DE19948679A1

DE19948679A1 - Nukleinsäuren und Protein-Sequenzen aus Endothelzellen

Info

Publication number: DE19948679A1
Application number: DE19948679A
Authority: DE
Inventors: Karl-Heinz Thierauch; Jens Glienke; Bernd Hinzmann; Christian Pilarsky
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1999-10-01
Filing date: 1999-10-01
Publication date: 2001-04-05

Abstract

Es werden Nukleinsäure-Sequenzen -mRNA, cDNA, genomische Sequenzen- aus Gewebe menschlicher Endothelzellen, die für Genprodukte oder Teile davon kodieren und deren Verwendung beschrieben. Es werden weiterhin die über die Sequenzen erhältlichen Polypeptide und deren Verwendung beschrieben.

Description

Die Erfindung betrifft Nukleinsäure-Sequenzen - mRNA, cDNA, genomische Sequenzen - aus Gewebe menschlicher Endothelzellen, die für Genprodukte oder Teile davon kodieren und deren Verwendung. Die Erfindung betrifft weiterhin die über die Sequenzen erhältlichen Polypeptide und deren Verwendung.

Angiogenese ist ein Prozeß, der im adulten Lebewesen bei den zyklischen Prozessen der Reproduktion in der Frau, bei der Wundheilung und in verschiedenen pathologischen Situationen zu beobachten ist, wie z. B. Tumorwachstum, rheumatische Erkrankungen, Endometriose, bei der Kollateralenbildung im Herzen und in der Peripherie, etc.

Persistente Angiogenese kann die Ursache für verschiedene Erkrankungen wie Psoriasis, Arthritis, wie rheumatoide Arthritis, Hämangioma, Angiofribroma, Augenerkrankungen, wie diabetische Retinopathie, Neovaskulares Glaukom, Nierenerkrankungen, wie Glomerulonephritis, diabetische Nephropatie, maligne Nephrosklerose, thrombische mikroangiopatische Syndrome, Transplantationsabstoßungen und Glomerulopathie, fibrotische Erkrankungen, wie Leberzirrhose, mesangialzellproliferative Erkrankungen und Artheriosklerose sein oder zu einer Verschlimmerung dieser Erkrankungen führen.

Gelänge es, Angiogenese zu induzieren oder zu hemmen, so würden sich mehrere Erkrankungen grundlegend therapieren lassen. Hierzu müßte man die Gene bzw. die für die Angiogenese relevanten Nukleinsäure-Sequenzen kennen.

Bisher ist nicht bekannt, welche Gene bzw. Nukleinsäure-Sequenzen oder Teile davon angiogeneserelevant sind.

Es konnten nun Nukleinsäure-Sequenzen gefunden werden, die angiogeneserelevant sind.

Diese Sequenzen sind entweder bisher nicht beschrieben worden oder sie sind nur als Nukleinsäure-Sequenzen aus Nagern bekannt, jedoch ohne Hinweis auf Angiogenese. Weitere Sequenzen sind als humane Gene oder Teile davon beschrieben, jedoch nicht in bezug auf mögliche angiogeneserelevante Eigenschaften.

Zur Suche nach angiogeneserelevanten Genen wurden Endothelzellen aus Vorhäuten adulter Personen gewonnen, die auf zweierlei Arten kultiviert wurden:

a) auf einer Rattenschwanzkollagenmatrix in subkonfluenter Dichte und
b) auf einem Gel aus extrazellulärer Matrix (Matrigel).

Unter Kulturform a) bilden die Zellen die klassischen kopfsteinpflasterartigen Monolayer.

Unter Kulturform b) bilden die Zellen netzartige Strukturen mit röhrenförmigen Gebilden.

Die Zellkulturform a) stellt einen frühen Angiogenesezustand mit vornehmlich proliferativem Phänotyp dar.

Die Zellkulturform b) stellt ein Modell für eine spätere Phase der Angiogenese dar, bei der die Differenzierung der Endothelzellen zu einer Bildung von schlauchförmigen Strukturen führt. Diese Strukturen sind eine Voraussetzung für einen Blutfluß, der von der Gewebsfläche separiert ist.

Aus beiden Zellkulturformen wird mRNA isoliert, in cDNA transkribiert, und mit einer Restriktionsendonuklease in Fragmente der Größe von 200 bis 1500 bp geschnitten. Mittels einer subtraktiven PCR-Technik wurden die differentiell vorkommenden Fragmente beider Zustände amplifiziert. Sie wurden in Vektoren eingebaut und kloniert. Die Klone wurden zunächst sequenziert und anschließend wurden ihre Sequenzen mit bioinformatorischen Techniken komplettiert.

Mit Hilfe einer quantitativen, in der Literatur beschriebenen PCR-Technik (Pilarsky et al., 1998, s. Versuchsbeschreibung) wurde zunächst untersucht, ob die Gene in den beiden Kulturzuständen differentiell exprimiert sind. Zur Normierung wurde die Expression des 23 kDalton Proteins (s. Versuchsbeschreibung) als interner Marker verwendet. In der differentiellen Expression traten Verhältnisse von 2-7 fach auf.

Es konnten nun die Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 gefunden werden, die als Kandidatengene bei der Angiogenese eine Rolle spielen. Die Erfindung betrifft somit Nukleinsäure-Sequenzen, die ein Genprodukt oder ein Teil davon kodieren, umfassend

a) eine Nukleinsäure-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe der Nukleinsäure-Sequenzen Seq ID Nos. 1 bis Seq. ID No. 59
b) eine allelische Variation der unter a) genannten Nukleinsäure- Sequenzen
oder
c) eine Nukleinsäure-Sequenz, die komplementär zu den unter a) oder b) genannten Nukleinsäure-Sequenzen ist.

Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäure-Sequenzen gemäß einer der Sequenzen Seq ID Nos. 1 bis Seq. ID No. 59 oder eine komplementäre oder allelische Variante davon und die Nukleinsäure-Sequenzen davon, die eine 90%ige bis 95%ige Homologie zu einer humanen Nukleinsäure-Sequenz aufweisen.

Die Erfindung betrifft auch die Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59, die in Endothelzellgewebe erhöht exprimiert sind

Die Erfindung betrifft ferner Nukleinsäure-Sequenzen, umfassend einen Teil der oben genannten Nukleinsäure-Sequenzen, in solch einer ausreichenden Größe, daß sie mit den Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 hybridisieren.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen weisen im allgemeinen eine Länge von mindestens 50 bis 3000 bp, vorzugsweise eine Länge von mindestens 150 bis 2800 bp, besonders bevorzugt eine Länge von 150 bis 2600 bp auf.

Mit den erfindungsgemäßen Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 können gemäß gängiger Verfahrenspraxis auch Expressionskassetten konstruiert werden, wobei auf der Kassette mindestens eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäure- Sequenzen zusammen mit mindestens einer dem Fachmann allgemein bekannten Kontroll- oder regulatorischen Sequenz, wie z. B. einem geeigneten Promotor, kombiniert wird. Die endungsgemäßen Sequenzen können in sense oder antisense Orientierung eingefügt sein.

In der Literatur sind ist eine große Anzahl von Expressionskassetten bzw. Vektoren und Promotoren bekannt, die verwendet werden können.

Unter Expressionskassetten bzw. Vektoren sind zu verstehen:
1. bakterielle, wie z. B., phagescript, pBs, ϕX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene), pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia),
2. eukaryontische, wie z. B. pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia).

Unter Kontroll- oder regulatorischer Sequenz sind geignete Promotoren zu verstehen. Hierbei sind zwei bevorzugte Vektoren der pKK232-8 und der PCM7- Vektor. Im einzelnen sind folgende Promotoren gemeint: lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P_R, trc, CMV, HSV Thymidin-Kinase, SV40, LTRs aus Retrovirus und Maus Metallothionein-I.

Die auf der Expressionskassette befindlichen DNA-Sequenzen können ein Fusionsprotein kodieren, das ein bekanntes Protein und ein biologisch aktives Polypeptid-Fragment umfaßt.

Die Expressionskassetten sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen können auch zur Herstellung von Vollängen-Genen verwendet werden. Die erhältlichen Gene sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure- Sequenzen, sowie die aus der Verwendung erhältlichen Gen-Fragmente.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen können mit geeigneten Vektoren in Wirtszellen gebracht werden, in denen als heterologer Teil die auf den Nukleinsäure-Sequenzen enthaltene genetischen Information befindet, die exprimiert wird.

Die die Nukleinsäure-Sequenzen enthaltenden Wirtszellen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Geeignete Wirtszellen sind z. B. prokaryontische Zellsysteme wie E. coli oder eukaryontische Zellsysteme wie tierische oder humane Zellen oder Hefen. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen können in sense oder antisense Form verwendet werden.

Die Herstellung der Polypeptide oder deren Fragment erfolgt durch Kultivierung der Wirtszellen gemäß gängiger Kultivierungsmethoden und anschließender Isolierung und Aufreinigung der Peptide bzw. Fragmente, ebenfalls mittels gängiger Verfahren. Die Erfindung betrifft ferner Nukleinsäure-Sequenzen, die mindestens eine Teilsequenz eines biologisch aktiven Polypeptids kodieren.

Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Polypeptid-Teilsequenzen, sogenannte ORF (open-reading-frame)-Peptide, die von den erfinderischen Teilsequenzen exprimiert werden.

Die Erfindung betrifft ferner die Polypeptid-Sequenzen, die mindestens eine 80%ige Homologie, insbesondere eine 90%ige Homologie zu den Polypeptiden aufweisen.

Die Erfindung betrifft auch Antikörper, die gegen ein Polypeptid oder ein Fragment gerichtet sind, welche von den erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 kodiert werden.

Unter Antikörper sind insbesondere monoklonale Antikörper zu verstehen.

Die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen kodierten Polypeptide können auch als Tool zum Auffinden von Wirkstoffen bei angiogenen Erkrankungen verwendet werden, was ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist.

Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der Nukleinsäure-Sequenzen gemäß den Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 zur Expression von Polypeptiden, die als Tools zum Auffinden von Wirkstoffen gegen angiogenetische Erkrankungen verwendet werden können.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der von den endungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 exprimierten Polypeptide als Arzneimittel in der Gentherapie zur Behandlung angiogener Erkrankungen, bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung angiogener Erkrankungen.

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren bzw. die über diese Nukleinsäuren exprimierten Proteine können somit entweder alleine oder in Formulierung als Arzneimittel zur Behandlung von Psoriasis, Arthritis, wie rheumatoide Arthritis, Hämangioma, Angiofribroma, Augenerkrankungen, wie diabetische Retinopathie, Neovaskulares Glaukom, Nierenerkrankungen, wie Glomerulonephritis, diabetische Nephropatie, maligne Nephrosklerose, thrombische mikroangiopatische Syndrome, Transplantationsabstoßungen und Glomerulopathie, fibrotische Erkrankungen, wie Leberzirrhose, mesangialzellproliferative Erkrankungen, Artheriosklerose und Verletzungen des Nervengewebes zum Einsatz kommen.

Die Erfindung betrifft auch Arzneimittel, die mindestens eine Polypeptidsequenz enthalten, die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 exprimiert werden.

Die gefundenen erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen können auch genomische oder mRNA-Sequenzen sein.

Die Erfindung betrifft auch genomische Gene, ihre Promotoren, Enhancer, Silencer, Exonstruktur, Intronstruktur und deren Spleißvarianten, erhältlich aus den cDNAs der Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59, sowie deren Verwendung zusammen mit geeigneten regulativen Elementen, wie geeigneten Promotoren und/ oder Enhancern.

Mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren (cDNA-Sequenzen) werden genomische BAC-, PAC- und Cosmid-Bibliotheken gescreent und über komplementäre Basenpaarung (Hybridisierung) spezifisch humane Klone isoliert. Die so isolierten BAC-, PAC- und Cosmid-Klone werden mit Hilfe der Fluoreszenz-in-situ- Hybridisation auf Metaphasenchromosomen hybridisiert und entsprechende Chromosomenabschnitte identifiziert, auf denen die entsprechenden genomischen Gene liegen. BAC-, PAC- und Cosmid-Klone werden sequenziert, um die entsprechenden genomischen Gene in ihrer vollständigen Struktur (Promotoren, Enhancer, Silencer, Exons und Introns) aufzuklären. BAC-, PAC- und Cosmid-Klone können als eigenständige Moleküle für den Gentransfer eingesetzt werden.

Die Erfindung betrifft auch BAC-, PAC- und Cosmid-Klone, enthaltend funktionelle Gene und ihre chromosomale Lokalisation, entsprechend den Sequenzen Seq. ID. No. 1 bis Seq. ID No. 59, zur Verwendung als Vehikel zum Gentransfer.

Bedeutungen von Fachbegriffen und Abkürzungen

Nukleinsäuren = Unter Nukleinsäuren sind in der vorliegenden Erfindung zu verstehen: mRNA, partielle cDNA, vollängen cDNA und genomische Gene (Chromosomen).
ORF = Open Reading Frame, eine definierte Abfolge von Aminosäuren, die von der cDNA-Sequenz abgeleitet werden kann.

Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Herstellung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen, ohne die Erfindung auf diese Beispiele und Nukleinsäure- Sequenzen zu beschränken.

Beispiel 1 1. Suche nach angiogeneserelevanten Kandidatengenen 1.1 Verwendete Zellen

Primäre, humane, mikrovaskuläre Endothelzellen (MVEC) wurden aus menschlichen Vorhäuten präpariert und mittels biotinyliertem anti CD31 (PECAM) Antikörper selektioniert (Referenz).
Kulturbedingungen: 37°C, 5%CO₂
Medium: M199, 10% FCS, 10% Humanserum, 6 µg/ml ECGF, 1 mM Natriumpyruvat, 3 U/ml Heparin, 100 U/mlPenicilin, 100 µg/ml Streptomycin, 1× nicht essentielle Aminosäuren

1.2 Kultivierung und RNA-Präparation

Für die Kulturform a) werden die Zellen auf mit Collagen I beschichtetem Plastik kultiviert. Für die Kulturform b) werden die Zellen auf einem Gel aus extrazellulären Matrixproteinen ausgebracht. Das dazu verwendete Matrigel (Becton Dickinson) wurde 1 zu 1 mit M199 Medium verdünnt, in der Kälte in das verwendete Kulturgefäß gegossen (60 µl/cm²) und bei 37°C für 30 min. geliert. Anschließend wurden die Zellen ausgebracht.

Für Kulturform a) und b) wurden MVEC in einer Dichte von 2 × 10⁴/cm² ausgebracht und für 7 h bei 37°C, 5% CO₂ inkubiert.

Die Gesamt-RNA-Präparation wurde nach der Guanidinium Thiocyanat Methode mit anschließender Zentrifugation durch ein Caesiumchlorid-Kissen durchgeführt (Sambrook J., Fritsch E.F., and Maniatis T.; 1989, Molecular Gloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press).

Die polyA⁺ RNA-Selektion wurde über oligo(dT)-Zellulosesäulen (mRNA Purification Kit, Pharmacia Biotech) durchgeführt.

1.3 Erstellen von subtraktiven cDNA-Banken

Die Subtraktion wurde nach der Methode von Diatchenko et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1996 Jun 11, 93: 6025-30) mit Hilfe des PCR-Select cDNA Subtraction Kit durchgeführt.

Die polyA+ RNA, die die Zielsequenzen enthält, wird als Tester, die davon abzuziehende polyA+ RNA als Driver bezeichnet.

Es wurden 2 Subtraktionen durchgeführt, wobei einmal die polyA+ RNA der Kulturform a) und einmal die polyA+ RNA der Kulturform b) als Tester diente. Die folgende Versuchsbeschreibung stellt exemplarisch nur eine Subtraktion dar.

1.4 Synthese von doppelsträngiger cDNA (ds cDNA)

Sowohl für den Tester als auch für den Driver wird eine doppelsträngige cDNA- Synthese durchgeführt.

1. Strang-Synthese

Die Strangsynthese wird mit folgendem Ansatz durchgeführt:

polyA+ RNA	2 µg
cDNA-Synthese Primer(10µM)	1 µl
Wasser	add 5 µl

Die Reaktionen werden für 2 min. bei 70°C und anschließend 2 min auf Eis inkubiert.

Zu jeder Reaktion wurde folgendes zugegeben:

5× First-strand buffer (250 mM Tris-HCL, pH 8, 330 mM Mg-Chlorid, 375 mM KCl)	2 µl
10 mM dNTP	1 µl
Wasser	1 µl
MMLV reverse transcriptase (200 U/µl)	1 µl

Die Reaktionen wurden für 90 Minuten bei 42°C und anschließend für 2 Minuten auf Eis inkubiert.

2. Strang-Synthese

Die 2. Strang-Synthese wurde mit folgendem Ansatz durchgeführt:

1. Strang-Synthese	10 µl
Wasser	48,4 µl

5× Second-strand buffer(500 mM KCL, 50 mM Ammoniumsulfat, 25 mM Mg-Chlorid, 0,75 mM β-NAD, 100 mM Tris-HCL, pH 7,5,

0,25 mg/ml BSA)	16 µl
10 mM dNTP	1,6 µl

20× Second-strand enzyme cocktail (DNA Polymerase 16 U/µl

Rnase H 0,2 U/µl, E. coli DNA Ligase 1,2 U/µl)

4 µl

Die Reaktionen wurden für 2 h bei 16°C inkubiert.
Zu jeder Reaktion wurde T4 DNA Polymerase wie folgt zugegeben:

T4 DNA Polymerase 3 U/µl

2 µl

Die Reaktionen wurden für 30 min bei 16°C inkubiert.

Die Reaktionen wurden mit EDTA abgestoppt, wobei die Lösung folgende Zusammensetzung aufweist:

20× EDTA/Glykogen Mix (200 mM EDTA, 1 mg/ml Glykogen)

4 µl

Es wurde für jede Reaktion eine Phenol/Chloroform-Extraktion und eine Ethanol- Präzipitation durchgeführt. Die Pellets wurden in je 50 µl Wasser resuspendiert.

1.5 Rsa I-Verdau der ds cDNA

Sowohl für den Tester als auch für den Driver wurde ein Rsa -I-Verdau durchgeführt. Hierzu wurden folgende Lösungen verwendet:

ds cDNA	43,5 µl
10× Rsa I Restriktionspuffer (100 mM Bis Tris Propan-HCl, pH 7,0, 100 mM Mg-Chlorid, 1 mM DTT)	5 µl
Rsa I (10 U/µl)	1,5 µl

Die Reaktionen wurden für 90 min bei 37°C inkubiert.

Die Reaktionen wurden anschließend mit EDTA abgestoppt, wobei die Lösung folgende Zusammensetzung aufweist:

20× EDTA/Glykogen Mix (200 mM EDTA 1 mg/ml Glykogen)

2,5 µl

Anschließend wurde für jede Reaktion eine Phenol/Chloroform-Extraktion und eine Ethanol-Präzipitation durchgeführt. Die hierbei entstehenden Pellets wurden in je 5,5 µl Wasser für die weitere Verarbeitung resuspendiert.

1.6 Adaptor-Ligation an Rsa I verdaute ds Tester cDNA

Die Tester cDNA wurde in 2 Fraktionen aufgeteilt. An jede Tester-Fraktion wurde ein Adapter ligiert. Die Konzentrationen der verwendeten Substanzen für die beiden Tester sind im einzelnen in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt.

Die Reaktionen wurden über Nacht bei 16°C inkubiert und anschließend mit EDTA abgestoppt (20× EDTA/Glykogen Mix, 1 µl (200 mM EDTA,1 mg/ml Glykogen)).

Die Reaktionen wurden für 5 min bei 72°C inkubiert.

1.7 Subtraktive Hybridisierungen

Die Driver und Tester wurden anschließend miteinander in zwei Schritten hybridisiert.

Hybridisierung

Die erste Hybridisierung wurde für die beiden Reaktionen mit den in der folgenden Tabelle aufgeführten Lösungen und Verbindungen durchgeführt.

Die Reaktionen wurden für 90 sek bei 98°C und anschließend direkt für 8 h bei 68°C inkubiert.

1. Hybridisierung

Für die 2. Hybridisierung wurden Reaktion 1 und 2 gemischt und frisch denaturierter Driver wie folgt zugegeben:

Driver	1 µl
4× Hybridisierungspuffer	1 µl
Wasser	2 µl

1 µl dieser Mischung wurde für 90 sek bei 98°C inkubiert und anschließend möglichst schnell mit Reaktion 1 und Reaktion 2 fusioniert.

Die 2. Hybridisierung wurde bei 68°C über Nacht inkubiert. Anschließend wurden zur 2. Hybridisierung 200 µl Verdünnungspuffer (20 mM HEPES-HCl (pH 8,3), 50 mM NaCl, 0,2 mM EDTA (pH 8,0)) zugegeben. Danach wurde die 2. Hybridisierung für 7 min bei 68°C inkubiert. Der so hergestellte Ansatz wurde dann für die PCR eingesetzt.

Differentiell exprimierte Fragmente in den subtrahierten cDNA Pools wurden über zwei aufeinanderfolgende PCRs selektiv amplifiziert.

Die 1. PCR wurde mit folgendem Ansatz durchgeführt:

10× PCR-Puffer (400mM Tricine-KOH, pH 9,2, 150 mM KOAc, 35 mM MG(OAc)2, 37,5 µg/ml BSA)	2,5 µl
10 mM dNTP	0,5 µl
PCR Primer 1 (10 µM)	1 µl
50× Advantage cDNA Polymerase	0,5 µl
verdünnte 2. Hybridisierung	1 µl
Wasser	19,5 µl

Das PCR-Programm wurde wie folgt durchgeführt:

75°C, 5 min
Schleife	94°C, 30 sek
66°C, 30 sek
72°C, 90 sek

Insgesamt wurden 27 Zyklen durchgeführt.

Die zweite PCR wurde mit folgendem Ansatz durchgeführt:

10× PCR-Puffer	2,5 µl
10 mM dNTP	0,5 µl
nested PCR-Primer 1 (10 µM)	1 µl
nested PCR Primer 2R (10 µM)	1 µl
50× Advantage cDNA Polymerase	0,5 µl
PCR Produkt	0,1 µl
H₂O	19,4 µl

Das PCR-Programm wurde wie folgt durchgeführt:

94°C, 30 sek
68°C, 30 sek
72°C, 90 sek

Insgesamt wurden 12 Zyklen durchgeführt.

Die Subtraktionseffizienz wurde durch eine semi-quantitative PCR für ein bekanntes nicht reguliertes Gen (SH3P18) überprüft. Es zeigte sich eine Reduktion in dem subtrahierten cDNA Pool um einen Faktor von 150-200.

2. Ligation der subtrahierten cDNA Pools in pUC 18

Die vorwärts und rückwärts subtrahierten cDNA Pools wurden in pUC 18 Sma I/BAP ligiert (SureClone Ligation Kit, Pharmacia Biotech) und anschließend in chemisch kompetente E. coli DH5α kloniert.

Die Fragmente der subtrahierten cDNA Pools wurden dazu zu Blunt-Enden aufgefüllt und phosphoryliert. Folgende Zusammensetzungen wurden hierfür verwendet:

Subtrahierter cDNA Pool	1,5 µg
Klenow Fragment	1 µl
10× Blunting/Kinasing Buffer	2 µl
Polynucleotide Kinase	1 µl
Wasser	add 20 µl

Die Reaktionen wurden für 30 min bei 37°C inkubiert, anschließend über PCR Purification Columns aufgereinigt und in 30 µl Wasser eluiert. Anschließend wurde die DNA-Konzentration wurde mittels OD-Messung bestimmt.

2.1 Ligation in pUC 18

Die Ligation in pUC 18 wurde mit folgendem Ansatz durchgeführt:

Blunt-ended cDNA Pool	50 ng
pUC 18 Sma I/BAP (50 ng/µl)	1 µl
2× Ligationspuffer	10 µl
DTT	1 µl
T4 DNA Ligase (6U/µl)	3 µl
Wasser	add 20 µl

Die Reaktionen wurden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.

2.2 Transformation der Ligationen in E. coli DH5α

Die Ligationen wurden in chemisch kompetente E. coli DH5α transformiert. Die transformierten Zellen wurden auf 2YT Agarose-Platten mit 100 µg/ml Ampicilin, 625 µM IPTG und 0,005% X-Gal ausgestrichen und über Nacht bei 37°C angezogen. Auf 17 zufällig ausgewählten, weißen Klonen wurde eine Kolonie-PCR mit Vektor- Primern (M13 Standardprimer) durchgeführt. 15-16 Klone zeigten dabei Inserts mit einer Größenverteilung, die der des verwendeten cDNA Pools entsprach.

Für jede Subtraktion wurden 1536 Klone in 384-well Platten mit 50 µl 2YT, 1×HMFM, 100 µg/ml Ampicilin pro well transferiert. Die gefüllten 384-well Platten wurden über Nacht bei 37°C inkubiert und konnten dann bei -80°C gelagert werden.

3. Herstellung von Kolonie-Filtern

Die 1536 Klone einer subtraktiven cDNA Bank wurden auf eine Hybond Nylon N+ Membran (Amersham) angeimpft. Die Membran wurde auf eine 2YT Agarose-Platte mit 100 µg/ml Ampicilin gelegt und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Membran wurde mit der Kolonie-Seite nach oben für 4 min auf in Denaturierungslösung (0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl) getränktes Whatman 3MM Papier gelegt. Anschließend wurde die Membran für 4 min auf in Neutralisierungslösung (1 M Tris-HCl (pH 7,5), 1,5 M NaCl) getränktes Whatman 3MM Papier inkubiert. Die Membran wurde dann für 1 h bei 37°C mit Proteinase K behandelt. Die Membran wurde dazu in 300 ml Proteinase K Puffer (50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 14 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mg/ml Proteinase K) getaucht. Schließlich wurde die Membran bei 80°C für 3 h getrocknet und wurde dann für die Hybridisierungen verwendet.

4. Differentielle Hybridisierung

Um die differentielle Expression der klonierten Fragmente nachzuweisen wurde mit Hilfe eines PCR-Select Differential Screening Kits eine differentielle Hybridisierung auf Kolonie-Filtern der subtraktiven cDNA-Banken durchgeführt.

Für eine spezifische Hybridisierung der vorwärts und rückwärts subtrahierten cDNA Pools auf die subtraktiven cDNA-Bank Kolonie-Filter war es notwendig die Adapter- Sequenzen in der Hybridisierungsprobe zu entfernen.

Als Hybridisierungsproben für die Rsa I-Restriktion der subtrahierten cDNA Pools wurden eingesetzt:

cDNA Pool	28 µl
10× Rsa I Restriktionspuffer (100 mM Bis Tris Propan-HCl, pH 7,0 100 mM Mg-Chlorid, 1 mM DTT)	3 µl
Rsa I (10 U/µl)	2 µl

Die Reaktionen wurden bei 37°C für 5 h inkubiert und anschließend über PCR- Reinigungssäulen aufgereinigt und in 30 µl Wasser eluiert. Die DNA-Konzentration wurde mittels OD-Messung bestimmt.

5. Radioaktive Markierung der subtrahierten cDNA Pools

Die radioaktive Markierung der subtrahierten cDNA Pools wurde mit folgendem Ansatz durchgeführt:

cDNA Pool 150 ng in	9 µl
Reaktionspuffer, - dCTP (333 mM Tris-HCl, pH 8, 33,3 Mg-Chlorid, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 170 µM dATP, 170 µM dGTP, 170 µM dTTP)	3 µl
Random Primer Mix (0,9 mg/ml random nonamers, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM Mg-Chlorid, 1 mM DTT, 50 µg/ml BSA)	2 µl
AP32 dCTP	3 µl
Klenow Fragment (3 U/µl)	1,5 µl

Die Reaktionen wurden bei 37°C für 1 h inkubiert, anschließend über PCR- Reinigungssäulen aufgereinigt und in 30 µl Wasser eluiert. Es wurde die spezifische Aktivität der Reaktionen bestimmt um sicherzugehen, daß in beiden Hybridisierungsreaktionen die gleiche Menge an markierter DNA eingesetzt wurde.

6. Prähybridisierung und Hybridisierung der Filter und Hybridisierungs proben

Für die Hybridisierungen wurde folgende Lösungen verwendet:

20× SSC	50 µl
Blocking Lösung (10 mg/ml sheared salmon sperm DNA, 0,3 mg/ml komplementäre Oligos zu Adaptoren)	50 µl

Die Lösung wurde für 5 min bei 98°C inkubiert, dann für 5 min auf Eis gestellt und mit 5 ml Express-Hybridisations-Lösung gemischt. Diese Lösung wurde dann in der Hybridisierungsflasche mit dem Filter bei 72°C für 1 h prähybridisiert.

Die Hybridisierungsproben wurden ebenfalls mit folgender Lösung versetzt:

Der Ansatz wurde dann für 5 min bei 98°C und für 2 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Hybridisierungsproben zu dem Filter in die Hybridisierungsflaschen gegeben und über Nacht bei T2°C hybridisiert.

Anschließend wurde wie folgt verfahren:

a) 4× 20 min bei 68°C mit vorgewärmtem 2×SSC, 0,5% SDS
b) 2× 20 min bei 68°C mit vorgewärmtem 0,2×SSC, 0,5% SDS
c) anschließend Exposition in Phosphor-Imager-Kassetten für 22 h bei Raumtemperatur

7. Auswertung der differentiellen Hybridisierungen

Die Auswertung der Hybridisierungen erfolgte an einem Phosphor-Imager.

Ein Klon wurde dann als differentiell exprimiert eingestuft, wenn er ausschließlich ein detektierbares Hybridisierungssignal mit dem vorwärts subtrahierten cDNA Pool zeigte oder wenn die Signalstärke mit dem vorwärts subtrahierten cDNA Pool um mindestens den Faktor 5 größer war als mit dem rückwärts subtrahierten cDNA Pool.

8. Bestätigung der differentiellen Expression mittels semi-quantitativer RT- PCR

Um die differentielle Expression der Klone mit differentiellem Hybridisierungsergebnis zu bestätigen, wurden Sequenzen zufällig ausgewählt und entsprechende Primer hergestellt.

Als Methode zum Nachweis der differentiellen Expression wurde die comparative multiplex RT-PCR nach Pilarsky et al. (The Prostate 36: 85-91 (1998)) angewendet. Als interner Standard wurden Primer für das 23 kD highly basic-Protein verwendet. Die interessierende Sequenz und das Standardfragment wurden simultan in einer Reaktion für eine unterschiedliche Anzahl an Zyklen amplifiziert. Die PCR-Produkte wurden anschließend auf einem 6% Sequenzier-Gel aufgetrennt und mittels einer Software analysiert und quantifiziert. Zuerst wurde die Anzahl an Zyklen ermittelt für die sowohl das Standardfragment, als auch die interessierende Sequenz linear amplifzierten und die dann für die quantifizierende PCR verwendet wurde. Zur quantifizierenden RT-PCR wurden unterschiedliche RNA-Präparationen herangezogen und jeweils 3 Reaktionen angesetzt.

Es konnte für 90% der untersuchten Sequenzen mit differentiellem Hybridisierungsergebnis ein Unterschied in der Expression festgestellt werden, der größer war als ein Faktor 2.

9. Automatische Verlängerung der gefundenen Nukleinsäure-Sequenzen

Um möglichst viel Sequenzinformation für jeden differentiell exprimierten Klon zu erhalten, wurde eine automatische Verlängerung der Ausgangssequenz anhand aller verfügbaren EST-Sequenzen durchgeführt.

Die automatische Verlängerung der Sequenz S vollzieht sich in drei Schritten:

1. Ermittlung aller zu S homologen Sequenzen aus der Gesamtmenge aller verfügbaren EST's aus der LifeSeq-Datenbank (Stand Oktober 1997) mit Hilfe des BLAST Algorithmus (Altschul S., Gish W., Miller W., Myers E., Lipman D. (1990) J. Mol. Biol., 215, 403-410).
2. Assemblierung dieser Sequenzen mittels des Standardprogramms GAP4 (Bonfield J., Smith K., Staden R. (1995), Nucleic Acids Research 23, 4992-4999).
3. Berechnung einer Konsensus-Sequenz aus den assemblierten Sequenzen.

Nun wird versucht die Konsensus-Sequenz in gleicher Weise zu verlängern. Diese Iteration wird mit der jeweils erhaltenen Konsensus-Sequenz fortgesetzt, bis keine weitere Verlängerung mehr möglich ist.

10. Gefundene Nukleinsäure-Sequenzen

Analog der unter 1 bis 9 beschriebenen Verfahrensweise wurden z. B. folgende Sequenzen gefunden, von denen einige mehrfach in Kulturform a) oder Kulturform b) der Endothelzellen überexprimiert werden.

Diese Nukleinsäure-Sequenzen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Die mögliche Funktion dieser Genbereiche betrifft die Angiogenese.

Das Ergebnis ist in der folgenden Tabelle I dargestellt:

TABELLE I

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 der ermittelten Kandidatengene werden in dem nachfolgenden Sequenzprotokoll beschrieben.

Sequenzprotokoll

Claims

1. Eine Nukleinsäure-Sequenz, die ein Genprodukt oder ein Teil davon kodiert, umfassend

a) eine Nukleinsäure-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe Seq ID No. 1 bis Seq. ID No. 59
b) eine allelische Variation der unter a) genannten Nukleinsäure- Sequenzen
oder
c) eine Nukleinsäure-Sequenz, die komplementär zu den unter a) oder b) genannten Nukleinsäure-Sequenzen ist.

2. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß einer der Sequenzen Seq ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 oder eine komplementäre oder allelische Variante davon.

3. Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59, dadurch gekennzeichnet, daß sie in Endothelzellgewebe erhöht exprimiert sind.

4. BAC, PAC und Cosmid-Klone, enthaltend funktionelle Gene und ihre chromosomale Lokalisation, entsprechend den Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID. No. 1 bis Seq. ID No. 59, zur Verwendung als Vehikel zum Gentransfer.

5. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine 90%ige Homologie zu einer humanen Nukleinsäure-Sequenz aufweist.

6. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine 95%ige Homologie zu einer humanen Nukleinsäure-Sequenz aufweist.

7. Eine Nukleinsäure-Sequenz, umfassend einen Teil der in den Ansprüchen 1 bis 6 genannten Nukleinsäure-Sequenzen, in solch einer ausreichenden Größe, daß sie mit den Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 6 hybridisieren.

8. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Größe des Fragments eine Länge von mindestens 50 bis 3000 bp aufweist.

9. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Größe des Fragments eine Länge von mindestens 150 bis 2800 bp aufweist.

10. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Größe des Fragments eine Länge von mindestens 150 bis 2600 bp aufweist.

11. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, die mindestens eine Teilsequenz eines biologisch aktiven Polypeptids kodiert.

12. Eine Expressionskassette, umfassend ein Nukleinsäure-Fragment oder eine Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, zusammen mit mindestens einer Kontroll- oder regulatorischen Sequenz.

13. Eine Expressionskassette, umfassend ein Nukleinsäure-Fragment oder eine Sequenz gemäß Anspruch 12, worin die Kontroll- oder regulatorische Sequenz ein geeigneter Promotor ist.

14. Eine Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 12 und 13, dadurch gekennzeichnet, daß die auf der Kassette befindlichen DNA-Sequenzen ein Fusionsprotein kodieren, das ein bekanntes Protein und ein biologisch aktives Polypeptid-Fragment umfaßt.

15. Verwendung der Nukleinsäure-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 11 zur Herstellung von Vollängen-Genen.

16. Ein DNA-Fragment, umfassend ein Gen, das aus der Verwendung gemäß Anspruch 15 erhältlich ist.

17. Wirtszelle, enthaltend als heterologen Teil ihrer exprimierbaren genetischen Information ein Nukleinsäure-Fragment gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11.

18. Wirtszelle gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es ein prokaryontisches oder eukaryontisches Zellsystem ist.

19. Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß das prokaryontische Zellsystem E. coli und das eukaryontische Zellsystem ein tierisches, humanes oder Hefe-Zellsystem ist.

20. Ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids oder eines Fragments, dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen gemäß den Ansprüchen 17 bis 19 kultiviert werden.

21. Ein Antikörper, der gegen ein Polypeptid oder ein Fragment gerichtet ist, welches von den Nukleinsäuren der Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 kodiert wird, das gemäß Anspruch 20 erhältlich ist.

22. Ein Antikörper gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß er monoklonal ist.

23. Polypeptidsequenz, exprimiert von einer der Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59.

24. Polypeptidsequenzen gemäß Anspruch 23, mit mindestens 80%iger Homologie zu diesen Sequenzen.

25. Polypeptidsequenzen gemäß Anspruch 23, mit mindestens 90%iger Homologie zu diesen Sequenzen.

26. Polypeptidsequenz, dadurch gekennzeichnet, daß sie die Sequenz Seq ID No. 34 umfasst.

27. Verwendung der Polypeptidsequenzen gemäß den Ansprüchen 23 bis 26 als Tools zum Auffinden von Wirkstoffen gegen angiogenetische Erkrankungen.

28. Verwendung der Nukleinsäure-Sequenzen gemäß den Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 zur Expression von Polypeptiden, die als Tools zum Auffinden von Wirkstoffen gegen angiogenetische Erkrankungen verwendet werden können.

29. Verwendung der Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 in sense oder antisense Form.

30. Verwendung der Polypeptidsequenzen gemäß den Ansprüchen 23 bis 26 als Arzneimittel in der Gentherapie zur Behandlung angiogenetischer Erkrankungen.

31. Verwendung der Polypeptidsequenzen gemäß den Ansprüchen 23 bis 26 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung angiogenetischer Erkrankungen.

32. Arzneimittel, enthaltend mindestens eine Polypeptidsequenz gemäß den Ansprüchen 23 bis 26.

33. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es eine genomische Sequenz ist.

34. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß es eine mRNA-Sequenz ist.

35. Genomische Gene, ihre Promotoren, Enhancer, Silencer, Exonstruktur, Intronstruktur und deren Spleißvarianten, erhältlich aus den cDNAs der Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59.

36. Verwendung der genomischen Gene gemäß Anspruch 35, zusammen mit geeigneten regulativen Elementen.

37. Verwendung gemäß Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß das regulative Element ein geeigneter Promotor undl oder Enhancer ist.

38. Verwendung der Nukleinsäure-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 11 und der Peptide gemäß den Ansprüchen 23 bis 26, entweder alleine oder in Formulierung als Arzneimittel zur Behandlung von Psoriasis, Arthritis, wie rheumatoide Arthritis, Hämangioma, Angiofribroma, Augenerkrankungen, wie diabetische Retinopathie, Neovaskulares Glaukom, Nierenerkrankungen, wie Glomerulonephritis, diabetische Nephropatie, maligne Nephrosklerose, thrombische mikroangiopatische Syndrome, Transplantationsabstoßungen und Glomerulopathie, fibrotische Erkrankungen, wie Leberzirrhose, mesangialzellproliferative Erkrankungen, Artheriosklerose und Verletzungen des Nervengewebes.