EP1165033A1 - Utilisation de la vitamine c ou analogues pour stimuler la synthese des cellules de la peau - Google Patents

Utilisation de la vitamine c ou analogues pour stimuler la synthese des cellules de la peau

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EP1165033A1
EP1165033A1 EP00909442A EP00909442A EP1165033A1 EP 1165033 A1 EP1165033 A1 EP 1165033A1 EP 00909442 A EP00909442 A EP 00909442A EP 00909442 A EP00909442 A EP 00909442A EP 1165033 A1 EP1165033 A1 EP 1165033A1
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EP
European Patent Office
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skin
ascorbic acid
analogs
differentiation
composition
Prior art date
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Application number
EP00909442A
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German (de)
English (en)
Inventor
André Rougier
Alain Richard
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La Roche Posay Laboratoire Dermatologique SAS
Original Assignee
La Roche Posay Laboratoire Dermatologique SAS
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Filing date
Publication date
Application filed by La Roche Posay Laboratoire Dermatologique SAS filed Critical La Roche Posay Laboratoire Dermatologique SAS
Publication of EP1165033A1 publication Critical patent/EP1165033A1/fr
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    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/30—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing organic compounds
    • A61K8/67—Vitamins
    • A61K8/676—Ascorbic acid, i.e. vitamin C
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
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    • A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
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    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
    • A61Q19/08—Anti-ageing preparations

Definitions

  • the invention relates to a method for increasing the rate of differentiation and / or proliferation of skin fibroblasts and / or increasing the rate of differentiation of skin keratinocytes by applying to the skin a composition comprising an effective amount of ascorbic acid or at least one of its analogs. It also relates to a process for stimulating the synthesis of cutaneous vimentin by applying to the skin a composition comprising an effective amount of ascorbic acid or of at least one of its analogs. It further relates to a process for stimulating the synthesis of cutaneous keratin by applying to the skin a composition comprising an effective amount of ascorbic acid or of at least one of its analogs.
  • Human skin is made up of two compartments, namely a surface compartment, the epidermis, and a deep compartment, the dermis.
  • the natural human epidermis is mainly composed of three types of cells which are the keratinocytes, very majority, the melanocytes and the Langerhans cells. Each of these cell types contributes by its own functions to the essential role played in the body by the skin, in particular the role of protecting the body from external aggressions (climate, ultraviolet rays, tobacco, ...), called "function fence". Poor renewal of these cells and more particularly of keratinocytes, which is observed in particular with age, results in poor protection of the skin, the skin then having a dry and / or dull appearance.
  • the dermis provides the epidermis with solid support. It is also its nourishing element. It mainly consists of fibroblasts and an extracellular matrix itself composed mainly of collagen, elastin and a substance, known as the fundamental substance, components synthesized by the fibroblast. There are also leukocytes, mast cells or tissue macrophages. It is also crossed by blood vessels and nerve fibers.
  • Vimentin fibers are found in an important way in the dermis, since they correspond to the intermediate filament of fibroblasts. These vimentin fibers are also present in melanocytes and in Langerhans cells of the epidermis, they can also be present in keratinocytes when these are in a hyperproliferative state.
  • Keratins are the intermediate filaments of epithelial cells, such as keratinocytes in the skin. Thus, there are four types of keratin in the epidermis, including keratin 10, called K10, which is specific to the state of differentiation of keratinocytes.
  • One of the aims of the present invention is therefore to increase the rate of differentiation and / or proliferation of fibroblasts in the skin and / or to increase the rate of differentiation of keratinocytes in the skin so as to combat extrinsic aggressions, whether they either physical or chemical, which damage the skin, in particular by reducing its function barrier, and against skin aging, whether chronobiological or photo-induced.
  • ascorbic acid applied topically to the skin increases the rate of differentiation and / or proliferation of skin fibroblasts and / or increases the rate of differentiation of keratinocytes in the skin by applying to the skin.
  • a composition comprising an effective amount of ascorbic acid or at least one of its analogs.
  • Ascorbic acid is known to stimulate the synthesis of collagen, preventing, as a co-factor, the auto-inactivation of the enzymes lysine- and proline-hydroxylases and increasing the synthesis of mRNA of procollagens .
  • Ascorbic acid (or vitamin C) is also known to stimulate the synthesis of elastin in the skin.
  • US patents 5801192, US 4983382 and EP 0717983 We can also cite an article entitled "Pola to incorporate vitamin C in new cosmetics line for skin care" of the Japan economy Journal of June 5, 1984 (page 15) .
  • a subject of the invention is therefore the use of an effective amount of ascorbic acid or one of its analogs in a composition or in the preparation of a composition intended to be applied to the skin to increase the rate of differentiation and / or proliferation of skin fibroblasts and / or increase the rate of differentiation of skin keratinocytes.
  • a third object of the invention is the use of an effective amount of ascorbic acid or one of its analogs in a composition or in the preparation of a composition intended to be applied to the skin to stimulate the synthesis of cutaneous vimentin.
  • a fourth object of the invention is the use of an effective amount of ascorbic acid or one of its analogs in a composition or in the preparation of a composition intended to be applied to the skin to stimulate the synthesis of cutaneous keratin 10.
  • the invention further relates to a method for increasing the rate of differentiation and / or proliferation of fibroblasts of the skin in a person having an abnormally low rate of differentiation and / or proliferation of fibroblasts, comprising topical application to the skin with an effective amount of ascorbic acid or one of its analogs.
  • Another subject of the invention is a method for increasing the rate of differentiation of keratinocytes in the skin in a person having an abnormally low rate of differentiation of keratinocytes, comprising the topical application to the skin of an effective amount of ascorbic acid or one of its analogs.
  • ascorbic acid applied topically to the skin makes it possible to increase the synthesis of mRNA of vimentin and thus to increase the rate of synthesis of vimentin.
  • ascorbic acid applied topically to the skin increases the synthesis of keratin 10 mRNA and thus increases the rate of synthesis of keratin 10.
  • proteins, intermediate filaments of skin cells are therefore representative of the proliferating and / or differentiating state of skin cells, more particularly cells of the dermis and epidermis. More particularly, vimentin, which is the intermediate filament of fibroblasts, is representative of the proliferating and / or differentiating state of fibroblasts and keratin 10 is representative of the differentiating state of keratinocytes.
  • the ratio of the synthesis of mRNAs of vimentin to that of keratin 10 due to the topical application of ascorbic acid is comparable to that without topical application of ascorbic acid. This indicates that the skin condition, after topical application of ascorbic acid, is maintained in a normal state (without, for example, hyper-proliferation or -differentiation of one dermal or epidermal compartment relative to the other) .
  • the analogues of ascorbic acid are, more particularly, its salts, such as in particular sodium ascorbate, magnesium or sodium ascorbylphosphate, its esters, such as in particular its acetic, propionic or palmitic esters, or its sugars , such as in particular glycosilated ascorbic acid.
  • Ascorbic acid is usually in L-form because it is usually extracted from natural products.
  • the effective amount of ascorbic acid or its analogs which can be used according to the invention is of course that which is necessary to obtain the expected effects according to the invention.
  • this quantity preferably represents from 0.001% to 20% of the total weight of the composition, preferably from 0.1% to 15% of the total weight of the composition. composition and advantageously from 3% to 10% of the total weight of the composition.
  • composition of the invention is used for a time sufficient to obtain the expected effects according to the invention.
  • this duration can be at least 15 days, but can also be more than 4 weeks, or even more than 8 weeks.
  • composition of the invention intended for topical application contains a physiologically acceptable medium, that is to say compatible with the skin including the scalp, mucous membranes and / or the eyes and may in particular constitute a cosmetic or dermatological composition. .
  • This composition can be in all the galenical forms normally used in the cosmetic and dermatological fields, and it can in particular be in the form of an aqueous solution possibly gelled, of a dispersion of the lotion type possibly biphasic, of an emulsion obtained by dispersion of a fatty phase in an aqueous phase (O / W) or vice versa (W / O), or of a triple emulsion (W / O / W or O / W / O) or of a vesicular type dispersion ionic and / or non-ionic.
  • These compositions are prepared according to the usual methods.
  • composition of the invention can constitute, for example, a lotion, a gel, a cream or a milk, and for example a lotion or a cleansing or cleansing milk, a shampoo or a shower gel.
  • composition L-ascorbic acid 5.00%
  • Biopsies of these treated surfaces are then carried out.
  • Biopsies are ground under liquid nitrogen in a Mikrodismembrator S (Braun).
  • the powder obtained is collected in the teflon capsule with 2 ml of lysis solution (guanidine isothiocyanate 5M, mercaptoethanol, 0.1 M, lauryisucosyl of Na 0.017M, citrate Na 0.025M, pH7, antifoam 3 ⁇ l / ml).
  • the suspension is transferred to a tube which is stirred at temperature room for 15 minutes.
  • the lysate is deposited on the surface of a 1.4 ml cushion of 5.7 M cesium chloride, 0.1 M EDTA, pH 7 in a 3.8 ml polyallomer tube for the rotor SW60 (Beckman L70M ultracentrifuge ). Ultracentrifugation at 35,000 RPM is carried out for 18 hours at 20 ° C. The pellet is rinsed with absolute ethanol, centrifuged at 13,000 RPM, 4 ° C, 10 minutes and dissolved in 100 ⁇ l of distilled water.
  • RNA harvested from biopsies is estimated by the optical density of the solution at 260 nm and then measured by amplifying the 28S ribosomal RNA by RT-PCR.
  • the measurement of the specific mRNAs is carried out by quantitative RT-PCR on aliquots of the same dilution of total RNA, stored at -80 ° C. until their use.
  • the specific oligonucleotide primers of the genes studied have 24 bases, have an A - T% close to 50% and are chosen from two different exons in order to avoid amplification of possible traces of DNA present in the samples.
  • the optimal amplification conditions (temperature and number of cycles) were determined for each of the genes studied, taking into account their level of expression in the skin. RT-PCR is carried out using the Gen amp Amp rTth kit from Perkin Elmer or the Titam kit from Boehringer.
  • Each RT-PCR reaction is carried out in the presence of a known number of copies of a synthetic RNA created in the laboratory containing the sequences of the oligonucleotide primers specific for the mRNAs of interest and the amplification product of which has a molecular size allowing discriminate it from endogenous mRNA.
  • This multistandard makes it possible to control and calculate the yield of the reverse transcription and of the amplification reaction.
  • the amplification products are analyzed by electrophoresis in polyacrylamide gel followed by staining with CyberGreen. The intensity of the fluorescent signals is measured using a Fluoro S Multilmager. The results are corrected for the yield of RT-PCR and expressed in arbitrary units per unit of ribosomal 28 S RNA.
  • the A / P ratio is significantly greater than 1 with a probability greater than 95% for a value of t> 1.83 and a probability greater than 99% for a value of t> 2.82.
  • the total quantity of RNA purified from biopsies is first evaluated by measuring the optical density at 260 nm and their quality estimated by measuring the OD ratio 260/290 nm.
  • RNA was obtained from each of the biopsies (between 2.1 and 6.3 ⁇ g) with a satisfactory degree of purity (D.O. report 260/280).
  • the concentration of total RNA is brought by dilution to a calculated value of 4 nanograms per ⁇ l. This process makes it possible to carry out the reactions of reverse transcription and amplification on similar amounts of total RNA for all samples.
  • the amount of total RNA present in the diluted solution is quantitatively determined by measurement of the 28S ribosomal RNA, carried out in tripiicate. This same RNA solution will be used for all measurements of specific RNAs whose results are expressed per unit of 28S RNA.
  • the vimentin / keratin 10 ratio is detailed in Table 3.
  • VIM / K10 subject Active Placebo a 7.22 6.05 b 6.88 [14.10] c 5.27 5.63 d 4.53 2.68 e 4.82 4.18 f 2.65 4.31 g 3.59 6.34 h 3.77 5.36 i 3.21 4.48 j 4.19 4.93
  • biopsies contain a proportion of mRNA of keratin 10 and of vimentin, comparable on the side treated with ascorbic acid and placebo.
  • results also indicate that the biopsies were performed uniformly in the different individuals. The fa-placebo sample is outside the norm.

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Abstract

L'invention se rapporte à un procédé pour augmenter le taux de différenciation et/ou de prolifération des fibroblastes de la peau et/ou augmenter le taux de différenciation des kératinocytes de la peau en appliquant sur la peau une composition comprenant une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'au moins un des ses analogues. Elle a également trait à un procédé pour stimuler la synthèse de la vimentine cutanée en appliquant sur la peau une composition comprenant une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'au moins un des ses analogues. Elle a en outre trait à un procédé pour stimuler la synthèse de la kératine 10 cutanée en appliquant sur la peau une composition comprenant une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'au moins un de ses analogues.

Description

UTILISATION DE LA VITAMINE C OU ANALOGUES POUR STIMULER LA SYNTHESE DE CELLULES DE LA PEAU
L'invention se rapporte à un procédé pour augmenter le taux de différenciation et/ou de prolifération des fibroblastes de la peau et/ou augmenter le taux de différenciation des keratinocytes de la peau en appliquant sur la peau une composition comprenant une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'au moins un de ses analogues. Elle a également trait à un procédé pour stimuler la synthèse de la vimentine cutanée en appliquant sur la peau une composition comprenant une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'au moins un de ses analogues. Elle a en outre trait à un procédé pour stimuler la synthèse de la kératine 10 cutanée en appliquant sur la peau une composition comprenant une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'au moins un de ses analogues.
La peau humaine est constituée de deux compartiments à savoir un compartiment superficiel, l'épiderme, et un compartiment profond, le derme.
L'épiderme humain naturel est composé principalement de trois types de cellules qui sont les keratinocytes, très majoritaires, les mélanocytes et les cellules de Langerhans. Chacun de ces types cellulaires contribue par ses fonctions propres au rôle essentiel joué dans l'organisme par la peau, notamment le rôle de protection de l'organisme des agressions extérieures (climat, rayons ultraviolets, tabac, ...), appelé "fonction barrière". Un mauvais renouvellement de ces cellules et plus particulièrement des keratinocytes, qui s'observe notamment avec l'âge, entraîne une mauvaise protection de la peau, la peau présente alors un aspect sec et/ou terne.
Le derme fournit à l'épiderme un support solide. C'est également son élément nourricier. Il est principalement constitué de fibroblastes et d'une matrice extracellulaire composée elle-même principalement de collagène, d'élastine et d'une substance, dite substance fondamentale, composants synthétisés par le fibroblaste. On y trouve aussi des leucocytes, des mastocytes ou encore des macrophages tissuiaires. Il est également traversée par des vaisseaux sanguins et des fibres nerveuses.
Les fibres de vimentine se trouvent de manière importante dans le derme, puisqu'elles correspondent au filament intermédiaire des fibroblastes. Ces fibres de vimentine sont également présentes dans les mélanocytes et dans les cellules de Langerhans de l'épiderme, elles peuvent être également présentes dans les keratinocytes lorsque celles-ci sont dans un état hyperproliférant.
Les kératines sont les filaments intermédiaires des cellules épithéliales, telles que les keratinocytes dans la peau. Ainsi, il existe dans l'épiderme quatre types de kératines, dont la kératine 10, appelée K10, spécifique de l'état de différenciation des keratinocytes.
Avec l'âge, la qualité de la peau diminue, notamment on observe un amincissement du derme. Il est également admis que des facteurs extrinsèques comme les rayons ultraviolets, le tabac ou certains traitements (Glucocorticoïdes, vitamine D et dérivés par exemple) ont également un effet négatif sur la peau.
On comprend alors l'importance du renouvellement cellulaire et de la qualité de ce renouvellement, tant au niveau de l'épiderme qu'au niveau du derme, pour ainsi lutter contre les agressions extrinsèques qui endommagent la peau, notamment en diminuant sa fonction barrière, et contre les signes du vieillissement cutané qu'il soit chronobiologique ou photo-induit.
Un des buts de la présente invention est donc d'augmenter le taux de différenciation et/ou de prolifération des fibroblastes de la peau et/ou augmenter le taux de différenciation des keratinocytes de la peau pour ainsi lutter contre les agressions extrinsèques, qu'elles soient physiques ou chimiques, qui endommagent la peau, notamment en diminuant sa fonction barrière, et contre le vieillissement cutané qu'il soit chronobiologique ou photo-induit.
Or, la demanderesse a maintenant découvert que l'acide ascorbique appliqué topiquement sur la peau augmente le taux de différenciation et/ou de prolifération des fibroblastes de la peau et/ou augmente le taux de différenciation des keratinocytes de la peau en appliquant sur la peau une composition comprenant une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'au moins un de ses analogues.
L'acide ascorbique (ou vitamine C) est connu pour stimuler la synthèse de collagène, en empêchant, en tant que co-facteur, l'auto-inactivation des enzymes lysine- et proline- hydroxylases et en augmentant la synthèse des ARNm de procollagènes. L'acide ascorbique (ou vitamine C) est également connu pour stimuler la synthèse de l'élastine de la peau. On peut citer à cet égard les brevets US 5801192, US 4983382 et EP 0717983. On peut également citer un article intitulé "Pola to incorporate vitamin C in new cosmetics line for skin care" du Japan Economie Journal du 5 juin 1984 (page 15). Ainsi, il a été décrit que l'acide ascorbique utilisé dans des compositions cosmétiques permet de traiter notamment les rides (Fragrance Journal, Vol.8, N°6(45) (1980) pp38-43, "Cosmetic and vitamin -action and safety to dermatology").
L'invention a donc pour objet l'utilisation d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour augmenter le taux de différenciation et/ou de prolifération des fibroblastes de la peau et/ou augmenter le taux de différenciation des keratinocytes de la peau.
L'invention a pour troisième objet l'utilisation d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour stimuler la synthèse de la vimentine cutanée.
L'invention a pour quatrième objet l'utilisation d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour stimuler la synthèse de la kératine 10 cutanée.
L'invention a en outre pour objet un procédé pour augmenter le taux de différenciation et/ou de prolifération des fibroblastes de la peau chez une personne ayant un taux de différenciation et/ou de prolifération des fibroblastes anormalement bas, comprenant l'application topique sur la peau d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues.
L'invention a encore pour objet un procédé pour augmenter le taux de différenciation des keratinocytes de la peau chez une personne ayant un taux de différenciation des keratinocytes anormalement bas, comprenant l'application topique sur la peau d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues.
En effet, la demanderesse a découvert que l'acide ascorbique appliqué topiquement sur la peau permet d'augmenter la synthèse d'ARNm de la vimentine et ainsi d'augmenter le taux de synthèse de vimentine. Elle a également découvert que l'acide ascorbique appliqué topiquement sur la peau permet d'augmenter la synthèse d'ARNm de la kératine 10 et ainsi d'augmenter le taux de synthèse de la kératine 10.
Ces protéines, filaments intermédiaires de cellules de la peau, sont donc représentatives de l'état proliférant et/ou différenciant des cellules de la peau, plus particulièrement des cellules du derme et de l'épiderme. Plus particulièrement, la vimentine, qui est le filament intermédiaire des fibroblastes, est représentative de l'état proliférant et/ou différenciant des fibroblastes et la kératine 10 est représentative de l'état différenciant des keratinocytes.
Ainsi, par application topique d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou de ses analogues, le renouvellement de cescellules de la peau est plus rapide, l'aspect de la peau est amélioré, la peau est plus éclatante, moins terne, plus ferme, plus tonique, plus élastique, les rides sont atténuées ou leurs apparitions sont retardées, les signes cutanés du vieillissement sont diminuées.
Avantageusement, le rapport de la synthèse des ARNm de la vimentine sur celle de la kératine 10 due à l'application topique de l'acide ascorbique est comparable à celui sans application topique de l'acide ascorbique. Ceci indique que l'état de la peau, après application topique de l'acide ascorbique, est maintenue dans un état normal (sans par exemple une hyper- prolifération ou -différenciation d'un compartiment dermique ou épidermique par rapport à l'autre).
Les analogues de l'acide ascorbique sont, plus particulièrement, ses sels, tels que notamment l'ascorbate de sodium, l'ascorbylphosphate de magnésium ou de sodium, ses esters, tels que notamment ses esters acétique, propionique ou palmitique, ou ses sucres, tels que notamment l'acide ascorbique glycosilé.
L'acide ascorbique est généralement sous forme L, car il est habituellement extrait de produits naturels.
La quantité efficace d'acide ascorbique ou de ses analogues utilisable selon l'invention est bien entendu celle qui est nécessaire pour obtenir les effets attendus selon l'invention. Pour donner un ordre de grandeur, cette quantité représente préférentiellement de 0,001% à 20% du poids total de la composition, préférentiellement de 0,1% à 15% du poids total de la composition et avantageusement de 3% à 10% du poids total de la composition.
En outre, la composition de l'invention est utilisée pendant un temps suffisant pour obtenir les effets attendus selon l'invention. Pour donner un ordre de grandeur, cette durée peut être au minimum de 15 jours, mais peut être aussi de plus de 4 semaines, voire de plus de 8 semaines.
La composition de l'invention destinée à une application topique contient un milieu physiologiquement acceptable, c'est-à-dire compatible avec la peau y compris le cuir chevelu, les muqueuses et/ou les yeux et peut constituer notamment une composition cosmétique ou dermatologique.
Cette composition peut se présenter sous toutes les formes galéniques normalement utilisées dans les domaines cosmétique et dermatologique, et elle peut être notamment sous forme d'une solution aqueuse éventuellement gélifiée, d'une dispersion du type lotion éventuellement biphasée, d'une émulsion obtenue par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse (H/E) ou inversement (E/H), ou d'une émulsion triple (E/H/E ou H/E/H) ou d'une dispersion vésiculaire de type ionique et/ou non ionique. Ces compositions sont préparées selon les méthodes usuelles.
La composition de l'invention peut constituer par exemple une lotion, un gel, une crème ou un lait, et par exemple une lotion ou un lait de démaquillage ou de nettoyage, un shampooing ou un gel douche.
L'exemple suivant illustre l'invention sans la limiter aucunement. Dans les compositions les proportions indiquées sont des pourcentages en poids, sauf mention contraire. Exemple : 1. Méthode
On a appliqué sur le bas du cou de 10 femmes entre 55 et 60 ans pendant 3 mois, une fois par jour, d'un côté une émulsion eau dans huile (Véhicule ou Placebo) et d'un autre côté la même émulsion eau dans huile, mais comprenant également 5 % de vitamine C (= Composition ou Actif).
Composition : Acide L-ascorbique 5,00 %
Hydroxyde de sodium 1 ,83 %
Acide citrique, 1 H20 1 ,24 %
Disodium EDTA 0,05 %
Huile d'amandes d'abricot 3,00 % Huile de silicone 4 %
Cyclopentasiloxane et dimethicone copolyol 20 %
Dimethicone et dimethiconol 3 %
Glycerin 23 % Propylene glycol 4 %
Charges 7 %
Conservateurs 0,30 %
Eau qsp 100,00 %
On procède ensuite à des biopsies de ces surfaces traitées.
2. Extraction et purification des ARN totaux.
Les biopsies sont broyées sous azote liquide dans un Mikrodismembrator S (Braun). La poudre obtenue est récoltée dans la capsule de téflon par 2 ml de solution de lyse (isothiocyanate de guanidine 5M, mercaptoéthanol, 0,1 M, lauryisucosyl de Na 0,017M, citrate Na 0,025M, pH7, antifoam 3 μl/ml). La suspension est transférée dans un tube mis sous agitation à température ambiante durant 15 minutes. Le lysat est déposé à la surface d'un coussin de 1 ,4 ml de chlorure de Césium 5,7M, EDTA 0, 1 M, pH 7 dans un tube de polyallomer de 3,8 ml pour le rotor SW60 (Ultracentrifugeuse Beckman L70M). Une ultracentrifugation à 35.000 RPM est réalisée durant 18 heures à 20°C. Le culot est rincé à l'éthanol absolu, centrifugé à 13.000 RPM, 4°C, 10 minutes et mis en solution dans 100 μl d'eau distillée.
3. Quantification de la concentration en ARN total et en ARNm spécifiques.
La quantité d'ARN récolté à partir des biopsies est estimée par la densité optique de la solution à 260 nm puis mesurée en amplifiant par RT-PCR l'ARN ribosomial 28S. La mesure des ARNm spécifiques est réalisée par RT-PCR quantitative sur des aliquots de la même dilution d'ARN total, conservées à -80°C jusqu'à leur utilisation.
Mesure de l'ARNm de la kératine 10 (K10) et de la vimentine
Les amorces oligonucléotidiques spécifiques des gènes étudiés comportent 24 bases, ont un % de A - T proche de 50 % et sont choisies sur deux exons différents afin d'éviter l'amplification d'éventuelles traces d'ADN présentes dans les échantillons. Les conditions optimales d'amplification (température et nombre de cycles) ont été déterminées pour chacun des gènes étudiés en tenant compte de leur niveau d'expression dans la peau. La RT-PCR est réalisée à l'aide du kit Gène Amp rTth de Perkin Elmer ou du kit Titam de Boehringer.
Chaque réaction de RT-PCR est réalisée en présence d'un nombre connu de copies d'un ARN synthétique créé en laboratoire contenant les séquences des amorces oligonucléotidiques spécifiques des ARNm d'intérêt et dont le produit d'amplification a une taille moléculaire permettant de le discriminer de l'ARNm endogène. Ce multistandard permet de contrôler et de calculer le rendement de la transcription réverse et de la réaction d'amplification. Les produits d'amplification sont analysés par électrophorèse en gel de polyacrylamide suivie d'une coloration au CyberGreen. L'intensité des signaux fluorescents est mesurée à l'aide d'un Fluoro S Multilmager. Les résultats sont corrigés pour le rendement de la RT-PCR et exprimés en unités arbitraires par unité d'ARN 28 S ribosomial
4. Analyse statistique
L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du t-Test de Student unilatéral sur les rapports des valeurs Actif (Vitamine C)/Placebo (= A/P).
t(n- 1 ) = (M A/P - 1 ) Vn M écarts - types
Pour un degré de liberté n-1 = 9, le rapport A/P est significativement supérieur à 1 avec une probabilité supérieure à 95 % pour une valeur de t > 1 ,83 et une probabilité supérieure à 99 % pour une valeur de t > 2,82.
5. Résultats
Mesure de l'ARN total obtenu à partir des biopsies
La quantité totale d'ARN purifié à partir des biopsies est évaluée dans un premier temps par mesure de la densité optique à 260 nm et leur qualité estimée par la mesure du rapport des DO 260/290 nm.
Des quantités largement suffisantes d'ARN ont été obtenues à partir de chacune des biopsies (entre 2,1 et 6,3 μg) avec un degré de pureté (rapport de D.O. 260/280) satisfaisant.
La concentration en ARN total est amenée par dilution à une valeur calculée de 4 nanogrammes par μl. Ce procédé permet de réaliser les réactions de transcription reverse et d'amplification sur des quantités similaires d'ARN total pour tous les échantillons. La quantité d'ARN total présente dans la solution diluée est déterminée de façon quantitative par mesure de l'ARN ribosomial 28S, réalisée en tripiicate. Cette même solution d'ARN sera utilisée pour toutes les mesures des ARNs spécifiques dont les résultats sont exprimés par unité d'ARN 28S.
Mesure du taux à l'équilibre des ARNm de la vimentine et de la kératine 10
Les résultats exprimés en unités arbitraires par unité d'ARN 28S sont détaillés dans les tableaux 1 et 2.
Tableau 1 : ARNm de la vimentine
Test de Student unilatéral : *t =2,02, P< 0,05
Sept sujets sur 10 présentent un taux à l'équilibre de l'ARNm de la vimentine accru par l'acide ascorbique. Tableau 2 : ARNm de la kératine 10 (K10)
Test de Student unilatéral : **t = 2,95, p < 0,01
Huit sujets sur dix présentent un taux à l'équilibre de l'ARNm de la kératine 10 accru avec l'acide ascorbique.
Le rapport vimentine/kératine 10 est détaillé dans le tableau 3.
Tableau 3: Rapport vimentine / kératine 10 (VIM / KIO)
VIM / K10 sujet Actif Placebo a 7,22 6,05 b 6,88 [14,10] c 5,27 5,63 d 4,53 2,68 e 4,82 4,18 f 2,65 4,31 g 3,59 6,34 h 3,77 5,36 i 3,21 4,48 j 4,19 4,93
Moyenne 4,61 4,88
Ces résultats indiquent que les biopsies contiennent une proportion d'ARNm de la kératine 10 et de la vimentine, comparable du côté traité par l'acide ascorbique et le placebo. Les résultats indiquent également que les biopsies ont été réalisées de manière uniforme chez les différents individus. L'échantillon fa- placebo est en dehors de la norme.
Lorsque les mesures de la vimentine sont rapportées aux mesures équivalentes faites pour l'ARNm procollagènes I ou III, la valeur moyenne de ces rapports calculée sur la série des échantillons traités et des échantillons placebo est très proche indiquant une modulation coordonnée de l'expression des procollagènes et de la vimentine. En outre, si on considère que la vimentine est représentative du compartiment dermique, puisqu'elle est le filament intermédiaire des fibroblastes, alors l'augmentation de l'expression des procollagènes I et III s'accompagne d'un accroissement parallèle de l'expression de la vimentine et suggère que l'acide ascorbique induit soit un accroissement du nombre de cellules conjonctives du derme soit l'activation de leur phénotype biosynthétique.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues dans la préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour augmenter le taux de différenciation et/ou de prolifération des fibroblastes de la peau.
2. Utilisation d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues dans la préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour augmenter le taux de différenciation des keratinocytes de la peau.
3. Utilisation d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour stimuler la synthèse de la vimentine cutanée.
4. Utilisation d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour stimuler la synthèse de la kératine 10 cutanée.
5. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée par le fait que les analogues de l'acide ascorbique sont choisis parmi ses sels, ses esters, et ses sucres.
6. Utilisation selon la revendications précédente, caractérisée en ce que les analogues de l'acide ascorbique sont choisis parmi l'ascorbate de sodium, l'ascorbylphosphate de magnésium, de sodium, ses esters acétique, propionique, palmitique et l'acide ascorbique glycosilé.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fait que la quantité d'acide ascorbique ou de ses analogues représente de 0,001% à 20%, préférentiellement de 0,1% à 15%, et avantageusement de 3% à 10% du poids total de la composition.
8. Procédé pour augmenter la synthèse de vimentine cutanée chez une personne déficiente en vimentine cutanée comprenant l'application topique sur la peau d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues.
9. Procédé pour augmenter la synthèse de kératine 10 cutanée chez une personne déficiente en kératine 10 cutanée comprenant l'application topique sur la peau d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues.
10. Procédé pour augmenter le taux de différenciation et/ou de prolifération des fibroblastes de la peau chez une personne ayant un taux de différenciation et/ou de prolifération des fibroblastes anormalement bas, comprenant l'application topique sur la peau d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues.
11. Procédé pour augmenter le taux de différenciation des keratinocytes de la peau chez une personne ayant un taux de différenciation des keratinocytes anormalement bas, comprenant l'application topique sur la peau d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues.
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