FR2774095A1 - Expression du gene insl4 dans les tissus osseux embryonnaires humains et applications - Google Patents

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Abstract

La présente invention concerne la localisation de l'expression du gène insulin-like 4 (INSL4) dans les tissus osseux et ligaments embryonnaires chez l'homme, des procédés de détection et de diagnostic, des méthodes de marquage et de détection de cellules desdits tissus exprimant les produits d'expression du gène INSL4 ainsi que des méthodes de sélection de composés capables de moduler l'activité desdites cellules. L'invention concerne également des médicaments destinés au traitement de pathologies liées à la différenciation et/ ou la prolifération anormale desdits tissus, notamment les pathologies liées au développement anormal du cartilage et/ ou à une ossification anormale de l'os en formation et/ ou au développement anormal des ligaments interosseux.

Description

EXPRESSION DU GENE INSL4 DANS LES TISSUS OSSEUX
EMBRYONNAIRES HUMAINS ET APPLICATIONS.
La présente invention concerne la localisation de l'expression du gène insulin-like 4 (INSL4) dans les tissus osseux et ligaments embryonnaires chez l'homme, des procédés de détection et de diagnostic, des méthodes de marquage et de détection de cellules desdits tissus exprimant les produits d'expression du gène INSL4 ainsi que des méthodes de sélection de composés capables de moduler l'activité desdites cellules. L'invention concerne également des médicaments destinés au traitement de pathologies liées à la différenciation et/ou la prolifération anormale desdits tissus, notamment les pathologies liées au développement anormal du cartilage et/ou à une ossification anormale de l'os en formation
et/ou au développement anormal des ligaments interosseux.
L'insuline, l'IGF-I, l'IGF-II (" Insulin-like growth factors I and II " ou facteurs de croissance de type insuline I et II) et la relaxine appartiennent à une famille d'hormones peptidiques ayant certaines structures et fonctions en commun, notamment leur influence sur la prolifération, le développement, la différenciation et!e
métabolisme cellulaire (D. Le Roith, 1997).
L'insuline est bien connue comme étant une hormone
endocrine pancréatique régulant le métabolisme énergétique.
Les facteurs de croissance de type insuline-IGF-I sont des peptides promoteurs de croissance impliqués dans la régulation endocrine, paracrine et autocrine de la croissance cellulaire et qui sont exprimés dans de norbreux tissus. L'IGF-II a des propriétés similaires mais est exprimée en quantité plus importante en période prénatale et est considérée comme étant un facteur de croissance foetale. La relaxine induit un remodelage des tissus conjonctifs dans le tractus reproductif et inhibe les contractions utérines. Le gène de la relaxine est exprimé dans le corpus luteum, la decidua, le trophoblaste et la prostate (Bogic, L.V. et al., 1995). Son rôle fonctionnel dans le cerveau o une expression très importante a été
observée, reste à être élucidé.
On a adjoint, également, à cette famille les Ley I-L (INSL3) qui sont actuellement clones sous forme d'ADNc et dont l'activité biologique est encore à définir. Les transcrits Ley I-L sont présents dans les cellules de Leydig et dans d'autres tissus comme par exemple le corpus luteum, le trophoblaste, les membranes foetales et le tissu mammaire (Adham, I.M. et al., 1993; Tashima, L.S. et al.,
1995).
Différentes études ont montré l'importance évidente de ces gènes dans la régulation de la croissance du foetus et du développement des cellules souches (V.K.M. Han et al., 1996; D.J. Hansell et al., 1991, et L.S. Tashiman et al., 1995). L'IGF-I et 1'IGF-II sont exprimées par la plupart des tissus foetaux et embryonnaires et régulent la croissance et la différenciation cellulaire comme facteur autocrine/paracrine. Des expériences de mutagénèse dirigée effectuées sur les gènes codant pour les facteurs de croissance IGF-I et IGF-II ont mis en évidence l'application importante des systèmes de facteurs de croissance dans le processus de croissance (J. Baker et al., 1993; T.M. De Chiara et al., 1990, et J.P. Liu et al., 1993). De Chiara et al. ont démontré une relation causale entre une invalidation du gène de l'IGF-II et un phénotype de déficience de croissance qui devient apparent dès le seizième jour de l'embryon et qui persiste après sa naissance. Liu et al. ont observé que des souris mutantes IGF-I (-I-) présentaient un poids à leur naissance d'environ 60 % de leur poids normal et que certaines
d'entre elles étaient mort-nées.
Cette famille peptidique présente en commun des caractères structuraux définis par la position de différentes cystéines essentielles pour la formation d'une
structure tertiaire.
On a pu démontrer que tous les membres de cette famille se fixaient à des récepteurs de surface cellulaires. Ces récepteurs ont été identifiés par clonage moléculaire et caractérisés en détail pour l'insuline et les IGFs. Ils appartiennent à la superfamille des récepteurs tyrosine-kinases (RTK's) qui comprend des récepteurs de facteurs de croissance et leurs analogues oncogènes tels que c- erbB2/neu (récepteur EGF), c-met (récepteur de facteur de croissance des hépatocytes), fms
(récepteur de CSF-1) et trk (récepteur de NGF).
La voie de transduction du signal intracellulaire pour
ces récepteurs est caractérisée par une activité tyrosine-
kinase qui produit une autophosphorylation des résidus tyrosine sur le récepteur suivie par une chaîne d'événements correspondant à des phosphorylations. Ceci inclut notamment l'activation de l'IRS-1 (en particulier pour l'insuline et les IGFs), P13K, Shc, GBR2, Sos, Ras, Raf et la protéine activant la mitogénèse (MAP-kinase), kinase culminant lorsque la cascade de phosphorylation affecte différents processus cellulaires tels que la transcription. Les effets physiologiques pléiotropiques de cette cascade de signaux en général font l'objet de recherches intensives. Les polypeptides membres de cette famille sont tous caractérisés par la présence d'un peptide signal, une chaîne B, un peptide de jonction C ou chaîne C et une chaîne A.
Pour ces hormones polypeptidiques, les termes de pré-
prohormone, prohormone ou hormone mature sont définis à partir de la présence ou non de certains éléments et de leur arrangement en structure tertiaire. La pré-prohormone se distingue de la prohormone par la présence de l'élément peptide signal. La distinction entre prohormone et hormone mature active est plus complexe et fonction de l'hormone considérée. Par exemple, dans la proinsuline et la prorelaxine, les chaînes B et A sont localisées respectivement aux extrémités N- et C- terminales et sont séparées par un long peptide C de jonction qui est clivé lors de la phase de maturation qui aboutit à la forme active de l'hormone. Au contraire de l'insuline et de la relaxine, le peptide C des IGFs n'est pas clivé pendant la phase de maturation. Les formes matures des peptides IGFs contiennent, en plus des domaines A, B et C, deux peptides carboxyl terminaux (domaines D et E) qui sont clivés après expression. Récemment, un nouveau gène, dénommé INSL4, de la famille des insulin-like (insulines apparentées) a été caractérisé (WO 95 34653, Chassin, D. et al., 1995). Ce gène a été cloné à partir d'une banque d'ADNc de placenta
précoce et localisé sur le chromosome 9p24.
Le gène INSL4 code pour un polypeptide de 139 acides aminés dénommé " EPIL " (peptide insulin-like de placenta précoce).
Pour plus de clarté dans la présente description, on
désignera par polypeptide EPIL, le polypeptide putatif de 139 acides aminés déduit de la séquence d'acide nucléique
codante et tel que défini dans la figure 1.
La séquence d'acides aminés déduite a montré, en accord avec l'organisation générale de cette famille d'hormones, certaines homologies structurales comme la présence d'un peptide signal, d'une chaîne B et A et d'un peptide C de jonction ou chaîne C, ainsi que la présence de 6 résidus cystéine, devant être probablement impliqués dans
la formation de 3 ponts disulfures.
Ces documents décrivent l'organisation du gène INSL4 qui est composé de deux exons et d'un intron. Ces documents montrent également que les transcrits ARNm du gène INSL4 ont seulement été détectés dans les tissus placentaires et
faiblement dans l'utérus (D. Chassin et al., 1995).
Le gène INSL4 qui appartient également à cette famille pourrait être un nouveau membre de cette famille de gène qui est impliqué dans le développement humain. Pour nous permettre de mieux comprendre le rôle de ces gènes dans le développement embryonnaire et foetal, l'étude des voies d'expression de ces gènes à différentes étapes du développement a été une approche réussie (T. Strachan et al., 1997; C. Ottolenghi et al., 1997, et J. Burn et al., 1995). En étudiant la chronologie et la localisation de l'expression des gènes INSL4 et IGF-II dans le développement du placenta et des tissus humains d'embryons en début de gestation par la technique d'hybridation in situ, les inventeurs ont mis en évidence un niveau d'expression élevé de transcrits d'INSL4 dans le
trophoblaste humain, en particulier dans les syncytio-
trophoblastes. De manière tout à fait surprenante, les inventeurs ont également mis en évidence un niveau d'expression élevé de transcrits d'INSL4 dans des tissus foetaux âgés de huit semaines, mais seulement dans les
ligaments interosseux et dans lepérichondre.
La présente invention a donc pour objet un polypeptide EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3 codé par le gène INSL4, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans des cellules
foetales du tissu osseux.
Dans la présente description, le terme de polypeptide
désigne également une protéine ou un peptide.
On entend désigner dans la présente invention par polypeptide EPIL 1, un polypeptide codé par le gène INSL4, constitué d'une seule chaîne comportant les régions A, B et C de séquence globale d'acides aminés choisie parmi les séquences d'acides aminés comprises entre les positions 18 et 139, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence globale comportant au moins la séquence d'acides aminés comprise entre les positions 24 et 139, extrémités incluses, ledit polypeptide EPIL 1 pouvant en outre comporter un peptide signal de telle sorte que la séquence d'acides aminés du polypeptide EPIL 1 comprenant le peptide signal est la séquence comprise entre les positions 1 et 139, extrémités comprises, de la séquence d'acides aminés définie à la
figure 1.
On entend désigner dans la présente invention par polypeptide EPIL 2, un polypeptide codé par le gène INSL4, constitué: a) d'une chaîne A dont la séquence d'acides aminés est la séquence comprise entre les positions 115 et 139, extrémités incluses de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1; b) d'une chaîne B dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi une séquence comprise entre les positions 18 et 58, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 24 et 53, extrémités incluses; ledit polypeptide EPIL 2 pouvant comporter en outre un peptide signal de séquence d'acides aminés choisie parmi une séquence comprise entre les positions 1 et 23, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence du peptide signal comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 1 et 17,
extrémités incluses.
On entend désigner dans la présente invention par polypeptide EPIL 3, un polypeptide codé par le gène INSL4, constitué d'une chaîne C dont la séquence d'acides aminés est choisie parmi une séquence comprise entre les positions 54 et 114, extrémités incluses, de la séquence d'acides aminés définie à la figure 1, ladite séquence comprenant au moins la séquence comprise entre les positions 59 et 114,
extrémités incluses.
On entend désigner par tissu osseux dans la présente
description, les tissus composant préférentiellement les os
cartilagineux longs, courts ou plats.
L'invention concerne également les polypeptides selon l'invention, caractérisés en ce que les cellules foetales
du tissu osseux sont des cellules du périchondre.
L'invention a aussi pour objet les polypeptides EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3 codés par le gène INSL4, caractérisés en ce qu'ils sont exprimés dans des cellules foetales de
ligaments, notamment les ligaments interosseux.
L'invention comprend en outre les polypeptides EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3 codés par le gène INSL4, caractérisés en ce qu'ils sont impliqués dans le processus de différenciation, de prolifération et/ou de régénération de
cellules du tissu osseux et/ou de ligaments.
Font également partie de l'invention, les polypeptides EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3 codés par le gène INSL4, caractérisés' en ce qu'ils sont impliqués dans le processus de développement du cartilage et/ou d'ossification de l'os
en formation.
Il doit être compris que l'invention ne concerne pas les polypeptides sous forme naturelle, c'est-à-dire qu'ils ne sont pas pris dans leur environnement naturel mais qu'ils ont pu être obtenus par purification à partir de sources naturelles, ou bien obtenus par recombinaison génétique, pouvant être glycosylés ou non, ou encore obtenus par synthèse chimique et pouvant alors comporter
des acides aminés non naturels ou modifiés.
L'invention est relative à l'utilisation d'un ou de plusieurs anticorps dirigés contre un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3, l'un de leurs homologues ou variants ou un de leurs fragments, pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage d'un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3 ou l'un de leurs homologues ou variants, dans le
tissu osseux et/ou dans les ligaments.
L'invention est aussi relative à l'utilisation d'un ou de plusieurs anticorps dirigés contre un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3, l'un de leurs homologues ou variants, ou l'un de leurs fragments pour le diagnostic de pathologies liées à l'expression anormale de polypeptide EPIL 1, EPIL 2
et/ou EPIL 3 dans le tissu osseux et/ou dans les ligaments.
On entendra désigner comme polypeptides homologues de polypeptide EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3, les polypeptides présentant, par rapport auxdits polypeptides EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une mutation, notamment ponctuelle. Parmi les polypeptides homologues, on préfère ceux dont la séquence d'acides aminés présente au moins 80 %, de préférence 90 %, de similitude avec les séquences d'acides
aminés des polypeptides selon l'invention.
On entendra par polypeptide variant de polypeptide EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3, l'ensemble des polypeptides mutés pouvant exister naturellement, en particulier chez l'être humain, et qui correspondent notamment à des troncatures, substitutions, délétions et/ou additions d'au moins un résidu d'acide amine. Ces polypeptides variants correspondent en particulier à une expression anormale des
polypeptides EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3.
Par fragment de polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3, ou d'un de leurs homologues ou variants, on entend désigner un polypeptide de séquence d'acides aminés comportant au minimun 5 acides aminés, de préférence 10 acides aminés et
15 acides aminés consécutifs desdits polypeptides.
Parmi les anticorps qui pourront être utilisés pour la pour ladite détection, identification, localisation et/ou ledit dosage ou pour ledit diagnostic de pathologies, on préfère les anticorps mono ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3, l'un de leurs homologues ou
variants, ou l'un de leurs fragments.
Des anticorps polyclonaux spécifiques peuvent être obtenus à partir d'un sérum d'un animal immunisé contre,
par exemple:
- un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3, l'un de leurs homologues ou variants, ou l'un de leurs fragments, notamment produit par recombinaison génétique ou par synthèse peptidique, selon les modes opératoires usuels, à partir d'une séquence d'acide nucléique codant pour lesdits polypeptides ou de séquence d'acides aminés desdits polypeptides. Les anticorps monoclonaux spécifiques peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes
décrite par Kôhler et Milstein, 1975.
Lesdits anticorps sont, par exemple, des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab ou F(ab')2. Ils peuvent également, selon l'invention, se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable. Il est bien entendu qu'on entend par l'expression
" plusieurs anticorps " dans la présente description, au
moins deux anticorps de spécificité différente, c'est-à-
dire capable de reconnaître et de se lier à deux épitopes ou domaines différents desdits polypeptides. Il est d'ailleurs préféré selon l'invention d'utiliser au moins deux anticorps de spécificité différente pour les procédés, les méthodes et les kits de l'invention qui incluent lesdits anticorps. Dans ce cas, on pourra par exemple utiliser deux marquages d'anticorps différents ou deux
systèmes de révélation différents.
Cesdits anticorps pourront ainsi constituer un moyen d'analyse immunocytochimique ou immunohistochimique de l'expression desdits polypeptides sur des coupes spécifiques de tissus osseux et/ou de ligaments, par
exemple par immunofluorescence, marquage à l'or, immuno-
conjugués enzymatiques.
Ils permettent notamment de mettre en évidence et de quantifier la présence spécifique normale ou anormale desdits polypeptides dans les tissus osseux et/ou de ligaments, ce qui les rend utiles pour l'identification et la localisation de l'expression de ces polypeptides, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence
anormale desdits polypeptides.
Plus généralement, lesdits anticorps peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation o l'expression d'un desdits polypeptides doit être observée de manière qualitative et/ou quantitative dans un
échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligaments.
Les techniques et les réactifs spécifiques permettant la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage des complexes antigène-anticorps que l'on pourra utiliser dans les procédés de l'invention, sont bien connus de l'homme du métier et sont, par exemple, les techniques ELISA, RIA ou d'immunofluorescence pouvant être associées, dans le cas o les anticorps de l'invention ne sont pas déjà immunoconjugués ou marqués, avec les réactifs appropriés tels que des anticorps immunoconjugués, marqués à la fluorescéine ou radiomarqués capables de reconnaitre spécifiquement lesdits anticorps, ainsi que les substrats chromogènes spécifiques des enzymes conjugués et les réactifs témoins de contrôles positif, négatif et quantitatif. Ainsi, l'invention comprend un procédé de détection, d'identification, de localisation et/ou de dosage spécifique d'un polypeptide EPIL 1, EPIL 2 et/ou EPIL 3 ou un de ses fragments dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligament, ou de diagnostic de pathologies liées à la présence anormale du ou desdits polypeptides dans le tissu osseux et/ou dans les ligaments, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) mise en contact dudit échantillon biologique avec un ou plusieurs anticorps dirigés contre le ou lesdits polypeptides; b) mise en évidence, identification, localisation et/ou
dosage du complexe antigène-anticorps formé.
L'invention comprend également un kit ou nécessaire pour la détection, l'identification, la localisation et/ou Il le dosage spécifique d'un polypeptide EPIL 1, EPIL 2 et/ou EPIL 3 ou un de ses fragments dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligaments, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale du ou desdits polypeptides dans ledit échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) un ou plusieurs anticorps dirigés contre le ou lesdits polypeptides; b) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique; c) le cas échéant, les réactifs permettant la détection,
l'identification et/ou le dosage des complexes antigène-
anticorps produits par la réaction immunologique.
L'invention concerne également l'utilisation d'une sonde ou amorce oligonucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4, pour la détection, l'identification, la localisation, l'amplification, et/ou le dosage de séquence d'acide nucléique correspondant au
gène INSL4 dans le tissu osseux et/ou dans les ligaments.
L'invention comprend également l'utilisation d'une sonde ou amorce oligonucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4, pour le diagnostic de pathologies liées à l'expression anormale du gène INSL4
dans le tissu osseux et/ou dans les ligaments.
On entendra désigner par -séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4-, la séquence nucléotidique du gène INSL4 telle que définie à la figure 1 ou toutes séquences nucléotidiques codant pour un polypeptide homologue ou variant de polypeptide EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3, leur séquence complémentaire, la séquence nucléotidique
de leur ARN correspondant ainsi que leurs fragments.
Lesdites sondes oligonucléotidiques capables de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4, pourront être marquées ou fixées sur un support solide par liaison covalente ou non, les techniques de marquage ou de fixation
de telles sondes étant bien connues de l'homme de l'art.
Une hybridation spécifique signifie que l'hybridation est réalisée dans des conditions de stringence, en particulier dans des conditions de température et de force ionique telles qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN globalement complémentaires. A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les séquences nucléotidiques décrites ci-dessus, sont
avantageusement les suivantes.
L'hybridation est réalisée à une température préférentielle de 65 C, en présence de tampon 6 x SSC, 5 x de solution de Denhardt, 0,5 % SDS et 100 pg/ml d'ADN de
sperme de saumon.
1 x SSC correspond à 0,15 M NaCl et 0,05M de citrate de sodium et une solution de 1 x Denhardt correspond à 0,02 % Ficoll, 0,02 % de polyvinylpyrrolidone et 0,02 % de
sérum albumine bovine.
Les étapes de lavage peuvent, par exemple, être effectuées pendant 5 à 30 min. à 65 C, dans un tampon 2 x
SSC ou 1 x SSC et à 0,1 % SDS.
Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci- avant pour un polynucléotide de taille définie,
seront adaptées par l'homme du métier pour des oligo-
nucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon
l'enseignement de Sambrook et al., 1989.
Les sondes ou amorces oligonucléotidiques, et de manière générale les séquences d'acide nucléique selon i'invention, présenteront une taille minimale de 10 bases et on préférera des fragments de 20 bases, et de préférence
bases.
Font également partie de l'invention, les procédés de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligament, ou de diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de la dite séquence d'acide nucléique dans ledit échantillon biologique, caractérisés en ce qu'ils comportent les étapes suivantes: a) isolement de l'ADN à partir dudit échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN dudit échantillon biologique; b) amplification spécifique de ladite séquences d'acide nucléique à l'aide d'au moins une amorce capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4; c) analyse qualitative et/ou quantitative des produits d'amplification. L'invention comprend aussi les procédés de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligament, ou de diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de la dite séquence d'acide nucléique dans ledit échantillon biologique, caractérisés en ce qu'ils comportent les étapes suivantes: a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 avec ledit échantillon biologique, l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de ladite sonde à l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique; b) détection, identification et/ou dosage de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique et l'ADN dudit
échantillon biologique.
L'invention est relative en outre à des procédés de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligament, ou de diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de ladite séquence d'acide nucléique dans ledit échantillon biologique, caractérisés en ce qu'ils comportent les étapes suivantes: a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique immobilisée sur un support et capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4, avec ledit échantillon biologique, l'ADN de l'échantillon, ayant, le cas échéant, été préalablement amplifié à l'aide d'au moins une amorce capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 et/ou rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de ladite sonde à l'ADN dudit échantillon biologique; b) mise en contact de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique immobilisée sur un support et l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique, le cas échéant après élimination de l'ADN dudit échantillon biologique n'ayant pas hybridé avec ladit sonde, avec une sonde oligonucléotidique, notamment marquée, et capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide
nucléique correspondant au gène INSL4.
Font en outre partie de la présente invention, les kits ou nécessaires pour la détection, l'identification et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligament, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de ladite séquence
d'acide nucléique dans ledit échantillon biologique,.
caractérisés en ce qu'ils comprennent les éléments suivants: a) une sonde oligonucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation; c) le cas échéant, au moins une amorce capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de
1'ADN.
L'invention comprend également les kits ou nécessaires pour la détection, l'identification et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligament, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de ladite séquence d'acide nucléique dans ledit échantillon biologique, caractérisés en ce qu'ils comprennent les éléments suivants: a) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de capture, pouvantêtre fournie préimmobilisée sur un support, et capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4; b) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de révélation, notamment marquée, et capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène
INSL4;
c) le cas échéant, au moins une amorce capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de
1 'ADN.
Font aussi partie de l'invention, les procédés ou kits selon l'invention pour le diagnostic de pathologies liées à la différenciation et/ou la prolifération anormale du tissu osseux et/ou des cellules de ligaments, pour le diagnostic de pathologies liées au développement anormal du cartilage et/ou à une ossification anormale de l'os en formation et/ou pour le diagnostic d'ostéoporose et/ou pour le diagnostic de dysplasies. Parmi les dysplasies, on peut citer notamment les dysplasies diaphysaires comme l'hypoplasie diaphysaire ou ostéogénèse imparfaite ou
encore l'hyperplasie diaphysaire ou maladie d'Engelmann.
Dans la présente invention on entend par diagnostic de pathologies liées à la différenciation et/ou la prolifération anormale du tissu osseux et/ou des cellules de ligaments, ou pour le diagnostic de pathologies liées au développement anormal du cartilage et/ou à une ossification anormale de l'os en formation ou encore pour le diagnostic d'ostéoporose et/ou de dysplasie, non seulement le diagnostic proprement dit de la pathologie, mais aussi le diagnostic ou pronostic d'évolution de ladite pathologie, suite par exemple à un traitement thérapeutique. Ainsi, selon l'invention, lesdits procédés ou kits peuvent être utilisés pour évaluer l'efficacité d'un traitement
thérapeutique de ladite pathologie.
Les techniques d'amplification spécifique et d'analyse qualitative et/ou quantitative de séquence nucléique que l'on pourra utiliser dans les procédés de l'invention, sont bien connues de l'homme du métier et sont, par exemple, les méthodes comprenant au moins une étape d'amplification dite
par PCR (réaction en chaîne par la polymérase) ou par PCR-
like de la séquence cible susceptible d'être présente à l'aide d'au moins une amorce oligonucléotidique de séquence nucléique telle que définie précédemment. Les produits amplifiés pourront être traités à l'aide d'enzyme de restriction approprié avant de procéder à la détection ou au dosage du produit ciblé, notamment par un procédé selon l'invention. Par PCR-like on entendra désigner toutes les méthodes mettant en oeuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acide nucléique, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés. Ces techniques sont bien entendu connues. En général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN, il convient préalablement d'effectuer une transcription réverse. Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, par exemple les méthodes dites NASBA " Nucleic Acid Sequence Based Amplification " (Compton, 1991), TAS " Transcription based Amplification System " (Guatelli et al., 1990), LCR " Ligase Chain Reaction " (Landegren et al., 1988), " Endo Run Amplification " (ERA), " Cycling Probe Reaction " (CPR), et SDA " Strand Displacement Amplification " (Walker et al., 1992), bien connues de l'homme du métier. Sont également connues de l'homme du métier, les techniques de quantification d'acide nucléique dans lesquelles par exemple on amplifie l'acide nucléique à quantifier par une méthode type PCR et en présence d'un acide nucléique standard de même taille, de quantité connue et capable de s'hybrider aux mêmes amorces
que l'acide nucléique cible.
Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions. La spécificité de l'amplification peut être contrôlée par exemple par hybridation moléculaire en
utilisant comme sondes les sondes telles que définies ci-
dessus, notamment marquees.
L'invention comprend en outre, les méthodes de marquage de cellule de tissu osseux et/ou de ligament, notamment d'origine foetales, caractérisées en ce qu'elles comprennent les étapes suivantes: a) mise en contact d'un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligament avec un ou plusieurs anticorps dirigés contre le ou les polypeptides EPIL 1, EPIL 2 et/ou EPIL 3, lesdits anticorps pouvant être marqués; b) le cas échéant, marquage desdits anticorps à l'aide de
composés marqués capable de reconnaître lesdits anticorps.
Les techniques de marquage de cellules par des anticorps spécifiques de composé de ladite cellule, sont bien connues des immuraocytochimistes ou des immunohistochimistes et ne seront pas développées dans la
présente description.
Sont également comprises dans la présente invention les méthodes de marquage de cellule de tissu osseux et/ou de ligament, notamment d'origine foetales, caractérisées en ce qu'elles comprennent les étapes suivantes: a) mise en contact d'un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligament avec une ou plusieurs sondes oligonucléotidiques capables de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4, lesdites sondes pouvant être marquées; b) le cas échéant, marquage desdites sondes à l'aide de
composés marqués capables de reconnaître lesdites sondes.
L'invention a aussi pour objet un procédé de détection de cellule anormale de tissu osseux et/ou de ligament, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une méthode de
marquage selon l'invention.
Un autre aspect de l'invention concerne des méthodes de sélection de composé chimique ou biochimique capable de moduler la différenciation, la régénération et/ou la prolifération de cellules humaines et/ou animales de tissu osseux et/ou de ligament, caractérisées en ce qu'elles mettent en oeuvre un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3, un de leurs polypeptides homologues ou variant, ou un de leurs fragments, une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4, ou une cellule de tissu osseux ou de ligament, notamment foetale. Ladite cellule pouvant être une cellule transformée par recombinaison génétique ou sélectionnée
selon l'invention.
Parmi ces méthodes, on préfère les méthodes caractérisées en ce que ledit composé sélectionné est capable d'inhiber ou de favoriser la différenciation, la régénération et/ou la prolifération de cellules humaines et/ou animales de tissu osseux et/ou de ligament, notamment
les cellules foetales du périchondre.
Lesdits composés pourront par exemple être sélectionnés sur leur capacité à se lier à un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3, à un de leurs polypeptides homologues ou variant, ou à un de leurs fragments, et à inhiber ou favoriser l'activité desdits polypeptides dans les tissus osseux et/ou dans les ligaments, en tant que, par exemple, ligands agonistes ou antagonistes d'un récepteur spécifique desdits polypeptides sur les cellules
desdits tissus.
Lesdits composés pourront être également sélectionnés sur leur capacité à se lier à une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4, et à inhiber ou favoriser l'expression du gène codant pour lesdits
polypeptides en tant qu'inducteur ou répresseur.
Lesdits composés pourront également être sélectionnés sur leur capacité à moduler sur lesdites cellules in vitro ou in vivo, l'activité biologique desdits polypeptides exprimés par lesdites cellules, comme notamment la différenciation, la prolifération ou la régénération
desdites cellules.
Par exemple, l'invention comprend une méthode de sélection de composés capables de se lier à un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3, à un de leurs polypeptides homologues ou variants, ou à un de leurs fragments, ou encore capables de se lier à une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4, et capables de moduler l'activité desdits polypeptides dans les tissus osseux et/ou dans les ligaments, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: a) mise en contact dudit composé avec ledit polypeptide ou ladite séquence d'acide nucléique; b) détermination de la capacité dudit composé à se lier avec ledit polypeptide ou ladite séquence d'acide nucléique; c) mise en évidence de la modulation de l'activité desdits polypeptides sur des cellules de tissu osseux et/ou de ligament, susceptible d'être obtenue avec les composés
sélectionnés à l'étape b).
Il sera possible, par exemple, d'utiliser des cellules de tissu osseux et/ou de ligament transformées par recombinaison génétique ou sélectionnées selon l'invention,
à l'étape b) et/ou c) de la présente méthode.
L'invention comprend également les composés chimiques ou biochimiques, susceptibles d'être sélectionnés par une
méthode selon l'invention.
Les composés susceptibles d'être sélectionnés peuvent être des composés organiques tels que des polypeptides ou hydrates de carbone ou tous autres composés déjà connus, ou des composés organiques nouveaux élaborés à partir de techniques de modélisation moléculaire et obtenus par synthèse chimique ou biochimique, ces techniques étant
connues de l'homme de l'art.
L'invention a en outre pour objet des composés selon 1 invention à titre de médicament, de préférence choisis parmi: a) un polypeptide EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3, un de leurs polypeptides homologues ou variants ou un de leurs fragments, pouvant être obtenu par recombinaison génétique ou par synthèse chimique; b) un anticorps dirigé contre un polypeptide tel que défini en a); c) un composé chimique ou biochimique, caractérisé en ce qu'il est un ligand d'un polypeptide tel que défini en a); d) un vecteur comprenant tout ou partie d'une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4; e) un vecteur tel que défini en d), présentant à sa surface un marqueur spécifique de cellules de tissu osseux ou de ligament cible dont on cherche à moduler l'activité; f) une séquence d'acide nucléique sens ou antisens capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence
d'acide nucléique correspondant au gène INSL4.
Les fragments de polypeptide EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3, ou de leurs polypeptides homologues ou variants, et tels que définis en a) seront de préférence caractérisés en ce
qu'ils sont biologiquements actifs.
Par fragment biologiquement actif, on entendra désigner en particulier un fragment de séquence d'acides aminés de polypeptide EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3, ou de leurs polypeptides homologues ou variants présentant au moins une des activités desdits polypeptides comme notamment: - la capacité de moduler, notamment d'inhiber ou de favoriser, la différenciation, la prolifération et/ou la régénération de cellules de tissu osseux et/ou de ligament; et/ou - la capacité d'être reconnu par un anticorps spécifique d'un polypeptide EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3, ou d'un de leurs
polypeptides homologues ou variants.
Les polypeptides EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3, leurs polypeptidas homologues ou variants ou leurs fragments, recombinants pourront être obtenus à partir de méthodes bien connues de l'homme de l'art à l'aide de vecteurs de clonage et/ou d'expression contenant une séquence d'acide nucléique codant pour lesdits polypeptides et de cellules
hôtes transformées par lesdits vecteurs.
Les polypeptides recombinants obtenus peuvent aussi bien se présenter sous forme glycosylée que non glycosylée et peuvent présenter ou non la structure tertiaire
naturelle.
Ces polypeptides peuvent être produits à partir des séquences d'acide nucléique codant pour lesdits polypeptides selon les techniques de production de
polypeptides recombinants connues de l'homme du métier.
Dans ce cas, la séquence d'acide nucléique utilisée est placée sous le contrôle de signaux permettant son
expression dans un hôte cellulaire.
Un système efficace de production d'un polypeptide recombinant nécessite de disposer d'un vecteur, par exemple d'origine plasmidique ou virale, et d'une cellule hôte compatible. L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes, comme les bactéries, ou eucaryotes, comme par exemple les levures, cellules d'insectes ou de mammifères comme les cellules CHO (cellules d'ovaires de hamster chinois) ou les cellules murines ou tout autre système avantageusement disponible. Un hôte cellulaire préféré pour l'expression des protéines de l'invention est constitué par les cellules d'ovaire de hamster chinois CHO, et par les
cellules 3A-subE d'origine placentaire humaine.
Le vecteur doit comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que
des régions appropriées de régulation de la transcription.
Il doit pouvoir être maintenu de façon stable dans la cellule et peut éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite. Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences d'acide nucléique peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi,
ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi.
De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards, telles que par exemple la
lipofection, l'électroporation, le choc thermique.
Les cellules hôtes transformées par les vecteurs précédents peuvent être obtenues par l'introduction dans ces cellules d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée. Parmi les cellules hôtes utilisables à ces fins, on peut citer bien entendu les cellules bactériennes (Olins et Lee, 1993), mais également les cellules de levure (Buckholz, 1993), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifères (Edwards et Aruffo, 1993), et notamment les cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO), des cellules humaines telles que les cellules 3A-subE d'origine placentaire, mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre des baculovirus par exemple
(Luckow, 1993).
Les procédés de purification de polypeptide recombinant ou synthétique utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant ou synthétique peut être purifié à partir de méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoaffinité à l'aide d'anticorps mono ou
polyclonaux spécifiques.
Une variante préférée consiste à produire un polypeptide recombinant fusionné à une protéine "porteuse" (protéine conjuguée). L'avantage de ce système est qu'il permet une stabilisation et une diminution de la protéolyse du produit recombinant, une augmentation de la solubilité au cours de la renaturation in vitro et/ou une simplification de la purification lorsque le partenaire de
fusion possède une affinité pour un ligand spécifique.
Les polypeptides EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3, leurs polypeptides homologues ou variants ou leurs fragments
peuvent être également obtenus par synthèse chimique.
Les polypeptides obtenus par synthèse chimique
pourront comporter des acides aminés non naturels.
Parmi lesdits composés sélectionnés à titre de médicament, on peut citer en particulier les oligonucléotides antisens, c'est-à-dire dont la structure assure, par hybridation avec la séquence cible, une inhibition de l'expression du produit correspondant. Il faut également citer les oligonucléotides sens qui, par interaction avec des protéines impliquées dans la régulation de l'expression du gène INSL4, induiront soit
une inhibition, soit une activation de cette expression.
L'invention concerne des composés selon l'invention, destinés au traitement de pathologies liées à la différenciation et/ou la prolifération anormale du tissu osseux et/ou des cellules de ligaments, notamment de pathologies liées au développement anormal du cartilage et/ou à une ossification anormale de l'os en formation, en particulier destinés au traitement de l'ostéoporose et/ou
de dysplasie.
Parmi lesdites dysplasies, on préfère notamment les dysplasies diaphysaires comme l'hypoplasie diaphysaire ou ostéogénèse imparfaite et l'hyperplasie diaphysaire ou
maladie d'Engelmann.
L'invention a enfin pour objet des composés selon l'invention, destinés au traitement de pathologies impliquant à la régénération de tissu osseux et/ou de ligament, en particulier au traitement visant à réparer des lésions du tissu osseux et/ou de ligaments suite à un choc traumatique. Les composés de l'invention en tant que principes actifs de médicament, seront préférentiellement sous forme soluble, associés à un véhicule pharmaceutiquement
acceptable.
De préférence, ces composés seront administrés par voie systémique, en particulier par voie intraveineuse, par
voie intramusculaire, intradermique ou par voie orale.
Leurs modes d'administration, posologies et formes galéniques optimaux peuvent être déterminés selon les critères généralement pris en compte dans l'établissement d'un traitement adapté à un patient comme par exemple l'âge ou le poids corporel du patient, la gravité de son état général, la tolérance au traitement et les effets secondaires constatés, etc. On peut également pallier de façon générale la carence ou la surexpression de polypeptides selon l'invention par une thérapie dite "de remplacement" permettant l'amplification ou la diminution des activités desdits polypeptides. La thérapie de remplacement pourra être effectuée par thérapie génique, c'est-à- dire en introduisant les séquences d'acide nucléique selon l'invention et/ou les gènes correspondants avec les éléments qui permettent leur expression in vivo, dans le cas o l'un des gènes est insuffisamment exprimé par exemple, ou bien lorsqu'il est
exprimé sous une forme anormale.
Les principes de la thérapie génique sont connus. On peut utiliser des vecteurs viraux, par exemple sur la base des adénovirus (Perricaudet et al., 1992), des AAV, Adenovirus Associated Virus (Carter, 1993), des rétrovirus (Temin, 1986), des poxvirus ou des virus herpès (Epstein et al., 1992). La plupart du temps ces virus sont utilisés sous forme défective et, de façon générale, avec ou sans intégration dans le génome cellulaire. Il est également possible de prévoir des vecteurs non viraux, c;est-à-dire synthétiques, qui miment des séquences virales ou bien qui sont constitués par de l'ADN ou de l'ARN nu selon la
technique développée notamment par la société VICAL.
Dans la plupart des cas, il faudra prévoir des éléments de ciblage assurant une expression spécifique de façon à pouvoir limiter les zones d'expression des polypeptides. Il est même intéressant, dans certains cas, d'avoir des vecteurs d'expression transitoire ou au moins d'expression contrôlée que l'on pourra bloquer lorsque cela
sera nécessaire.
Les composés selon l'invention utilisables à titre de médicament offrent une nouvelle approche pour le traitement de maladies liées à la différenciation ou à la prolifération non régulée de cellules ou tissus osseux et/ou de ligaments ou à l'absence ou à l'insuffisance de certaines cellules de tissus osseux et/ou de ligaments,
suite par exemple à un traumatisme.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention
apparaissent dans la suite de la description avec les
exemples et les figures dont les légendes sont représentées ci-après. Légende des Figures Figure 1: Séquence d'acide nucléique de l'ADNc du gène INSL4 et séquence d'acides aminés du polypeptide EPIL
codé par cette séquence.
Figure 2: Comparaison de la distribution de 1'ARNm d'INSL4 et d'IGF-II dans le placenta humain âgé de 14 semaines; - observation sur fond clair (A) et sur fond noir (B) d'une même coupe de tissu hybridée avec une sonde INSL4 antisens; - agrandissement de la coupe précédente observée sur fond clair (C); - observation sur fond clair (D) et sur fond noir (E) d'une même coupe de tissu hybridée avec une sonde IGF-II antisens; agrandissement de la coupe précédente observée sur fond clair (F); s: syncytiotrophoblaste; c: cytotrophoblaste; m: mésenchyme; la barre d'échelle représente 295 Mm pour (A), (B), (D) et
(E), et représente 15 Mm pour (C) et (D).
Figure 3: Distribution cellulaire de l'ARNm d'IGF-II dans des embryons humains âgés de 25 jours (A et B), 30 jours (C, D, E et F) ou 45 jours (G et H) obtenue par hybridation in situ à l'aide d'une sonde oligonucléotidique
marquée au 35S.
Microphotographies sur fond clair (panel de gauche) et sur fond noir (panel de droite) d'une même coupe de tissu: - coupe axiale (A) et (B) au niveau du "rhombencéphale"; nt: tube neural; ov: vésicule otique; - coupe abdominale longitudinale (C) et (D); nt: tube neural; m: mésonéphron; coupe sagitale au niveau des arcs branchiaux (ba) (E) et (F); - coupe longitudinale du corps vertébral (vb) (G) et (H); la barre d'échelle représente 295 pm pour (A), (B), (C) et
(D), et représente 150 Mm pour tous les autres panels.
Figure 4: Hybridation in situ effectuée avec une sonde oligonucléotidique d'INSL4 sur un foetus humain âgé
de 8 semaines.
Microphotographies sur fond clair (panel de gauche) et fond noir (panel de droite) d'une même coupe de tissu: - coupe de la partie distale du fémur dans l'articulation développée de la hanche (A) et (B) au niveau du "rhombencéphale"; f: fémur; 1: ligament; - coupe longitudinale du rachis (C) et (D);
l'ARNm d'INSL4 est localisé dans les disques inter-
vertébraux, dans les ligaments intervertébraux; vb:corps vertébral; 1: ligament; - coupe transversale de côte (E) et (F); pc: périchondre; r: côte; la barre d'échelle représente 295 gm pour (A), (B), (C) et
(D), et représente 150 4m pour (E) et (F).
EXEMPLES
Matériels et méthodes A) Sujets expérimentaux Des embryons morphologiquement normaux âgés de trois à huit semaines (après ovulation) ont été obtenus après avortement légal par la mifepristone (RU 486) à l'Hôpital Broussais à Paris. Une complète indépendance a été respectée entre la direction médicale de l'hôpital et le groupe de recherche. Le consentement maternel n'a jamais été demandé avant que l'avortement ait été décidé et réalisé. Le consentement a été obtenu après explication de l'objectif de recherche et seulement après que l'avortement médical ait été effectué. Cette procédure est approuvée par le Comité Ethique de l'Hôpital des Enfants Malades de Necker (Paris). Les embryons ont été séparés du trophoblaste par dissection sous microscope. Le stade de développement de chacun des embryons a été estimé en utilisant la classification de Carnegie établie par O'Rahilly (R. O'Rahilly et al., 1987 et 1994). Les embryons microdisséqués ont été congelés et conservés à - 80 C. Des cryocoupes (12 im) ont été montés sur des lames prétraitées (lames Probon Plus, Microm France). Les coupes ont été fixées pendant 30 minutes dans une solution de para- formaldéhyde en tampon phosphate 0,1 M (pH 7,4), rincées une fois en PBS (tampon phosphate salin) et brièvement dans de l'eau, puis déshydratées avec une série de solution
d'éthanol à différentes concentrations (50 %, 75 %, 95 %).
Les coupes ont été ensuite séchées à l'air et conservées à
*- 80 C afin de préserver l'ARNm.
B) Sonde d'hybridation Des sondes oligonucléotidiques de 60-mer ont été synthétisées et purifiées (DNAgency, Malvern, PA). Elles ont été marquées en 3' avec [_-35S]dATP (NEN, Boston, MA) en utilisant une désoxyribonucléotidyle terminale transférase (Gibco BRL, Grand Island, NY) à une activité
spécifique d'environ 7 x 108 cpm/mg. Les sondes oligo-
nucléotidiques ont été purifiées sur colonnes Biospin (Bio-
Rad Laboratories, Hercules, CA) avant utilisation. La séquence de la sonde INSL4 antisens est la suivante:
'-CTGGGGTGGTGGTGAATGTCTTCTCAGGCATGGGGCAATATGACAGCAAGTGTTTT
CCAA-3', localisée sur l'exon 1. La séquence de la sonde IGF-II antisens est la suivante:
'-AGCCAATCGATTTTGTACATGTTTGAAGATGCTGCTGTGCTTCCTCAGCCCGATGG
AGGG-3', localisée sur l'exon 7 dans la région codante commune des ARNm de l'IGF-II. Des sondes sens ont été
utilisées comme témoin.
C) Hybridation in situ Le protocole expérimental (M. Abitbol et al., 1993, et M. Gerard et al., 1995) inclut une étape d'hybridation utilisant une solution contenant 50 % de formamide, 4 x SSC (solution standard de citrate salin), 1 x solution de Denhardt, 0,25 mg/ml d'ARNt de levure, 0,25 mg/ml de sperme de hareng, 0,25 mg/ml de poly-A, 10 % de sulfate dextran,
mM de dithiothreitol (DTT) et une sonde marquée [a-
S]dATP d'activité spécifique de 6 x 106 cpm/ml. 100 pl de la solution d'hybridation a été déposée sur chacune des coupes. Puis les sections ont été recouvertes avec un parafilm et incubées dans une chambre humide à 43 C pendant heures. Après hybridation, les lames ont été lavées deux fois dans 1 x SSC contenant 10 mM DTT pendant 15 minutes à , et deux fois dans une solution de 0,5 x SSC contenant 10 mM DTT pendant 15 minutes à température ambiante. Les coupes ont été ensuite plongées dans l'eau, déshydratées avec une série de solutions d'éthanol de différentes concentrations puis exposées pendant une semaine sur des films à rayon X Amersham Hyperfilm Betamax et dans une émulsion photographique Kodak NTB2 (Eastmman Kodak, Rochester, NY) pendant un à deux mois à 4 C. Les coupes ont
ensuite été développées et marquées avec du bleu toluidine.
Les résultats sont analysés par microscopie à contraste de phase. Exemple 1: Hybridation in situ de membranes placentaires et foetales
Afin de démontrer la spécificité des sondes oligo-
nucléotidiques, une analyse par Northern blot a été réalisée avec 12 Mg d'ARN total issus de tissus de trophoblaste. Les transcrits d'INSL4 ont été détectés à une taille de 0,7 kilobase (kb) avec à la fois les sondes oligonucléotidiques et une sonde d'ADNc, en accord avec la taille du transcrit d'INSL4 publié par Chassin et al. (1995). Pour le gène IGF-II un transcrit majeur de 6,0 kilobases et d'autres transcrits de 2 à 5 kilobases ont été détectés, confirmant les résultats de Han et al. (1988), qui a identifié des transcrits multiples d'IGF-II avec des tailles estimées de 1,8, 2,0, 2,8, 3,0, 4,0, 4,8 et 6, 2 kb, le dernier étant le plus abondant. Ces résultats montrent la spécificité des oligomers d'INSL4 et d'IGF-II qui ont
été choisis respectivement pour les ARNm d'INSL4 et d'IGF-
II humains. L'hybridation in situ effectuée avec des oligo-
nucléotides sens d'INSL4 et d'IGF-II génère seulement des grains diffus correspondant au bruit de fond, démontrant ainsi la spécificité de l'hybridation positive obtenue avecdes oligonucléotides antisens.
Un niveau faible d'expression du gène INSL4 a été détecté à partir de placenta précoce âgé de 25 jours et un niveau abondant d'ARNm d'INSL4 a été identifié à partir de placenta âgé de 14 semaines. Le gène INSL4 est exprimé dans les syncytiotrophoblastes et de manière moins abondante dans les cytotrophoblastes. Les cellules de la partie centrale du mésoderme villeux et les cellules de cordon ombilical expriment encore plus faiblement le gène INSL4 (figure 2). Aucun signal n'a été détecté ni dans l'amnion
ni dans le sac vitellin (résultats non représentés).
L'ARNm d'IGF-II a été exprimé en quantité abondante dans les colonnes de trophoblastes intermédiaires et dans le stroma villeux à 20 jours et 14 semaines de développement, mais n'est pas détectable dans les coupes de syncytiotrophoblastes (figure 2). Dans les membranes foetales (20 jours), d'abondantes quantités d'ARNm d'IGF-II ont été identifiées dans les cellules d'amnions et les cellules externes du sac vitellin (résultats non représentés). Ces résultats sont résumés dans le tableau I ci-après. TABLEAU I: Distribution de l'ARNm d'INSL4 et d'IGF-II dans le placenta et les membranes foetales humains Type de Cellules ARNm d'INSL4 ARNm d'IGF-II Placenta
Syncytiotrophoblastes ++++ Nég.
Cytotrophoblastes ++ ++ Stroma villeux ++++ Trophoblastes Intermédiaires + ++++ Membranes foetales Cellules de + Nd Cordon ombilical Amnion Nég. ++++ Sac vitellin Nég. ++++ Légende du Tableau 1: Nd: non déterminé; Nég.: signal d'hybridation négatif; +: signal d'hybridation faible; ++: signal d'hybridation modéré; +++: signal d'hybridation fort; ++++: signal d'hybridation très fort; les signaux sont
O10 observés après 6 semaines d'exposition.
Le gène INSL4 est exprimé de manière plus importante
dans les syncytiotrophoblastes que dans les cyto-
trophoblastes. Ces résultats sont confirmés par la technique RT-PCR (amplification par réaction en chaîne à la polymérase en utilisant la transcriptase inverse) effectuée sur l'ARN total de cellules de syncytiotrophoblaste et de cytotrophoblaste (D. Bellet et al. , 1997). L'ARNm d'IGF-II est, de manière significative, plus abondante que l'ARNm d'INSL4 dans les coupes adjacentes testées avec la sonde oligonucléotidique d'INSL4. L'expression du gène IGF-II dans le placenta d'embryon humain âgé de 25 à 40 jours et de 14 semaines est localisée dans les cellules de la partie centrale du mésoderme villeux et dans les cellules de cytotrophoblaste intermédiaire ou villeux. Les transcrits
d'IGF-II ne sont pas détectés dans la couche syncytio-
trophoblastique pour les étapes de développement étudiées.
Des observations similaires ont été reportées par exemple par V.K.M. Han (V.K.M. Han et al., 1996). Ainsi, il est probable que ces deux gènes jouent un rôle différent dans
le développement du trophoblaste.
Exemple 2: Hybridation in situ de tissus embryonnaires Aucune sonde oligonucléotidique marquée d'INSL4 n'a été détectée dans les tissus embryonnaires âgés de 20 ou 30 jours, suggérant que le gène INSL4 n'est pas exprimé à cette étape précoce ou que le niveau de transcrit est trop faible pour être détecté par hybridation in situ. Par opposition, le gène IGF-II a été fortement exprimé à cette étape embryonnaire précoce. L'expression du gène IGF-II a été mise en évidence dans plusieurs tissus dérivés du mésoderme et de l'endoderme (figure 3), résultats concordants avec ceux précédemment décrits (V. K.M. Han et al., 1987a et 1987b, J.E. Lee et al., 1990). Le site majeur de l'expression de l'IGF-II est localisé dans le foie pour
toutes les étapes étudiées.
Les coupes de tissus foetaux âgés de 8 semaines ont
été également hybridés en utilisant les sondes oligo-
nucléotidiques d'INSL4. De manière surprenante, l'ARNm d'INSL4 montre une distribution spatiale spécifique. En effet, la majorité des transcrits d'INSL4 sont localisés dans le périchondre des quatre membres, des côtes et des vertèbres. De plus, l'ARNm d'INSL4 est très abondant dans les ligaments interosseux (figure 4). Par opposition, aucun marquage n'a été détecté dans le foie, les poumons, le coeur, le thymus, l'estomac, le muscle ou les intestins à ce stade de développement. Le tableau II ci-après résume les résultats en accord avec les types de cellules
identifiées dans les coupes de tissus foetaux testés.
TABLEAU II: Distribution de l'ARNm d'INSL4 et d'IGF-II dans les tisssus embryonnaires (âgés de 25, 30 et 45 jours pour 1'IGF-II et de 8 semaines pour l'INSL4) Tissus Emribryonnaires ARNm d'INSL4 ARNm d'IGF-II Méninges Nég. ++ Proéminence mandibulaire Nég. ++ Arcs branchiaux Nég. ++ Thymus Nég. Nd Arcs aortiques Nég. + Coeur Nég. + Moelle osseuse Nég. Nd Poumon Nég + Foie Nég. +++ Estomac Nég. Nd Pancréas Nég. Nd Intestins Nég Nd Glandes surrénales Nég. ++ Métanéphros Nég. t+ Sclérotome Nég. + Périchondre ++ ++ Ligaments ++ Nd Muscles squelettiques Nég. ++
Epiderme Nég. Nég.
Légende du Tableau II: Nd: non déterminé; Nég.: signal d'hybridation négatif; +: signal d'hybridation faible; ++: signal d'hybridation modéré; +++: signal d'hybridation fort; ++++: signal d'hybridation très fort; les signaux sont
observés après 6 semaines d'exposition.
Les coupes de tissus embryonnaires hybridés avec les mêmes sondes oligonucléotidiques d'INSL4 et d'IGF-II montrent qu'au contraire des transcrits d'IGF-II, qui sont
localisés dans la plupart des tissus embryonnaires (V.R.K.
Han et al., 1987a et 1987b; J.E. Lee et al., 1990), le gène INSL4 est exprimé seulement dans quelques-uns de ces tissus. En effet, dans les coupes de tissu d'embryon humain âgé de 8 semaines, les transcrits d'INSL4 ne sont localisés que dans les cellules du périchondre et des ligaments. A ce stade de développement, la chondrification est commencée
pour tous les os des membres inférieurs.
Il est remarquable que le gène INSL4 soit un membre de la superfamille des gènes apparentés à l'insuline et que d'autres membres de cette famille codent pour des polypeptides régulateurs à la fois de la croissance et du développement dans de nombreux tissus. En particulier, les facteurs de croissance apparentés à l'insuline (IGFs) jouent un rôle important dans la régulation de la formation des os (B. Bhaumic et al., 1993; R. Malpe et al., 1997, et S. Mohan et al., 1991). Dans ce contexte, l'expression spécifique du gène INSL4 au cours du développement embryonnaire chez l'homme, à la fois sur le plan chronologique et sur le plan de sa distribution tissulaire hautement restrictive dans l'embryon, suggère fortement que ce gène est très certainement impliqué dans différents stades de développement de l'os en formation et des ligaments. Biblioqraphie * Abitbol M., et al., 1993, Nucleus basalis magnocellularis and hippocampus are the major sites of FMR-1 expression during human embryonic development, a preliminary report. C R Acad. Sci. Paris 318: 57-66.
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Claims (40)

REVENDICATIONS
1. Gène INSL4, caractérisé en ce qu'il est exprimé dans
des cellules foetales du tissu osseux et/ou de ligaments.
2. Polypeptide EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3 codé par le gène INSL4 selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est
exprimé dans des cellules foetales du tissu osseux.
3. Polypeptide selon la revendication 2, caractérisé en ce que les cellules foetales du tissu osseux sont des
cellules du périchondre.
4. Polypeptide EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3 codé par le gène INSL4 selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il est
exprimé dans des cellules foetales de ligaments.
5. Polypeptide selon l'une des revendications 2 à 4,
caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de différenciation de cellules du tissu osseux et/ou de ligaments.
6. Polypeptide selon l'une des revendications 2 à 4,
caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de prolifération de cellules du tissu osseux et/ou de ligaments.
7. Polypeptide selon l'une des revendications 2 à 4,
caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de régénération de cellules du tissu osseux et/ou de ligaments.
8. Polypeptide selon l'une des revendications 2 à 7,
caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus de
développement du cartilage de l'os en formation.
9. Polypeptide selon l'une des revendications 2 à 7,
caractérisé en ce qu'il est impliqué dans le processus
d'ossification de l'os en formation.
10. Utilisation d'un ou de plusieurs anticorps dirigés contre un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3 selon l'une
des revendications 2 à 9, ou l'un de leurs homologues ou
variants, ou contre l'un de leurs fragments, pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage d'un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3 ou l'un de leurs homologues ou variants, dans le tissu osseux et/ou
dans les ligaments.
11. Utilisation d'un ou de plusieurs anticorps dirigés contre un polypeptide EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3 selon l'une
des revendications 2 à 9, ou l'un de leurs homologues ou
variants, ou contre l'un de leurs fragments pour le diagnostic de pathologies liées à l'expression anormale de polypeptide EPIL 1, EPIL 2 et/ou EPIL 3 dans le tissu
osseux et/ou dans les ligaments.
12. Utilisation d'une sonde ou amorce oligonucléotidique, pour la détection, l'identification, la localisation, l'amplification, et/ou le dosage de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 selon la revendication 1 dans le tissu osseux et/ou dans les ligaments.
13. Utilisation d'une sonde ou amorce oligonucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 selon la revendication 1, pour le diagnostic de pathologies liées à l'expression anormale du gène INSL4 dans le tissu osseux
et/ou dans les ligaments.
14. Procédé de détection, d'identification, de localisation et/ou de dosage spécifique d'un polypeptide
EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3 selon l'une des revendications 2 à
9, ou l'un de leurs homologues ou variants, dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligaments, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale du ou desdits polypeptides dans le tissu osseux et/ou dans les ligaments, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) mise en contact dudit échantillon biologique avec un ou plusieurs anticorps dirigés contre le ou lesdits polypeptides ou contre l'un de leurs fragments; b) mise en évidence, identification, localisation et/ou
dosage du complexe antigène-anticorps formé.
15. Kit ou nécessaire pour la détection, l'identification, la localisation et/ou le dosage spécifique d'un polypeptide
EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3 selon l'une des revendications 2 à
9, ou l'un de leurs homologues ou variants, dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligaments, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale du ou desdits polypeptides dans ledit échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) un ou plusieurs anticorps dirigés contre le ou lesdits polypeptides, ou un de leurs fragments; b) le cas échéant, les réactifs pour la constitution du milieu propice à la réaction immunologique; c) le cas échéant, les réactifs permettant la détection,
l'identification et/ou le dosage des complexes antigène-
anticorps produits par la réaction immunologique.
16. Procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 selon la revendication 1, dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligaments, ou de diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de ladite séquence d'acide nucléique dans ledit échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: a) isolement de l'ADN à partir dudit échantillon biologique à analyser, ou obtention d'un ADNc à partir de l'ARN dudit échantillon biologique; b) amplification spécifique de ladite séquence d'acide nucléique à l'aide d'au moins une amorce capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 c) analyse qualitative et/ou quantitative des produits d'amplification.
17. Procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 selon la revendication 1, dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligaments, ou de diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de ladite séquence d'acide nucléique dans ledit échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 avec ledit échantillon biologique, l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique ayant, le cas échéant, préalablement été rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de ladite sonde à l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique; b) détection, identification et/ou dosage de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique et l'ADN
dudit échantillon biologique.
18. Procédé de détection, d'identification et/ou de dosage spécifique de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 selon la revendication 1, dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligaments, ou de diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de ladite séquence d'acide nucléique dans ledit échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes: a) mise en contact d'une sonde oligonucléotidique immobilisée sur un support et capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4, avec ledit échantillon biologique, l'ADN de l'échantillon, ayant, le cas échéant, été préalablement amplifié à l'aide d'au moins une amorce capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 et/ou rendu accessible à l'hybridation, dans des conditions permettant l'hybridation de ladite sonde à 1'ADN dudit échantillon biologique; b) mise en contact de l'hybride formé entre ladite sonde oligonucléotidique immobilisée sur un support et l'ADN contenu dans ledit échantillon biologique, le cas échéant après élimination de l'ADN dudit échantillon biologique n'ayant pas hybridé avec ladite sonde, avec une sonde oligonucléotidique, notamment marquée, et capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence
d'acide nucléique correspondant au gène INSL4.
19. Kit ou nécessaire pour la détection, l'identification et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 selon la revendication 1, dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligaments, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de ladite séquence d'acide nucléique dans ledit échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) une sonde oligonucléotidique capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la mise en oeuvre d'une réaction d'hybridation; c) le cas échéant, au moins une amorce capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de l'ADN.
20. Kit ou nécessaire pour la détection, l'identification et/ou le dosage spécifique de séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 selon la revendication 1, dans un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligaments, ou pour le diagnostic de pathologies liées à la présence anormale de ladite séquence d'acide nucléique dans ledit échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les éléments suivants: a) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de capture, pouvant être fournie préimmobilisée sur un support, et capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4; b) une sonde oligonucléotidique, dite sonde de révélation, notamment marquée, et capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4; c) le cas échéant, au moins une amorce capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 ainsi que les réactifs nécessaires à une réaction d'amplification de
1'ADN.
tE
21. Procédé ou kit selon l'une des revendications 14 à 20,
: 30 pour le diagnostic de pathologies liées à la différenciation et/ou la prolifération anormale du tissu
osseux et/ ou des cellules de ligaments.
22. Procédé ou kit selon la revendication 21, pour le diagnostic de pathologies liées au développement anormal du cartilage et/ou à une ossification anormale de l'os en formation.
23. Procédé ou kit selon l'une des revendications 14 à 20,
pour le diagnostic d'ostéoporose et/ou de dysplasie.
24. Méthode de marquage de cellule de tissu osseux et/ou de ligaments, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: a) mise en contact d'un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligaments avec un ou plusieurs anticorps dirigés contre le ou les polypeptides EPIL 1, EPIL 2
et/ou EPIL 3 selon l'une des revendications 2 à 9,
lesdits anticorps pouvant être marqués; b) le cas échéant, marquage desdits anticorps à l'aide de composés marqués capables de reconnaître lesdits anticorps.
25. Méthode de marquage de cellule de tissu osseux et/ou de ligaments, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes: a) mise en contact d'un échantillon biologique de tissu osseux et/ou de ligaments avec une ou plusieurs sondes oligonucléotidiques capables de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4 selon la revendication 1, lesdites sondes pouvant être marquées; b) le cas échéant, marquage desdites sondes à l'aide de composés marqués capables de reconnaître lesdites sondes.
26. Méthode de marquage de cellule selon l'une des
revendications 24 et 25, caractérisée en ce que la cellule
de tissu osseux et/ou de ligaments est une cellule foetale.
27. Procédé de détection de cellule anormale de tissu osseux et/ou de ligaments, caractérisé en ce qu'il met en
oeuvre une méthode selon l'une des revendications 24 à 26.
28. Méthode de sélection de composé chimique ou biochimique capable de moduler la différenciation, la régénération et/ou la prolifération de cellules humaines et/ou animales de tissu osseux et/ou de ligaments, caractérisée en ce qu'elle met en oeuvre un polypeptide
EPIL 1, EPIL 2, EPIL 3 selon l'une des revendications 2 à
9, un de leurs polypeptides homologues ou variants, ou un de leurs fragments, une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4, ou une cellule de tissu osseux
I( ou de ligaments, notamment foetale.
29. Méthode de sélection selon la revendication 28, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable d'inhiber la différenciation, la régénération et/ou la prolifération de cellules humaines et/ou animales de
tissu osseux et/ou de ligaments.
30. Méthode de sélection selon la revendication 28, caractérisée en ce que ledit composé sélectionné est capable de favoriser la différenciation, la régénération et/ou la prolifération de cellules humaines et/ou animales
de tissu osseux et/ou de ligaments.
31. Méthode de sélection selon l'une des revendications 28
à 30, caractérisée en ce que lesdites cellules sont des
cellules foetales.
32. Méthode de sélection selon la revendication 31, caractérisée en ce que les cellules foetales sont des
cellules du périchondre.
33. Composé chimique ou biochimique, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être sélectionné par une méthode
selon l'une des revendications 28 à 32.
34. Composé selon la revendication 33, à titre de médicament.
35. Composé selon l'une des revendications 33 et 34,
caractérisé en ce qu'il est choisi parmi: a) un polypeptide EPIL 1, EPIL 2 ou EPIL 3, un de leurs polypeptides homologues ou variants ou un de leurs fragments, pouvant être obtenu par recombinaison génétique ou par synthèse chimique; b) un anticorps dirigé contre un polypeptide tel que défini en a); c) un composé chimique ou biochimique, caractérisé en ce I0 qu'il est un ligand d'un polypeptide tel que défini en a); d) un vecteur comprenant tout ou partie d'une séquence d'acide nucléique correspondant au gène INSL4; e) un vecteur tel que défini en d), présentant à sa surface un marqueur spécifique de cellule de tissu osseux ou de ligaments cible dont on cherche à moduler l'activité; f) une séquence d'acide nucléique sens ou antisens capable de s'hybrider spécifiquement avec une séquence d'acide
nucléique correspondant au gène INSL4.
36. Composé selon l'une des revendications 34 à 35,
destiné au traitement de pathologies liées à la différenciation et/ou la prolifération anormale du tissu
osseux et/ou des cellules de ligaments.
37. Composé selon la revendication 36, destiné au traitement de pathologies liées au développement anormal du cartilage et/ou à une ossification anormale de l'os en formation.
38. Composé selon l'une des revendications 34 à 35,
destiné au traitement d'ostéoporose ou de dysplasie.
39. Composé selon l'une des revendications 34 à 35,
destiné au traitement de pathologies impliquant à la
régénération de tissu osseux et/ou de ligaments.
40. Composé selon la revendication 39, caractérisé en ce que ledit traitement vise à réparer des lésions du tissu
osseux et/ou de ligaments suite à un choc traumatique.
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