EP1165036A1 - Composition cosmetique comprenant un extrait lipidique de skeletonema - Google Patents

Composition cosmetique comprenant un extrait lipidique de skeletonema

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EP1165036A1
EP1165036A1 EP00915266A EP00915266A EP1165036A1 EP 1165036 A1 EP1165036 A1 EP 1165036A1 EP 00915266 A EP00915266 A EP 00915266A EP 00915266 A EP00915266 A EP 00915266A EP 1165036 A1 EP1165036 A1 EP 1165036A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
skin
composition according
intercellular communication
alga
extract
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00915266A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Carine Nizard
Nicolas Provost
Cécile VIRON
Valérie KRZYCH
Alex Saunois
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LVMH Recherche GIE
Original Assignee
LVMH Recherche GIE
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Filing date
Publication date
Application filed by LVMH Recherche GIE filed Critical LVMH Recherche GIE
Publication of EP1165036A1 publication Critical patent/EP1165036A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/06—Preparations for care of the skin for countering cellulitis

Definitions

  • the invention essentially relates to a cosmetic composition
  • a cosmetic composition comprising at least one substance promoting intercellular communication of skin cells, in particular keratinocytes, fibroblasts, and pre-adipocytes of the skin, in particular promoting the formation of connexin, use and cosmetic treatment process.
  • the search for means to fight against the aging of man mobilizes a large number of researchers today. This is in particular the case in the field of cosmetics where it is sought to combat, or at least slow down, the appearance of the aesthetic and physiological effects of skin aging, such as wrinkles, loss of elasticity of the skin. skin, color, etc.
  • the aging of the human species is characterized by many disorders that affect living tissue.
  • Tissue homeostasis important for the skin, is modified during aging.
  • Communicating junctions participate in the regulation of cell homeostasis, their role in maintaining the physiological balance of the skin is therefore important.
  • the inventors have highlighted an effect of aging on the functional capacity of cells to communicate with each other, in particular via communicating junctions (JC) or "gap junctions" (GJ), as well as an effect of aging on amount of connexin 43 present in cells. They have indeed demonstrated that the functional capacity of cells to communicate with each other, in particular via communicating junctions (JC) decreases with age.
  • JC Communicating junctions
  • GJ Gap Junctions
  • Connexons of one cell align end to end with those of the neighboring cell, thereby establishing a junctional channel (Goodenough, D A., Goher. JA, & Paul, DL (1996) Connexms, Connexons, and cellular communication. Annual review of biochimistry, 65, 475-502)
  • These communicating junctions (JC) allow the maintenance of cellular and tissue homeostasis.
  • Connexins are part of a family of proteins, each with tissue specificities.
  • Connexin 43 is the major protein of keratinocytes (Salomon, D., Saurat, J.-H., & P., M (1988). Cell-to-cell communication within intact human skin.
  • JC are present in all the layers of the epidermis with the exception of the stratum corneum.
  • the molecules acting on the functioning of cells can do so, either by penetrating into the cells, or without penetrating into the cells, but by attaching themselves to receptors present on the cellular plasma membrane, triggering thus a senna of reactions which will lead to the release of small molecules called "second messengers" in the cell cytoplasm.
  • second small messengers such as for example AMPc (3 ', 5'-adenosine cyclic monophosphate)
  • the inventors have shown that, surprisingly, the use of boldine, or independently, the use of lipid extracts of the Skeletonema costatum alga makes it possible to restore intercellular communication, in particular through JC and allows also increase the level of connexin 43 present in skin cells, in particular in keratinocytes, fibroblasts and pre-adipocytes.
  • the main object of the present invention is to solve the new technical problem consisting in providing a new solution for improving the effectiveness of cosmetic compositions, in particular for combating, or at least slowing down, the appearance of aesthetic effects and physiological effects of skin aging, such as wrinkles, loss of skin elasticity, color, etc.
  • this technical problem has been solved for the first time, in a surprising and not obvious manner, by the discovery that a substance which promotes intercellular communication of keratinocytes, fibroblasts and pre-adipocytes of the skin allows to provide a cosmetic composition having improved properties, in particular to combat, or at least slow down, the appearance of the aesthetic and physiological effects of skin aging, such as wrinkles, loss of elasticity of the skin, color, etc. .
  • the present invention has also made it possible to discover, unexpectedly and not evidently, that a substance promoting the formation of connexin, in particular connexin 43, makes it possible to prepare a cosmetic composition with increased effectiveness, in particular for combating, or at least slow down, the aforementioned appearance of the aesthetic and physiological effects of skin aging.
  • a lipid extract of the Skeletonema alga in particular of the Skeletonema alga costatum, in particular a total lipid extract of said alga, promotes intercellular communication through the communicating junctions of skin cells, in particular keratinocytes, fibroblasts, and pre-adipocytes of the skin, and thus makes it possible to prepare a cosmetic composition with increased effectiveness, in particular for combating or slowing down the appearance of the aesthetic and physiological effects of skin aging, or for combating adipose overloads.
  • the present invention relates to a cosmetic composition, characterized in that it comprises, as active ingredient, at least one substance which favors the intercellular communication of skin cells, in particular keratinocytes , fibroblasts, and skin preadipocytes.
  • the composition is characterized in that said substance promoting intercellular communication, promotes mtercellular communication through the communicating junctions of skin cells, in particular keratinocytes, fibroblasts, and skin pre-adipocytes.
  • the composition is characterized in that the said substance promoting intercellular communication faves the formation of connexin, in particular connexin 43.
  • the aforementioned composition is characterized in that said substance promoting cell communication comprises at least one lipid extract of the Skeletonema alga, in particular of the Skeletonema costatum alga, in particular a total lipid extract of said alga.
  • Skeletonema alga in particular Skeletonema costatum (named SKC in the remainder of the document), is a well known unicellular alga, from the phylum of Chlorophytes, of the branch of Chrysophycophytes, from the class of Diatomophycees and from the 'order of Power Plants.
  • Diatomophycees are very widespread in fresh water, manna or brackish. The life of species of this class can be planktonic or benthic. The protoplasm is enclosed in a siliceous frustule.
  • Skeletonema costatum (SKC) is a cosmopolitan species, most often manna, which is frequently found associated with phytoplanktonic bloom in coastal waters.
  • this lipid extract is characterized in that it is an extract obtained by extraction of the Skeletonema alga with an alcoholic solvent chosen from the group consisting of isopropanol, ethanol, and methanol.
  • the extraction is carried out under reflux.
  • the alga is frozen before being extracted with the alcoholic solvent, preferably freezing being performed at a temperature between - 40 ° C and - 20 ° C approximately and for a period preferably between 1 and 7 days approximately.
  • the frozen algae is immersed directly in the heated alcoholic solvent.
  • Thermal shock makes it possible to facilitate the decantation of silica (from the skeleton of algae cells)
  • the extract of the abovementioned alga is obtained after the succession of the following steps a) the alcoholic solvent is alcahnized up to a pH of between 10 and 14, preferably at a pH equal to 13, for example with an aqueous solution of sodium hydroxide or with an aqueous solution of potassium hydroxide, b) the insolubles are eliminated from the hydroalcoholic phase, c) distilled water is added to the hydro-alcoholic phase, d) the solution obtained undergoes a liquid-liquid extraction with an apolar solvent immiscible with the hydro-alcoholic phase, such as for example heptane, hexane or cyclohexane, e) the phase containing the apolar solvent is eliminated, f) the hydroalcoholic phase recovered after elimination of the phase containing the apolar solvent, is acidified to a pH between 1 and 3, preferably at a pH equal to 2, e.g.
  • the solution obtained after acidification undergoes a liquid-liquid extraction with an apolar solvent immiscible with the hydro-alcoholic phase, such as for example l heptane, hexane or cyclohexane, h) the hydro-alcoholic phase is eliminated, î) the phase containing the non-polar solvent recovered after elimination of the hydro-alcoholic phase undergoes evaporation in order to obtain an oil free of non-polar solvent , this oil being the desired extract.
  • an apolar solvent immiscible with the hydro-alcoholic phase such as for example l heptane, hexane or cyclohexane
  • the above-mentioned extract is obtained by extraction with supercritical CO 2 .
  • a maceration of the alga is carried out in the alcoholic solvent at room temperature and preferably for a period of between 5 minutes and 80 minutes approximately, and preferably again, for a period of between about 20 minutes and 40 minutes.
  • the amount of alcoholic solvent used is between 0J liter and about 20 liters of solvent, preferably between 2 liters and about 10 liters of solvent, per 100 g of algae, expressed by weight dry seaweed.
  • the extraction can be carried out under an inert atmosphere, preferably under an atmosphere saturated with nitrogen. This makes it possible in particular to avoid a pronounced oxidative degradation of the active molecules
  • the packaging of this lipid extract is preferably carried out under an inert gas such as nitrogen in order to protect the active molecules.
  • the aforementioned composition is characterized in that it comprises from 0.01% to 10% approximately, and in particular from 0.1% to 3% approximately by weight of said lipid extract of the seaweed
  • Skeletonema in particular of the Skeletonema costatum seaweed relative to the total weight of the final composition.
  • the present invention also relates to the use of at least one substance promoting the intercellular communication of keratinocytes, fibroblasts, and pre-adipocytes of the skin, as cosmetic agent, possibly in the presence of a cosmetically vehicle acceptable.
  • said substance promoting mtercellular communication promotes intercellular communication through the communicating junctions of keratinocytes, fibroblasts, and pre-adipocytes of the skin.
  • the substance promoting the cellular communication favese the formation of connexin, in particular connexin 43.
  • the substance comprises at least one lipid extract of Skeletonema seaweed, especially seaweed Skeletonema costatum, in particular a total lipid extract of said alga, in particular as previously defined.
  • this abovementioned extract is an extract obtained by liquid-liquid extraction between an alkalinized and then acidified alcohol and an apolar solvent immiscible with the hydro-alcoholic phase, such as for example heptane, hexane or cyclohexane.
  • the substance promoting intercellular communication of the skin cells is boldine, a product which corresponds to the formula below:
  • compositions of the invention which contain said boldine contain about 0.001 to 10%, advantageously 0.01 to 1%, by weight.
  • the present invention also covers a process for promoting and / or increasing the activity of a cosmetic agent acting directly in the cell or through second intracellular messengers, characterized in that it comprises the simultaneous or preliminary application to that of said cosmetic agent, on the areas of the skin concerned of a person in need thereof, of an effective amount of at least one substance promoting intercellular communication, in particular a substance promoting intercellular communication such than previously defined.
  • the present invention also covers a method of anti-aging cosmetic treatment of the skin, characterized in that it comprises the application to the areas of the skin concerned of a person in need thereof, of a effective amount of at least one substance promoting intercellular communication, to obtain an anti-aging effect on said areas of the skin, in particular for improving skin firmness, improving the elasticity of the skin, delaying the appearance of ndes or reducing their depth, in particular a substance promoting cell communication as defined above.
  • FIG. 1 shows the modulation curve of intercellular communication as a function of the age of the donors. It is obtained from keratinocytes isolated from donors of different ages by a method known as scratch-loading. The curve is expressed as a function of the ratio of the fluorescent surface to the total surface, on the ordinate, and as a function of the donor age, in years, on the abscissa. "R” is the correlation coefficient here equal to 0.76.
  • the measurements obtained with young donors are represented by solid squares with the standard deviation and the measurements noted with white circles were obtained with elderly donors, also with the standard deviation,
  • FIG. 2 also represents a modulation curve of intercellular communication as a function of the age of the donors, obtained by a micro-injection method, but this time expressed as a function of the number of cells marked with keratinocytes, on the ordinate, and as a function of the age expressed in years, on the abscissa, r still represents the correlation coefficient here equal to 0.91 and the measurements obtained with young donors being noted with black squares, with their standard deviation, while the measurements obtained with elderly donors are noted with white circles, with their standard deviation,
  • FIG. 3 represents the evolution of the rate of connexin 43 measured in keratinocytes of donors of different ages, obtained by flow cytometry, expressed as a function of the percentage of labeling on the ordinate and as a function of the age of the donors (in years), on the abscissa, with a correlation coefficient r equal here to 0.82.
  • the measurements obtained with young donors are noted with black squares with their standard deviation, and the measurements obtained with elderly donors are noted with white circles, with their standard deviation,
  • FIG. 4 represents the results of modulation of intercellular communication in normal human keratinocytes, noted KHN, in different donors treated or not with a lipid extract of l alga Skeletonema costatum, abbreviated SKC, represented in the form of histograms, expressed according to relative unit of diffusion on the ordinate, the white stick being obtained with control KHNs and the gnsé stick being obtained with KHNs treated with a lipid extract of the Skeletonema costatum alga in a proportion of 2.5 ⁇ g / ml / 24h, in vitro,
  • FIG. 5 represents the measurement by the micro-injection technique, of the modulation of intercellular communication in normal human keratinocytes (abbreviated as KH ⁇ ) in different donors treated or not with a lipid extract of the Skeletonema costatum alga, abbreviated SKC, with on the ordinate the number of labeled cells, the results with the control KH ⁇ , untreated, being shown with a white stick called "control”, and the KH ⁇ treated with a lipid extract of the alga Skeletonema costatum or SKC at the dose of 2.5 ⁇ g / ml / 24h being represented by a black stick, known as treated,
  • KH ⁇ normal human keratinocytes
  • FIG. 6 also shows a histogram, obtained from results measured in flow cytometry, of the modulation of the amount of connexin 43 relative to their respective controls of donors of different ages treated with the lipid extract of the alga Skeletonema costatum, abbreviated to SKC, at a dose of 2.5 ⁇ g / ml / 24h, with the percentage increase on the ordinate and the age of the donors, in years, on the abscissa.
  • Example I Demonstration of the decrease in the functionality of intercellular communication by Communicating Junctions (CIJC) with age and the decrease in the amount of connexin 43 with age.
  • CIJC Communicating Junctions
  • Normal human keratinocyte (KH ⁇ ) cultures are produced from skin samples.
  • the sample is initially taken 4 times in PB S (Phosphate Buffered Saline - Sigma) (50 ml tubes). It is then decontaminated by soaking it in two successive baths of 70% ethanol for 30 seconds. When the sample is decontaminated, it is placed in a petri dish containing PBS. Strips 1 mm wide are then cut, taking care to eliminate a maximum of adipose tissue and dermis. The strips are placed progressively in a petn box containing PBS.
  • PB S Phosphate Buffered Saline - Sigma
  • the strips are placed for 4 h at 37 ° C. in a 0.25% trypsin solution in PBS
  • the dermis of the epidermis is then dissociated by scraping the strips with a scalpel, the epidermal cells obtained are suspended in a tube containing DMEM medium (Dulbecco Modified Eagle Medmm - Gibco) + 10% of SVF (Fetal Calf Serum - Eurobio)
  • DMEM medium Dulbecco Modified Eagle Medmm - Gibco
  • SVF Fetal Calf Serum - Eurobio
  • the surface part consisting of cells of the stratum corneum is removed and filtered through a sieve. The filtered part is centrifuged for 5 minutes at 176 g. The pellet is taken up with KHN-D medium (DMEM + 10% FCS + hydrocortisone 0.4 ⁇ g / ml + EGF 10 ng / ml + cholenic toxin 10 -9 M).
  • the cells are counted and then seeded at 15 ⁇ 10 6 cells / bottle.
  • the medium After 24 hours of culture, the medium is changed, the cells are rinsed with PBS and the culture medium K-SFM (Gibco) is used for the rest of the culture.
  • the keratinocytes are transplanted in a completely conventional manner, but it is necessary to transplant them at 60-70% of the confluence so that they keep their capacity to proliferate.
  • the maintenance medium is eliminated and the cell carpet is rinsed with PBS.
  • the cells are placed in the presence of 3 ml of a trypsin-EDTA solution, then when the cells detach, the trypsin is inhibited by medium with 10% FCS (Eurobio).
  • FCS Eurobio
  • the cell suspension is homogenized, recovered and then centrifuged at 20 g for 5 minutes at room temperature. The pellet thus obtained is repns with medium alone.
  • the seeding is done as before at 10 6 cells / 75 cm 2 in ventilated bottles and stored under the conditions mentioned above.
  • the confluence is obtained after ten days and the cells can be amplified for 6 to 7 passages.
  • the confluence cells are rinsed with PBS (Sigma) before the addition of the dye.
  • 2 ml of 0.05% Lucifer Yellow (Sigma) diluted in PBS are deposited on the cells and the "scratch" is er at room temperature.
  • Six '"scratches” are made in 60 mm boxes.
  • the cells are left in the presence of the dye for 5 minutes, then it is removed and recovered.
  • the cells are then rinsed with PBS, in order to eliminate the excess fluorescence. They are fixed using 3% Paraformaldehyde (PFA) for 10 minutes.
  • PFA Paraformaldehyde
  • the boxes are observed using an inverted fluorescence microscope equipped with a camera which allows the acquisition of images.
  • Six or eight photos are taken for each box and are then analyzed with image analysis software (Perfectimage, Iconix).
  • image analysis software Perfectimage, Iconix
  • the computer calculates and gives the ratio of the surfaces: Fluorescent surface / Total surface. The higher the ratio, the greater the capacity of the cells to communicate with each other.
  • the preparation of the cells is similar to that used by the scratch-loading technique or in English "scrape-loading"
  • Lucifer Yellow (10% in 0.33 M LiCl) is injected directly into a cell, only using a capillary connected to a micromanipulator (Leitz).
  • the injection is controlled by a m j ector automatic (Tranjector 5246, Eppendorf), and lasts 1 second with an intensity of 10335 HPa.
  • the injections are made under an inverted microscope (20X) in phase contrast (Leica microscope, Fluovert FU) Twenty injections are carried out in a 60 mm petn dish After fixing the cells with 3% paraformaldehyde, the cells are rinsed with PBS The observation and the counting of the number of labeled cells are then carried out
  • I 1 4- Flow rate When the confluence is reached, the culture medium is removed and the cells are rinsed 2 times with PBS buffer. Then, they are trypsinized using a mixture of 0% trypsin and 0.02% EDTA. The trypsin inhibition is carried out with culture medium adding 10% of FCS. A count of the number of cells to be had, in order to adjust this to 10 cells per tube. The cell suspension is centrifuged at 176 g for 5 minutes and the pellet is taken up in 100 ml of PBS. Cells are fixed with 3% PFA for 25 minutes at 4 ° C. To remove the PFA, the cells are again centrifuged at 176 g for 5 minutes and rinsed twice in PBS.
  • the buffer in which the antibodies are prepared, consists of PBS, 1% FCS and 0.2% saponin (Sigma), a detergent which induces microporation of the membrane, but which does not damage the cell. This detergent is used to keep intact and to quantify the intracytoplasmic connexin 43 but also transmembrane (Personal communication, R. Mouawad, Hôpital Salgestnere - Pans)
  • the primary antibody used is the anti-connexin 43 (Zymed, monoclonal AC made in the souns).
  • the concentration of the primary antibody should be 1.3 ⁇ g / ml (l / 750 th ).
  • the incubation is 45 minutes at 4 ° C.
  • the cells are centrifuged and incubated with the buffer used for the preparation of the antibodies (PBS, saponin and SVF). They are then placed in the presence of the secondary anti-sun antibody coupled to fluorescein. at the dilution of l / 50 th (Jackson Immunotech). After incubation with the second antibody, the cells are centrifuged and nnc dires, then repnses in 1 ml of buffer (PBS, saponin, SVF)
  • the fluorescence intensity is measured in the KHNs treated as above and in KHNs which have not been put in the presence of the secondary anti-sun antibody coupled to fluorescein, with a flow cytometer (Epies profile II from COULTRONIC), the measurements are processed and compared by software (Phoenix flow system soft from COULTRONIC), which gives us a value measured in an arbitrary unit given by the machine, which we call: marking rate of the Connexin 43 in KHN, which reflects the amount of Connexin 43 per KHN (on average).
  • Connexin 43 labeling rate in KHN measured in keratinocytes of donors of different ages.
  • Table III and FIG. 3 show a decrease in the rate of connexin 43 as a function of age, the amount of connexin 43 appearing to be inversely proportional to the age of the donors.
  • the correlation coefficient is 0.82.
  • the inventors have therefore shown the advantage of using substances which promote intercellular communication, in particular through JC, to combat the signs of skin aging, in particular to slow their appearance. They have therefore developed a new way to fight against skin aging, in particular against wrinkles and loss of elasticity of the skin.
  • Example II Obtaining lipid extracts from the Skeletonema costatum alga.
  • the amount of solvent used is 10 liters of API for 1 liter of water contained in the biomass.
  • the 250 kg of biomass represent an amount of dry matter of 75 kg and 175 kg of water.
  • the amount of API engaged here is
  • biomass + IPA The whole (biomass + IPA) is brought to reflux for half an hour with stirring at approximately 80 ° C., before being cooled to around 50 ° C.
  • the extract is transferred to a GUEDU type filter in order to carry out the spent biomass / lipid extract separation under IPA.
  • the yield relative to the dry weight of this first step is 28% in crude oil.
  • the lipid extract is taken up in cold 1TPA at the rate of 10 kg of solvent per 1 kg of oil. Agitation is continued for 20 minutes. The juice is then filtered (this eliminates the sticky residual mud).
  • the bleaching and deodorization treatment is carried out in two batches in an 80 liter schott reactor and lasts 30 minutes at room temperature.
  • the amount of zeolite (ABSENT 2000, supplier UOP) added is 0.94 kg and that of activated carbon (CXV, supplier CECA) is 1.6 kg.
  • the carbon to zeolite ratio is 1.7.
  • the zeolite and the charcoal are then removed by filtration on paper.
  • the yield relative to the dry weight of this second step is 37%.
  • the overall oil yield for the whole process is 10% relative to the dry weight of biomass Antioxidants (DL ⁇ -tocopherol at 0.05% final by weight and ascorbyl palmitate at 0.05 % final by weight) are incorporated by a solution
  • the extraction begins with a dispersion of 49.8 kg of frozen plant biomass at 29% by dry mass in 539 kg of ethanol at 96%, alkalized with 9 kg of aqueous sodium solution at 30.5% After maceration of 30 minutes at 40 ° C under reflux and under a nitrogen atmosphere, the whole is cooled to 18 ° C. The insolubles are then separated by wringing under nitrogen and are eliminated.
  • the 756 kg of solution relating to the above-mentioned hypophase are acidified by adding 2.8 kg of sulfuric acid to obtain a pH of 2.2. The whole is stirred for 10 minutes under nitrogen and then faces 158 kg of heptane. The free fatty acids are extracted from the 147 kg constituting the first heptanic epiphase of this new liquid / liquid partition. The operation is repeated five more times to recover a total of 697 kg of heptanic phase. This phase evaporated to dryness on a rotary evaporator and then by molecular distillation provides the active extract, ie an amount representing 1J kg of oil. The oil produced is liquid, homogeneous and has a dark yellow color.
  • This oil will be named below: the lipid extract E2 from SKC.
  • Example III Evaluation of the Effect of a Lipid Extract from the SKC Alga on Intercellular Communication by Communicating Junctions (CIJC) and the rate of Connexin 43 on KHN of elderly donors.
  • the lipid extract of the SKC alga used in this example is the lipid extract E2 of SKC obtained according to the ethanol extraction process described above.
  • Example I Normal Human Keratinocytes obtained according to the protocol described in Example I (1.1.1 - Culture of Normal Human Keratinocytes). Unlike the controls, the KHNs treated with the lipid extract El or E2 of SKC (at the time when the culture is in confluence) are brought into contact with an amount "x" of said extract expressed in ⁇ g per milliliter of culture and for 24 hours (x ⁇ g / ml / 24 hours) before undergoing evaluations carried out with the Scratch-Loading, Micro-injections or Flow Cytometry techniques, according to the protocols described in Example I (respectively 1.1.2, 1.1.3, 1.1.4).
  • R is the ratio of the fluorescent surface to the total surface.
  • the lipid extracts of SKC therefore induce a restoration of the CIJC of the cells of elderly donors approximately at the level of the CIJC of the cells of young donors.
  • SKC lipid extracts increase the amount of connexin 43.
  • the inventors have therefore developed a new means for combating skin aging, in particular against wrinkles and loss of elasticity of the skin.
  • results obtained above show the advantage of using lipid extracts of the Skeletonema costatum alga in cosmetic compositions to promote and / or increase the activity of other cosmetic agents acting directly in the cell or via second intracellular messengers, and present or not, in the same cosmetic composition as the lipid extracts of SKC.
  • the concentrations used are: 12.5, 25, 50, 100 and 200 mM.
  • the incubations are 24 hours in the culture medium.
  • the table below summarizes the measured diffusion surface values.
  • Example VI Emulsion-gel for the face, anti-wrinkle
  • Example VIII Emulsion-gel for the face, anti-wrinkle

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Abstract

La présente invention a pour objet: des compositions cosmétiques comprenant, à titre d'ingrédient actif, au moins une substance favorisant la communication intercellulaire des cellules de la peau, en particulier des kératinocytes, des fibroblastes, et des pré-adipocytes de la peau; l'utilisation d'au moins une substance favorisant la communication intercellulaire des kératinocytes, des fibroblastes, et des pré-adipocytes de la peau, comme agent cosmétique, éventuellement en présence d'un véhicule cosmétiquement acceptable; un procédé pour favoriser et/ou augmenter l'activité d'un agent cosmétique agissant directement dans la cellule ou par l'intermédiaire de seconds messagers intracellulaires, et un procédé de traitement cosmétique anti-vieillissement de la peau.

Description

COMPOSIΗON COSMEΗQUE COMPRENANT UN EXTRAIT LIPIDIQUE DE SKELETONEMA
L'invention concerne essentiellement une composition cosmétique comprenant au moins une substance favorisant la communication intercellulaire des cellules de la peau, en particulier des keratinocytes, des fibroblastes, et des pré-adipocytes de la peau, en particulier favorisant la formation de connexine, utilisation et procédé de traitement cosmétique. La recherche de moyens de lutte contre le vieillissement de l'homme mobilise de nos jours un grand nombre de chercheurs. C'est en particulier le cas dans le domaine de la cosmétique où l'on cherche à lutter contre, ou au moins à ralentir, l'apparition des effets esthétiques et physiologiques du vieillissement cutané, tels que rides, perte d'élasticité de la peau, de couleur etc.. Le vieillissement de l'espèce humaine est caractérisé par de nombreux troubles qui touchent les tissus vivants. Les marques de ce processus naturel sont aisément décelables sur un organe tel que la peau (Montagna, W., & Carlisle, K. (1990). Structural changes in ageing skin. British journal of dermatology, 122 (35), 61-70). Le vieillissement de la peau est une conjonction de deux phénomènes, un processus cellulaire intrinsèque (génétique) associé au vieillissement dit extrinsèque qui regroupe les agressions de l'environnement (Grove, G. L. (1989). Physiologie changes in older skin. Clinics in gériatrie medicine, 5(1), 115-125). Les effets de la sénescence sur le tissu cutané sont visibles principalement par la formation des rides. Celles-ci sont le reflet des changements importants qui ont lieu dans le derme et l'epiderme. L'homéostasie tissulaire, importante pour la peau, est modifiée au cours du vieillissement. Les jonctions communicantes participent à la régulation de l'homéostasie de la cellule, leur rôle dans le maintien de l'équilibre physiologique de la peau est donc important. Les inventeurs ont mis en évidence un effet du vieillissement sur la capacité fonctionnelle des cellules à communiquer entre elles, notamment par l'intermédiaire des jonctions communicantes (JC) ou « gap junctions » (GJ), ainsi qu'un effet du vieillissement sur la quantité de connexine 43 présente dans les cellules. Ils ont en effet démontré que capacité fonctionnelle des cellules à communiquer entre elles, notamment par l'intermédiaire des jonctions communicantes (JC) diminue avec l'âge. Ils ont également démontré que la quantité de connexine 43 diminue avec l'âge Les inventeurs ont donc montré l'intérêt d'utiliser des substances favorisant la communication mtercellulaire, notamment a travers les JC, pour lutter contre les signes du vieillissement cutané, en particulier pour ralentir leur apparition. Il s'agit là d'un nouveau moyen pour lutter contre le vieillissement cutané, en particulier contre les πdes et la perte d'élasticité de la peau.
Les jonctions communicantes (JC) ou Gap Junctions (GJ), sont des structures protéiques transmembranaires permettant le passage de petites molécules (<1000 Da) entre deux cellules (Watt, F M (1991). Intercellular communication via gap junctions In L. A Goldsmith (Eds ), Physiology, biochemistry, molecular biology of the skin (pp 857-859) New York Oxford Oxford university press) Ces structures hexameπques sont appelées connexons qui sont eux mêmes formes de connexines
Lorsqu'un contact intercellulaire est établi, les connexons d'une cellule s'alignent bout à bout avec ceux de la cellule voisine, établissant ainsi un canal jonctionnel (Goodenough, D A., Goher. J. A., & Paul, D. L. (1996). Connexms, connexons, and cellular communication. Annual review of biochimistry, 65, 475- 502) Ces jonctions communicantes (JC) permettent le maintien de l'homéostasie cellulaire et tissulaire. Les connexines font partie d'une famille de protéines ayant chacune des spécificités tissulaires. La connexine 43 est la protéine majoritaire des keratinocytes (Salomon, D., Saurat, J.-H., & P., M (1988). Cell-to-cell communication within intact human skin. Journal of clmical investigation, 82, 248-254). Dans la peau, les JC sont présentes dans toutes les couches de l'epiderme à l'exception de la couche cornée. D'autre part, il est connu que les molécules agissant sur le fonctionnement des cellules peuvent le faire, soit en pénétrant dans les cellules, soit sans pénétrer dans les cellules, mais en se fixant à des récepteurs présents sur la membrane plasmique cellulaire, déclenchant ainsi une séné de réactions qui aboutirons à la libération de petites molécules appelées « seconds messagers » dans le cytoplasme cellulaire. Ces seconds messagers de petite taille, tel que par exemple l'AMPc (3',5'-adénosιne monophosphate cyclique), circulent d'une cellule à l'autre à travers les JC, transmettant ainsi l'information d'une cellule à l'autre. Il en est de même pour les molécules de petites tailles pénétrant dans les cellules, et capables de circuler d'une cellule à l'autre à travers les JC. Ainsi, en augmentant la communication mtercellulaire, notamment à travers les JC, les inventeurs ont mis au point un nouveau moyen pour favoriser et/ou augmenter l'activité d'un agent cosmétique.
De plus, les inventeurs ont montré que, de manière surprenante, l'utilisation de la boldine, ou indépendamment, l'utilisation d'extraits lipidiques de l'algue Skeletonema costatum permet de restaurer la communication intercellulaire, notamment à travers les JC et permet également d'augmenter le taux de connexine 43 présente dans les cellules de la peau, notamment dans les keratinocytes, les fibroblastes et des pré-adipocytes.
Ainsi, la présente invention a pour but principal de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une nouvelle solution pour améliorer l'efficacité des compositions cosmétiques, en particulier pour lutter, ou au moins ralentir, l'apparition des effets esthétiques et physiologiques du vieillissement cutané, tels que rides, perte d'élasticité de la peau, de couleur, etc..
Selon la présente invention, ce problème technique a été résolu pour la première fois, d'une manière surprenante et non évidente, par la découverte qu'une substance favorisant la communication intercellulaire des keratinocytes, des fibroblastes et des pré-adipocytes de la peau permet de fournir une composition cosmétique ayant des propriétés améliorées, en particulier pour lutter contre, ou au moins ralentir, l'apparition des effets esthétiques et physiologiques du vieillissement cutané, tels que rides, perte d'élasticité de la peau, de couleur, etc..
D'autre part, la présente invention a permis de découvrir également de manière inattendue et non évidente qu'une substance favorisant la formation de connexine, en particulier de connexine 43, permet de préparer une composition cosmétique à efficacité accrue, en particulier pour lutter, ou au moins ralentir, l'apparition précitée des effets esthétiques et physiologiques du vieillissement cutané.
Il a encore été découvert, selon la présente invention, de manière inattendue et non évidente, d'une part que la boldine et d'autre part, indépendamment, qu'un extrait lipidique de l'algue Skeletonema, notamment de l'algue Skeletonema costatum, en particulier un extrait lipidique total de ladite algue, favorise la communication intercellulaire à travers les jonctions communiquantes des cellules de la peau, en particulier des keratinocytes, des fibroblastes, et des pré-adipocytes de la peau, et permet ainsi de préparer une composition cosmétique à efficacité accrue, en particulier pour lutter contre ou ralentir l'apparition des effets esthétiques et physiologiques du vieillissement cutané, ou pour lutter contre les surcharges adipeuses. Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention est relative à une composition cosmétique, caracténsée en ce qu'elle comprend, à titre d'ingrédient actif, au moins une substance favoπsant la communication intercellulaire des cellules de la peau, en particulier des keratinocytes, des fibroblastes, et des pré- adipocytes de la peau.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la composition est caracténsée en ce que ladite substance favorisant la communication intercellulaire, favorise la communication mtercellulaire à travers les jonctions communicantes des cellules de la peau, en particulier des keratinocytes, des fibroblastes, et des pré-adipocytes de la peau.
Selon un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, la composition est caractérisée en ce que ladite substance favorisant la communication intercellulaire, favonse la formation de connexine, en particulier de connexine 43. Selon encore un autre mode de réalisation avantageux de l'invention, la composition précitée est caractérisée en ce que ladite substance favonsant la communication mtercellulaire comprend au moins un extrait lipidique de l'algue Skeletonema, notamment de l'algue Skeletonema costatum, en particulier un extrait lipidique total de ladite algue. II est rappelé que l'algue Skeletonema, en particulier Skeletonema costatum (nommée SKC dans la suite du document), est une algue unicellulaire bien connue, du phylum des Chlorophytes, de l'embranchement des Chrysophycophytes, de la classe des Diatomophycees et de l'ordre des Centrales. Les Diatomophycees sont très répandues dans les eaux douces, mannes ou saumâtres. La vie des espèces de cette classe peut être planctonique ou benthique. Le protoplasme est enfermé dans un frustule siliceux. Skeletonema costatum (SKC) est une espèce cosmopolite le plus souvent manne, que l'on trouve fréquemment associée aux efflorescences phytoplanctoniques des eaux côtières.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, cet extrait lipidique est caracténsé en ce qu'il s'agit d'un extrait obtenu par extraction de l'algue Skeletonema avec un solvant alcoolique choisi parmi le groupe consistant de l'isopropanol, de l'éthanol, et du méthanol.
Selon encore une vanante de réalisation avantageuse, l'extraction est réalisée sous reflux. Selon encore une variante de réalisation avantageuse, l'algue est congelée avant d'être extraite avec le solvant alcoolique, de préférence la congélation étant réalisée a une température située entre - 40°C et - 20°C environ et pendant une durée compnse de préférence entre 1 et 7 jours environ.
Selon encore une vanante de réalisation avantageuse, l'algue congelée est plongée directement dans le solvant alcoolique chauffé. Le choc thermique permet en effet de faciliter la décantation de la silice (issue du squelette des cellules des algues)
Selon encore une vanante de réalisation avantageuse, dans le cas d'une extraction avec un alcool alcahnisé, l'extrait de l'algue précité est obtenu après la succession des étapes suivantes a) le solvant alcoolique est alcahnisé jusqu'à un pH compris entre 10 et 14, de préférence a un pH égal a 13, par exemple avec une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium ou avec une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium, b) les insolubles sont élimines de la phase hydro-alcoolique, c) de l'eau distillée est ajoutée à la phase hydro-alcoolique, d) la solution obtenue subit une extraction liquide-liquide avec un solvant apolaire non miscible avec la phase hydro-alcoolique, tel que par exemple l'heptane, l'hexane ou le cyclohexane, e) la phase contenant le solvant apolaire est éliminée, f) la phase hydro-alcoolique récupérée après élimination de la phase contenant le solvant apolaire, est acidifiée jusqu'à un pH compris entre 1 et 3, de préférence a un pH égal à 2, par exemple avec une solution aqueuse d'acide sulfunque ou avec une solution aqueuse d'acide chlorhydnque, g) la solution obtenue après acidification subit une extraction liquide- liquide avec un solvant apolaire non miscible avec la phase hydro- alcoolique, tel que par exemple l'heptane, l'hexane ou le cyclohexane, h) la phase hydro-alcoolique est éliminée, î) la phase contenant le solvant apolaire récupérée après élimination de la phase hydro-alcoolique subit une évaporation afin d'obtenir une huile exempte de solvant apolaire, cette huile étant l'extrait recherché.
L'emploi d'un alcool alcahnisé, puis acidifié permet d'obtenir un extrait aux caractenstiques visuelles et olfactives acceptables dans des compositions cosmétiques (couleur jaune, et odeur acceptable). Selon encore une variante de réalisation avantageuse, l'extrait précité est obtenu par extraction au CO2 supercritique.
Selon encore une autre vanante de réalisation avantageuse, avant toute autre opération d'extraction, on réalise une macération de l'algue dans le solvant alcoolique à température ambiante et de préférence pendant une durée comprise entre 5 minutes et 80 minutes environ, et de préférence encore, pendant une durée comprise entre 20 minutes et 40 minutes environ.
Selon encore une autre variante de réalisation avantageuse, la quantité de solvant alcoolique utilisée est compnse entre 0J litre et 20 litres environ de solvant, de préférence comprise entre 2 litres et 10 litres environ de solvant, pour 100 g d'algue, exprimés en poids sec d'algue.
Selon encore une autre variante de réalisation avantageuse, l'extraction peut-être réalisée sous atmosphère inerte, de préférence sous atmosphère saturée en azote. Ceci permet d'éviter en particulier une dégradation oxydative prononcée des molécules actives
Le conditionnement de cet extrait lipidique est réalise de préférence sous gaz inerte tel que de l'azote afin de protéger les molécules actives.
Selon encore une autre variante de réalisation avantageuse, la composition précité est caractérisée en ce qu'elle comprend de 0,01% à 10% environ, et en particulier de 0,1% à 3% environ en poids dudit extrait lipidique de l'algue
Skeletonema, notamment de l'algue Skeletonema costatum par rapport au poids total de la composition finale.
Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne aussi l'utilisation d'au moins une substance favonsant la communication intercellulaire des keratinocytes, des fibroblastes, et des pré-adipocytes de la peau, comme agent cosmétique, éventuellement en présence d'un véhicule cosmétiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation particulier de l'utilisation, celle-ci est caractérisée en ce que ladite substance favorisant la communication mtercellulaire, favorise la communication intercellulaire à travers les jonctions communicantes des keratinocytes, des fibroblastes, et des pré-adipocytes de la peau.
Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, la substance favonsant la communication mtercellulaire favonse la formation de connexine, en particulier de connexine 43. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la substance comprend au moins un extrait lipidique de l'algue Skeletonema, notamment de l'algue Skeletonema costatum, en particulier un extrait lipidique total de ladite algue, notamment tel que précédemment défini. Avantageusement, cet extrait précité est un extrait obtenu par extraction liquide-liquide entre un alcool alcahnisé puis acidifié et un solvant apolaire non miscible avec la phase hydro-alcoolique, tel que par exemple l'heptane, l'hexane ou le cyclohexane.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la substance favorisant la communication intercellulaire des cellules de la peau est la boldine, produit qui répond à la formule ci-dessous :
avantageusement les compositions de l'invention qui renferment ladite boldine, en renferment à raison d'environ 0,001 à 10 %, avantageusement 0,01 à 1 %, en poids.
Selon un troisième aspect, la présente invention couvre aussi un procédé pour favonser et/ou augmenter l'activité d'un agent cosmétique agissant directement dans la cellule ou par l'intermédiaire de seconds messagers intracellulaires, caractérisé en ce qu'il comprend l'application simultanée ou préliminaire à celle dudit agent cosmétique, sur les zones de la peau concernée d'une personne en ayant besoin, d'une quantité efficace d'au moins une substance favorisant la communication intercellulaire, en particulier une substance favorisant la communication intercellulaire telle que précédemment définie.
Selon un quatnème aspect, la présente invention couvre aussi un procédé de traitement cosmétique anti-vieillissement de la peau, caracténsé en ce qu'il comprend l'application sur les zones de la peau concernée d'une personne en ayant besoin, d'une quantité efficace d'au moins une substance favonsant la communication intercellulaire, pour obtenir un effet anti-vieillissement sur lesdites zones de la peau, notamment pour améliorer la fermeté cutanée, améliorer l'élasticité de la peau, retarder l'apparition des ndes ou diminuer leur profondeur, en particulier une substance favorisant la communication mtercellulaire telle que précédemment définie. Les exemples qui suivent sont donnés à titre purement îllustratif de l'invention, en référence aux dessins annexes dans lesquels .
- la figure 1 représente la courbe de modulation de la communication intercellulaire en fonction de l'âge des donneurs. Elle est obtenue à partir de keratinocytes isolés chez des donneurs d'âges différents par une méthode dite d'égratignure-chargement La courbe est expnmee en fonction du rapport de la surface fluorescente sur la surface totale, en ordonnée, et en fonction de l'âge des donneurs, en années, en abscisse. « r » est le coefficient de corrélation ici égal à 0,76. Les mesures obtenues avec des donneurs jeunes sont représentées par des carrés pleins avec l'écart type et les mesures notées avec des cercles blancs ont été obtenues sur des donneurs âgés, avec également l'écart type,
Cette figure est a lire en relation avec le tableau I (Exemple I),
- de même, la figure 2 représente encore une courbe de modulation de la communication intercellulaire en fonction de l'âge des donneurs, obtenue par une méthode de micro-injection, mais cette fois ci exprimée en fonction du nombre de cellules marquées de keratinocytes, en ordonnée, et en fonction de l'âge expnmé en années, en abscisse, r représente encore le coefficient de corrélation ici égal à 0,91 et les mesures obtenues avec les donneurs jeunes étant notées avec des carrés noirs, avec leur écart type, tandis que les mesures obtenues avec les donneurs âgées sont notées avec des cercles blancs, avec leur écart type,
Cette figure est à lire en relation avec le tableau II (Exemple I),
- la figure 3 représente l'évolution du taux de connexine 43 mesure chez des keratinocytes de donneurs d'âges différents, obtenu en cytométπe en flux, exprime en fonction du pourcentage de marquage en ordonnée et en fonction de l'âge des donneurs (en années), en abscisse, avec un coefficient de corrélation r égal ici à 0,82. Les mesures obtenues avec les donneurs jeunes sont notées avec des carrés noirs avec leur écart type, et les mesures obtenues avec des donneurs âgées sont notées avec des cercles blancs, avec leur écart type,
Cette figure est à lire en relation avec le tableau III (Exemple I), - la figure 4 représente les résultats de modulation de la communication intercellulaire chez des keratinocytes humains normaux, notés KHN, chez différents donneurs traités ou non avec un extrait lipidique de l'algue Skeletonema costatum, en abrégé SKC, représentés sous forme d'histogrammes, expnmés en fonction d'unité relative de diffusion en ordonnée, le bâton blanc étant obtenu avec des KHN témoins et le bâton gnsé étant obtenu avec des KHN traités avec un extrait lipidique de l'algue Skeletonema costatum à une proportion de 2,5 μg/ml/24h, in vitro,
Cette figure est à lire en relation avec le tableau NI (Exemple III),
- la figure 5 représente la mesure par la technique de micro-injection, de la modulation de la communication intercellulaire chez des keratinocytes humains normaux (en abrège KHΝ) chez différents donneurs traités ou non avec un extrait lipidique de l'algue Skeletonema costatum, en abrégé SKC, avec en ordonnée le nombre de cellules marquées, les résultats avec les KHΝ témoins, non traités, étant montrés avec un bâton blanc dit "témoin", et les KHΝ traités avec un extrait lipidique de l'algue Skeletonema costatum ou SKC à la dose de 2,5 μg/ml/24h étant représentés par un bâton noir, dite traités,
Cette figure est à lire en relation avec le tableau V (Exemple III),
- la figure 6 représente encore un histogramme, obtenu à partir de résultats mesurés en cytometπe en flux, de la modulation de la quantité de connexine 43 par rapport a leurs témoins respectifs de donneurs d'âges différents traités avec l'extrait lipidique de l'algue Skeletonema costatum, en abrégé SKC, à la dose de 2,5 μg/ml/24h, avec en ordonnée le pourcentage d'augmentation par rapport à leurs témoins respectifs, et en abscisse l'âge des donneurs, en années.
Cette figure est à lire en relation avec le tableau VI (Exemple III), D'autres avantages de l'invention apparaîtront au vu de la description et des exemples qui suivent.
Sauf indications contraires, les proportions données dans les exemples de compositions sont exprimés en pourcentage en poids
Exemple I - Mise en évidence de la diminution de la fonctionnalité de la communication intercellulaire par Jonctions Communicantes (CIJC) avec l'âge et de la diminution de la quantité de connexine 43 avec l'âge.
IJ- Matériel et méthodes
I 1 1 - Culture de keratinocytes humains normaux
Les cultures de keratinocytes humains normaux (KHΝ) sont réalisées à partir de prélèvements de peau.
Le prélèvement est dans un premier temps nncé 4 fois dans du PB S (Phosphate Buffered Saline - Sigma) (tubes 50 ml). Il est ensuite décontaminé en le trempant dans deux bains successifs d'éthanol à 70% pendant 30 secondes. Lorsque le prélèvement est décontamine, il est placé dans une boîte de pétri contenant du PBS. On découpe alors des bandelettes de 1 mm de largeur en prenant soin d'éliminer un maximum de tissu adipeux et de derme Les bandelettes sont placées au fur et a mesure dans une boîte de petn contenant du PBS.
Pour pouvoir récupérer les keratinocytes de l'epiderme, on place les bandelettes pendant 4h à 37°C dans une solution de trypsine a 0,25% dans du PBS
On dissocie ensuite le derme de l'epiderme par grattage des bandelettes au scalpel, les cellules épidermiques obtenues sont mises en suspension dans un tube contenant du milieu DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medmm - Gibco) + 10% de SVF (Sérum de Veau Foetal - Eurobio) Apres homogénéisation de la suspension, on élimine la partie superficielle constituée de cellules de la couche cornée et on filtre sur un tamis. La partie filtrée est centrifugée pendant 5 minutes à 176 g. Le culot est repris avec du milieu KHN-D (DMEM + 10% SVF + hydrocortisone 0,4 μg/ml + EGF 10 ng/ml + toxine cholénque 10-9M). Les cellules sont comptées puis ensemencées à 15xl06 cellules/flacon.
Apres 24h de culture, le milieu est changé, les cellules sont rincées avec du PBS et on utilise pour la suite de la culture du milieu de prolifération K-SFM (Gibco).
Les keratinocytes se repiquent de manière tout à fait classique, mais il est nécessaire de les repiquer à 60-70% de la confluence pour qu'ils gardent leurs capacités à proliférer. Ainsi, lorsque les cellules sont à 60-70% de la confluence, le milieu d'entretien est éliminé et le tapis cellulaire est rincé avec du PBS. Les cellules sont mises en présence de 3 ml d'une solution de trypsine-EDTA, puis lorsque les cellules se détachent, la trypsine est inhibée par du milieu avec 10% de SVF (Eurobio). La suspension cellulaire est homogénéisée, récupérée puis centrifugée à 20 g pendant 5 minutes à température ambiante. Le culot ainsi obtenu est repns avec du milieu seul. Pour l'entretien, l'ensemencement se fait comme précédemment à 106 cellules/75 cm2 dans des flacons ventilés et conservés dans les conditions citées plus haut. La confluence est obtenue au bout d'une dizaine de jours et les cellules peuvent être amplifiées pendant 6 à 7 passages.
Dans le cas où l'on souhaite tester l'activité d'une substance sur ces keratinocytes, on effectuera les test à partir du milieu de culture avec keratinocytes, au moment de la confluence déente ci-dessus. 1.1 2- Egratignure-Chargement ou en anglais " Scrape loadmg"
Cette technique a été développée en 1987 par l'équipe de Trosko (El-Fouly, M. H., Trosko, J. E , & Chang, C.-C. (1987). Scrape loading and dye transfert a rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Expérimental cell research, 168, 422-430). Elle repose sur l'utilisation d'un colorant, le Jaune de Lucifer (Lucifer Yellow - Sigma) de Poids Moléculaire (PM) = 457,2. Cette molécule (un aminophta mide) est hautement fluorescente et ne diffuse qu'à travers les jonctions communicantes. Cette molécule ne passe pas a travers la membrane plasmique de cellules intactes. La couche cellulaire est lésée à l'aide d'un scalpel, ceci permettant au colorant l'accès aux Jonctions communicantes.
Les cellules a confluence sont rincées avec du PBS (Sigma) avant l'addition du colorant. 2 ml de Jaune de Lucifer (Sigma) à 0,05% dilués dans du PBS sont déposés sur les cellules et l' " égratignure (scrape) " a heu à température ambiante. Six '" égratignures (scrapes) " sont effectuées dans des boîtes de 60 mm Les cellules sont laissées en présence du colorant pendant 5 minutes, puis celui-ci est retiré et récupéré. Les cellules sont alors rincées avec du PBS, afin d'éliminer l'excès de fluorescence. Elles sont fixées à l'aide de Paraformaldehyde (PFA) à 3% pendant 10 minutes. Les cellules sont à nouveau rincées avec du PBS, et après le rinçage, 2 ml de PBS sont laissés dans les boîtes.
Ensuite, les boîtes sont observées grâce à un microscope inversé à fluorescence muni d'une caméra qui permet l'acquisition des images. Six ou huit photos sont prises pour chaque boîte et sont ensuite analysées avec un logiciel d'analyse d'image (Perfectimage, Iconix). On quantifie alors, la fluorescence correspondant à la surface occupée par le Jaune de Lucifer dans les couches cellulaires. Pour cela, on dispose un rectangle de taille prédéfinie au niveau de la zone à étudier. L'ordinateur calcule et donne le rapport des surfaces : Surface fluorescente / Surface totale. Plus le rapport est élevé, plus la capacité des cellules à communiquer entre elles est grande.
1.1.3- Micro-imection
La préparation des cellules est semblable à celle utilisée par la technique d'égratignure-chargement ou en anglais "scrape-loading"
Grâce à la précision de cette technique, le Jaune de Lucifer (10% dans 0,33 M LiCl) est injecté directement dans une cellule, uniquement à l'aide d'un capillaire relié à un micromanipulateur (Leitz). L'injection est contrôlée par un mjecteur automatique (Tranjector 5246, Eppendorf), et dure 1 seconde avec une intensité de 10335 HPa. Les injections se font sous microscope inversé (20X) en contraste de phase (Microscope Leica, Fluovert FU) On réalise une vingtaine d'injections dans une boîte de pétn de 60 mm Après la fixation des cellules avec du paraformaldéhyde à 3%, les cellules sont rincées avec du PBS L'observation et le comptage du nombre de cellules marquées sont ensuite réalisés
I 1 4- Cvtométπe en flux Lorsque la confluence est atteinte, le milieu de culture est enlevé et les cellules sont rincées 2 fois avec du tampon PBS. Ensuite, elles sont trypsinées a l'aide d'un mélange de trypsine a 0J% et d'EDTA a 0,02%. L'inhibition de la trypsine s'effectue avec du milieu de culture additionne de 10% de SVF Un comptage du nombre de cellules à eu, afin d'ajuster celui-ci à 10 cellules par tube. La suspension cellulaire est centrifugée a 176 g pendant 5 minutes et le culot est repris dans 100 ml de PBS. On fixe les cellules avec du PFA à 3% pendant 25 minutes à 4°C. Pour éliminer le PFA, les cellules sont à nouveau centnfugées à 176 g pendant 5 minutes et rincées 2 fois dans du PBS.
Le tampon, dans lequel les anticorps sont préparés, se compose de PBS, de 1% de SVF et de saponine (Sigma) à 0,2%, détergent qui induit une microporation de la membrane, mais qui n'abîme pas la cellule. Ce détergent est utilisé afin de garder intacte et de quantifier la connexine 43 intracytoplasmique mais aussi transmembranaire (Communication personnelle, R. Mouawad, Hôpital Salpétnere - Pans) L'anticorps pnmaire utilisé est l'anti-connexme 43 (Zymed, AC monoclonal fait chez la souns). La concentration de l'anticorps pnmaire doit être 1,3 μg/ml (l/750eme). L'incubation est de 45 minutes à 4°C. Afin d'éliminer l'excès d'anticorps, les cellules sont centnfugées et nncées avec le tampon servant à la préparation des anticorps (PBS, saponine et SVF). Elles sont alors mises en présence de l'anticorps secondaire anti-souns couplé à la fluorescéïne. à la dilution de l/50eme (Jackson Immunotech). Après l'incubation avec le deuxième anticorps, les cellules sont centnfugées et nncées, puis repnses dans 1 ml de tampon (PBS, saponine, SVF)
On mesure l' intensité de fluorescence dans les KHN traités comme décnt ci-dessus et dans des KHN qui n'ont pas été mis en présence de l'anticorps secondaire anti-souns couplé à la fluorescéïne, avec un cytomètre en flux (Epies profile II de chez COULTRONIC), les mesures sont traitées et comparées par un logiciel (Phoenix flow system soft de chez COULTRONIC), qui nous donne une valeur mesuré dans une unité arbitraire donnée par la machine, que nous appelons : taux de marquage de la connexine 43 dans les KHN, qui reflète la quantité de connexine 43 par KHN (en moyenne).
1.2- Résultats
1.2 J- Evaluation de la fonctionnalité de la Communication Intercellulaire par Jonctions Communicantes (CIJC) ou Gap Junctional Intercellular Communication (GJIC) en fonction de l'âge des donneurs.
.2.1.1- Egratignure-Chargement ou "Scrape-Loading" (Figure 1) L'étude a été menée sur 9 donneurs âgés de 40 à 75 ans.
Tableau I
Modulation de la communication intercellulaire en fonction de l'âge des donneurs.
On peut observer dans les résultats montrés dans le tableau I, et sur la figure 1 (en annexe), que la communication intercellulaire diminue en fonction de l'âge des donneurs, la capacité des keratinocytes à communiquer semble être inversement proportionnelle à l'âge des donneurs.
Le coefficient de corrélation est de 0,76. I.2J.2- Micro injections (Figure 2)
L'étude a été menée sur les mêmes donneurs que pour l'égratignure- chargement ou "scrape-loading", excepté le donneur de 43 ans.
Tableau II
Modulation de la communication intercellulaire en fonction de l'âge des donneurs
A la lecture des résultats montrés dans le tableau II et sur la figure 2 (en annexe), nous observons une CIJC inversement proportionnelle à l'âge, mais avec cette technique plus précise que l'égratignure-chargement ou "Scrape-Loading", le coefficient de corrélation est de 0,91.
Les deux techniques, égratignure-chargement ou "Scrape-Loading" et Micro-injections, donnent des résultats qui vont dans le même sens : la fonctionnalité de la CIJC diminue avec l'âge de manière très significative.
1.2.2- Evaluation de l'effet de l'âge sur la quantité de connexine 43 (Figure 3)
Cytométrie en flux :
L'étude a été menée sur les mêmes donneurs que pour l'égratignure- chargement ou "scrape-loading", excepté le donneur de 43 ans et le donneur de 75 ans. Tableau III
Taux de marquage de la connexine 43 dans les KHN, mesurés chez des keratinocytes de donneurs d'âges différents.
On observe dans le tableau III et sur la figure 3 (en annexe) une diminution du taux de connexine 43 en fonction de l'âge, la quantité de connexine 43 apparaissant être inversement proportionnelle à l'âge des donneurs.
Le coefficient de corrélation est de 0,82.
Ces résultats mettent en évidence un effet du vieillissement sur la capacité fonctionnelle des cellules à communiquer entre elles, notamment par l'intermédiaire des jonctions communicantes (JC) ou « gap junctions » (GJ), ainsi qu'un effet du vieillissement sur la quantité de connexine 43 présente dans les cellules. Ils montrent, en effet, que capacité fonctionnelle des cellules à communiquer entre elles, notamment par l'intermédiaire des jonctions communicantes (JC) diminue avec l'âge. Ils montrent également que la quantité de connexine 43 diminue avec l'âge.
Les inventeurs ont donc montré l'intérêt d'utiliser des substances favorisant la communication intercellulaire, notamment à travers les JC, pour lutter contre les signes du vieillissement cutané, en particulier pour ralentir leur apparition. Ils ont donc mis au point un nouveau moyen pour lutter contre le vieillissement cutané, en particulier contre les rides et la perte d'élasticité de la peau.
Les inventeurs ont donc également montré l'intérêt d'utiliser des substances favorisant la communication intercellulaire, notamment à travers les JC, pour favoriser et/ou augmenter l'activité d'un agent cosmétique. Ils ont donc mis au point un nouveau moyen pour favoriser et/ou augmenter l'activité d'un agent cosmétique. Exemple II - Obtention d'extraits lipidiques de l'algue Skeletonema costatum.
II J - Extraction à l'isopropanol. suivant un premier procédé De préférence, l'ensemble de l'extraction sera réalisé sous atmosphère inerte (saturation en azote) afin d'éviter une dégradation prononcée des molécules actives.
Dans cette préparation, nous utilisons 250 kg de biomasse (Skeletonema costatumλ Les algues, qui ont été congelées à -20°C, sont plongées dans de l'isopropanol (IPA) sous reflux à 80-83°C, et ce sous agitation. Le choc thermique permet de faciliter la décantation de la silice (issue du squelette des cellules des algues).
La quantité de solvant utilisée est de 10 litres d'IPA pour 1 litre d'eau contenue dans la biomasse. Dans cette préparation, pour un pourcentage de matière sèche de 30%, les 250 kg de biomasse représentent une quantité de matière sèche de 75 kg et 175 kg d'eau. La quantité d'IPA engagée est ici de
1925 kg.
L'ensemble (biomasse + IPA) est porté sous reflux pendant une demi-heure sous agitation à environ 80°C, avant d'être refroidi vers 50°C.
Après le refroidissement de la masse réactionnelle vers 50°C, l'extrait est transféré dans un filtre de type GUEDU afin de réaliser la séparation biomasse épuisée / extrait lipidique sous IPA.
L'extrait lipidique est concentré dans un réacteur batch (Facteur de concentration = 71,5).
Le rendement par rapport au poids sec de cette première étape est de 28 % en huile brute.
Pour commencer la seconde étape, l'extrait lipidique est repris dans de 1TPA à froid à raison de 10 kg de solvant pour 1 kg d'huile. L'agitation est prolongée pendant 20 minutes. Le jus est ensuite filtré (ceci permet d'éliminer la boue collante résiduelle).
Le traitement de décoloration et de désodorisation est réalisé en deux batchs dans un réacteur schott de 80 litres et dure 30 minutes à température ambiante. La quantité de zéolithe (ABSENT 2000, fournisseur UOP) ajoutée est de 0,94 kg et celle de charbon actif (CXV, fournisseur CECA) est de 1,6 kg. Le rapport charbon sur zéolithe est de 1,7. La zéolithe et le charbon sont ensuite éliminés par filtration sur papier.
Le rendement par rapport au poids sec de cette seconde étape est de 37%.
Ainsi, le rendement global en huile pour l'ensemble du procédé est de 10% par rapport au poids sec de biomasse Des antioxydants (du DL α-tocopherol a 0,05% final en poids et du palmitate d'ascorbyle a 0,05% final en poids) sont incorporés par une solution
Le filtrat et les antioxydants sont ensuite concentres en batch jusqu'à l'obtention d'une huile de couleur brune Le conditionnement de cet extrait lipidique (sous forme d'huile) est réalisé sous gaz inerte tel que de l'azote
Cette huile sera nommée ci-apres l'extrait lipidique El de SKC
II 2 - Extraction à l'éthanol suivant un second procédé
L'extraction débute par une dispersion de 49,8 kg de biomasse végétale congelée à 29% en masse sèche dans 539 kg d'éthanol à 96%, alca nisés par 9 kg de solution aqueuse sodique à 30,5% Apres une macération de 30 minutes a 40°C sous reflux et sous atmosphère azotée, l'ensemble est refroidi à 18°C. Les insolubles sont alors sépares par essorage sous azote et sont éliminés.
Les 573,9 kg de filtrat sont additionnés de 151 kg d'eau distillée. L'ensemble est agité lentement pendant 10 minutes pour être ensuite affronté à 162 kg d'heptane. L'épiphase heptanique de la partition liquide/liquide est éliminée. Notons que l'hypophase contient les acides gras sous forme saline L'opération est répétée deux autres fois
Les 756 kg de solution relative a l'hypophase précédemment citée sont acidifiés par ajout de 2,8 kg d'acide sulfuπque pour obtenir un pH de 2,2. L'ensemble est agité 10 minutes sous azote pour être ensuite affronte à 158 kg d'heptane. Les acides gras libres sont extraits des 147 kg constituant la première epiphase heptanique de cette nouvelle partition liquide/liquide. L'opération est repétée cinq autres fois pour récupérer au total 697 kg de phase heptanique. Cette phase évaporée à sec à l'évaporateur rotatif puis par distillation moléculaire fournit l'extrait actif soit une quantité représentant 1J kg d'huile. L'huile produite est liquide, homogène et possède une couleur jaune foncée.
Cette huile sera nommée ci-après : l'extrait lipidique E2 de SKC.
Exemple III - Evaluation de l'effet d'un extrait lipidique de l'algue SKC sur la Communication Intercellulaire par Jonctions Communicantes (CIJC) et le taux de connexine 43 sur des KHN de donneurs âgés.
L'extrait lipidique de l'algue SKC utilisé dans cet exemple est l'extrait lipidique E2 de SKC obtenu suivant le procédé d'extraction à l'éthanol décrit ci- dessus.
Les études décrites ci-dessous ont été réalisées également avec l'extrait lipidique El de SKC (résultats non montrés), avec des résultats comparables à ceux décrits ci-dessous et obtenus avec l'extrait lipidique E2 de SKC.
Les études sont réalisées sur des Keratinocytes Humains Normaux (KHN) obtenus suivant le protocole décrit dans l'exemple I (1.1.1 - Culture de Keratinocytes Humains Normaux). A la différence des témoins, les KHN traités avec l'extrait lipidique El ou E2 de SKC (au moment ou la culture est en confluence) sont mis en contact d'une quantité « x » dudit extrait exprimée en μg par millilitre de milieu de culture et pendant 24 heures (x μg/ml/24H) avant de subir des évaluations réalisées avec les techniques d'Egratignure-Chargement, de Micro-injections, ou de Cytométrie en flux, suivant les protocoles décrits dans l'exemple I (respectivement 1.1.2, 1.1.3, 1.1.4).
• Egratignure-Chargement ou "Scrape-Loading" (Figure 4) L'étude a été réalisée sur les Keratinocytes Humains Normaux (KHN) de 4 donneurs âgés de 60 à 79 ans.
Tableau IV
Modulation de la communication intercellulaire chez des KHN de différents donneurs traités avec des extraits lipidiques (E2) de SKC mesuré par la méthode d'égratignure-chargement
Où « R » est le rapport de la surface fluorescente sur la surface totale.
Les résultats montrés dans le tableau IN et la figure 4 (en annexe) démontrent que les extraits lipidiques de SKC induisent une augmentation de la CIJC chez les donneurs âgés (p<0,0001-test de student).
Il y a donc une restauration de la communication cellulaire par les extraits lipidiques de SKC, à peu près au même niveau que les KHΝ de donneurs jeunes.
Micro-injections (Figure 5)
L'étude a été réalisée sur 12 donneurs âgés de 49 à 79 ans.
Tableau V
Modulation de la communication intercellulaire chez des KHN de différents donneurs traités avec des extraits li idi ues (E2) de SKC
On observe une augmentation d'un facteur 2 du nombre de cellules marquées (p<0,0001-test de student). Les extraits lipidiques de SKC induisent donc une restauration de la CIJC des cellules de donneurs âgés à peu près au niveau de la CIJC des cellules de donneurs jeunes.
• Cytométrie en flux (Figure 6)
L'étude a été réalisée sur 6 donneurs de 49 à 60 ans.
Tableau VI
Modulation de la quantité de connexine 43 après traitement avec l'extrait lipidique (E2) de SKC à 2,5 μg/ml/24h mesurée en Cytométrie en Flux.
On observe une augmentation moyenne de 25,6% du marquage des cellules traitées par rapport aux cellules témoins.
Les extraits lipidiques de SKC induisent une augmentation de la quantité de connexine 43.
Les résultats obtenus avec les différents moyens d'évaluation de l'effet d'extraits lipidiques de l'algue Skeletonema costatum sur la communication intercellulaire, notamment à travers les JC et sur le taux de connexine 43, réalisées sur des KHN de donneurs âgés, montrent que l'utilisation d'extraits lipidiques de l'algue Skeletonema costatum permet de restaurer la communication intercellulaire, notamment à travers les JC et permet également d'augmenter le taux de connexine 43 présente dans les KHN.
Ces résultats montrent l'intérêt d'utiliser des extraits lipidiques de l'algue Skeletonema costatum dans des compositions cosmétiques pour lutter contre les signes du vieillissement cutané, en particulier pour ralentir leur apparition. Les ~> .
inventeurs ont donc mis au point un nouveau moyen pour lutter contre le vieillissement cutané, en particulier contre les rides et la perte d'élasticité de la peau.
De plus, les résultats obtenus ci-dessus, montrent l'intérêt de l'utilisation d'extraits lipidiques de l'algue Skeletonema costatum dans des compositions cosmétiques pour favoriser et/ou augmenter l'activité d'autres agents cosmétiques agissant directement dans la cellule ou par l'intermédiaire de seconds messagers intracellulaires, et présent ou non, dans la même composition cosmétique que les extraits lipidiques de SKC.
Exemple IV : Evaluation de l'effet de la boldine par le test d'égratignure- chargement ou "scrape-loading"
L'étude a été réalisée sur des keratinocytes humains normaux (KHN). Les concentrations utilisées sont : 12,5, 25, 50, 100 et 200 mM. Les incubations sont de 24h dans le milieu de culture. Le tableau ci-dessous résume les valeurs de surface de diffusion mesurées.
Tableau VII
Comme on peut le voir dans le tableau VII, la dose qui semble la plus efficace pour augmenter la fonctionnalité de la CIJC est 50 mM/24h. L'analyse statistique des données montre que seule cette concentration permet d'obtenir une différence réellement significative de l'augmentation de la CIJC par rapport aux KHN non traités. Les résultats du tableau VII laissent envisager un effet dose de la boldine sur la CIJC. Exemple V : Crème de jour pour le visage, anti-âge
Exemple VI : Emulsion-gel pour le visage, anti-rides
Exemple VII : Emulsion raffermissante pour le corps
Exemple VIII : Emulsion-gel pour le visage, anti-rides

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition cosmétique, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre d' ingrédient actif, au moins une substance favorisant la communication intercellulaire des cellules de la peau, en particulier des keratinocytes, des fibroblastes, et des pre-adipocytes de la peau.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite substance favonsant la communication intercellulaire, favorise la communication intercellulaire à travers les jonctions communicantes des cellules de la peau, en particulier des keratinocytes, des fibroblastes, et des pré-adipocytes de la peau.
3. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ladite substance favonsant la communication intercellulaire, favonse la formation de connexine, en particulier de connexine 43
4. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite substance favorisant la communication intercellulaire comprend au moins un extrait lipidique de l'algue Skeletonema, notamment de l'algue Skeletonema costatum, en particulier un extrait lipidique total de ladite algue.
5. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce qu'il s'agit d'un extrait obtenu par extraction de l'algue Skeletonema avec un solvant alcoolique choisi parmi le groupe consistant de l'isopropanol, de l'éthanol, et du methanol.
6. Composition selon la revendication 5, caracténsée en ce que l'extrait précité est obtenu par extraction de l'algue avec de l'isopropanol.
7. Composition selon la revendication 5, caracténsée en ce que l'extrait précité est obtenu par extraction de l'algue avec de l'éthanol.
8. Composition selon l'une des revendications 4 à 7, caracténsée en ce que l'extraction est réalisée sous reflux.
9. Composition selon l'une des revendications 4 à 8, caractérisée en ce que l'algue est congelée avant d'être extraite avec le solvant alcoolique, de préférence la congélation étant réalisée à une température située entre -40°C et - 20°C environ et pendant une durée comprise de préférence entre 1 et 7 jours environ.
10. Composition selon l'une des revendications 4 à 9, caracténsée en ce que l'algue congelée est plongée directement dans le solvant alcoolique chauffé.
11. Composition selon l'une des revendications 5 à 10, caractérisée en ce que l'extrait de l'algue précité est obtenu après la succession des étapes suivantes : a) le solvant alcoolique est alcalinisé jusqu'à un pH compris entre 10 et 14, de préférence à un pH égal à 13, par exemple avec une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium ou avec une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium, b) les insolubles sont éliminés de la phase hydro-alcoolique, c) de l'eau distillée est ajoutée à la phase hydro-alcoolique, d) la solution obtenue subit une extraction liquide-liquide avec un solvant apolaire non miscible avec la phase hydro-alcoolique, tel que par exemple l'heptane, l'hexane ou le cyclohexane, e) la phase contenant le solvant apolaire est éliminée, f) la phase hydro-alcoolique récupérée après élimination de la phase contenant le solvant apolaire, est acidifiée jusqu'à un pH compris entre 1 et 3, de préférence à un pH égal à 2, par exemple avec une solution aqueuse d'acide sulfurique ou avec une solution aqueuse d'acide chlorhydrique, g) la solution obtenue après acidification subit une extraction liquide- liquide avec un solvant apolaire non miscible avec la phase hydroalcoolique, tel que par exemple l'heptane, l'hexane ou le cyclohexane, h) la phase hydro-alcoolique est éliminée, i) la phase contenant le solvant apolaire récupérée après élimination de la phase hydro-alcoolique subit une évaporation afin d'obtenir une huile exempte de solvant apolaire, cette huile étant l'extrait recherché.
12. Composition selon la revendication 4, caractérisée en ce que l'extrait précité est obtenu par extraction au CO supercritique.
13. Composition selon l'une des revendications 5 à 11, caractérisée en ce que, avant toute opération d'extraction, on réalise une macération de l'algue dans le solvant alcoolique à température ambiante, de préférence pendant une durée comprise entre 5 minutes et 80 minutes environ, et de préférence encore, pendant une durée comprise entre 20 minutes et 40 minutes environ.
14. Composition selon l'une des revendications 5 à 10, ou 13, caractérisée en ce que la quantité de solvant alcoolique utilisée est comprise entre 0, 1 litre et 20 litres environ de solvant, de préférence comprise entre 2 litres et 10 litres environ de solvant, pour 100 g d'algue, exprimé en poids sec d'algue.
15. Composition selon l'une des revendications 4 à 14, caractérisée en ce que l'extraction est réalisée sous atmosphère inerte, de préférence sous atmosphère saturée en azote.
16. Composition selon l'une des revendications 4 à 15, caractérisée en ce qu'elle comprend de 0,01% à 10% environ, et en particulier de 0,1% à 3% environ en poids dudit extrait lipidique de l'algue Skeletonema, notamment de l'algue Skeletonema costatum par rapport au poids total de la composition finale.
17. Composition selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite substance favorisant la communication intercellulaire des cellules de la peau est la boldine.
18. Composition selon la revendications 17, caractérisée en ce qu'elle comprend de 0,001% à 10% environ, et en particulier de 0,01% à 1% environ en poids de boldine par rapport au poids total de la composition finale.
19. Utilisation d'au moins une substance favorisant la communication intercellulaire des keratinocytes, des fibroblastes, et des pré-adipocytes de la peau, comme agent cosmétique, éventuellement en présence d'un véhicule cosmétiquement acceptable.
20. Utilisation selon la revendication 19, caractérisée en ce que ladite substance favorisant la communication intercellulaire, favorise la communication intercellulaire à travers les jonctions communicantes des keratinocytes, des fibroblastes, et des pré-adipocytes de la peau.
21. Utilisation selon la revendication 19 ou 20, caractérisée en ce que la substance favorisant la communication intercellulaire favorise la formation de connexine, en particulier de connexine 43.
22. Utilisation selon l'une des revendications 19 à 21, caractérisée en ce que ladite substance comprend au moins un extrait lipidique de l'algue Skeletonema, notamment de l'algue Skeletonema costatum, en particulier un extrait lipidique total de ladite algue, notamment tel que défini à l'une quelconque des revendications 5 à 16, avantageusement un extrait obtenu par extraction liquide-liquide entre un alcool alcahnisé puis acidifié et un solvant apolaire non miscible avec la phase hydro-alcoolique, tel que par exemple l'heptane, l'hexane ou le cyclohexane.
23. Utilisation selon l'une des revendications 19 à 21, caractérisée en ce que ladite substance est la boldine.
24. Procédé pour favoriser et/ou augmenter l'activité d'un agent cosmétique agissant directement dans la cellule ou par l'intermédiaire de seconds messagers intracellulaires, caractérisé en ce qu'il comprend l'application simultané ou préliminaire à celle dudit agent cosmétique, sur les zones de la peau concernée d'une personne en ayant besoin, d'une quantité efficace d'au moins une substance favorisant la communication intercellulaire, en particulier une substance favorisant la communication intercellulaire telle que définie à l'une quelconque des revendications 2 à 18.
25. Procédé de traitement cosmétique anti-vieillissement de la peau, caractérisé en ce qu'il comprend l'application sur les zones de la peau concernée d'une personne en ayant besoin, d'une quantité efficace d'au moins une substance favorisant la communication intercellulaire, pour obtenir un effet antivieillissement sur lesdites zones de la peau, notamment pour améliorer la fermeté cutanée, améliorer l'élasticité de la peau, retarder l'apparition des rides ou diminuer leur profondeur, en particulier une substance favorisant la communication intercellulaire telle que définie à l'une quelconque des revendications 2 à 18.
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