DE19911684A1 - Menschliche Nukleinsäure-Sequenzen aus Endothelzellen - Google Patents
Menschliche Nukleinsäure-Sequenzen aus EndothelzellenInfo
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Abstract
Es werden Nukleinsäure-Sequenzen - mRNA, cDNA, genomische Sequenzen - aus Gewebe menschlicher Endothelzellen, die für Genprodukte oder Teile davon kodieren und deren Verwendung beschrieben. Es werden weiterhin die über die Sequenzen erhältlichen Polypeptide und deren Verwendung beschrieben.
Description
Die Erfindung betrifft Nukleinsäure-Sequenzen - mRNA, cDNA, genomische
Sequenzen - aus Gewebe menschlicher Endothelzellen, die für Genprodukte oder
Teile davon kodieren und deren Verwendung. Die Erfindung betrifft weiterhin die
über die Sequenzen erhältlichen Polypeptide und deren Verwendung.
Angiogenese ist ein Prozeß, der im adulten Lebewesen bei den zyklischen
Prozessen der Reproduktion in der Frau, bei der Wundheilung und in verschiedenen
pathologischen Situationen zu beobachten ist, wie z. B. Tumorwachstum,
rheumatische Erkrankungen, Endometriose, bei der Kollateralenbildung im Herzen
und in der Peripherie, etc.
Persistente Angiogenese kann die Ursache für verschiedene Erkrankungen wie
Psoriasis, Arthritis, wie rheumatoide Arthritis, Hämangioma, Angiofribroma,
Augenerkrankungen, wie diabetische Retinopathie, Neovaskulares Glaukom,
Nierenerkrankungen, wie Glomerulonephritis, diabetische Nephropatie, maligne
Nephrosklerose, thrombische mikroangiopatische Syndrome,
Transplantationsabstoßungen und Glomerulopathie, fibrotische Erkrankungen, wie
Leberzirrhose, mesangialzellproliferative Erkrankungen und Arteriosklerose sein
oder zu einer Verschlimmerung dieser Erkrankungen führen.
Gelänge es, Angiogenese zu induzieren oder zu hemmen, so würden sich mehrere
Erkrankungen grundlegend therapieren lassen. Hierzu müßte man die Gene bzw.
die für die Angiogenese relevanten Nukleinsäure-Sequenzen kennen.
Bisher ist nicht bekannt, welche Gene bzw. Nukleinsäure-Sequenzen oder Teile
davon angiogeneserelevant sind.
Es konnten nun Nukleinsäure-Sequenzen gefunden werden, die
angiogeneserelevant sind.
Diese Sequenzen sind entweder bisher nicht beschrieben worden oder sie sind nur
als Nukleinsäure-Sequenzen aus Nagern bekannt, jedoch ohne Hinweis auf
Angiogenese. Weitere Sequenzen sind als humane Gene oder Teile davon
beschrieben, jedoch nicht in bezug auf mögliche angiogeneserelevante
Eigenschaften.
Zur Suche nach angiogeneserelevanten Genen wurden Endothelzellen aus
Vorhäuten adulter Personen gewonnen, die auf zweierlei Arten kultiviert wurden:
- a) auf einer Rattenschwanzkollagenmatrix in subkonfluenter Dichte
und - b) auf einem Gel aus extrazellulärer Matrix (Matrigel).
Unter Kulturform a) bilden die Zellen die klassischen kopfsteinpflasterartigen
Monolayer.
Unter Kulturform b) bilden die Zellen netzartige Strukturen mit röhrenförmigen
Gebilden.
Die Zellkulturform a) stellt einen frühen Angiogenesezustand mit vornehmlich
proliferativem Phänotyp dar.
Die Zellkulturform b) stellt ein Modell für eine spätere Phase der Angiogenese dar,
bei der die Differenzierung der Endothelzellen zu einer Bildung von
schlauchförmigen Strukturen führt. Diese Strukturen sind eine Voraussetzung für
einen Blutfluß, der von der Gewebsfläche separiert ist.
Aus beiden Zellkulturformen wird mRNA isoliert, in cDNA transkribiert, und mit einer
Restriktionsendonuklease in Fragmente der Größe von 200 bis 1500 bp
geschnitten. Mittels einer subtraktiven PCR-Technik wurden die differentiell
vorkommenden Fragmente beider Zustände amplifiziert. Sie wurden in Vektoren
eingebaut und kloniert. Die Klone wurden zunächst sequenziert und anschließend
wurden ihre Sequenzen mit bioinformatorischen Techniken komplettiert.
Mit Hilfe einer quantitativen, in der Literatur beschriebenen PCR-Technik (Pilarsky et
al., 1998, s. Versuchsbeschreibung) wurde zunächst untersucht, ob die Gene in den
beiden Kulturzuständen differentiell exprimiert sind. Zur Normierung wurde die
Expression des 23 kDalton Proteins (s. Versuchsbeschreibung) als interner Marker
verwendet. In der differentiellen Expression traten Verhältnisse von 2-7fach auf.
Es konnten nun die Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59
gefunden werden, die als Kandidatengene bei der Angiogenese eine Rolle spielen.
Die Erfindung betrifft somit Nukleinsäure-Sequenzen, die ein Genprodukt oder ein
Teil davon kodieren, umfassend
- a) eine Nukleinsäure-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe der Nukleinsäure-Sequenzen Seq ID No. 1 bis Seq. ID No. 59
- b) eine allelische Variation der unter a) genannten Nukleinsäure-
Sequenzen
oder - c) eine Nukleinsäure-Sequenz, die komplementär zu den unter a) oder b) genannten Nukleinsäure-Sequenzen ist.
Die Erfindung betrifft weiterhin Nukleinsäure-Sequenzen gemäß einer der
Sequenzen Seq ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 oder eine komplementäre oder
allelische Variante davon und die Nukleinsäure-Sequenzen davon, die eine 90%ige
bis 95%ige Homologie zu einer humanen Nukleinsäure-Sequenz aufweisen.
Die Erfindung betrifft auch die Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID
No. 59, die in Endothelzellgewebe erhöht exprimiert sind.
Die Erfindung betrifft ferner Nukleinsäure-Sequenzen, umfassend einen Teil der
oben genannten Nukleinsäure-Sequenzen, in solch einer ausreichenden Größe,
daß sie mit den Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 hybridisieren.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen weisen im allgemeinen eine
Länge von mindestens 50 bis 3000 bp, vorzugsweise eine Länge von mindestens
150 bis 2800 bp, besonders bevorzugt eine Länge von 150 bis 2600 bp auf.
Mit den erfindungsgemäßen Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 können
gemäß gängiger Verfahrenspraxis auch Expressionskassetten konstruiert werden,
wobei auf der Kassette mindestens eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäure-
Sequenzen zusammen mit mindestens einer dem Fachmann allgemein bekannten
Kontroll- oder regulatorischen Sequenz, wie z. B. einem geeigneten Promotor,
kombiniert wird. Die erfindungsgemäßen Sequenzen können in sense oder
antisense Orientierung eingefügt sein.
In der Literatur sind ist eine große Anzahl von Expressionskassetten bzw. Vektoren
und Promotoren bekannt, die verwendet werden können.
Unter Expressionskassetten bzw. Vektoren sind zu verstehen: 1. bakterielle, wie z. B.,
phagescript, pBs, ϕX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a,
pNH46a (Stratagene), pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia),
2. eukaryontische, wie z. B. pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene),
pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia).
Unter Kontroll- oder regulatorischer Sequenz sind geeignete Promotoren zu
verstehen. Hierbei sind zwei bevorzugte Vektoren der pKK232-8 und der PCM7
Vektor. Im einzelnen sind folgende Promotoren gemeint: lacI, lacZ, T3, T7, gpt,
lambda PR, trc, CMV, HSV Thymidin-Kinase, SV40, LTRs aus Retrovirus und Maus
Metallothionein-I.
Die auf der Expressionskassette befindlichen DNA-Sequenzen können ein
Fusionsprotein kodieren, das ein bekanntes Protein und ein biologisch aktives
Polypeptid-Fragment umfaßt.
Die Expressionskassetten sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen können auch zur Herstellung von
Vollängen-Genen verwendet werden. Die erhältlichen Gene sind ebenfalls
Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäure-
Sequenzen, sowie die aus der Verwendung erhältlichen Gen-Fragmente.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen können mit geeigneten Vektoren
in Wirtszellen gebracht werden, in denen als heterologer Teil die auf den
Nukleinsäure-Sequenzen enthaltene genetischen Information befindet, die
exprimiert wird.
Die die Nukleinsäure-Sequenzen enthaltenden Wirtszellen sind ebenfalls
Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Geeignete Wirtszellen sind z. B. prokaryontische Zellsysteme wie E. coli oder
eukaryontische Zellsysteme wie tierische oder humane Zellen oder Hefen.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen können in sense oder antisense
Form verwendet werden.
Die Herstellung der Polypeptide oder deren Fragment erfolgt durch Kultivierung der
Wirtszellen gemäß gängiger Kultivierungsmethoden und anschließender Isolierung
und Aufreinigung der Peptide bzw. Fragmente, ebenfalls mittels gängiger Verfahren.
Die Erfindung betrifft ferner Nukleinsäure-Sequenzen, die mindestens eine
Teilsequenz eines biologisch aktiven Polypeptids kodieren.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Polypeptid-Teilsequenzen, sogenannte
ORF (open-reading-frame)-Peptide, die von den erfinderischen Teilsequenzen
exprimiert werden.
Die Erfindung betrifft ferner die Polypeptid-Sequenzen, die mindestens eine 80%ige
Homologie, insbesondere eine 90%ige Homologie zu den Polypeptiden aufweisen.
Die Erfindung betrifft auch Antikörper, die gegen ein Polypeptid oder ein Fragment
gerichtet sind, welche von den erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen Seq.
ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 kodiert werden.
Unter Antikörper sind insbesondere monoklonale Antikörper zu verstehen.
Die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen kodierten Polypeptide
können auch als Tool zum Auffinden von Wirkstoffen bei angiogenen Erkrankungen
verwendet werden, was ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist.
Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der
Nukleinsäure-Sequenzen gemäß den Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59
zur Expression von Polypeptiden, die als Tools zum Auffinden von Wirkstoffen
gegen angiogenetische Erkrankungen verwendet werden können.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der von den erfindungsgemäßen
Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59 exprimierten Polypeptide
als Arzneimittel in der Gentherapie zur Behandlung angiogener Erkrankungen, bzw.
zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung angiogener Erkrankungen.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren bzw. die über diese Nukleinsäuren
exprimierten Proteine können somit entweder alleine oder in Formulierung als
Arzneimittel zur Behandlung von Psoriasis, Arthritis, wie rheumatoide Arthritis,
Hämangioma, Angiofribroma, Augenerkrankungen, wie diabetische Retinopathie,
Neovaskulares Glaukom, Nierenerkrankungen, wie Glomerulonephritis, diabetische
Nephropatie, maligne Nephrosklerose, thrombische mikroangiopatische Syndrome,
Transplantationsabstoßungen und Glomerulopathie, fibrotische Erkrankungen, wie
Leberzirrhose, mesangialzellproliferative Erkrankungen, Arteriosklerose und
Verletzungen des Nervengewebes zum Einsatz kommen.
Die Erfindung betrifft auch Arzneimittel, die mindestens eine Polypeptidsequenz
enthalten, die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID No. 1
bis Seq. ID No. 59 exprimiert werden.
Die gefundenen erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen können auch
genomische oder mRNA-Sequenzen sein.
Die Erfindung betrifft auch genomische Gene, ihre Promotoren, Enhancer, Silencer,
Exonstruktur, Intronstruktur und deren Spleißvarianten, erhältlich aus den cDNAs
der Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59, sowie deren Verwendung
zusammen mit geeigneten regulativen Elementen, wie geeigneten Promotoren und/oder
Enhancern.
Mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren (cDNA-Sequenzen) werden genomische
BAC-, PAC- und Cosmid-Bibliotheken gescreent und über komplementäre
Basenpaarung (Hybridisierung) spezifisch humane Klone isoliert. Die so isolierten
BAC-, PAC- und Cosmid-Klone werden mit Hilfe der Fluoreszenz-in-situ-
Hybridisation auf Metaphasenchromosomen hybridisiert und entsprechende
Chromosomenabschnitte identifiziert, auf denen die entsprechenden genomischen
Gene liegen. BAC-, PAC- und Cosmid-Klone werden sequenziert, um die
entsprechenden genomischen Gene in ihrer vollständigen Struktur (Promotoren,
Enhancer, Silencer, Exons und Introns) aufzuklären. BAC-, PAC- und Cosmid-Klone
können als eigenständige Moleküle für den Gentransfer eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft auch BAC-, PAC- und Cosmid-Klone, enthaltend funktionelle
Gene und ihre chromosomale Lokalisation, entsprechend den Sequenzen Seq. ID.
No. 1 bis Seq. ID No. 59, zur Verwendung als Vehikel zum Gentransfer.
Nukleinsäuren = Unter Nukleinsäuren sind in der voliegenden Erfindung zu
verstehen: mRNA, partielle cDNA, vollängen cDNA und
genomische Gene (Chromosomen).
ORF = Open Reading Frame, eine definierte Abfolge von Aminosäuren, die von der cDNA-Sequenz abgeleitet werden kann.
ORF = Open Reading Frame, eine definierte Abfolge von Aminosäuren, die von der cDNA-Sequenz abgeleitet werden kann.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Herstellung der erfindungsgemäßen
Nukleinsäure-Sequenzen, ohne die Erfindung auf diese Beispiele und Nukleinsäure-
Sequenzen zu beschränken.
Primäre, humane, mikrovaskuläre Endothelzellen (MVEC) wurden aus menschlichen
Vorhäuten präpariert und mittels biotinyliertem anti CD31 (PECAM) Antikörper
selektioniert (Referenz).
Kulturbedingungen: 37°C, 5% CO2
Medium: M199, 10% FCS, 10% Humanserum, 6 µg/ml ECGF, 1 mM Natriumpyruvat, 3 U/ml Heparin, 100 U/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin, 1 × nicht essentielle Aminosäuren.
Kulturbedingungen: 37°C, 5% CO2
Medium: M199, 10% FCS, 10% Humanserum, 6 µg/ml ECGF, 1 mM Natriumpyruvat, 3 U/ml Heparin, 100 U/ml Penicillin, 100 µg/ml Streptomycin, 1 × nicht essentielle Aminosäuren.
Für die Kulturform a) werden die Zellen auf mit Collagen I beschichtetem Plastik
kultiviert. Für die Kulturform b) werden die Zellen auf einem Gel aus extrazellulären
Matrixproteinen ausgebracht. Das dazu verwendete Matrigel (Becton Dickinson)
wurde 1 zu 1 mit M199 Medium verdünnt, in der Kälte in das verwendete
Kulturgefäß gegossen (60 µl/cm2) und bei 37°C für 30 min. geliert. Anschließend
wurden die Zellen ausgebracht.
Für Kulturform a) und b) wurden MVEC in einer Dichte von 2 × 104/cm2 ausgebracht
und für 7 h bei 37°C, 5% CO2 inkubiert.
Die Gesamt-RNA-Präparation wurde nach der Guanidinium Thiocyanat Methode mit
anschließender Zentrifugation durch ein Caesiumchlorid-Kissen durchgeführt
(Sambrook J., Fritsch E. F., and Maniatis T.; 1989, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press).
Die polyA+ RNA-Selektion wurde über oligo(dT)-Zellulosesäulen (mRNA Purification
Kit, Pharmacia Biotech) durchgeführt.
Die Subtraktion wurde nach der Methode von Diatchenko et al. (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1996 Jun 11, 93: 6025-30) mit Hilfe des PCR-Select cDNA Subtraction
Kit durchgeführt.
Die polyA+ RNA, die die Zielsequenzen enthält, wird als Tester, die davon
abzuziehende polyA+ RNA als Driver bezeichnet.
Es wurden 2 Subtraktionen durchgeführt, wobei einmal die polyA+ RNA der
Kulturform a) und einmal die polyA+ RNA der Kulturform b) als Tester diente. Die
folgende Versuchsbeschreibung stellt exemplarisch nur eine Subtraktion dar.
Sowohl für den Tester als auch für den Driver wird eine doppelsträngige cDNA-
Synthese durchgeführt.
Die Strangsynthese wird mit folgendem Ansatz durchgeführt:
polyA+ RNA | 2 µg |
cDNA-Synthese Primer (10 µM) | 1 µl |
Wasser | add 5 µl |
Die Reaktionen werden für 2 min. bei 70°C und anschließend 2 min auf Eis
inkubiert.
Zu jeder Reaktion wurde folgendes zugegeben:
5 × First-strand buffer (250 mM Tris-HCL, pH8, 330 mM Mg-Chlorid, 375 mM KCl) | 2 µl |
10 mM dNTP | 1 µl |
Wasser | 1 µl |
MMLV reverse transcriptase (200 U/µl) | 1 µl |
Die Reaktionen wurden für 90 Minuten bei 42°C und anschließend für 2 Minuten auf
Eis inkubiert.
Die 2. Strang-Synthese wurde mit folgendem Ansatz durchgeführt:
1. Strang-Synthese | 10 µl |
Wasser | 48,4 µl |
5 × Second-strand buffer (500 mM KCL, 50 mM Ammoniumsulfat, 25 mM Mg-Chlorid, 0,75 mM β-NAD, 100 mM Tris-HCL, pH 7,5, 0,25 mg/ml BSA) | 16 µl |
10 mM dNTP | 1,6 µl |
20 × Second-strand enzyme cocktail (DNA Polymerase 16 U/µl Rnase H 0,2 U/µl, E. coli DNA Ligase 1,2 U/µl) | 4 µl |
Die Reaktionen wurden für 2 h bei 16°C inkubiert.
Zu jeder Reaktion wurde T4 DNA Polymerase wie folgt zugegeben:
T4 DNA Polymerase 3 U/µl | 2 µl |
Die Reaktionen wurden für 30 min bei 16°C inkubiert.
Die Reaktionen wurden mit EDTA abgestoppt, wobei die Lösung folgende
Zusammensetzung aufweist:
20 × EDTA/Glykogen Mix (200 mM EDTA, 1 mg/ml Glykogen) | 4 µl |
Es wurde für jede Reaktion eine Phenol/Chloroform-Extraktion und eine Ethanol-
Präzipitation durchgeführt. Die Pellets wurden in je 50 µl Wasser resuspendiert.
Sowohl für den Tester als auch für den Driver wurde ein Rsa I-Verdau durchgeführt.
Hierzu wurden folgende Lösungen verwendet:
ds cDNA | 43,5 µl |
10 × Rsa I Restriktionspuffer (100 mM Bis Tris Propan-HCl, pH 7,0, 100 mM Mg-Clorid, 1 mM DTT) | 5 µl |
Rsa I (10 U/µl) | 1,5 µl |
Die Reaktionen wurden für 90 min bei 37°C inkubiert.
Die Reaktionen wurden anschließend mit EDTA abgestoppt, wobei die Lösung
folgende Zusammensetzung aufweist:
20 × EDTA/Glykogen Mix (200 mM EDTA 1 mg/ml Glykogen) | 2,5 µl |
Anschließend wurde für jede Reaktion eine Phenol/Chloroform-Extraktion und eine
Ethanol-Präzipitation durchgeführt. Die hierbei entstehenden Pellets wurden in je
5,5 µl Wasser für die weitere Verarbeitung resuspendiert.
Die Tester cDNA wurde in 2 Fraktionen aufgeteilt. An jede Tester-Fraktion wurde ein
Adapter ligiert. Die Konzentrationen der verwendeten Substanzen für die beiden
Tester sind im einzelnen in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt.
Die Reaktionen wurden über Nacht bei 16°C inkubiert und anschließend mit EDTA
abgestoppt (20 × EDTA/Glykogen Mix, 1 µl (200 mM EDTA, 1 mg/ml Glykogen)).
Die Reaktionen wurden für 5 min bei 72°C inkubiert.
Die Driver und Tester wurden anschließend miteinander in zwei Schritten
hybridisiert.
Die erste Hybridisierung wurde für die beiden Reaktionen mit den in der folgenden
Tabelle aufgeführten Lösungen und Verbindungen durchgeführt.
Die Reaktionen wurden für 90 sek bei 98°C und anschließend direkt für 8 h bei 68°C
inkubiert.
Für die 2. Hybridisierung wurden Reaktion 1 und 2 gemischt und frisch denaturierter
Driver wie folgt zugegeben:
Driver | 1 µl |
4 × Hybridisierungspuffer | 1 µl |
Wasser | 2 µl |
1 µl dieser Mischung wurde für 90 sek bei 98°C inkubiert und anschließend
möglichst schnell mit Reaktion 1 und Reaktion 2 fusioniert.
Die 2. Hybridisierung wurde bei 68°C über Nacht inkubiert. Anschließend wurden
zur 2. Hybridisierung 200 µl Verdünnungspuffer (20 mM HEPES-HCl (pH 8,3), 50 mM
NaCl, 0,2 mM EDTA (pH 8,0)) zugegeben. Danach wurde die 2. Hybridisierung für 7 min
bei 68°C inkubiert. Der so hergestellte Ansatz wurde dann für die PCR
eingesetzt.
Differentiell exprimierte Fragmente in den subtrahierten cDNA Pools wurden über zwei
aufeinanderfolgende PCRs selektiv amplifiziert.
Die 1. PCR wurde mit folgendem Ansatz durchgeführt:
10 × PCR-Puffer (400 mM Tricine-KOH, pH 9,2, 150 mM KOAc, | 2,5 µl |
AL=L<35 mM MG(OAc) 2, 37,5 µg/ml BSA) | |
10 mM dNTP | 0,5 µl |
PCR Primer 1 (10 µM) | 1 µl |
50 × Advantage cDNA Polymerase | 0,5 µl |
verdünnte 2. Hybridisierung | 1 µl |
Wasser | 19,5 µl |
Das PCR-Programm wurde wie folgt durchgeführt:
75°C, 5 min
Schleife 94°C, 30 sek
66°C, 30 sek
72°C, 90 sek
75°C, 5 min
Schleife 94°C, 30 sek
66°C, 30 sek
72°C, 90 sek
Insgesamt wurden 27 Zyklen durchgeführt.
Die zweite PCR wurde mit folgendem Ansatz durchgeführt:
10 × PCR-Puffer | 2,5 µl |
10 mM dNTP | 0,5 µl |
nested PCR-Primer 1 (10 µM) | 1 µl |
nested PCR Primer 2R (10 µM) | 1 µl |
50 × Advantage cDNA Polymerase | 0,5 µl |
PCR Produkt | 0,1 µl |
H2O | 19,4 µl |
Das PCR-Programm wurde wie folgt durchgeführt:
94°C, 30 sek
68°C, 30 sek
72°C, 90 sek
94°C, 30 sek
68°C, 30 sek
72°C, 90 sek
Insgesamt wurden 12 Zyklen durchgeführt.
Die Subtraktionseffizienz wurde durch eine semi-quantitative PCR für ein bekanntes
nicht reguliertes Gen (SH3P18) überprüft. Es zeigte sich eine Reduktion in dem
subtrahierten cDNA Pool um einen Faktor von 150-200.
Die vorwärts und rückwärts subtrahierten cDNA Pools wurden in pUC 18 Sma I/BAP
ligiert (SureClone Ligation Kit, Pharmacia Biotech) und anschließend in chemisch
kompetente E. coli DH5α kloniert.
Die Fragmente der subtrahierten cDNA Pools wurden dazu zu Blunt-Enden
aufgefüllt und phosphoryliert. Folgende Zusammensetzungen wurden hierfür
verwendet:
Subtrahierter cDNA Pool | 1,5 µg |
Klenow Fragment | 1 µl |
10 × Blunting/Kinasing Buffer | 2 µl |
Polynucleotide Kinase | 1 µl |
Wasser | add 20 µl |
Die Reaktionen wurden für 30 min bei 37°C inkubiert, anschließend über PCR
Purification Columns aufgereinigt und in 30 µl Wasser eluiert. Anschließend wurde
die DNA-Konzentration wurde mittels OD-Messung bestimmt.
Die Ligation in pUC 18 wurde mit folgendem Ansatz durchgeführt:
Blunt-ended cDNA Pool | 50 ng |
pUC 18 Sma I/BAP (50 ng/µl) | 1 µl |
2 × Ligationspuffer | 10 µl |
DTT | 1 µl |
T4 DNA Ligase (6U/µl) | 3 µl |
Wasser | add 20 µl |
Die Reaktionen wurden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Ligationen wurden in chemisch kompetente E. coli DH5α transformiert.
Die transformierten Zellen wurden auf 2YT Agarose-Platten mit 100 µg/ml Ampicilin,
625 µM IPTG und 0,005% X-Gal ausgestrichen und über Nacht bei 37°C angezogen.
Auf 17 zufällig ausgewählten, weißen Klonen wurde eine Kolonie-PCR mit Vektor-
Primern (M13 Standardprimer) durchgeführt. 15-16 Klone zeigten dabei Inserts mit
einer Größenverteilung, die der des verwendeten cDNA Pools entsprach.
Für jede Subtraktion wurden 1536 Klone in 384-well Platten mit 50 µl 2YT, 1×HMFM,
100 µg/ml Ampicilin pro well transferiert. Die gefüllten 384-well Platten wurden über
Nacht bei 37°C inkubiert und konnten dann bei -80°C gelagert werden.
Die 1536 Klone einer subtraktiven cDNA Bank wurden auf eine Hybond Nylon N+
Membran (Amersham) angeimpft. Die Membran wurde auf eine 2YT Agarose-Platte
mit 100 µg/ml Ampicilin gelegt und über Nacht bei 37°C inkubiert. Die Membran
wurde mit der Kolonie-Seite nach oben für 4 min auf in Denaturierungslösung (0,5 M
NaOH, 1,5 M NaCl) getränktes Whatman 3MM Papier gelegt. Anschließend wurde
die Membran für 4 min auf in Neutralisierungslösung (1 M Tris-HCl (pH 7,5), 1,5 M
NaCl) getränktes Whatman 3MM Papier inkubiert. Die Membran wurde dann für 1 h
bei 37°C mit Proteinase K behandelt. Die Membran wurde dazu in 300 ml Proteinase
K Puffer (50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl (pH 8), 50 mg/ml Proteinase K)
getaucht. Schließlich wurde die Membran bei 80°C für 3 h getrocknet und wurde
dann für die Hybridisierungen verwendet.
Um die differentielle Expression der klonierten Fragmente nachzuweisen wurde mit
Hilfe eines PCR-Select Differential Screening Kits eine differentielle Hybridisierung
auf Kolonie-Filtern der subtraktiven cDNA-Banken durchgeführt.
Für eine spezifische Hybridisierung der vorwärts und rückwärts subtrahierten cDNA
Pools auf die subtraktiven cDNA-Bank Kolonie-Filter war es notwendig die Adapter-
Sequenzen in der Hybridisierungsprobe zu entfernen.
Als Hybridisierungsproben für die Rsa I-Restriktion der subtrahierten cDNA Pools wurden
eingesetzt:
cDNA Pool | 28 µl |
10 × Rsa I Restriktionspuffer (100 mM Bis Tris Propan-HCl, | 3 µl |
AL=L<pH 7,0 100 mM Mg-Chlorid, 1 mM DTT) | |
Rsa I (10 U/µl) | 2 µl |
Die Reaktionen wurden bei 37°C für 5 h inkubiert und anschließend über PCR-
Reinigungssäulen aufgereinigt und in 30 µl Wasser eluiert. Die DNA-Konzentration
wurde mittels OD-Messung bestimmt.
Die radioaktive Markierung der subtrahierten cDNA Pools wurde mit folgendem
Ansatz durchgeführt:
cDNA Pool 150 ng in | 9 µl |
Reaktionspuffer, -dCTP (333 mM Tris-HCl, pH 8, 33,3 Mg-Chlorid, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 170 µM dATP, 170 µM dGTP, 170 µM dTTP) | 3 µl |
Random Primer Mix (0,9 mg/ml random nonamers, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM Mg-Chlorid, 1 mM DTT, 50 µg/ml BSA) | 2 µl |
AP32 dCTP | 3 µl |
Klenow Fragment (3 U/µl) | 1,5 µl |
Die Reaktionen wurden bei 37°C für 1 h inkubiert, anschließend über PCR-
Reinigungssäulen aufgereinigt und in 30 µl Wasser eluiert. Es wurde die spezifische
Aktivität der Reaktionen bestimmt um sicherzugehen, daß in beiden
Hybridisierungsreaktionen die gleiche Menge an markierter DNA eingesetzt wurde.
Für die Hybridisierungen wurde folgende Lösungen verwendet:
20 × SSC | 50 µl |
Blocking Lösung (10 mg/ml sheared salmon sperm DNA, 0,3 mg/ml komplementäre Oligos zu Adaptoren) | 50 µl |
Die Lösung wurde für 5 min bei 98°C inkubiert, dann für 5 min auf Eis gestellt und mit
5 ml Express-Hybridisations-Lösung gemischt. Diese Lösung wurde dann in der
Hybridisierungsflasche mit dem Filter bei 72°C für 1 h prähybridisiert.
Die Hybridisierungsproben wurden ebenfalls mit folgender Lösung versetzt:
20 × SSC | 50 µl |
Blocking Lösung (10 mg/ml sheared salmon sperm DNA, 0,3 mg/ml komplementäre Oligos zu Adaptoren) | 50 µl |
Der Ansatz wurde dann für 5 min bei 98°C und für 2 min auf Eis inkubiert.
Anschließend wurden die Hybridisierungsproben zu dem Filter in die
Hybridisierungsflaschen gegeben und über Nacht bei 72°C hybridisiert.
Anschließend wurde wie folgt verfahren:
- a) 4 × 20 min bei 68°C mit vorgewärmtem 2xSSC, 0,5% SDS
- b) 2 × 20 min bei 68°C mit vorgewärmtem 0,2xSSC, 0,5% SDS
- c) anschließend Exposition in Phosphor-Imager-Kassetten für 22 h bei Raumtemperatur
Die Auswertung der Hybridisierungen erfolgte an einem Phosphor-Imager.
Ein Klon wurde dann als differentiell exprimiert eingestuft, wenn er ausschließlich
ein detektierbares Hybridisierungssignal mit dem vorwärts subtrahierten cDNA Pool
zeigte oder wenn die Signalstärke mit dem vorwärts subtrahierten cDNA Pool um
mindestens den Faktor 5 größer war als mit dem rückwärts subtrahierten cDNA
Pool.
Um die differentielle Expression der Klone mit differentiellem
Hybridisierungsergebnis zu bestätigen, wurden Sequenzen zufällig ausgewählt und
entsprechende Primer hergestellt.
Als Methode zum Nachweis der differentiellen Expression wurde die comparative
multiplex RT-PCR nach Pilarsky et al. (The Prostate 36: 85-91 (1998)) angewendet.
Als interner Standard wurden Primer für das 23kD highly basic Protein verwendet.
Die interessierende Sequenz und das Standardfragment wurden simultan in einer
Reaktion für eine unterschiedliche Anzahl an Zyklen amplifiziert. Die PCR-Produkte
wurden anschließend auf einem 6% Sequenzier-Gel aufgetrennt und mittels einer
Software analysiert und quantifiziert. Zuerst wurde die Anzahl an Zyklen ermittelt für
die sowohl das Standardfragment, als auch die interessierende Sequenz linear
amplifizierten und die dann für die quantifizierende PCR verwendet wurde. Zur
quantifizierenden RT-PCR wurden unterschiedliche RNA-Präparationen
herangezogen und jeweils 3 Reaktionen angesetzt.
Es konnte für 90% der untersuchten Sequenzen mit differentiellem
Hybridisierungsergebnis ein Unterschied in der Eipression festgestellt werden, der
größer war als ein Faktor 2.
Um möglichst viel Sequenzinformation für jeden differentiell exprimierten Klon zu
erhalten, wurde eine automatische Verlängerung der Ausgangssequenz anhand
aller verfügbaren EST-Sequenzen durchgeführt.
Die automatische Verlängerung der Sequenz S vollzieht sich in drei Schritten:
- 1. Ermittlung aller zu S homologen Sequenzen aus der Gesamtmenge aller verfügbaren EST's aus der LifeSeq-Datenbank (Stand Oktober 1997) mit Hilfe des BLAST Algorithmus (Altschul S., Gish W., Miller W., Myers E., Lipman D. (1990) J. Mol. Biol., 215, 403-410).
- 2. Assemblierung dieser Sequenzen mittels des Standardprogramms GAP4 (Bonfield J., Smith K., Staden R. (1995), Nucleic Acids Research 23, 4992-4999).
- 3. Berechnung einer Konsensus-Sequenz aus den assemblierten Sequenzen.
Nun wird versucht die Konsensus-Sequenz in gleicher Weise zu verlängern. Diese
Iteration wird mit der jeweils erhaltenen Konsensus-Sequenz fortgesetzt, bis keine
weitere Verlängerung mehr möglich ist.
Analog der unter 1 bis 9 beschriebenen Verfahrensweise wurden z. B. folgende
Sequenzen gefunden, von denen einige mehrfach in Kulturform a) oder Kulturform
b) der Endothelzellen überexprimiert werden.
Diese Nukleinsäure-Sequenzen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden
Erfindung.
Die mögliche Funktion dieser Genbereiche betrifft die Angiogenese.
Das Ergebnis ist in der folgenden Tabelle I dargestellt:
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59
der ermittelten Kandidatengene werden in dem nachfolgenden Sequenzprotokoll
beschrieben.
Claims (37)
1. Eine Nukleinsäure-Sequenz, die ein Genprodukt oder ein Teil davon kodiert,
umfassend
- a) eine Nukleinsäure-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe Seq ID No. 1 bis Seq. ID No. 59
- b) eine allelische Variation der unter a) genannten Nukleinsäure- Sequenzen
- a) eine Nukleinsäure-Sequenz, die komplementär zu den unter a) oder b) genannten Nukleinsäure-Sequenzen ist.
2. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß einer der Sequenzen Seq ID No. 1 bis
Seq. ID No. 59 oder eine komplementäre oder allelische Variante davon.
3. Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59, dadurch
gekennzeichnet, daß sie in Endothelzellgewebe erhöht exprimiert sind.
4. BAC, PAC und Cosmid-Klone, enthaltend funktionelle Gene und ihre
chromosomale Lokalisation, entsprechend den Sequenzen Seq. ID. No. 1 bis
Seq. ID No. 59, zur Verwendung als Vehikel zum Gentransfer.
5. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß sie eine 90%ige Homologie zu einer humanen
Nukleinsäure-Sequenz aufweist.
6. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß sie eine 95%ige Homologie zu einer humanen
Nukleinsäure-Sequenz aufweist.
7. Eine Nukleinsäure-Sequenz, umfassend einen Teil der in den Ansprüchen 1
bis 6 genannten Nukleinsäure-Sequenzen, in solch einer ausreichenden
Größe, daß sie mit den Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 6
hybridisieren.
8. Ein Nukleinsäure-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch
gekennzeichnet, daß die Größe des Fragments eine Länge von mindestens
50 bis 3000 bp aufweist.
9. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch
gekennzeichnet, daß die Größe des Fragments eine Länge von mindestens
150 bis 2800 bp aufweist.
10. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch
gekennzeichnet, daß die Größe des Fragments eine Länge von mindestens
150 bis 2600 bp aufweist.
11. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, die
mindestens eine Teilsequenz eines biologisch aktiven Polypeptids kodiert.
12. Eine Expressionskassette, umfassend ein Nukleinsäure-Fragment oder eine
Sequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, zusammen mit mindestens
einer Kontroll- oder regulatorischen Sequenz.
13. Eine Expressionskassette, umfassend ein Nukleinsäure-Fragment oder eine
Sequenz gemäß Anspruch 12, worin die Kontroll- oder regulatorische
Sequenz ein geigneter Promotor ist.
14. Eine Expressionskassette gemäß einem der Ansprüche 12 und 13, dadurch
gekennzeichnet, daß die auf der Kassette befindlichen DNA-Sequenzen ein
Fusionsprotein kodieren, das ein bekanntes Protein und ein biologisch aktives
Polypeptid-Fragment umfaßt.
15. Verwendung der Nukleinsäure-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 11
zur Herstellung von Vollängen-Genen.
16. Ein DNA-Fragment, umfassend ein Gen, das aus der Verwendung gemäß
Anspruch 15 erhältlich ist.
17. Wirtszelle, enthaltend als heterologen Teil ihrer exprimierbaren genetischen
Information ein Nukleinsäure-Fragment gemäß einem der Ansprüche 1 bis
11.
18. Wirtszelle gemäß Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß es ein
prokaryontisches oder eukaryontische Zelisystem ist.
19. Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet,
daß das prokaryontische Zelisystem E. coli und das eukaryontische
Zellsystem ein tierisches, humanes oder Hefe-Zellsystem ist.
20. Ein Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids oder eines Fragments,
dadurch gekennzeichnet, daß die Wirtszellen gemäß den Ansprüchen 17 bis
19 kultiviert werden.
21. Ein Antikörper, der gegen ein Polypeptid oder ein Fragment gerichtet ist,
welches von den Nukleinsäuren der Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59
kodiert wird, das gemäß Anspruch 20 erhältlich ist.
22. Ein Antikörper gemäß Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß er
monoklonal ist.
23. Polypeptidsequenz, exprimiert von einer der Sequenzen Seq. ID No. 1 bis
Seq. ID No. 59.
24. Polypeptidsequenzen gemäß Anspruch 23, mit mindestens 80%iger
Homologie zu diesen Sequenzen.
25. Polypeptidsequenzen gemäß Anspruch 23, mit mindestens 90%iger
Homologie zu diesen Sequenzen.
26. Verwendung der Polypeptidsequenzen gemäß den Ansprüchen 23 bis 25 als
Tools zum Auffinden von Wirkstoffen gegen angiogenetische Erkrankungen.
27. Verwendung der Nukleinsäure-Sequenzen gemäß den Sequenzen Seq. ID
No. 1 bis Seq. ID No. 59 zur Expression von Polypeptiden, die als Tools zum
Auffinden von Wirkstoffen gegen angiogenetische Erkrankungen verwendet
werden können.
28. Verwendung der Nukleinsäure-Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59
in sense oder antisense Form.
29. Verwendung der Polypeptidsequenzen gemäß den Ansprüchen 23 bis 25 als
Arzneimittel in der Gentherapie zur Behandlung angiogenetischer
Erkrankungen.
30. Verwendung der Polypeptidsequenzen gemäß den Ansprüchen 23 bis 25 zur
Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung angiogenetischer
Erkrankungen.
31. Arzneimittel, enthaltend mindestens eine Polypeptidsequenz gemäß den
Ansprüchen 23 bis 25.
32. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch
gekennzeichnet, daß es eine genomische Sequenz ist.
33. Eine Nukleinsäure-Sequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch
gekennzeichnet, daß es eine mRNA-Sequenz ist.
34. Genomische Gene, ihre Promotoren, Enhancer, Silencer, Exonstruktur,
Intronstruktur und deren Spleißvarianten, erhältlich aus den cDNAs der
Sequenzen Seq. ID No. 1 bis Seq. ID No. 59.
35. Verwendung der genomischen Gene gemäß Anspruch 34, zusammen mit
geeigneten regulativen Elementen.
36. Verwendung gemäß Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß das
regulative Element ein geeigneter Promotor und/oder Enhancer ist.
37. Verwendung der Nukleinsäure-Sequenzen gemäß den Ansprüchen 1 bis 11
und der Peptide gemäß den Ansprüchen 23 bis 25, entweder alleine oder in
Formulierung als Arzneimittel zur Behandlung von Psoriasis, Arthritis, wie
rheumatoide Arthritis, Hämangioma, Angiofribroma, Augenerkrankungen, wie
diabetische Retinopathie, Neovaskulares Glaukom, Nierenerkrankungen, wie
Glomerulonephritis, diabetische Nephropatie, maligne Nephrosklerose,
thrombische mikroangiopatische Syndrome, Transplantationsabstoßungen
und Glomerulopathie, fibrotische Erkrankungen, wie Leberzirrhose,
mesangialzellproliferative Erkrankungen, Arteriosklerose und Verletzungen
des Nervengewebes.
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DE19911684A DE19911684A1 (de) | 1999-03-09 | 1999-03-09 | Menschliche Nukleinsäure-Sequenzen aus Endothelzellen |
JP2000603357A JP2002537832A (ja) | 1999-03-09 | 2000-03-08 | 内皮細胞由来のヒト核酸配列及びタンパク質配列 |
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