CA2364608A1 - Utilisation de la vitamine c ou analogues pour augmenter le taux differenciation et/ou de proliferation des cellules de la peau - Google Patents
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Abstract
L'invention se rapporte à un procédé pour augmenter le taux de différenciati on et/ou de prolifération des fibroblastes de la peau et/ou augmenter le taux d e différenciation des kératinocytes de la peau en appliquant sur la peau une composition comprenant une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'au moin s un des ses analogues. Elle a également trait à un procédé pour stimuler la synthèse de la vimentine cutanée en appliquant sur la peau une composition comprenant une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'au moins un des ses analogues. Elle a en outre trait à un procédé pour stimuler la synthèse de l a kératine 10 cutanée en appliquant sur la peau une composition comprenant une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'au moins un de ses analogues.</SDO AB>
Description
UTILISATION DE LA VITAMINE C OU ANALOGUES POUR STIMULER LA SYNTHESE DE
CELLULES DE LA PEAU
L'invention se rapporte à un procédé pour augmenter le taux de s différenciation et/ou de prolifération des fibroblastes de la peau et/ou augmenter le taux de différenciation des kératinocytes de la peau en appliquant sur la peau une composition comprenant une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'au moins un de ses analogues.
Elle a également trait à un procédé pour stimuler la synthèse de la vimentine io cutanée en appliquant sur la peau une composition comprenant une quantité
efficace d'acide ascorbique ou d'au moins un de ses analogues. Elle a en outre trait à un procédé pour stimuler la synthèse de la kératine 10 cutanée en appliquant sur la peau une composition comprenant une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'au moins un de ses analogues.
is La peau humaine est constituée de deux compartiments à savoir un compartiment superficiel, l'épiderme, et un compartiment profond, le derme.
L'épiderme humain naturel est composé principalement de trois types de 2o cellules qui sont les kératinocytes, très majoritaires, les mélanocytes et les cellules de Langerhans. Chacun de ces types cellulaires contribue par ses fonctions propres au rôle essentiel joué dans l'organisme par la peau, notamment le rôle de protection de l'organisme des agressions extérieures (climat, rayons ultraviolets, tabac, ...), appelé "fonction barrière". Un mauvais 2s renouvellement de ces cellules et plus particulièrement des kératinocytes, qui s'observe notamment avec l'âge, entraîne une mauvaise protection de la peau, la peau présente alors un aspect sec et/ou terne.
Le derme fournit à l'épiderme un support solide. C'est également son 3o élément nourricier. II est principalement constitué de fibroblastes et d'une matrice extracellulaire composée elle-méme principalement de collagène, d'élastine et d'une substance, dite substance fondamentale, composants synthétisés par le fibroblaste. On y trouve aussi des leucocytes, des
CELLULES DE LA PEAU
L'invention se rapporte à un procédé pour augmenter le taux de s différenciation et/ou de prolifération des fibroblastes de la peau et/ou augmenter le taux de différenciation des kératinocytes de la peau en appliquant sur la peau une composition comprenant une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'au moins un de ses analogues.
Elle a également trait à un procédé pour stimuler la synthèse de la vimentine io cutanée en appliquant sur la peau une composition comprenant une quantité
efficace d'acide ascorbique ou d'au moins un de ses analogues. Elle a en outre trait à un procédé pour stimuler la synthèse de la kératine 10 cutanée en appliquant sur la peau une composition comprenant une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'au moins un de ses analogues.
is La peau humaine est constituée de deux compartiments à savoir un compartiment superficiel, l'épiderme, et un compartiment profond, le derme.
L'épiderme humain naturel est composé principalement de trois types de 2o cellules qui sont les kératinocytes, très majoritaires, les mélanocytes et les cellules de Langerhans. Chacun de ces types cellulaires contribue par ses fonctions propres au rôle essentiel joué dans l'organisme par la peau, notamment le rôle de protection de l'organisme des agressions extérieures (climat, rayons ultraviolets, tabac, ...), appelé "fonction barrière". Un mauvais 2s renouvellement de ces cellules et plus particulièrement des kératinocytes, qui s'observe notamment avec l'âge, entraîne une mauvaise protection de la peau, la peau présente alors un aspect sec et/ou terne.
Le derme fournit à l'épiderme un support solide. C'est également son 3o élément nourricier. II est principalement constitué de fibroblastes et d'une matrice extracellulaire composée elle-méme principalement de collagène, d'élastine et d'une substance, dite substance fondamentale, composants synthétisés par le fibroblaste. On y trouve aussi des leucocytes, des
2 mastocytes ou encore des macrophages tissulaires. II est également traversée par des vaisseaux sanguins et des fibres nerveuses.
Les fibres de vimentine se trouvent de manière importante dans le derme, s puisqu'elles correspondent au filament intermédiaire des fibroblastes. Ces fibres de vimentine sont également présentes dans les mélanocytes et dans les cellules de Langerhans de l'épiderme, elles peuvent être également présentes dans les kératinocytes lorsque celles-ci sont dans un état hyperproliférant.
io Les kératines sont les filaments intermédiaires des cellules épithéliales, telles que les kératinocytes dans la peau. Ainsi, il existe dans l'épiderme quatre types de kératines, dont la kératine 10, appelée K10, spécifique de l'état de différenciation des kératinocytes.
is Avec l'âge, la qualité de la peau diminue, notamment on observe un amincissement du derme. II est également admis que des facteurs extrinsèques comme les rayons ultraviolets, le tabac ou certains traitements (Glucocorticoïdes, vitamine D et dérivés par exemple) ont également un effet 2o négatif sur la peau.
On comprend alors l'importance du renouvellement cellulaire et de la qualité
de ce renouvellement, tant au niveau de l'épiderme qu'au niveau du derme, pour ainsi lutter contre les agressions extrinsèques qui endommagent la 2s peau, notamment en diminuant sa fonction barrière, et contre les signes du vieillissement cutané qu'il soit chronobiologique ou photo-induit.
Un des buts de la présente invention est donc d'augmenter le taux de différenciation et/ou de prolifération des fibroblastes de la peau et/ou 3o augmenter le taux de différenciation des kératinocytes de la peau pour ainsi lutter contre les agressions extrinsèques, qu'elles soient physiques ou chimiques, qui endommagent la peau, notamment en diminuant sa fonction
Les fibres de vimentine se trouvent de manière importante dans le derme, s puisqu'elles correspondent au filament intermédiaire des fibroblastes. Ces fibres de vimentine sont également présentes dans les mélanocytes et dans les cellules de Langerhans de l'épiderme, elles peuvent être également présentes dans les kératinocytes lorsque celles-ci sont dans un état hyperproliférant.
io Les kératines sont les filaments intermédiaires des cellules épithéliales, telles que les kératinocytes dans la peau. Ainsi, il existe dans l'épiderme quatre types de kératines, dont la kératine 10, appelée K10, spécifique de l'état de différenciation des kératinocytes.
is Avec l'âge, la qualité de la peau diminue, notamment on observe un amincissement du derme. II est également admis que des facteurs extrinsèques comme les rayons ultraviolets, le tabac ou certains traitements (Glucocorticoïdes, vitamine D et dérivés par exemple) ont également un effet 2o négatif sur la peau.
On comprend alors l'importance du renouvellement cellulaire et de la qualité
de ce renouvellement, tant au niveau de l'épiderme qu'au niveau du derme, pour ainsi lutter contre les agressions extrinsèques qui endommagent la 2s peau, notamment en diminuant sa fonction barrière, et contre les signes du vieillissement cutané qu'il soit chronobiologique ou photo-induit.
Un des buts de la présente invention est donc d'augmenter le taux de différenciation et/ou de prolifération des fibroblastes de la peau et/ou 3o augmenter le taux de différenciation des kératinocytes de la peau pour ainsi lutter contre les agressions extrinsèques, qu'elles soient physiques ou chimiques, qui endommagent la peau, notamment en diminuant sa fonction
3 barrière, et contre le vieillissement cutané qu'il soit chronobiologique ou photo-induit.
Or, la demanderesse a maintenant découvert que l'acide ascorbique s appliqué topiquement sur la peau augmente le taux de différenciation etlou de prolifération des fibroblastes de la peau et/ou augmente le taux de différenciation des kératinocytes de la peau en appliquant sur la peau une composition comprenant une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'au moins un de ses analogues.
io L'acide ascorbique (ou vitamine C) est connu pour stimuler la synthèse de collagène, en empêchant, en tant que co-facteur, l'auto-inactivation des enzymes lysine- ét proline- hydroxylases et en augmentant la synthèse des ARNm de procollagènes. L'acide ascorbique (ou vitamine C) est également is connu pour stimuler la synthèse de l'élastine de la peau. On peut citer à
cet égard les brevets US 5801192, US 4983382 et EP 0717983. On peut également citer un article intitulé "Pola to incorporate vitamin C in new cosmetics line for skip care" du Japan Economic Journal du 5 juin 1984 (page 15). Ainsi, il a été décrit que l'acide ascorbique utilisé dans des Zo compositions cosmétiques permet de traiter notamment les rides (Fragrance Journal, Vol.B, N°6(45) (1980) pp38-43, "Cosmetic and vitamin -action and safety to dermatology").
L'invention a donc pour objet l'utilisation d'une quantité efficace d'acide 2s ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la préparation d'une composition destinée à étre appliquée sur la peau pour augmenter le taux de différenciation et/ou de prolifération des fibroblastes de la peau et/ou augmenter le taux de différenciation des kératinocytes de la peau.
L'invention a pour troisième objet l'utilisation d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la
Or, la demanderesse a maintenant découvert que l'acide ascorbique s appliqué topiquement sur la peau augmente le taux de différenciation etlou de prolifération des fibroblastes de la peau et/ou augmente le taux de différenciation des kératinocytes de la peau en appliquant sur la peau une composition comprenant une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'au moins un de ses analogues.
io L'acide ascorbique (ou vitamine C) est connu pour stimuler la synthèse de collagène, en empêchant, en tant que co-facteur, l'auto-inactivation des enzymes lysine- ét proline- hydroxylases et en augmentant la synthèse des ARNm de procollagènes. L'acide ascorbique (ou vitamine C) est également is connu pour stimuler la synthèse de l'élastine de la peau. On peut citer à
cet égard les brevets US 5801192, US 4983382 et EP 0717983. On peut également citer un article intitulé "Pola to incorporate vitamin C in new cosmetics line for skip care" du Japan Economic Journal du 5 juin 1984 (page 15). Ainsi, il a été décrit que l'acide ascorbique utilisé dans des Zo compositions cosmétiques permet de traiter notamment les rides (Fragrance Journal, Vol.B, N°6(45) (1980) pp38-43, "Cosmetic and vitamin -action and safety to dermatology").
L'invention a donc pour objet l'utilisation d'une quantité efficace d'acide 2s ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la préparation d'une composition destinée à étre appliquée sur la peau pour augmenter le taux de différenciation et/ou de prolifération des fibroblastes de la peau et/ou augmenter le taux de différenciation des kératinocytes de la peau.
L'invention a pour troisième objet l'utilisation d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la
4 préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour stimuler la synthèse de la vimentine cutanée.
L'invention a pour quatrième objet l'utilisation d'une quantité efficace d'acide s ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour stimuler la synthèse de la kératine 10 cutanée.
L'invention a en outre pour objet un procédé pour augmenter le taux de io différenciation etlou de prolifération des fibroblastes de la peau chez une personne ayant un taux de différenciation et/ou de prolifération des fibroblastes anormalement bas, comprenant l'application topique sur la peau d'une quantité
efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues.
is L'invention a encore pour objet un procédé pour augmenter le taux de différenciation des kératinocytes de la peau chez une personne ayant un taux de différenciation des kératinocytes anormalement bas, comprenant l'application topique sur la peau d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues.
En effet, la demanderesse a découvert que l'acide ascorbique appliqué
topiquement sur la peau permet d'augmenter la synthèse d'ARNm de la vimentine et ainsi d'augmenter le taux de synthèse de vimentine. Elle a également découvert que l'acide ascorbique appliqué topiquement sur la 2s peau permet d'augmenter la synthèse d'ARNm de la kératine 10 et ainsi d'augmenter le taux de synthèse de la kératine 10.
Ces protéines, filaments intermédiaires de cellules de la peau, sont donc représentatives de l'état proliférant et/ou différenciant des cellules de la 3o peau, plus particulièrement des cellules du derme et de l'épiderme. Plus particulièrement, la vimentine, qui est le filament intermédiaire des fibroblastes, est représentative de l'état proliférant et/ou différenciant des fibroblastes et la kératine 10 est représentative de l'état différenciant des kératinocytes.
Ainsi, par application topique d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou s de ses analogues, le renouvellement de cescellules de la peau est plus rapide, l'aspect de la peau est amélioré, la peau est plus éclatante, moins terne, plus ferme, plus tonique, plus élastique, les rides sont atténuées ou leurs apparitions sont retardées, les signes cutanés du vieillissement sont diminuées.
io Avantageusement, le rapport de la synthèse des ARNm de la vimentine sur celle de la kératine 10 due à l'application topique de l'acide ascorbique est comparable à celui sans application topique de l'acide ascorbique. Ceci indique que l'état de la peau, après application topique de l'acide ascorbique, is est maintenue dans un état normal (sans par exemple une hyper-prolifération ou -différenciation d'un compartiment dermique ou épidermique par rapport à l'autre).
Les analogues de l'acide ascorbique sont, plus particulièrement, ses sels, 2o tels que notamment l'ascorbate de sodium, l'ascorbylphosphate de magnésium ou de sodium, ses esters, tels que notamment ses esters acétique, propionique ou palmitique, ou ses sucres, tels que notamment l'acide ascorbique glycosilé.
2s L'acide ascorbique est généralement sous forme L, car il est habituellement extrait de produits naturels.
La quantité efficace d'acide ascorbique ou de ses analogues utilisable selon l'invention est bien entendu celle qui est nécessaire pour obtenir les effets 3o attendus selon l'invention. Pour donner un ordre de grandeur, cette quantité
représente préférentiellement de 0,001 % à 20% du poids total de la composition, préférentiellement de 0,1% à 15% du poids total de la composition et avantageusement de 3% à 10% du poids total de la composition.
En outre, la composition de l'invention est utilisée pendant un temps suffisant s pour obtenir les effets attendus selon l'invention. Pour donner un ordre de grandeur, cette durée peut être au minimum de 15 jours, mais peut être aussi de plus de 4 semaines, voire de plus de 8 semaines.
La composition de l'invention destinée à une application topique contient un io milieu physiologiquement acceptable, c'est-à-dire compatible avec la peau y compris le cuir chevelu, les muqueuses etlou les yeux et peut constituer notamment une composition cosmétique ou dermatologique.
Cette composition peut se présenter sous toutes les formes galéniques is normalement utilisées dans les domaines cosmétique et dermatologique, et elle peut être notamment sous forme d'une solution aqueuse éventuellement gélifiée, d'une dispersion du type lotion éventuellement biphasée, d'une émulsion obtenue par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse (H/E) ou inversement (E/H), ou d'une émulsion triple (E/HlE ou 2o H/E/H) ou d'une dispersion vésiculaire de type ionique et/ou non ionique.
Ces compositions sont préparées selon les méthodes usuelles.
La composition de l'invention peut constituer par exemple une lotion, un gel, une crème ou un lait, et par exemple une lotion ou un lait de démaquillage 2s ou de nettoyage, un shampooing ou un gel douche.
L'exemple suivant illustre l'invention sans la limiter aucunement. Dans les compositions les proportions indiquées sont des pourcentages en poids, sauf mention contraire.
Exemple 1. Méthode On a appliqué sur le bas du cou de 10 femmes entre 55 et 60 ans pendant 3 s mois, une fois par jour, d'un côté une émulsion eau dans huile (Véhicule ou Placébo) et d'un autre côté la même émulsion eau dans huile, mais comprenant également 5 % de vitamine C (= Composition ou Actif).
Composition lo Acide L-ascorbique 5,00 Hydroxyde de sodium 1,83 Acide citrique,1 H20 1,24 Disodium EDTA 0,05 Huile d'amandes d'abricot 3,00 is Huile de silicone 4 Cyclopentasiloxane et dimethicone copolyol 20 Dimethicone et dimethiconol 3 %
Glycerin 23 2o Propylene glycol 4 %
Charges 7 %
Conservateurs 0,30 Eau qsp 100,00 2s On procède ensuite à des biopsies de ces surfaces traitées.
2. Extraction et purification des ARN totaux.
Les biopsies sont broyées sous azote liquide dans un Mikrodismembrator S
30 (Braun). La poudre obtenue est récoltée dans la capsule de téflon par 2 ml de solution de lyse (isothiocyanate de guanidine 5M, mercaptoéthanol, 0,1M, laurylsucosyl de Na 0,017M, citrate Na 0,025M, pH7, antifoam 3 pl/ml). La suspension est transférée dans un tube mis sous agitation à température ambiante durant 15 minutes. Le lysat est déposé à la surtace d'un coussin de 1,4 ml de chlorure de Césium 5,7M, EDTA 0, 1M, pH 7 dans un tube de polyallomer de 3,8 ml pour le rotor SW60 (Ultracentrifugeuse Beckman L70M). Une ultracentrifugation à 35.000 RPM est réalisée durant 18 heures s à 20°C. Le culot est rincé à féthanol absolu, centrifugé à 13.000 RPM, 4°C, minutes et mis en solution dans 100 ~,I d'eau distillée.
3. Quantification de la concentration en ARN total et en ARNm spécifiques.
lo La quantité d'ARN récolté à partir des biopsies est estimée par la densité
optique de la solution à 260 nm puis mesurée en amplifiant par RT-PCR
TARN ribosomial 28S. La mesure des ARNm spécifiques est réalisée par RT-PCR quantitative sur des aliquots de la même dilution d'ARN total, conservées à -80°C jusqu'à leur utilisation.
Mesure de l'ARNm de la kératine 10 (K10) et de la vimentine Les amorces oligonucléotidiques spécifiques des gènes étudiés comportent 24 bases, ont un % de A - T proche de 50 % et sont choisies 2o sur deux exons différents afin d'éviter l'amplification d'éventuelles traces d'ADN présentes dans les échantillons. Les conditions optimales d'amplification (température et nombre de cycles) ont été déterminées pour chacun des gènes étudiés en tenant compte de leur niveau d'expression dans la peau. La RT-PCR est réalisée à l'aide du kit Gene Amp rTth de Perkin Elmer ou du kit Titam de Boehringer.
Chaque réaction de RT-PCR est réalisée en présence d'un nombre connu de copies d'un ARN synthétique créé en laboratoire contenant les séquences des amorces oligonucléotidiques spécifiques des ARNm 3o d'intérêt et dont le produit d'amplification a une taille moléculaire permettant de le discriminer de fARNm endogène. Ce multistandard permet de contrôler et de calculer le rendement de la transcription réverse et de la réaction d'amplification.
Les produits d'amplification sont analysés par électrophorèse en gel de polyacrylamide suivie d'une coloration au CyberGreen. L'intensité des signaux fluorescents est mesurée à l'aide d'un Fluoro S Multilmager.
s Les résultats sont corrigés pour te rendement de la RT-PCR et exprimés en unités arbitraires par unité d'ARN 28 S ribosomial 4. Analyse statistique lo L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du t-Test de Student unilatéral sur les rapports des valeurs Actif (Vitamine C)/Placebo (= A/P).
t(n-1)=(MA/P-1)Vn M écarts - types is Pour un degré de liberté n-1 - 9, le rapport A/P est significativement supérieur à 1 avec une probabilité supérieure à 95 % pour une valeur de t >
1,83 et une probabilité supérieure à 99 % pour une valeur de t > 2,82.
20 5. Résultats Mesure de l'ARN total obtenu à partir des biopsies La quantité totale d'ARN purifié à partir des biopsies est évaluée dans un 2s premier temps par mesure de la densité optique à 260 nm et leur qualité
estimée par la mesure du rapport des DO 260/290 nm.
Des quantités largement suffisantes d'ARN ont été obtenues à partir de chacune des biopsies (entre 2,1 et 6,3 ~g) avec un degré de pureté (rapport 3o de D.O. 260/280) satisfaisant.
La concentration en ARN total est amenée par dilution à une valeur calculée de 4 nanogrammes par ~I. Ce procédé permet de réaliser les réactions de transcription reverse et d'amplification sur des quantités similaires d'ARN
total pour tous les échantillons. La quantité d'ARN total présente dans la solution diluée est déterminée de façon quantitative par mesure de l'ARN
ribosomial 28S, réalisée en triplicate.
s Cette même solution d'ARN sera utilisée pour toutes les mesures des ARNs spécifiques dont les résultats sont exprimés par unité d'ARN 28S.
Mesure du taux à l'équilibre des ARNm de la vimentine et de la kératine 10 io Les résultats exprimés en unités arbitraires par unité d'ARN 28S sont détaillés dans les tableaux 1 et 2.
Tableau 1: ARNm de la vimentine sujet Actif Placbo A/P
a 96,7 51,4 1,88 b 70,9 55,0 1,29 c 67,5 77,7 0,87 d 200,3 131,1 1,53 e 123,0 91,1 1,35 f 106,0 102,5 1,03 9 98,5 92,5 1,06 h 81,4 98,6 0,83 i 112,9 128,6 0,88 j 81,7 66,1 1,24 Moyenne 103,9 89,5 1,20*
Ecart-type 38,4 ~ 27,6 0,33 Is Test de Student unilatéral : *t =2,02, P< 0,05 Sept sujets sur 10 présentent un taux à l'équilibre de l'ARNm de la vimentine accru par l'acide ascorbique.
Tableau 2 : ARNm de la kératine 10 (K10) sujet Actif Placbo A/P
a 13,4 8,5 1,58 b 10,3 3,9 2,64 c 12,8 13,8 0,93 d 44,2 48,9 0,90 e 25,5 21,8 1,17 f 40,0 23,8 1,68 g 27,4 14,6 1,88 h 21,6 ~ 18,4 1,17 i 35,2 28,7 1,23 j 19,5 13,4 1,46 Moyenne 25,0 19,6 1,46**
Ecart-type 11,8 ~ 12,6 ~ 0,52 Test de Student unilatéral : **t = 2,95, p < 0,01 Huit sujets sur dix présentent un taux à l'équilibre de l'ARNm de la kératine accru avec l'acide ascorbique.
lo Le rapport vimentine/kératine 10 est détaillé dans le tableau 3.
ls Tableau 3: Rapport vimentine / kératine 10 (VIM / KIO) sujet Actif Placbo 7,22 6,05 b 6,88 [14,10]
c 5,27 5,63 d 4,53 2,68 e 4, 82 4,18 f 2,65 4,31 g 3,59 6,34 h 3,77 5,36 i 3,21 4,48 j 4,19 4,93 Moyenne 4,61 ~ 4,88 s Ces résultats indiquent que les biopsies contiennent une proportion d'ARNm de la kératine 10 et de la vimentine, comparable du côté traité par l'acide ascorbique et le placebo. Les résultats indiquent également que les biopsies ont été
réalisées de manière uniforme chez les différents individus. L'échantillon b-placebo est en dehors de la norme.
lo Lorsque les mesures de la vimentine sont rapportées aux mesures équivalentes faites pour l'ARNm procollagènes I ou III, la valeur moyenne de ces rapports calculée sur la série des échantillons traités et des échantillons placebo est très proche indiquant une modulation coordonnée de l'expression des procollagènes et ls de la vimentine. En outre, si on considère que fa vimentine est représentative du compartiment dermique, puisqu'elle est le filament intermédiaire des fibroblastes, alors l'augmentation de l'expression des procollagènes I et III s'accompagne d'un accroissement parallèle de l'expression de la vimentine et suggère que l'acide ascorbique induit soit un accroissement du nombre de cellules conjonctives du 2o derme soit l'activation de leur phénotype biosynthétique.
L'invention a pour quatrième objet l'utilisation d'une quantité efficace d'acide s ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour stimuler la synthèse de la kératine 10 cutanée.
L'invention a en outre pour objet un procédé pour augmenter le taux de io différenciation etlou de prolifération des fibroblastes de la peau chez une personne ayant un taux de différenciation et/ou de prolifération des fibroblastes anormalement bas, comprenant l'application topique sur la peau d'une quantité
efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues.
is L'invention a encore pour objet un procédé pour augmenter le taux de différenciation des kératinocytes de la peau chez une personne ayant un taux de différenciation des kératinocytes anormalement bas, comprenant l'application topique sur la peau d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues.
En effet, la demanderesse a découvert que l'acide ascorbique appliqué
topiquement sur la peau permet d'augmenter la synthèse d'ARNm de la vimentine et ainsi d'augmenter le taux de synthèse de vimentine. Elle a également découvert que l'acide ascorbique appliqué topiquement sur la 2s peau permet d'augmenter la synthèse d'ARNm de la kératine 10 et ainsi d'augmenter le taux de synthèse de la kératine 10.
Ces protéines, filaments intermédiaires de cellules de la peau, sont donc représentatives de l'état proliférant et/ou différenciant des cellules de la 3o peau, plus particulièrement des cellules du derme et de l'épiderme. Plus particulièrement, la vimentine, qui est le filament intermédiaire des fibroblastes, est représentative de l'état proliférant et/ou différenciant des fibroblastes et la kératine 10 est représentative de l'état différenciant des kératinocytes.
Ainsi, par application topique d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou s de ses analogues, le renouvellement de cescellules de la peau est plus rapide, l'aspect de la peau est amélioré, la peau est plus éclatante, moins terne, plus ferme, plus tonique, plus élastique, les rides sont atténuées ou leurs apparitions sont retardées, les signes cutanés du vieillissement sont diminuées.
io Avantageusement, le rapport de la synthèse des ARNm de la vimentine sur celle de la kératine 10 due à l'application topique de l'acide ascorbique est comparable à celui sans application topique de l'acide ascorbique. Ceci indique que l'état de la peau, après application topique de l'acide ascorbique, is est maintenue dans un état normal (sans par exemple une hyper-prolifération ou -différenciation d'un compartiment dermique ou épidermique par rapport à l'autre).
Les analogues de l'acide ascorbique sont, plus particulièrement, ses sels, 2o tels que notamment l'ascorbate de sodium, l'ascorbylphosphate de magnésium ou de sodium, ses esters, tels que notamment ses esters acétique, propionique ou palmitique, ou ses sucres, tels que notamment l'acide ascorbique glycosilé.
2s L'acide ascorbique est généralement sous forme L, car il est habituellement extrait de produits naturels.
La quantité efficace d'acide ascorbique ou de ses analogues utilisable selon l'invention est bien entendu celle qui est nécessaire pour obtenir les effets 3o attendus selon l'invention. Pour donner un ordre de grandeur, cette quantité
représente préférentiellement de 0,001 % à 20% du poids total de la composition, préférentiellement de 0,1% à 15% du poids total de la composition et avantageusement de 3% à 10% du poids total de la composition.
En outre, la composition de l'invention est utilisée pendant un temps suffisant s pour obtenir les effets attendus selon l'invention. Pour donner un ordre de grandeur, cette durée peut être au minimum de 15 jours, mais peut être aussi de plus de 4 semaines, voire de plus de 8 semaines.
La composition de l'invention destinée à une application topique contient un io milieu physiologiquement acceptable, c'est-à-dire compatible avec la peau y compris le cuir chevelu, les muqueuses etlou les yeux et peut constituer notamment une composition cosmétique ou dermatologique.
Cette composition peut se présenter sous toutes les formes galéniques is normalement utilisées dans les domaines cosmétique et dermatologique, et elle peut être notamment sous forme d'une solution aqueuse éventuellement gélifiée, d'une dispersion du type lotion éventuellement biphasée, d'une émulsion obtenue par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse (H/E) ou inversement (E/H), ou d'une émulsion triple (E/HlE ou 2o H/E/H) ou d'une dispersion vésiculaire de type ionique et/ou non ionique.
Ces compositions sont préparées selon les méthodes usuelles.
La composition de l'invention peut constituer par exemple une lotion, un gel, une crème ou un lait, et par exemple une lotion ou un lait de démaquillage 2s ou de nettoyage, un shampooing ou un gel douche.
L'exemple suivant illustre l'invention sans la limiter aucunement. Dans les compositions les proportions indiquées sont des pourcentages en poids, sauf mention contraire.
Exemple 1. Méthode On a appliqué sur le bas du cou de 10 femmes entre 55 et 60 ans pendant 3 s mois, une fois par jour, d'un côté une émulsion eau dans huile (Véhicule ou Placébo) et d'un autre côté la même émulsion eau dans huile, mais comprenant également 5 % de vitamine C (= Composition ou Actif).
Composition lo Acide L-ascorbique 5,00 Hydroxyde de sodium 1,83 Acide citrique,1 H20 1,24 Disodium EDTA 0,05 Huile d'amandes d'abricot 3,00 is Huile de silicone 4 Cyclopentasiloxane et dimethicone copolyol 20 Dimethicone et dimethiconol 3 %
Glycerin 23 2o Propylene glycol 4 %
Charges 7 %
Conservateurs 0,30 Eau qsp 100,00 2s On procède ensuite à des biopsies de ces surfaces traitées.
2. Extraction et purification des ARN totaux.
Les biopsies sont broyées sous azote liquide dans un Mikrodismembrator S
30 (Braun). La poudre obtenue est récoltée dans la capsule de téflon par 2 ml de solution de lyse (isothiocyanate de guanidine 5M, mercaptoéthanol, 0,1M, laurylsucosyl de Na 0,017M, citrate Na 0,025M, pH7, antifoam 3 pl/ml). La suspension est transférée dans un tube mis sous agitation à température ambiante durant 15 minutes. Le lysat est déposé à la surtace d'un coussin de 1,4 ml de chlorure de Césium 5,7M, EDTA 0, 1M, pH 7 dans un tube de polyallomer de 3,8 ml pour le rotor SW60 (Ultracentrifugeuse Beckman L70M). Une ultracentrifugation à 35.000 RPM est réalisée durant 18 heures s à 20°C. Le culot est rincé à féthanol absolu, centrifugé à 13.000 RPM, 4°C, minutes et mis en solution dans 100 ~,I d'eau distillée.
3. Quantification de la concentration en ARN total et en ARNm spécifiques.
lo La quantité d'ARN récolté à partir des biopsies est estimée par la densité
optique de la solution à 260 nm puis mesurée en amplifiant par RT-PCR
TARN ribosomial 28S. La mesure des ARNm spécifiques est réalisée par RT-PCR quantitative sur des aliquots de la même dilution d'ARN total, conservées à -80°C jusqu'à leur utilisation.
Mesure de l'ARNm de la kératine 10 (K10) et de la vimentine Les amorces oligonucléotidiques spécifiques des gènes étudiés comportent 24 bases, ont un % de A - T proche de 50 % et sont choisies 2o sur deux exons différents afin d'éviter l'amplification d'éventuelles traces d'ADN présentes dans les échantillons. Les conditions optimales d'amplification (température et nombre de cycles) ont été déterminées pour chacun des gènes étudiés en tenant compte de leur niveau d'expression dans la peau. La RT-PCR est réalisée à l'aide du kit Gene Amp rTth de Perkin Elmer ou du kit Titam de Boehringer.
Chaque réaction de RT-PCR est réalisée en présence d'un nombre connu de copies d'un ARN synthétique créé en laboratoire contenant les séquences des amorces oligonucléotidiques spécifiques des ARNm 3o d'intérêt et dont le produit d'amplification a une taille moléculaire permettant de le discriminer de fARNm endogène. Ce multistandard permet de contrôler et de calculer le rendement de la transcription réverse et de la réaction d'amplification.
Les produits d'amplification sont analysés par électrophorèse en gel de polyacrylamide suivie d'une coloration au CyberGreen. L'intensité des signaux fluorescents est mesurée à l'aide d'un Fluoro S Multilmager.
s Les résultats sont corrigés pour te rendement de la RT-PCR et exprimés en unités arbitraires par unité d'ARN 28 S ribosomial 4. Analyse statistique lo L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du t-Test de Student unilatéral sur les rapports des valeurs Actif (Vitamine C)/Placebo (= A/P).
t(n-1)=(MA/P-1)Vn M écarts - types is Pour un degré de liberté n-1 - 9, le rapport A/P est significativement supérieur à 1 avec une probabilité supérieure à 95 % pour une valeur de t >
1,83 et une probabilité supérieure à 99 % pour une valeur de t > 2,82.
20 5. Résultats Mesure de l'ARN total obtenu à partir des biopsies La quantité totale d'ARN purifié à partir des biopsies est évaluée dans un 2s premier temps par mesure de la densité optique à 260 nm et leur qualité
estimée par la mesure du rapport des DO 260/290 nm.
Des quantités largement suffisantes d'ARN ont été obtenues à partir de chacune des biopsies (entre 2,1 et 6,3 ~g) avec un degré de pureté (rapport 3o de D.O. 260/280) satisfaisant.
La concentration en ARN total est amenée par dilution à une valeur calculée de 4 nanogrammes par ~I. Ce procédé permet de réaliser les réactions de transcription reverse et d'amplification sur des quantités similaires d'ARN
total pour tous les échantillons. La quantité d'ARN total présente dans la solution diluée est déterminée de façon quantitative par mesure de l'ARN
ribosomial 28S, réalisée en triplicate.
s Cette même solution d'ARN sera utilisée pour toutes les mesures des ARNs spécifiques dont les résultats sont exprimés par unité d'ARN 28S.
Mesure du taux à l'équilibre des ARNm de la vimentine et de la kératine 10 io Les résultats exprimés en unités arbitraires par unité d'ARN 28S sont détaillés dans les tableaux 1 et 2.
Tableau 1: ARNm de la vimentine sujet Actif Placbo A/P
a 96,7 51,4 1,88 b 70,9 55,0 1,29 c 67,5 77,7 0,87 d 200,3 131,1 1,53 e 123,0 91,1 1,35 f 106,0 102,5 1,03 9 98,5 92,5 1,06 h 81,4 98,6 0,83 i 112,9 128,6 0,88 j 81,7 66,1 1,24 Moyenne 103,9 89,5 1,20*
Ecart-type 38,4 ~ 27,6 0,33 Is Test de Student unilatéral : *t =2,02, P< 0,05 Sept sujets sur 10 présentent un taux à l'équilibre de l'ARNm de la vimentine accru par l'acide ascorbique.
Tableau 2 : ARNm de la kératine 10 (K10) sujet Actif Placbo A/P
a 13,4 8,5 1,58 b 10,3 3,9 2,64 c 12,8 13,8 0,93 d 44,2 48,9 0,90 e 25,5 21,8 1,17 f 40,0 23,8 1,68 g 27,4 14,6 1,88 h 21,6 ~ 18,4 1,17 i 35,2 28,7 1,23 j 19,5 13,4 1,46 Moyenne 25,0 19,6 1,46**
Ecart-type 11,8 ~ 12,6 ~ 0,52 Test de Student unilatéral : **t = 2,95, p < 0,01 Huit sujets sur dix présentent un taux à l'équilibre de l'ARNm de la kératine accru avec l'acide ascorbique.
lo Le rapport vimentine/kératine 10 est détaillé dans le tableau 3.
ls Tableau 3: Rapport vimentine / kératine 10 (VIM / KIO) sujet Actif Placbo 7,22 6,05 b 6,88 [14,10]
c 5,27 5,63 d 4,53 2,68 e 4, 82 4,18 f 2,65 4,31 g 3,59 6,34 h 3,77 5,36 i 3,21 4,48 j 4,19 4,93 Moyenne 4,61 ~ 4,88 s Ces résultats indiquent que les biopsies contiennent une proportion d'ARNm de la kératine 10 et de la vimentine, comparable du côté traité par l'acide ascorbique et le placebo. Les résultats indiquent également que les biopsies ont été
réalisées de manière uniforme chez les différents individus. L'échantillon b-placebo est en dehors de la norme.
lo Lorsque les mesures de la vimentine sont rapportées aux mesures équivalentes faites pour l'ARNm procollagènes I ou III, la valeur moyenne de ces rapports calculée sur la série des échantillons traités et des échantillons placebo est très proche indiquant une modulation coordonnée de l'expression des procollagènes et ls de la vimentine. En outre, si on considère que fa vimentine est représentative du compartiment dermique, puisqu'elle est le filament intermédiaire des fibroblastes, alors l'augmentation de l'expression des procollagènes I et III s'accompagne d'un accroissement parallèle de l'expression de la vimentine et suggère que l'acide ascorbique induit soit un accroissement du nombre de cellules conjonctives du 2o derme soit l'activation de leur phénotype biosynthétique.
Claims (11)
1. Utilisation d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues dans la préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour augmenter le taux de différenciation des fibroblastes de la peau.
2. Utilisation d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues dans ta préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour augmenter le taux de différenciation des kératinocytes de la peau.
3. Utilisation d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour stimuler ta synthèse de la vimentine cutanée.
4. Utilisation d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues dans une composition ou dans la préparation d'une composition destinée à être appliquée sur la peau pour stimuler la synthèse de la kératine 10 cutanée.
5. Utilisation selon l'une des revendications précédentes, caractérisée par le fait que les analogues de l'acide ascorbique sont choisis parmi ses sels, ses esters, et ses sucres.
6. Utilisation selon la revendications précédente, caractérisée en ce que les analogues de l'acide ascorbique sont choisis parmi fascorbate de sodium, l'ascorbylphosphate de magnésium, de sodium, ses esters, acétique, propionique, palmitique et l'acide ascorbique glycosilé.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée par le fiait que ia quantité d'acide ascorbique ou de ses analogues représente de 0,001 % à 20%, préférentiellement de 0,1% à 15%, et avantageusement de 3% à
10% du poids total de la composition.
10% du poids total de la composition.
8. Procédé pour augmenter ta synthèse de vimentine cutanée chez une personne déficiente en vimentine cutanée comprenant l'application topique sur la peau d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues.
9. Procédé pour augmenter la synthèse de kératine 10 cutanée chez une personne déficiente en kératine 10 cutanée comprenant l'application topique sur la peau d'une quantité efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues.
10. Procédé pour augmenter le taux de différenciation des fibroblastes de la peau chez une personne ayant un taux de différenciation des fibrobtastes anormalement bas, comprenant, l'application topique sur la peau d'une quantité
efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues.
efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues.
11. Procédé pour augmenter le taux de différenciation des kératinocytes de la peau chez une personne ayant un taux de différenciation des kératinocytes anormalement bas, comprenant l'application topique sur la peau d'une quantité
efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues.
efficace d'acide ascorbique ou d'un de ses analogues.
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