EP1144606A2 - Menschliche angiogeneserelevante nukleinsäure- und protein-sequenzen aus endothelzellen - Google Patents

Menschliche angiogeneserelevante nukleinsäure- und protein-sequenzen aus endothelzellen

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Publication number
EP1144606A2
EP1144606A2 EP00909340A EP00909340A EP1144606A2 EP 1144606 A2 EP1144606 A2 EP 1144606A2 EP 00909340 A EP00909340 A EP 00909340A EP 00909340 A EP00909340 A EP 00909340A EP 1144606 A2 EP1144606 A2 EP 1144606A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
seq
sequences
sequence
acid sequence
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP00909340A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Karl-Heinz Thierauch
Jens Glienke
Bernd Hinzmann
Christian Pilarsky
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer Pharma AG
Original Assignee
Schering AG
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Filing date
Publication date
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Priority claimed from DE19948679A external-priority patent/DE19948679A1/de
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Publication of EP1144606A2 publication Critical patent/EP1144606A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers

Definitions

  • the invention relates to nucleic acid sequences -mRNA, cDNA, genomic sequences- from tissue of human endothelial cells, which code for gene products or parts thereof, and their use.
  • the invention further relates to the polypeptides obtainable via the sequences and their use.
  • Angiogenesis is a process that can be observed in the adult in the cyclical processes of reproduction in women, in wound healing and in various pathological situations, such as.
  • Persistent angiogenesis can be the cause of various diseases such as psoriasis, arthritis, such as rheumatoid arthritis, hemangioma, angiofibroma, eye diseases such as diabetic retinopathy, neovascular glaucoma, renal diseases, such as glomerulonephritis, diabetic nephropathy, malignant nephrosclerosis, thrombogenic microangiopathic syndrome, transplant rejections and glomerulopathy, fibrotic Diseases such as cirrhosis of the liver, mesangial cell proliferative diseases and atherosclerosis or lead to an exacerbation of these diseases.
  • arthritis such as rheumatoid arthritis, hemangioma, angiofibroma
  • eye diseases such as diabetic retinopathy, neovascular glaucoma
  • renal diseases such as glomerulonephritis, diabetic nephropathy, malignant nephrosclerosis, thrombogenic
  • Nucleic acid sequences relevant to angiogenesis have now been found. These sequences have either not been described to date or are only known as rodent nucleic acid sequences, but without evidence of angiogenesis. Further sequences are described as human genes or parts thereof, but not with regard to possible angiogenesis-related properties.
  • endothelial cells were obtained from the foreskins of adults, which were cultivated in two ways:
  • the cells Under culture form b), the cells form network-like structures with tubular structures.
  • the cell culture form a) represents an early state of angiogenesis with a predominantly proliferative phenotype.
  • the cell culture form b) represents a model for a later phase of angiogenesis, in which the differentiation of the endothelial cells leads to the formation of tubular structures. These structures are a prerequisite for blood flow that is separated from the tissue surface.
  • MRNA is isolated from both cell culture forms, transcribed into cDNA, and with a restriction endonuclease into fragments of the size from 200 to 1500 bp cut.
  • the differentially occurring fragments of both states were amplified using a subtractive PCR technique. They were built into vectors and cloned. The clones were first sequenced and then their sequences were completed using bioinformatory techniques.
  • the nucleic acid sequences Seq. ID No. 1 to Seq. ID No. 59 are found that play a role as candidate genes in angiogenesis.
  • the invention thus relates to nucleic acid sequences encoding a gene product or a part thereof, comprising
  • nucleic acid sequence which is complementary to the nucleic acid sequences mentioned under a) or b).
  • the invention further relates to nucleic acid sequences according to one of the
  • the invention also relates to the nucleic acid sequences Seq. ID No. 1 to Seq. ID No. 59, which are expressed in increased endothelial cell tissue
  • the invention further relates to nucleic acid sequences comprising a part of the above-mentioned nucleic acid sequences, in such a sufficient size that they can be combined with the sequences Seq. ID No. 1 to Seq. ID No. 59 hybridize.
  • the nucleic acid sequences according to the invention generally have a length of at least 50 to 3000 bp, preferably a length of at least 150 to 2800 bp, particularly preferably a length of 150 to 2600 bp.
  • expression cassettes can also be constructed in accordance with current process practice, with at least one of the nucleic acid sequences according to the invention together with at least one control or regulatory sequence known to the person skilled in the art, such as, for example, on the cassette.
  • a suitable promoter is combined.
  • the sequences according to the invention can be inserted in sense or antisense orientation.
  • Expression cassettes or vectors are to be understood: 1. bacterial, such as. B., phagescript, pBs, ⁇ X174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene), pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia),
  • eukaryotic such as B. pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1, pSG
  • Suitable control or regulatory sequence means suitable promoters.
  • Two preferred vectors are the pKK232-8 and the PCM7 vector. Specifically, the following promoters are meant: lad, lacZ, T3, 17, gpt, lambda PR, trc, CMV, HSV thymidine kinase, SV40, LTRs from retrovirus and mouse metallothionein-I.
  • the DNA sequences on the expression cassette can encode a fusion protein which comprises a known protein and a biologically active polypeptide fragment.
  • the expression cassettes are also the subject of the present invention.
  • nucleic acid sequences according to the invention can also be used to produce full-length genes.
  • the available genes are also the subject of the present invention.
  • the invention also relates to the use of the nucleic acid sequences according to the invention and the gene fragments obtainable from the use.
  • nucleic acid sequences according to the invention can be brought into host lines with suitable vectors, in which the heterologous part contains the genetic information contained on the nucleic acid sequences which is expressed.
  • the host cells containing the nucleic acid sequences are also the subject of the present invention.
  • Suitable host cells are e.g. B. prokaryotic cell systems such as E. coli or eukaryotic cell systems such as animal or human cells or yeasts.
  • nucleic acid sequences according to the invention can be used in sense or antisense form.
  • polypeptides or their fragments are produced by cultivating the host cells in accordance with common cultivation methods and then isolating and purifying the peptides or fragments, likewise by means of conventional methods.
  • the invention further relates to nucleic acid sequences which encode at least a partial sequence of a biologically active polypeptide.
  • the present invention relates to partial polypeptide sequences, so-called ORF (open reading frame) peptides, which are expressed by the inventive partial sequences.
  • ORF open reading frame
  • the invention further relates to the polypeptide sequences which have at least 80% homology, in particular 90% homology to the polypeptides.
  • the invention also relates to antibodies which are directed against a polypeptide or a fragment which are derived from the nucleic acid sequences Seq. ID No. 1 to Seq. ID No. 59 can be encoded.
  • Antibodies are to be understood in particular as monoclonal antibodies.
  • polypeptides encoded by the nucleic acid sequences according to the invention can also be used as a tool for finding active substances angiogenic diseases can be used, which is also the subject of the present invention.
  • the present invention also relates to the use of the nucleic acid sequences according to the sequences Seq. ID No. 1 to Seq. ID No. 59 for the expression of polypeptides that can be used as tools for finding active substances against angiogenic diseases.
  • the invention also relates to the use of the nucleic acid sequences Seq according to the invention.
  • ID No. 1 to Seq. ID No. 59 expressed polypeptides as drugs in gene therapy for the treatment of angiogenic diseases, or for the manufacture of a drug for the treatment of angiogenic diseases.
  • nucleic acids according to the invention or the proteins expressed via these nucleic acids can thus be used either alone or in formulation as a medicament for the treatment of psoriasis, arthritis, such as rheumatoid arthritis, hemangioma, angiofribroma, eye diseases, such as diabetic retinopathy, neovascular glaucoma, kidney diseases, such as glomerulonephritis, diabetic Nephropathy, malignant nephrosclerosis, thrombic microangiopatic syndromes, transplant rejections and glomerulopathy, fibrotic diseases such as cirrhosis of the liver, mesangial cell proliferative diseases, atherosclerosis and injuries to the nerve tissue are used.
  • arthritis such as rheumatoid arthritis, hemangioma, angiofribroma
  • eye diseases such as diabetic retinopathy, neovascular glaucoma
  • kidney diseases such as glomerulonephritis, diabetic Nephro
  • the invention also relates to medicaments which contain at least one polypeptide sequence which is derived from the nucleic acid sequences Seq. ID No. 1 to Seq. ID No. 59 can be expressed.
  • the nucleic acid sequences according to the invention found can also be genomic or mRNA sequences.
  • the invention also relates to genomic genes, their promoters, enhancers, silencers, exon structure, intron structure and their splice variants, obtainable from the cDNAs of the sequences Seq. ID No. 1 to Seq. ID No. 59, and their use together with suitable regulatory elements, such as suitable promoters and / or enhancers.
  • genomic BAC, PAC and cosmid libraries are screened and specifically human clones are isolated via complementary base pairing (hybridization).
  • the BAC, PAC and cosmid clones isolated in this way are hybridized with the aid of fluorescence in situ hybridization to metaphase chromosomes and corresponding chromosome sections are identified on which the corresponding genomic genes lie.
  • BAC, PAC and cosmid clones are sequenced in order to elucidate the corresponding genomic genes in their complete structure (promoters, enhancers, silencers, exons and introns).
  • BAC, PAC and cosmid clones can be used as independent molecules for gene transfer.
  • the invention also relates to BAC, PAC and cosmid clones containing functional genes and their chromosomal localization, according to the sequences Seq. ID. No. 1 to Seq. ID No. 59, for use as a vehicle for gene transfer.
  • Nucleic acids nucleic acids are to be understood in the full invention: mRNA, partial cDNA, full length cDNA and genomic genes (chromosomes).
  • ORF Open Reading Frame, a defined sequence of
  • Amino acids that can be derived from the cDNA sequence.
  • MVEC microvascular endothelial cells
  • the cells are cultivated on plastic coated with collagen I.
  • the cells are applied on a gel made of extracellular matrix proteins.
  • the Matrigel (Becton Dickinson) used was diluted 1 to 1 with M199 medium, poured into the culture vessel (60 ⁇ l / cm2) in the cold and at 37 ° C for 30 min. gelled. The lines were then applied.
  • MVEC were applied at a density of 2 ⁇ 10 4 / cm 2 and incubated for 7 hours at 37 ° C., 5% CO 2 .
  • the total RNA preparation was made after the guanidinium thiocyanate
  • RNA selection was carried out using oligo (dT) cellulose columns (mRNA
  • the subtraction was carried out according to the method of Diatchenko et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1996 Jun 11, 93: 6025-30) using the PCR-Select cDNA Subtraction Kit.
  • the polyA + RNA that contains the target sequences is called the tester, and the polyA + RNA to be subtracted from this is called the driver.
  • a double-stranded cDNA synthesis is carried out for both the tester and the driver.
  • the strand synthesis is carried out with the following approach: polyA + RNA 2 ⁇ g cDNA synthesis primer (10 ⁇ M) 1 ⁇ l water add 5 ⁇ l The reactions are for 2 min. incubated at 70 ° C and then on ice for 2 min.
  • 5x first-strand buffer 250mM Tris-HCL, pH8, 330mM Mg-Chloride, 375mM KCI
  • the reactions were incubated at 42 ° C for 90 minutes and then on ice for 2 minutes.
  • the reactions were incubated at 16 ° C for 2 h.
  • T4 DNA polymerase was added to each reaction as follows: T4 DNA polymerase 3U / ⁇ l 2 ⁇ l
  • Phenol / chloroform extraction and ethanol precipitation were performed for each reaction. The pellets were resuspended in 50 ⁇ l water.
  • the reactions were incubated at 37 ° C for 90 min.
  • the tester cDNA was divided into 2 fractions. An adapter was ligated to each tester fraction. The concentrations of the substances used for the two testers are listed in detail in the table below.
  • the reactions were incubated at 16 ° C. overnight and then stopped with EDTA (20 ⁇ EDTA / glycogen mix, 1 ⁇ l (200 mM EDTA, 1 mg / ml glycogen)).
  • the first hybridization was carried out for the two reactions with the solutions and compounds listed in the table below.
  • the reactions were incubated for 90 seconds at 98 ° C. and then directly for 8 hours at 68 ° C.
  • the 2nd hybridization was incubated at 68 ° C overnight. Then 200 .mu.l dilution buffer (20 mM HEPES-HCl (pH 8.3), 50 mM NaCl, 0.2 mM EDTA (pH 8.0)) were added for the second hybridization. Then the 2nd dilution buffer (20 mM HEPES-HCl (pH 8.3), 50 mM NaCl, 0.2 mM EDTA (pH 8.0)) were added for the second hybridization. Then the 2nd
  • Hybridization incubated for 7 min at 68 ° C. The batch prepared in this way was then used for the PCR.
  • Differentially expressed fragments in the subtracted cDNA pools were selectively amplified using two successive PCRs.
  • the 1st PCR was carried out with the following approach:
  • the PCR program was carried out as follows: 75 ° C., 5 min
  • the second PCR was carried out using the following approach:
  • the PCR program was carried out as follows: 94 ° C, 30 sec
  • the subtraction efficiency was checked by a semi-quantitative PCR for a known unregulated gene (SH3P18). There was a reduction in the subtracted cDNA pool by a factor of 150-200.
  • the forward and backward subtracted cDNA pools were ligated in pUC 18 Sma l / BAP (SureClone Ligation Kit, Pharmacia Biotech) and then cloned into chemically competent E. coli DH5 ⁇ .
  • the fragments of the subtracted cDNA pools were filled in to blunt ends and phosphorylated.
  • the following compositions were used for this:
  • the reactions were incubated overnight at room temperature.
  • the ligations were transformed into chemically competent E. coli DH5 ⁇ .
  • the transformed cells were spread on 2YT agarose plates with 100 ⁇ g / ml ampicilin, 625 ⁇ M IPTG and 0.005% X-Gal and grown overnight at 5 37 ° C.
  • Colony PCR with vector primers was carried out on 17 randomly selected white clones. 15-16 clones showed inserts with a size distribution that corresponded to that of the cDNA pool used. 0 For each subtraction, 1536 clones were placed in 384-well plates with 50 ⁇ l 2YT,
  • IxHMFM 100 ⁇ g / ml ampicilin transferred per well.
  • the filled 384-well plates were incubated overnight at 37 ° C and could then be stored at -80 ° C.
  • the 1536 clones of a subtractive cDNA library were inoculated onto a Hybond Nylon N + membrane (Amersham).
  • the membrane was placed on a 2YT agarose plate with 100 ⁇ g / ml ampicilin and incubated overnight at 37 ° C.
  • the membrane was in with the colony side up for 4 min
  • the reactions were incubated at 37 ° C. for 5 hours and then purified using PCR cleaning columns and eluted in 30 ⁇ l of water. The DNA concentration was determined by means of OD measurement.
  • Reaction buffer - dCTP (333mM Tris-HCl, pH8, 33.3 Mg chloride, 10mM 2-mercaptoethanol, 170 ⁇ M dATP, 170 ⁇ M dGTP, 170 ⁇ M dTTP) 3 ⁇ l
  • Random Primer Mix (0.9mg / ml random nonamers, 50mM Tris-HCl, pH7.5, 10mM Mg chloride, 1mM DTT, 50 ⁇ g / ml BSA) 2 ⁇ l
  • the solution was incubated for 5 minutes at 98 ° C., then placed on ice for 5 minutes and mixed with 5 ml of express hybridization solution. This solution was then prehybridized in the hybridization bottle with the filter at 72 ° C. for 1 h.
  • the hybridization samples were also mixed with the following solution: 20x SSC 50 ⁇ l
  • Blocking solution (10mg / ml sheared salmon sperm DNA, 0.3mg / ml complementary oligos to adapters) 50 ⁇ l
  • the mixture was then incubated for 5 minutes at 98 ° C. and for 2 minutes on ice.
  • the hybridization samples were then added to the filter in the hybridization bottles and hybridized overnight at 72 ° C.
  • the hybridizations were evaluated on a phosphor imager.
  • a clone was classified as differentially expressed if it only showed a detectable hybridization signal with the forward-subtracted cDNA pool or if the signal strength with the forward-subtracted cDNA pool was at least 5 times greater than with the backward-subtracted cDNA pool.
  • sequences were selected at random and appropriate primers were prepared.
  • Hybridization result a difference in expression was found that was greater than a factor of 2.
  • nucleic acid sequences Analogously to the procedure described in 1 to 9, z. B. found the following sequences, some of which are overexpressed several times in culture form a) or culture form b) of the endothelial cells.
  • nucleic acid sequences are also the subject of the present invention.
  • the expression of the sequence of interest is based on the expression of a non-differentially regulated so-called “household gene”, here the 23 kD highly basic protein.
  • the expression of the VEGF receptor KDR was determined as a positive control.
  • This endothelial cell-specific gene is known that it is on angiogenetically active endothelium is upregulated. Accordingly, a significantly increased KDR expression was detected in the 8 week placenta compared to the 9 month old placenta.
  • Table II The results are summarized in Table II
  • sequence 34 was determined by means of 5 'and 3' RACE experiments. With a length of 6011 bp, the size for sequence 34 agrees very well with the size ( ⁇ 6 kb) determined in a Northern hybridization. The complete mRNA sequence contains an open reading frame that codes for 1036 amino acids.
  • the derived protein has a molecular weight of ⁇ 114kD, is high in cysteine (12.5% cysteine content) and has a hitherto unique domain structure.
  • the protein has an N-terminal signal peptide, part of a thiol protease domain, an RGD motif, 6 Von Willebrand factor type C domains, a potential transmembrane domain and 5 possible N-glycosylation sites.
  • the genomic localization of sequence 34 to Chr. 2p21 and the complete intron / exon structure were also determined. Due to the domain structure of the protein, a type I transmembrane orientation can be assumed, with a long extracellular N-terminus and a short intracellular C-terminus. To test this, a rabbit antiserum was produced which is directed against a peptide from the extracellular part of the protein. With the help of this antiserum it could be shown that the protein actually has a type I transmembrane orientation.
  • sequence 34 was used for immunohistological examinations on sections of an ovarian carcinoma or a prepuce. It was shown that sequence 34 is expressed in the tumor by endothelial cells, but not by stromal cells. In contrast, no sequence 34 expression could be detected in the prepuce. Sequence 34 is therefore expressed in the angiogenetically active tumor endothelium of the ovarian carcinoma examined, but not in the resting endothelium of normal tissue. These results were confirmed by in situ hybridizations at the mRNA level. In order to determine the expression profile for sequence 34, Northem hybridization was carried out on various human tissues. This revealed an expression pattern for sequence 34, which speaks for a specific function of the protein in endothelial cells, with the strongest expression in placenta, followed by the kidney, heart and lung.
  • sequence 34 Consistent with the data from the expression analysis in the two placenta samples for sequence 34.
  • the stronger expression of sequence 34 in the 9-month-old placenta was taken as an indication of a vessel-stabilizing function of the sequence.
  • the antisense oligonucleotide data clearly show that sequence 34 does not play a role during endothelial cell proliferation, but is significantly involved in the formation of stable capillary structures.
  • the invention thus relates in particular to the sequence Seq ID No. 34 and their use to form stable capillary structures. Furthermore, this sequence and the protein sequence derived therefrom also relates to the use, either alone or in formulation as a medicament for the treatment of psoriasis, arthritis, such as rheumatoid arthritis, hemangioma, angiofribroma, eye diseases, such as diabetic retinopathy, neovascular glaucoma, kidney diseases, such as glomerulonephritis, diabetic Nephropathy, malignant nephrosclerosis, thrombic microangiopatic syndromes,
  • Transplant rejection and glomerulopathy fibrotic diseases such as Cirrhosis of the liver, mesangial cell proliferative diseases, atherosclerosis and nerve tissue injuries.

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Abstract

Es werden Nukleinsäure-Sequenzen - mRNA, cDNA, genomische Sequenzen - aus Gewebe menschlicher Endothelzellen, die für Genprodukte oder Teile davon kodieren und deren Verwendung, beschrieben. Es werden weiterhin die über die Sequenzen erhältlichen Polypeptide und deren Verwendung beschrieben.

Description

Menschliche Nukleinsäure-und Protein-Sequenzen aus EndoϊhelzeTlen
Die Erfindung betrifft Nukleinsäure-Sequenzen -mRNA, cDNA, genomische Sequenzen- aus Gewebe menschlicher Endothelzellen, die für Genprodukte oder Teile davon kodieren und deren Verwendung. Die Erfindung betrifft weiterhin die über die Sequenzen erhältlichen Polypeptide und deren Verwendung.
Angiogenese ist ein Prozeß, der im adulten Lebewesen bei den zyklischen Prozessen der Reproduktion in der Frau, bei der Wundheilung und in verschiedenen pathologischen Situationen zu beobachten ist, wie z. B. Tumorwachstum, rheumatische Erkrankungen, Endometriose, bei der Kollateralenbildung im Herzen und in der Peripherie, etc.
Persistente Angiogenese kann die Ursache für verschiedene Erkrankungen wie Psoriasis, Arthritis, wie rheumatoide Arthritis, Hämangioma, Angiofribroma, Augenerkrankungen, wie diabetische Retinopathie, Neovaskulares Glaukom, Nierenerkrankungen, wie Glomerulonephritis, diabetische Nephropatie, maligne Nephrosklerose, thrombische mikroangiopatische Syndrome, Transplantationsabstoßungen und Glomerulopathie, fibrotische Erkrankungen, wie Leberzirrhose, mesangialzellproliferative Erkrankungen und Artheriosklerose sein oder zu einer Verschlimmerung dieser Erkrankungen führen.
Gelänge es, Angiogenese zu induzieren oder zu hemmen, so würden sich mehrere Erkrankungen grundlegend therapieren lassen. Hierzu müßte man die
Gene bzw. die für die Angiogenese relevanten Nukleinsäure-Sequenzen kennen.
Bisher ist nicht bekannt, welche Gene bzw. Nukleinsäure-Sequenzen oder Teile davon angiogeneserelevant sind.
Es konnten nun Nukleinsäure-Sequenzen gefunden werden, die angiogeneserelevant sind. Diese Sequenzen sind entweder bisher nicht beschrieben worden oder sie sind nur als Nukleinsäure-Sequenzen aus Nagern bekannt, jedoch ohne Hinweis auf Angiogenese. Weitere Sequenzen sind als humane Gene oder Teile davon beschrieben, jedoch nicht in bezug auf mögliche angiogenesereievante Eigenschaften.
Zur Suche nach angiogeneserelevanten Genen wurden Endothelzellen aus Vorhäuten adulter Personen gewonnen, die auf zweierlei Arten kultiviert wurden:
a) auf einer Rattenschwanzkollagenmatrix in subkonfluenter Dichte
und
b) auf einem Gel aus extrazellulärer Matrix (Matrigel).
Unter Kulturform a) bilden die Zellen die klassischen kopfsteinpflasterartigen Monolayer.
Unter Kulturform b) bilden die Zellen netzartige Strukturen mit röhrenförmigen Gebilden.
Die Zellkulturform a) stellt einen frühen Angiogenesezustand mit vornehmlich proliferativem Phänotyp dar.
Die Zeil kulturform b) stellt ein Modell für eine spätere Phase der Angiogenese dar, bei der die Differenzierung der Endothelzellen zu einer Bildung von schlauchförmigen Strukturen führt. Diese Strukturen sind eine Voraussetzung für einen Blutfluß, der von der Gewebsfläche separiert ist.
Aus beiden Zellkulturformen wird mRNA isoliert, in cDNA transkribiert, und mit einer Restriktionsendonuklease in Fragmente der Größe von 200 bis 1500 bp geschnitten. Mittels einer subtraktiven PCR-Technik wurden die differentiell vorkommenden Fragmente beider Zustände amplifiziert. Sie wurden in Vektoren eingebaut und kloniert. Die Klone wurden zunächst sequenziert und anschließend wurden ihre Sequenzen mit bioinformatorischen Techniken komplettiert.
Mit Hilfe einer quantitativen, in der Literatur beschriebenen PCR-Technik (Pilarsky et al., 1998, s. Versuchsbeschreibung) wurde zunächst untersucht, ob die Gene in den beiden Kulturzuständen differentiell exprimiert sind. Zur Normierung wurde die Expression des 23 kDalton Proteins (s.
Versuchsbeschreibung) als interner Marker verwendet. In der differentiellen Expression traten Verhältnisse von 2-7 fach auf.
Es konnten nun die Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 gefunden werden, die als Kandidatengene bei der Angiogenese eine Rolle spielen.
Die Erfindung betrifft somit Nukleinsäure-Sequenzen, die ein Genprodukt oder ein Teil davon kodieren, umfassend
a) eine Nukleinsäure-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe der Nukleinsäure-Sequenzen Seq ID Nos. 1 bis Seq. ID No. 59
b) eine allelische Variation der unter a) genannten Nukleinsäure- Sequenzen
oder
c) eine Nukleinsäure-Sequenz, die komplementär zu den unter a) oder b) genannten Nukleinsäure-Sequenzen ist. Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäure-Sequenzen gemäß einer der
Sequenzen Seq ID Nos. 1 bis Seq. ID No. 59 oder eine komplementäre oder ailelische Variante davon und die Nukleinsäure-Sequenzen davon, die eine
90%ige bis 95% ige Homologie zu einer humanen Nukleinsäure-Sequenz aufweisen.
Die Erfindung betrifft auch die Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59, die in Endothelzellgewebe erhöht exprimiert sind
Die Erfindung betrifft ferner Nukleinsäure-Sequenzen, umfassend einen Teil der oben genannten Nukleinsäure-Sequenzen, in solch einer ausreichenden Größe, daß sie mit den Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 hybridisieren.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen weisen im allgemeinen eine Länge von mindestens 50 bis 3000 bp, vorzugsweise eine Länge von mindestens 150 bis 2800 bp, besonders bevorzugt eine Länge von 150 bis 2600 bp auf.
Mit den erfindungsgemäßen Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 können gemäß gängiger Verfahrenspraxis auch Expressionskassetten konstruiert werden, wobei auf der Kassette mindestens eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen zusammen mit mindestens einer dem Fachmann allgemein bekannten Kontroll- oder regulatorischen Sequenz, wie z. B. einem geeigneten Promotor, kombiniert wird. Die erfindungsgemäßen Sequenzen können in sense oder antisense Orientierung eingefügt sein.
In der Literatur sind ist eine große Anzahl von Expressionskassetten bzw. Vektoren und Promotoren bekannt, die verwendet werden können.
Unter Expressionskassetten bzw. Vektoren sind zu verstehen: 1. bakterielle, wie z. B., phagescript, pBs, φX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene), pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia),
2. eukaryontische, wie z. B. pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1 , pSG
(Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia).
Unter Kontroll- oder regulatorischer Sequenz sind geignete Promotoren zu verstehen. Hierbei sind zwei bevorzugte Vektoren der pKK232-8 und der PCM7 Vektor. Im einzelnen sind folgende Promotoren gemeint: lad, lacZ, T3, 17, gpt, lambda PR, trc, CMV, HSV Thymidin-Kinase, SV40, LTRs aus Retrovirus und Maus Metallothionein-I.
Die auf der Expressionskassette befindlichen DNA-Sequenzen können ein Fusionsprotein kodieren, das ein bekanntes Protein und ein biologisch aktives Polypeptid-Fragment umfaßt.
Die Expressionskassetten sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen können auch zur Herstellung von Vollängen-Genen verwendet werden. Die erhältlichen Gene sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen, sowie die aus der Verwendung erhältlichen Gen- Fragmente.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen können mit geeigneten Vektoren in Wirtszeilen gebracht werden, in denen als heterologer Teil die auf den Nukleinsäure-Sequenzen enthaltene genetischen Information befindet, die exprimiert wird. Die die Nukleinsäure-Sequenzen enthaltenden Wirtszellen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Geeignete Wirtszellen sind z. B. prokaryontische Zellsysteme wie E. coli oder eukaryontische Zellsysteme wie tierische oder humane Zellen oder Hefen.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen können in sense oder antisense Form verwendet werden.
Die Herstellung der Polypeptide oder deren Fragment erfolgt durch Kultivierung der Wirtszellen gemäß gängiger Kultivierungsmethoden und anschließender Isolierung und Aufreinigung der Peptide bzw. Fragmente, ebenfalls mittels gängiger Verfahren. Die Erfindung betrifft ferner Nukleinsäure-Sequenzen, die mindestens eine Teilsequenz eines biologisch aktiven Poiypeptids kodieren.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Polypeptid-Teilsequenzen, sogenannte ORF (open-reading-frame)-Peptide, die von den erfinderischen Teilsequenzen exprimiert werden.
Die Erfindung betrifft ferner die Polypeptid-Sequenzen, die mindestens eine 80%ige Homologie, insbesondere eine 90%ige Homologie zu den Polypeptiden aufweisen.
Die Erfindung betrifft auch Antikörper, die gegen ein Polypeptid oder ein Fragment gerichtet sind, welche von den erfindungsgemäßen Nukleinsäure- Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 kodiert werden.
Unter Antikörper sind insbesondere monoklonale Antikörper zu verstehen.
Die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen kodierten Polypeptide können auch als Tool zum Auffinden von Wirkstoffen bei angiogenen Erkrankungen verwendet werden, was ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist.
Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Nukleinsäure-Sequenzen gemäß den Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 zur Expression von Polypeptiden, die als Tools zum Auffinden von Wirkstoffen gegen angiogenetische Erkrankungen verwendet werden können.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der von den erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 exprimierten Polypeptide als Arzneimittel in der Gentherapie zur Behandlung angiogener Erkrankungen, bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung angiogener Erkrankungen.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren bzw. die über diese Nukleinsäuren exprimierten Proteine können somit entweder alleine oder in Formulierung als Arzneimittel zur Behandlung von Psoriasis, Arthritis, wie rheumatoide Arthritis, Hämangioma, Angiofribroma, Augenerkrankungen, wie diabetische Retinopathie, Neovaskulares Glaukom, Nierenerkrankungen, wie Glomerulonephritis, diabetische Nephropatie, maligne Nephrosklerose, thrombische mikroangiopatische Syndrome, Transplantationsabstoßungen und Glomerulopathie, fibrotische Erkrankungen, wie Leberzirrhose, mesangialzellproliferative Erkrankungen, Artheriosklerose und Verletzungen des Nervengewebes zum Einsatz kommen.
Die Erfindung betrifft auch Arzneimittel, die mindestens eine Polypeptidsequenz enthalten, die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 exprimiert werden.
Die gefundenen erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen können auch genomische oder mRNA-Sequenzen sein. Die Erfindung betrifft auch genomische Gene, ihre Promotoren, Enhancer, Silencer, Exonstruktur, Intronstruktur und deren Spleißvarianten, erhältlich aus den cDNAs der Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59, sowie deren Verwendung zusammen mit geeigneten regulativen Elementen, wie geeigneten Promotoren und/ oder Enhancem.
Mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren (cDNA-Sequenzen) werden genomische BAC-, PAC- und Cosmid-Bibliotheken gescreent und über komplementäre Basenpaarung (Hybridisierung) spezifisch humane Klone isoliert. Die so isolierten BAC-, PAC- und Cosmid-Klone werden mit Hilfe der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisation auf Metaphasenchromosomen hybridisiert und entsprechende Chromosomenabschnitte identifiziert, auf denen die entsprechenden genomischen Gene liegen. BAC-, PAC- und Cosmid-Klone werden sequenziert, um die entsprechenden genomischen Gene in ihrer vollständigen Struktur (Promotoren, Enhancer, Silencer, Exons und Introns) aufzuklären. BAC-, PAC- und Cosmid-Klone können als eigenständige Moleküle für den Gentransfer eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft auch BAC-, PAC- und Cosmid-Klone, enthaltend funktionelie Gene und ihre chromosomale Lokalisation, entsprechend den Sequenzen Seq. ID. No. 1 bis Seq. ID No. 59, zur Verwendung als Vehikel zum Gentransfer.
Bedeutungen von Fachbegriffen und Abkürzungen
Nukleinsäuren= Unter Nukleinsäuren sind in der voliegenden Erfindung zu verstehen: mRNA, partielle cDNA, vollängen cDNA und genomische Gene (Chromosomen). ORF= Open Reading Frame, eine definierte Abfolge von
Aminosäuren, die von der cDNA-Sequenz abgeleitet werden kann.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Herstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen, ohne die
Erfindung auf diese Beispiele und Nukleinsäure-Sequenzen zu beschränken.
Beispiel 1
1. Suche nach angiogeneserelevanten Kandidatengenen
1.1 Verwendete Zellen
Primäre, humane, mikrovaskuläre Endothelzellen (MVEC) wurden aus menschlichen Vorhäuten präpariert und mittels biotinyliertem anti CD31 (PECAM) Antikörper selektioniert (Referenz).
Kulturbedingungen: 37°C, 5%C02
Medium: M199, 10% FCS, 10% Humanserum, 6μg/ml ECGF, 1mM
Natriumpyruvat, 3 U/ml Heparin, 100 U/mIPenicilin, 100μg/ml Streptomycin, 1x nicht essentielle Aminosäuren
1.2 Kultivierung und RNA-Präparation
Für die Kulturform a) werden die Zellen auf mit Collagen I beschichtetem Plastik kultiviert. Für die Kulturform b) werden die Zellen auf einem Gel aus extrazellulären Matrixproteinen ausgebracht. Das dazu verwendete Matrigel (Becton Dickinson) wurde 1 zu 1 mit M199 Medium verdünnt, in der Kälte in das verwendete Kulturgefäß gegossen (60μl/cm2) und bei 37°C für 30 min. geliert. Anschließend wurden die Zeilen ausgebracht. Für Kulturform a) und b) wurden MVEC in einer Dichte von 2x104/cm2 ausgebracht und für 7h bei 37°C, 5% C02 inkubiert. Die Gesamt-RNA-Präparation wurde nach der Guanidinium Thiocyanat
Methode mit anschließender Zentrifugation durch ein Caesiumchlorid-Kissen durchgeführt (Sambrook J., Fritsch E. F., and Maniatis T.; 1989, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press). Die polyA+ RNA-Selektion wurde über oligo(dT)-Zellulosesäulen (mRNA
Purification Kit, Pharmacia Biotech) durchgeführt.
1.3 Erstellen von subtraktiven cDNA-Banken
Die Subtraktion wurde nach der Methode von Diatchenko et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1996 Jun 11 , 93:6025-30) mit Hilfe des PCR-Select cDNA Subtraction Kit durchgeführt.
Die polyA+ RNA, die die Zielsequenzen enthält, wird als Tester, die davon abzuziehende polyA+ RNA als Driver bezeichnet.
Es wurden 2 Subtraktionen durchgeführt, wobei einmal die polyA+ RNA der Kulturform a) und einmal die polyA+ RNA der Kulturform b) als Tester diente. Die folgende Versuchsbeschreibung stellt exemplarisch nur eine Subtraktion dar.
1.4 Synthese von doppelsträngiger cDNA (ds cDNA)
Sowohl für den Tester als auch für den Driver wird eine doppelsträngige cDNA- Synthese durchgeführt.
1. Strang-Synthese
Die Strangsynthese wird mit folgendem Ansatz durchgeführt: polyA+ RNA 2μg cDNA-Synthese Primer(10μM) 1 μl Wasser add 5μl Die Reaktionen werden für 2 min. bei 70°C und anschließend 2 min auf Eis inkubiert.
Zu jeder Reaktion wurde folgendes zugegeben:
5x First-strand buffer ( 250mM Tris-HCL, pH8, 330mM Mg-Chlorid, 375mM KCI)
2μl 10mM dNTP
1 μl Wasser
1 μl MMLV reverse transcriptase (200 U/μl)
1 μl
Die Reaktionen wurden für 90 Minuten bei 42°C und anschließend für 2 Minuten auf Eis inkubiert.
2. Strang-Synthese Die 2. Strang-Synthese wurde mit folgendem Ansatz durchgeführt: 1. Strang-Synthese 10μl
Wasser 48,4μl
5x Second-strand buffer(500mM KCL, 50mM Ammoniumsulfat, 25mM Mg-Chlorid, 0,75mM ß-NAD, 100mM Tris-HCL, pH7,5, 0,25mg/ml BSA) 16μl
10mM dNTP 1 ,6μl
20x Second-strand enzyme cocktail (DNA Polymerase 1 6U/μl Rnase H 0,2U/μl, E. coli DNA Ligase 1 ,2U/μl) 4μl
Die Reaktionen wurden für 2h bei 16°C inkubiert.
Zu jeder Reaktion wurde T4 DNA Polymerase wie folgt zugegeben: T4 DNA Polymerase 3U/μl 2μl
Die Reaktionen wurden für 30 min bei 16°C inkubiert. Die Reaktionen wurden mit EDTA abgestoppt, wobei die Lösung folgende Zusammensetzung aufweist:
20x EDTA/Glykogen Mix (200mM EDTA, 1 mg/ml Glykogen) 4μl
Es wurde für jede Reaktion eine Phenol/Chloroform-Extraktion und eine Ethanol-Präzipitation durchgeführt. Die Pellets wurden in je 50μl Wasser resuspendiert.
1.5 Rsa I-Verdau der ds cDNA
Sowohl für den Tester als auch für den Driver wurde ein Rsa I-Verdau durchgeführt. Hierzu wurden folgende Lösungen verwendet:
ds cDNA 43,5μl 10x Rsa I Restriktionspuffer (100mM Bis Tris Propan-HCI, pH7,0, 100mM Mg-Clorid, 1 mM DTT) 5μl
Rsa l (10U/μl) 1 ,5μl
Die Reaktionen wurden für 90 min bei 37°C inkubiert.
Die Reaktionen wurden anschließend mit EDTA abgestoppt, wobei die Lösung folgende Zusammensetzung aufweist:
20x EDTA/Glykogen Mix (200mM EDTA 1 mg/ml Glykogen) 2,5μl
Anschließend wurde für jede Reaktion eine Phenol/Chloroform-Extraktion und eine Ethanol-Präzipitation durchgeführt. Die hierbei entstehenden Pellets wurden in je 5,5μl Wasser für die weitere Verarbeitung resuspendiert. 1.6 Adaptor-Ligation an Rsa I verdaute ds Tester cDNA
Die Tester-cDNA wurde in 2 Fraktionen aufgeteilt. An jede Tester-Fraktion wurde ein Adapter ligiert. Die Konzentrationen der verwendeten Substanzen für die beiden Tester sind im einzelnen in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt.
Die Reaktionen wurden über Nacht bei 16°C inkubiert und anschließend mit EDTA abgestoppt (20x EDTA/Glykogen Mix, 1μl (200mM EDTA, 1 mg/ml Glykogen)).
Die Reaktionen wurden für 5 min bei 72°C inkubiert.
1.7 Subtraktive Hybridisierungen Die Driver und Tester wurden anschließend miteinander in zwei Schritten hybridisiert.
Hybridisierung
Die erste Hybridisierung wurde für die beiden Reaktionen mit den in der folgenden Tabelle aufgeführten Lösungen und Verbindungen durchgeführt.
Die Reaktionen wurden für 90 sek bei 98°C und anschließend direkt für 8h bei 68°C inkubiert.
1. Hybridisierung:
Für die 2. Hybridisierung wurden Reaktion 1 und 2 gemischt und frisch denaturierter Driver wie folgt zugegeben:
Driver 1 μl
4x Hybridisierungspuffer 1 μl
Wasser 2μl 1 μl dieser Mischung wurde für 90 sek bei 98°C inkubiert und anschließend möglichst schnell mit Reaktion 1 und Reaktion 2 fusioniert.
Die 2. Hybridisierung wurde bei 68°C über Nacht inkubiert. Anschließend wurden zur 2. Hybridisierung 200μl Verdünnungspuffer (20mM HEPES-HCI (pH8,3), 50mM NaCI, 0,2mM EDTA (pH8,0)) zugegeben. Danach wurde die 2.
Hybridisierung für 7 min bei 68°C inkubiert. Der so hergestellte Ansatz wurde dann für die PCR eingesetzt.
Differentiell exprimierte Fragmente in den subtrahierten cDNA Pools wurden über zwei aufeinanderfolgende PCRs selektiv amplifiziert. Die 1. PCR wurde mit folgendem Ansatz durchgeführt:
10x PCR-Puffer (400mM Tricine-KOH, pH9,2, 150mM KOAc, 35mM MG(OAc)2, 37,5μg/ml BSA) 2,5μl 10mM dNTP 0,5μl PCR Primer 1 (10μM) 1 μl
50x Advantage cDNA Polymerase 0,5μl verdünnte 2. Hybridisieruπg 1 μl Wasser 19,5μl
Das PCR-Programm wurde wie folgt durchgeführt: 75°C, 5 min
Schleife 94°C, 30 sek
66°C, 30 sek
72°C, 90 sek
Insgesamt wurden 27 Zyklen durchgeführt.
Die zweite PCR wurde mit folgendem Ansatz durchgeführt:
10x PCR-Puffer 2,5μl 10mM dNTP 0,5μl nested PCR-Primer 1 (10μM) 1 μ| nested PCR Primer 2R (1 OμM) 1 μ| 50x Advantage cDNA Polymerase 0,5μl
PCR Produkt 0,1 μl
H2O 19,4μl I
Das PCR-Programm wurde wie folgt durchgeführt: 94°C, 30 sek
68°C, 30 sek
72°C, 90 sek insgesamt wurden 12 Zyklen durchgeführt.
Die Subtraktionseffizienz wurde durch eine semi-quantitative PCR für ein bekanntes nicht reguliertes Gen ( SH3P18) überprüft. Es zeigte sich eine Reduktion in dem subtrahierten cDNA Pool um einen Faktor von 150- 200.
2. Ligation der subtrahierten cDNA Pools in pUC 18
Die vorwärts und rückwärts subtrahierten cDNA Pools wurden in pUC 18 Sma l/BAP ligiert (SureClone Ligation Kit, Pharmacia Biotech) und anschließend in chemisch kompetente E. coli DH5α kloniert.
Die Fragmente der subtrahierten cDNA Pools wurden dazu zu Blunt-Enden aufgefüllt und phosphoryliert. Folgende Zusammensetzungen wurden hierfür verwendet:
Subtrahierter cDNA Pool 1 ,5μg
Klenow Fragment 1 μl
10x Blunting/Kinasing Buffer 2μl
Polynucleotide Kinase 1 μl
Wasser add 20μl Die Reaktionen wurden für 30 min bei 37°C inkubiert, anschließend über PCR Purification Columns aufgereinigt und in 30μl Wasser eluiert. Anschließend wurde die DNA-Konzentration wurde mittels OD-Messung bestimmt.
^
2.1 Ligation in pUC 18
Die Ligation in pUC 18 wurde mit folgendem Ansatz durchgeführt:
0 Blunt-ended cDNA Pool 50ng pUC 18 Sma l/BAP (50ng/μl) 1 μ|
2x Ligationspuffer 10μl
DTT 1 μ|
T4 DNA Ligase (6U/μl) 3μl 5 Wasser add 20μl
Die Reaktionen wurden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
0 2.2 Transformation der Ligationen in E. coli DH5α
Die Ligationen wurden in chemisch kompetente E. coli DH5α transformiert. Die transformierten Zellen wurden auf 2YT Agarose-Platten mit 100μg/ml Ampicilin, 625μM IPTG und 0,005% X-Gal ausgestrichen und über Nacht bei 5 37°C angezogen.
Auf 17 zufällig ausgewählten, weißen Klonen wurde eine Kolonie-PCR mit Vektor-Primern (M13 Standardprimer) durchgeführt. 15-16 Klone zeigten dabei Inserts mit einer Größenverteiiung, die der des verwendeten cDNA Pools entsprach. 0 Für jede Subtraktion wurden 1536 Klone in 384-well Platten mit 50μl 2YT,
IxHMFM, 100μg/ml Ampicilin pro well transferiert. Die gefüllten 384-well Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert und konnten dann bei -80°C gelagert werden.
3. Herstellung von Kolonie-Filtern:
Die 1536 Klone einer subtraktiven cDNA Bank wurden auf eine Hybond Nylon N+ Membran (Amersham) angeimpft. Die Membran wurde auf eine 2YT Agarose-Platte mit 100μg/ml Ampicilin gelegt und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Membran wurde mit der Kolonie-Seite nach oben für 4 min auf in
Denaturierungslösung (0,5M NaOH, 1.5M NaCI) getränktes Whatman 3MM Papier gelegt. Anschließend wurde die Membran für 4 min auf in Neutralisierungslösung ( 1 M Tris-HCI (pH7,5), 1.5M NaCI) getränktes Whatman 3MM Papier inkubiert. Die Membran wurde dann für 1 h bei 37°C mit Proteinase K behandelt. Die Membran wurde dazu in 300ml Proteinase K Puffer (50mM NaCI, 5mM EDTA, 10mM Tris-HCI (pH8), 50mg/ml Proteinase K) getaucht. Schließlich wurde die Membran bei 80°C für 3h getrocknet und wurde dann für die Hybridisierungen verwendet.
4. Differentielle Hybridisierung:
Um die differentielle Expression der klonierten Fragmente nachzuweisen wurde mit Hilfe eines PCR-Select Differential Screening Kits eine differentielle Hybridisieruπg auf Kolonie-Filtern der subtraktiven cDNA-Banken durchgeführt.
Für eine spezifische Hybridisierung der vorwärts und rückwärts subtrahierten cDNA Pools auf die subtraktiven cDNA-Bank Kolonie-Filter war es notwendig die Adapter-Sequenzen in der Hybridisierungsprobe zu entfernen. Als Hybridisierungsproben für die Rsa I-Restriktion der subtrahierten cDNA
Pools wurden eingesetzt: cDNA Pool 28μl
10x Rsa I Restriktionspuffer (100mM Bis Tris Propan-HCI, pH7,0 100mM Mg-Chlorid, 1mM DTT) 3μl
Rsa l (10U/μl) 2μl
Die Reaktionen wurden bei 37°C für 5h inkubiert und anschließend über PCR- Reinigungssäulen aufgereinigt und in 30μl Wasser eluiert. Die DNA- Konzentration wurde mittels OD-Messung bestimmt.
5. Radioaktive Markierung der subtrahierten cDNA Pools
Die radioaktive Markierung der subtrahierten cDNA Pools wurde mit folgendem Ansatz durchgeführt: cDNA Pooi 150ng in 9μl
Reaktionspuffer, - dCTP (333mM Tris-HCI, pH8, 33,3 Mg-Chlorid, 10mM 2-Mercaptoethanol, 170μM dATP, 170μM dGTP, 170μM dTTP) 3μl
Random Primer Mix (0,9mg/ml random nonamers, 50mM Tris-HCI, pH7,5, 10mM Mg-Chlorid, 1 mM DTT, 50μg/ml BSA) 2μl
AP32 dCTP 3μl
Klenow Fragment (3U/μl) 1 ,5μl
Die Reaktionen wurden bei 37°C für 1 h inkubiert, anschließend über PCR- Reinigungssäulen aufgereinigt und in 30μl Wasser eluiert. Es wurde die spezifische Aktivität der Reaktionen bestimmt um sicherzugehen, daß in beiden Hybridisierungsreaktionen die gleiche Menge an markierter DNA eingesetzt wurde. 6. Prähybridisierung und Hybridisierung der Filter und
Hybridisieruπgs-proben
Für die Hybridisierungen wurde folgende Lösungen verwendet:
20x SSC 50μl
Blocking Lösung (10mg/mi sheared salmon sperm DNA,
0,3mg/ml komplementäre Oligos zu Adaptoren) 50μl
Die Lösung wurde für 5min bei 98°C inkubiert, dann für 5min auf Eis gestellt und mit 5 ml Express-Hybridisations-Lösung gemischt. Diese Lösung wurde dann in der Hybridisierungsfiasche mit dem Filter bei 72°C für 1h prähybridisiert.
Die Hybridisierungsproben wurden ebenfalls mit folgender Lösung versetzt: 20x SSC 50μl
Blocking Lösung (10mg/ml sheared salmon sperm DNA, 0,3mg/ml komplementäre Oligos zu Adaptoren) 50μl
Der Ansatz wurde dann für 5min bei 98°C und für 2 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Hybridisierungsproben zu dem Filter in die Hybridisierungsflaschen gegeben und über Nacht bei 72°C hybridisiert.
Anschließend wurde wie folgt verfahren:
a) 4x 20min bei 68°C mit vorgewärmtem 2xSSC, 0,5% SDS
b) 2x 20 min bei 68°C mit vorgewärmtem 0,2xSSC, 0,5% SDS
c) anschließend Exposition in Phosphor-Imager-Kassetten für 22h bei Raumtemperatur 7. Auswertung der differentiellen Hybridisierungen
Die Auswertung der Hybridisierungen erfolgte an einem Phosphor-Imager.
Ein Klon wurde dann als differentiell exprimiert eingestuft, wenn er ausschließlich ein detektierbares Hybridisierungssignal mit dem vorwärts subtrahierten cDNA Pool zeigte oder wenn die Signalstärke mit dem vorwärts subtrahierten cDNA Pool um mindestens den Faktor 5 größer war als mit dem rückwärts subtrahierten cDNA Pool.
8. Bestätigung der differentiellen Expression mittels semi-quantitativer RT-PCR
Um die differentielle Expression der Klone mit differentiellem
Hybridisierungsergebnis zu bestätigen, wurden Sequenzen zufällig ausgewählt und entsprechende Primer hergestellt.
Als Methode zum Nachweis der differentiellen Expression wurde die comparative multiplex RT-PCR nach Pilarsky et al. (The Prostate 36:85-91 (1998)) angewendet. Als interner Standard wurden Primer für das 23kD highly basic Protein verwendet. Die interessierende Sequenz und das Standardfragment wurden simultan in einer Reaktion für eine unterschiedliche Anzahl an Zyklen amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden anschließend auf einem 6% Sequenzier-Gel aufgetrennt und mittels einer Software analysiert und quantifiziert. Zuerst wurde die Anzahl an Zyklen ermittelt für die sowohl das Standardfragment , als auch die interessierende Sequenz linear amplifizierten und die dann für die quantifizierende PCR verwendet wurde. Zur quantifizierenden RT-PCR wurden unterschiedliche RNA-Präparationen herangezogen und jeweils 3 Reaktionen angesetzt. Es konnte für 90%der untersuchten Sequenzen mit differentiellem
Hybridisierungsergebnis ein Unterschied in der Expression festgestellt werden, der größer war als ein Faktor 2.
9. Automatische Veriängerung der gefundenen Nukleinsäure- Sequenzen
Um möglichst viel Sequenzinformation für jeden differentiell exprimierten Klon zu erhalten, wurde eine automatische Verlängerung der Ausgangssequenz anhand aller verfügbaren EST-Sequenzen durchgeführt.
Die automatische Veriängerung der Sequenz S vollzieht sich in drei Schritten:
1. Ermittlung aller zu S homologen Sequenzen aus der Gesamtmenge aller verfügbaren EST's aus der LifeSeq-Datenbank (Stand Oktober 1997) mit Hilfe des BLAST Algorithmus (Altschui S., Gish W., Miller W., Myers E., Lipman D. (1990) J. Mol. Biol., 215, 403-410).
2. Assemblierung dieser Sequenzen mittels des Standardprogramms GAP4 (Bonfield J., Smith K., Staden R. (1995), Nucleic Acids Research 23, 4992- 4999).
3. Berechnung einer Konsensus-Sequenz aus den assemblierten Sequenzen.
Nun wird versucht die Konsensus-Sequenz in gleicher Weise zu verlängern. Diese Iteration wird mit der jeweils erhaltenen Konsensus-Sequenz fortgesetzt, bis keine weitere Verlängerung mehr möglich ist.
10. Gefundene Nukleinsäure-Sequenzen Analog der unter 1 bis 9 beschriebenen Verfahrensweise wurden z. B. folgende Sequenzen gefunden, von denen einige mehrfach in Kulturform a) oder Kulturform b) der Endothelzellen überexprimiert werden.
Diese Nukleinsäure-Sequenzen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die mögliche Funktion dieser Genbereiche betrifft die Angiogenese.
Das Ergebnis ist in der folgenden Tabelle I dargestellt:
TABELLE
a), b) = Kulturformen
11. Expressionsanalyse
Um zu untersuchen, ob die regulierten Sequenzen auch in vivo bei der Bildung neuer Blutgefäße beteiligt sind, wurde ihre Expression in humanem Plazenta- Gewebe der δ.Woche mit einer hohen Angiogenese-Aktivität und in humanem Plazenta-Gewebe des 9.Monats mit wenig Angiogenese-Aktivität ermittelt. Eine stärkere Expression in der 8 wöchigen Plazenta wurde dabei als Hinweis auf eine Angiogenese-relevante Funktion der Sequenz gewertet. Eine stärkere Expression in der 9 Monate alten Plazenta wurde als Hinweis auf eine gefäßstabilisierende Funktion der Sequenz beurteilt. Dazu wurde eine semi-quantitative RT-PCR- Technik verwendet, die comparative multiplex RT-PCR. Bei dieser Methode wird die Expression der interessierenden Sequenz bezogen auf die Expression eines nicht differenziell regulierten sogenannten „Haushaltsgens", hier das 23kD highly basic protein. Als positiv Kontrolle wurde die Expression des VEGF-Rezeptors KDR ermittelt. Von diesem Endothelzell-spezifischen Gen ist bekannt, daß es auf angiogenetisch aktivem Endothel hochreguliert ist. Entsprechend wurde eine deutlich erhöhte KDR-Expression in der 8 wöchigen Plazenta im Vergleich zur 9 Monate alten Plazenta detektiert. Die Ergebnisse sind in der Tabelle II zusammengefaßt
Tabelle
Sequenz MVEC, Plazenta Plazenta proliferierend 8.Woche 9. Monat
1 *** *** _
2 n. d.
3 **** *★* *
4 ** ** **
5 *** *** *
6 ** **
7 * **** * *
8 n. d.
9 ** * ***
10 *** **** *
11 ** - **
12 n. d.
13 - ** _
14 **** *** *
15 *** #* _
16 - - _
17 *** ** _
18 **** *** _
19 n. d.
20 *** **** **
21 n. d.
22 ** ** **
23 * **** **
24 *** ** .
25 ** * *
26 n. d.
27 ** * *
28 ** * -
29 * * *
30 **** *** -
31 ** *** ***
32 **** *** *
33 *** ** **
34 ** ** -•***
In der Tabelle bedeuten:
**** = sehr starke Expression
*** = starke Expression
** = mittlere Expression
= schwache Expression
= Expression unterhalb der Detektionsgrenze n. d. = nicht durchgeführt
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 der ermittelten Kandidatengene werden in dem nachfolgenden Sequenzprotokoll beschrieben. Aufgrund der deutlichen Überexpression der Sequenz 34 in den tubulären MVEC (>8x) und einer schwachen Homologie zu Thrombospondin-2, einem Gen, das bei der Reifung des Blutgefäßsystems eine wichtige Rolle spielt, wurde aus der Vielzahl von Sequenzen die Sequenz 34 zur weiteren Analyse ausgewählt. Ausgehend von der identifizierten Teilsequenz wurde mittels 5'- und 3'-RACE- Experimenten die komplette mRNA Sequenz für Sequenz 34 ermittelt. Mit einer Länge von 6011 bp stimmt die Größe für Sequenz 34 sehr gut mit der in einer Northern-Hybridisierung ermittelten Größe (~6kb) überein. Die komplette mRNA Sequenz enthält einen offenen Leserahmen, der für 1036 Aminosäuren kodiert. Das abgeleitete Protein hat ein Molekulargewicht von ~114kD, ist Cystein-reich (12,5% Cysteingehalt) und weist eine bislang einzigartige Domänenstruktur auf. Das Protein besitzt ein N-Terminales Signalpeptid, einen Teil einer Thiolprotease- Domäne, ein RGD-Motiv, 6 Von-Willebrand-Faktor Typ C-Domänen, eine potentielle Transmembrandomäne und 5 mögliche N-Glykosylierungsstellen. Weiter wurde die genomische Lokalisation der Sequenz 34 auf Chr. 2p21 und die komplette Intron/Exon-Struktur bestimmt. Aufgrund der Domänenstruktur des Proteins ist eine Typ I Transmembranorientierung anzunehmen, mit einem langen extrazellulären N- Terminus und einem kurzen intrazellulären C-Terminus. Um dies zu testen wurde ein Kaninchen-Antiserum hergestellt, welches gegen ein Peptid aus dem extrazellulären Teil des Proteins gerichtet ist. Mit Hilfe dieses Antiserums konnte gezeigt werden, daß das Protein tatsächlich eine Typ I-Transmembranorientierung aufweist.
Dieses Anti-Sequenz 34-Serum wurde zur immunhistologischen Untersuchungen an Schnitten eines Ovarialkarzinoms, bzw eines Präputiums eingesetzt. Dabei zeigte sich, daß Sequenz 34 im Tumor von Endothelzellen exprimiert wird, nicht aber von Stromazellen. Dagegen konnte keine Sequenz 34-Expression im Präputium detektiert werden. Sequenz 34 ist also im angiogenetisch aktiven Tumorendothel des untersuchten Ovarialkarzinoms exprimiert, nicht aber im ruhenden Endothel des Normalgewebes. Diese Ergebnisse wurden durch in situ Hybridisierungen auf mRNA-Ebene bestätigt. Um das Expressionsprofil für Sequenz 34 zu ermitteln, wurde eine Northem- Hybridisierung auf verschiedenen humanen Geweben durchgeführt. Dabei zeigte sich ein Expressionsmuster für Sequenz 34, das für eine spezifische Funktion des Proteins in Endothelzellen spricht, mit der stärksten Expression in Plazenta, gefolgt von der Niere, dem Herzen und der Lunge.
Um zu testen, ob Sequenz 34 in dem in vitro Modell auf Matrigel eine wichtige Funktion bei der Tubulus-Bildung hat, wurden Antisense-Oligonukleotide hergestellt. Es konnte ein Oligonukleotid ermittelt werden, welches die Sequenz 34-Expression inhibiert. Dieses Oligonukleotid war nicht toxisch für die Zellen und führte nicht zu einem veränderten Proliferationsverhalten der behandelten Zellen. Endothelzellen, die mit diesem Oligonukleotid transfiziert wurden, zeigten dagegen eine dramatische Inhibition der Tubulus-Bildung auf Matrigel (> 20% des Kontrollwertes) im Vergleich zu untransfizierten und mit einem Kontroll- Oligonukleotid transfizierten Zellen. Die Sequenz 34 trägt also wesentlich zur Bildung von Kapillar-ähnlichen Strukturen bei. Diese Ergebnisse stehen im
Einklang zu den Daten aus der Expressionsanalyse in den beiden Plazentaproben für Sequenz 34. Die stärkere Expression von Sequenz 34 in der 9 Monate alten Plazenta wurde als Hinweis auf eine Gefäß stabilisierende Funktion der Sequenz gewertet. Die Antisense-Oligonukleotid Daten zeigen deutlich, daß Sequenz 34 keine Rolle während der Endothelzellproliferation spielt, aber wesentlich an der Bildung stabiler Kapillar-Strukturen beteiligt ist.
Die Erfindung betrifft somit insbesondere die Sequenz Seq ID No. 34 und deren Verwendung zur Bildung stabiler Kapillarstrukturen. Weiterhin betrifft diese Sequenz und die daraus abgeleitete Proteinsequenz auch die Verwendung, entweder alleine oder in Formulierung als Arzneimittel zur Behandlung von Psoriasis, Arthritis, wie rheumatoide Arthritis, Hämangioma, Angiofribroma, Augenerkrankungen, wie diabetische Retinopathie, Neovaskulares Glaukom, Nierenerkrankungen, wie Glomerulonephritis, diabetische Nephropatie, maligne Nephrosklerose, thrombische mikroangiopatische Syndrome,
Transplantationsabstoßungen und Glomerulopathie, fibrotische Erkrankungen, wie Leberzirrhose, mesangialzellproliferative Erkrankungen, Artheriosklerose und Verletzungen des Nervengewebes.

Claims

Patentansprüche
1 . Eine Nukleinsäure-Sequenz, die ein Genprodukt oder ein Teil davon kodiert, umfassend
a) eine Nukleinsäure-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe Seq ID No. 1 bis Seq. ID No. 59
b) eine allelische Variation der unter a) genannten Nukleinsäure-
Sequenzen
oder
c) eine Nukleinsäure-Sequenz, die komplementär zu den unter a) oder b) genannten Nukleinsäure-Sequenzen ist.
2. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß einer der Sequenzen Seq ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 oder eine komplementäre oder allelische Variante davon.
Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Endothelzellgewebe erhöht exprimiert sind.
BAC, PAC und Cosmid-Klone, enthaltend funktionelle Gene und ihre chromosomale Lokalisation, entsprechend den Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID. No. 1 bis Seq. ID No. 59, zur Verwendung als Vehikel zum Gentransfer.
5. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine 90% ige Homologie zu einer humanen Nukleinsäure-Sequenz aufweist.
6. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine 95% ige Homologie zu einer humanen Nukleinsäure-Sequenz aufweist.
7. Eine Nukleinsäure-Sequenz, umfassend einen Teil der in den Ansprüchen 1 bis 6 genannten Nukleinsäure-Sequenzen, in solch einer ausreichenden Größe, daß sie mit den Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 hybridisieren.
8. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Größe des Fragments eine Länge von mindestens 50 bis 3000 bp aufweist.
9. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Größe des Fragments eine Länge von mindestens 150 bis 2800 bp aufweist.
10. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Größe des Fragments eine Länge von mindestens 150 bis 2600 bp aufweist.
11. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, die mindestens eine Teilsequenz eines biologisch aktiven Polypeptids kodiert.
12. Eine Expressionskassette, umfassend ein Nukleinsäure-Fragment oder eine Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, zusammen mit mindestens einer Kontroll- oder regulatorischen Sequenz.
13. Eine Expressionskassette, umfassend ein Nukleinsäure-Fragment oder eine Sequenz gemäß Anspruch 12, worin die Kontroll- oder regulatorische Sequenz ein geigneter Promotor ist.
14. Eine Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß die auf der Kassette befindlichen DNA-Sequenzen ein Fusionsprotein kodieren, das ein bekanntes Protein und ein biologisch aktives Polypeptid-Fragment umfaßt.
15. Verwendung der Nukleinsäure-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 11 zur Herstellung von Vollängen-Genen.
16. Ein DNA-Fragment, umfassend ein Gen, das aus der Verwendung gemäß Anspruch 15 erhältlich ist.
17. Wirtszelle, enthaltend als heterologen Teil ihrer exprimierbaren genetischen Information ein Nukleinsäure-Fragment gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11.
18. Wirtszelle gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es ein prokaryontisches oder eukaryontische Zellsystem ist.
19. Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß das prokaryontische Zellsystem E. coli und das eukaryontische Zellsystem ein tierisches, humanes oder Hefe-Zellsystem ist.
20. Ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids oder eines Fragments, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen gemäß den Ansprüchen 17 bis 19 kultiviert werden.
21. Ein Antikörper, der gegen ein Polypeptid oder ein Fragment gerichtet ist, welches von den Nukleinsäuren der Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 kodiert wird, das gemäß Anspruch 20 erhältlich ist.
22. Ein Antikörper gemäß Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, daß er monoklonal ist.
23. Polypeptidsequenz, exprimiert von einer der Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59.
24. Polypeptidsequenzen gemäß Anspruch 23, mit mindestens 80%iger Homologie zu diesen Sequenzen.
25. Polypeptidsequenzen gemäß Anspruch 23, mit mindestens 90%iger Homologie zu diesen Sequenzen.
26. Polypeptidsequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Sequenz Seq ID No. 34 umfasst.
27. Verwendung der Polypeptidsequenzen gemäß den Ansprüchen 23 bis 26 als Tools zum Auffinden von Wirkstoffen gegen angiogenetische
Erkrankungen.
28. Verwendung der Nukleinsäure-Sequenzen gemäß den Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 zur Expression von Polypeptiden, die als Tools zum Auffinden von Wirkstoffen gegen angiogenetische Erkrankungen verwendet werden können.
29. Verwendung der Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 in sense oder antisense Form.
30. Verwendung der Polypeptidsequenzen gemäß den Ansprüchen 23 bis 26 als Arzneimittel in der Gentherapie zur Behandlung angiogenetischer Erkrankungen.
31 . Verwendung der Polypeptidsequenzen gemäß den Ansprüchen 23 bis 26 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung angiogenetischer Erkrankungen.
32. Arzneimittel, enthaltend mindestens eine Polypeptidsequenz gemäß den Ansprüchen 23 bis 26.
33. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet daß es eine genomische Sequenz ist.
34. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, daß es eine mRNA-Sequenz ist.
35. Genomische Gene, ihre Promotoren, Enhancer, Silencer, Exonstruktur, Intronstruktur und deren Spleißvarianten, erhältlich aus den cDNAs der
Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59.
36. Verwendung der genomischen Gene gemäß Anspruch 35, zusammen mit geeigneten regulativen Elementen.
37. Verwendung gemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß das regulative Element ein geeigneter Promotor und/ oder Enhancer ist.
38. Verwendung der Nukleinsäure-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 1 1 und der Peptide gemäß den Ansprüchen 23 bis 26, entweder alleine oder in Formulierung als Arzneimittel zur Behandlung von Psoriasis, Arthritis, wie rheumatoide Arthritis, Hämangioma, Angiofribroma, Augenerkrankungen, wie diabetische Retinopathie, Neovaskulares Glaukom, Nierenerkrankungen, wie Glomerulonephritis, diabetische Nephropatie, maligne Nephrosklerose, thrombische mikroangiopatische
Syndrome, Transplantationsabstoßungen und Glomerulopathie, fibrotische Erkrankungen, wie Leberzirrhose, mesangialzellproliferative Erkrankungen, Artheriosklerose und Verletzungen des Nervengewebes.
39. Nukleinsäuresequenz Seq. ID No. 34, dadurch gekennzeichnet, daß sie stabile Kapillar-Strukturen bildet.
0. Verwendung der Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID No. 34 und der über diese Sequenz exprimierten Peptide, entweder alleine oder in Formulierung als Arzneimittel zur Behandlung von Psoriasis, Arthritis, wie rheumatoide Arthritis, Hämangioma, Angiofribroma, Augenerkrankungen, wie diabetische Retinopathie, Neovaskulares Glaukom, Nierenerkrankungen, wie Glomerulonephritis, diabetische Nephropatie, maligne Nephrosklerose, thrombische mikroangiopatische Syndrome, Transplantationsabstoßungen und Glomerulopathie, fibrotische Erkrankungen, wie Leberzirrhose, mesangialzellproliferative Erkrankungen, Artheriosklerose und Verletzungen des Nervengewebes.
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