EP1409675A1 - Gene implique dans la regulation de l'apoptose - Google Patents

Gene implique dans la regulation de l'apoptose

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EP1409675A1
EP1409675A1 EP01995795A EP01995795A EP1409675A1 EP 1409675 A1 EP1409675 A1 EP 1409675A1 EP 01995795 A EP01995795 A EP 01995795A EP 01995795 A EP01995795 A EP 01995795A EP 1409675 A1 EP1409675 A1 EP 1409675A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
polypeptide
sequence
tsip4
nucleic acid
apoptosis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01995795A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Robert Amson
Adam Telerman
Brent Passer
Jean-Pierre Roperch
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Molecular Engines Laboratories
Original Assignee
Molecular Engines Laboratories
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Filing date
Publication date
Application filed by Molecular Engines Laboratories filed Critical Molecular Engines Laboratories
Publication of EP1409675A1 publication Critical patent/EP1409675A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4747—Apoptosis related proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid sequence involved in the regulation of apoptosis and tumor reversion of the p53 pathway, as well as the protein encoded by this nucleic acid sequence.
  • Apoptosis, or cell death, is a complex phenomenon that is regulated by many proteins, including the p53 protein. This protein interacts with many other proteins, and its expression, which induces the phenomena of cell death and tumor reversion, can be correlated with the induction or repression of the expression of other cellular genes.
  • TSAP Tumor Suppressor Activated Pathway
  • TSIP Tumor Suppressor Inhibited Pathway
  • PSI presenilin 1
  • TSIP 2 presenilin 1, PSI
  • SEQ ID No. 2 This protein (SEQ ID No. 2) has thus been called TSIP4, and it is an object of the present invention, as well as the nucleic sequences which code for said protein.
  • the TSIP4 gene will in particular be preferred, it being understood that by gene, it may be understood either the cDNA sequence or the genomic DNA sequence, with or without the regulatory elements.
  • the subject of the present invention is a purified or isolated nucleic acid, characterized in that it comprises a nucleic sequence chosen from the following group of sequences: a) SEQ ID N 0 1; b) the sequence of a fragment of at least 15 consecutive nucleotides of a sequence chosen from SEQ ID No. 1; c) a nucleic sequence having an identity percentage of at least 80%, after optimal alignment with a sequence defined in a) or b); d) a nucleic sequence hybridizing under conditions of high stringency with a nucleic sequence defined in a) or b); e) the complementary sequence or the TARN sequence corresponding to a sequence as defined in a), b), c) or d).
  • a nucleic sequence chosen from the following group of sequences: a) SEQ ID N 0 1; b) the sequence of a fragment of at least 15 consecutive nucleotides of a sequence chosen from SEQ ID No. 1; c) a nucleic sequence having an
  • the nucleic acid sequence according to the invention defined in c) has a percentage identity of at least 80% after optimal alignment with a sequence as defined in a) or b) above, preferably 90%, more preferably 95%, most preferably 98%, or 99%.
  • nucleic acid nucleic or nucleic acid sequence, polynucleotide, oligonucleotide, polynucleotide sequence, nucleotide sequence, terms which will be used interchangeably in the present description, is intended to denote a precise sequence of nucleotides, modified or not, making it possible to define a fragment or region of a nucleic acid, which may or may not contain unnatural nucleotides, and which may correspond to both double-stranded DNA, single-stranded DNA and transcripts of said DNAs.
  • the nucleic acid sequences according to the invention also include PNA (Peptid Nucleic Acid), or the like.
  • nucleotide sequences in their natural chromosomal environment that is to say in the natural state. These are sequences which have been isolated and / or purified, that is to say that they have been taken directly or indirectly, for example by copy, their environment having been at least partially modified. This also means the nucleic acids obtained by chemical synthesis.
  • percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences within the meaning of the present invention is meant a percentage of identical nucleotides or amino acid residues between the two sequences to be compared, obtained after the best alignment, this percentage being purely statistical and the differences between the two sequences being distributed randomly and over their entire length.
  • the term “best alignment” or “optimal alignment” is intended to denote the alignment for which the percentage of identity determined as below is the highest. Sequence comparisons between two nucleic acid or amino acid sequences are traditionally carried out by comparing these sequences after having optimally aligned them, said comparison being carried out by segment or by "comparison window" to identify and compare the regions. sequence similarity locale.
  • the optimal alignment of the sequences for comparison can be achieved, besides manually, by means of the local homology algorithm of Smith and Waterman (1981), by means of the local homology algorithm of Neddleman and Wunsch (1970 ), using the similarity search method of Pearson and Lipman (1988), using computer software using these algorithms (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI).
  • the BLAST program is preferably used with the BLOSUM 62 matrix.
  • the PAM or PAM250 matrices can also be used.
  • the percentage of identity between two nucleic acid or amino acid sequences is determined by comparing these two optimally aligned sequences, the nucleic acid or amino acid sequence to be compared can include additions or deletions by compared to the reference sequence for optimal alignment between these two sequences.
  • the percentage of identity is calculated by determining the number of identical positions for which the nucleotide or the amino acid residue is identical between the two sequences, by dividing this number of identical positions by the total number of positions compared and by multiplying the result obtained by 100 to obtain the percentage of identity between these two sequences.
  • nucleic acid sequences having a percentage identity of at least 80%, preferably 90%, more preferably 98%, after optimal alignment with a reference sequence is meant the nucleic acid sequences having, with respect to the sequence reference nucleic acid, certain modifications such as in particular a deletion, a truncation, an elongation, a chimeric fusion, and / or a substitution, in particular point, and whose nucleic sequence has at least 80%, preferably 90%, more preferred 98%, of identity after optimal alignment with the reference nucleic sequence. They are preferably sequences whose complementary sequences are capable of hybridizing specifically with the sequences SEQ ID No. 1 of the invention.
  • the specific hybridization conditions or high stringency will be such that they ensure at least 80%, preferably 90%, more preferably 98% identity after optimal alignment between one of the two sequences and the sequence complementary to each other.
  • Hybridization under conditions of high stringency means that the conditions of temperature and ionic strength are chosen in such a way that they allow hybridization to be maintained between two complementary DNA fragments.
  • high stringency conditions of the hybridization step for the purpose of defining the polynucleotide fragments described above are advantageously as follows.
  • DNA-DNA or DNA-RNA hybridization is carried out in two stages: (1) prehybridization at 42 ° C for 3 hours in phosphate buffer (20 mM, pH 7.5) containing 5 x SSC (1 x SSC corresponds to a 0.15 M NaCl + 0.015 M sodium citrate solution), 50% formamide, 7% sodium dodecyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5% dextran sulfate and 1% salmon sperm DNA; (2) actual hybridization for 20 hours at a temperature depending on the size of the probe (ie: 42 ° C, for a probe of size> 100 nucleotides) followed by 2 washes of 20 minutes at 20 ° C in 2 x SSC + 2% SDS, 1 wash for 20 minutes at 20 ° C in 0.1 x SSC + 0.1% SDS.
  • the last washing is carried out in 0.1 ⁇ SSC + 0.1% SDS for 30 minutes at 60 ° C. for a probe of size> 100 nucleotides.
  • the high stringency hybridization conditions described above for a polynucleotide of defined size can be adapted by a person skilled in the art for larger or smaller oligonucleotides, according to the teaching of Sambrook et al., 1989.
  • nucleic sequences variant of SEQ ID are also preferred.
  • N ° 1, or its fragments that is to say all of the nucleic sequences corresponding to allelic variants, that is to say individual variations of the sequence SEQ ID N ° 1.
  • These mutated sequences natural correspond to polymorphisms present in mammals, in particular in humans and, in particular, to polymorphisms which can lead to the onset of a pathology, such as for example cell degeneration.
  • the present invention relates to the variant nucleic acid sequences in which the mutations lead to a modification of the amino acid sequence of the polypeptide, or of its fragments, encoded by the normal sequence of SEQ ID No. 1.
  • the invention preferably relates to a purified or isolated nucleic acid according to the present invention, characterized in that it comprises or consists of the sequence SEQ ID TST ° 1, its complementary sequence or the sequence of the RNA corresponding to SEQ ID N ° 1.
  • the invention also relates to a purified or isolated nucleic acid characterized in that it codes for a polypeptide having a continuous fragment of at least 100, more preferably 150, most preferably 200 amino acids of the protein SEQ ID # 2.
  • the primers or probes characterized in that they comprise a sequence of a nucleic acid according to the invention, also form part of the invention.
  • the present invention also relates to the primers or the probes according to the invention which can make it possible in particular to demonstrate or discriminate the variant nucleic sequences, or to identify the genomic sequence of the genes whose cDNA is represented by SEQ ID # 1, using in particular an amplification method such as the PCR method, or a related method.
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid sequence according to the invention as probe or primer, for the detection, identification, assay or amplification of nucleic acid sequence.
  • the polynucleotides which can be used as a probe or as a primer in methods of detection, identification, assay or amplification of nucleic sequence have a minimum size of 15 bases, preferably 20 bases, or better from 25 to 30 bases.
  • the probes and primers according to the invention can be labeled directly or indirectly with a radioactive or non-radioactive compound by methods well known to those skilled in the art, in order to obtain a detectable and / or quantifiable signal.
  • the unlabeled polynucleotide sequences according to the invention can be used directly as a probe or primer.
  • Non-radioactive entities are selected from ligands such as biotin, avidin, streptavidin, dioxygenin, haptens , dyes, luminescent agents such as radioluminescent, chemoluminescent, bioluminescent, fluorescent, phosphorescent agents.
  • the polynucleotides according to the invention can thus be used as a primer and / or probe in methods using in particular the PCR technique (polymerase chain reaction) (Rolfs et al., 1991).
  • This technique requires the choice of pairs of oligonucleotide primers framing the fragment which must be amplified.
  • the amplified fragments can be identified, for example after agarose or polyacrylamide gel electrophoresis, or after a chromatographic technique such as gel filtration or ion exchange chromatography, and then sequenced.
  • the specificity of the amplification can be controlled using as primers the nucleotide sequences of polynucleotides of the invention and as matrices, plasmids obtaining these sequences or even the amplification products derived therefrom.
  • the amplified nucleotide fragments can be used as reagents in hybridization reactions in order to demonstrate the presence, in a biological sample, of a target nucleic acid of sequence complementary to that of said amplified nucleotide fragments.
  • the invention also relates to the nucleic acids capable of being obtained, by amplification using primers according to the invention.
  • Other techniques for amplifying the target nucleic acid can advantageously be used as an alternative to PCR (PCR-like) using pairs of primers of nucleotide sequences according to the invention.
  • PCR-like is meant to denote all the methods implementing direct or indirect reproductions of the nucleic acid sequences, or in which the labeling systems have been amplified, these techniques are of course known. In general it is the amplification of DNA by a polymerase; when the original sample is an RNA, a reverse transcription should be carried out beforehand.
  • the target polynucleotide to be detected is an mRNA
  • the cDNA obtained will then serve as a target for the primers or probes used in the amplification or detection method according to the invention.
  • the probe hybridization technique can be performed in various ways (Matthews et al., 1988). The most general method consists in immobilizing the nucleic acid extracted from cells of different tissues or cells in culture on a support (such as nitrocellulose, nylon, polystyrene) and incubating, under well defined conditions, the target nucleic acid immobilized with the probe. After hybridization, the excess probe is eliminated and the hybrid molecules formed are detected by the appropriate method (measurement of radioactivity, fluorescence or enzymatic activity linked to the probe).
  • the latter can be used as capture probes.
  • a probe called a “capture probe”
  • a probe is immobilized on a support and is used to capture by specific hybridization the target nucleic acid obtained from the biological sample to be tested and the target nucleic acid is then detected.
  • a second probe called a “detection probe”, marked by an easily detectable element.
  • the antisense oligonucleotides that is to say those whose structure ensures, by hybridization with the target sequence, an inhibition of the expression of the corresponding product.
  • Such oligonucleotides can be used as therapeutic products and medicaments to regulate the phenomena of apoptosis and tumor repression.
  • the use of its sense or antisense sequences can also be implemented in vitro, to define new means of model and study of apoptosis.
  • the present invention also relates to an isolated polypeptide characterized in that it comprises a polypeptide chosen from: a) a polypeptide of sequence SEQ ID No. 2; b) a polypeptide varying from a polypeptide of sequence defined in a); c) a polypeptide homologous to a polypeptide defined in a) or b), comprising at least 80% identity with said polypeptide of a); d) a fragment of at least 15 consecutive amino acids of a polypeptide defined in a), b) or c); e) a biologically active fragment of a polypeptide defined in a), b) or c).
  • polypeptide is meant, within the meaning of the present invention, denote proteins or peptides.
  • biologically active fragment is meant a fragment having the same biological activity as the peptide fragment from which it is deduced, preferably in the same order of magnitude (to within a factor of 10).
  • the examples show that the protein TSIP4 (SEQ ID No. 2) has a potential role in the phenomena of apoptosis.
  • a biologically active fragment of the TSIP4 protein therefore consists of a polypeptide derived from SEQ ID No. 2 also having a role in apoptosis.
  • a polypeptide according to the invention is a polypeptide consisting of the sequence SEQ ID No. 2 (corresponding to the protein encoded by the TSIP4 gene) or of a sequence having at least 80% identity with SEQ ID No. 2 after optimal alignment.
  • the polypeptide sequence has a percentage identity of at least 80% after optimal alignment with the sequences SEQ ID No. 2, preferably 90 or 95%, more preferably 98%, or 99%.
  • polypeptide whose amino acid sequence having a percentage identity of at least 80%, preferably 90%, more preferably 98%, after optimal alignment with a reference sequence, is intended to denote the polypeptides having certain modifications with respect to the reference polypeptide, such as in particular one or more deletions, truncations, an elongation, a chimeric fusion, and / or one or more substitutions.
  • the variant polypeptides encoded by the variant nucleic sequences as defined above are preferred, in particular the polypeptides whose sequence of amino acids has at least one mutation corresponding in particular to a truncation, deletion, substitution and / or addition of at least one amino acid residue with respect to the sequence SEQ DD N ° 2 or with one of its fragments , more preferably variant polypeptides having a mutation linked to a pathology, such as cancer or a neurodegenerative disease.
  • the present invention also relates to the cloning and / or expression vectors comprising a nucleic acid or coding for a polypeptide according to the invention.
  • a vector can also contain the elements necessary for the expression and optionally for the secretion of the polypeptide in a host cell.
  • a host cell is also an object of the invention.
  • Said vectors preferably comprise a promoter, translation initiation and termination signals, as well as suitable regions for regulating transcription. They must be able to be maintained stably in the cell and may possibly have specific signals specifying the secretion of the translated protein.
  • control signals are chosen according to the cellular host used.
  • the nucleic acid sequences according to the invention can be inserted into vectors with autonomous replication within the chosen host, or vectors integrative of the chosen host.
  • plasmid or viral type systems are preferably used depending on the host cell, the viral vectors possibly being in particular adenoviruses (Perricaudet et al., 1992), retroviruses, lentiviruses, poxvirus or herpesvirus (Epstein et al., 1992).
  • adenoviruses Perricaudet et al., 1992
  • retroviruses retroviruses
  • lentiviruses lentiviruses
  • poxvirus or herpesvirus Epstein et al., 1992.
  • herpesvirus Epstein et al., 1992.
  • viruses are, for example, retroviruses (Temin, 1986), or AANs (Carter, 1993).
  • naked polynucleotides such as naked AD ⁇ or naked ⁇ AR ⁇ are preferred according to the technique developed by the company NICAL, artificial bacteria chromosomes (BAC, bacterial artificial chromosome), artificial yeast chromosomes (YAC, yeast artificial chromosome) for expression in yeast, mouse artificial chromosomes (MAC) for expression in murine cells and preferably human artificial chromosomes (HAC, human artificial chromosome) for expression in human cells.
  • BAC bacteria chromosome
  • YAC yeast artificial chromosome
  • MAC mouse artificial chromosomes
  • HAC human artificial chromosome
  • Such vectors are prepared according to the methods commonly used by those skilled in the art, and the resulting clones can be introduced into an appropriate host by standard methods, such as for example lipofection, electroporation, heat shock, transformation after chemical permeabilization of the membrane, cell fusion.
  • the invention furthermore includes host cells, in particular eukaryotic and prokaryotic cells, transformed by the vectors according to the invention as well as transgenic animals, preferably mammals, except humans, comprising one of said cells transformed according to the invention. .
  • transgenic animals preferably mammals, except humans, comprising one of said cells transformed according to the invention.
  • These animals can be used as models, for the study of the etiology of inflammatory and / or immune diseases, and in particular of inflammatory diseases of the digestive tract, or for the study of cancers.
  • bacterial cells Olins and Lee, 1993
  • yeast cells Buckholz, 1993
  • animal cells in particular cell cultures.
  • mammals Edwards and Aruffo, 1993
  • Chinese hamster ovary (CHO) cells in particular Chinese hamster ovary
  • a preferred cellular host for the expression of the proteins of the invention consists of COS cells.
  • animals such as rodents, in particular mice, rats or rabbits, which express a polypeptide according to the invention, are preferred.
  • animals such as mice, rats or rabbits are also preferred, characterized in that the gene coding for the protein with sequence SEQ ID No. 2, or whose sequence is coded by homologous gene in these animals, is not functional, is invalidated or has at least one mutation.
  • transgenic animals are obtained for example by homologous recombination on embryonic stem cells, transfer of these stem cells to embryos, selection of the affected chimeras at the level of the reproductive lines, and growth of said chimeras.
  • transgenic animals according to the invention can thus overexpress the gene coding for the protein according to the invention, or their homologous gene, or express said gene into which a mutation is introduced.
  • transgenic animals in particular mice, are obtained for example by transfection of a copy of this gene under the control of a strong promoter of ubiquitous nature, or selective for a type of tissue, or after viral transcription.
  • transgenic animals according to the invention can be made deficient for the gene coding for the polypeptide of the sequence SEQ ID NO: 1
  • the cells and mammals according to the invention can be used in a method for producing a polypeptide according to the invention, as described below, and can also be used as an analysis model.
  • the transformed cells or mammals as described above can also be used as models in order to study the interactions between the polypeptides according to the invention, and the chemical or protein compounds, involved directly or indirectly in the activities of the polypeptides according to the invention, this in order to study the different mechanisms and interactions involved.
  • polypeptides according to the invention can in particular be used for the selection of products interacting with the polypeptides according to the invention, in particular the protein of sequence SEQ DN No. 2 or its variants according to the invention, as cofactor, or inhibitor, in particular competitive, or else having an agonist or antagonist activity of the activity of the polypeptides according to the invention.
  • said transformed cells or transgenic animals are used as a model, in particular for the selection of products making it possible to combat pathologies linked to an abnormal expression of this gene.
  • the invention also relates to the use of a cell, a mammal or a polypeptide according to the invention for the screening of chemical or biochemical compounds. capable of interacting directly or indirectly with the polypeptides according to the invention, and / or capable of modulating the expression or the activity of these polypeptides.
  • the invention also relates to a method for screening for compounds capable of interacting in vitro or in vivo with a nucleic acid according to the invention, using a nucleic acid, a cell or a mammal according to the invention, and by detecting the formation of a complex between the candidate compounds and the nucleic acid according to the invention.
  • Such a compound according to the invention can be a compound having a chemical structure, a lipid, a sugar, a protein, a peptide, a hybrid protein-lipid compound, protein-sugar, peptide-lipid, or peptide-sugar, a protein. or a peptide to which chemical ramifications have been added.
  • the invention also relates to the use of a nucleic acid sequence according to the invention for the synthesis of recombinant polypeptides.
  • the method for producing a polypeptide of the invention in recombinant form, itself included in the present invention is characterized in that the transformed cells, in particular the cells or mammals of the present invention, are cultivated in conditions allowing the expression of a recombinant polypeptide encoded by a nucleic acid sequence according to the invention, and that said recombinant polypeptide is recovered.
  • Recombinant polypeptides characterized in that they are capable of being obtained by said production method, also form part of the invention.
  • the recombinant polypeptides obtained as indicated above can be both in glycosylated and non-glycosylated form and may or may not have the natural tertiary structure.
  • sequences of the recombinant polypeptides can also be modified in order to improve their solubility, in particular in aqueous solvents.
  • polypeptides can be produced from the nucleic acid sequences defined above, according to the techniques for producing recombinant polypeptides known to those skilled in the art.
  • the nucleic acid sequence used is placed under the control of signals allowing its expression in a cellular host.
  • An efficient system for producing a recombinant polypeptide requires having a vector and a host cell according to the invention.
  • These cells can be obtained by introducing into host cells a nucleotide sequence inserted into a vector as defined above, then culturing said cells under conditions allowing replication and / or expression of the transfected nucleotide sequence.
  • the methods used for the purification of a recombinant polypeptide are known to those skilled in the art.
  • the recombinant polypeptide can be purified from lysates and cell extracts, from the culture medium supernatant, by methods used individually or in combination, such as fractionation, chromatography methods, immunoafinity techniques using '' specific monoclonal or polyclonal antibodies, etc.
  • polypeptides according to the present invention can also be obtained by chemical synthesis using one of the many known peptide syntheses, for example the techniques using solid phases (see in particular
  • polyclonal antibodies can be obtained from a serum of an animal immunized against the polypeptides according to the invention, in particular produced by genetic recombination or by peptide synthesis, according to the usual procedures.
  • Mono- or polyclonal antibodies or their fragments, chimeric or immunoconjugate antibodies, characterized in that they are capable of specifically recognizing the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 are particularly preferred.
  • the specific monoclonal antibodies can be obtained according to the conventional method of culture of hybridomas described by Kôhler and Milstein (1975).
  • the antibodies according to the invention are, for example, chimeric antibodies, humanized antibodies, Fab or F (ab ') 2 fragments. They can also be in the form of immunoconjugates or labeled antibodies in order to obtain a detectable and / or quantifiable signal.
  • the invention also relates to methods for the detection and / or purification of a polypeptide according to the invention, characterized in that they use an antibody according to the invention.
  • the invention further comprises purified polypeptides, characterized in that they are obtained by a method according to the invention.
  • the antibodies of the invention in particular the monoclonal antibodies, can also be used for the detection of these polypeptides in a biological sample.
  • polypeptides according to the invention, in particular the polypeptide of sequence SEQ ID No. 2 or one of its variants, on sections of specific tissues, for example by immunofluorescence, gold labeling, enzyme immunoconjugates.
  • the antibodies of the invention can be advantageously used in any situation where the expression of a polypeptide according to the invention, normal or mutated, must be observed.
  • a method of detecting a polypeptide according to the invention in a biological sample comprising the steps of bringing the biological sample into contact with an antibody according to the invention and of demonstrating the antigen-antibody complex formed is also an object of the invention, as well as a kit for implementing such a method.
  • a kit contains in particular: a) a monoclonal or polyclonal antibody according to the invention; b) optionally reagents for the constitution of a medium suitable for the immunological reaction; c) reagents for the detection of the antigen-antibody complex produced during the immunological reaction.
  • the antibodies according to the invention can also be used in the treatment of a neurodegenerative disease, or of cancer, in humans, when an abnormal expression of the TSIP4, PSI, p53 or a gene is observed. gene described by the inventors of the present application, in application WO 97/22695 or WO 00/08147.
  • Abnormal expression means over-expression, under-expression or expression of a mutated protein.
  • antibodies can be obtained directly from human serum, or from animals immunized with polypeptides according to the invention, then “humanized”, and can be used as such or in the preparation of a medicament intended for the treatment of aforementioned diseases.
  • methods for determining an allelic variability, a mutation, a deletion, a loss of heterozygosity or any genetic anomaly of the gene according to the invention characterized in that they use a nucleic acid sequence, a polypeptide or an antibody according to the invention.
  • Mutations in the sequence of the TSIP4 gene repressed during apoptosis induced by p53 can be detected directly by analysis of the nucleic acid and of the sequences according to the invention (genomic DNA, RNA or cDNA), but also by l intermediary of the polypeptides according to the invention.
  • the use of an antibody according to the invention which recognizes an epitope carrying a mutation makes it possible to discriminate between a "healthy" protein and a protein "associated with a pathology".
  • the precise description of the mutations observable in the TSIP4 gene can thus make it possible to lay the foundations for a molecular diagnosis of neurodegenerative diseases and cancers, or any disease involving apoptosis.
  • the invention lays the foundations for such a molecular diagnosis based on the search for mutations in TSIP4.
  • a method of diagnosis and / or prognostic evaluation of a neurodegenerative disease or of a cancer is preferred, characterized in that the presence of at least one mutation and / or alteration of expression of the gene corresponding to SEQ ID No. 1 by the analysis of all or part of a nucleic sequence corresponding to said gene.
  • This method of diagnosis and / or prognostic evaluation can be used preventively (study of a predisposition to a neurodegenerative disease or cancer), or in order to serve for the establishment and / or confirmation of a clinical condition in a patient.
  • the neurodegenerative disease is Alzheimer's disease.
  • the analysis can be carried out by sequence of all or part of the gene, or by other methods known to those skilled in the art.
  • methods based on PCR can be used, for example PCR-SSCP which makes it possible to detect point mutations.
  • a DNA chip containing a sequence according to the invention is also one of the objects of the invention.
  • a protein chip containing an amino acid sequence according to the invention is also an object of the invention.
  • a protein chip allows the study of interactions between the polypeptides according to the invention and other proteins or chemical compounds, and can thus be useful for the screening of compounds interacting with the polypeptides according to the invention. It is also possible to use the protein chips according to the invention to detect the presence of antibodies directed against the polypetides according to the invention in the serum of patients. It is also possible to use a protein chip containing an antibody according to the invention.
  • the invention also relates to methods for obtaining an allele of the TSIP4 gene, associated with a detectable phenotype, comprising the following steps: a) obtaining a nucleic acid sample from an individual expressing said detectable phenotype; b) bringing said nucleic acid sample into contact with an agent capable of specifically detecting a nucleic acid coding for the TSIP4 protein; c) isolating said nucleic acid coding for the TSIP4 protein.
  • Such a method can be followed by a sequence step of all or part of the nucleic acid coding for the protein TSIP4, which makes it possible to predict the susceptibility to a neurodegenerative disease or to cancer.
  • the agent capable of specifically detecting a nucleic acid coding for the TSIP4 protein is advantageously an oligonucleotide probe according to the invention, which can be formed from DNA, RNA, PNA, modified or not.
  • the modifications may include radioactive or fluorescent labeling, or be due to modifications in the bonds between the bases (phosphorothioates, or methylphosphonates for example).
  • Those skilled in the art know the protocols for isolating a specific DNA sequence.
  • Step b) of the above process above described can also be an amplification step as described above.
  • the invention also relates to a method for detecting and / or assaying a nucleic acid according to the invention in a biological sample, comprising the following steps of bringing a probe according to the invention into contact with a biological sample and detecting and / or assaying the hybrid formed between said polynucleotide and the nucleic acid of the biological sample.
  • a reagent kit comprising: a) a polynucleotide according to the invention, used as a probe; b) the reagents necessary for the implementation of a hybridization reaction between said probe and the nucleic acid of the biological sample; c) the reagents necessary for the detection and / or the assay of the hybrid formed between said probe and the nucleic acid of the biological sample; which is also an object of the invention.
  • kit can also contain positive or negative controls to ensure the quality of the results obtained.
  • positive or negative controls to ensure the quality of the results obtained.
  • those skilled in the art can also carry out an amplification step using primers chosen from the sequences according to the invention.
  • the invention also relates to the compounds chosen from a nucleic acid, a polypeptide, a vector, a cell, or an antibody according to the invention, or the compounds obtained by the screening methods according to the invention, as a medicament.
  • a neurodegenerative disease or of cancer associated with the presence of at least one mutation of the gene corresponding to SEQ ID No. 1, and / or with an expression abnormal protein corresponding to SEQ ID NO: 2.
  • the present invention also relates to methods of screening and identifying products which may interfere in the p53 cascade, and thus induce tumor reversion and / or apoptosis or conversely, reduce the phenomena of apoptosis.
  • This aspect of the present invention is based on the fact that the TSIP4 protein, object of the present application, binds to the TSIP2 protein described in patent application WO 97/22695, whose role in Alzheimer's disease has been reported.
  • the invention is directed to a method of screening, selection or identification of a compound interfering with, reducing or inhibiting the binding of TSIP4 to TSIP2, having the steps of: a) bringing said compound into contact with a system allowing the in vitro determination of the link between TSIP4 and TSIP2; b) identification of the decrease and / or inhibition of the link between TSIP4 and TSIP2.
  • a subject of the present invention is also in particular a method for screening, selecting or identifying a compound for the reduction and / or inhibition of tumor repression and / or cell death (apoptosis), presenting the steps of : a) bringing compounds into contact with a system allowing the in vitro determination of the bond between TSIP4 and TSIP2; b) identification of the compounds inducing the reduction and / or inhibition of the link between TSEP4 and TSIP2; c) study of the compounds identified in step b) in a model making it possible to measure the phenomena of apoptosis and / or tumor repression; d) identification of the reduction and / or inhibition of tumor repression and / or cell death in said model compared to a control model with which said compound has not been brought into contact.
  • apoptosis In order to determine compounds allowing the increase in tumor repression and / or cell death (apoptosis), it is also possible to combine different methods according to the invention, it is in particular possible to thus obtain a method for screening, selecting or identifying compounds having the function of an increase in tumor repression and / or cell death (apoptosis), comprising the steps of: a) bringing said compound into contact with a system allowing the determination in in vitro of the link between TSIP4 and TSIP2; b) identification of the compounds inducing the reduction and / or inhibition of the link between TSIP4 and TSIP2.
  • step b) bringing the compounds selected in step b) into contact in a model making it possible to measure the phenomena of apoptosis and / or tumor repression; d) identification of the increase in tumor repression and / or cell death in said model compared to a control model with which said compound has not been brought into contact.
  • the present invention therefore makes use of the fact that the proteins TSIP4 and TSIP2 can bind to each other. It is therefore interesting to identify the domains of each protein which are actually in contact with the other protein. Indeed, this should make it possible to be able to use the peptides thus identified as decoys or agonists of complete proteins. This can thus make it possible to define compounds which will interfere in the TSIP4 - TSIP2 link, and which may possibly induce tumor suppression and / or apoptosis, or conversely reduce these phenomena.
  • the present invention allows the identification of TSIP4 regions involved in the binding with the TSIP2 protein, by a method comprising the steps of: a) contacting peptides derived from the TSIP4 protein in a system allowing the in vitro determination of the link between TSIP4 and TSIP2; b) identification of the peptides resulting in the reduction of the link between TSIP4 and TSIP2 in said system;
  • the present invention also makes it possible to determine the regions of TSIP2 involved in the binding with TSIP4, according to methods similar to the methods described above that these regions can in particular be used as decoys when it is desired to reduce tumor repression and / or apoptosis.
  • region of a protein is meant in particular peptides of primary sequence originating from the primary sequence of said protein. These regions thus identified can be tested like the products described above for their properties in the regulation of tumor repression and / or apoptosis.
  • the present invention therefore makes it possible to identify products making it possible to interact with the TSIP4 - TSIP2 link, and therefore which may have an interest in the regulation of apoptosis and / or tumor repression.
  • these products to be able to be used for a therapeutic treatment, in particular cancer or neurodegenerative diseases, need to be optimized, in order to have a higher activity, and / or a lower toxicity.
  • the animal models which can be used are, for example, for cancer, models based on immunocompromised mice (for example scid / scid), to which tumor cells are injected (in particular subcutaneously), which will lead to the development of tumors.
  • the efficacy of potentially anti-tumor compounds is studied, for example by measuring the size of the tumors formed.
  • the object of the present invention is in particular to allow the identification of compounds which could be used for the treatment of cancer, in that they have an activity of increasing tumor repression and / or apoptosis.
  • One of the objects of the present invention is therefore a method comprising the steps of: a) implementing a method according to the invention, making it possible to identify compounds having a certain activity of increasing tumor repression and / or apoptosis, b) modification of the product selected in step a), c) test of the product modified in step b) in in vitro and / or in vivo methods, on relevant models of tumor repression and / or apoptosis, d) identification of the product making it possible to obtain a tumor repression and / or apoptosis activity greater than the activity obtained for the product selected in step a).
  • Step d) can be replaced by a step d '), which would be: d') identification of the product making it possible to obtain the biological effect sought with less
  • the invention also relates to the methods for optimizing products repressing tumor repression and / or apoptosis, identified by the methods described above, and allowing the identification of products which can be used as medicaments.
  • the invention also relates to a method of identifying a product having an activity of reduction and / or inhibition of tumor repression and / or apoptosis, characterized in that it comprises the steps of: a ) implementation of a method according to the invention, making it possible to identify compounds having a certain activity of decreasing tumor repression and / or apoptosis, b) modification of the product selected in step a) in particular by grafting residues onto the chemical skeleton, c) testing of the modified product in step b) in in vitro and / or in vivo methods, on relevant models of tumor suppression and / or apoptosis, d) identification of the product making it possible to obtain a tumor repression and / or apoptosis activity reduced compared to the activity obtained for the product selected in step a).
  • Step d) can also be replaced by a step d '), which would be: d') identification of the product making it possible to obtain the biological effect sought with less toxicity in an animal model (when one of the models used in the step c) is in vivo). It is indeed still a question of being able to obtain the product which has the best ratio (biological activity and clinical effect) / (potential risks of use).
  • the implementation of the methods according to the present invention requires models making it possible to determine the link between TSIP4 and TSIP2, as well as easy measurement of increases or decreases in the amount of protein TSIP2 or p53 in a eukaryotic cell.
  • TSIP2 or p53 protein can be studied by Western Blot, the revelation being effected by the use of an antibody directed against said protein.
  • Such antibodies, directed to p53 can in particular be found in Calbiochem, under the reference OP09L.
  • the expression of the two proteins TSIP4, TSIP2, and p53 can be increased by introduction of the genes (in particular the cDNAs) coding for these proteins in the cells, either by being placed on vectors, or by introduction into the chromosome.
  • said mammalian cell is transfected with at least one vector chosen from a vector carrying a DNA fragment coding for TSIP4, a vector carrying a DNA fragment coding for TSIP2, a vector carrying a fragment of DNA encoding p53, a vector carrying a DNA fragment encoding more than one of these proteins.
  • a vector carrying a DNA fragment coding for TSIP4 a vector carrying a DNA fragment coding for TSIP2
  • a vector carrying a fragment of DNA encoding p53 a vector carrying a DNA fragment encoding more than one of these proteins.
  • the same vector can express all the proteins, alternatively it is possible to introduce several vectors. It is possible to use vectors allowing the expression and the easy purification of the proteins TSIP4 and TSIP2, for example in prokaryotic (E. coli, B. subtiis ...) or eukaryotic (yeasts such as Saccharomyces, Kluyveromyces ..
  • proteins may be advantageous for proteins to have a label at their N- or C-terminal end. , in order to facilitate the purification.
  • a Histidine or GST label is chosen in particular.
  • a usable protocol can be the following:
  • TSIP4 and TSIP2 proteins for example in prokaryotic (E. coli, B. subtiis ...) or eukaryotic (yeasts such as Saccharomyces, Kluyveromyces ..., mammalian cells (HeLa, Cos, Hep- 2) ...) or insects (using a Baculovirus system).
  • prokaryotic E. coli, B. subtiis
  • eukaryotic yeasts such as Saccharomyces, Kluyveromyces ..., mammalian cells (HeLa, Cos, Hep- 2)
  • insects using a Baculovirus system
  • a Histidine label is chosen, or GST
  • the proteins expressed are linked to sepharose beads exhibiting Gluthathione.
  • preparation of proteins by in vitro translation can easily be done using commercial vectors (for example available from Promega), which make it possible to clone the cDNAs under the control of well known promoters (T7 or T3), and to use the appropriate RNA polymerases to produce the RNAs, then perform protein expression in vitro, using the available kits, and following the manufacturer's directions.
  • Fluorescence Resonance Energy Transfer which consists in labeling each of the proteins with an appropriate residue, the binding of the two proteins inducing a reaction between each of the two residues and the emission of an easily detectable fluorescence.
  • a subject of the present invention is also the compounds which can be obtained by a process according to the invention, in particular the compounds having an activity of increasing tumor repression and / or apoptosis, those having an activity of inhibiting the TSIP4 - TSIP2 linkage, as well as those having an activity of reduction and / or inhibition of tumor repression and / or apoptosis.
  • the present invention also relates to the peptide sequences corresponding to a TSIP4 region interacting with the TSIP2 protein, which can in particular be identified by a method according to the invention.
  • the invention also relates to the peptide sequences corresponding to a TSIP2 region interacting with the TSIP4 protein, which can in particular be identified by a method according to the invention, the method making it possible to identify the peptide sequences of TSIP4 interacting with TSIP2 able to be adapted. to determine the peptide sequences of TSIP2 interacting with TSIP4, in particular by adapting the in vitro protocol developed above.
  • the invention also relates to the nucleotide sequences coding for the peptide sequences thus identified.
  • peptide sequence or nucleic or nucleotide sequence represent isolated sequences, that is to say out of their natural state, and can in particular be modified by replacement of their base units by non-natural units, or by modifying the links between base units (for example phosphorothioates (nucleic acid) or Peptid Nucleic Acids)
  • a compound identified by a method according to the invention can be a compound having a chemical structure, a lipid, a sugar, a protein, a peptide, a hybrid protein-lipid compound, protein-sugar, peptide-lipid, or peptide-sugar. , a protein or peptide to which chemical ramifications have been added.
  • chemical compounds envisaged they may contain one or more (in particular 2 or 3) rings, aromatic or not, having from 3 to 8 carbon atoms, as well as several residues of all kinds (in particular lower alkyl, c ' that is to say having between 1 to 6 carbon atoms).
  • These compounds, nucleic sequences, peptide sequences can thus be used for the preparation of a medicament, intended in particular for the treatment of cancer, or of a neurodegenerative disease, according to the pro or anti-apoptosis / tumor reversion effect. .
  • the present invention also relates to a complex consisting of a TSIP4 protein and a TSIP2 protein.
  • the present invention also relates to a method of inhibiting the binding of TSIP4 to TSIP2 in a cell, comprising the step of: a) bringing said cell into contact with a compound identified by a method according to the invention, inhibiting binding TSIP4-TSIP2.
  • the compound thus envisaged can also be a “decoy” peptide derived from the TSIP4 protein or from the TSIP2 protein.
  • the method can be carried out in vitro or in vivo.
  • the present invention is also directed to a method for the treatment of cancer, characterized in that a compound identified according to the present invention which increases apoptosis and / or tumor reversion is administered to a patient.
  • a method for the treatment of a neurodegenerative disease consisting in administering, to a patient, a compound according to the present invention and decreasing or inhibiting apoptosis, is also an object of the present invention.
  • Figure 1 distribution of TSIP4 mRNA in different tissues.
  • Figure 2 differential expression of TSIP 4 in the K562 / KS system.
  • TSIP2 as bait
  • TSIP4 as prey
  • TSIP2 gene (cDNA) was cloned into the plasmid pEG202 known to those skilled in the art for such an application (promoter 67-1511, lexA 1538-2227,
  • TSIP4 gene (cDNA) was cloned into the plasmid pJG4-5, also well known to those skilled in the art (promoter GAL 1-528, fusion cassette 528-849,
  • the reporter plasmid pSH18-34 also known to those skilled in the art, is also used. This plasmid is in particular available from Invitrogen, under the reference number N611-20, and also already transformed in the strain EGY48
  • yeast strain RFY 231 (described in Finley Jr, et al, 1998, Proc atl Acad Sci USA, 95, 14266-71).
  • This yeast strain has the genotype (MAT ⁇ trplAv.hisG his3 ura3-l leu2 :: 3Lexop-LEU2), and is derived from EGY48 (Guris et al., 1993, Cell, 75, 791-803).
  • the reporter gene was the LacZ gene.
  • the study is carried out on a medium containing galactose, not containing leucine, and the presence of colored colonies on these dishes is studied.
  • TSIP 4 protein has two alternative forms, one corresponding to SEQ ID ⁇ ° 2, coded by SEQ ID No 1, the other corresponding to amino acids 198-400 of SEQ ID No 2, coded by bases 592 to 1200 of SEQ ID No. 1.
  • a putative signal peptide corresponds to amino acids 198-243 of SEQ ID No.
  • the TSIP4 protein (complete) has 4 predicted trans-membrane domains (amino acids 224-244, 260-280, 320-340, 350-370), the N- and C-terminal ends being located in the cytoplasm. These transmembrane domains, as well as the intra- or extra-cellular domains are also objects of the invention, as well as the sequences which encode them.
  • Example 3 Expression of the TSIP 4 Protein Hybridization of a Northern Blot from different human tissues with a probe corresponding to a perturbation sequence of TSIP 4 shows the existence of two transcripts (approximately 1.8 and 6 kb). Most mRNA is found in the heart, skeletal muscle, and the brain. It is also less present important in the placenta, pancreas and kidney. Its expression is very weak in the lung and almost nonexistent in the liver ( Figure 1).
  • Example 4 Differential Expression of TSIP 4 in the K562 / KS System Hybridization of a Northern Blot with the TSIP4 probe showed an attenuated signal compared to the K562 line, whereas an equivalent signal is obtained with the control probe GAPDH ( Figure 2).
  • the 562 / KS model has been described by Telerman et al (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8702-6).
  • the TSIP4 protein is therefore repressed in a tumor repression model.
  • Plasmids are available from Amersham Pharmacia Biotech AB.
  • Proteins are human proteins, encoded by complementary cDNAs corresponding to sequences SEQ ID No. 1 (TSIP4) and the complete sequence of TSIP2 (GenBank U50957).
  • NP40 NP40 1%; Tris pH 7.4 10 mM; NaCl 150 mM; EDTA ImM; Glycerol 10%; DTT ImM; Aprotinin 2 ⁇ g / ml; Leupeptin 2 ⁇ g / ml; Pepstatin 2 ⁇ g / ml; AEBSF ImM).
  • Glutathione-Sepharose 4B beads are available from Amersham Pharmacia Biotech AB under number 17.0756.01.
  • EXAMPLE 7 Protocol for Translating Proteins In Vitro The Promega TNT Coupled Reticulocyte Lysate System kit is used with T7 or T3 RNA polymerase depending on the vector used to translate and express proteins (T7 for AIPI and TSIP4 1, T3 for TSIP2). The kit is used according to the manufacturer's instructions (Reference L4610)
  • the proteins incorporate methionine S 35 (Amersham Pharmacia).
  • the products obtained in vitro are analyzed by SDS-PAGE electrophoresis.
  • the gel After electrophoresis, the gel is placed in fixing buffer (5% methanol, 15% acetic acid, 80% water) for 1/2 hour and the signal is amplified by immersion of the gel in the Amplify product. from Amersham Pharmacia
  • Example 3 50 mM TrisHCl, NaC1150 mM, leupeptin 2 ⁇ l / ml, aprotinin 1%, ABESF 1 mM). Then added 5 to 10 ⁇ l of the in vitro translation product as obtained in Example 3, depending on the amount of the product observed by autoradiography.
  • the beads are rinsed 10 times with buffer A NP 40, without antiproteases.

Abstract

La présente invention concerne une séquence d'acide nucléique dans la régulation de l'apoptose et de la réversion tumorale de la voie de p53, ainsi que la protéine codée par cette séquence d'acide nucléique, ainsi que des méthodes de détection, identification et/ou criblage de composés pouvant notamment être utilisés pour le traitement des cancers ou de certaines maladies neuro-dégénératives, liés à des dérèglements dans la régulation de la suppression tumorale et/ou de l'apoptose, dans la chaîne biologique de p53, lesdits procédés étant basés sur l'interaction entre TSIP4 et TSIP2.

Description

GENE IMPLIQUE DANS LA REGULATION DE L'APOPTOSE
La présente invention concerne une séquence d'acide nucléique impliquée dans la régulation de l'apoptose et de la réversion tumorale de la voie de p53, ainsi que la protéine codée par cette séquence d'acide nucléique.
L'apoptose, ou mort cellulaire, est un phénomène complexe qui est régulé par de nombreuses protéines, dont la protéine p53. cette protéine interagit avec de nombreuses autres protéines, et son expression, qui induit les phénomènes de mort cellulaire et de réversion tumorale, peut être correlée avec l'induction ou la répression de l'expression d'autres gènes cellulaires.
Les inventeurs de la présente invention ont ainsi mis en évidence des gènes induits et activés lors de la cascade menant à la répression tumorale et/ou l'apoptose (TSAP pour « Tumor Suppressor Activated Pathway »), ou des gènes réprimés (TSIP pour « Tumor Suppressor Inhibited Pathway »). Ces gènes ont fait notamment l'objet des demandes de brevets WO 97/22695 ou WO 00/08147.
Il est important de pouvoir comprendre précisément les mécanismes de la cascade de p53, afin de pouvoir générer de nouveaux composés ayant une activité antitumorale (pouvant notamment induire l'apoptose ou la suppression tumorale), ou pouvant être utilisés pour le traitement de maladies neuro-dégénératives. En effet, les inventeurs de la présente demande ont démontré que la préséniline 1 (PSI), dont la rôle avait été suggéré dans la maladie d'Alzheimer, était identique à la protéine TSIP 2 décrite dans la demande WO 97/22695. Ainsi, il est légitime de rechercher des médicaments pouvant interférer dans l'apoptose, afin de réduire ce phénomène, et qui pourraient être utilisés dans les maladies neuro-dégénératives.
Les inventeurs de la présente demande ont mis en évidence l'interaction de la protéine TSIP 2 (préséniline 1, PSI) avec une protéine, dont il a été montré qu'elle est elle-même réprimée dans un modèle de mort cellulaire. Cette protéine (SEQ ID N° 2) a ainsi été appelée TSIP4, et c'est un objet de la présente invention, ainsi que les séquences nucléiques qui codent pour ladite protéine. On préférera notamment le gène TSIP4, étant entendu que par gène, on pourra entendre soit la séquence d'ADNc, soit la séquence d'ADN génomique, avec ou sans les éléments régulateurs. Ainsi, la présente invention a pour objet un acide nucléique purifié ou isolé, caractèr en ce qu'il comprend une séquence nucléique choisie dans le groupe de séquences suivantes : a) SEQ ID N0 1 ; b) la séquence d'un fragment d'au moins 15 nucléotides consécutifs d'une séquence choisie parmi SEQ ID N° 1 ; c) une séquence nucléique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, après alignement optimal avec une séquence définie en a) ou b) ; d) une séquence nucléique s'hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence nucléique définie en a) ou b) ; e) la séquence complémentaire ou la séquence de TARN correspondant à une séquence telle que définie en a), b), c) ou d). La séquence d'acides nucléiques selon l'invention définie en c) présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 % après alignement optimal avec une séquence telle que définie en a) ou b) ci-dessus, de préférence 90 %, de façon plus préférée 95 %, de façon la plus préférée 98 %, ou 99 %.
Par acide nucléique, séquence nucléique ou d'acide nucléique, polynucléotide, oligonucléotide, séquence de polynucléotide, séquence nucléotidique, termes qui seront employés indifféremment dans la présente description, on entend désigner un enchaînement précis de nucléotides, modifiés ou non, permettant de définir un fragment ou une région d'un acide nucléique, comportant ou non des nucléotides non naturels, et pouvant correspondre aussi bien à un ADN double brin, un ADN simple brin que des produits de transcription desdits ADNs. Ainsi, les séquences nucléiques selon l'invention englobent également les PNA (Peptid Nucleic Acid), ou analogues. II doit être compris que la présente invention ne concerne pas les séquences nucléotidiques dans leur environnement chromosomique naturel, c'est-à-dire à l'état naturel. Il s'agit de séquences qui ont été isolées et/ou purifiées, c'est-à-dire qu'elles ont été prélevées directement ou indirectement, par exemple par copie, leur environnement ayant été au moins partiellement modifié. On entend ainsi également désigner les acides nucléiques obtenus par synthèse chimique.
Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. On entend désigner par "meilleur alignement" ou "alignement optimal", l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité déterminé comme ci-après est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI). Afin d'obtenir l'alignement optimal, on utilise de préférence le programme BLAST, avec la matrice BLOSUM 62. On peut également utiliser les matrices PAM ou PAM250.
Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acides nucléiques ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale, la séquence d'acides nucléiques ou d'acides aminés à comparer pouvant comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions comparées et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences. Par séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, de façon plus préférée 98 %, après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les séquences nucléiques présentant, par rapport à la séquence nucléique de référence, certaines modifications comme en particulier une délétion, une troncation, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une substitution, notamment ponctuelle, et dont la séquence nucléique présente au moins 80 %, de préférence 90 %, de façon plus préférée 98 %, d'identité après alignement optimal avec la séquence nucléique de référence. Il s'agit de préférence de séquences dont les séquences complémentaires sont susceptibles de s'hybrider spécifiquement avec les séquences SEQ ID N° 1 de l'invention. De préférence, les conditions d'hybridation spécifiques ou de forte stringence seront telles qu'elles assurent au moins 80 %, de préférence 90 %, de façon plus préférée 98 % d'identité après alignement optimal entre l'une des deux séquences et la séquence complémentaire de l'autre. Une hybridation dans des conditions de forte stringence signifie que les conditions de température et de force ionique sont choisies de telle manière qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN complémentaires. A titre d'illustration, des conditions de forte stringence de l'étape d'hybridation aux fins de définir les fragments polynucléotidiques décrits ci-dessus, sont avantageusement les suivantes.
L'hybridation ADN-ADN ou ADN-ARN est réalisée en deux étapes : (1) préhybridation à 42°C pendant 3 heures en tampon phosphate (20 mM, pH 7,5) contenant 5 x SSC (1 x SSC correspond à une solution 0,15 M NaCl + 0,015 M citrate de sodium), 50 % de formamide, 7 % de sodium dodécyl sulfate (SDS), 10 x Denhardt's, 5 % de dextran sulfate et 1 % d'ADN de sperme de saumon ; (2) hybridation proprement dite pendant 20 heures à une température dépendant de la taille de la sonde (i.e. : 42°C, pour une sonde de taille > 100 nucléotides) suivie de 2 lavages de 20 minutes à 20°C en 2 x SSC + 2 % SDS, 1 lavage de 20 minutes à 20°C en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS. Le dernier lavage est pratiqué en 0,1 x SSC + 0,1 % SDS pendant 30 minutes à 60°C pour une sonde de taille > 100 nucléotides. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-dessus pour un polynucléotide de taille définie, peuvent être adaptées par l'homme du métier pour des oligonucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al., 1989.
Parmi les séquences nucléiques présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, de façon plus préférée 98 %, après alignement optimal avec la séquence selon l'invention, on préfère également les séquences nucléiques variantes de SEQ ID N° 1, ou de ses fragments, c'est-à-dire l'ensemble des séquences nucléiques correspondant à des variants alléliques, c'est-à-dire des variations individuelles de la séquence SEQ ID N° 1. Ces séquences mutées naturelles correspondent à des polymorphismes présents chez les mammifères, en particulier chez l'être humain et, notamment, à des polymorphismes pouvant conduire à la survenue d'une pathologie, comme par exemple une dégénérescence cellulaire. De préférence, la présente invention concerne les séquences nucléiques variantes dans lesquelles les mutations conduisent à une modification de la séquence d'acides aminés du polypeptide, ou de ses fragments, codés par la séquence normale de SEQ ID N° 1.
On entend également désigner par séquence nucléique variante tout ARN ou ADNc résultant d'une mutation et/ou variation d'un site d'épissage de la séquence nucléique génomique dont l' ADNc a pour séquence SEQ ID N° 1.
L'invention concerne de préférence un acide nucléique purifié ou isolé selon la présente invention, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué de la séquence SEQ ID TST° 1, de sa séquence complémentaire ou de la séquence de l'ARN correspondant à SEQ ID N° 1.
L'invention concerne également un acide nucléique purifié ou isolé caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide possédant un fragment continu d'au moins 100, de façon plus préférée 150, de façon la plus préférée 200 acides aminés de la protéine SEQ ID N° 2.
Les amorces ou sondes, caractérisées en ce qu'elles comprennent une séquence d'un acide nucléique selon l'invention, font également partie de l'invention. Ainsi, la présente invention concerne également les amorces ou les sondes selon l'invention qui peuvent permettre en particulier de mettre en évidence ou de discriminer les séquences nucléiques variantes, ou d'identifier la séquence génomique des gènes dont l'ADNc est représenté par SEQ ID N° 1, en utilisant notamment une méthode d'amplification telle que la méthode PCR, ou une méthode apparentée.
L'invention concerne également l'utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention comme sonde ou amorce, pour la détection, l'identification, le dosage ou l'amplification de séquence d'acide nucléique.
Selon l'invention, les polynucléotides pouvant être utilisés comme sonde ou comme amorce dans des procédés de détection, d'identification, de dosage ou d'amplification de séquence nucléique, présentent une taille minimale de 15 bases, de préférence de 20 bases, ou mieux de 25 à 30 bases. Les sondes et amorces selon l'invention peuvent être marquées directement ou indirectement par un composé radioactif ou non radioactif par des méthodes bien connues de l'homme du métier, afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable.
Les séquences de polynucléotides selon l'invention non marquées peuvent être utilisées directement comme sonde ou amorce.
Les séquences sont généralement marquées pour obtenir des séquences utilisables pour de nombreuses applications. Le marquage des amorces ou des sondes selon l'invention est réalisé par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives. Parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le P, le P, le S, le H ou le 125I. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels la biotine, l'avidine, la streptavidine, la dioxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémoluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents. Les polynucléotides selon l'invention peuvent ainsi être utilisés comme amorce et/ou sonde dans des procédés mettant en oeuvre notamment la technique de PCR (amplification en chaîne par polymérase) (Rolfs et al., 1991). Cette technique nécessite le choix de paires d'amorces oligonucléotidiques encadrant le fragment qui doit être amplifié. On peut, par exemple, se référer à la technique décrite dans le brevet américain U.S. N° 4,683,202. Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions, puis séquences. La spécificité de l'amplification peut être contrôlée en utilisant comme amorces les séquences nucléotidiques de polynucléotides de l'invention et comme matrices, des plasmides obtenant ces séquences ou encore les produits d'amplification dérivés. Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être utilisés comme réactifs dans des réactions d'hybridation afin de mettre en évidence la présence, dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique cible de séquence complémentaire à celle desdits fragments nucléotidiques amplifiés.
L'invention vise également les acides nucléiques susceptibles d'être obtenus, par amplification à l'aide d'amorces selon l'invention. D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternative à la PCR (PCR-like) à l'aide de couple d'amorces de séquences nucléotidiques selon l'invention. Par PCR-like on entend désigner toutes les méthodes mettant en œuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acides nucléiques, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés, ces techniques sont bien entendu connues. En général il s'agit de l'amplification de l'ADN par une polymérase ; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN il convient préalablement d'effectuer une transcription reverse. Il existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, comme par exemple la technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin (Walker et al., 1992), la technique TAS (Transcription-based Amplification System) décrite par Kwoh et al. (1989), la technique 3SR (Self-Sustained Séquence Replication) décrite par Guatelli et al. (1990), la technique NASBA (Nucleic Acid Séquence Based Amplification) décrite par Kievitis et al. (1991), la technique TMA (Transcription Mediated Amplification), la technique LCR (Ligase Chain Reaction) décrite par Landegren et al. (1988), la technique de RCR (Repair Chain Reaction) décrite par Segev (1992), la technique CPR (Cycling Probe Reaction) décrite par Duck et al. (1990), la technique d'amplification à la Q-béta-réplicase décrite par Miele et al. (1983). Certaines de ces techniques ont depuis été perfectionnées. Dans le cas où le polynucléotide cible à détecter est un ARNm, on utilise avantageusement, préalablement à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification à l'aide des amorces selon l'invention ou à la mise en œuvre d'un procédé de détection à l'aide des sondes de l'invention, une enzyme de type transcriptase inverse afin d'obtenir un ADNc à partir de l'ARNm contenu dans l'échantillon biologique. L'ADNc obtenu servira alors de cible pour les amorces ou les sondes mises en oeuvre dans le procédé d'amplification ou de détection selon l'invention. La technique d'hybridation de sondes peut être réalisée de manières diverses (Matthews et al., 1988). La méthode la plus générale consiste à immobiliser l'acide nucléique extrait des cellules de différents tissus ou de cellules en culture sur un support (tels que la nitrocellulose, le nylon, le polystyrène) et à incuber, dans des conditions bien définies, l'acide nucléique cible immobilisé avec la sonde. Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont détectées par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde).
Selon un autre mode de mise en œuvre des sondes nucléiques selon l'invention, ces dernières peuvent être utilisées comme sondes de capture. Dans ce cas, une sonde, dite « sonde de capture », est immobilisée sur un support et sert à capturer par hybridation spécifique l'acide nucléique cible obtenu à partir de l'échantillon biologique à tester et l'acide nucléique cible est ensuite détecté grâce à une seconde sonde, dite « sonde de détection », marquée par un élément facilement détectable.
Parmi les fragments d'acides nucléiques intéressants, il faut ainsi citer en particulier les oligonucléotides anti-sens, c'est-à-dire dont la structure assure, par hybridation avec la séquence cible, une inhibition de l'expression du produit correspondant. Il faut également citer les oligonucléotides sens qui, par interaction avec des protéines impliquées dans la régulation de l'expression du produit correspondant, induiront soit une inhibition, soit une activation de cette expression. De tels oligonucléotides peuvent être utilisés en tant que produits thérapeutiques et médicaments pour réguler les phénomènes d'apoptose et de répression tumorale. L'utilisation de ses séquences sens ou antisens peut également être mise en œuvre in vitro, pour définir de nouveaux moyens de modèle et d'étude de l'apoptose. La présente invention concerne également un polypeptide isolé caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide choisi parmi : a) un polypeptide de séquence SEQ ID N° 2 ; b) un polypeptide variant d'un polypeptide de séquence définie en a) ; c) un polypeptide homologue à un polypeptide défini en a) ou b), comportant au moins 80 % d'identité avec ledit polypeptide de a) ; d) un fragment d'au moins 15 acides aminés consécutifs d'un polypeptide défini en a) , b) ou c) ; e) un fragment biologiquement actif d'un polypeptide défini en a), b) ou c). Par « polypeptide », on entend, au sens de la présente invention, désigner des protéines ou des peptides.
Par « fragment biologiquement actif», on entend un fragment possédant la même activité biologique que le fragment peptidique dont il est déduit, de préférence dans le même ordre de grandeur (à un facteur 10 près). Ainsi, les exemples montrent que la protéine TSIP4 (SEQ ID N° 2) a un rôle potentiel dans les phénomènes d'apoptose. Un fragment biologiquement actif de la protéine TSIP4 consiste donc en un polypeptide issu de SEQ ID N° 2 possédant également un rôle dans l'apoptose.
De préférence un polypeptide selon l'invention est un polypeptide constitué de la séquence SEQ ID N° 2 (correspondant à la protéine codée par le gène TSIP4) ou d'une séquence possédant au moins 80 % d'identité avec SEQ ID N° 2 après alignement optimal.
La séquence du polypeptide présente un pourcentage d'identité d'au moins 80 % après alignement optimal avec les séquences SEQ ID N° 2, de préférence 90 ou 95 %, de façon plus préférée 98 %, ou 99 %.
Par polypeptide dont la séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, de façon plus préférée 98 %, après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les polypeptides présentant certaines modifications par rapport au polypeptide de référence, comme en particulier une ou plusieurs délétions, troncations, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une ou plusieurs substitutions.
Parmi les polypeptides dont la séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, de façon plus préférée 98 %, après alignement optimal avec la séquence SEQ ID N° 2 ou avec l'un de ses fragments selon l'invention, on préfère les polypeptides variants codés par les séquences nucléiques variantes telles que précédemment définies, en particulier les polypeptides dont la séquence d'acides aminés présente au moins une mutation correspondant notamment à une troncation, délétion, substitution et/ou addition d'au moins un résidu d'acide aminé par rapport à la séquence SEQ DD N° 2 ou avec l'un de ses fragments, de manière plus préférée les polypeptides variants présentant une mutation liée à une pathologie, comme un cancer ou une maladie neurodegenerative. La présente invention concerne également les vecteurs de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nucléique ou codant pour un polypeptide selon l'invention. Un tel vecteur peut également contenir les éléments nécessaires à l'expression et éventuellement à la sécrétion du polypeptide dans une cellule hôte. Une telle cellule hôte est également un objet de l'invention. Les vecteurs caractérisés en ce qu'ils comportent une séquence de promoteur et/ou de régulateur selon l'invention, font également partie de l'invention.
Lesdits vecteurs comportent de préférence un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Ils doivent pouvoir être maintenus de façon stable dans la cellule et peuvent éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion de la protéine traduite.
Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences d'acide nucléique selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi.
Parmi les systèmes à réplication autonome, on utilise de préférence en fonction de la cellule hôte, des systèmes de type plasmidique ou viral, les vecteurs viraux pouvant notamment être des adénovirus (Perricaudet et al., 1992), des rétrovirus, des lentivirus, des poxvirus ou des virus herpétiques (Epstein et al., 1992). L'homme du métier connaît les technologies utilisables pour chacun de ces systèmes. Lorsque l'on souhaite l'intégration de la séquence dans les chromosomes de la cellule hôte, on peut utiliser par exemple des systèmes de type plasmidique ou viral ; de tels virus sont, par exemple, les rétrovirus (Temin, 1986), ou les AAN (Carter, 1993). Parmi les vecteurs non viraux, on préfère les polynucléotides nus tels que l'ADΝ nu ou ΓARΝ nu selon la technique développée par la société NICAL, les chromosomes artificiels de bactérie (BAC, bacterial artificial chromosome), les chromosomes artificiels de levure (YAC, yeast artificial chromosome) pour l'expression dans la levure, les chromosomes artificiels de souris (MAC, mouse artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules murines et de manière préférée les chromosomes artificiels d'homme (HAC, human artificial chromosome) pour l'expression dans les cellules humaines.
De tels vecteurs sont préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple la lipofection, l'électroporation, le choc thermique, la transformation après perméabilisation chimique de la membrane, la fusion cellulaire.
L'invention comprend en outre les cellules hôtes, notamment les cellules eucaryotes et procaryotes, transformées par les vecteurs selon l'invention ainsi que les animaux transgéniques, de préférence les mammifères, excepté l'Homme, comprenant une desdites cellules transformées selon l'invention. Ces animaux peuvent être utilisés en temps que modèles, pour l'étude de l'étiologie de maladies inflammatoires et/ou immunes, et en particulier des maladies inflammatoires du tube digestif, ou pour l'étude de cancers. Parmi les cellules utilisables aux sens de la présente invention, on peut citer les cellules bactériennes (Olins et Lee, 1993), mais aussi les cellules de levure (Buckholz, 1993), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifères (Edwards et Aruffo, 1993), et notamment les cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO). On peut citer également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant par exemple en œuvre des baculovirus (Luckow, 1993). Un hôte cellulaire préféré pour l'expression des protéines de l'invention est constitué par les cellules COS. Parmi les mammifères selon l'invention, on préfère des animaux tels que les rongeurs, en particulier les souris, les rats ou les lapins, exprimant un polypeptide selon l'invention.
Parmi les mammifères selon l'invention, on préfère également des animaux tels que les souris, les rats ou les lapins, caractérisés en ce que le gène codant pour la protéine de séquence SEQ ID N° 2, ou dont la séquence est codée par le gène homologue chez ces animaux, n'est pas fonctionnel, est invalidé ou présente au moins une mutation.
Ces animaux transgéniques sont obtenus par exemple par recombinaison homologue sur cellules souches embryonnaires, transfert de ces cellules souches à des embryons, sélection des chimères affectées au niveau des lignées reproductrices, et croissance desdites chimères.
Les animaux transgéniques selon l'invention peuvent ainsi surexprimer le gène codant pour la protéine selon l'invention, ou leur gène homologue, ou exprimer ledit gène dans lequel est introduite une mutation. Ces animaux transgéniques, en particulier des souris, sont obtenus par exemple par transfection de copie de ce gène sous contrôle d'un promoteur fort de nature ubiquitaire, ou sélectif d'un type de tissu, ou après transcription virale.
Alternativement, les animaux transgéniques selon l'invention peuvent être rendus déficients pour le gène codant pour le polypeptide de la séquence SEQ ID
N° 2, ou son gène homologue, par inactivation à l'aide du système LOXP/CRE recombinase (Rohlmann et al., 1996) ou de tout autre système d'inactivation de l'expression de ce gène.
Les cellules et mammifères selon l'invention sont utilisables dans une méthode de production d'un polypeptide selon l'invention, comme décrit ci- dessous, et peuvent également servir à titre de modèle d'analyse.
Les cellules ou mammifères transformés tels que décrits précédemment peuvent aussi être utilisés à titre de modèles afin d'étudier les interactions entre les polypeptides selon l'invention, et les composés chimiques ou protéiques, impliqués directement ou indirectement dans les activités des polypeptides selon l'invention, ceci afin d'étudier les différents mécanismes et interactions mis enjeu.
Ils peuvent en particulier être utilisés pour la sélection de produits interagissant avec les polypeptides selon l'invention, notamment la protéine de séquence SEQ D N° 2 ou ses variants selon l'invention, à titre de cofacteur, ou d'inhibiteur, notamment compétitif, ou encore ayant une activité agoniste ou antagoniste de l'activité des polypeptides selon l'invention. De préférence, on utilise lesdites cellules transformées ou animaux transgéniques à titre de modèle notamment pour la sélection de produits permettant de lutter contre les pathologies liées à une expression anormale de ce gène.
L'invention concerne également l'utilisation d'une cellule, d'un mammifère ou d'un polypeptide selon l'invention pour le criblage de composés chimiques ou biochimiques. pouvant interagir directement ou indirectement avec les polypeptides selon l'invention, et/ou capable de moduler l'expression ou l'activité de ces polypeptides.
De la même façon, l'invention concerne aussi un procédé de criblage de composés capables d'interagir in vitro ou in vivo avec un acide nucléique selon l'invention, en utilisant un acide nucléique, une cellule ou un mammifère selon l'invention, et en détectant la formation d'un complexe entre les composés candidats et l'acide nucléique selon l'invention.
Les composés ainsi sélectionnés sont également objets de l'invention.
Un tel composé selon l'invention peut être un composé ayant une structure chimique, un lipide, un sucre, une protéine, un peptide, un composé hybride protéine-lipide, protéine-sucre, peptide-lipide, ou peptide-sucre, une protéine ou un peptide sur lequel on a ajouté des ramifications chimiques.
Parmi les composés chimiques envisagés, ils peuvent contenir un ou plusieurs cycles, aromatique(s) ou non, ainsi que plusieurs résidus de toute sorte
(notamment alkyle inférieur, c'est-à-dire présentant entre 1 à 6 atomes de carbones). L'invention concerne aussi l'utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon l'invention pour la synthèse de polypeptides recombinants.
La méthode de production d'un polypeptide de l'invention sous forme recombinante, elle-même comprise dans la présente invention, se caractérise en ce que l'on cultive les cellules transformées, notamment les cellules ou mammifères de la présente invention, dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant codé par une séquence d'acide nucléique selon l'invention, et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant. Les polypeptides recombinants, caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par ladite méthode de production, font également partie de l'invention.
Les polypeptides recombinants obtenus comme indiqué ci-dessus, peuvent aussi bien se présenter sous forme glycosylée que non glycosylée et peuvent présenter ou non la structure tertiaire naturelle.
Les séquences des polypeptides recombinants peuvent être également modifiées afin d'améliorer leur solubilité, en particulier dans les solvants aqueux.
De telles modifications sont connues de l'homme du métier comme par exemple la délétion de domaines hydrophobes ou la substitution d'acides aminés hydrophobes par des acides aminés hydrophiles.
Ces polypeptides peuvent être produits à partir des séquences d'acide nucléique définies ci-dessus, selon les techniques de production de polypeptides recombinants connues de l'homme du métier. Dans ce cas, la séquence d'acide nucléique utilisée est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire.
Un système efficace de production d'un polypeptide recombinant nécessite de disposer d'un vecteur et d'une cellule hôte selon l'invention.
Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée.
Les procédés utilisés pour la purification d'un polypeptide recombinant sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immunoafïïnité à l'aide d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux spécifiques, etc..
Les polypeptides selon la présente invention peuvent aussi être obtenus par synthèse chimique en utilisant l'une des nombreuses synthèses peptidiques connues, par exemple les techniques mettant en œuvre des phases solides (voir notamment
Stewart et al., 1984) ou des techniques utilisant des phases solides partielles, par condensation de fragments ou par une synthèse en solution classique. Les polypeptides obtenus par synthèse chimique et pouvant comporter des acides aminés non naturels correspondants sont également compris dans l'invention.
Les anticorps mono- ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide selon l'invention, font partie de l'invention.
Des anticorps polyclonaux spécifiques peuvent être obtenus à partir d'un sérum d'un animal immunisé contre les polypeptides selon l'invention, notamment produit par recombinaison génétique ou par synthèse peptidique, selon les modes opératoires usuels.
On note notamment l'intérêt d'anticorps reconnaissant de façon spécifique certains polypeptides, variants, ou leurs fragments immunogènes, selon l'invention.
Les anticorps mono- ou polyclonaux ou leurs fragments, anticorps chimériques ou immunoconjugués, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement le polypeptide de séquence SEQ ID N° 2 sont particulièrement préférés.
Les anticorps monoclonaux spécifiques peuvent être obtenus selon la méthode classique de culture d'hybridomes décrite par Kôhler et Milstein (1975).
Les anticorps selon l'invention sont, par exemple, des anticorps chimériques, des anticorps humanisés, des fragments Fab ou F(ab')2. Ils peuvent également se présenter sous forme d'immunoconjugués ou d'anticorps marqués afin d'obtenir un signal détectable et/ou quantifiable.
L'invention concerne également des méthodes pour la détection et/ou la purification d'un polypeptide selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles mettent en œuvre un anticorps selon l'invention.
L'invention comprend en outre des polypeptides purifiés, caractérisés en ce qu'ils sont obtenus par une méthode selon l'invention.
Par ailleurs, outre leur utilisation pour la purification des polypeptides, les anticorps de l'invention, en particulier les anticorps monoclonaux, peuvent également être utilisés pour la détection de ces polypeptides dans un échantillon biologique.
Ils constituent ainsi un moyen d'analyse immunocytochimique ou immuno- histochimique de l'expression des polypeptides selon l'invention, notamment le polypeptide de séquence SEQ ID N° 2 ou l'un de ses variants, sur des coupes de tissus spécifiques, par exemple par immunofluorescence, marquage à l'or, immunoconjugués enzymatiques.
Ils peuvent permettre notamment de mettre en évidence une expression anormale de ces polypeptides dans les tissus ou prélèvements biologiques.
Plus généralement, les anticorps de l'invention peuvent être avantageusement mis en œuvre dans toute situation où l'expression d'un polypeptide selon l'invention, normal ou muté, doit être observée.
Ainsi, un procédé de détection d'un polypeptide selon l'invention dans un échantillon biologique, comprenant les étapes de mise en contact de l'échantillon biologique avec un anticorps selon l'invention et de mise en évidence du complexe antigène-anticorps formé est également un objet de l'invention, ainsi qu'une trousse permettant de mettre en œuvre un tel procédé. Une telle trousse contient en particulier : a) un anticorps monoclonal ou polyclonal selon l'invention ; b) éventuellement des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à la réaction immunologique ; c) les réactifs permettant la détection du complexe antigène- anticorps produit lors de la réaction immunologique. Les anticorps selon l'invention peuvent également être utilisés dans le traitement d'une maladie neuro-dégénérative, ou d'un cancer, chez l'homme, lorsque l'on observe une expression anormale du gène TSIP4, PSI, p53, ou un gène décrit par les inventeurs de la présente demande, dans la demande WO 97/22695 ou WO 00/08147. Une expression anormale signifie une surexpression, une sous- expression ou l'expression d'une protéine mutée.
Ces anticorps peuvent être obtenus directement à partir de sérum humain, ou à partir d'animaux immunisés avec des polypeptides selon l'invention, puis « humanisés », et peuvent être utilisés tels quels ou dans la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies précitées. Font également partie de l'invention, les méthodes de détermination d'une variabilité allélique, d'une mutation, d'une délétion, d'une perte d'hétérozygotie ou de toute anomalie génétique du gène selon l'invention, caractérisées en ce qu'elles mettent en œuvre une séquence d'acide nucléique, un polypeptide ou un anticorps selon l'invention.
On peut détecter les mutations dans la séquence du gène TSIP4 réprimé lors de l'apoptose induite par p53, directement par analyse de l'acide nucléique et des séquences selon l'invention (ADN génomique, ARN, ou ADNc), mais également par l'intermédiaire des polypeptides selon l'invention. En particulier, l'utilisation d'un anticorps selon l'invention qui reconnaît un épitope portant une mutation permet de discriminer entre une protéine « saine » et une protéine « associée à une pathologie ». La description précise des mutations observables dans le gène TSIP4 peut permettre ainsi de poser les bases d'un diagnostic moléculaire des maladies neuro- dégénératives et les cancers, ou toute maladie impliquant l'apoptose. Une telle démarche, basée sur la recherche de mutations dans le gène, permettra de contribuer au diagnostic de ces maladies et éventuellement de réduire l'importance de certains examens complémentaires invasifs ou coûteux. L'invention pose les bases d'un tel diagnostic moléculaire basé sur la recherche de mutations dans TSIP4.
En particulier, on préfère une méthode de diagnostic et/ou d'évaluation pronostique d'une maladie neuro-dégénérative ou d'un cancer caractérisée en ce qu'on détermine à partir d'un prélèvement biologique d'un patient la présence d'au moins une mutation et/ou une altération d'expression du gène correspondant à SEQ ID N° 1 par l'analyse de tout ou partie d'une séquence nucléique correspondant audit gène.
Cette méthode de diagnostic et/ou d'évaluation pronostique peut être utilisée de façon préventive (étude d'une prédisposition à une maladie neuro-dégénérative ou au cancer), ou afin de servir à l'établissement et/ou la confirmation d'un état clinique chez un patient.
De préférence, la maladie neuro-dégénérative est la maladie d' Alzheimer.
L'analyse peut être effectuée par séquence de tout ou partie du gène, ou par d'autres méthodes connues de l'homme du métier. On peut en particulier utiliser des méthodes basées sur la PCR, par exemple la PCR-SSCP qui permet de détecter des mutations ponctuelles.
On peut également effectuer l'analyse par fixation d'une sonde selon l'invention correspondant à l'une des séquences SEQ ID N° 1 sur une puce à ADN et l'hybridation sur ces microplaques. Une puce à ADN contenant une séquence selon l'invention est également un des objets de l'invention.
De même, une puce à protéines contenant une séquence d'acides aminés selon l'invention est aussi un objet de l'invention. Une telle puce à protéines permet l'étude des interactions entre les polypeptides selon l'invention et d'autres protéines ou des composés chimiques, et peut ainsi être utile pour le criblage de composés interagissant avec les polypeptides selon l'invention. On peut également utiliser les puces à protéines selon l'invention pour détecter la présence d'anticorps dirigés contre les polypetides selon l'invention dans le sérum de patients. On peut aussi mettre en œuvre une puce à protéines contenant un anticorps selon l'invention.
L'homme du métier sait également mettre en œuvre des techniques permettant l'étude de l'altération de l'expression d'un gène, par exemple par l'étude de l'ARNm (en particulier par Northern Blot ou par des expériences de RT-PCR, avec des sondes ou des amorces selon l'invention), ou de la protéine exprimée, en particulier par Western Blot, en utilisant des anticorps selon l'invention.
L'invention se rapporte également à des procédés d'obtention d'un allèle du gène TSIP4, associé à un phénotype détectable, comprenant les étapes suivantes : a) obtenir un échantillon d'acide nucléique d'un individu exprimant ledit phénotype détectable ; b) mettre en contact ledit échantillon d'acide nucléique avec un agent capable de détecter spécifiquement un acide nucléique codant pour la protéine TSIP4 ; c) isoler ledit acide nucléique codant pour la protéine TSIP4. Un tel procédé peut être suivi d'une étape de séquence de tout ou partie de l'acide nucléique codant pour la protéine TSIP4, ce qui permet de prédire la susceptibilité à une maladie neuro-dégénérative ou à un cancer.
L'agent capable de détecter spécifiquement un acide nucléique codant pour la protéine TSIP4 est avantageusement une sonde d'oligonucléotides selon l'invention, qui peut être formée d'ADN, d'ARN, de PNA, modifiés ou non. Les modifications peuvent inclure un marquage radioactif ou fluorescent, ou être dues à des modifications dans les liaisons entre les bases (phosphorothioates, ou méthylphosphonates par exemple). L'homme du métier connaît les protocoles permettant d'isoler une séquence spécifique d'ADN. L'étape b) du procédé ci- dessus décrit peut également être une étape d'amplification telle que décrite précédemment.
L'invention se rapporte également à un procédé de détection et/ou de dosage d'un acide nucléique selon l'invention dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes de mise en contact d'une sonde selon l'invention avec un échantillon biologique et de détection et/ou dosage de l'hybride formé entre ledit polynucléotide et l'acide nucléique de l'échantillon biologique.
L'homme du métier sait mettre en œuvre un tel procédé, et peut en particulier utiliser une trousse de réactifs comprenant : a) un polynucléotide selon l'invention, utilisé en tant que sonde ; b) les réactifs nécessaires à la mise en œuvre d'une réaction d'hybridation entre ladite sonde et l'acide nucléique de l'échantillon biologique ; c) les réactifs nécessaires à la détection et/ou le dosage de l'hybride formé entre ladite sonde et l'acide nucléique de l'échantillon biologique ; qui est également un objet de l'invention.
Une telle trousse peut également contenir des contrôles positifs ou négatifs afin d'assurer la qualité des résultats obtenus. Toutefois, afin de détecter et/ou doser un acide nucléique selon l'invention, l'homme du métier peut également effectuer une étape d'amplification à l'aide d'amorces choisies parmi les séquences selon l'invention.
Enfin, l'invention concerne également les composés choisis parmi un acide nucléique, un polypeptide, un vecteur, une cellule, ou un anticorps selon l'invention, ou les composés obtenus par les procédés de criblage selon l'invention, à titre de médicament, en particulier pour la prévention et/ou le traitement d'une maladie neuro-dégénérative ou d'un cancer, associé à la présence d'au moins une mutation du gène correspondant à SEQ ID N° 1, et/ou à une expression anormale de la protéine correspondant à SEQ ID N° 2. La présente invention se rapporte également à des procédés de criblage et d'identification de produits pouvant interférer dans la cascade de p53, et ainsi induire la réversion tumorale et/ou l'apoptose ou inversement, diminuer les phénomènes d'apoptose. Cet aspect de la présente invention est basé sur le fait que la protéine TSIP4, objet de la présente demande, se lie à la protéine TSIP2 décrite dans la demande de brevet WO 97/22695, dont le rôle dans la maladie d' Alzheimer a été rapporté.
Dans un premier mode de mise en œuvre, l'invention est dirigée vers un procédé de criblage, de sélection ou d'identification d'un composé interférant avec, réduisant ou inhibant la liaison de TSIP4 à TSIP2, présentant les étapes de : a) mise en contact dudit composé avec un système permettant la détermination in vitro de la liaison entre TSIP4 et TSIP2 ; b) identification de la diminution et/ou l'inhibition de la liaison entre TSIP4 et TSIP2.
La présente invention a notamment également pour objet un procédé de criblage, de sélection ou d'identification d'un composé pour la diminution et/ou l'inhibition de la répression tumorale et/ou la mort cellulaire (apoptose), présentant les étapes de : a) mise en contact de composés avec un système permettant la détermination in vitro de la liaison entre TSIP4 et TSIP2 ; b) identification des composés induisant la diminution et/ou l'inhibition de la liaison entre TSEP4 et TSIP2 ; c) étude des composés identifiés dans l'étape b) dans un modèle permettant de mesurer les phénomènes d'apoptose et/ou répression tumorale ; d) identification de la diminution et/ou l'inhibition de la répression tumorale et/ou la mort cellulaire dans ledit modèle par rapport à un modèle témoin avec lequel ledit composé n'a pas été mis en contact.
Certains modèles permettant d'étudier/mesure l'apoptose et/ou la répression tumorale ont déjà été décrits, et consistent notamment en les modèles in vitro décrits par Tellerman ét al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8702-6), Amson et al.
(1996, Proc. Natl. Acad. SCI ; USA, 93, 3953-7), ou Nemani et al. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 9039-42).
Afin de déterminer des composés permettant l'augmentation de la répression tumorale et/ou la mort cellulaire (apoptose), il est également possible de combiner différents procédés selon l'invention, il est notamment possible d'obtenir ainsi un procédé de criblage, de sélection ou d'identification de composés ayant pour fonction une augmentation de la répression tumorale et/ou la mort cellulaire (apoptose), présentant les étapes de : a) mise en contact dudit composé avec un système permettant la détermination in vitro de la liaison entre TSIP4 et TSIP2 ; b) identification des composés induisant la diminution et/ou l'inhibition de la liaison entre TSIP4 et TSIP2. c) mise en contact des composés sélectionnés dans l'étape b) dans un modèle permettant de mesurer les phénomènes d'apoptose et/ou répression tumorale ; d) identification de l'augmentation de la répression tumorale et/ou la mort cellulaire dans ledit modèle par rapport à un modèle témoin avec lequel ledit composé n'a pas été mis en contact.
Un tel procédé est donc également un objet de la présente invention. La présente invention utilise donc le fait que les protéines TSIP4 et TSIP2 peuvent se lier l'une à l'autre. Il est donc intéressant d'identifier les domaines de chaque protéine qui sont effectivement en contact avec l'autre protéine. En effet, ceci devrait permettre de pouvoir utiliser les peptides ainsi identifiés en tant que leurres ou agonistes des protéines complètes. Ceci peut ainsi permettre de définir des composés qui interféreront dans la liaison TSIP4 - TSIP2, et qui pourront éventuellement induire la suppression tumorale et/ou l'apoptose, ou à l'inverse diminuer ces phénomènes.
De façon plus générale, la présente invention permet l'identification de régions de TSIP4 impliquées dans la liaison avec la protéine TSIP2, par un procédé comportant les étapes de : a) mise en contact de peptides issus de la protéine TSIP4 dans un système permettant la détermination in vitro de la liaison entre TSIP4 et TSIP2 ; b) identification des peptides entraînant la diminution de la liaison entre TSIP4 et TSIP2 dans ledit système ;
Il est évident que la présente invention permet également la détermination des régions de TSIP2 impliquées dans la liaison avec TSIP4, selon des procédés semblables aux procédés décrits précédemment que ces régions peuvent notamment être utilisées comme leurres lorsque l'on désire diminuer la répression tumorale et/ou l'apoptose.
Par « région » d'une protéine, on entend notamment des peptides de séquence primaire issue de la séquence primaire de ladite protéine. Ces régions ainsi identifiées peuvent être testées comme les produits décrits ci-dessus pour leurs propriétés dans la régulation de la répression tumorale et/ou l'apoptose.
La présente invention permet donc d'identifier des produits permettant d'interagir avec la liaison TSIP4 - TSIP2, et donc pouvant avoir un intérêt dans la régulation de l'apoptose et/ou la répression tumorale. Toutefois, il est possible que ces produits, pour pouvoir être utilisés pour un traitement thérapeutique, notamment le cancer ou les maladies neuro-dégénératives, nécessitent d'être optimisés, afin d'avoir une activité supérieure, et/ou une toxicité moindre.
En effet, le développement d'un médicament est souvent effectué sur le principe suivant :
- criblage de composés ayant une activité voulue par une méthode approprié,
- sélection des composés répondant au « cahier des charges »,
- détermination de la structure (notamment la séquence (éventuellement tertiaire) s'il s'agit de peptides, formule et squelette s'il s'agit de composés chimiques) des composés sélectionnés,
- optimisation des composés sélectionnés, par modification de la structure (par exemple par le changement de la conformation stéroéochimique (par exemple passage de L en D des acides aminés dans un peptide), ajout de substituants sur les squelettes peptidiques ou chimiques, notamment par greffage de résidus sur le squelette, modification des peptides (voir notamment Gante ("Peptidomimetics", dans Angewandte Chemie-International Editio Engl. 1994, 33. 1699-1720)
- passage et criblage des composés ainsi obtenus sur des modèles appropriés qui sont souvent des modèles plus proches de la pathologie étudiée. A ce stade, on utilise notamment souvent des modèles animaux, en général chez les rongeurs (souris, rats...) ou chez des chiens, voire des primates.
Les modèles animaux qui peuvent être utilisés sont par exemple, pour le cancer, des modèles basés sur des souris immunodéprimées (par exemple scid/scid), auxquelles on injecte (notamment en sous-cutané) des cellules tumorales, qui vont mener au développement de tumeurs. On étudie l'efficacité des composés potentiellement anti-tumoraux, par exemple par la mesure de la taille des tumeurs formées.
On peut, pour l'étude des maladies neuro-dégénératives, utiliser le modèle décrit par Amson et al. (2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, 5346-50), qui consiste en des souris déficientes en p53, ou le modèle décrit dans Chen et al, Janus et al, et Morgan et al. (2000, Nature, 408 pp. 975-985)
Ainsi, la présente invention a notamment pour objet de permettre l'identification de composés qui pourraient être utilisés pour le traitement du cancer, en ce qu'ils possèdent une activité d'augmentation de la répression tumorale et/ou de l'apoptose. Un des objets de la présente invention est donc un procédé comportant les étapes de : a) mise en œuvre d'un procédé selon l'invention, permettant d'identifier des composés ayant une certaine activité d'augmentation de la répression tumorale et/ou de l'apoptose, b) modification du produit sélectionné à l'étape a), c) test du produit modifié dans l'étape b) dans des procédés in vitro et/ou in vivo, sur des modèles pertinents de répression tumorale et/ou d'apoptose, d) identification du produit permettant d'obtenir une activité de répression tumorale et/ou d'apoptose supérieure à l'activité obtenue pour le produit sélectionné à l'étape a). L'étape d) peut être remplacée par une étape d'), qui serait : d') identification du produit permettant d'obtenir l'effet biologique cherché avec une toxicité moindre dans un modèle animal
(lorsque un des modèles utilisés dans l'étape c) est in vivo). Lorsque l'on effectue les tests sur des modèles d'apoptose ou de répression tumorale in vitro, on peut par exemple utiliser le modèle K256/KS décrit par Tellerman et al. (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8702-6). On peut également utiliser les cellules Ml- LTR, décrites par Amson et al. (1996, Proc. Natl. Acad. SCI ; USA, 93, 3953-7), ou les cellules U937/US3-US4, décrites par Nemani et al. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 9039-42). Les essais in vivo peuvent être réalisés en injectant ces cellules des animaux, notamment des souris immunodéprimées et en étudiant les effets des différents composés testés.
L'homme du métier saura définir les conditions et les seuils nécessaires pour l'identification d'un produit pouvant être utilisé en tant que médicament, selon les exigences réglementaires (notamment de toxicologie), par rapport au bénéfice apporté par le produit ainsi identifié.
De la même façon, l'invention concerne également les procédés d'optimisation des produits réprimant la répression tumorale et/ou l'apoptose, identifiés par les procédés décrits plus haut, et permettant l'identification de produits utilisables comme médicaments.
Ainsi l'invention concerne également un procédé d'identification d'un produit ayant une activité de diminution et/ou d'inhibition de la répression tumorale et/ou de l'apoptose, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes de : a) mise en œuvre d'un procédé selon l'invention, permettant d'identifier des composés ayant une certaine activité de diminution de la répression tumorale et/ou de l'apoptose, b) modification du produit sélectionné à l'étape a) notamment par greffage de résidus sur le squelette chimique, c) test du produit modifié dans l'étape b) dans des procédés in vitro et/ou in vivo, sur des modèles pertinents de répression tumorale et/ou d'apoptose, d) identification du produit permettant d'obtenir une activité de répression tumorale et/ou d'apoptose réduite par rapport à l'activité obtenue pour le produit sélectionné à l'étape a). L'étape d) peut également être remplacée par une étape d'), qui serait : d') identification du produit permettant d'obtenir l'effet biologique cherché avec une toxicité moindre dans un modèle animal (lorsque un des modèles utilisés dans l'étape c) est in vivo). Il s'agit en effet encore de pouvoir obtenir le produit qui présente le meilleur rapport (activité biologique et effet clinique) / (risques potentiels d'utilisation).
Les paramètres à mettre enjeu pour obtenir ces résultats sont tous connus et à la portée de l'homme du métier, désirant développer de nouveaux médicaments, et peuvent être trouvés par exemple dans les directives des organismes tels que l'Agence du Médicament, la Commission Européenne, ou la Fédéral Drug Agency.
La mise en œuvre des procédés selon la présente invention nécessite des modèles permettant de déterminer la liaison entre TSIP4 et TSIP2, ainsi qu'une mesure aisée des augmentations ou diminution de la quantité de protéine TSIP2 ou p53 dans une cellule eucaryote.
La quantité de protéine TSIP2 ou p53 peut être étudiée par Western Blot, la révélation s' effectuant par utilisation d'un anticorps dirigé contre ladite protéine. De tels anticorps, dirigés vers p53, peuvent être notamment trouvés chez Calbiochem, sous la référence OP09L. Afin de mettre en œuvre les procédés selon l'invention nécessitant l'étude et le criblage sur des cellules mammifères, il peut être avantageux de surexprimer l'une ou l'autre des protéines TSIP4, TSIP2 et p53 dans lesdites cellules, deux d'entre elles, ou les trois ensemble.
Ainsi, il est plus facile de pouvoir étudier les variations dans la quantité de protéine TSIP2 ou de p53, notamment par comparaison des cellules sur lesquelles on teste les composés d'intérêt avec les mêmes cellules, auxquelles on n'ajoute pas les composés que l'on désire cribler.
Il est entendu que l'expression des deux protéines TSIP4, TSIP2, et p53 peut être augmentée par introduction des gènes (notamment les ADNc) codant pour ces protéines dans les cellules, soit placés sur des vecteurs, soit par introduction dans le chromosome.
Lorsque l'on choisit une expression épisomale, ladite cellule mammifère est transfectée par au moins un vecteur choisi parmi un vecteur portant un fragment d'ADN codant pour TSIP4, un vecteur portant un fragment d'ADN codant pour TSIP2, un vecteur portant un fragment d'ADN codant pour p53, un vecteur portant un fragment d'ADN codant pour plus d'une de ces protéines. Ainsi, le même vecteur peut exprimer toutes les protéines, alternativement il est possible d'introduire plusieurs vecteurs. Il est possible d'utiliser des vecteur permettant l'expression et la purification facile des protéines TSIP4 et TSIP2, par exemple dans des cellules procaryotes (E. coli, B. subtiis...) ou eucaryotes (levures telles Saccharomyces, Kluyveromyces..., cellules mammifères (HeLa, Cos, Hep-2...) ou d'insectes (en utilisant un système à Baculovirus). Ainsi, il peut être avantageux que les protéines possèdent une étiquette à leur extrémité N- ou C-terminale, afin de faciliter la purification. On choisit notamment une étiquette Histidine, ou GST. Ces méthodes sont bien connues de l'homme du métier, qui trouve les plasmides appropriés dans les catalogues de sociétés telles Stratagène. Lorsque l'on met en œuvre les procédés selon l'invention sur des modèles in vitro, pour étudier la liaison entre TSIP2 et TSIP4, il existe plusieurs façons d'opérer.
Un protocole utilisable peut être le suivant :
- expression et purification des protéines TSIP4 et TSIP2, par exemple dans des cellules procaryotes (E. coli, B. subtiis...) ou eucaryotes (levures telles Saccharomyces, Kluyveromyces..., cellules mammifères (HeLa, Cos, Hep- 2...) ou d'insectes (en utilisant un système à Baculovirus). Il peut être avantageux que les protéines possèdent une étiquette à leur extrémité N- ou C-terminale, afin de faciliter la purification. On choisit notamment une étiquette Histidine, ou GST. Ces méthodes sont bien connues de l'homme du métier, qui trouve les plasmides appropriés dans les catalogues de sociétés telles Stratagène.
- liaison des protéines à des billes appropriées. Lorsque l'on utilise une étiquette GST, on lie les protéines exprimées à des billes de sépharose présentant de la Gluthathione. - préparation de protéines par traduction in vitro. Ceci peut aisément être effectué en utilisant des vecteurs commerciaux (par exemple disponibles chez Promega), qui permettent de cloner les ADNc sous le contrôle de promoteurs bien connus (T7 ou T3), et d'utiliser les ARN polymérases appropriées pour produire les ARN, puis d'effectuer l'expression des protéines in vitro., en utilisant les trousses disponibles, et en suivant les indications du fabriquant.
- co-précipitation des protéines, en ajoutant les protéines obtenues par traduction in viti-o aux billes de sépharose - glutathione sur lesquelles sont fixées les protéines de fusion avec la GST. Après un temps de contact suffisant, on lave les billes et on effectue une analyse par gel d'électrophorèse en SDS-PAGE, et autoradiographie. L'apparition des bandes correspondant aux deux protéines montre bien la liaison entre celles-ci.
L'utilisation de contrôles appropriés permet ainsi de définir la diminution et/ou l'inhibition de la liaison entre TSIP4 et TSIP2, par comparaison des quantités de protéines libérées après ajout du composé testé lors de l'étape de coprécipitation avec les quantités de protéines libérées dans les contrôles.
On peut aussi étudier la liaison des protéines en utilisant le système FRET
(Fluorescence Résonance Energy Transfer) qui consiste à marquer chacune des protéines avec un résidu approprié, la liaison des deux protéines induisant une réaction entre chacun des deux résidus et l'émission d'une fluorescence aisément détectable.
La présente invention a également pour objet les composés pouvant être obtenu par un procédé selon l'invention, notamment les composés possédant une activité d'augmentation de la répression tumorale et/ou de l'apoptose, ceux possédant une activité d'inhibition de la liaison TSIP4 - TSIP2, ainsi que ceux possédant une activité de diminution et/ou d'inhibition de la répression tumorale et/ou de l'apoptose.
La présente invention concerne également les séquences peptidiques correspondant à une région de TSIP4 interagissant avec la protéine TSIP2, qui peuvent notamment être identifiées par un procédé selon l'invention.
L'invention concerne aussi les séquences peptidiques correspondant à une région de TSIP2 interagissant avec la protéine TSIP4, qui peuvent notamment être identifiées par un procédé selon l'invention, le procédé permettant d'identifier les séquences peptidiques de TSIP4 interagissant avec TSIP2 pouvant être adapté pour déterminer les séquences peptidiques de TSIP2 interagissant avec TSIP4, notamment en adaptant le protocole in vitro développé ci-dessus.
L'invention concerne aussi les séquences nucléotidiques codant pour les séquences peptidiques ainsi identifiées. II est clair que le terme séquence peptidique ou séquence nucléique ou nucléotidique (ces deux derniers termes étant utilisés de façon indifférente) représentent des séquences isolés, c'est-à-dire hors de leur état naturel, et peuvent notamment être modifiés par le remplacement de leurs unités de bases par des unités non-naturelles, ou par la modification des liaisons entre les unités de bases (par exemple les phosphorothioates (acide nucléique) ou les Peptid Nucleic Acids)
Il est un objet de l'invention que de permettre l'identification de composés interférant avec la liaison TSIP4 et TSIP2, certains de ces composés pouvant notamment induire des effets sur la cascade de p53. Ainsi, les composés selon l'invention, les séquences peptidiques selon l'invention, ou les séquences nucléotidiques selon l'invention, à titre de médicament, sont également objets de l'invention.
Un composé identifié par une méthode selon l'invention peut être un composé ayant une structure chimique, un lipide, un sucre, une protéine, un peptide, un composé hybride protéine-lipide, protéine-sucre, peptide-lipide, ou peptide- sucre, une protéine ou un peptide sur lequel on a ajouté des ramifications chimiques.
Parmi les composés chimiques envisagés, ils peuvent contenir un ou plusieurs (notamment 2 ou 3) cycles, aromatique(s) ou non, ayant de 3 à 8 atomes de carbone, ainsi que plusieurs résidus de toute sorte (notamment alkyle inférieur, c'est-à-dire présentant entre 1 à 6 atomes de carbones).
Ces composés, séquences nucléiques, séquences peptidiques, peuvent ainsi être utilisés pour la préparation d'un médicament, destiné notamment au traitement du cancer, ou d'une maladie neuro-dégénérative, selon l'effet pro- ou anti- apoptose/réversion tumorale.
Les inventeurs de la présente demande ont, pour la première fois, mis en évidence le fait que la protéine TSIP4 se lie à la protéine TSIP2. Ainsi, la présente invention concerne également un complexe constitué d'une protéine TSIP4 et d'une protéine TSIP2.
La présente invention concerne également un procédé d'inhibition de la liaison de TSIP4 à TSIP2 dans une cellule, comprenant l'étape de : a) mise en contact de ladite cellule avec un composé identifié par un procédé selon l'invention, inhibant la liaison TSIP4-TSIP2. Le composé ainsi envisagé peut également être un peptide « leurre » issu de la protéine TSIP4 ou de la protéine TSIP2. Le procédé peut être mis en œuvre in vitro ou in vivo. La présente invention est également dirigé vers une méthode pour le traitement d'un cancer, caractérisée en ce que l'on administre, à un patient, un composé identifié selon la présente invention et augmentant l'apoptose et/ou la réversion tumorale. Une méthode pour le traitement d'une maladie neuro-dégénérative, consistant à administrer, à un patient, un composé selon la présente invention et diminuant ou inhibant l'apoptose, est également un objet de la présente invention.
Les exemples qui suivent permettent de mieux comprendre les avantages de l'invention et ne doivent pas être considérés comme limitant la portée de l'invention.
DESCRIPTION DES FIGURES
Figure 1 : distribution de l'ARNm de TSIP4 dans différents tissus. Figure 2 : expression différentielle de TSIP 4 dans le système K562/KS.
EXEMPLES
Exemple 1 : Liaison de TSIP4 et TSIP2
La liaison existant entre TSIP 4 et TSIP 2 a été observée dans un système double-hybride, dérivé du système développé par Finley et Brent (Interaction trap cloning with yeast, 169-203, in DNA Cloning, Expression Systems : a practical
Approach, 1995, Oxford Universal Press, Oxford), en utilisant la préséniline 1
(TSIP2) en tant qu'appât, et TSIP4 en tant que proie.
Le gène (ADNc) de TSIP2 a été clonée dans le plasmide pEG202 connu de l'homme du métier pour une telle application (promoteur 67-1511, lexA 1538-2227,
ADH Ter 2209-2522, pBR remnants 2540-2889, 2μ ori 2890-4785, YSCNFLP
4923-5729, HIS3 7190-5699, TYIB 7243-7707, RAFjart 7635-7976, squelette pBR 7995-10166, bla 8131-8988).
Le gène (ADNc) TSIP4 a été clone dans le plasmide pJG4-5, également bien connu de l'homme du métier (promoteur GAL 1-528, cassette de fusion 528-849,
ADH Ter 867-1315, 2μ ori 1371-3365, TRP1 3365-4250, squelette pUC 4264-
6422, Ap 4412-5274). On utilise également le plasmide rapporteur pSH18-34, également connu de l'homme du métier. Ce plasmide est notamment disponible chez Invitrogen, sous le numéro de référence N611-20, et également déjà transformé dans la souche EGY48
(aussi appelée RFY 231), chez le même fournisseur (référence souche seule : C835- 00, transformée par pSHl 8-34 : C836-00)
La liaison a été démontrée dans la souche de levure RFY 231 (décrite dans Finley Jr, et al, 1998, Proc atl Acad Sci USA, 95, 14266-71). Cette souche de levure possède le génotype (MATα trplAv.hisG his3 ura3-l leu2::3Lexop-LEU2), et est dérivée de EGY48 (Guris et al., 1993, Cell, 75, 791-803). Le gène rapporteur était le gène LacZ.
On effectue l'étude sur un milieu contenant du galactose, ne contenant pas de leucine, et on étudie la présence de colonies colorées sur ces boîtes.
On a ainsi pu montrer que la protéine TSEP21 se lie à la protéine TSIP4, et que la liaison est sur les 204 acides aminés C-terminaux de la protéine TSIP2.
Exemple 2 : analyse de la protéine TSIP4
Il semble que la protéine TSIP 4 possède deux formes alternatives, l'une correspondant à SEQ ID Ν°2, codée par SEQ ID N°l, l'autre correspondant aux acides aminés 198-400 de SEQ ID N°2, codés par les bases 592 à 1200 de SEQ ID N°l. un peptide signal putatif correspond aux acides aminés 198-243 de SEQ ID
N°2 (bases 592 à 729 de SEQ ID N°l).
Les séquences ci-dessus décrites sont aussi objets de l'invention.
La protéine TSIP4 (complète) possède 4 domaines trans-membranaires prédites (acides aminés 224-244, 260-280, 320-340, 350-370), les extrémités N- et C-terminales étant situées dans le cytoplasme. Ces domaines transmembranaires, ainsi que les domaines intra- ou extra-cellulaires sont également objets de l'invention, ainsi que les séquences qui les codent.
Exemple 3 : expression de la protéine TSIP 4 L'hybridation d'un Northern Blot de différents tissus humains avec une sonde correspondant à une séquence pertielle de TSIP 4 montre l'existence de deux transcrits (environ 1,8 et 6 kb). L'ARNm est trouvé majoritairement dans le cœur, le muscle squelettique, et le cerveau. Il est également présent de façon moins importante dans le placenta, le pancréas et le rein. Son expression est très faible dans le poumon et quasi inexistante dans le foie (figure 1).
Exemple 4 : expression différentielle de TSIP 4 dans le système K562/KS L'hybridation d'un Northern Blot avec la sonde TSIP4 a montré un signal atténué par rapport à la lignée K562, alors q'un signal équivalent est obtenu avec la sonde contrôle GAPDH (Figure 2). Le modèle 562/KS a été décrit par Telerman ét al (1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 8702-6).
La protéine TSIP4 est donc réprimée dans un modèle de répression tumorale.
Exemple 5 : expression des protéines de fusion GST
Pour obtenir des protéines de fusion GST, on peut suivre le protocole suivant : Préparation d'une préculture à partir d'une colonie isolée de B121 (DE3), transformée avec le plasmide pGEX-P-l-TSIP4 ou pGEX-P-l-TSIP2, dans un milieu SB avec lOOμg/ml d'ampicilline, à 37°C.
Les plasmides sont disponibles chez Amersham Pharmacia Biotech AB.
Les protéines sont les protéines humaines, codées par les ADNc complémentaires correspondant aux séquences SEQ ID N° 1 (TSIP4) et la séquence complète de TSIP2 (GenBank U50957).
Le lendemain, inoculer 250 ml de SB+Amp avec 5 ml de la préculture.
Croissance à 28 °C ou 37°C selon la toxicité des protéines pour les bactéries hôtes, jusqu'à une densité optique entre 0,5 et 0,7. Ajout de 0, 1 mM IPTG pour induire la synthèse des protéines.
Croissance à 28°C ou 37°C pendant Ih ou lh30.
Centrifugation 3000 rpm pendant 10 min (1800g, 4°C)
Resuspension du précipité dans 10 ml de tampon A NP40 (NP40 1 % ; Tris pH 7,4 10 mM ; NaCl 150 mM ; EDTA ImM ; Glycerol 10% ; DTT ImM ; Aprotinin 2μg/ml ; Leupeptin 2μg/ml ; Pepstatin 2μg/ml ; AEBSF ImM).
Sonication 3 fois pendant 15 s à puissance 50, sur glace.
Centrifugation à 12000 rpm pendant 10 min (18000g, 4°C)
Garder le surnageant à -80°C. Exemple 6 : protocole à suiyre pour la liaison des protéines de fusion aux billes de sepharose-glutathione
Ajout de 2 ml de surnageant à 200 μl de billes (préparées après 3 rinçages dans le PBS, 1 rinçage dans le tampon A NP40, resuspension à 50 % (poids par volume) dans le tampon A NP40, centrifugation à 3000 rpm à chaque fois).
Les billes Glutathione-sepharose 4B sont disponibles chez Amersham Pharmacia Biotech AB, sous le numéro 17.0756.01.
Remuer doucement pendant au moins 1 heure à 4°C. Rincer les billes 3 fois dans le tampon A NP40 sans inhibiteur de protéase.
Resuspendre les billes dans 1 ml de tampon A NP40 avec inhibiteur de protéase.
Pour l'analyse par électrophorèse SDS-PAGE, prendre 20 à 40 μl des billes resuspendues, centrifuger pendant 5 min, écarter le surnageant, resuspendre les billes dans 10 μl de tampon de charge de X, chauffer à 97°C pendant 7 min.
Charger sur gel et analyser après révélation par bleu de Coomassie, pour normaliser la quantité des protéines de fusion à utiliser.
Exemple 7 : protocole pour la traduction de protéines in vitro Le kit TNT Coupled Reticulocyte Lysate System de Promega est utilisé avec les ARN polymérase T7 ou T3 en fonction du vecteur utilisé pour traduire et exprimer les protéines (T7 pour AIPI et TSIP4 1, T3 pour TSIP2). Le kit est utilisé selon les instructions du fabricant (Référence L4610)
Les protéines incorporent de la méthionine S35 (Amersham Pharmacia). Les produits obtenus in vitro sont analysés par électrophorèse SDS-PAGE.
Après électrophorèse, le gel est placé dans du tampon de fixation (5 % de méthanol, 15 % d'acide acétique, 80 % d'eau) pendant une 1/2 heure et le signal est amplifié par immersion du gel dans le produit Amplify de Amersham Pharmacia
(Ref : NAMP100). Un film Kodak Biomax MR est alors exposé sur le gel séché pendant une durée variant d'une heure à une semaine, puis développé. Exemple 8 : protocole pour la co-précipitation des protéines
30 μl des billes de sépharose- glutathione couplés aux protéines de fusion
GST, après normalisation des quantités, sont rincés dans le tampon B (NP40 1 %,
TrisHCl 50 mM, NaC1150 mM, leupeptine 2 μl/ml, aprotinine 1 %, ABESF 1 mM). On ajoute ensuite 5 à 10 μl du produit de traduction in vitro tel qu'obtenu dans l'exemple 3, en fonction de la quantité du produit observé par autoradiographie.
Après une nuit de contact, les billes sont rincées 10 fois avec du tampon A NP 40, sans antiprotéases.
On analyse par SDS-PAGE et autoradiographie. On peut ainsi montrer la liaison entre les protéines TSIP4 et TSIP2.
Exemple 9 : protocole pour le criblage de composés interférant avec la liaison TSIP4 - TSIP2
On effectue les essais décrits dans les exemples 5 à 8, en ajoutant les composés que l'on désire étudier à l'étape de l'exemple 8, et on compare avec les résultats obtenus lorsque les composés ne sont pas ajoutés.
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Claims

Revendications
1. Acide nucléique purifié ou isolé, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléique choisie dans le groupe de séquences suivantes : a) SEQ ID N0 1 ; b) la séquence d'un fragment d'au moins 15 nucléotides consécutifs de SEQ ID N0 l ; c) une séquence nucléique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, après alignement optimal avec une séquence définie en a) ou b) ; d) une séquence nucléique s'hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence nucléique définie en a) ou b) ; e) la séquence complémentaire ou la séquence d'ARN correspondant à une séquence telle que définie en a), b), c) ou d).
2. Acide nucléique purifié ou isolé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué d'une séquence choisie dans le groupe constitué de SEQ ID N° 1, la séquence complémentaire de SEQ ID N° 1 et la séquence d'ARN correspondant à SEQ ID N° 1.
3. Acide nucléique purifié ou isolé caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide possédant un fragment continu d'au moins 200 acides aminés de la protéine SEQ ID N0 2.
4. Polypeptide isolé caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide choisi parmi : a) un polypeptide correspondant à SEQ ID N° 2 ; b) un polypeptide variant d'un polypeptide de séquence définie en a) ; c) un polypeptide homologue à un polypeptide défini en a) ou b), comportant au moins 80 % d'homologie avec ledit polypeptide de a) ; d) un fragment d'au moins 15 acides aminés consécutifs d'un polypeptide défini en a), b) ou c) ; e) un fragment biologiquement actif d'un polypeptide défini en a), b) ou c).
5. Vecteur de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3 ou codant pour un polypeptide selon la revendication 4.
6. Cellule hôte caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur selon la revendication 5.
7. Animal, excepté l'homme, caractérisé en ce qu'il comprend une cellule selon la revendication 6.
8. Utilisation in vitro d'une séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3 en tant que sonde ou amorce, pour la détection et/ou l'amplification de séquences d'acide nucléique.
9. Utilisation in vitro d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3 comme oligonucléotide sens ou antisens.
10. Utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3 pour la production d'un polypeptide recombinant.
11. Procédé d'obtention d'un polypeptide recombinant caractérisé en ce que l'on cultive une cellule selon la revendication 6 dans des conditions permettant l'expression dudit polypeptide et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.
12. Polypeptide recombinant caractérisé en ce qu'il est obtenu par un procédé selon la revendication 11.
13. Anticorps monoclonal ou polyclonal caractérisé en ce qu'il lie sélectivement un polypeptide selon l'une des revendications 4 ou 12.
14. Procédé de détection d'un polypeptide selon l'une des revendications 4, ou 12, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d'un échantillon biologique avec un anticorps selon la revendication 13 ; b) mise en évidence du complexe antigène-anticorps formé.
15. Trousse de réactifs pour la mise en œuvre d'un procédé selon la revendication 14, caractérisée en ce qu'elle comprend : a) un anticorps monoclonal ou polyclonal selon la revendication 13 ; b) éventuellement des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à la réaction immunologique ; c) les réactifs permettant la détection du complexe antigène- anticorps produit lors de la réaction immunologique.
16. Méthode de diagnostic et/ou d 'évaluation pronostique d'une maladie neuro-dégénérative ou d'un cancer caractérisée en ce qu'on détermine à partir d'un prélèvement biologique d'un patient la présence d'au moins une mutation et/ou une altération d'expression du gène correspondant à SEQ ID N° 1 par l'analyse de tout ou partie d'une séquence nucléique correspondant audit gène.
17. Puce à ADN caractérisée en ce qu'elle contient une séquence nucléique selon l'une des revendications 1 à 3.
18. Puce à protéines caractérisée en ce qu'elle contient un polypeptide selon l'une des revendications 4 ou 12, ou un anticorps selon la revendication 13.
19. Procédé de détection et/ou de dosage d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d'un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 3, marqué ; b) détection et/ou dosage de l'hybride formé entre ledit polynucléotide et l'acide nucléique de l'échantillon biologique.
20. Procédé de détection et/ou de dosage d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'amplification des acides nucléiques dudit échantillon biologique à l'aide d'amorces choisies parmi les acides nucléiques selon l'une des revendications 1 à 2.
21. Procédé de criblage de composés capables de se fixer à un polypeptide de séquence SEQ ID N° 2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de mise en contact d'un polypeptide selon l'une des revendications 4 ou 12, d'une cellule selon la revendication 6, ou d'un mammifère selon la revendication 7, avec un composé candidat et de détection de la formation d'un complexe entre ledit composé candidat et ledit polypeptide.
22. Procédé de criblage de composés capables d'interagir in vitro ou in vivo avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de mise en contact d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3, d'une cellule selon la revendication 6, ou d'un mammifère selon la revendication 7, avec un composé candidat et de détection de la formation d'un complexe entre ledit composé candidat et ledit acide nucléique
23. Utilisation d'un composé obtenu par un procédé selon l'une des revendications 21 ou 22, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une maladie neuro-dégénérative ou d'un cancer.
24. Composé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi a) un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3 ; b) un polypeptide selon l'une des revendications 4 ou 12 ; c) un vecteur selon la revendication 5 ; d) une cellule selon la revendication 6 ; e) un anticorps selon la revendication 13, à titre de médicament.
25. Composé selon la revendication 24, pour la prévention et/ou le traitement d'une maladie neuro-dégénérative ou d'un cancer associé à la présence d'au moins une mutation ou d'une altération d'expression du gène correspondant à SEQ ID N0 1.
26. Procédé d'identification d'un composé inhibant la liaison de TSIP4 à
TSIP2, présentant les étapes de : a) mise en contact dudit composé avec un système permettant la détermination in vitro de la liaison entre TSÏÏ et TSIP2 ; b) identification de la diminution et/ou l'inhibition de la liaison entre TSIP4 et TSIP2.
27. Procédé d'identification d'un composé pour la diminution et/ou l'inhibition de la répression tumorale et/ou la mort cellulaire (apoptose), présentant les étapes de : a) mise en contact de composés avec un système permettant la détermination in vitro de la liaison entre TSIP4 et TSIP2 ; b) identification des composés induisant la diminution et/ou l'inhibition de la liaison entre TSIP4 et TSIP2 ; c) mise en contact des composés identifiés dans l'étape b) dans un modèle permettant de mesurer les phénomènes d'apoptose et/ou répression tumorale ; d) identification de la diminution et/ou l'inhibition de la répression tumorale et/ou la mort cellulaire dans ledit modèle par rapport à un modèle témoin avec lequel ledit composé n'a pas été mis en contact.
28. Procédé d'identification d'un composé pour l'augmentation de la répression tumorale et/ou la mort cellulaire (apoptose), présentant les étapes de : a) mise en contact de composés avec un système permettant la détermination in vitro de la liaison entre TSIP4 et TSIP2 ; b) identification des composés induisant la diminution et/ou l'inhibition de la liaison entre TSIP4 et TSIP2 ; c) mise en contact des composés identifiés dans l'étape b) dans un modèle permettant de mesurer les phénomènes d'apoptose et/ou répression tumorale ; d) identification de l'augmentation de la répression tumorale et/ou la mort cellulaire dans ledit modèle par rapport à un modèle témoin avec lequel ledit composé n'a pas été mis en contact.
29. Procédé d'identification des régions de TSIP4 impliquées dans la liaison avec la protéine TSIP2, comportant les étapes de : a) mise en contact de peptides issus de la protéine TSIP4 dans un système permettant la détermination in vitro de la liaison entre
TSIP4 et TSIP2 ; b) identification des peptides entraînant la diminution de la liaison entre TSIP4 et TSIP2 dans ledit système ;
30. Procédé d'identification d'un produit ayant une activité d'augmentation de la répression tumorale et/ou de l'apoptose, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes de : a) mise en œuvre d'un procédé selon l'une des revendications 26 ou 28, b) modification du produit sélectionné à l'étape a) notamment par greffage de résidus sur le squelette chimique, c) test du produit modifié dans l'étape b) dans des procédés in vitro et/ou in vivo, sur des modèles pertinents de répression tumorale et/ou d'apoptose, d) identification du produit permettant d'obtenir une activité de répression tumorale et/ou d'apoptose supérieure à l'activité obtenue pour le produit sélectionné à l'étape a).
31. Procédé d'identification d'un produit ayant une activité de diminution et/ou d'inhibition de la répression tumorale et/ou de l'apoptose, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes de : a) mise en œuvre d'un procédé selon l'une des revendications 26 ou 27, b) modification du produit sélectionné à l'étape a) notamment par greffage de résidus sur le squelette chimique, c) test du produit modifié dans l'étape b) dans des procédés in vitro et/ou in vivo, sur des modèles pertinents de répression tumorale et/ou d' apoptose, d) identification du produit permettant d'obtenir une activité de répression tumorale et/ou d'apoptose réduite par rapport à l'activité obtenue pour le produit sélectionné à l'étape a).
32. Utilisation d'un composé identifié par un procédé selon l'une des revendications 26, 28, ou 30, possédant une activité d'augmentation de la répression tumorale et/ou de l'apoptose, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du cancer.
33. Utilisation d'un composé identifié par un procédé selon l'une des revendications 26, 27, ou 31, possédant une activité de diminution et/ou d'inhibition de la répression tumorale et/ou de l'apoptose, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une maladie neuro-dégénérative.
34. Séquence peptidique correspondant à une région de TSIP4 pouvant être identifiée par un procédé selon la revendication 29.
35. Séquence nucléotidique codant pour une séquence peptidique selon la revendication 34.
36. Séquence peptidique selon la revendication 34, ou séquence nucléotidique selon la revendication 35 à titre de médicament.
37. Utilisation d'une séquence peptidique selon la revendication 34, ou d'une séquence nucléotidique selon la revendication 35 pour la préparation d'un médicament.
38. Complexe constitué d'une protéine TSIP4 et d'une protéine TSEP2.
39. Procédé d'inhibition de la liaison TSIP4 - TSIP2 dans une cellule in vitro, comprenant l'étape de : a) mise en contact de ladite cellule avec un composé identifié par un procédé selon la revendication 26.
REVENDICATIONS MODIFIEES
[reçues par le Bureau International le 22 Mai 2002 (22.05.02); revendications originales 1-39 remplacées par les revendications modifiées 1-38 (8 pages)]
1. Acide nucléique purifié ou isolé, caractérisé en ce qu'il comprend une séquence nucléique choisie dans le groupe de séquences suivantes : a) SEQ ID N° 1 ; b) une séquence nucléique présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, après alignement optimal avec une séquence définie en a) ; c) une séquence nucléique s'hybridant dans des conditions de forte stringence avec une séquence nucléique définie en a) ; d) la séquence complémentaire ou la séquence d'ARN correspondant à une séquence telle que définie en a), b) ou c).
2. Acide nucléique purifié ou isolé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend ou est constitué d'une séquence choisie dans le groupe constitué de SEQ ID N° 1, la séquence complémentaire de SEQ ID N° 1 et la séquence d'ARN correspondant à SEQ ID N° 1.
3. Polypeptide isolé caractérisé en ce qu'il comprend un polypeptide choisi parmi : a) un polypeptide correspondant à SEQ ID N° 2 ; b) un polypeptide variant d'un polypeptide de séquence définie en a) ; c) un polypeptide homologue à un polypeptide défini en a) ou b), comportant au moins 80 % d'homologie avec ledit polypeptide de a) ; d) un fragment d'au moins 15 acides aminés consécutifs d'un polypeptide défini en a), b) ou c) ; e) un fragment biologiquement actif d'un polypeptide défini en a), b) ou c).
4. Vecteur de clonage et/ou d'expression comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 2 ou codant pour un polypeptide selon la revendication 3.
5. Cellule hôte caractérisée en ce qu'elle est transformée par un vecteur selon la revendication 4.
6. Animal, excepté l'homme, caractérisé en ce qu'il comprend une cellule selon la revendication 5.
7. Utilisation in vitro d'une séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 2 en tant que sonde ou amorce, pour la détection et/ou l'amplification de séquences d'acide nucléique.
8. Utilisation in vitro d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 2 comme oligonucléotide sens ou antisens.
9. Utilisation d'une séquence d'acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 2 pour la production d'un polypeptide recombinant.
10. Procédé d'obtention d'un polypeptide recombinant caractérisé en ce que l'on cultive une cellule selon la revendication 5 dans des conditions permettant l'expression dudit polypeptide et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.
11. Polypeptide recombinant caractérisé en ce qu'il est obtenu par un procédé selon la revendication 10.
12. Anticorps monoclonal ou polyclonal caractérisé en ce qu'il lie sélectivement un polypeptide selon l'une des revendications 3 ou 11.
13. Procédé de détection d'un polypeptide selon l'une des revendications 3, ou 11, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d'un échantillon biologique avec un anticorps selon la revendication 12 ; b) mise en évidence du complexe antigène-anticorps formé.
14. Trousse de réactifs pour la mise en œuvre d'un procédé selon la revendication 13, caractérisée en ce qu'elle comprend : a) un anticorps monoclonal ou polyclonal selon la revendication 12 ; b) éventuellement des réactifs pour la constitution d'un milieu propice à la réaction immunologique ; c) les réactifs permettant la détection du complexe antigène- anticorps produit lors de la réaction immunologique.
15. Méthode de diagnostic et/ou d 'évaluation pronostique d'une maladie neuro-dégénérative ou d'un cancer caractérisée en ce qu'on détermine à partir d'un prélèvement biologique d'un patient la présence d'au moins une mutation et/ou une altération d'expression du gène correspondant à SEQ ID N° 1 par l'analyse de tout ou partie d'une séquence nucléique correspondant audit gène.
16. Puce à ADN caractérisée en ce qu'elle contient une séquence nucléique selon l'une des revendications 1 à 2.
17. Puce à protéines caractérisée en ce qu'elle contient un polypeptide selon l'une des revendications 3 ou 11, ou un anticorps selon la revendication 12.
18. Procédé de détection et/ou de dosage d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 et 2 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mise en contact d'un polynucléotide selon l'une des revendications 1 et 2, marqué ; b) détection et/ou dosage de l'hybride formé entre ledit polynucléotide et l'acide nucléique de l'échantillon biologique.
19. Procédé de détection et/ou de dosage d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 et 2 dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'amplification des acides nucléiques dudit échantillon biologique à l'aide d'amorces choisies parmi les acides nucléiques selon l'une des revendications 1 et 2.
20. Procédé de criblage de composés capables de se fixer à un polypeptide de séquence SEQ ID N° 2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de mise en contact d'un polypeptide selon l'une des revendications 3 ou 11, d'une cellule selon la revendication 5, ou d'un mammifère selon la revendication 6, avec un composé candidat et de détection de la formation d'un complexe entre ledit composé candidat et ledit polypeptide.
21. Procédé de criblage de composés capables d'interagir in vitro ou in vivo avec un acide nucléique selon l'une des revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de mise en contact d'un acide nucléique selon l'une des revendications 1 et 2, d'une cellule selon la revendication 5, ou d'un mammifère selon la revendication 6, avec un composé candidat et de détection de la formation d'un complexe entre ledit composé candidat et ledit acide nucléique
22. Utilisation d'un composé obtenu par un procédé selon l'une des revendications 20 ou 21, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une maladie neuro-dégénérative ou d'un cancer.
23. Composé caractérisé en ce qu'il est choisi parmi a) un acide nucléique selon l'une des revendications 1 et 2 ; b) un polypeptide selon l'une des revendications 3 ou 11 ; c) un vecteur selon la revendication 4 ; d) une cellule selon la revendication 5 ; e) un anticorps selon la revendication 12, à titre de médicament.
24. Composé selon la revendication 23, pour la prévention et/ou le traitement d'une maladie neuro-dégénérative ou d'un cancer associé à la présence d'au moins une mutation ou d'une altération d'expression du gène correspondant à SEQ ID N° 1.
25. Procédé d'identification d'un composé inhibant la liaison de TSIP4 à TSIP2, présentant les étapes de : a) mise en contact dudit composé avec un système permettant la détermination in vitro de la liaison entre TSIP4 et TSIP2 ; b) identification de la diminution et/ou l'inhibition de la liaison entre TSIP4 et TSIP2.
26. Procédé d'identification d'un composé pour la diminution et/ou l'inhibition de la répression tumorale et/ou la mort cellulaire (apoptose), présentant les étapes de : a) mise en contact de composés avec un système permettant la détermination in vitro de la liaison entre TSIP4 et TSIP2 ; b) identification des composés induisant la diminution et/ou l'inhibition de la liaison entre TSIP4 et TSIP2 ; c) mise en contact des composés identifiés dans l'étape b) dans un modèle permettant de mesurer les phénomènes d'apoptose et/ou répression tumorale ; d) identification de la diminution et ou l'inhibition de la répression tumorale et/ou la mort cellulaire dans ledit modèle par rapport à un modèle témoin avec lequel ledit composé n'a pas été mis en contact.
27. Procédé d'identification d'un composé pour l'augmentation de la répression tumorale et/ou la mort cellulaire (apoptose), présentant les étapes de : a) mise en contact de composés avec un système permettant la détermination in vitro de la liaison entre TSIP4 et TSIP2 ; b) identification des composés induisant la diminution et/ou l'inhibition de la liaison entre TSIP4 et TSIP2 ; c) mise en contact des composés identifiés dans l'étape b) dans un modèle permettant de mesurer les phénomènes d'apoptose et/ou répression tumorale ; d) identification de l'augmentation de la répression tumorale et/ou la mort cellulaire dans ledit modèle par rapport à un modèle témoin avec lequel ledit composé n'a pas été mis en contact.
28. Procédé d'identification des régions de TSIP4 impliquées dans la liaison avec la protéine TSIP2, comportant les étapes de : a) mise en contact de peptides issus de la protéine TSIP4 dans un système permettant la détermination in vitro de la liaison entre TSIP4 et TSIP2 ; b) identification des peptides entraînant la diminution de la liaison entre TSIP4 et TSIP2 dans ledit système ;
29. Procédé d'identification d'un produit ayant une activité d'augmentation de la répression tumorale et/ou de l'apoptose, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes de : a) mise en œuvre d'un procédé selon l'une des revendications 25 ou 27, b) modification du produit sélectionné à l'étape a) notamment par greffage de résidus sur le squelette chimique, c) test du produit modifié dans l'étape b) dans des procédés in vitro et/ou in vivo, sur des modèles pertinents de répression tumorale et/ou d'apoptose, d) identification du produit permettant d'obtenir une activité de répression tumorale et/ou d'apoptose supérieure à l'activité obtenue pour le produit sélectionné à l'étape a).
30. Procédé d'identification d'un produit ayant une activité de diminution et/ou d'inhibition de la répression tumorale et/ou de l'apoptose, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes de : a) mise en œuvre d'un procédé selon l'une des revendications 26 ou 26, b) modification du produit sélectionné à l'étape a) notamment par greffage de résidus sur le squelette chimique, c) test du produit modifié dans l'étape b) dans des procédés in vitro et/ou in vivo, sur des modèles pertinents de répression tumorale et/ou d'apoptose, d) identification du produit permettant d'obtenir une activité de répression tumorale et/ou d'apoptose réduite par rapport à l'activité obtenue pour le produit sélectionné à l'étape a).
31. Utilisation d'un composé identifié par un procédé selon l'une des revendications 25, 27, ou 29, possédant une activité d'augmentation de la répression tumorale et/ou de l'apoptose, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du cancer.
32. Utilisation d'un composé identifié par un procédé selon l'une des revendications 25, 26, ou 30, possédant une activité de diminution et/ou d'inhibition de la répression tumorale et/ou de l'apoptose, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une maladie neuro-dégénérative.
33. Séquence peptidique correspondant à une région de TSIP4 pouvant être identifiée par un procédé selon la revendication 28.
34. Séquence nucléotidique codant pour une séquence peptidique selon la revendication 33.
35. Séquence peptidique selon la revendication 33, ou séquence nucléotidique selon la revendication 34 à titre de médicament.
36. Utilisation d'une séquence peptidique selon la revendication 33, ou d'une séquence nucléotidique selon la revendication 34 pour la préparation d'un médicament.
37. Complexe constitué d'une protéine TSIP4 et d'une protéine TSIP2.
38. Procédé d'inhibition de la liaison TSIP4 - TSIP2 dans une cellule in vitro, comprenant l'étape de : a) mise en contact de ladite cellule avec un composé identifié par un procédé selon la revendication 25.
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