CA2319076A1 - Expression du gene insl4 dans les tissus osseux embryonnaires humains et applications - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne la localisation de l'expression du gène insulinlike 4 (INSL4) dans les tissus osseux et ligaments embryonnaires chez l'homme, des procédés de détection et de diagnostic, des méthodes de marquage et de détection de cellules desdits tissus exprimant les produits d'expression du gène INSL4 ainsi que des méthodes de sélection de composés capables de moduler l'activité desdites cellules. L'invention concerne également des médicaments destinés au traitement de pathologies liées à la différenciation et/ou la prolifération anormale desdits tissus, notamment les pathologies liées au développement anormal du cartilage et/ou à une ossification anormale de l'os en formation et/ou au développement anormal des ligaments interosseux.

Description

WO 99!37780 PGT/FR99/00137 ' 1 EMBRYONNAIRES HUMAINS ET APPLICATIONS.
La présente invention concerne la localisation de l'exprc;ssion du génc insulin-like 4 (INSU dans les tissus osseux ct ligaments embryonnaires chez l'homme, des procédés de détection et de diagnostic, des méthodes de marquage et de détection de cellutes desdits tissus exprimant les produits d'expression du gène INSL4 ainsi que des méthodes de sélection de composés capables de moduler l'activité desdites cellules.
L'invention concerne également des médicaments destinés au traitement de pathologies to liées à la différenciation et/ou la prolifération anormale desdits tissus, notamment les pathologies liées au développement anormal du cartilage et/ou à une ossifccation anormale de l'os en formation et/ou au développement anotznal des ligaments interosseux.
L'insuline, 1'IGF-I, l'IGF-II (~~ Insulin like growth factors I and II ~ ou facteurs de croissance de type insuline I et II) et la relaxine appartiennent à une famille d'hormones peptidiques ayant certaines structures et fonctions en commun, notamment leur influence sur la prolifération, le développement, la différenciation et le métabolisme cellulaire (D. Le Roith, 1997).
L'insuline est bien connue comme étant une hormone endocrine pancréatique 2o régulant le métabolisme énergétique. Les facteurs de croissance de type insuline-IGF-I
sont des peptides promoteurs de croissance impliqués dans la régulation endocrine, paracrine et autocrine de la croissance cellulaire et qui sont exprimés dans de nombreux tissus. L'IGF-II a des propriétés similaires mais est exprimée en quantité
plus importante en période prénatale et est considérée comme étant un facteur de croissance foetale.
La relaxine induit un remodelage des tissus conjonctifs dans le tractus reproductif et inhibe les contractions utérines. Le gène de la relaxine est exprimé dans le corpus luteum, la decidua, le trophoblaste et la prostate (Bogie, L.V. et al., 1995).
Son r8le fonctionnel dans le cerveau où une expression très importante a été
observée, 3o reste à être élucidé.

WO 99137780 PCT/FIt99/00137

2 On. a adjoint, également, à cette famille les Ley I-L (INSL3) qui sont actuellement clonés sous forme d'ADNc et dont l'activité biologique est encore à
définir. Les transcrits Ley I-L sont présents dans les cellules de Leydig et dans d'autres tissus comme par exemple le corpus luteum, le trophoblaste, les membranes foetates et le tissu mammaire (Adham, LM. ct al., 1993 ; Tashima, L.S. et al., 1995).
Différentes études ont montré l'importance évidente de ces gènes dans la régulation de la croissance du foetus et du développement des cellules souches (V.K.M. Han et al., 1996 ; D.J. Hansell et al., 1991, et L.S. Tashiman ct al., 1995).
L'IGF-I et l'IGF-II sont exprimées par la plupart des tissus foetaux et embryonnaires et régulent la croissance et la différenciation cellulaire comme facteur autocrine/paracrine. Des expériences de mutagénèse dirigée effectuées sur les gènes codant pour les facteurs de croissance IGF-I et IGF-II ont mis en évidence l'application importante des systèmes de facteurs de croissance dans le processus de croissance (J. Baker et al.; 1993 ; T.M. De Chiara et al., 1990, et J.P. Liu et al., 1993). De Chiara et al. ont démontré une relation causale entre une invalidation du gène de l'IGF-II et un phénotype de déficience de croissance qui devient apparent dès le seizième jour de l'embryon et qui persiste 'après sa naissance. Liu et al.
ont observé
que des souris mutantes IGF-I (-I ) présentaient un poids à leur naissance d'environ 60 % de leur poids normal et que certaines d'entre elles étaient mort-nées.
Cette famille peptidique présente en commun des caractères structuraux définis par la position de différentes cystéines essentielles pour la formation d'une structure tertiaire.
On a pu démontrer que tous les membres de cette famille se fixaient à des récepteurs de surface cellulaires. Ces récepteurs ont été identifiés par clonage moléculaire et caractérisés en détail pour l'insuline et les IGFs. Ils appartiennent à la superfamille des récepteurs tyrosine-kinases (RTK's) qui comprend des récepteurs de facteurs de croissance et leurs analogues oncogZnes tels que c-erbB2lneu (récepteur EGF), c-met (récepteur de facteur de croissance des hépatocytes), fms (récepteur de CSF-1) et trk (récepteur de NGF).
3o La voie de transduction du signal intracellulaire pour ces récepteurs est caractérisée par une activité tyrosine-kinase qui produit une autophosphorylation des

3 résidus tyrosine sur le récepteur suivie par une chaîne d'événements correspondant à
des phosphorylations. Ceci inclut notamment l'activation de l'IRS-1 (en particulier pour l'insuline et les IGFs), P13K, Shc, GBR2, Sos, Ras, Raf et la protéine activant la mitogénèse (MAP-kinase), kinase culminant lorsque la cascade de phosphorylation s affecte différents processus cellulaires tels que la transcription.
I,es effets physiologiques pléiotropiqucs de cette cascade de signaux en général font l'objet de recherches intensives.
Les polypeptides membres de cette famille sont tous caractérisés par la présence d'un peptide signal, une chaîne B, un peptide de jonction C ou chainc C et to une chaire A.
Pour ces hormones polypeptidiques, les termes de pré-prohormone, prohormone ou hormone mature sont définis à partir de la présence ou non de certains éléments et de leur arrangement en structure tertiaire. La pré-prohormone se distingue de la prohonmone par la présence de l'élément peptide signal. La distinction entre 15 prohormone et hormone mature active est plus complexe et fonction de l'hormone considérée.
Par exemple, dans la proinsuline et la prorelaxine, les chaînes B et A sont localisées respectivement aux extrémités N- et C-terminales et sont séparées par un long peptide C de jonction qui est clivé lors de la phase de maturation qui aboutit à la 2o forme active de l'hormone.
Au contraire de l'insuline et de la relaxine, le peptide C des IGFs n'est pas clivé pendant la phase de maturation. Les formes matures des peptides IGFs contiennent, en plus des domaines A, B et C, deux peptides carboxyl terminaux (domaines D et E) qui sont clivés après expression.
2s Récemment, un nouveau gène, dénommé INSL4, de la famille des insulin-like (insulines apparentées) a été caractérisé (WO 95 34653, Chassin, D. et al., 1995). Ce gène a été cloné à partir d'une banque d'ADNc de placenta précoce et localisé
sur le chromosome 9p24.
Le gène INSL4 code pour un polypeptide de 139 acides aminés dénommé
30 ~~ EPIL ~ (peptide insulin-like de placenta précoce).

_WO 99/37780 PGT/FR99/00137

4 Pour plus de clarté dans ta présente description, on dêsignera par polypeptide EPIL, le polypeptide putatif de 139 acides aminés déduü de la séquence d'acide nucléique codante et tel que déni dans ta figure 1.
La séquence d'acides aminés déduite a montré, cn accord avec l'organisation s générale de cette famille d'hormones, certaines homologies structurales comme la présence d'un peptide signal, d'une chaîne B et A et d'un peptide C de jonction ou chaîne C, ainsi que la présence de 6 résidus cystéine, devant étre probablement impliqués dans la formation de 3 ponts Bisulfures.
Ces documents décrivent l'organisation du gène INSL4 qui est composé de 1o deux exons et d'un intron. Ces documents montrent également que les transcrits ARNm du gène INSL4 ont seulement été détectés dans les tissus placentaires et faiblement dans l'utérus (D. Chassin et at., 1995).
Le gène INSL4 qui appartient également à cette famille pourrait étre un nouveau membre de cette famille de gène qui est impliqué dans le développement 1s humain. Pour nous permettre de mieux comprendre lc r8le de ces gènes dans te développement embryonnaire et foetal, l'étude des voies d'expression de ces gènes à
différentes étapes du développement a été une approche réussie (T. Strachan et al., 1997 ; C. Ottotenghi et al., 1997, et J. Burn et al., 1995). En étudiant ta chronologie et la localisation de l'expression des gènes INSL4 et IGF II dans te développement du 2o placenta et des tissus humains d'embryons en début de gestation par la technique d'hybridation in situ, les inventeurs ont mis en évidence un niveau d'expression élevé
de transcrits d'INSL4 dans le trophoblaste humain, en particulier dans les syncytio-trophoblastes. De manière tout à fait surprenante, les inventeurs ont également mis en évidence un niveau d'expression élevé de transcrits d'INSL4 dans des tissus foetaux 2s âgés de huit semaines, mais seulement dans les ligaments interosseux et dans le périchondre.
La présente invention a donc pour objet un polypeptide EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3 codé par le gène INSL4, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules 3o foetales du tissu osseux.

Dans la présente description, le terne de polypeptide désigne également une protéine ou un peptide.
On entend désigner dans la présente invention par polypeptidc EPIL 1, un polypcptide codé par lc gène INSL4, constitué d'une seule chaire comportant Ies

5 régions A, B et C de séquence globale d'acides aminés choisie parmi les séquences d'acides aminés comprises entre les positions 18 et 139, extrémités incluses;
de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence globale comportant au moins la séquence d'acides aminés comprise entre les positions 24 et 139, extrémités incluses, ledit polypeptide EPIL 1 pouvant en outre comporter un peptide signal de to telle sorte que la séquence d'acides aminés du polypeptide EPIL 1 comprenant le peptide signal est la séquence comprise entre les positions 1 et 139, extrémités comprises, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1.
On entend désigner dans la présente invention par polypcptide EPIL 2, un polypeptide codé par le gène INSL4, constitué
t5 a) d'une chaîne A dont la séquence d'acides aminés est la séquence comprise entre les positions 115 et 139, extrémités incluses de 1a séquence d'acides aminés définie à la figure 1 ;
b) d'une chaîne B dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi une séquence comprise entre les positions 18 et 58, extrémités incluses, de la séquence 2o d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 24 et 53, extrémités incluses ;
ledit polypeptide EPIL 2 pouvant comporter en outre un peptide signal de séquence d'acides aminés choisie parmi une séquence comprise entre les positions 1 et 23, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite 25 séquence du peptide signal comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 1 et 17, extrémités incluses.
On entend désigner dans la présente invention par polypeptide EPIL 3, un potypeptide codé par le gène INSL4, constitué d'une chaîne C dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi une séquence comprise entre les positions 54 et 114, 30 extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite G
séquence comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 59 et 114, extrémités incluses.
On entend désigner par tissu osseux dans la présente description, les tissus composant préférentiellement les os cartilagineux longs, courts ou plats.
L'invention concerne également les polypcptides selon l'invention, caractérisés en ce que les cellules foetales du tissu osseux sont des cellules du périchondrc.
L'invention a aussi pour objet les polypeptides EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3 codés par le gène INSL4, caractérisés en ce qu'ils sont exprimés dans des cellules foetales de ligaments; notamment les ligaments interosseux.
to L'invention comprend en outre les polypeptides EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3 codés par le gène INSL4, caractérisés en ce qu'ils sont impliqués dans le processus de différenciation, de prolifération et/ou de régénération de cellules du tissu osseux et/ou de ligaments.
Font également partie de l' invention, les polypcptides EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL
3 codés par le gène INSI~, caractérisés en ce qu'ils sont impliqués dans le processus de développement du cartilage et/ou d'ossification de l'os en formation.
I1 doit ëtre compris que l'invention ne concerne pas les polypeptides sous forme naturelle, c'est-à-dire qu'ils ne sont pas pris dans leur environnement naturel mais qu'ils ont pu être obtenus par purification à partir de sources naturelles, ou bien obtenus par recombinaison génétique, pouvant être glycosylés ou non, ou encore obtenus par synthèse chimique et pouvant alors comporter des acides aminés non naturels ou modifiés.
L'invention est relative à l'utilisation d'un ou de plusieurs anticorps dirigés contre un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3, l'un de leurs homologues ou variants ou un de leurs fragments, pour la détection, l'identification, la localisatiôn et/ou le dosage d'un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3 ou l'un de leurs homologues ou variants, dans le tissu osseux et/ou dans les ligaments.
L'invention est aussi relative à l'utilisation d'un ou de plusieurs anticorps dirigés contre un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3, l'un de leurs homologues ou 3o variants, ou l'un de leurs fragments pour le diagnostic de pathologies liées à

7 _ l'expression anormale de polypeptide EPIL 1, EPIL 2 et/ou EPIL 3 dans le tissu osseux et/ou dans les ligaments.
On entendra désigner comme polypcptidcs homologues dc polypeptide EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3, les polypeptides présentant, par rapport auxdits polypeptidcs EPIL
s 1, EPIL 2 ou EPIL 3, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une mutation, notamment ponctuelle. Parmi les polypeptides homologues, on préfcre ceux dont la séquence d'acides aminés présente au moins 80 % , de préférence 90 % , de similitude avec les séquences d'acides aminés des polypeptides selon l'invention.
to On entendra par polypeptide variant de polypepdde EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL
3, l'ensemble des polypeptides mutés pouvant exister naturellement, en particulier chez I'être humain, et qui correspondent notamment à des troncatures, substitutions, délétions et/ou additions d'au moins un résidu d'acide aminé. Ces polypcptides variants correspondent en particulier à une expression anormale des polypcptides 15 EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3.
Par fragment de polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3, ou d'un de leurs homologues ou variants, on entend désigner un polypeptide de séquence d'acides aminés comportant au minimun 5 acides aminés, de préférence 10 acides aminés et 15 acides aminés consécutifs desdits polypeptides.
2o Parmi les anticorps qui pourront étre utilisés pour ladite détection, identification, localisation edou ledit dosage ou pour ledit diagnostic de pathologies, on préfère les anticorps mono ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3, l'un de leurs homologues ou variants, ou l'un 25 de leurs fragments.
Des anticorps polyclonaux spécifiques peuvent 8tre obtenus à partir d'un sérum d'un animal immunisé contre, par exemple - un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3, l'un de leurs homologues ou variants, ou l'un de leurs fragments, notamment produit par recombinaison génétique 30 ou par synthèse peptidique, selon les modes opératoires usuels, à partir d'une 8 _ séquence d'acide nucléique codant pour lesdits polypeptides ou de séquence d'acides aminés desdits polypeptides.
Les anticorps monoclon~lux spécifiques peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Ktihlcr et Milstcin, 1975.
Lesdits anticorps sont, par exemple, des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab ou F(ab')2. Ils peuvent également, selon l'invention, se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable.
Il est bien entendu qu'on entend par l'expression ~~ plusieurs anticorps ~~
dans la 1o présente description, au moins deux anticorps de spécificité différente, c'est-à-dire capable de reconnaître et de se lier à deux épitopes ou domaines différents desdits polypeptides. Il est d'ailleurs préféré selon l'invention d'utiliser au moins deux anticorps de spécificité différente pour les procédés, Ics méthodes et les kits de l'invention qui incluent lesdits anticorps. Dans ce cas, on pourra par exemple utiliser ts doux marquages d'anticorps différents ou deux systèmes de révélation différents.
Lesdits anticorps pourront ainsi constituer un moyen d'analyse immuno-cytochimique ou immunohistochimique de l'expression desdits polypeptides sur des coupes spécifiques de tissus osseux et/ou de ligaments, par exemple par immunofluorescence, marquage à l'or, immunoconjugués enzymatiques.
2o Ils permettent notamment de mettre en évidence et de quantifier la présence spécifique normale ou anormale desdits polypeptides dans les tissus osseux et/ou de ligaments, ce qui les rend utiles pour l'identification et la localisation de l'expression de ces polypeptides, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale desdits polypeptides.
2s Plus généralement, lesdits anticorps peuvent 8tre avantageusement mis en oeuvre dans toute situation oll l'expression d'un desdits polypeptides doit être observée de manière qualitative et/ou quantitative dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligaments.
Les techniques et les réactifs spécifiques permettant la détection, 30 l'identification, la localisation et/ou le dosage des complexes antigène-anticorps que l'on pauma utiliser dans les procédés de l'invention, sont bien connus de l'homme du métier et sont, par exemple, les techniques ELISA, RIA ou d'immunofluorescence pouvant être associées, dans le cas o~ les anticorps de l'invention ne sont pas déjà
immunoconjugués ou marqués, avec les réactifs appropriés tels que des anticorps immunoconjugués, marqués ~ la fluorescéïnc ou radiomarqués capables de reconnaître spécifiquement lesdits anticorps, ainsi que les substrats chromogCnes spécifiques des enzymes conjugués et les réactifs témoins de contr8lcs positif; négatif et quantitatif.
Ainsi, l'invention comprend un procédé de détection, d'identification, de localisation et/ou de dosage spécifique d'un polypeptide EPIL 1, EPIL 2 et/ou ou un de ses fragments dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligament, ou de diagnostic de pathologies liées à la présence anormale du ou desdits polypeptides dans le tissu osseux et/ou dans les ligaments, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes a) mise en contact dudit échantillon biologique. avec un ou plusieurs anticorps dirigés contre le ou lesdits polypeptides ;
b) mise en évidence, identification, localisation et/ou dosage du complexe antigène-anticorps formé.
L'invention comprend également un kit ou nécessaire pour la détection, l'identification, la localisation et/ou ie dosage spécifique d'un polypeptide EPIL 1, EPIL 2 et/ou EPIL 3 ou un de ses fragments dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligaments, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale du ou desdits polypeptides dans ledit échantillon biologique, caractérisé en ce .qu' il comprend les éléments suivants a) un ou plusieurs anticorps dirigés contre le ou lesdits polypeptides ;
b) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique ;
c) le cas échéant, les réactifs permettant la détection, l'identification et/ou le dosage des complexes antigène-anticorps produits par la réaction immunologique.
L'invention concerne également l'utilisation d'une sonde ou amorce oligonucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide 3o nucléique correspondant au gène INSL4, pour la détection, l'identification, la WO 99/37780 PGT/P'R99/00137 localisation, l'amplification, et/ou le dosage de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 dans Ie tissu osseux et/ou dans les ligaments.
L'invention comprend également l'utilisation d'une sonde ou amorce oligonucléotidique capable de s'hybrider spéci0qucment avec une séquence d'acide s nucléique correspondant au gène INSL4, pour !e diagnostic dc pathologies liées à
l'expression anormale du gène INSL4 dans le tissu osseux et/ou dans les ligaments.
On entendra désigner par -séquence d'acide nbcléique correspondant au gène INS1,4-, la séquence nucléotidique du gène INSL4 telle que définie à 1a figure 1 ou toutes séquences nucléotidiques codant pour un polypeptide homologue ou variant de 1o polypeptide EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3, leur séquence complémentaire, la séquence nucléotidique de leur ARN correspondant ainsi que leurs fragments.
Lesdites sondes oIigonucléotidiques capables de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4, pourront étre marquées ou fixées sur un support solide par liaison covalente ou non, les techniques de marquage ou de fixation de telles sondes étant bien connues de l'homme de l'art.
Une hybridation spécifique signifie que l'hybridation est réalisée dans des conditions de stringence, en particulier dans des conditions de température et de force ionique telles qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN globalement complémentaires.
2o A titre ilIustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les séquences nucléotidiques décrites ci-dessus, sont avantageusement les suivantes.
L'hybridation est réalisée à une température préfêrentielle de 65 °C, en présence de tampon 6 x SSC, 5 x de solution de Denhardt, 0,5 % SDS et 100.
ug/ml d'ADN de sperme de saumon.
1 x SSC correspond à 0,15 M NaCI et O,OSM de citrate de sodium et une solution de 1 x Denhardt correspond à 0,02 % Ficoll, 0,02 ~ de polyvinylpyrrolidone et 0,02 % de sérum albumine bovine.
Les étapes de lavage peuvent, par exemple, être effectuées pendant 5 à 30 min.
à 65°C, dans un tampon 2 x SSC ou 1 x SSC et à 0,1 % SDS.

.WO 99/37780 PCT/FR99/00137 tt -Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-avant pour un polynucléotide de taille définie, seront adaptées par l'homme du métier pour des oligo-nucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement dc Sambrook et al., 1989.
s Les sondes ou amorces oligonuctéotidiques, et dc manière générale les séquences d'acide nucléique selon l'invention, présenteront une taille minimale de 10 bases et on préférera des fragments de 20 bases, et de préférence 30 bases.
Font également partie de l'invention, !es procédés de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique correspondant au gène to INSL4 dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou tic ligament, ou de diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de ladite séquence d'acide nucléique dans ledit échantillon biologique, caractérisés en ce qu'ils comportent les étapes suivantes a) isolement de l'ADN à partir dudit échantillon biologique à analyser, ou obtention 15 d'un ADNc à partir de l'ARN dudit échantillon biologique ;
b) amplification spécifique de ladite séquence d'acide nucléique à l'aide d'au moins une amorce capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 ;
c) analyse qualitative et/ou quantitative des produits d'amplification.
2o L' invention comprend aussi les procédés de détection, d' identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique correspondant au géne INSL4 dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligament, ou de diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de ladite séquence d'acide nucléique dans ledit échantillon biologique, caractérisés en ce qu'ils comportent les étapes suivantes 25 a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 avec ledit échantillon biologique, l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de ladite sonde à l'ADN contenu dans ledit 3o échantillon biologique ;

b) détection, identification et/ou dosage de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique et l'ADN dudit échantillon biologique.
L'invention est relative en outre à des procédés de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 dans un échantillon biologique dc tissu osseux et/ou dc ligament, ou dc diagnostic de pathologies liées à 1a présence anormale de ladite séquence d'acide nucléique dans ledit échantillon biologique, caractérisés en ce qu'ils comportent les étapes suivantes a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique immobilisée sur un support et capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4, avec ledit échantillon biologique, l'ADN de l'échantillon, ayant, le cas échéant, été préalablement amplifié à l'aide d'au moins une amorce capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 et/ou rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de ladite sonde à l'ADN dudit échantillon biologique ;
b) mise en contact de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique immobilisée sur un support et l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique, le cas échéant apr~,'s élimination de l'ADN dudit échantillon biologique n'ayant pas hybridé
2o avec ladite sonde, avec une sonde oligonucléotidique, notamment marquée, et capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4.
Font en outre partie de Ia présente invention, les kits ou nécessaires pour la détection, l'identification et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligament, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la prësence anormale de ladite séquence d'acide nucléique dans ledit échantillon biologique, caractérisés en ce qu'ils comprennent les éléments suivants a) une sonde oligonucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 ;

_ WO 99/37780 PCT/Fit99/00137 b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation ;
c) le cas échéant, au moins une amorce capable de s'hybrider spécifiquement avec unc séquence d'acide nucléique correspondant au géne INSL4 ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN.
L'invention comprend également les kits ou nécessaires pour la détection, l'identification et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligament, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de ladite séquence 1o d'acide nucléique dans ledit échantillon biologique, caractérisés en ce qu'ils comprennent les éléments suivants a) une sonde oligonucléotidique, dite somle de capture, pouvant étre fournie préimmobilisée sur un support, et capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gtne INSL4 ;
ls b) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de révélation, notamment marquée, et capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 ;
c) le cas échéant, au moins une amorce capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 ainsi que les réactifs 2o nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN.
Font aussi partie de l'invention, les procédés ou kits selon l'invention pour le diagnostic de pathologies liées à la différenciation et/ou la prolifération anormale du tissu osseux et/ou des cellules de ligaments, pour le diagnostic de pathologies liées au développement anormal du cartilage et/ou à une ossification anormale de l'os en 25 formation et/ou pour le diagnostic d'ostéoporose et/ou pour le diagnostic de dysplasies. Parmi les dysplasies, on peut citer notamment les dysplasies diaphysaires comme l'hypoplasie diaphysaire ou ostéogénèse imparfaite ou encore l'hyperplasie diaphysaire ou maladie d'Engelmann.
Dans la présente invention on entend par diagnostic de pathologies liées à la 3o différenciation edou la prolifération anormale du tissu osseux et/ou des cellules de ligaments, ou pour le diagnostic de pathologies liées au développement anormal du cartilage et/ou à une ossification anormale de l'os en formation ou encore pour le diagnostic d'ostéoporose et/ou de dysplasie, non seulement le diagnostic proprement dit de la pathologie, mais aussi le diagnostic ou pronostic d'évolution de ladite pathologie, suite par exemple à un traitement thérapeutique. Ainsi, selon l'invention, lesdits procédës ou kits peuvent être utilisés pour évaluer l'efficacité d'un traitement thérapeutique de ladite pathologie.
Les techniques d'amplification spécifique ct d'analyse qualitative ct/ou quantitative de séquence nucléique que l'on pourra utiliser dans ics procédés de l'invention, sont bien connues de l'homme du métier et sont, par exemple, les lo méthodes comprenant au moins une étape d'amplification dite par PCR
(réaction en chaire par la polymérase) ou par PCR-like de la séquence cible susceptible d'étre présente à l'aide 'd'au moins une amorce oligonucléotidique de séquence nucléique telle que définie précédemment. Les produits amplifiés pourront étre traités à
l'aide d'enzyme de restriction appropriée avant de procéder à la détection ou au dosage du produit ciblé, notamment par un procédé selon l'invention.
Par PCR-like on entendra désigner toutes les méthodes mettant en oeuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acide nucléique, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés. Ces techniques sont bien entendu connues. En général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une 2o polymérase ; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN, il convient préalablement d'effectuer une transcription réverse. Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, par exemple les méthodes dites NASBA ~~
Nucleic Acid Sequence Based Amplification » (Compton, 1991), TAS ~~ Transcription based Amplification System » (Guatelli et al., 1990), LCR ~~ Ligase Chair Reaction »
2s (Landegren et al. , 1988), ~~ Endo Run Amplification » (ERA), K Cycling Probe Reaction » (CPR), et SDA ~~ Strand Displacement Amplification » (Walker et al., 1992), bien connues de l'homme du métier. Sont également connues de l'homme du métier, les techniques de quantification d'acide nucléique dans lesquelles par exemple on amplifie l'acide nucléique à quantifier par une méthode type PCR et en présence 3o d'un acide nucléique standard de m8me taille, de quantité connue et capable de s'hybrider aux mêmes amorces que l'acide nucléique cible.

Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions. La spécificité dc l'amplification peut être contrblée par exemple par 5 hybridation moléculaire en utilisant comme sondes les sondes telles que définies ci-dessus, notamment marquées.
L'invention comprend en outre, les méthodes de marquage de cellule de tissu osseux et/ou de ligament, notamment d'origine foetales, caractérisées en ce qu'eues comprennent les étapes suivantes lo a) mise en contact d'un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligament avec un ou plusieurs anticorps dirigés contre le ou les polypeptides EPIL 1, EPIL 2 ct/ou EPIL 3, lesdits anticorps pouvant être marqués ;
b) le cas échéant, marquage desdits ànticorps à l'aide dc composés marqués capable de reconnaitre lesdits anticorps.
15 Les techniques de marquage de cellules par des anticorps spécifiques de composé de ladite cellule, saut bien connues des immunocytochimistes ou des immunohistochimistes et ne seront pas développées dans la présente description.
Sont également comprises dans la présente invention les méthodes de marquage de cellule de tissu osseux et/ou de ligament, notamment d'origine foetales, 2o caractérisées en ce qu'elles comprennent les étapes suivantes à) mise en contact d'un échantillon biologique de tissu osseux etlou de ligament avec une ou plusieurs sondes oligonucléoddiques capables de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique carrespondant au gène INSL4, lesdites sondes pouvant être marquées ;
2s b} le cas échéant, marquage desdites sondes à l'aide de composés marqués capables de reconnaître lesdites sondes.
L'invention a aussi pour objet un procédé de détection de cellule anormale de tissu osseux et/ou de ligament, caractérisé cn ce qu'il met en oeuvre une méthode de marquage selon l'invention.
3o Un autre aspect de l'invention concerne des méthodes de sélection de composé
chimique ou biochimique capable de moduler la différenciation, la régénération et/ou la prolifération de cellules humaines et/ou animales de tissu osseux et/ou de ligament, caractérisées en ce qu'elles mettent en oeuvre un polypeptide EPIL I, EPIL 2, EPIL
3, un de leurs polypeptides homologues ou variant, ou un de leurs fragments, une séquence d'acide nucléique correspondant au cène INSL4, ou une cellule de tissu s osseux ou de ligament, notamment foctale. Ladite cellule pouvant être une cellule transformée par recombinaison génétique ou sélectionnée scion l'invention.
Parmi ces méthodes, on préfère les méthodes caractérisées en ce que ledit composé sélectionné est capable d'inhiber ou de favoriser la différenciation, la régénération et/ou la prolifération de cellules humaines et/ou animales de tissu osseux 1o et/ou de ligament, notamment les cellules foctales du périchondre.
Lesdits composés pourront par exemple être sélectionnés sur leur capacité à se lier à un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3, à un de leurs polypeptides homologues ou variant, ou à un de leurs fragments, et à inhiber ou favoriser l'activité
desdits polypeptides dans les tissus osseux et/ou dans les ligaments, en tant que, par exemple, 15 ligands agonistes ou antagonistes d'un récepteur spécifique desdits polypeptides sur les cellules desdits tissus.
Lesdits composés pourront être également sélectionnés sur leur capacité à se lier à une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4, et à
inhiber ou favoriser l'expression du gène codant pour lesdits polypeptides en tant qu'inducteur ou 2o répresseur.
Lesdits composés pourront également étre sélectionnés sur leur capacité à
moduler sur lesdites cellules in vitro ou in vivo, l'activité biologique desdits polypeptides exprimés par lesdites cellules, comme notamment la différenciation, la prolifération ou la régénération desdites cellules.
25 Par exemple, l'invention comprend une méthode de sélection de composés capables de se lier à un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3, à un de leurs polypeptides homologues ou variants, ou à un de leurs fragments, ou encore capables de se lier à une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4, et capables de moduler l'activité desdits polypeptides dans Ies tissus osseux et/ou dans les 30 ligaments, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes a) mise en contact dudit composé avec ledit potypeptide ou ladite séquence d'acide nucléique ;
b) détermination de la capacité dudit composé à se lier avec ledit polypeptide ou ladite séquence d'acide nucléique ;
s c) mise en évidence de la modulation de l'activité desdits polypeptides sur des cellules de tissu osseux et/ou de ligament, susceptible d'étre obtenue avec les composés sélectionnés à l'étape b).
Il sera possible, par exemple, d'utiliser des cellules de tissu osseux et/ou de ligament transformées par recombinaison génétique ou sélectionnées selon l' invention, to à l'étape b) et/ou c) de la présente méthode.
L'invention comprend également les composés chimiques ou biochimiques, susceptibles d'être sélectionnés par une méthode selon l'invention.
Les composés susceptibles d'étre sélectionnés peuvent être des composés organiques tels que des polypeptides ou hydrates de carbone ou tous autres composés 1s déjà connus, ou des composés organiques nouveaux élaborés à partir de techniques de modélisation moléculaire et obtenus par synthèse chimique ou biochimique, ces techniques étant connues de l'homme de l'art.
L'invention a en outre pour objet des composés selon l'invention â titre de médicament, de préférence choisis parmi 2o a) un polypeptide EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3, un de leurs polypeptides homologues ou variants ou un de leurs fragments, pouvant être obtenu par recombinaison génétique ou par synthèse chimique ;
b) un anticorps dirigé contre un polypeptide tel que défini en a) ;
c) un composé chimique ou biochimique, caractérisé en ce qu'il est un ligand 25 d'un polypeptide tel que défini en a) ;
d) un vecteur comprenant tout ou partie d'une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 ;
e) un vecteur tel que défini cn d), présentant à sa surface un marqueur spécifique de cellules de tissu osseux ou de ligament cible dont on cherche à
moduler 30 l'activité ;

f) une séquence d'acide nucléique sens ou antisens capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSLA.
Les fragments de polypeptide EPIL I, EPIL 2 ou EPIL 3, ou de leurs polypeptides homologues ou variants, et tels que définis en a) seront de préférence caractérisés en ce qu'ils sont biologiquements actifs.
Par fragment biologiquement actif, on entendra désigner en particulier un fragment de séquence d'acides aminés de polypepdde EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3, ou de leurs polypeptides homologues ou variants présentant au moins une des activités desdits polypeptides comme notamment lo - la capacité de moduler, notamment d'inhiber ou de favoriser, la différenciation, la prolifération et/ou la régénération de cellules de tissu osseux ct/ou de ligament ; et/ou - la capacité d'étre reconnu par un anticorps spécifique d'un polypcptide EPIL
1, EPIL 2 ou EPIL 3, ou d'un de leurs polypeptides homologues ou variants.
Les polypeptides EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3, leurs polypeptides homologues ou variants ou leurs fragments, recombinants pourront être obtenus à partir de méthodes bien connues de l'homme de l'art à l'aide de vecteurs de clonage et/ou d'expression contenant une séquence d'acide nucléique codant pour lesdits polypeptides et de cellules hôtes transformées par lesdits vecteurs.
2o Les polypeptides recombinants obtenus peuvent aussi bien se présenter sous forme glycosylée que non glycosylée et peuvent présenter ou non la structure tertiaire naturelle.
Ces polypeptides peuvent être produits à partir des séquences d'acide nucléique codant pour lesdits polypeptides selon les techniques de production de polypeptides recombinants connues de l'homme du métier. Dans ce cas, la séquence d'acide nucléique utilisée est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire.
Un système efficace de production d'un polypeptide recombinant nécessite de disposer d'un vecteur, par exemple d'origine plasmidique ou virale, et d'une cellule 3o hôte compatible.

.WO 99/37780 PCT/FR99/00137 L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes, comme les bactéries, ou eucaryotes, comme par exemple les lewres, cellules d'insectes ou de mammifères comme les cellules CHO (cellules d'ovaires de hamster chinois) ou les cellules mucines ou tout autre systc',me avantagcusGment disponible. Un hôte cellulaire s préféré pour l'expression des protéines de l'invention est constitué par les cellules d'ovaire de hamster chinois CHO, et par les cellules 3A-subE d'origine placentaire humaine.
Le vecteur doit comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de 1a 1o transcription. Il doit pouvoir être maintenu de façon stable dans la cellule et peut éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite.
Ces différents signaux de contr8le sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences d'acide nucléique peuvent être insérées dans des 15 vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi.
De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par , des méthodes standards, telles que par exemple la lipofection, 20 l'électroporation, le choc thermique.
Les cellules hôtes transformées par les vecteurs précédents peuvent être obtenues par l'introduction dans ces cellules d'une séquence nucléotidique insérêe dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique 2s transfectée.
Parmi les cellules h8tes utilisables à ces fins, on peut citer bien entendu les cellules bactériennes (Olins et Lee, 1993), mais également les cellules de lewre (Buclcholz, 1993), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifères (Edwards et Aruffo, 1993), ct notamment les cellules d'ovaire 3o de hamster chinois (CHO), des cellules humaines telles que les cellules 3A-subE

WO 99/37780 PC'T/FR99/00137 d'origine placentaire, mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre des baculovirus par exemple (Luckow, 1993).
Les procédés de purification de polypeptide recombinant ou synthétique utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptidc recombinant ou synthétique peut 5 être purifié à partir dc méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immuno-affinité à l'aide d'anticorps mono ou polyclonaux spécifiques.
Une variante préférée consiste à produire un polypeptidc recombinant fusionné
à une protéine ~~porteus~~~ (protéine conjuguée). L'avantage de ce système est qu'il to permet une stabilisation et une diminution de la protéolysc du produit recombinant, une augmentation de la solubilité au cours de la renaturation in vitro et/ou une simplification de la purification lorsque le partenaire de fusion possède une affinité
pour un ligand spécifique.
Les polypeptides EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3, leurs polypeptides homologues 1s ou variants ou leurs fragments peuvent étre également obtenus par synthèse chimique.
Les polypeptides obtenus par synthèse chimique pourront comporter des acides aminés non naturels.
Parmi lesdits composés sélectionnés à titre de médicament, on peut citer en particulier les oligonucléotides antisens, c'est-it-dire dont la structure assure, par 2o hybridation avec la séquence cible, une inhibition de E'expression du produit cornspondant. Il faut également citer les oligonucléotides sens qui, par interaction avec des protéines impliquées dans la régulation de l'expression du gène INSL4, induiront soit une inhibition, soit une activation de cette expression.
L' invention concerne des composés selon l' invention, destinés au traitement de 2s pathologies liées à la différenciation et/ou la prolifération anormale du tissu osseux et/ou des cellules de ligaments, notamment de pathologies liées au développement anormal du cartilage et/ou à une ossification anormale de l'os en formation, en particulier destinés au traitement de L'ostéoporose ot/ou de dysplasie.
Parmi lesdites dysplasies, on préfère notamment les dysplasies diaphysaires 3o comme L'hypoplasie diaphysaire ou ostéogénèse imparfaite et l'hyperplasie diaphysaire ou maladie d'Engelmann.

L'invention a enfin pour objet des composés selon l'invention, destinés au traitement de pathologies impliquant à la régénération de tissu osseux et/ou de ligament, en particulier au traitement visant ~ réparer des lésions du tissu osseux et/ou de ligaments suite à un choc traumatique.
Les composés de l'invention en tant que principes actifs de médicament, seront préférentiellement sous forme soluble, associés à un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par voie intramusculaire, intradermique ou par voie orale.
Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'~ge ou le poids corporel du parlent, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés, etc.
On peut également pallier de façon générale la carence ou la surexpression de polypeptides selon l'invention par une thérapie dite ~~de remplacement~~
permettant l'amplification ou la diminution des activités desdits polypeptides.
La thérapie de remplacement pourra ëtre effectuée par thérapie génique, c'est-2o à-dire en introduisant les séquences d'acide nucléique selon l'invention et/ou les gènes correspondants avec les éléments qui permettent leur expression in vivo, dans le cas od l'un des gènes est insuffisamment exprimé par exemple, ou bien lorsqu'il est exprimé sous une forme anormale.
Les principes de la thérapie génique sont connus. On peut utiliser des vecteurs viraux, par exemple sur la base des adénovirus (Perricaudet et al., 1992), des AAV, Adenovirus Associated Virus (Carter, 1993), des rétrovirus (Temin, 1986), des poxvirus ou des virus herpès (Epstein et al., 1992). La plupart du temps ces virus sont utilisés sous forme défective et, de façon générale, avec ou sans intégration dans le génome cellulaire. Il est également possible de prévoir des vecteurs non viraux, c'est-3o à-dire synthétiques, qui miment des séquences virales ou bien qui sont constitués par WO 99137780 PCT/FR99/0013'i de l'ADN ou de l'ARN nu selon la tectuûque développée notamment par ta société
VICAL.
Dans la plupart des cas, il faudra prévoir des éléments tic ciblage assurant une expression spécifique de façon ~ pouvoir limiter les zones d'expression des s golypeptides. Il est méme intéressant, dans certains cas, d'avoir des vecteurs d'expression transitoire ou au moins d'expression contr0lée que l'on pourra bloquer lorsque cela sera nécessaire.
Les composés selon l'invention utilisables à titre de médicament offrent une nouvelle approche pour le traitement de maladies liées à la différenciation ou à la lo prolifération non régulëe de cellules ou tissus osseux et/ou de ligaments ou à l'absence ou à l'insuffisance de certaines cellules de tissus osseux et/ou de ligaments, suite par exemple à un traumatisme.
D'autres caractéristiques ct avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec les exemptes et les figures dont les légendes sont représentées ts ci-aprts.
Légende des Figures Figure 1 : Séquence d'acide nucléique de l'ADNc du gène INSL4 et séquence d'acides aminés du potypeptide EPIL codé par cette séquence.
Figures 2A, 2B, 2C, 2D, 2E, 2F : Comparaison de la distribution de l'ARNm 2o d'INSL4 et d'IGF-II dans le placenta humain âgé de 14 semaines ;
- observation sur fond clair (figure 2A) et sur fond noir (figure 2B} d'une même coupe de tissu hybridée avec une sonde INSLA antisens ;
- agrandissement de la coupe précédente observée sur fond clair (figure 2C) ;
- observation sur fond clair (figure 2D} et sur fond noir (figure 2E) d'une même 2s coupe de tissu hybridée avec une sonde IGF-II antisens ;
- agrandissement de la coupe précédente observée sur fond clair (figure 2F) ;
s : syncytiotrophoblaste ; c : cytotrophoblaste ; m : mésenchyme ;
la barre d'échelle représente 29s ~,m pour figures 2A, 2B, 2D et 2E, et représente 15 ~cm pour figures 2C et 2D.
3o Figures 3A, 3B, 3C, 3D, 3E, 3F, 3G, 3H : Distribution cellulaire de l'AIZNm d'IGF-II dans des embryons humains âgés de~ 25 jours (figures 3A et 3B), 30 jours (figures 3C, 3D, 3E et 3F) ou 45 jours (figures 3G et 3H) obtenue par hybridation in situ à l'aide d'une sonde oligonucléotidique marquée au "S:
Microphotographies sur fond clair (panel de gauche) et sur fond noir (panel de droite) d'une mëme coupe de tissu - coupe axiale (figures 3A et 3B) au niveau du ~rhombencéphaie~ ; nt : tube ncurat ;
ov : vésicule otique ;
- coupe abdominale longitudinale (figures 3C et 3D) ; nt : tube neural ; m mésonéphron ;
- coupe sagitale au niveau des arcs branchiaux (ba) (figures 3E et 3F) ;
to - coupe longitudinale du corps vertébral (vb) (figures 3G et 3H) ;
la barre d'échelle représente 295 ~m pour figures 3A, 3B, 3C et 3D, et représente 150 ~cm pour tous les autres panels.
Figures 4A, AB, 4C, 4D, 4E et 4F : Hybridation in situ effectuée avec une sonde oligonucléotidique d'INSL4 sur un foetus humain âgé de 8 semaines.
t5 Microphotographies sur fond clair (panel de gauche) et fond noir (panel de droite) d'une même coupe de tissu - coupe de la partie distale du fémur dans l'articulation développée de la hanche (figures 4A et 4B) au niveau du ~~rhombencéphale~ ; f : fémur; 1 : ligament ;
- coupe longitudinale du rachis (figures 4C et 4D) ;
20 l'ARNm d'INSL4 est localisé dans les disques inter-vertébraux, dans les ligaments intervertébraux ; vb :corps vertébral ; 1 : ligament ;
- coupe transversale de c8te (Figure 4E et 4F) ; pc : périchondre ; r : c8te ;
la barre d'échelle représente 295 ~m pour figures 4A, 4B, 4C et 4D, et représente 150 ~m pour figures 4E et 4F.
EXEMPLES
Matériels et méthodes A) Sujets expérimentaux 3o Des embryons morphologiquement normaux âgés de trois à huit semaines (après owlation) ont été obtenus après avortement légal par la mifepristone (RU 486) à l'HBpital Broussais à Paris. Une complète indépendance a été respectée entre la direction médicale de l'h8pital et le groupe de recherche. Le consentement maternel n'a jamais été demandé avant que l'avortement ait été décidé et réalisé. Lc consentement a été obtenu aprCS explication de l'objectif de recherche et seulement s après que l'avortement médical ait été effectué. Cette procédure est approuvée par le Comité Ethique de l'H6pital des Enfants Malades de Neckcr (Paris). Les embryons ont été séparés du trophoblaste par dissection sous microscope. Lc stade de développement de chacun des embryons a été estimé en utilisant ia classification de Carnegie établie par O'Rahilly (R. O'Rahilly et al., 1987 et 1994). Les embryons lo microdisséqués ont été congelés et conservés à - 80°C. Des cryocoupes (I2 p,m) ont été montés sur des lames prétraitées (lames Probon Plus, Microm France). Les coupes ont été fixées pendant 30 minutes dans une solution de para-formaldéhyde en tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4), rincées une fois en PBS (tampon phosphate salin) et brièvement dans de l'eau, puis déshydratées avec une série de solution d'éthanol à
ts différentes concentrations (50 %, 75 %, 95 96). Les coupes ont été ensuite séchées à
l'air ct conservées à - 80°C afin de préserver l'ARNm.
B) Sonde d' hybridation Des sondes oligonucléotidiques de 60-mer ont été synthétisées et purifeées 20 (DNAgency, Malvern, PA). Elles ont été marquées en 3' avec [a"S]dATP (NEN, Boston, MA) en utilisant une désoxyribonucléotidyle terminale transférase (Gibco BRL, Grand Island, N~ à une activité spécifique d'environ 7 x 10°
cpm/mg. Les sondes oligonucléotidiques ont été purifiées sur colonnes Biospin (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) avant utilisation. La séquence de la sonde INSL4 2s antisens est la suivante (SEQ ID N° 2) 5'-CTGGGGTGGTGGTGAATGTCTTCTCAGGCATGGGGCAATATGACAGCAA
GTGTTTTCCAA-3', localisée sur l'exon 1. La séquence de la sonde IGF-û antisens est la suivante (SEQ ID N° 3) 5'-AGCCAATCGATTTTGTACATGTTTGAAGATGCTGCTGTGCTTCCTCAGCC
30 CGATGG AGGG-3', localisée sur l'exon 7 dans la région codante commune des ARNm de fIGF-II. Des sondes sens ont été utilisées comme témoin.

C) Hybridation in situ Le protocoie expérimental (M. Abitbot et al., 1993, et M. Gerard et al., 1995) inclut une étape d'hybridation utilisant une solution contenant 50 R6 de formamide, 4 x SSC (solution standard dc citrate salin), 1 x solution de Denhardt, 0,25 mg/ml s d'ARNt de levure, 0,25 mg/ml de sperme de hareng, 0,25 mg/ml dc poly-A, 10 3~ dc sulfate dextran, 100 mM de dithiothreitol (DTT) et une sonde marquée [ "S)dATP
d'activité spécifque de 6 x lOb cpm/ml. 100 ~cl de la solution d'hybridation a été
déposée sur chacune des coupes. Puis les sections ont été recouvertes avec un parafilm et incubées dans une chambre humide à 43°C pendant 20 heures. Après hybridation, ~o les lames ont été lavées deux fois dans 1 x SSC contenant 10 mM DTT pendant minutes à 55°, et deux fois dans une solution de 0,5 x SSC contenant 10 mM DTT
~ pendant 15 minutes à température ambiante. Les coupes ont été ensuite plongées dans l'eau, déshydratées avec une série de solutions d'éthanol de différentes concentrations puis exposées pendant une semaine sur des films à rayon X Amersham Hyperfilm 15 Betamax et dans une émulsion photographique Kodak NTB2 (Eastmman Kodak, Rochester, NY) pendant un à deux mois à 4°C. Les coupes ont ensuite été
développées et marquées avec du bleu toluidine. Les résultats sont analysés par microscopie à contraste de phase.
2o Exemple 1 : Hybridation in situ de membranes nlacentaj,~ et foetale~
Afin de démontrer la spécificité des sondes oligonucléotidiques, une analyse par Northern blot a été réalisée avec 12 p,g d' ARN total issus de tissus de trophoblaste. Les transcrits d'INSL4 ont été détectés à une taille de 0,7 kilobase (kb) avec à la fois les sondes oligonucléotidiques et une sonde d'ADNc, en accord avec la 25 taille du transcrit d'INSL4 publié par Chassie et al. (1995). Pour le gène IGF-II un transcrit majeur de 6,0 kilobases et d'autres transcrits de 2 à 5 kilobases ont été
détectés, confirmant les résultats de Han et al. (1988), qui a identifié des transcrits multiples d'IGF-II avec des tailles estimées de 1,8, 2,0, 2,8, 3,0, 4,0, 4,8 et 6,2 kb, le dernier étant le plus abondant. Ces résultats montrent la spécificité des oligomers 3o d'INSL4 et d'IGF-II qui ont été choisis respectivement pour les ARNm d'INS1,4 et d'IGF-II humains. L'hybridation in situ effectuée avec des oligonucléotides sens d'INSL.4 et d'IGF-II génère seulement des grains diffus correspondant au bruit de fond, démontrant ainsi la spécificité de l'hybridation positive obtenue avec des oligonucléotides antisens.
Un niveau faible d'expression du géne INSL4 a été détecté à partir de placenta s précoce âgé de 25 jours et un niveau abondant d'ARNm d'INSL4 a été identifié
à
partir de placenta âgé de 14 semaines. Le gène INSL4 est exprimé dans les syncytiotrophoblastes et de manière moins abondante dans les cytotrophoblastcs. Lcs cellules de la partie centrale du mésoderme villeux et les cellules de cordon ombilical expriment encore plus faiblement le gène INSL4 (figures 2A, 2B et 2C). Aucun signal lo n'a été détecté ni dans l'amnion ni dans le sac vitellin (résultats non représentés).
L'ARNm d'IGF II a été exprimé en quantité abondante dans les colonnes de trophoblastes intermédiaires et dans le stroma villeux à 20 jours et 14 semaines de dévelop~ment, mais n'est pas détectable dans les coupes de syncytiotrophoblastes (figures 2D, 2r~et 2F). Dans les membranes foetales (20 jours), d'abondantes quantités 1s d'ARNm d'IGF II ont été identifiées dans les cellules damnions et les collules externes du sac vitellin (résultats non représentés). Ces résultats sont résumés dans le tableau I ci-après.

TABLEAU I : Distribution de t'ARNm d'INSL4 et d'IGF II dans le placenta et les membranes foetales humains Type de Cellules ARNm d'INSL4 ARNm d'IGF-II

Pl t aen a + + + + Ng, Syncytiotrophoblastes Cytotrophoblastes + + + +

Stroma villeux + + + +

Trophoblastes Intermdiaires + + + + +

membranes faetales Cellules de + Nd Cordon ombilical Amnion Ng. + + + +

Sac vitellin ~ Ng. ~ + + + +

s Légende du Tableau 1 Nd : non déterminé ; Nég. : signal d'hybridation négatif ; + : signal d'hybridation faible ; + + : signal d'hybridation modéré ; + + + : signal d'hybridation fort ;
+ + + + : signal d'hybridation très fort ; ies signaux sont observés après 6 semaines d'exposition.
Le gène INSL4 est exprimé de manière plus importante dans Ies syncytiotrophoblastes que dans les cytotrophoblastes. Ces résultats sont confirmés par la technique RT-PCR (amplification par réaction en chaîne à la polymérase en utilisant la transcriptase inverse) effectuée sur l'ARN total de cellules de syncytiotrophoblaste ts et de cytotrophoblaste (D. Bellet et al., 1997). L'ARNm d'IGF ll est, de manière significative, plus abondante que l'ARNm d'INSL4 dans les coupes adjacentes testées avec la sonde oligonucléotidique d'INSL4. L'expression du gène IGF II dans le placenta d'embryon humain âgé de 25 à 40 jours et de 14 semaines est localisée dans les cellules de la parle centrale du mésoderme villeux et dans les cellules de cytotrophoblaste intermédiaire ou villeux. Les transcrits d'IGF II ne sont pas détectés dans la couche syncytiotrophoblastique pour les étapes de développement étudiées.
Des observations similaires ont été reportées par exemple par V.K.M. Han (V.K.M.
Han et al., 1996). Ainsi, il est probable que ces deux g~nes jouent un r8le différent dans le développement du trophoblaste.
Exemple 2 : Hybridation in situ de tissus embrvon_~A~rec Aucune sonde oligonucléotidiquc marquée d'INSL4 n'a été détectée dans les tissus embryonnaires âgés de 20 ou 30 jours, suggérant que le gène INSL4 n'est pas lo exprimé à cette étape précoce ou que le niveau de transcrit est trop faible pour étre détecté par hybridation in situ. Par opposition, le gène IGF ll a été
fortement exprimé
à cette étape embryonnaire précoce. L'expression du gène IGF ll a été mise en évidence dans plusieurs tissus dérivés du mésoderme et de l'endoderme (figures 3A à
3H), résultats concordants avec ceux précédemment décrits (V.K.M. Han et al., ls 1987a et 1987b, J.E. Lee et al., 1990). Le site majeur de l'expression de l'IGF II est localisé dans le foie pour toutes les étapes étudiées.
Les coupes de tissus foetaux âgés de 8 semaines ont été également hybridés en utilisant les sondes oligo-nucléotidiques d'INSL4. De manière surprenante, l'ARNm d'INSL4 montre une distribution spatiale spécifique. En effet, 1a majorité des transcrits 2o d'INS1.4 sont localisés dans le périchondre des quatre membres, des c8tes et des vertèbres. De plus, l'ARNm d'INSL4 est trés abondant dans les ligaments interosseux (figures 4A à 4F). Par opposition, aucun marquage n'a été détecté dans le foie, les poumons, le coeur, le thymus, l'estomac, le muscle ou les intestins à ce stade de développement. Le tableau û ci-après résume les résultats en accord avec les types de 25 cellules identifiées dans les coupes de tissus foetaux testés.

WO 99137780 PC'T/FR99/00137 -TABLEAU II . Distribution de I'ARNm d'INSL4 et d'IGF II dans les tisssus embryonnaires (âgés de 25, 30 et 45 jours pour l'IGF II et de 8 semaines pour l'INSU
Tissus Embryonnaires ARNm d'INSL4 AItIYm d'IGF-ll Mninges Ng. + +

Prominence mandibulaire Ng. ++

Arcs branchiaux Ng. + +

Thymus Ng. Nd Arcs aortiques Ng. +

Cacur Ng. +

Moelle osseuse Ng. Nd Poumon Ng, .+.

Foie Ng. + + +

Estomac Ng. Nd Pancras Ng. Nd Intestins Ng. Nd Glandes surrnales Ng. + +

Mtanphros , Ng. + +

Sclrotome Ng, +

Prichondre + + + +

Ligaments + + Nd Muscles squelettiques Ng. + +

Epiderme Ng. Ng.

Légende du Tableau II
Nd : non déterminé ; Nég. : signal d'hybridation négatif ; + : signal d'hybridation faible ; + + : signal d' hybridation modéré ; + + + : signal d' hybridation fort ;
+ + + + : signal d'hybridation trZs fort ; les signaux sont observés après 6 semaines lo d'exposition.

Les coupes de tissus embryonnaires hybridés avec les mêmes sondes oligonucléotidiques d'INSL4 et d'IGF ll montrent qu'au contraire des transcrits d'IGF
II, qui sont localisés dans la plupart des tissus embryonnaires (V.R.K. Han et al., 1987a et 1987b ; J.E. Lec et al., 1990), lc gène INSL4 est exprimé seulement dans 5 quelques-uns de ces tissus. En effet, dans les coupes de tissu d'embryon humain âgé
de 8 semaines, les transcrits d'INSL4 ne sont localisés que dans les cellules du périchondre et des ligaments. A cc stade de développement, la chondrification est commencée pour tous les os des membres inférieurs.
Il est remarquable que le gène INSL4 soit un membre de la superfamille des 10 gènes apparentés à l'insuline et que d'autres membres de cette famille codent pour des polypeptides régulateurs à la fois de la croissance et du développement dans de nombreux tissus. En particulier, les facteurs de croissance apparentés à
l'insuline (IGFs) jouent un r8le important dans la régulation de la formation des os (B.
Bhaumic et al., 1993 ; R. Malpe et al., 1997, et S. Mohan et al., 1991). Dans ce contexte, 1s l'expression spécifique du gène INSl,4 au cours du développement embryonnaire chez l'homme, à la fois sur le plan chronologique et sur le plan de sa distribution tissulaire hautement restrictive dans l'embryon, suggère fortement que ce gène est très certainement impliqué dans différents stades de développement de l'os en formation et des ligaments.

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~ Walker, G.T. et al., (1992), Nucleic Acids Res. 20 : 1691-1696.

LISTE DE SÉQUENCES
(1) INFORMATIONS GÉNÉRALES:
(i) DÉPOSANT:
(A) NOM: INSTITUT GUSTAVE-ROUSSY
(B) RUE: 39 RUE CAMILLE DESMOULINS
(C) VILLE: VILLEJUIF
( E ) PAYS : FRANCE
(F) CODE POSTAL: 94800 (ü ) TITRE DE L' INVENTION: NOUVELLE PROTÉINE DÉNOMMÉE EPIL/PLACENTIN, PROCÉDÉ DE PRÉPARATION DE CETTE PROTÉINE ET COMPOSITION
PHARMACEUTIQUE LA CONTENANT, ADN CODANT POUR LADITE
PROTÉINE
(iii) NOMBRE DE SÉQUENCES: 3 (iv) FORME DÉCHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:
(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk (8) ORDINATEUR: IBM PC compatible (C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS
(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB) (2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 1:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 618 paires de bases (B) TYPE: nuclbotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü ) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: CDS
(B) EMPLACEMENT:107..523 (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: l:

Met Ala Ser Leu Phe Arg Ser Tyr Leu Pro Ala Ile Trp Leu Leu Leu Ser Gln Leu WO 99/3778b PCf/FR99/00137 Leu Glu Ser Leu AlaGlu Leu Gly Gly Arg Phe Arg Ala Arg Cys Pro AAA TCA GAG ACA

Gly His Leu Leu TyrCys ProMetPro Lys Phe Thr Lys Ser Glu Thr ACC TGG CGT AAA

Thr Pro Gly Gly LeuLeu GluSerGly Pro Glu Met Thr Trp Arg Lys TCA AAC TTA ACG

Val Thr Ser Asn LysAsp GlyGlnAla Gly Thr Ser Ser Asn Leu Thr TTC TTG AAA CTG

Glu Ile Pro Asn SerPro GluLeuLys Pro Ser Glu Phe Leu Lys Leu CAG AAG CGC AAG

Gly Pro Ser Leu LysIle IleLeuSer Lys Arg Ser Gln Lys Arg Lys CGT GAT GTA TGT

Gly His Arg Phe ProPhe CysCysGlu Ile Asp Asp Arg Asp Val Cys ACT TTA ATCAT GGACATCTCA

Gly Ser Val Lys CysThr Thr Leu TATGTATTCT CCCAATTAAA
CAATGACAAA T

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID N0: 2:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 60 paires de bases (B) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü ) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: sonde INSL4 antisens (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 2:

(2) INFORMATIONS POUR LA SEQ ID NO: 3:
(i) CARACTÉRISTIQUES DE LA SÉQUENCE:
(A) LONGUEUR: 60 paires de bases (8) TYPE: nucléotide (C) NOMBRE DE BRINS: simple (D) CONFIGURATION: linéaire (ü ) TYPE DE MOLÉCULE: ADNc (ix) CARACTÉRISTIQUE:
(A) NOM/CLE: sonde IGF-II antisens (xi) DESCRIPTION DE LA SÉQUENCE: SEQ ID NO: 3:

Claims (13)

REVENDICATIONS

1. Utilisation de la séquence INSL4 pour la préparation d'une composition destinée au traitement de pathologies liées à la régénération, ou à la différentiation et/ou à la prolifération anormale, du tissu osseux et/ou des cellules de ligaments.

2. Utilisation selon la revendication 1, pour le traitement et/ou la prévention de l'ostéoporose ou d'une dysplasie.

3. Utilisation selon la revendication 1, pour la réparation des lésions du tissu osseux et/ou des ligaments suite à un choc traumatique.

4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite composition comprend un composé choisi parmi les composés suivants :
a) une séquence nucléique comprenant un fragment d'au moins 10 nucléotides de la séquence du gène INSL4 ou la séquence antisens de ce fragment :
b) un polypeptide, ou l'un de ses fragments d'au moins 5 acides aminés, codé
par la séquence du gène INSL4 ; et c) un anticorps capable de reconnaître un polypeptide, ou un de ses fragments d'au moins 5 acides amines, codé par la séquence du gène INSL4.

5. Utilisation de la séquence dur gène INSL4 dans un procédé de diagnostic de pathologies liées à la différentiation et/ou à la prolifération anormale du tissu osseux et/ou des cellules de ligaments.

6. Utilisation selon la revendication 5, dans un procédé de diagnostic de pathologies liées au développement anormal du cartilage et/ou à une ossification anormale de l'os en formation.

7. Utilisation selon la revendication 5, dans un procédé de diagnostic de l'ostéoporose et/ou d'une dysplasie.

8. Utilisation selon l'une des revendications 5 à 7, caractérisée en ce que ledit procédé met en oeuvre un fragment d'au moins 10 nucléotides de la séquence du gène INSL4 comme sonde ou amorce.

9, Utilisation selon l'une des revendications 5 à 7, caractêrisée en ce que ledit procédé met en oeuvre un anticorps capable de reconnaître un polypeptiàe, ou un de ses fragments d'au moins 5 acides aminés, codé par 1a séquence du gêne

10. Kit ou nécessaire pour 1c diagnostic de pathologies liée à la différentiation et/ou â la prolifération anormale du tissu osseux et/ou des cellules de ligaments.caractérisé en ce qu'il comprend au moins un composé choisi parmi les composés suivants a) une séquence nucléique comprenant un fragment d'au moins 10 nuclcotides de la séquence du géne INSL4 ou la séquence complémentaire de ce fragment ; et b) un anticorps capable de reconnaître un polypeptide, ou un de ses fragments d'au moins 5 acides aminés, codé par la séquence du gène INSL4.

11 Kit on nécessaire selon la revendication 10, dans un procédé de diagnostic de pathologies liées au développment anormal du cartilage et/ou à
une ossification anormale de l'os en formation.

12. Kit ou nécessaire selon la revendication 10, dans un procédé de diagnostic de l'ostéoporose et/ou d'une dysplasie.

13. Méthode de sélection de composé capable de moduler la diffêrentiation et/ou la prolifération du tissu osseux et/ou de cellules de ligaments, caractérisée en ce que ladire méthode met en oeuvre un composé choisi parmi les composés suivants.
a) une séquence nucléique comprenant un fragment d'au moins 10 nucléotides de la séquence du géne INSL4.ou la séquence complémentaire de ce fragment ;
b) une cellule transformée comprenant une séquence nucléique comprenant un fragment d'au moins 10 nucléotides de la séquence du INSL4, et c) un polypeptide, ou l'un de ses fragments d'au moins 5 acides aminés, codé
par la séquence du gène INSL4.