui est présent dans la famille de la sphère orale 2 (groupe 4) est davantage lié à la probasine.
CanF2 principalement exprimée dans la glande parotide (Konieczny et al., 1997) ne semble pas être orthologue à une lipocaline préalablement décrite.
La présente invention a permis de révélé l'existence d'une duplication génomique au locus q34 du chromosome 9 humain qui recèle une famille de gène du type LCN1 ; cette famille comporte outre le gène LCN1, précédemment décrit, deux pseudogènes ainsi que deux gènes hOBPII qui sont paralogues à LCN 1. Les inventeurs ont révélé que la famille hOBPII-LCNl résulte d'événements consécutifs de duplications génomiques. Les séquences ainsi que l'organisation génomique ont révélé que les gènes LCN1et hOBPII dérivent d'un ancêtre commun et ont été généré au moyen de duplication en tandem.
Les comparaisons de séquences ont démontré que les protéines hOBPIIaa et hOBPIIba sont les formes de protéines des hOBPII les plus proches de LCN1; ceci est corroboré par le fait que la taille de l'exon 5 de LCN1est de 121 pb, ce qui correspond à la taille de l'exon 5a de la protéine hOBPII et par le fait qu'aucun exon 3b n'ait été trouvé dans la protéine LCN1. Des résultats similaires sont obtenus lorsque cette comparaison est effectuée avec les sept autres exons des lipocalines.
Ces données sont en faveur d'une acquisition de la diversité des protéines hOBPII à travers l'intégration de d'ADN génomique additionnel environnant au niveau du site accepteur d'épissage amont pour l'exon 5 de hOBPIIa ou à travers le recrutement d'un exon surnuméraire (exon 3b) pour la protéine hOBPIIb. L'hypothèse d'un recrutement d'exons plutôt qu'une réduction de la taille des exons ou qu'une perte d'exons est plus probable.
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Les inventeurs ont montré que les gènes hOBPII et LCN1 codent pour des protéines impliquées dans différentes fonctions, comme le montre l'expression de ces gènes à la fois dans la sphère orale et dans la sphère génitale. De plus, les inventeurs ont montré par l'analyse phylogénétique (exemple 6) que plusieurs protéines différentes pouvaient participer à la même fonction d'odorant-binding protéine ; ainsi trois sous-familles de lipocalines (les groupes 5,8 et 9) correspondant à plusieurs protéines sont retrouvées exprimées dans la sphère orale et notamment dans les glandes nasales et buccales.
Cette analyse montrant que plusieurs lipocalines participent à une même fonction physiologique et qu'une même protéine pouvait participer à différentes fonctions, a conduit les inventeurs à analyser l'expression des autres lipocalines humaines dans l'ensemble des tissus étudiés (Figure 10). Ceci a conduit à montrer que le gène codant pour l'apolipoprotéine D est exprimé dans les glandes du cornet nasal et du méat moyen, en faisant ainsi une potentielle odorant-binding protéine. De même la rétinol-binding protéine (RBP) est exprimée par l'épithélium nasal et pourrai! aussi participer à cette fonction.
Les inventeurs proposent donc d'inclure les protéines ApoD et RBP dans la famille des OBP humaines et les incluent dans l'ensemble des revendications portant sur ces OBP humaines.
Les inventeurs ont démontré que la transcription des deux gènes hOBPII génère de nombreux transcrits alternatifs qui codent pour des protéines distinctes dont la structure est compatible avec celle d'un transporteur de ligand hydrophobe.
Les inventeurs ont mis en évidence l'expression des deux gènes hOBPII dans la sphère orale (glandes nasales, glandes de von Ebner, glandes sous-maxillaires, glandes lacrymales, poumon). Les inventeurs ont également démontré que les protéines hOBPII selon l'invention sont produites par les cellules de la sphère génitale ; le gène hOBPII est majoritairement exprimé dans la prostate, le canal déférent et les
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glandes mammaires alors que l'expression du gène hOBPIIa est restreinte au canal déférent. Les analyses in situ ont révélé que l'ARNm est produit par les cellules glandulaires de la prostate et des cellules sécrétrices épithéliales du canal déférent supportant l'idée d'une sécrétion des protéines correspondantes dans le fluide séminal. Les protéines selon l'invention sont donc susceptibles d'être impliquées dans la fonction de reproduction, mais également dans toutes les autres fonctions habituellement attribuées aux lipocalines.
Exemple 7: Fabrication d'une protéine recombinante hOBPIIba dans un système procaryote.
Une PCR sur l'ADN plasmidique d'un clone de hOBPIIba à l'aide des amorces BIIa/b (5' GTC GGA TCC CTG TCC TTC ACC CTG GAG G 3'), oligonucléotide sens démarrant 45 bases après l'ATG initiant la protéine, et XIIb ( 5' GTC CTC GAG GTG TTC GGG AAC GCA GCT TC 3'), oligonucléotide antisens précédant le codon stop de la protéine hOBPIIba, a permis d'amplifier la totalité de l'ADN codant pour la protéine hOBPIIba sécrétée. Les sites de restriction enzymatique BamH 1 et Xho 1 situés aux extrémités des deux oligonucléotides (bases soulignées), furent utilisés pour un clonage directionnel dans un vecteur plasmidique d'expression pGEX-6Pl, suivi d'une transformation par électroporation (1800V, 200#, 25F) dans une souche bactérienne BL21. La synthèse de la protéine recombinante est obtenue par ajout d'IPTG à raison de 5 mM final pendant 3 h dans 250 ml de culture de la souche en milieu LB contenant 100 g/ml d'ampicilline préalablement incubée à 37 C pendant 2 h. Les cultures centrifugées sont reprises dans 25 ml de tampon TENGN. Le lysat est soniqué et centrifugé à nouveau. La protéine de fusion est alors purifiée à l'aide de 4 ml de billes fixant de façon covalente du glutathion insoluble (Sigma) pour 25 ml de surnageant. Après 4 h
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d'incubation, elles sont lavées avec 3 volumes de NaCl 1M puis par 10 volumes de PBS IX. L'élution est obtenue par mise en contact des billes pendant 10 min avec une solution de glutathion (Glutathion réduit 10 mM, Tris-HCl pH 8,0 50 mM).
La quantité de protéine recombinante produite est estimée par migration en gel de polyacrylamide et coloration au bleu de Coomassie (Figure 11). La spécificité de l'induction d'une protéine recombinante est testée par Western blot à l'aide d'un anticorps anti-GST de chèvre (Figure 11), révélé avec un anticorps anti-IgG de chèvre couplé à la peroxydase en utilisant un kit ECL+plus (Amersham). La séparation de la protéine de fusion en deux protéines est obtenue par protéolyse de 100 g de protéine recombinante préalablement dialysée à l'aide de 2U de preScissionTM protéase (Pharmacia Biotech) dans 10 l final contenant du tampon de l'enzyme IX, pendant 4 h à 5 C.
Exemple 8: Détection des hOBPII dans différents tissus par immunohistochimie.
La localisation des protéines hOBPn au sein des structures nasales (figure 12), des structures buccales et des glandes lachrymales (figure 13), des glandes mammaires et des poumons (figure 14) est révélée par immunohistochimie.
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LISTAGE DE SEQUENCES <110> UNIVERSITE D'AUVERGNE CLERMONT I <120> ODORANT-BINDING PROTEINES HUMAINES FIXANTS DES LIGANDS HYDROPHOBES :
POLYPEPTIDES ET POLYNUCLEOTIDES CODANT LESDITS POLYPEPTIDES, ET
LEURS APPLICATIONS <130> D15947 <160> 16 <170> PatentIn Vers. 2.0 <210> 1 <211> 676 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (43)..(552) <223> cDNA396 (676)/gl (hOBPIIa-alpha) <400> 1 cgcccagtga cctgccgagg tcggcagcac agagctctgg ag atg aag ace ctg 54
Met Lys Thr Leu
1 ttc ctg ggt gtc acg ctc ggc ctg gcc gct gcc ctg tcc ttc ace ctg 102 Phe Leu Gly Val Thr Leu Gly Leu Ala Ala Ala Leu Ser Phe Thr Leu
5 10 15 20 gag gag gag gat atc aca ggg ace tgg tac gtg aag gcc atg gtg gtc 150 Glu Glu Glu Asp Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Val Lys Ala Met Val Val
25 30 35 gat aag gac ttt ccg gag gac agg agg ccc agg aag gtg tcc cca gtg 198 Asp Lys Asp Phe Pro Glu Asp Arg Arg Pro Arg Lys Val Ser Pro Val
40 45 50 aag gtg aca gcc ctg ggc ggt ggg aac ttg gaa gcc acg ttc ace ttc 246 Lys Val Thr Ala Leu Gly Gly Gly Asn Leu Glu Ala Thr Phe Thr Phe
55 60 65 atg agg gag gat cgg tgc atc cag aag aaa atc ctg atg cgg aag acg 294 Met Arg Glu Asp Arg Cys Ile Gln Lys Lys Ile Leu Met Arg Lys Thr
70 75 80 gag gag cet ggc aaa ttc age gcc tat ggg ggc agg aag ctc ata tac 342 Glu Glu Pro Gly Lys Phe Ser Ala Tyr Gly Gly Arg Lys Leu Ile Tyr
85 90 95 100 ctg cag gag ctg ccc ggg acg gac gac tac gtc ttt tac tgc aaa gac 390
POLYPEPTIDES ET POLYNUCLEOTIDES CODANT LESDITS POLYPEPTIDES, ET
LEURS APPLICATIONS <130> D15947 <160> 16 <170> PatentIn Vers. 2.0 <210> 1 <211> 676 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (43)..(552) <223> cDNA396 (676)/gl (hOBPIIa-alpha) <400> 1 cgcccagtga cctgccgagg tcggcagcac agagctctgg ag atg aag ace ctg 54
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85 90 95 100 ctg cag gag ctg ccc ggg acg gac gac tac gtc ttt tac tgc aaa gac 390
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Leu Gln Glu Leu Pro Gly Thr Asp Asp Tyr Val Phe Tyr Cys Lys Asp
105 110 115 cag cgc cgt ggg ggc ctg cgc tac atg gga aag ctt gtg ggt agg aat 438 Gln Arg Arg Gly Gly Leu Arg Tyr Met Gly Lys Leu Val Gly Arg Asn
120 125 130 cet aat acc aac ctg gag gcc ctg gaa gaa ttt aag aaa ttg gtg cag 486 Pro Asn Thr Asn Leu Glu Ala Leu Glu Glu Phe Lys Lys Leu Val Gln
135 140 145 cac aag gga ctc tcg gag gag gac att ttc atg ccc ctg cag acg gga 534 His Lys Gly Leu Ser Glu Glu Asp Ile Phe Met Pro Leu Gln Thr Gly
150 155 160 agc tgc gtt ctc gaa cac taggcagccc ccgggtctgc acctccagag 582 Ser Cys Val Leu Glu His 165 170 cccaccctac caccagacac agagcccgga ccacctggac ctaccctcca gccatgaccc 642 ttccctgctc ccacccacct gactccaaat aaag 676 <210> 2 <211> 170 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Lys Thr Leu Phe Leu Gly Val Thr Leu Gly Leu Ala Ala Ala Leu
1 5 10 15 Ser Phe Thr Leu Glu Glu Glu Asp Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Val Lys
20 25 30 Ala Met Val Val Asp Lys Asp Phe Pro Glu Asp Arg Arg Pro Arg Lys
35 40 45 Val Ser Pro Val Lys Val Thr Ala Leu Gly Gly Gly Asn Leu Glu Ala
50 55 60 Thr Phe Thr Phe Met Arg Glu Asp Arg Cys Ile Gln Lys Lys Ile Leu
65 70 75 80 Met Arg Lys Thr Glu Glu Pro Gly Lys Phe Ser Ala Tyr Gly Gly Arg
85 90 95 Lys Leu Ile Tyr Leu Gln Glu Leu Pro Gly Thr Asp Asp Tyr Val Phe
100 105 110 Tyr Cys Lys Asp Gln Arg Arg Gly Gly Leu Arg Tyr Met Gly Lys Leu
115 120 125 Val Gly Arg Asn Pro Asn Thr Asn Leu Glu Ala Leu Glu Glu Phe Lys
130 135 140 Lys Leu Val Gln His Lys Gly Leu Ser Glu Glu Asp Ile Phe Met Pro
105 110 115 cag cgc cgt ggg ggc ctg cgc tac atg gga aag ctt gtg ggt agg aat 438 Gln Arg Arg Gly Gly Leu Arg Tyr Met Gly Lys Leu Val Gly Arg Asn
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cgcccagtga cctgccgagg tcggcagcac agagctctgg ag atg aag acc ctg 54
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Met Lys Thr Leu
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85 on 95
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85 on 95
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130 135 140 cag gaa gct cat gta cet gca gga gct gcc cag gag gga cca cta cat 480 Gln Glu Ala His Val Pro Ala Gly Ala Ala Gln Glu Gly Pro Leu His 145 150 155 160 ctt tta ctg caa aga cca gca cca tgg ggg cet gct cca cat ggg aaa 528 Leu Leu Leu Gln Arg Pro Ala Pro Trp Gly Pro Ala Pro His Gly Lys
165 170 175 gct tgt ggg taggaattct gataccaacc gggaggccct ggaagaattt 577 Ala Cys Gly aagaaattgg tgcagcgcaa gggactctcg gaggaggaca ttttcacgcc cctgcagacg 637 ggaagctgcg ttcccgaaca ctaggcagcc cccgggtctg cacctccaga gcccacccta 697 ccaccagaca cagagcccgg accacctgga cctaccctcc agccatgacc cttccctgct 757 cccacccacc tgactccaaa taaag 782 <210> 12 <211> 179 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Arg Pro Val Thr Cys Arg Gly Arg Gln His Arg Ala Leu Glu Met Lys
1 5 10 15 Thr Leu Phe Leu Gly Val Thr Leu Gly Leu Ala Ala Ala Leu Ser Phe
20 25 30 Thr Leu Glu Glu Glu Asp Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Val Lys Ala Met
35 40 45 Val Val Asp Lys Asp Phe Pro Glu Asp Arg Arg Pro Arg Lys Val Ser
50 55 60 Pro Val Lys Val Thr Ala Leu Gly Gly Gly Lys Leu Glu Ala Thr Phe
65 70 75 80 Thr Phe Met Arg Glu Asp Arg Cys Ile Gln Lys Lys Ile Leu Met Arg
85 90 95 Lys Thr Glu Glu Pro Gly Lys Tyr Ser Ala Cys Leu Ser Ala Val Glu
<Desc/Clms Page number 71>
100 105 110 Met Asp Gln Ile Thr Pro Ala Leu Trp Glu Ala Leu Ala Ile Asp Thr
115 120 125 Leu Arg Lys Leu Arg Ile Gly Thr Arg Arg Pro Arg Ile Arg Trp Gly
130 135 140 Gln Glu Ala His Val Pro Ala Gly Ala Ala Gln Glu Gly Pro Leu His 145 150 155 160 Leu Leu Leu Gln Arg Pro Ala Pro Trp Gly Pro Ala Pro His Gly Lys
165 170 175 Ala Cys Gly <210> 13 <211> 542 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (43)..(297) <223> cDNA2098 (542) - forme courte (hOBPIIb-gamma) <400> 13 cgcccagtga cctgccgagg tcggcagcac agagctctgg ag atg aag acc ctg 54
Met Lys Thr Leu
1 ttc ctg ggt gtc acg ctc ggc ctg gcc gct gcc ctg tcc ttc acc ctg 102 Phe Leu Gly Val Thr Leu Gly Leu Ala Ala Ala Leu Ser Phe Thr Leu
5 10 15 20 gag gag gag gat gag gga gga tcg gtg cat cca gaa gaa aat cet gat 150 Glu Glu Glu Asp Glu Gly Gly Ser Val His Pro Glu Glu Asn Pro Asp
25 30 35 gcg gaa gac gga gga gcc tgg caa att cag cgc cta tgg ggg cag gaa 198 Ala Glu Asp Gly Gly Ala Trp Gln Ile Gln Arg Leu Trp Gly Gln Glu
40 45 50 gct cat ata cet gca gga gct gcc cag gag gga cca cta cat ctt tta 246 Ala His Ile Pro Ala Gly Ala Ala Gln Glu Gly Pro Leu His Leu Leu
55 60 65 ctg caa aga cca gca cca tgg ggg cet gct cca cat ggg aaa gct tgt 294 Leu Gln Arg Pro Ala Pro Trp Gly Pro Ala Pro His Gly Lys Ala Cys
70 75 80 ggg taggaattct gataccaacc gggaggccct ggaagaattt aagaaattgg 347 Gly
85 tgcagcgcaa gggactctcg gaggaggaca ttttcacgcc cctgcagacg ggaagctgcg 407
<Desc/Clms Page number 72>
ttcccgaaca ctaggcagcc cccgggtctg cacctccaga gcccacccta ccaccagaca 467 cagagcccgg accacctgga cctaccctcc agccatgacc cttccctgct cccacccacc 527 tgactccaaa taaag 542 <210> 14 <211> 85 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Met Lys Thr Leu Phe Leu Gly Val Thr Leu Gly Leu Ala Ala Ala Leu 1 5 10 15 Ser Phe Thr Leu Glu Glu Glu Asp Glu Gly Gly Ser Val His Pro Glu
20 25 30 Glu Asn Pro Asp Ala Glu Asp Gly Gly Ala Trp Gin Ile Gin Arg Leu
35 40 45 Trp Gly Gln Glu Ala His Ile Pro Ala Gly Ala Ala Gin Glu Gly Pro
50 55 60 Leu His Leu Leu Leu Gin Arg Pro Ala Pro Trp Gly Pro Ala Pro His
65 70 75 80 Gly Lys Ala Cys Gly
85 <210> 15 <211> 10664 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> G ne hOBPIIa <400> 15 ctctgcttct atattcggcc tccaaatctg tgctcaatgc agcaactgga gtgacccctt 60 aaatacgtaa gtcacagctt gcctttgtca gagctatcca gggtctttca ctcagagcag 120 aagctgaagt cctcgtggtg gtccttaatc cctacatggc cgttccaccc actccccagc 180 ctcatgtgtg gccggtctcc ctggatcatt tgctgtggct gctctgccgt gtgttcccgg 240 aaactgccag cgttctccca cctctgggct ggcactggat gctcctgcca cctggactcc 300 tcttccagct gacgagctca tggcttgctt ccttcatgtc ttaaattcgg tgtttgaatg 360 ccaccttggc gaggctgttc ctcatcaatt catgtaaagg acaaataacc ccttgtctgg 420 ccactcctgt ccaacttgtc cactttgctt tttccatagc actgatcacc atttaaaata 480
20 25 30 Glu Asn Pro Asp Ala Glu Asp Gly Gly Ala Trp Gin Ile Gin Arg Leu
35 40 45 Trp Gly Gln Glu Ala His Ile Pro Ala Gly Ala Ala Gin Glu Gly Pro
50 55 60 Leu His Leu Leu Leu Gin Arg Pro Ala Pro Trp Gly Pro Ala Pro His
65 70 75 80 Gly Lys Ala Cys Gly
85 <210> 15 <211> 10664 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> G ne hOBPIIa <400> 15 ctctgcttct atattcggcc tccaaatctg tgctcaatgc agcaactgga gtgacccctt 60 aaatacgtaa gtcacagctt gcctttgtca gagctatcca gggtctttca ctcagagcag 120 aagctgaagt cctcgtggtg gtccttaatc cctacatggc cgttccaccc actccccagc 180 ctcatgtgtg gccggtctcc ctggatcatt tgctgtggct gctctgccgt gtgttcccgg 240 aaactgccag cgttctccca cctctgggct ggcactggat gctcctgcca cctggactcc 300 tcttccagct gacgagctca tggcttgctt ccttcatgtc ttaaattcgg tgtttgaatg 360 ccaccttggc gaggctgttc ctcatcaatt catgtaaagg acaaataacc ccttgtctgg 420 ccactcctgt ccaacttgtc cactttgctt tttccatagc actgatcacc atttaaaata 480
<Desc/Clms Page number 73>
atgtatgaac cagtgaccca tcagtgacca gagacagtag attgaacagg tattgcttgc 540 acagtgaaca atcagctcta gaggtttaaa gagaaccaca aagaatggct caggattgca 600 cgagggcagt taaggaagaa ataaacaggg gtggggatcc tttccacaag tgtgggttca 660 gaccgcatgg gagaaggtgt ggttctccca agggaagctg gagaagtttg ctgggttgtc 720 ccagccacag ctggcccacg gtcagggcag aggccagcag gcagggaaat gtaggctggg 780 tctggcaagc aggaagcctc tcttcccccg caaggcaggt gggctggggc tgggaagcct 840 acaagagtca ctgggaaccc acaggtgcag atgccactga atctcaatag gaagccatct 900 gggggggtcc cctgaattca atgtggtgtg tgccgccaga cgtccccaac ttgtgccact 960 gccatttata caggaagaga aagaaaaagg aagaaatgga agcatctgga accagtcatc 1020 ctggacccat gctaggaggt gcttccccct acgcctcaac caacaaagct tagcattgca 1080 ccaggtgcac aagagaagcg cctgctggct ccagctccat tgcctcggaa ccagccatga 1140 agggtgcgtg tggagctgga ggcaagacat tgatagctgg cactgcaatt cacttattta 1200 ttttgttcat tttaagtccc ctgcacctag aatataagcc ccccaagcac aggacatttg 1260 ttttattgat cgatgtattc cttgtgcccc aaagaatgag aggcatctag aaagtctgca 1320 aaaatcaaac ataaaaatga acctttattc agtcattgtt attttgatgg atatttgagg 1380 catttccaag atttgtaagt aacaattgaa cccttctcct ggttcatgtg tgggagtgta 1440 tctgttcaaa tgatgcttct gagtggagtt gctgagtctt tggctctagg tttttttttt 1500 ttaagcattt atgctcattg tggtttttaa attaaacatttaaccctgag acactgtaga 1560 ttcccatgca attgtaaaaa gccacacaga gctatcatgt gtatcttcac ctggcttgct 1620 ccagccccaa ccccagcaat gacagacctg ttctccactc ctgcaatctg ctcattgcaa 1680 gaatgtcgtc tattgcaatc ataaaattgt gggattggct ttttttttcc tgtgcagcat 1740 cattctctgg agattcatcc tattgttgca tttatcaata gtttattcca ttttacttct 1800
<Desc/Clms Page number 74>
gagtagtgct ctatggtatg gatgtaccac agtctgttta accattcacc tgttggagga 1860 agtctgtgtt tatagatttg ggctatgaca catgtatagg tttttgcatg gacatcagtt 1920 ttcatttccc tgggacaaag gcccaggggt tctattgctg gattctatgc ttgttacagg 1980 gctcattttg ttttgttttg ctttgtttta ttttgttttt aacctgtcaa gccattttcc 2040 agatccagtt tccatgcatc ctcaccaggc ttcagtatga tcactatgat cttatctcag 2100 ccaccttaat aggtatgtac tgatatatca tggcttttat ttgcatttca ctgatgacta 2160 atggtgttga gcatcttttc atgtgtttat ttgccatctg tatatcctct ctagtcaagt 2220 gtcccttcat gtcttttgtt tacgttctat ttttgaaact gttgagtttt gaaaaattct 2280 ttataaagta tagaaactaa ttctttgttg aatatgtagt ttgtcaatat tttctttcag 2340 tctttggctt gtctttttat tctgttaaca gggtctctta cagagcaaaa ggtttttatt 2400 ttgatgaagt ctattttaac aatttttcct tttatggatc atatttttgg caacaaatct 2460 aaaacctcct gacccagctc catatgtcaa agattttctt gttttctaaa agttttatag 2520 ttttaagttt tatgttgaag tctatgatcc attttgagtt aattttcata cagggtgtga 2580 gaccaaggtt gtggttcttc tttttctttg gtggttttgt ctgtggatgt ccagttgctc 2640 cagcccattt gctacaaaag ctatctttcc tccactgaat tacttttgca tctttgtaaa 2700 aatgtaattg ggtgtatttg tacaggtctg tttgaggatt ctttattgtc tgtcccattg 2760 atctatgcat ctgtccatgt gctagctata taagtcttga aagggtagcc tgtagctggg 2820 tgtggtggcg agagcctgta atcccagcta ttcgggaagt ggaggcagga gaatcgattg 2880 aacccaggag gtggaggttg cagtgagtca agatcgtgcc actgcactcc agcctgggtg 2940
<Desc/Clms Page number 75>
acagagtgaa ctccatataa aaaaataaaa acaaaaataa agtagcgtga tttctcccac 3000 cttattcttt tttaaaaaag ttttagctat tccagttcct ttgcctttcc atataaattt 3060 tagaataatc ttgtctatat ctaccacaat tctttctgga attttgatag aaattttgtt 3120 acatctttat attatttgag agaaatgata tttttactat gttgagtctt ctaatccatg 3180 gatataacgt ctctccattt gtttagatct tctttgattt attttataat cattgcattg 3240 ttttcagcat acaaatccag catatgggtt gttagactta tgcctaggca tctcattttt 3300 ttagccatta taaatagtac tgtgttttta agtttagggt ccattactag tatgtagaca 3360 cacaattgat ctttgtatat ttatcttgtg tcctgcaacc ttgctgaact cacttactag 3420 ttctaggagg tgtattgttt tcttttgttt tgtttttcaa tttcttggga ttttctacag 3480 agataataat gtcatctgca gatgcagttt tcttccttcc tttccaattt gtatgtcttt 3540 aatttccttt ttaaaaaacc tatattactc tgactagaac tttctgtact atgttaaata 3600 caagtggtag agtggacatc cttgccttgt ccctgatgtt aaagagaaag catttgtaac 3660 tgagtatccc agcctcaaaa tgtgcttaaa aacttttttc ctttcttgct ttcagccttg 3720 aaacatactt cgaaactctt tatttctccc tttcccacca ggcacttccg tgagcagtgc 3780 tcgcttatct aattatgtgc ttacttagaa attccagggg ccaattttga aacaaaccag 3840 gcagagagac ccagctgcag aatcctccct cttaggggga gttacaggta gcctaccact 3900 tcccggctga aatcaggatg acgcaaacca gacctccgga cagacgattg atgactcaca 3960 ataaccatca gaacaagatg cagaccaaca tcctcctgca ccattcccac atatttccca 4020 caccttttcc tccttaaacc ccttcgctca gtccagaaaa tctgaatggt cttttaaagg 4080
<Desc/Clms Page number 76>
catgggtctg gccattcccc aactgccagt atttgaataa agctgctttc cttttaccac 4140 acctcacttc tcatgccttg acttctgagc agcgagcagc tggacttgag ccagttacac 4200 atcagtcttt caccattaga aataatgtag ccataggttt ttttttcgta gatgttcttt 4260 ttcaagttaa agaagttctc ttctattcct atttttctga gaggtgttat cccgaatgag 4320 tgttgaattt tgttaaatac ttttaacaac ccaacaggaa ccaccatcag aagccatcca 4380 gagaaacgca ccaggccaca aagcactggg ggccagggat cttgcccctg ctgtctgcca 4440 tgggttgacc cccagcctcc aaccctacca tcccctgacg gtgtctgcag cagttgaacc 4500 caaccagcat ctaaaagaac acagttggtg aacgagactg ggacacaggg caagatgggt 4560 ggacaatggg aggctcctgg agagcacccg taccagcgag catagaattc atgggggtga 4620 cctgttccct gaagcatctg cgcgtgttgt tccagcattt tcttcaagga ttgagccagc 4680 agcaccagtg tcatacggtg cttaaatcaa tgattcacag ccaaccaatg aaatacaagg 4740 tgccggctgg gcgcggtggc tcacgcctgt aatcccagca ctttgggagg ccgaggcggg 4800 cggatcacga ggtcaggaga tcgagaccat cccggctaaa acggtgaaac cccgtctcta 4860 ctaaaaatac aaaaaaaatt agccgggcgt agtggcgggc gcctgtagtc ccagctactt 4920 gggaggctga ggcaggagaa tggcgtgaac ccgggaggcg gagcttgcag tgagccaaga 4980 tcccgccact gcactccagc ctgggcgaca gagcgagact ccgtctcaaa aaaaaaaaaa 5040 aaaaaaaaaa aaaagaaata caaggtgcct ggggtacagg caacaaaaat ggggaacgga 5100 gaaatcttcc cgttgaggta gagactccag cctgtttgct catctctggt cctgaagagc 5160 ccagtccccg ccctaaggat ggggtttctg ctcggcagca cttgccgtga gaggggtgag 5220
<Desc/Clms Page number 77>
gcactgggtc acgccagccc tttctttata gcccccaggg tttattagag tgtgcattag 5280 tattatttag caagcacttg agggtgtctg atcttgggcc agagaggcac aaagattgtg 5340 tgggcccagc acctgcctgc agagcgtggg tcagccttgg gtcccagggc agatgacgca 5400 ggcccgggaa ctacagggtc caggagggag aaggcaaagt tctggctcag gttggctggg 5460 gatgaggcca gcggagccag gtgcccaagg gagctcagcc acaaactctg agcacaggct 5520 ggcaggtggc tcttgatgct catgccaccc atttatctaa agggatgaga ttcaaggcct 5580 gtcctggtgg ctgggggccg tcgaagctga cgagagaggg gatgtagagt gaatgtatat 5640 tccactctac cacttgtatt taacagggag atggatgatg aacacgtgca ggaggaaaca 5700 ggcaggacaa tccagagaga tcacgtgttc tgaggacagc acagccaggc tccggtacgg 5760 agtgaagcgg ggtggggcag gcggcggggt ccctcatatg gcccgaggag gccgtatata 5820 tactgacctt gagccacaca atagtgccct tctctgcccc taggaagctc gagtgcaggg 5880 tccaggtggg gaaaatcaat gcagagtggg tcccagagtg ggcggaagct tgggctctag 5940 ggcgtgcggg actcagctgg cagcagcccc acatctctat ggttctaaag cccagtccat 6000 ttctgctcag cagggagatg gccagttccc cagaggactt gcccagggtc ccagccgtgg 6060 ccctgggagg gctcaggggt gagggaggga gaattccgag ccgtgggccc tccctctgtg 6120 gctcggggtg cagacgtgca ctaccctgcc ctgtcctctg gagtcctccg ggctcatcca 6180 agtgggcgca tttgggtgca aaccctggac agcatcgtgt gtcttttctt ctctggctgg 6240 cactgaattg ctgttcacca gatgccagca atgaggacac tccccctccc ggatgcagga 6300 ctggttgcca ccatggggag gggtgcaccg tgccacgtgc tcccaggaca ctggccaggg 6360
<Desc/Clms Page number 78>
ggctataaag aacatctcga gaggagccag cacagccttg ttcagacgcc cagtgacctg 6420 ccgaggtcgg cagcacagag ctctggagat gaagaccctg ttcctgggtg tcacgctcgg 6480 cctggccgct gccctgtcct tcaccctgga ggaggaggat gtgagctggg ttggcgtggg 6540 cggatggagg agccaggtgg actcctgggc agggggcagt gccaggggcc ctgctttagg 6600 aggtgtcact taagcctggg gtggtggtgg aggggtccta ttgttccttc agcagacaat 6660 gctccccatg aggcccaggg ccggagcagg ctcggctcag gggttcctgc tgcactgacg 6720 cctgaagccc gaaggtctcg cagggttggg ccctgtggag ggagggctca cctggtgctg 6780 gggcccgggg gtccatgggg tgcagacatg ccctccttcc actgggggct gggagccctg 6840 agcagggggc tggctctaac tcactccagc tgagctctaa ctaaggtgca ggaacccagc 6900 ctgcctttag gggtggcagc cgggcaccat gggtgtctgg ttatagctgc aggcctgagt 6960 gccagggtca gagtagaatc tgggccaccc atggtgggct cacggccttg gcctgctcca 7020 gatcacaggg acctggtacg tgaaggccat ggtggtcgat aaggactttc cggaggacag 7080 gaggcccagg aaggtgtccc cagtgaaggt gacagccctg ggcggtggga acttggaagc 7140 cacgttcacc ttcatgtgag tgttgcccac tgcagggccc ctcaggccac tttcgctccc 7200 cgccccagac ccacctggtg cccattgccc catccacatt tcgggtgttg ggaagagtca 7260 ccccctgcct tggagggaaa cagccagggc atcctgaagc tcggtggggt gggggggcag 7320 tggaattttc aggttgccgg gtcagggcca tgcaccaggt gagctgagga tgggccaggt 7380 gtgtcctggg agccgctgcc cgcgtgtctc ctgttttcca ggagggagga tcggtgcatc 7440 cagaagaaaa tcctgatgcg gaagacggag gagcctggca aatacagcgc ctgtgagccc 7500
<Desc/Clms Page number 79>
ctccccgacc ccccactccc catgcccaac cccggatgca ccagccccac tgcaggtgga 7560 gagtgcccag gccacacttc tgccagggtc ccagccctgc ccacctccaa ggaggggctg 7620 gcctctcctt cctggggggc tggtggccct gacatcagac accaggtgtg acaggcttgt 7680 ccacagtaga gatggaccag atcaagcctg ccctctggga ggccctagcc attgacacat 7740 tgaggaatcc gagtgttagg gaccaggagg ccgagggtta gggatgggaa gccaaggctg 7800 agggtttggg atcaggaatc cgagggttag ggacagggaa gtggggcagg agcagctgct 7860 ggagctggga aggccggact ctagtcctgg acgtgctctg gccttgtggc tccattactt 7920 gcattgggac cttccgagag gaggctcctg cctccgtgtc cgggtccatg ctgtgcggag 7980 cagccaggcc tggctcaggc tgtccagggc acctgggtga ccactgaaac attcctgagt 8040 gtttcttcgt gtggtcctga gtgctctctc cgggaatgag ggcactgaag acccatcttc 8100 tctgtcatct acagatgggg gcaggaagct catatacctg caggagctgc ccgggacgga 8160 cgactacgtc ttttactgca aagaccagcg ccgtgggggc ctgcgctaca tgggaaagct 8220 tgtgggtgag gggcccgctg gggcctgcat gtcctgcccc atggtctctg cctccagaag 8280 ccagtggaac caccatcatc acgccctggc acggggggaa aaggaagccc cctgcgccgg 8340 ccttcgtgtg ctaggcacca agcgctgccc tggatggctg gtccaagttc ctgaagtggg 8400 agtggggtgg gccaggcagg gacagacacg gccctcggtg acgtgaacct gccaagggcc 8460 gcttgtgggg tctcaggtgt aggggcctca ccttaagggg gaggtancat cttaacagag 8520 ctcttcatgg ggcagggact ctccagggcg gcagggcagc cagtgcctct gggacacaag 8580 gtccctccag gtgagggttg tgaccctgca gagtggcttt gggagctgcc caggtccccc 8640
<Desc/Clms Page number 80>
tggggttgct gagtggcttg gaccctgcca ctgtcccctt tcctggggac ctctcacctg 8700 ggcggtggcc gtctcctctg tccccagtcc cacccctgag ctcttgtcca ttctcaggcc 8760 tcctctcccc cttgcctggt gctggacagt tgccatctct tctgtcccca gccccacccc 8820 tgagctctga tccactctcg ggcctctccc ccgtcctgat gctgggccgt ggtcgtctcc 8880 ttttagcatc tgctccctgc agggccgtgc cgctgtcccc acgtcggctc acctggccac 8940 ctcacctgca ggtaggaatc ctaataccaa cctggaggcc ctggaagaat ttaagaaatt 9000 ggtgcagcac aagggactct cggaggagga cattttcacg cccctgcaga cgggtgagga 9060 cggctgtgcc cagtaccccg tgttcccctg tgtctctgtg tgatctccag tgtcccatga 9120 ccctcgtgtc ctcccatgtc ccccgcattc cccatgtgcc ccgagtctcc tcgcaggggc 9180 tctgggccct gcttagcatc ctcgtcgttg gagggtctgc actctgggct gcgatggggt 9240 ctggggctcc gcgctctggg ctgcgatgcg gtctggggct ccgcgctctg ggctgcgatg 9300 gggtctgggg ctccgcgctc tgggctgcga tggggtctgg ggctccgcgc tctgggctgc 9360 gatggggtct ggggctccgc gctctgggct gcgatggggt ctggggctcc gcgctctggg 9420 ctgcgatggg gtctggggct ccgcgctctg ggctgcgatg gggtctgggg ctccgcgctc 9480 tgggctgcga tggggtctgg ggctccgcgc tctgggctgc gatggggtct ggggctctga 9540 gctctgggct gcgatggggt ctgggccctg gtctagggcg ccttctaatc cctgggtttt 9600 tcttggtctc tgcaggaagc tgcgttctcg aacactaggg tgagtgagcc tttaggaggg 9660 cactggacaa gcccagagtc ctgggttccc ggggttcgag ggtacatctg ctctggccct 9720 tcccatccca cacagccagg gagacccccc cagggtcagg cacgaggttg gcacctcaga 9780
<Desc/Clms Page number 81>
gtctgcccac ccaaaattcc tgggacattc gggaagtcct ttgttttacc attcctgcac 9840 ctgccagccc gagtgagggt cctcctcggc ctttccacag cgaggcctcc ctccggctcc 9900 ctcaggtgtc agctcggccc atcgccccct gcacctgtcc ccactcggtc tactcccccc 9960 cacccactca ccaaggatgc tcagaggcct gcccagtcat tggaggagct gaggctgctc 10020 tggagccccg aggctgccca gcagtggccg atgtggaagc tgcagagcct ggggagggag 10080 ctctgggcct ggcctctgcc ctaccctgca gcctccctga cctctgctcc tcttcccagc 10140 acagcagccc ccgggtctgc acctccagag cccaccctac caccagacac agagcccgga 10200 ccacctggac ctaccctcca gccatgaccc ttccctgctc ccacccacct gactccaaat 10260 aaagagcttc tcccccagct ctgggcaggc ctatctgtgg ggacggaggg gctcgcaccg 10320 gctccctggg aggcctgctg ggagggggag ccacaaggga agctggggag atgttggacc 10380 tagcaagggc caaaccacaa gaggcacgat gtccaacagg ctgtggggct gcgtgatgtc 10440 ctggaggggc ctccggaaga gccgccctcg gatctcaggc tcagcttggg acgggcaggg 10500 ctctgggcag gagcacttgg gaagccactg ggagggccgg agtggggaca cggcgtcaga 10560 cctgcatcag tgggtccacc acagggctcc cgccccgggg gtctcagtgg gatcctccga 10620 gcgggtccac tttancatcc tgngctcagt ggcatcactg gata 10664 <210> 16 <211> 13591 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> G ne hOBPIIb <400> 16 tctctgcttc tatattcggc ctccaaatct gtgctcaatg cagcaactgg agtgacccct 60 taaatacgta agtcacagct tgcctttgtc agagctctcc agggtctttc actcagagca 120
<Desc/Clms Page number 82>
gaagctgaag tcctcgtggt ggtccttaat ccctacatgg cagttccacc cactccccag 180 cctcatgtgt ggccggtctc cctggatcat ttgctgtggc tgctctgctg tgtgttcccg 240 gaaactgcca gcattctccc acctccaggc tggcactgga tgctcctgcc acctggactc 300 ctcttccagc tgacgagctc atggcttgct tccttcatgt cttaaattcg gtgtttgaat 360 gccaccttgg cggggctgtt cctcatcaat tcatttaaag gacaaataac cccttgtcct 420 gacactcctg tccaacttgt ccactttgct ttttccatag cactgatcac catttaaaat 480 aacgtatgaa ccagtgaccc atcaggatcc agagacaata gattgaacag ggattgcttg 540 cacaatgaac aatcagctct agaggtttaa agagaaccac aaagaatggc tcaggattgc 600 acgagggcag ttaaggaaga aataaacagg ggtggggatc ctttccacaa gtctgggttc 660 agacctcatg ggagaaggtg tggttctccc aagggaagct ggagaagttt gctgggttgt 720 cccagccaca gctggcccac ggtcagggca gaggccagca ggcagggaaa tgtaggctgg 780 gtctggcaag caggaagcct ctctccccac ccaaggcagg tgggctgggg ctgggaagcc 840 tgcaagagtc actgagaacc cacaggtgca gatgccactg aatctcaata ggaagccatc 900 tgggggcggt cccctgaatt caatgtggtg tgtgccgcca gacgtccccg acttgtgcca 960 ctgccatttg cataggaaga gaaagaaaaa ggaagaaatg gaagcatctg gaaccagtca 1020 tcctggaccc atgctaggag gcgcttctcc ctacgcctca accaacaaag cttagcattg 1080 caccaggtgc acaagagaag cgcctgcttg ctccagctcc attgcctcgg aaccggccat 1140 gaagggtacg tgtggagctg gaggcaagac attgatagct ggcactgcaa ttcacttatt 1200 tattgtgttc attttaagtc ccctgcacct agaatataag ccccccgagc acaggacatt 1260 tgtttcattg atcgatgtat tccttgtgcc ccaaagaatg agaggcatct agaaagtctg 1320 caaaaatcaa acataaaaat gaacctttat tcagtcattg ttattttgat ggaaatttga 1380 ggcatttcca agatttgtaa gtaacaattg aacccttctg ctggttcatg tgtgggagtg 1440 tatctgttga aatgatgctt ctgagtggag ttgctgagtc tttggctcta ggtttttttt 1500 ttttaagcat ttatgcttat tgtggttttt aaattaaaca tttaaccctg agacattgta 1560
<Desc/Clms Page number 83>
attcccatg cagttgtaaa aagccacaca gagctatcat gtgtatcttc acctggcttg 620 tccagcccc aaccccagca atgacagacc tgttctccac tcctgaaatc tgctcattgc 680 agaatgtcg tctattgcaa tcataaaatt gtgggattgg cttttttttt tcctgtgcag 740 atcattctc tggagattca tcccattgtt gcatttatca atagtttatt ccattttact 800 ctgagtagt gctctatggt atggatgtac cacagtctgt ttaactattc acctgttgga 860 gatgtctgt gtttatagat ttgggctatg acacatgtac aggtttttgc atggacatca 920 ttttcattt ttctgggaca aaggcccagg ggttctattg cggggttcta tgcttgttgc 980 gggtttttt tttttaaacc tgtcaagcca ttttccagaa actgtccagt ttccatgcat 040 :ctcaccagg cttcagtatg atcactatga tcttatctca gccaccttaa taggtatgta :100 :tgatatatc atggctttta tttgcatttc actgatgact aatggtgttg agcatctttt @160 :atgtgttta tttgccatct gtatatcctc tctagtcaag tgtcccttca tgtcttttgt !220 ;tacattcta tttttgaaac tgttgagttt tgaaaaattc tttataaagt atagaaacta !280 ittctttgtt gaatatgtag tttgtcaata ttttctttca gtctttggct tgtcttttta @340 @tctgttaac agggtctctt acagagcaaa aggtttttat tttgatgaag tctattttaa 2400 :aatttttcc ttttatggat catatttttg gtgacacatc taaaatctcc tgacccagct 2460 @catatccca aagattttct ttctgttttc taaagctttt atagttttaa gttttatgtt 2520 :aagtctatg atccattttg agttaatttt cttgcagggt gtgagaccaa ggttgtggtt 2580 cttctttttg tttggtggtt ttgtctgtgg atgtccagtt aatccagccc atttgctaca 2640 iaagctatct tccattgaat tgcttttgca tctttgtaaa aacttaactg ggtatatgcg 2700
<Desc/Clms Page number 84>
tgcaggtctg tttgaggatt ctttattgtc tgtcccattg atctatgcat ctgtccatct 2760 gctagctata taatgagtct tgaaagggta gcctgtagct gggtatggtg gtgtgcatct 2820 gtaatcccag ctacttggga ggcggaggca ggagaatcac ttgaatctgg gaggtggagg 2880 ttgcaatgag tcgagattgt gctactgcac tccagcctgg gtgacagagc aagactctgt 2940 ctctaaaaaa aagaaagaag aagaaaagga aagaaagggt agcctgattc ctcccacttt 3000 attcttaaaa aaaaaagttt tagttattct agttcctttg cctttccata taaatgttag 3060 aataatcttg tctatgtcta caaaaattcc ttctggaatt ttgatagaaa ttgtgttaaa 3120 tctttatatt atttgagaga aatgacgctt ttattatgtt gagtctccta atccatggat 3180 atagcacatc tctccatttg tttagatctt ctttgattta ttttataatc attgcattat 3240 tttcagcata caaatccagc atatgggttg ttaaacttat gcctaggtat ctcttttttt 3300 tagccactat aagtagtatt gtgtttttaa gtttagggtc cgttactagt atgtagacac 3360 acaattgatc tttgtatatt tatcttgtat cctgcaacct tgctgaactc gcttaatagt 3420 tctaggaggt gtattgtttt cttttgtttt gtttttcagt ttcttgggat tttctacaga 3480 gacaatcatg tcatctgcag atgcagacag ttttcttcct tcctttccaa tttgtatgtc 3540 tttaatttcc tttttaaaaa acctttattg ctctgactag aactttctgt actatgttaa 3600 atacaagtgg tgaaagtgga catccttgcc ttgtccctga tgttaaggag aaagcgtttg 3660 taactgagta tcccagcctc aaaatgtgct taaaaacttt tttcctttct tgctttcagc 3720 cttgaaacat acttcgaaac tctttatttc tccctttccc accaggcact tctgtgagca 3780 gtgctcgctt atctaattat gtgcttactt agaaattcca ggggccaatt ttgaaacaaa 3840
<Desc/Clms Page number 85>
ccaggcagag agacccagct gcagaatcct ccctcttagg gggagttaca ggtagcctac 3900 cacttcccgg ctgaaatcag gatgactcaa accagacctc tggacagacg attaatgact 3960 catgataacc attggaacaa gatgcagacc aacatcctcc tgcaccattc ccacatattt 4020 cccacacctt ttcctcctta aaccccttcg ctcagtccag aaagtttgaa tggtctttta 4080 aaggcatggg gcctggccat tcctctactg ctagcatttg aataatgctg ctttcctttc 4140 accacacttc acttctcatg ccttgacttc tgagcagcga gcagctggac ttgagccagt 4200 tacacatcag tctttcacca tgagaaatga tgttagccat aggttttttg tagatgctct 4260 ttgtcaagtt aaggaggttc tcttctattc ctacttttct gagagttgtt ttcctgaatg 4320 cgtgatgaat ttagtcaagt actttttctg cattgatcga tatgatcatg taatttttct 4380 tcttaacata ttaatatggt tgatttttga gtattgtacc aggtttccat ccctggaata 4440 aactgctttt ggtcatggtg tagaattaat tttatatatt attatttgct aatattttgt 4500 aaaggatttc tgtatctata ttcatgaggt atattgttct gcagctttcc tttttgtgtt 4560 gtcaggtttt ggttgggaga tattctctca tcttctgaga ttatgcagag ttggtgttat 4620 ttatttttta aatggttggt agaattttct aatgaaacca tatggacatg aagaattatt 4680 tttggaagct tttaaaatta aaatgttaac tttaattgtc atagagctat taaagttatc 4740 tatcttatat tggcattgtg ttttttgaga aattggttca tttcacctat gttgtcaaat 4800 atatgtggga aggtctcttc gtagtattcc cttattatcc tttgatgtct gcagggtctg 4860 tagtgatagt ctctgttttg ttccagatgt tggttatttg tgtctttctt tctttttttg 4920 tttgtcagtc tttctagaac tgcctcaatt ttattaattt ttccagagaa ctaacccttg 4980
<Desc/Clms Page number 86>
tttcattgtt tttctctgtt gtttttctgc tttcgatttt ttctgctttc tgcttttgat 5040 ttattaattg ctgctcttat ctttgttatt tcttttcttc ttgctttggg tttattttgc 5100 tcttcttttt ctaggttctt gaagtgggag cttagatagt tgattttgga cttctctttt 5160 ctaatatatg catttaatgc ctctcagcac tgatttagct gtgtctcaca aattttgata 5220 tgtttttgtt tgtttgtttt tgaggtagag tctcgctctg tatcccaggc tggagtgcag 5280 tggcactatc ttggctcact gcaacctcca cctcctgggt tgaagtaatt ctcctgcttc 5340 agccccctaa gtagctggga ttacaggtat acgccaccat gcccagcaat ttatttattt 5400 atttattttt gtatttttag tagagatgag gttttgtcat gctgtccagg ctggtctcga 5460 actcctgacc tcaagtgatc tgcccacgtg gggctccaaa gcactgagat tataggcata 5520 agccactgtg cccagcctgt ttttgttttt tttgagatgg agtcttgctc tgtcacccag 5580 gctggagtgc agtggcatga tagcccactg caacctccgc ctcccgggtt caagtgattc 5640 tcctgcctca gcctcccgat tagctgggat tacaggcgtg caccaccaca ctcagctagt 5700 ttttgcattt ttggtagaga tgggttttcg ccatgttggc caggctggtc tcgaattcct 5760 gatcgcaagt gatccacccg cctgggcctc ccaaagtgct ggaattatag gcacaagcca 5820 tcacgcccag ctgatatgtt gtattttcat tttcatccag cctagtatat ttttaaattt 5880 accttcaggc ttcctctttg acctgtggat tattcacagg tgtgttgttt ccaagcatct 5940 gaagaaagat tttccattat ctttctggca ttgatttata gttagattcc atgtggtcag 6000 agactaccct ctatatcatt taaattttta aaaatttctt gaggctcatt ttctcatcca 6060 ggatatggtc tatcttggta tatattctgg tgcacttgaa aagaatgtgt gtagtgctgt 6120
<Desc/Clms Page number 87>
tgccaggtgg tgtgttctac aaatgtcaat tcgattatgt taattgatgg gtggccgagt 6180 tctttgatgt ccctgctggt tttctgtcta gttgctctga gagaagggta ttgaagtctc 6240 caactataat tgtggctttt taaatttctc ctttcagttc tgttttgctt cacatattgt 6300 gcagctaatg tttggtgcac acacgtttag gattactatg tcttctttgc agaatggccc 6360 acttattatt gtataatttc cctctctgtt aattagtctt tgttctaaag tctattttac 6420 ctgttattga aataatgctt ctgctttctt ttgattaatg tttatatatc ttttttcatg 6480 tttttacttt caacctgtct ctattgttac atttgaagta agtttcttgt agacggcata 6540 tagttgtata atggctttta attcactttg ccaatcactg tcatttaata tttaaaccat 6600 ttacatttaa tataattatt aacatgctag agtttgtatt atttttatag ggttgctata 6660 acaaaatact accaactggg tggcttagaa caaaaattta ttttctcaca ttctggtggc 6720 cagaagtctg agatcaagtg agatttggaa ggtagaaaaa ccaacaaaat atgttaatga 6780 tgttaccatt gtgggcaact gggactcagt ccttctgagg gccatctgag aaatagggtg 6840 gaaccatatt tgattgttcc acttagaagg aagagtccag accatttatc ccatcagtta 6900 ctatccctac agactgagga tgctgattca cttgcacatc tgggtttcat cagtgtcagg 6960 ggaagcacag aagaaaaggt gcaggcactt aaggtgggaa gctgtgaata cgtccgtgca 7020 ccaggaacga tctacaactg tggcaggtgg gccgacagcg tgggtcacca gtgccttcag 7080 ccaccccttg cactgcactg acccactcac acagcaaatc aagtccattt tgtaactgat 7140 gcttcagcat ggtggccagc caccgtctct gaaataatta aaataggtgg ttggtggcac 7200 aggcgatggt ccctactgtg cagttggtct tgcagcctta actgagattc atcgtaagct 7260
<Desc/Clms Page number 88>
cccactctgc tccttcttgg cgtgcctcag tcccagccag cacatgctct ggtctaggtg 7320 cttgtttggt ggtgccatct aaaccttctt atgcccaggt gtcgagtaaa gcccagacac 7380 tgtccacttc agtgaagcac ctaggaatta gcagccctga aaagctgtga tcactgtgag 7440 attcaaagaa aagggtcgtg agggaagtgg tgagagagaa agttgtgtgg tagcggcagc 7500 ccaacaggag ccaccatcag aaggaacaca gccatccaga gaagtgcccc aggccacaaa 7560 gcactggggg ccagagatct cacccctcat gtctgccatg ggttgacccc caacctccag 7620 ccctaccatc tcctgacggt gtctgcacca gttgaaccca accagtatct aaaaggacac 7680 agttggcgaa tgagactggg acacagggca agatgggtgg atgatgggag actcctggag 7740 agcacccgtc gcactgagcg tggacctcat gggagagccc tgttctctga agcatctgtg 7800 catgtcgttc cagcattttc ttcaaggatt gagccagcag caccagtgtt gtaaggtgct 7860 tagatcaatg attcacaaac aaccaatgaa atacgaggtg cctggggtac agtcaacaaa 7920 cacagagaac agagaaacct tcccgttgat gtagagactc cagcctgttt gctcatctct 7980 ggtcctgaag agcccaggcc ccattctttc ctgcccgggg ggatgagggt ggggggtttc 8040 tgcttggcag cacttgccgt gggaggggtg agggactggg tcacgccagc ccgttcgtta 8100 cagccccagg gtttattaga gtgtgcatta gtattattga gtaagtactt gagagtgtct 8160 gatcttgggc cagagaggca caaagatgcc attgtgtggg tccagcacct gcctgcagag 8220 cgtgggtcag ccttgggtcc cagggaagat gacacacacc tgggaaatgc agggtccggg 8280 agggagaagg caaagttctg gctcaggttg gctggggatg aggccagcag agccaggtgc 8340 ccaagggacc tcagccacga actctgagca caggctggca ggtgactctt ggtgcctcat 8400
<Desc/Clms Page number 89>
gcgacttgtt tatctaaagg gatgagattc aaggcctgtc ctgggggctg ggggccgtca 8460 aagctgacga gagaggggaa tgtatattct aacagggaga tggtcgatga atacgtgcag 8520 gaagaaatgg acaggacaat ccagagagat cgcgtgttct gaggacagca cagccaggct 8580 ccggtacgga gtgaagcggg gtcggggagg cggcggggtc cctcatatgg cccgaggagg 8640 ccgtatataa actgaccctg agccacaaaa tagtgccctc ctctgcccct aggaagctcg 8700 agtgcagggt ccaggtgggg aaaatcaatg cagagtgggt cccagagtgg gcggaagctt 8760 gggctctagg gcgtgcggga ctcagctggc agcagcccca cgtctctctg gttctaaagc 8820 ccagtccatt tctgctcagc agggagatgg ccagttcccc agaggacttg cccagggtcc 8880 cagccgtggc cctgggaggg tgcaggggtt ggtgagggag tatcccgagg ctgtgggccc 8940 tgcctctgtg gcttggggtg cagatggaca ccaccctgcc ctgtcctctc gagtcctctg 9000 ggctcatctg agtgggcgcg ttcgggtggt gcaaactctg gatggcatcg tgtgtctttt 9060 cttctctggc tggcactgac ttgctgttca ccagatgcca gcaatgagga cactccccct 9120 cccggatgca ggactggttg ccaccatggg gaggggtgca ccgtgccacg tgctcccagg 9180 acactggcca gggggctata aagaacatct cgagaggagc cagcacagcc ttgttcagac 9240 gcccagtgac ctgccgaggt cggcagcaca gagctctgga gatgaagacc ctgttcctgg 9300 gtgtcacgct cggcctggcc gctgccctgt ccttcaccct ggaggaggag gatgtgagct 9360 gggttggcgt gggcggatgg aggagccagg cggactcctg ggcagggggc agtgccaggg 9420 gccctgcttt aggaggtgtc actgaaggct ggcttctgac cccgtgctcc cagcctgggg 9480 tggtggtgga ggggtcctat tgttcctcca gcagacacgg ccccccgagg cccagggccg 9540
<Desc/Clms Page number 90>
gagcaggctc gtctcagggg ttcctgctgc actgacgcct gaagcccgaa ggtctcgcag 9600 ggttgggccc tgtggaggga gggctcacct ggtgctgggg cccgggggtc catggggtgc 9660 agacatgccc tccttccact gggggctggg agccctgagc agggggctgg ctctaactca 9720 ctccagctga gctctaacta aggtgcagga acacagcctg cctttaaggg cagcagccgg 9780 gcaccatggg tgtctggtta tagctgcagg cctgagtgcc agggtcagag tagaatctgg 9840 gccacccatg gtgggctcac ggccttggcc tgctccagat cacagggacc tggtacgtga 9900 aggccatggt ggtcgataag gactttccgg aggacaggag gcccaggaag gtgtccccag 9960 tgaaggtgac agccctgggc ggtgggaagt tggaagccac gttcaccttc atgtgagtgt 10020 tgcccactgc agggcccctc aggccacttt cgctcccctc cccagaccca cctggtgccc 10080 attgccccat ccacgtttcg ggtgttggga agagtcaccc cctgccttgg agggaaacag 10140 cctgggcatc ctgaagctcg gtggggtggg ggacagtgga attttcaggt tgccgggtca 10200 gggccatgca ccaggtgagc tgaggatggg ccatgggtgt cctgggagcc gctgcccgcg 10260 tgtctcctgt tttccaggag ggaggatcgg tgcatccaga agaaaatcct gatgcggaag 10320 acggaggagc ctggcaaata cagcgcctgt gagcccctcc cccactccca cccccaccct 10380 cccccaccgc caaccccagt gcaccagcct ccacaggtag agagtgccca ggctgccctt 10440 ttgccagggc cccagctctg cccacctcca aggaggggct ggcctctcct tcctgggggg 10500 ctggtggccc tgacatcaga caccgggtgt gacaggcttg tccgcagtcg agatggacca 10560 gatcacgcct gccctctggg aggccctagc cattgacaca ttgaggaagc tgaggattgg 10620 gacaaggagg ccaaggatta ggtacgggga ggctgagggt tagggatggg gaagctgagg 10680
<Desc/Clms Page number 91>
[ttaaggatg gggaagctga gggttaagga tggggaggct gagggttagg gacgggggcc 0740 iagggttagg gatcgggaag ctgagggtta gggatgagga ggccgagggt tagggatggg .0800 aggccgagg gttagtgctg cggaagctga ggattagaga tggggaggct gagggggaag .0860 itgagggtta gggacaggga agtggggcag gagcagctgc tggagctggg aaggccggac .0920 :ctagtcctg gacgtgctct ggccttgtgg ctccattact tgcattggga ccttcctgag L0980 iggaggctcc tgcctccgtg tccgggtcca cactgtgcgg agcagccagg cctggctcag L1040 gctgtccagg gcacctgggt gaccgctgaa acattcccga gtgtttcttc atgtggcccc L1100 jagtgttctc tctgggaatg acccattttc tctgtcatct acagatgggg gcaggaagct L1160 :atgtacctg caggagctgc ccaggaggga ccactacatc ttttactgca aagaccagca L1220 catgggggc ctgctccaca tgggaaagct tgtgggtgag gggcttgctg gggtctgcgt 11280 gtcctgcccc acggtctctg cctctggaag ccggtggaac cagcaccacc atgccctggc L1340 tgggggaaa aggaagcccc ctgtgccggc tttcatgtgc cgggcaccgc tgggcagccg 11400 gtccaagtac ctgaagtggg aatgggatgg gccaggcagg gacagacatg gccctcagtg 11460 acatgaacct gccaagggcc acttctgggg tctcgggtgt aggagggtca ccttaagggg 11520 gagggtcacc ttaagcgtcc taagagagct cttcatgggg cagggaccct ccagggcagg 11580 agggtggccg gtgcctctgg gagacaaggt ccctccaggt gagggctgtg accctgcagg 11640 gtggcattgg gagctgccca ggtcccctgg ggttgccgag tggcttggag agtccccgcc 11700 actgtccccc ttcctgggga cctctcatct gggcagtgac tgtctcctct gtccccagtc 11760 ccacccctga gctctcatcc attctcaagt ctcctctcct gcttgtccgg tgctgggcta 11820
<Desc/Clms Page number 92>
tggccatctc ttctgtcccc ggccccaccc cagagctctg gtccactctt gggtctctcc 11880 ccttgtcctg gtgctgggca gtggccatct cctctgtccc cagccccacc cccgagctct 11940 gatccactct caggcctctc cccctgtcct ggtgctgggc cgtggtcgtc tcctttcggc 12000 atctgctccc tgcagggccg tgccgctgtc cccacgtcgg ctcacctggc cacctcacct 12060 gcaggtagga attctgatac caaccgggag gccctggaag aatttaagaa attggtgcag 12120 cgcaagggac tctcggagga ggacattttc acgcccctgc agacgggtga ggatggctgt 12180 gcccagtccc ctgtgtccct ctgctgtgtc tgtctgctat ctccagtgtc ccatgacccc 12240 catgtcctcc catgtccccc gcattcccca tgtgccccga gtctcctcgc aggggctccc 12300 gggccctgtt tagcgtcctc ctcattggag gctctgtgct ctgggctgcg atggggtctg 12360 gggctccgcg ctctgggctg cgatggggtc tggggctccg cactctgggc tgcgatgggg 12420 tctggggctc cgcgctctgg gctgcgatgg gctctggggc tctgagctct gggctgtgat 12480 ggggtctggg ccctggtcta gggcgccttc taatccctgggtttttcttg gtctctgcag 12540 gaagctgcgt tcccgaacac tagggtgagt gagcctttag gagggcactg gacaagccca 12600 gagtcctggg ttcccggggt tcgagggtac atctgctctg gcccctccca tcccacacag 12660 ccagggagac ccccccaggg tcaggcacga ggttggcacc tcagagtctg cccacccaca 12720 gttcctggga cattcgggaa gtcctttgtt ttatcattcc tgcacctgcc agcccgagtg 12780 agggtcctcc tcggcctttc cacagcgagg cctccctccg gctccctcag gtgtcagctc 12840 agcccatcgc cccctgcacc tgtccccacg cggtccactc cccaccatcc acccaccaag 12900 gatgctcaga ggcctgccca gtcattggag gagctgaggt cgctctggag ccccgaggtt 12960
<Desc/Clms Page number 93>
gcccagcagt ggccgatgtg ggggctgcag agcctgggga gggagctctg gccctggcct 13020 ctgccctacc ctgcagcctc cctgacctct gctcctcttc ccagcacagc agcccccggg 13080 tctgcacctc cagagcccac cctaccacca gacacagagc ccggaccacc tggacctacc 13140 ctccagccat gacccttccc tgctcccacc cacctgactc caaataaagt ccttctcccc 13200 cagctctggg caggcctatc tgtggggaca gaggggcttg cacccgctcc ctgggaggtc 13260 tgctgggagg gggagccaca agggaagctg gggagatgtt ggacctagca agggccaaac 13320 cacaagaggc acgatgtcca acaggcctga ggggctgcgt gatgtcctgg aggggcctcc 13380 ggaagagccg ccctcaggtc tcaggttcag cttaggacag gcagggccct gggcaggagc 13440 gtttggaaag ccactgggga ggacaggagc ggggacacgg cgtcagggct gcagcagtgg 13500 ggccaccgca gggctcccgc ctcaggggtc tcagagggat cctccaagct cccccatttt 13560 agcagcctgg gctcagtggc agcactggag a 13591
Claims (45)
1. Polypeptide isolé comprenant une séquence en amino-acides ayant au moins 90% d'identité avec les séquences en amino-acides SEQ ID N 2, SEQ ID N 4, SEQ ID N 6, SEQ ID N 8, SEQ ID N 10, SEQ ID N 12 ou SEQ ID N 14.
2. Polypeptide isolé caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide choisi parmi : a) un polypeptide de séquence SEQ ID N 2, SEQ ID N 4, SEQ ID N 6, SEQ ID N 8, SEQ ID N 10, SEQ ID N 12 ou SEQ ID N 14; b) un polypeptide variant de polypeptide de séquences d'acides aminés défini en a) ; c) un polypeptide homologue au polypeptide défini en a) ou b) et comportant au moins 90 % d'identité avec ledit polypeptide de a) ; d) un fragment d'au moins 15 acides aminés consécutifs d'un polypeptide défini en a), b) ou c) ; e) un fragment biologiquement actif d'un polypeptide défini en a), b) ou c).
3. Polypeptide isolé sélectionné parmi un polypeptide correspondant à la séquence SEQ ID N 2 et dénommé OBPIIaa , à la séquence SEQ ID N 4 et dénommé OBPIIap , à la séquence SEQ ID N 6 et dénommé OBPIIay , à la séquence SEQ ID N 10 et dénommé OBPIIba , à la séquence SEQ ID N 12 et dénommé OBPIIbp .
4. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 caractérisé en ce qu'il comporte au moins le domaine Gly-Thr-Trp-Tyr.
5. Polynucléotide isolé caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4.
<Desc/Clms Page number 95>
6. Polynucléotide selon la revendication 5 de séquence SEQ ID N 1, SEQ ID N 3 , SEQ ID N 5, SEQ ID N 7, SEQ ID N 9, SEQ ID N 11ou SEQ ID N 13.
7. Polynucléotide isolé caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide choisi parmi : a) un polynucléotide de séquence SEQ ID N 1, SEQ ID N 3 , SEQ ID N 5, SEQ ID N 7, SEQ ID N 9, SEQ ID N 11ou SEQ ID N 13 ou dont la séquence est celle de l'ARN correspondant à la séquence SEQ ID N 1, SEQ ID N 3 , SEQ ID N 5, SEQ ID N 7, SEQ ID N 9, SEQ ID N 11ou SEQ ID N 13 ; b) un polynucléotide dont la séquence est complémentaire de la séquence d'un polynucléotide défini en a), c) un polynucléotide dont la séquence comporte au moins 80% d'identité, avec un polynucléotide défini en a) ou b), d) un polynucléotide hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence de polynucléotide défini en a), b) ou c), e) un fragment d'au moins 15 nucléotides consécutifs, de préférence 21 nucléotides consécutifs, et de manière préférée 30 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide défini en a), b), c) ou d).
8. Polynucléotide selon la revendication 7 caractérisé en ce qu'il est marqué directement ou indirectement par un composé radioactif ou un composé non radioactif.
9. Utilisation d'un polynucléotide selon la revendication 8 en tant que sonde pour la détection de séquences nucléiques.
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10. Utilisation d'un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 5 à 8 en tant qu'amorce pour l'amplification ou la polymérisation de séquences nucléiques.
11. Utilisation d'un polynucléotide selon la revendication 8 en tant que oligonucléotide sens ou antisens pour contrôler l'expression du produit protéique correspondant.
12. Vecteur recombinant de clonage d'un polynucléotide selon l'une des revendications 5 à 8 et/ou d'expression d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé en ce qu'il contient un polynucléotide selon l'une quelconque des revendications 5 à 8.
13. Vecteur selon la revendication 12 caractérisé en ce qu'il comporte les éléments permettant l'expression éventuellement la sécrétion dudit polypeptide dans une cellule hôte.
14. Vecteur selon l'une quelconque des revendications 12 à 13 caractérisé en ce que les éléments permettant l'expression dudit polypeptide sont choisis parmi : a) le polynucléotide isolé de séquence SED ID N 15 et SEQ ID N 16 ; b) un polynucléotide dont la séquence est complémentaire de la séquence du polynucléotide défini en a) ; c) un polynucléotide dont la séquence comporte au moins 80% d'identité avec un polynucléotide défini en a) ou en b) ; d) un polynucléotide hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence du polynucléotide défini en a), b) ou c).
15. Vecteur selon les revendications 13 et 14 pour l'expression dans les cellules eucaryotes sélectionnés parmi l'ADN viral et l'ADN nu.
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16. Cellule hôte, caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur selon l'une des revendications 12 à 15.
17. Procédé de préparation d'un polypeptide recombinant caractérisé en ce que l'on cultive une cellule hôte selon la revendication 16 dans des conditions permettant l'expression et éventuellement la sécrétion dudit polypeptide recombinant et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.
18. Polypeptide recombinant susceptible d'être obtenu par un procédé selon la revendication 17.
19. Utilisation d'un polypeptide choisi parmi un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 18 ou l'un de ses fragments, comme protéine de liaison à un ligand hydrophobe de préférence une molécule odorante.
20. Utilisation d'un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 18 ou l'un de ses fragments, comme inhibiteur compétitif comme, agoniste ou antagoniste des récepteurs cellulaires aux lipocalines.
21. Anticorps monoclonal ou polyclonal et ses fragments caractérisé en ce qu'il est dirigé spécifiquement contre un polypeptide isolé selon l'une des revendications 1 à 4 et 18.
22. Utilisation d'un anticorps selon la revendication 21 pour la mise en évidence de la présence d'un polypeptide selon l'une des revendications 1 à 4 et 18 dans un échantillon biologique.
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23. Procédé de détection d'anticorps dirigé contre hOBPII dans le sérum humain de patient allergique et/ou asthmatique en utilisant un polypeptide hOBPII.
24. Procédé pour contrôler la volatilisation d'une odeur caractérisé en ce qu'il comprend une étape de liaison de ladite odeur avec un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 18.
25. Procédé selon la revendication 24 caractérisé en ce que le polypeptide est lié à un support solide.
26. Procédé selon la revendication 24 caractérisé en ce que le polypeptide est dans une composition liquide.
27. Procédé selon la revendication 26 caractérisé en ce que ladite composition est une composition parfumée pour la peau.
28. Procédé de criblage de molécule, de préférence les odeurs ou saveurs qui comprend de passer la molécule sur un substrat qui comprend un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 18 lié audit substrat, ledit polypeptide liant ladite odeur ou saveur et récupérer ladite odeur ou saveur depuis le polypeptide si nécessaire.
29. Procédé selon la revendication 28 caractérisé en ce que les molécules sont des phéromones humaines.
30. Procédé pour solubiliser des molécules lipophiles caractérisé en ce qu'il comprend la liaison de ladite molécule à un polypeptide selon l'une quelconques des revendications 1 à 4 et 18.
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31. Application des polypeptides selon l'une des revendications 1 à 4 et 18 en combinaison avec des acides gras alimentaires, à titre d'additif alimentaire.
32. Application selon la revendication 31 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des hyperlipidémies et de l'obésité.
33. Application selon la revendication 31 pour complémenter les laits non-maternels.
34. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 18 en tant qu'agent de ciblage de composé pharmaceutique.
35. Polypeptide selon la revendication 34 caractérisé en ce que ledit polypeptide est exprimé sous la forme d'une protéine de fusion avec une protéine permettant un adressage cellulaire spécifique.
36. Polypeptide selon la revendication 35 caractérisé en ce que ladite protéine permettant un adressage cellulaire spécifique est choisie dans le groupe composé des interleukines, des cytokines, des lymphokines, des interférons, des facteurs de croissance, des hormones, des anticorps.
37. Polypeptide selon la revendication 34 caractérisé en ce que ledit polypeptide est associé à une molécule permettant un adressage cellulaire spécifique.
38. Polypeptide selon la revendication 37 caractérisé en ce que ladite molécule permettant un adressage cellulaire spécifique est
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choisie dans le groupe composé des stéroïdes, des interleukines, des cytokines, des lymphokines, des interférons, des facteurs de croissance, des hormones, des anticorps.
39. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 1 à 4 et 18 en tant que transporteur de composé pharmaceutique.
40. Composition pharmaceutique comprenant un composé pharmaceutique lié au moins à un polypeptide selon l'une des revendications 34 à 39 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
41. Composition pharmaceutique selon la revendication 40 caractérisée en ce que le composé pharmaceutique est choisi dans le groupe des agents anticancéreux.
42. Composition pharmaceutique selon la revendication 41 caractérisée en ce que ledit agent anticancéreux est un isotope radioactif choisi parmi le groupe : l'Iode131, l'Yttrium90, l'Or199, le Palladium 1 , le Cuivre67, le Bismuth217 et l'Antimoine211.
43. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 40 à 42 caractérisée en ce que ledit polypeptide selon l'une quelconque des revendications 34 à 39 constitue une forme retard de délivrance dudit composé pharmaceutique dans l'organisme.
44. Composition pharmaceutique comprenant un vecteur d'expression selon les revendications 12 ou 13 et un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
45. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 40 à 44 pour le traitement du cancer choisi de
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préférence parmi le cancer du sein, le cancer de l'utérus, le cancer de la prostate, le cancer du foie, du carcinome des cellules épithéliales pulmonaires.
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