EP1177313A2

EP1177313A2 - Methoden zur auffindung von proteasen, die spezifisch membrangebundene substrate spalten

Info

Publication number: EP1177313A2
Application number: EP00934985A
Authority: EP
Inventors: Christian Haass; Harald Steiner; Brigitte Pesold
Original assignee: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG; Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Boehringer Ingelheim Pharma GmbH and Co KG
Priority date: 1999-05-05
Filing date: 2000-05-05
Publication date: 2002-02-06
Also published as: WO2000068416A3; JP2002543797A; WO2000068416A2; DE19920514A1; MXPA01010500A; CA2370212A1

Abstract

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Auffindung von Proteasen, die membranassoziierte Substrate spalten sowie die dafür notwendigen rekombinanten Fusionsproteine.

Description

Methoden zur Auffindung von Proteasen, die spezifisch membrangebundene Substrate spalten

Technisches Gebiet

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Auffindung von Proteasen, die membranassoziierte Substrate spalten sowie die dafür notwendigen rekombinanten Fusionsproteine

Stand der Technik

Proteasen spielen eine wichtige Rolle für viele physiologische Prozesse wie beispielsweise die Transkription, Apoptose, Entwicklung und Signaltransduktion (Whiteside, S T et al J Biol Chem , 269, 1994 27059) Auch ist bekannt, daß Proteasen eine Schlusselrolle in einer ganzen Reihe von Erkrankungen einnehmen, wie beispielsweise bei den neurodegenerativen Krankheiten, die zum Beispiel auch die Alzheimer^'sche Krankheit beim Menschen umfassen Die in solchen Krankheitsbildern involvierten bekannten und noch unbekannten Proteasen stellen einen wichtigen Ansatzpunkt zur Entwicklung neuer therapeutischer Verfahren dar Das Auffinden von Proteasen und der Nachweis ihrer proteolytischen Aktivität und Spezifitat basiert auf dem Nachweis und der Charakterisierung eines Spaltprodukts Es sei hier auf die Verfahren von Smith und Kohorn (Smith, T A und Kohorn, B D Proc Natl Acad Sei USA 88, 1991 5159) und Dasmahapatra et al (Dasmahapatra, B et al PNAS 89(9), 1992 4159-4162) verwiesen

Smith und Kohorn beschreiben ein Verfahren zur Auffindung der cDNA s eukaryontischer Proteasen die eine vorgegebene Aminosauresequenz spalten Zum Nachweis einer spezifischen proteolytischen Aktivität wurde hier ein Fusionsprotein aus einer bekannten Proteasespaltsequenz und dem Transkriptionsfaktor GAL4 sowie die dafür spezifische Protease selbst rekombinant in Hefe expπmiert Die Spaltung der Proteasespaltsequenz durch die spezifische Protease trennt die transkπptions- aktivierende Domäne von der DNA-bindenden Domäne, die in diesem Fusionsprotein durch die Spaltsequenz funktional verbunden waren Der Nachweis der spezifischen Proteasereaktion erfolgt durch die Inaktivieruπg der Gal4-Aktιvιtat Auch Dasmahapatra et al verwenden das GAL4-Reportersystem in identischer Weise durch Insertion einer autolytisch spaltendenden Protease zwischen den funktionellen Anteilen des GAL4-Reportersystems Der Verlust der Gal4-Aktιvιtat dient auch hier zum iD Nachweis der autoproteolytischen Aktivität der Insertionssequenz

Beide Verfahren sind beschrankt auf das Auffinden cytoso sch lokalisierter bzw cytosohsch spaltender Proteasen, da die beschriebenen rekombinanten Substrate bzw Fusionsproteine cytosohsch lokalisiert sind

Manche physiologischen Vorgange, aber auch einige pathologische Prozesse wie die oben bereits erwähnten neurologischen Erkrankungen basieren auf der proteolytischen Spaltung membrangebundener Substrate Die Pathologie der Alzheimerschen Erkrankung, der am häufigsten vorkommenden neurodegenerativen Erkrankung am Menschen, ist mit der proteolytischen Aktivierung des neurotoxischen Amyloid ß- peptids (Aß) assoziiert und involviert mindestens zwei proteolytische Aktivitäten, die

20 beide ein membrangebundenes Substrat voraussetzen (Haass, C and Selkoe, D J Cell, 75, 1993 1039, Selkoe, D J J Biol Chem , 271 , 18295, Citron M et al Neuron 14, 1995 661 , Tischer, E and Cordeil, B J Biol Chem , 271 , 1996 21914) Wahrend die ß-Sekretase im Lumen von Membrankompartimenten den N-Terminus generiert spaltet die γ-Sekretase den C-Terminus der Amyioiddomane (Haass, C et al Nature

- 359, 1992 325, M Shoji et al Science, 258, 1992 126, Buscigho, J et al Proc Natl Acad Sei USA, 90, 1993 2092) Auch die zwei in die Alzheimersche Pathologie involvierten homologen Presenilinproteine (PS), die wahrscheinlich die γ-Sekretase aktivieren (DeStrooper, B et al Nature, 391 , 1998 391 ), sind membrangebunden und werden durch noch unbekannte Preseni nasen und Caspasen proteolytisch prozessiert ι (Thinakaran, G et al Neuron, 17, 1996 181 , Pod sny, M et al Neurobiology of Disease, 3, 1997 325, Mercken, M et al FEBS Letters, 389, 1996 297, Tomita, T et al Proc Natl Acad Sei USA, 94, 1997 2025, Capell, A et al J Biol Chem , 273 1998 32050, Thinakaran, G et al Neurobiol Disease, 4, 1998 438, Yu, G et al J Biol Chem 273 1998 16740, Kim, T -W et al Science, 277, 1997 373, Loetscher, H et al ^ J Biol Chem 272, 1997 20655, Vito P et al J Biol Chem 272, 1997 28315 Grunberg, J et al Biochemistry, 37, 1998 2263)

Derzeit ist es mit den Methoden des Standes der Technik nicht möglich, Proteine selbst bekannter proteolytischer Aktivität von membrangebundenen Substraten zu identifizieren und isolieren Die Identifizierung solcher Proteasen, wie beispielsweise w der oben genannten γ-Sekretase, der Presenilinasen und Caspasen wurde erheblich zum molekularen Verständnis pathologischer Erkrankungen beitragen und die Entwicklung hochspezifischer Proteaseinhibitoren zur Therapie entscheidend voranbringen Die Reinigung dieser bekannten proteolytischen Aktivitäten durch konventionelle Methoden unter Verwendung loslicher Substrate ist sehr schwierig

. ι wenn nicht sogar unmöglich, da diese Proteasen membrangebundene Substrate zur Erkennung ihrer Zielsequenz (Citron M et al Neuron, 14, 1995 661 , Tischer, E and Cordeil, B J Biol Chem , 271 , 1996 219145)

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher das Bereitstellen eines Verfahrens zum Auffinden von Proteasen, die membranassoziierte Substrate spalten 0

Darstellung der Erfindung und bevorzugter Aus führungsformen

Die der Anmeldung zugrundeliegende Aufgabe konnte mit der vorliegenden Erfindung im Rahmen der Beschreibung und der Patentansprüche gelost werden, indem ein Verfahren zum Auffinden von Proteasen die membranassoziierte Substrate spalten, zur Verfugung gestellt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, daß

I ein rekombinantes Fusionsprotein, bestehend aus mindestens einem Reporteranteil und einer Proteasespaltsequenz in einem geeigneten Zellsystem expπmiert wird das mit einer Membran assoziiert und

II ein weiteres Protein in dem gleichen Zellsystem expπmiert wird, und

III das Vorhandensein des abgespaltenen Reporteraπteils nachgewiesen wird

Eine Protease im Sinne der Erfindung ist jedes Protein oder Makromolekül mit einem Peptidanteil, das in der Lage ist, Peptidbindungen zu spalten Unter einem Fusionsprotein soll der Fachmann ein Protein verstehen, das rekombinant in einem geeigneten Zellsystem expπmiert wird und mindestens zwei funktionelle Anteile aufweist, einen Reporteranteil und eine Proteasespaltsequenz Unter membranassoziierten Fusionsproteinen im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Proteine zu verstehen, die in räumlicher Nahe mit einer beliebigen Membran innerhalb der Zelle oder der Zellmembran stehen Die Membranen der Zelle und Zellorganellen bzw Zellkompartimente sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Zellbiologie bestens bekannt und werden hier nicht im einzelnen aufgezahlt

Unter einem weiteren Protein, das neben dem erfindungsgemaßen rekombinanten Fusionsprotein im gleichen Zellsystem exprimiert wird, ist im Sinne der Erfindung sowohl ein endogen vorhandenenes Protein als auch ein rekombinantes Protein oder das Fragment eines solchen endogenen oder rekombinanten Proteins zu verstehen, von dem vermutet wird, das dieses eine proteolytische Aktivität aufweist Bei der Proteasespaltsequenz handelt es sich um eine Peptidsequenz, die als durch Proteasen spaltbare Sequenz bekannt ist oder als solche vermutet wird Für die Lokalisation des rekombinanten Fusionsproteins ergeben sich drei Möglichkeiten Zum einen kann die membranassoziierte Spaltsequenz vollständig oder teilweise innnerhalb der Membran lokalisiert sein In einer bevorzugten Ausfuhrungsform umfasst die Erfindung daher Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Proteasespaltsequenz ganz oder teilweise innerhalb der Zellmembran lokalisiert ist

Neben der seltenen jedoch nicht auszuschließenden Möglichkeit, daß die membranassoziierte Spaltsequenz außerhalb der Zellmembran in das extrazellulare Medium ragt, besteht auch die Möglichkeit, daß die membranassoziierte Proteasespaltsequenz teilweise oder ganz im Zytosol lokalisiert ist Selbst ein solches membranassoziiertes Proteasesubstrat, das vollständig im Zytosol lokalisiert ist, kann bedingt durch die unmittelbare räumliche Nahe von Membranen nicht als zytosohsch, sondern muß als membranassoziiert angesehen werden, da die Zugang chkeit dieses Substrats für eine rein zytosohsch spaltende Protease räumlich in erheblichem Maße eingeschränkt ist In einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform umfasst die Erfindung daher Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Proteasespaltsequenz ganz oder teilweise innerhalb des Zytosols lokalisiert ist

Wenn weder die Proteasespaltsequenz noch der Reporteranteil, noch ein anderer Teil des Fusionproteins eine Membranassoziation ermöglichen, so kann das Fusionsprotein mit einem zusätzlichen funktionellen Ankeranteil versehen werden Daher umfasst die Erfindung in einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform auch Verfahren die dadurch gekennzeichnet sind, daß das Fusionsprotein durch einen zusatzlichen Ankeranteil in der Membran verankert ist

Es ist auch möglich, das Fusionsprotein durch eine entsprechende geeignete Spaltsequenz in der Membran zu verankern Bei membranstandigen naturlichen Proteasesubstraten ist eine solche Eigenschaft zu erwarten Beispielsweise sei hier die Spaltsequenz genannt, die durch die γ-Sekretase gespalten wird Daher umfasst die Erfindung in einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform auch Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß das Fusionsprotein durch die Proteasespaltsequenz selbst in der Membran verankert ist Das rekombinante Fusionsprotein im Sinne der Erfindung kann neben den funktionellen Anteilen wie der Spaltsequenz, der Reportersequenz und optional einer zusätzlichen Ankersequenz auch reine Abstandshalter beinhalten Bei Abstandshaltern im Sinne des Patents handelt es sich um Peptide, die funktionelle Anteile voneinander trennen beziehungsweise verbinden Ihr Nutzen besteht in der räumlichen Trennung der funktionellen Anteile, die in manchen Fallen erst das unbeeintrachtigte Ausüben deren Funktion ermöglicht Daher umfasst die Anmeldung in einer weiteren besonders bevorzugten Ausfuhrungsform Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind daß die Proteasespaltsequenz und/oder der Reporteranteil und/oder der Ankeranteil des Fusionsproteins durch einen Abstandshalter verbunden sind Auch ist es möglich, Signalsequenzen direkt bzw über einen Abstandshalter mit dem Fusionsprotein zu verbinden Ein Beispiel für eine Signalsequenz ist für Hefezellen die Hefe Invertase Signalsequenz (Moir and Dumais, Gene 56, 1987 209) Eine Signalsequenz bzw Signalanteil im Sinne der vorliegenden Erfindung dirigiert in den entsprechenden Expressionssystemen den Transport des Fusionproteins zur Membran Die vorliegende Erfindung umfasst daher in einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform Verfahren die dadurch gekennzeichnet sind daß das erfindungsgemaße rekombinante Fusionsprotein einen Signalanteil enthalt, der das erfindungsgemaße Fusionsprotein zur gewünschten Membran eines dafür geeigneten Zellsystems dirigiert

Für die Durchfuhrung des erfmdungsgemaßen Verfahrens sind Zellsysteme besonders geeignet, die keine endogenen Proteasen exprimieren, die die Proteasespaltsequenz des erfmdungsgemaßen Fusionsprotein spalten, und die ein Exprimieren des Fusionproteins und eines weiteren Proteins oder Fragments desselben sowie die Assoziation des Fusionproteins mit Membranen ermöglichen

Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Auffindung von Proteasen jeglichen Ursprungs, die membranassoziierte Substrate spalten Die Proteasen können prokaryontischen, eukaryontischen, tierischen oder pflanzlichen Ursprungs sein Für die Auffindung von therapierelevanten Proteasen in Saugern eignen sich eukaryontischen Expressionssysteme besonders gut Daher umfasst die vorliegende Erfindung in einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß das geeignete Expressionsystem ein eukaryontisches Expressionssystem ist

Ganz besonders bevorzugt sind Hefeexpressionssysteme da diese einfach handhabbar und oftmals frei von endogenen Saugetierproteasen sind Zudem stehen eine Vielzahl rekombinanter Werkzeuge für Hefe zur Verfugung In einer weiteren ganz besonders bevorzugten Ausfuhrungsform umfasst die Erfindung daher Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß das geeignete Expressionsystem ein Hefe- expressionssystem ist

Zur Realisierung der Erfindung sind auch Expressionsysteme aus Saugetierzellen oder transgenen Tieren möglich Hierbei ist jedoch besonders auf das Vorhandensein und nach Möglichkeit Inaktivieren endogener Proteasen zu achten die das Verfahren beeinflussen können Die Erfindung umfasst daher auch Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß das geeignete Expressionsystem ein Sauger- expressionssystem ist

Der Reporteranteil eines erfmdungsgemaßen Fusionsproteins kann jedes beliebige rekombinant expπmierbare Protein oder Peptid sein, dessen Freisetzung vom Fusionsprotein durch proteolytische Spaltung ein nachweisbares Signal auslost Zum einen kann der Reporteranteil dann als Protein bzw Peptid im Zytosol nachgewiesen werden, beispielsweise durch reporteranteilspezifische Antikorperbindung im Zytosol nach Abtrennung der Membranfraktion In Frage kommen aber auch alle Arten loslicher Transkriptionsfaktoren Die Freisetzung löslicher Transkriptionsfaktoren kann dann

10 nachgeschaltete Signale auslosen Geeignete transkπptionsreguherende Elemente sind dem Fachmann aus dem Stand der Technik geläufig und beinhalten Signalmolekule wie Gal4 (Laughan, A and Gesteland, R Molec Cell Biol , 4, 1984 260-267), VP16 (Goff, Stephen P et al Current Opmion in Biotechnology, 6, 1995 59-64) und LexA (siehe Goff et al ) Der Transkriptionsaktivator Gal4 eignet sich besonders gut für

'^•< Hefeexpressionssysteme Auch verkürzte aktive Formen von Gal4, wie beispielsweise Gal4-1 -147/768-881 und Gal4-1 -238/768-881 (Jun Ma und Mark Ptashne, Cell 48, 1998 847-853) sind geeignet Daher umfasst die Erfindung in einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform auch Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß der Reporteranteil des Fusionsproteins der Hefetranskπptionsaktivator Gal4 ist

-Ό Typische Reportergene, die Transkriptionsaktivatoren nachgeschaltet sind, sind CAT (Alton and Vapnek, Nature 282, 1979 864-869), Luziferase (deWet et al Mol Cell Biol , 7, 1987 725-737, Engebrecht and Silverman, PNAS 1 , 1984 4154-4158), ß- Galctosidase (siehe oben, Goff et al ) und alkalische Phosphatase (Toh et al Eur J Biochem 182, 1989, 231 -238)

Als Ankeranteil im Sinne der Erfindung kommen alle Peptidsequenzen in Frage, die mit Membranen assoziieren Hier sei besonders auf die Transmembranregionen membran- standiger Proteine verwiesen Insbesondere eignen sich Transmembraπregionen von Typ1 Transmembranregionen. Preseni n (Sherπngton et al , Nature 325 754), z B die TM1 -Domäne von Presenihn 1 , und ßAPP (Kang et al , Nature 325 733) enthalten o bevorzugte Transmembranregionen Die Erfindung umfasst daher auch Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß der Ankeranteil des Fusionsproteins die TM1 - Domane von Presenihn 1 ist

In einer ganz besonders bevorzugten Ausfuhrungsform umfasst die vorliegende Erfindung ein Fusionsprotein, das neben der zu untersuchenden Spaltsequenz als

_J Ankeranteil über die TM1 -Domäne von Presini n 1 verfugt, dessen Reporteranteil der -• Hefetranskriptionsfaktor Gal4 ist und das mit einem geeigneten Membransignalanteil verbunden ist

Dem Fachmann sind eine ganze Reihe von Techniken gelaufig, die Expression endogener Proteine in Zellsystemen zu inhibieren Bei Bedarf ist der Fachmann somit in der Lage, systemeigene unerwünschte Proteasen aus geeigneten

10 Expressionssytemen zu entfernen oder zu inaktivieren Besonders bevorzugt sind Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß das geeignete Expressionsystem keine systemeigenen Proteasen enthalt, die membranassoziierte Substrate spalten Das erfindungsgemaße Verfahren eignet sich für alle Proteasespaltsequenzen Ganz besonders bevorzugt sind Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es sich bei

7- der Proteasespaltsequenz um eine Ammosauresequenzen handelt, die von mindestens einer der folgenden Proteasen gespalten wird γ-Sekretase (Selkoe, J Biol Chem 271 , 1996 18259), NOTCH Protease (Schroeter et al Nature 393, 1998 382), Presenihn Protease (Thinakaran et al Neuron 17, 1998 181 ), Caspasen (Nicholson, D W and Thornberry, N A Trends Biochem Sei , 22,

20 1997 299)

In einer weiteren ganz besonders bevorzugten Ausfuhrungsform offenbart die vorliegende Erfindung Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Proteasespaltsequenz das humane ß amyloid precursor protein (ßAPP) oder ein Teil davon ist

2i In einer weiteren ganz besonders bevorzugten Ausfuhrungsform offenbart die vorliegende Erfindung Verfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Proteasespaltsequenz einer der in den Figuren 5 oder 6 dargestellten Teilsequenzen des humanen ß amyloid precursor protem^'s (ßAPP) entspricht Das erfindungsgemaße Verfahren ist besonders geeignet, Proteasen und deren Gene so aus Genbibhotheken zu identifizieren Sobald ein geeignetes Zellsystem mit einem geeigneten rekombinanten Fusionsprotein mit einer festgelegten Proteasespaltsequenz vorliegt, muß nur noch das weitere Gen aus einer zu untersuchenden Genbibliothek im gleichen Expressionssystem expπmiert werden Sobald der Fachmann ein geeignetes Zellsystem mit einem erfmdungsgemaßen

^ rekombinanten Fusionsprotein etabliert hat, das eine Spaltsequenz von Interesse enthalt, muß er nur noch ein weiteres Protein oder Fragment davon aus einer zu untersuchenden Genbibliothek im gleichen Expressionssystem exprimieren, um Proteine oder Teile davon mit entspechender spezifischer proteolytischer Aktivität in der zu untersuchenden Genbibliothek aufzufinden

Ganz besonders bevorzugt sind erfindungsgemaße Verfahren zur Auffindung der γ- ir Sekretase, oder der Presmi nase, oder der NOTCH-Protease, oder der Presinihn- spaltenden Caspasen aus Genbibhotheken

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die rekombinanten Fusionsproteine, die zur Ausübung der oben beschriebenen Verfahren notwendig sind i s Solche Fusionsproteine können mit einer zellularen Membran assoziieren und bestehen mindestens aus einem Reporteranteil und einer Proteasespaltsequenz Sollte ein solches rekombmantes Fusionsprotein bestehend aus einem Reporteranteil und einer Proteasespaltsequenz nicht von selbst mit den Membranen des Expressionssystems assoziieren können, so muß ein solches Fusionsprotein einen

20 zusätzlichen Membranankeranteil enthalten

Auch kann es vorteilhaft sein, die oben genannten funktionellen Anteile des erfmdungsgemaßen Fusionsproteins durch zusätzliche Abstandshalter zu trennen und so den steπschen Freiraum einzelner funktioneller Anteile zu erhohen oder deren

Loka sation in oder an der Membran zu verandern

Desweiteren kann es vorteilhaft sein, dem rekombinanten erfmdungsgemaßen

Fusionsprotein einen zusatzlichen Signalanteil zum Zweck des zielgerichteten

Transports zur Membran eines Expressionssystems hinzuzufügen

Als besonders vorteilhafte Ausfuhrungsform hat sich für Hefeexpressionssysteme das

Reportermolekul Hefetranskπptionsaktivator Gal4 bewahrt 0 Eine weitere besonders vorteilhafte Ausfuhrungsform des erfmdungsgemaßen Fusionsproteins enthalt als Ankeranteil die TM1 -Domäne von Presenihn 1 Als Signalanteil in Hefeexpressionssystemen enthalt eine besondere Ausfuhrungsform der Erfindung Fusionsproteine deren Signalanteil der Hefe Invertase (siehe oben) entnommen ist Als Proteasespaltsequenzen enthalten die erfmdungsgemaßen Fusionsproteine in einer ganz besonderen Ausfuhrungsform mindestens eine der Aminosauresequenzen, die spezifisch von der γ-Sekretase, oder der Presenihnase, oder der NOTCH-Protease, oder den Preseni n-spaltenden Caspasen gespalten werden In einer ganz besonders bevorzugten Ausfuhrungsform enthalt das erfindungsgemaße

10 Fusionsprotein als Reporteranteil den Hefetranskπptionsaktivator Gal4, als Ankeranteil die TM1 -Domäne von Presinihn 1 und eine vermutete Proteasespaltsequenz In einer ganz besonders bevorzugten Ausfuhrungsform enthalt das erfindungsgemaße Fusionsprotein als Reporteranteil den Hefetranskriptionsaktivator Gal4, die TM1 - Domane von Presinihn 1 als Ankeranteil, die Signalsequenz der Hefe Invertase als i Signalanteil und eine vermutete Proteasespaltsequenz

Bevorzugt sind rekombinante erfindungsgemaße Fusionsproteine, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Proteasespaltsequenz das humane ß amyloid precursor protein (ßAPP) oder ein Teil davon ist Besonders bevorzugt sind rekombinante erfindungsgemaße Fusionsproteine, die

20 dadurch gekennzeichnet sind, daß die Proteasespaltsequenz einer der in den Figuren 5 oder 6 dargestellten Teilsequenzen des humanen ß amyloid precursor protein ^'s (ßAPP) entspricht

Ganz besonders bevorzugt sind rekombinante erfindungsgemaße Fusionsproteine, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es eine Signalsequenz gemäß Figur 3, eine Proteasespaltsequenz mit Abstandshalter gemäß Figure 5 und einen Reporteranteil gemäß Figur 8 enthalt

Ganz besonders bevorzugt sind rekombinante erfindungsgemaße Fusionsproteine, die dadurch gekennzeichnet sind, daß es eine Signalsequenz gemäß Figur 3 eine Proteasespaltsequenz mit Abstandshalter gemäß Figure 6 und einen Reporteranteil O gemäß Figur 8 enthalt

In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines der oben beschriebenen erfmdungsgemaßen Fusionsproteine in einem der oben beschriebenen erfmdungsgemaßen Verfahren < Die Erfindung wurde beispielhaft an einem rekombinanten Fusionsprotein (ssTM1 Gal4, ss steht für Signalsequenz gemäß Figur 3, jedoch ohne Methionm am Ende, TM1 steht für die Aminosauresequenz gemäß Figur 4, Gal4 steht für die Aminosauresequenz gemäß Figur 8, zwischen TM1 und Gal4 befindet sich der Abstandshalter bzw die Klonierungsstelle gemäß Figur 7) gezeigt, bei dem der Transkriptionsaktivator Gal4 C- o terminal mit der TM1 Domäne des PS1 Gens verbunden wurde (alle hier verwendeten Gal4-Konstrukte wurden aus pCI1 (Fields S and Song O Nature, 340, 1989 245) abgeleitet und beinhalten eine Expressionskassette des Gal4-Gens, die unter der Kontrolle der ADH1 Promoter- und Terminatorsequenzen steht Diese Kassette wurde in YCplac22 (Gietz, R D und Sugmo, A Gene, 74 1988 527) emkloniert zur s Darstellung des parentalen Plasmids für ssTM1 Gal4 und dessen Derivativen Das Fusionsprotein ssTMIGal4 besteht aus der Signalsequenz der Hefe-Invertase (aa1- aa19, Moir, D T und Dumais, D R Gene, 56, 1987 209), die an den N-Terminus des humanen PS1 fusioniert wurde, der bis hm zur ersten Transmembrandomane (aa3- aa101 ) reicht und an den sich eine 3aa (RPH) Spacerregion, die über die Stul-und 0 Ndel-Restπctionstellen verfugt, sowie Hefe-Gal4 (aa1 -aa881 ) anschließt SsTM1 Gal4 wurde durch PCR-Amphfikation der korrespondierenden cDNA-kodierenden Regionen unter Verwendung von Standardklonierungstechniken hergestellt (Ausubel, F M et al Current Protokols in Molec Biol (Greene, New York, 1992) Die Fusionsproteine ssTM1 -DEVDG-Gal4 und ssTM1-DEVNG-Gal4 wurden durch Insertion hybridisierter O gonukleotide, die für DEVDG oder DEVNG kodieren, in Stul und Ndel geschnittene ssTM1 Gal4-Konstrukte hergestellt ) Zum Zweck des Diπgierens an Membranen in Hefezellen wurde eine Zielsequenz, namhch die Signalsequenz der Hefe-Invertase (Dumais und Noir siehe oben) mit dem N-Terminus der TM1 -Domäne verbunden Nach Expression in SFY526 (Es wurden Standardmethoden (Ausubel et al , siehe oben) zur o Einfuhrung der Plasmide in den Hefestamm SFY526 verwendet (MATa, ura3-52, hιs3- 200, ade2-101, Iys2-801, trp1-901, Ieu2-3, 112, can^φ, gal4-542, gal80-538, URA3 Gall- lacZ) (Bartel, P L et al BioTechniques, 14, 1993 920) sowie zur Herstellung von Proteinextrakten und ß-gal Assays ) war keine ß-Galaktosidaseaktivitat detektierbar Die Expression des gleichen, jedoch loslichen Gal4-Anteιls für sich allein führte zu

^■> einer starken ß-Galaktosidaseaktivitat Nach Fraktionierung der Hefezellen war ssTM1- Gal4 in der Membranfraktion nachweisbar Die Membranassoziation von ssTM1 -Gal4 wurde ferner durch Karbonatextraktion erbracht Die Karbonatextraktion der Membranfraktion führte nicht zur Freisetzung des Fusionsproteins SsTM1-Gal4 verhalt sich somit wie ein integrales Membranprotein Zum Nachweis der Spaltbarkeit von membranassoziierten Proteasespaltsequenzen als

10 Bestandteil von ssTM1 -Gal4 wurde ssTM1 -DEVDG-Gal4 hergestellt, ein Fusionsprotein, dessen Bestandteile ssTM1 und Gal4 durch die Proteasespaltsequenz DEVDG (Nicholson, D W and Thornberry, N A , Trends Biochem Sei , 22, 1997 299) verbunden sind DEVDG stellt eine Erkennungsstelle für Caspase-3 dar (Lazebnik Y A et al , Nature 371 , 1994 346), Femandes-Alnemri, T et al , J Biol Chem 269, 1994 i_^ 30761 , Tewari, M et al , Cell, 81 , 1995 801 , Nicholson, D W et al Nature 376, 1995 37, Nicholson, D W and Thornberry, N A , Trends Biochem Sei , 22, 1997 299) Die Expression von ssTM1 -DEVDG-Gal4 in SFY526 Hefezellen bewirkte keine ß- Galaktosidaseaktivitat Die Koexpression von humaner Caspase-3 zusammen mit ssTM1 -DEVDG-Gal4 in SFY526 Hefezellen bewirkte eine starke ß-Galaktosidase-

20 aktivitat Die Gesamt cDNA der humanen Caspase-3 (Femandes-Alnemri, T et al , J Biol Chem , 269, 1994 30761 , Tewari, M et al , Cell, 81, 1995 801 , Nicholson, D W et al , Nature, 376, 1995 37) wurde in ein pVT100-U-Deπvat (Vernet, T et al , Gene, 52, 1997 225) emkloniert, in welchem das URA3-Gen durch das LEU2-Gen ersetzt worden war In diesem Konstrukt steht die Caspase-3-Expressιon unter der Kontrolle der ADH1 i Promoter- und Terminatorsequenzen Die Aktivität der Caspase-3-Expressιon wurde durch Spaltung von in vitro-translatiertem ³⁵S Methionm-radiomarkiertem PARPC (ein C-termmal trunkiertes PARP-Deπvat) bestätigt mittels eines cytoso schen Extrakts aus Caspase-3 transformierten Hefezellen Immunoblotting mit antι-Gal4-Antιkorpern zeigte daß ssTM1-DEVDG-Gal4 ohne Koexpression als Gesamtprotein membrangebunden 0 vorliegt Die Koexpression mit Caspase-3 führte zu löslichen abgespaltenen Gal4- Anteilen Auch die 12 kDa Untereinheit der Caspase-3 war nachweisbar Zum Nachweis der Spezifitat wurde das membranassoziierte Fusionsprotein ssTM1 - DEVNG-Gal4 in Hefezellen mit Caspase-3 koexpπmiert Der Austausch der Aminosäure Aspartat in der ursprünglichen Spaltsequenz gegen Asparagin resultierte in keiner i Spaltung des Fusionsproteins und somit in keiner ß-Galaktosidaseaktivitat Die oben genannten Versuche demonstrieren deutlich, daß die Expression einer Protease, in diesem Fall humane Caspase-3, effizient die Spaltung erfmdungsgemaßer membranassoziierter Fusionsproteine und die Freisetzung der membrangebunden Signalanteile, in diesem Fall des Transkriptionsaktivators Gal4, bewirken kann Ein solches erfmdungsgemaßes Verfahren unter Verwendung der erfmdungsgemaßen ιr Konstrukte erweist sich somit als hochspezifisch und sensibel unter in-vivo Bedingungen

In zwei weiteren spezifischen Ausfuhrungsbeispielen wurden erfindungsgemaße Fusionsproteine ohne Ankeranteil in geeigneten Expresssionssystemen hergestellt Das eine Fusionsprotein, ssMC1 -55-Gal4 enthalt eine Signalsequenz (ss) gemäß Figur

'- 3, ein Methionm (M), eine Aminosauresequenz gemäß Figur 4 (C1 -55) und den Reporteranteil (Gal4) gemäß Figur 8 Das andere Fusionsprotein, ssMC1 -99-Gal4 enthält eine Signalsequenz (ss) gemäß Figur 3, ein Methionm (M), die Aminosauresequenz gemäß Figur 5 (C1 -99) und den Reporteranteil (Gal4) gemäß Figur 8 Beide Fusionsproteine assoziieren ohne zusätzlichen Ankeranteil und eignen

20 sich speziell zum Auffinden der γ-Sekretase aus Genbibhotheken, die die Proteasespaltsequenzen in Figur 5 und 6 spezifisch spaltet

Legenden zu den Figuren

Fig. 1. Schematische Darstellung des Verfahrens

Figur 1 beschreibt schematisch die Funktionsweise des erfmdungsgemaßen Verfahrens zur Identifikation von Proteasen, die membranassoziierte Proteasespaltsequenzen erkennen am Beispiel eines erfmdungsgemaßen rekombinanten Fusionsproteins (I + II

Ό + III), das ein Signalmolekül (III) und einen Membranankeranteil (I) enthalt sowie eine diese funktionellen Anteile verbindende Proteasespaltsequenz (II) Im Falle der Expression einer vermuteten Protease (V) in einem geeigneten Zellsystem ergeben sich die beiden möglichen Folgen a) oder b) für das Zellsystem a) Die vermutete Protease (V) spaltet die vorgegebene Proteasespaltsequenz (II) nicht i Der Signalanteil des Fusionsproteins bleibt mit der Membran verbunden und kann weder direkt cytosohsch nachgewiesen werden noch indirekt durch ein im Zellkern vorhandenes Reportergen (VIA/B), das durch den Signalanteil (III) in seiner Transkription beemflusst wird Das Reportergen bleibt unbeemflusst (VIIA) b) Die vermutete Protease (V) spaltet die vorgegebene Proteasespaltsequenz (II) und kann nun direkt im Cytosol (VI) nachgewiesen werden beziehungsweise indirekt durch die Beeinflussung der Transkription eines Reportergens (VIB) im Zellkern

Das Reportergen vermittelt nun eine detektierbare Veränderung der Zelle

Fig. 2. Schematische Darstellung des Wirkungsweise von ssTM1 -DEVDG- Gal4

Figur 2 beschreibt schematisch die Funktionsweise des erfmdungsgemaßen Verfahrens zur Identifikation von Proteasen In dieser speziellen Ausfuhrungsform fuhrt die Transformation von CPP32 cDNA zu zwei möglichen Reaktionsfolgen a) oder b) innerhalb des Zellsystems a) Die vermutete Protease (V) CPP 32 spaltet die vorgegebene Proteasespaltsequenz (lla) DEVN nicht (IV) Das rekombinante Fusionsprotein besteht aus dem

Transknptionsaktivator Gal4 (III), der über zwei Abstandshalter (la, lila) und der Proteasespaltsequenz (lla) mit einem Membranankeranteil (I) aus der TM1 -Domäne von Presmihnl verbunden ist, wobei I zusätzlich einen Signalanteil der Hefe-Invertase enthalt Der Signalanteil des Konstrukts bleibt mit der Membran verbunden und kann weder direkt cytosohsch nachgewiesen werden noch indirekt durch ein im Zellkern vorhandenes Reportergen (Gal1 -lacZ) Das Reportergen bleibt unbeemflusst Eine Färbung der Kolonien durch ß-Galaktosidaseaktivitat ist nicht möglich b) Die vermutete Protease (V) CPP 32 spaltet (VI) die vorgegebene Proteasespaltsequenz (DEVD Mb) und gelangt nun durch das Cytosol in den Zellkern (VIB), wo es als Transknptionsaktivator die Expression der ß-Galaktosidase und somit die Blaufärbung der Kolonien ermöglicht (VIIB) Fig. 3 Signalsequenz (Hefe Suc2p 1-19) plus Methionin

MLLQAFLFLLAGFAAKISA + M

Fig. 4 Abstandshalter und Transmembrandomäne (humanes APP₆₉₅597-651, C1 -55)

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIATVIVITLVMLKKK

Fig. 5 Abstandshaiter, Transmembrandomäne und cytosolische Domäne

(humanes APP₆₉₅597-695, C1-99)

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIATVIVITLVMLKKKQ YTSIHHGWEVDAAVTPEERHLSKMQQNGYENPTYKFFEQMQN

Fig. 6 Abstandshaiter und Transmembrandomäne (humanes Presenilin 1,

Aminosäuren 3-101 ) ELPAPLSWQNAQMSEDNHLSNTV SQ DNRERQEHNDRRSLGHPEPLSNGRP

QGNSRQVNEQDEEEDEELTLKYGAKHVTMLF VTLCMNVVVATIK

Fig. 7 Abstandshaiter mit Klonierungsstelle

RPH

Fig. 8 Signal Molekül (Hefe Gal4p 1-881)

MKLLSSIEQACDICRLKKLKCSKEKPKCAKCLKΝΝWECRYSPKTKRSPLTRAHLTEVES RLERLEQLFLLIFPREDLDMILKMDSLQDIKALLTGLFVQDΝVΝKDAVTDRLASVETDMP LTLRQHRISATSSSEESSΝKGQRQLTVSIDSAAHHDΝSTIPLDFMPRDALHGFDWSEED DMSDGLPFLKTDPΝΝΝGFFGDGSLLCILRSIGFKPEΝYTΝSΝVΝRLPTMITDRYTLASR STTSRLLQSYLΝΝFHPYCPIVHSPTLMMLYΝΝQIEIASKDQWQILFΝCILAIGAWCIEGES TDIDVFYYQΝAKSHLTSKVFESGSIILVTALHLLSRYTQWRQKTΝTSYΝFHSFSIRMAISL GLΝRDLPSSFSDSSILEQRRRIWWSVYSWEIQLSLLYGRSIQLSQΝTISFPSSVDDVQR TTTGPTIYHGIIETARLLQVFTKIYELDKTVTAEKSPICAKKCLMICΝEIEEVSRQAPKFLQ MDISTTALTΝLLKEHPWLSFTRFELKWKQLSLIIYVLRDFFTΝFTQKKSQLEQDQΝDHQ SYEVKRCSIMLSDAAQRTVMSVSSYMDΝHΝVTPYFAWΝCSYYLFΝAVLVPIKTLLSΝSK SΝAEΝΝETAQLLQQIΝTVLMLLKKLATFKIQTCEKYIQVLEEVCAPFLLSQCAIPLPHISY _^ NNSNGSAIKNIVGSATIAQYPTLPEENVNNISVKYVSPGSVGPSPVPLKSGASFSDLVKL LSNRPPSRNSPVTIPRSTPSHRSVTPFLGQQQQLQSLVPLTPSALFGGANFNQSGNIAD SSLSFTFTNSSNGPNLITTQTNSQALSQPIASSNVHDNFMNNEITASKIDDGNNSKPLSP GWTDQTAYNAFGITTGMFNTTTMDDVYNYLFDDEDTPPNPKKE

w Beispiele

Beispiel 1: Darstellung der membranassoziierten Fusionsproteine ssTM1-Gal4, ssTM1-DEVDG-Gal4, ssTM1-DEVNG-Gal4

Alle Gal4-Fusιonsproteιne leiten sich von Plasmid pCL1 (S Fields and 0 Song,

;•< Nature, 340, 245 (1989)) ab, welches das GAL4 Gen in einer Expressionskassette enthalt, die aus dem ADH1 Promoter und dem ADH1 Terminator besteht Diese Expressionskassette wurde in den Hefeexpressionsvektor Ycplac22 (R D Gietz and A Sugino, Gene, 74, 527 (1988) kloniert Das resultierende Konstrukt (Ycplac22 Gal4) ist der Ausgangsvektor für ssTM1-Gal4 und seine Derivate Das Fusionsprotein ssTM1 - 0 Gal4 besteht aus der Signalsequenz der Invertase aus Hefe (As1 -As19 (D T Moir and D R Dumais, Gene, 56, 209 (1987)) gefolgt vom N-Terminus von humanem PS1 (bis zur ersten Transmembrandomane (As3-As101 )) gefolgt von einer drei Aminosäure (RPH) langen Abstandsregion welche Restriktionschnittsteilen für Stul und Ndell enthalt, gefolgt von Hefe Gal4 (As1-As881 ) SsTM1 Gal4 wurde durch PCR 5 Amphfikation der entsprechenden cDNA Regionen mittels

Standardklonierungstechniken (F M Ausubel et al , Current Protocols in Molecular Biology (Greene, New York, 1992)) hergestellt Die Fusioπsproteme ssTM1-DEVDG- Gal4 und ssTM1-DEVNG-Gal4 wurden durch Insertion von doppelstangigen Ohgonukleotiden, die für die Aminosauresequenz DEVDG oder DEVNG kodieren, in 0 das mit Stul und Ndell geschnittenes ssTM1 -Gal4 Konstrukt hergestellt

Beispiel 2: Nachweis der Membranbindung des membranassoziierten Fusionsproteins ssTM1- Gal4 und ssTM1-DEVDG-Gal4

Standardmethoden wurden zur Fraktionierung von Hefezellen verwendet (Guthπe C & i Fmk, G R (1991 ) Guide to Yeast Gentics and Molecular Biology, Academic Press San Diego). SsTM1 -Gal4 war in der Membranfraktion nachweisbar. Die Membranassoziation von ssTM1 -Gal4 wurde ferner durch Resistenz gegen alkalische Extraktion nachgewiesen (Y. Fujiki et al., J. Cell Biol., 93, 97 (1982)).

Beispiel 3: Darstellung der humanen Caspase-3 Die cDNA der humanen Caspase-3 (T. Fernandes-Alnemri et al., J. Biol. Chem. 269, 30761 (1994); M. Tewari et al., Ce// 81 , 801 (1995); D.W. Nicholson et al., Nature 376, 37 (1995).) wurde in eine Derivat des Hefeexpressionsvektors pVT100-U (2626. T. Vernet et al., Gene 52, 225 (1997).) kloniert, in dem das URA3 Gen durch das LEU2 Gen ersetzt wurde. In diesem Konstrukt erfolgt die Expression der Caspase-3 unter der Kontrolle der ADH1 Promoter- und Terminatorsequenzen. Die Caspase-3 wird in Hefezellen in die charakteristischen Untereinheiten des proteolytisch aktiven Enzyms gespalten. Der Mechanismus der Caspase-3-Aktivierung in Hefezellen, die weder Apoptose zeigen noch Caspase-Homologe (The Yeast Genome Directory, A Supplement to Nature 387, No. 6632) enthalten, ist nicht bekannt, aber könnte durch Autoaktivierung aufgrund der Überexpression erfolgen.

Beispiel 4: Nachweis der Spaltbarkeit von ssTM1 -DEVDG-Gal4 in Caspase-3 exprimierenden SFY526 Hefezellen.

Standardmethoden (Guthrie, C. & Finkk, G.R. (1991 ) Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Academic Press, San Diego; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology ((Greene, New York, 1992) wurden angewandt um die Expressionsvektoren für Gal4, ssTM1 -Gal4, ssTM1 -DEVDG-Gal4, ssTM1 -DEVNG-Gal4 und Caspase-3 in den Hefestamm SFY526 (MATa, ura3-52, his3-200, ande2-101, Iys2- 801, trp1-901, Ieu2-3, 112, can^Θ, gal4-542 gal80-538, URA3::Gal1-lacZ) (P.L. Bartel et al.. BioTechniques 14, 920 (1993)) einzubringen. Die Preparation von Proteinextrakten und ß-gal assays folgte Standardmethoden (Gurthrie, C. & Fink, G.R. (1991 ) Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Academic Press, San Diego; F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Greene, New York, 1992).

Claims

Ansprüche

Ein Verfahren zur Identifikation von Proteasen, die membranassoziierte Substrate spalten, dadurch gekennzeichnet, daß

I ein rekombinantes Fusionsprotein, bestehend aus mindestens einem Reporteranteil und einer Proteasespaltsequenz in einem geeigneten

Zellsystem expπmiert wird, das mit einer Membran assoziiert und

II ein weiteres Protein in dem gleichen Zellsystem expπmiert wird, und

III das Vorhandensein des abgespaltenen Reporteranteils nachgwiesen wird

Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Proteasespaltsequenz ganz oder teilweise innerhalb der Zellmembran lokalisiert ist

Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß die Proteasespaltsequenz ganz oder teilweise innerhalb des Zytosols lokalisiert ist

Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Fusionsprotein durch einen zusätzlichen Ankeranteil in der Membran verankert ist

Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Fusionsprotein durch die membranassoziierte Proteasespaltsequenz in der Membran verankert ist

Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die membranassoziierte Protease-Spaltsequenz und/oder der Reporteranteil und/oder der Ankeranteil des Fusionsproteins durch einen Abstandshaiter verbunden sind

Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das erfindungsgemaße Fusionsprotein einen Signalanteil enthalt, der das Fusionsprotein zur Membran eines dafür geeigneten Zellsystems dirigiert 8 Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das geeignete Expressionsystem ein eukaryontisches Expressionssystem ist

9 Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das geeignete Expressionsystem ein Hefeexpressionssystem ist 0

10 Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das geeignete Expressionsystem ein Saugerexpressionssystem ist

1 1 Verfahren gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet daß der Reporteranteil des •> Fusionsproteins der Hefetranskπptionsaktivator Gal4 ist

12 Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4 und 6 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet daß der Ankeranteil des Fusionsproteins die TM1 -Domäne von Presenihn 1 ist

0 13 Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die zu untersuchende Spaltsequenz mit einem Ankeranteil gemäß Anspruch 12 und einem Reporteranteil gemäß Anspruch 1 1 und einem geeigneten Signalanteil verbunden ist

ι 14 Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß das geeignete Expressionsystem keine systemeigenen Proteasen enthalt, die membran^¬ assoziierte Substrate spalten

15 Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet daß es 0 sich bei der Proteasespaltsequenz um eine Aminosauresequenz handelt die von der γ-Sekretase, oder von der NOTCH Protease, oder von der Presinihn Protease oder von den Presenihn-spaltenden Caspasen gespalten wird Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 15 dadurch gekennzeichnet, daß die Proteasespaltsequenz das humane ß amyloid precursor protein (ßAPP) oder ein Teil davon ist

Verfahren gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteasespaltsequenz einer der in den Figuren 5 oder 6 dargestellten

Teilsequenzen des humanen ß amyloid precursor protein ^'s (ßAPP) ist

Verfahren gemäß einem der vorangegangen Ansprüche zur Auffindung von Proteasen, die membranassoziierte Substrate spalten und deren Gene aus Genbibhotheken

Verfahren gemäß einem der vorangegangenen Ansprüche zur Auffindung der γ- Sektretase, oder der Presmihnase, oder der NOTCH-Protease oder der Preseni n- spaltenden Caspasen aus Genbibhotheken

Ein rekombmantes Fusionsprotein, das mit einer zellularen Membran assoziieren kann und mindestens einen Reporteranteil und eine Proteasespaltsequenz enthalt

Ein rekombmantes Fusionsprotein gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß es einen zusätzlichen Membranankeranteil enthalt

Ein rekombmantes Fusionsprotein gemäß Anspruch 20 oder 21 , dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich mindestens einen Abstandshaiter zwischen den funktionellen Anteilen des Fusionsproteins enthalt

Ein rekombmantes Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 20 bis 22 dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich einen Signalanteil zum Zweck des zielgerichteten Transports zur Membran eines Expressionssystems enthalt Ein rekombmantes Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 20 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Reporteranteil der Hefetranskπptionsaktivator Gal4 ist

Ein rekombmantes Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß der Ankeranteil die TM1 -Domäne von Presinihn 1 ist

Ein rekombmantes Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 20 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß der Signalanteil die Signalsequenz der Hefe Invertase ist

Ein rekombmantes Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 20 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß es als Proteasespaltsequenz mindestens eine der Aminosauresequenzen enthalt, die spezifisch von der γ-Sekretase, oder der NOTCH Protease, oder der Presenihn Protease oder von den Presenihn-spaltenden Caspasen gespalten werden

Ein rekombmantes Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 20 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Fusionsprotein als Reporteranteil den Hefetranskriptions- aktivator Gal4, die TM1 -Domäne von Presinihn 1 als Ankeranteil, und eine vermutete Proteasespaltsequenz enthalt

Ein rekombmantes Fusionsprotein gemäß Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß ein zusätzlicher Signalanteil der Signalanteil der Hefe Invertase ist

Ein rekombmantes Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 20 bis 29, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteasespaltsequenz das humane ß amyloid precursor protein (ßAPP) oder ein Teil davon ist

Ein rekombmantes Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 20 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteasespaltsequenz einer der in den Figuren 5 oder 6 dargestellten Teilsequenzen des humanen ß amyloid precursor protem^'s (ßAPP) entspricht Ein rekombmantes Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 20 bis 31 , dadurch gekennzeichnet, daß es eine Signalsequenz gemäß Figur 3, eine Proteasespaltsequenz mit Abstandshaiter gemäß Figure 5 und einen Reporteranteil gemäß Figur 8 enthalt

Ein rekombmantes Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 20 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Signalsequenz gemäß Figur 3, eine Proteasespaltsequenz mit Abstandshaiter gemäß Figure 6 und einen Reporteranteil gemäß Figur 8 enthalt Verwendung eines Fusionsprotein gemäß einem der Ansprüche 18 bis 27 in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17