EP1131339A1 - Procede d'isolation en continu de proteines actives - Google Patents

Procede d'isolation en continu de proteines actives

Info

Publication number
EP1131339A1
EP1131339A1 EP99957301A EP99957301A EP1131339A1 EP 1131339 A1 EP1131339 A1 EP 1131339A1 EP 99957301 A EP99957301 A EP 99957301A EP 99957301 A EP99957301 A EP 99957301A EP 1131339 A1 EP1131339 A1 EP 1131339A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
precipitate
enzymes
reactor
active proteins
proteins
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP99957301A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Philippe Warnery
Marc Cédric DAURY
Marcel Alexandre Juillerat
Simon Crelier
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Societe des Produits Nestle SA
Nestle SA
Original Assignee
Societe des Produits Nestle SA
Nestle SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Societe des Produits Nestle SA, Nestle SA filed Critical Societe des Produits Nestle SA
Priority to EP99957301A priority Critical patent/EP1131339A1/fr
Publication of EP1131339A1 publication Critical patent/EP1131339A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/30—Extraction; Separation; Purification by precipitation

Definitions

  • the subject of the present invention is a new process for the continuous isolation of active proteins and in particular of enzymes from plants or fermentation media, as well as the extraction device.
  • Enzymes play an important role in the biogenesis of aromas in fresh foods.
  • the synthesis processes which they catalyze give the food its characteristic taste and odor.
  • these compounds are often lost or thermally degraded, and the enzymes that synthesize them are inactivated.
  • US Pat. No. 4,728,613 describes a process for enriching the enzyme present in one of the 2 phases of an insoluble oil-water mixture.
  • the enzyme must still be isolated, which is not described in this patent. This process requiring several steps is therefore slow and tedious.
  • it only allows a low yield incompatible with industrial use since it causes part of the activity of the enzyme to be lost at each stage.
  • the present invention aims to remedy these problems.
  • the active proteins contained in a mixture are precipitated continuously and in a single step, in a suitable organic solvent.
  • enzymatic solution extracted from said plant material or from the fermentation medium, in a specific reactor said proteins contained in a solution based on juice of plant material, the conditions in the reactor being adjusted so as to obtain a precipitate of undenatured proteins, said precipitate is then continuously separated.
  • a step of maturing the protein precipitate can be applied after the precipitation in the reactor, so as to increase the size of its particles. constitutive. It can be obtained by mixing with a vertical turbine in a continuous reactor or using a static mixer, for example.
  • the method according to the invention makes it possible to obtain a protein extract, in particular enzymes, which is not denatured and therefore active.
  • a protein extract in particular enzymes, which is not denatured and therefore active.
  • the extraction yield as well as the activity of the enzymes are much higher than what can be obtained by conventional methods or batch processes.
  • Another object of the invention is a reactor which allows the continuous isolation of numerous active proteins. It allows for example to extract more activity of pectin methylesterase (PME), peroxidase (POX) and a larger quantity of proteins (cf. Table 1). It consists of an angle cell, preferably in the form of a T.
  • the reaction conditions are easily adjustable and allow the process to be optimized for each type of protein.
  • This reactor also has the advantage of having a simple geometry compared to other reactors, which makes it very easy to handle and to clean.
  • the invention relates to the non-denatured protein extract thus obtained and its use for regenerating the aromas and tastes of various food products such as soups and other vegetable-based foods, foods for children, for example.
  • This process can also be applicable in the field of biotechnology for "downstream processing", that is to say the separation of an enzyme produced by microorganisms in a bio-fermenter, for example.
  • “Fresh aroma or taste” is understood to mean the aroma and taste of fresh tomatoes, that is to say the green, acidic and light notes which are not found in industrial tomato juice, for example.
  • active proteins designates the enzymes present in the tomato and partly responsible for the taste and odor which are known to be undenatured. These active proteins are for example enzymes such as peroxidase (POX), acid phosphatase (PA), pectin methylesterase (PME) or alcohol dehydrogenase (ADH).
  • POX peroxidase
  • PA acid phosphatase
  • PME pectin methylesterase
  • ADH alcohol dehydrogenase
  • fruit and / or vegetables can be used as vegetable material, that is to say any edible plant, whether it is a seed, root, tuber, stem, leaf, flower or fruit, for example.
  • vegetable material that is to say any edible plant, whether it is a seed, root, tuber, stem, leaf, flower or fruit, for example.
  • plants are used for which it is desired to reinforce the natural fresh taste. We therefore particularly avoid plants whose natural taste can be unpleasant or whose cooked taste is desired, in particular asparagus, peas, soybeans, potatoes, cereals, sea buckthorn, medlars, for example.
  • the leaves in particular leek, fennel and cabbage, stems, in particular rhubarb and broccoli, certain roots, in particular carrot, onion, radish, celery and beets, tubers, especially cassava, and fruits, especially tomatoes, zucchini, eggplant, bananas, apples, apricots, melons, watermelons, pears, plums, peaches, cherry, kiwi and mirabelle plum, for example.
  • the plant material is prepared in the form of juice and then treated so that the solution contains as many enzymes as possible.
  • This initial extraction step consists in dissolving the maximum quantity of enzymes before the actual isolation step in a specific reactor. For this, we can homogenize the plant material and then bring the pH of the homogenate to 5-8.5, and preferably 7.0. Salt can then be added, for example sodium chloride.
  • the total salt concentration can be between 0.25-1 M and preferably
  • the insoluble parts can then be removed by centrifugation, by example.
  • the optimal conditions for each enzyme are presented in Table 2.
  • the supernatant thus obtained can be frozen or directly treated in the reactor so as to isolate the active proteins therefrom.
  • the extraction yield of the enzymes can be between 50 and 100% for the tomato, for example.
  • the solution containing the enzymes to be isolated is thus continuously introduced into a reactor consisting of a cell, two "inlet” branches (enzyme solution and solvent) and an “outlet” branch (for the enzyme isolate in the form of a precipitate), the latter preferably forming an angle of 90 ° relative to the inlets, ie a T-shaped cell. Other angles can be used.
  • the solution containing the enzymes to be isolated is mixed with the organic solvent then carried out in the reactor.
  • the solvent is preferably chosen from alcohols, and in particular ethanol, or any other derived organic solvent.
  • the solvent is injected directly into the cell, through one of the inlet branches of the reactor cell.
  • the alcohol is preferably used so that its final concentration is between 40 and 95% by mass and preferably 80%.
  • the conditions in the reactor are adjusted so as to obtain a precipitate of undenatured proteins.
  • the contact times and the cooling temperature are preferably chosen so that the internal temperature of the mixture remains low, so that the enzymes are not denatured.
  • use will be made, for example, of temperatures in the reactor of between -15 ° C. and + 18 ° C. and preferably around 0 ° C.
  • the protein precipitate is preferably in contact with the solvent, after passing through the reactor, between 0 to 30 minutes, and preferably 30 seconds.
  • the optimal conditions for the isolation of the various enzymes are preferably a final temperature of 0 ° C. in the T-shaped reactor, a final ethanol concentration of 80% and a contact time of the precipitate with the solvent of approximately 30 seconds.
  • the precipitate suspension is continuously discharged through the outlet, which preferably forms an angle of 90 ° relative to the inlets of the enzyme solution and the solvent.
  • the particle size of the suspension can vary between 1 and 2 microns.
  • the precipitate suspension can undergo a maturation step. This step increases the particle size of the suspension.
  • the conditions of duration and speed of mixing are preferably adjusted to obtain particles or aggregates of sufficient size.
  • the precipitate suspension can either be mixed at a temperature close to 4 ° C in a stirred tank fitted with a vertical propeller at a speed of 100 to 400 rpm (Reynolds number (Re) from 1175 to 4700) for 10 to 60 seconds, for example, and preferably at 300 rpm (about 3500 Re) for 20 seconds, or passed through static mixers at 4 ° C for 30 seconds, for example.
  • the precipitate obtained after maturation comprises aggregates whose size can reach 500 microns on average. The precipitate is then continuously separated.
  • Continuous separation of the protein precipitate is preferably obtained by simple centrifugation.
  • the pellet is recovered and then stored.
  • the supernatant can be either removed or treated in a distillation column and the ethanol thus recovered recycled in the process.
  • the enzymatic extract thus obtained can then be directly frozen without the addition of water or freeze-dried, for example.
  • the reactor is preferably a T-shaped cell in plexiglass, without a mixer, for example.
  • the shape of the reactor is such that there are as few dead zones as possible: the inlet flows are preferably at the foot of the mixing volume with an identical diameter of the inlet tubes and preferably around 1, 5 mm in diameter and the outlet flow, perpendicular to the other two, lying upwards.
  • the diameter of the outlet tube is preferably 1/3 larger than that of the inlet streams. It can be 2 mm, for example, when the inlet tubes are for example 1.5 mm.
  • diameters can vary according to the flow rates to be passed through the reactor, but they must preferably be chosen in order to guarantee a speed of the flow of the source of enzymes at the time of contact of approximately 5 to 20 cm / s, for example and preferably about 11 cm / s, in order to allow good mixing while avoiding possible denaturation of the enzymes.
  • This device makes it possible for example to process up to 14 tonnes of tomatoes per day with dimensions of the branches of the reactor of the order of 4 cm for the inlets and about 5.2 cm for the outlet.
  • Another subject of the invention relates to the use of the endogenous enzymes or proteins isolated according to the invention for the preparation of cosmetic or food products.
  • Said enzymes can thus be used to regenerate their aroma or taste in preparations such as soups, food for children, vegetable juices or purees or cold meats.
  • the process is particularly effective for extracting the "active ingredients” from tomatoes, carrots, onions, for example. If, for example, tomatoes are chosen as plant material, the enzymes continuously extracted by the process according to the invention can be used in tomato juice, tomato puree, all frozen and fresh tomato-based products such as than pizza, lasagna, for example.
  • tomatoes are washed and then transformed into juice.
  • the juice is then treated by a first so-called extraction step so as to dissolve the maximum quantity of enzymes before the isolation step proper in the specific reactor.
  • the plant material is homogenized and then the pH of the homogenate is brought to 7.0 by addition of a sodium hydroxide solution.
  • NaCl is added so that the final salt concentration is 0.5 M.
  • the insoluble parts are then removed by centrifugation.
  • the supernatant thus obtained can be frozen or directly treated in the reactor so as to isolate the active proteins therefrom.
  • the solution containing the enzymes to be isolated is then introduced via one of the inlet branches of the T-reactor. Ethanol is injected directly into the cell, through the other input branch of the reactor cell.
  • the final ethanol concentration is 80%.
  • the precipitate of non-denatured proteins obtained is continuously discharged through the branch of the T, placed at 90 ° relative to the inlet branches.
  • the temperature of the mixture is approximately 0 ° C.
  • the precipitate suspension is then vigorously mixed with a vertical turbine for a few 20 seconds (contact time).
  • the precipitate is then continuously separated by centrifugation.
  • the pellet is recovered and then stored.
  • the supernatant can be either removed or treated in a distillation column and the ethanol thus recovered recycled in the process.
  • the enzyme extract is either directly frozen (without adding water) or freeze-dried.
  • the enzymes thus isolated by the process according to the invention have a very higher activity yield than that which could be obtained by traditional batch processes for example. This easy to implement process is therefore particularly effective for the isolation of active proteins continuously.
  • Table 1, below gives the yields of recovered activities (in%) for pectin methylesterase (PME), peroxidase (POX), alcohol dehydrogenase (ADH) and acid phosphatase (AP).
  • the carrots are prepared as described in Example 1.
  • the conditions for continuous precipitation are 80% ethanol and a final temperature of 0 ° C.
  • the onions are also prepared as in Example 1.
  • the conditions for continuous precipitation are 80% ethanol and a final temperature of 0 ° C.
  • CSL cysteine sulfoxide lyase
  • POX peroxidase
  • a batch reactor (discontinuous) and a vertical propeller are used. Ethanol at 94% w / w is added to the tomato extract (80 g, at 4 ° C.) initially present in the reactor, to the desired concentration and then the mixture is continued to stir.
  • pectin methylesterase for example, is then measured. For a final concentration of 77%, this value varies from 0 to 20% depending on the temperature of the mixture. In addition, this enzyme is irreversibly denatured if it remains in contact with ethanol for too long. It should also be noted that no activity is measurable in the supernatant.
  • the tomato extract is mixed with a PEG 8000 33.3% solution in a batch reactor, cooled to 4 ° C. A slight precipitation appears from a final PEG concentration of 12.35%.
  • the solution is then centrifuged at 4 ° C for 10 minutes at 2000g.
  • the pellet is recovered and dissolved in water (as for ethanol precipitation) before measuring the enzymatic activities present after precipitation.
  • Table 4 Yields of activity recovered for different enzymes present in the tomato by batch batch processes with PEG 8000.
  • Table 5 Optimal conditions for the extraction of different tomato enzymes and proteins.
  • Table 6 Optimal precipitation conditions for some enzymes. The general optimal conditions: 80% ethanol, 0 ° C, without stirring and a contact time of the precipitate with the solvent of approximately 30 seconds (with high stirring).
  • the precipitate suspension obtained at the outlet of the reactor is subjected to stirring at a temperature of 4 ° C. in a stirred tank fitted with a vertical turbine.
  • the particle size is measured for mixing speeds of between 100 and 400 rpm (Re of
  • Table 7 Median particle size of the precipitate (in ⁇ m) as a function of the speed and the mixing time during the maturation step.
  • the time and speed of agitation have a significant effect on the median size of the particles of the precipitate and their aggregation.
  • the optimal conditions are a speed of 300 rpm for about 20 s.
  • Example 8 comparison of the yields for the T-shaped reactor and a CSTR.
  • Table 8 Yields of enzymatic and mass activity for the T-reactor according to the invention and a CSTR.
  • the treated and untreated samples are incubated for one hour at 37 ° C.
  • the different samples are then tested by a panel, as follows:
  • the amount of enzymes added is given in%. For example, if 100 g of tomato paste (which initially corresponds to 600 g of fresh tomatoes) is treated with 10% of enzymes, this means that the quantity of enzymes recovered after precipitation of 60 g of fresh tomatoes was added to the product.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Fruits And Vegetables (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Seasonings (AREA)

Abstract

Procédé d'isolation de protéines actives de materiel végétal ou de milieu de fermentation dans lequel on fait précipiter en continu et en une seule étape dans un solvant organique approprié les protéines actives contenues dans une solution enzymatique extraite dudit matériel végétal ou du milieu de fermentation, dans un réacteur spécifique, les conditions dans le réacteur étant réglées de manière à obtenir un précipité de protéines non dénaturées, ledit précipité est ensuite passé par une étape de maturation avant d'être séparé en continu.

Description

Procédé d'isolation en continu de protéines actives
La présente invention a pour objet un nouveau procédé d'isolation en continu de protéines actives et en particulier d'enzymes de plantes ou de milieux de fermentation ainsi que le dispositif d'extraction.
Etat de la technique
Les enzymes jouent un rôle important dans la biogénèse des arômes des aliments frais. Les processus de synthèse qu'elles catalysent confèrent à la nourriture son goût et son odeur caractéristique. Malheureusement, au cours du conditionnement des aliments, ces composés sont souvent perdus ou dégradés thermiquement, et les enzymes qui les synthétisent sont inactivées.
Dans l'industrie, les produits frais perdent leur saveur et leur odeur. Ceci est principalement dû aux traitements infligés pour arriver à un produit stable et hygiéniquement irréprochable. Les molécules responsables des odeurs, très volatiles, disparaissent en premier, celles responsables du goût frais, sont détériorées, et les enzymes sont inactivées. L'aliment se conserve alors plus facilement mais manque de goût véritable.
Pour résoudre ce problème, on introduit des exhausteurs de saveur produits synthétiquement. Ce moyen peu "naturel" a tendance à faire rechercher de nouveaux moyens de restituer leur goût à ces produits. C'est le cas en particulier des produits à base de végétaux tels que les fruits et les légumes.
Une méthode, proposée par Hewitt et al. (US 2,924,521), consiste dans l'extraction des enzymes à partir du matériel végétal frais, puis la régénération de l'arôme naturel des produits alimentaires en réintroduisant les enzymes correspondantes en fin de procédé. Les enzymes du végétal sont extraites et précipitées plusieurs fois à l'acétone froid. Un tel procédé d'extraction intermittent (en batch) est lent, les conditions sont donc peu reproductibles, ce qui entraîne une productivité basse. L'isolation efficace des enzymes endogènes est une étape clé dans le processus de restitution du goût. De nombreux documents décrivent de tels procédés d'extraction ou d'isolation d'enzymes endogènes de végétaux.
Par exemple, le brevet US 4728613 décrit un procédé d'enrichissement de l'enzyme présent dans une des 2 phases d'un mélange insoluble huile-eau. L'enzyme doit encore être isolée, ce qui n'est pas décrit dans ce brevet. Ce procédé nécessitant plusieurs étapes est donc lent et fastidieux. De plus il n'autorise qu'un faible rendement incompatible avec une utilisation industrielle puisqu'il fait perdre à chaque étape une partie de l'activité de l'enzyme.
D'une part, de tels procédés ne permettent pas une isolation en continu des enzymes du végétal, et d'autre part, le rendement et l'activité des enzymes obtenus sont généralement très faibles.
La présente invention vise à remédier à ces problèmes.
Résumé de l'invention
A cet effet, dans le procédé d'isolation de protéines "actives" de matériel végétal ou de milieu de fermentation selon la présente invention, on fait précipiter en continu et en une seule étape, dans un solvant organique approprié les protéines actives contenues dans une solution enzymatique extraite dudit matériel végétal ou du milieu de fermentation, dans un réacteur spécifique lesdites protéines contenues dans une solution à base de jus de matériel végétal, les conditions dans le réacteur étant réglées de manière à obtenir un précipité de protéines non dénaturées, ledit précipité est ensuite séparé en continu.
Les temps de contact, la vitesse d'agitation, la température et la quantité de solvant conditionnent la qualité et la quantité de précipité protéique. Ces paramètres sont donc réglés de manière à obtenir un précipité de protéines non dénaturées. Ainsi, dans le cas des enzymes on obtient des molécules "actives".
Une étape de maturation du précipité protéique peut être appliquée après la précipitation dans le réacteur, de manière à augmenter la taille de ses particules constitutives. Elle peut être obtenue par mélange avec une turbine verticale dans un réacteur en continu ou grâce à un mélangeur statique, par exemple.
Le procédé selon l'invention permet d'obtenir un extrait protéique, en particulier des enzymes, non dénaturé et donc actif. Par un tel procédé, le rendement de l'extraction ainsi que l'activité des enzymes sont très supérieurs à ce qui peut être obtenu par des procédés classiques ou des procédés en discontinu.
Un autre objet de l'invention est un réacteur qui permet l'isolation en continu de nombreuses protéines actives. Il permet par exemple d'extraire plus d'activité de pectine méthylestérase (PME), de peroxidase (POX) et une quantité de protéines plus importante (cf Table 1). Il est constitué d'une cellule en angle et de préférence en forme de T. Les conditions de réaction sont facilement réglables et permettent d'optimiser le procédé à chaque type de protéine.
Ce réacteur présente également l'avantage d'avoir une géométrie simple par rapport à d'autres réacteurs, ce qui le rend très facile à manipuler et à nettoyer.
L'invention concerne enfin l'extrait protéique non dénaturé ainsi obtenu et son utilisation pour régénérer les arômes et goûts de divers produits alimentaires tels que les soupes et autres aliments à base de légumes, les aliments pour enfants, par exemple.
Ce procédé peut également être applicable dans le domaine de la biotechnologie pour le "downstream processing", c'est-à-dire la séparation d'une enzyme produite par des micro-organismes dans un bio-fermenteur, par exemple.
Description détaillée de l'invention
On entend par "arôme ou goût frais", l'arôme et le goût de la tomate fraîche, c'est à dire les notes vertes, acides et légères que l'on ne retrouve pas dans le jus de tomate industriel, par exemple.
Le terme protéines "actives" désigne les enzymes présentes dans la tomate et en partie responsables du goût et de l'odeur que l'on sait non dénaturées. Ces protéines actives sont par exemple les enzymes telles que la peroxidase (POX), la phosphatase acide (PA), la pectine méthylestérase (PME) ou l'alcool déhydrogénase (ADH).
Pour mettre en oeuvre le présent procédé, on peut utiliser comme matière végétale des fruits et/ou des légumes, c'est-à-dire tout végétal comestible, qu'il s'agisse d'une graine, racine, tubercule, tige, feuille, fleur ou fruit, par exemple. On utilise cependant de préférence des végétaux pour lesquels on désire renforcer le goût frais naturel. On évitera donc particulièrement les végétaux dont le goût naturel peut être désagréable ou dont le goût cuit est recherché, notamment l'asperge, le petit pois, le soja, la pomme de terre, les céréales, la baie d'argousier, les nèfles, par exemple.
Parmi les végétaux préférés, on peut plus particulièrement distinguer les feuilles, notamment le poireau, le fenouil et le chou, les tiges, notamment la rhubarbe et le brocoli, certaines racines, notamment la carotte, l'oignon, le radis, le céleri et la betterave, les tubercules, notamment le manioc, et les fruits notamment la tomate, la courgette, l'aubergine, la banane, la pomme, l'abricot, le melon, la pastèque, la poire, la prune, la pêche, la cerise, le kiwi et la mirabelle, par exemple.
On peut aussi utiliser comme végétaux des champignons supérieurs comestibles qui peuvent être considérés comme compris dans les végétaux, notamment Agaricus bisporus, Pleurotus ostreatus, Boletus edulis ou Lentinus edodes, par exemple.
On peut également utiliser avantageusement les "déchets" industriels de végétaux tels que les pelures, les feuilles et les branches, par exemple.
Le matériel végétal est préparé sous forme de jus puis traité de manière à ce que la solution contienne le plus d'enzymes possible. Cette étape d'extraction initiale consiste à solubiliser la quantité maximale d'enzymes avant l'étape d'isolation proprement dite dans un réacteur spécifique. Pour cela, on peut homogénéiser le matériel végétal puis amener le pH de l'homogénat à 5-8.5, et de préférence 7.0. On peut alors ajouter du sel, par exemple du chlorure de sodium. La concentration totale de sel peut être comprise entre 0.25-1 M et de préférence
0.5 M. On peut éliminer ensuite les parties insolubles par centrifugation, par exemple. Les conditions optimales pour chaque enzyme sont présentées dans la Table 2. Le surnageant ainsi obtenu peut être congelé ou directement traité dans le réacteur de manière à en isoler les protéines actives. Le rendement d'extraction des enzymes peut être compris entre 50 et 100% pour la tomate, par exemple.
La solution contenant les enzymes à isoler est ainsi introduite en continu dans un réacteur constitué d'une cellule, de deux branches "entrée" (solution enzymatique et solvant) et d'une branche de "sortie" (pour l'isolât d'enzymes sous forme de précipité), cette dernière formant de préférence un angle de 90° par rapport aux entrées, soit une cellule en forme de T. D'autres angles peuvent être utilisés.
Le mélange de la solution contenant les enzymes à isoler avec le solvant organique s'effectue ensuite dans le réacteur.
Le solvant est de préférence choisi parmi les alcools, et en particulier l'éthanol, ou tout autre solvant organique dérivé. Le solvant est directement injecté dans la cellule, par une des branches d'entrée de la cellule du réacteur. L'alcool est de préférence utilisé de manière à ce que sa concentration finale soit comprise entre 40 et 95% en masse et de préférence 80%.
Les conditions dans le réacteur sont réglées de manière à obtenir un précipité de protéines non dénaturées. Les temps de contact et la température de refroidissement sont de préférence choisis de manière à ce que la température interne du mélange reste basse, de sorte que les enzymes ne soient pas dénaturées. A cet effet, on utilisera par exemple des températures dans le réacteur comprises entre -15°C et +18°C et de préférence environ 0°C. Le précipité protéique est de préférence en contact avec le solvant, après le passage dans le réacteur, entre 0 à 30 minutes, et de préférence 30 secondes.
Les conditions optimales pour l'isolation des diverses enzymes sont de préférence une température finale de 0°C dans le réacteur en forme de T, une concentration finale d'éthanol de 80% et un temps de contact du précipité avec le solvant d'environ 30 secondes. La suspension de précipité est évacuée en continu par la sortie qui forme de préférence un angle de 90° par rapport aux entrées de la solution enzymatique et du solvant. La taille des particules de la suspension peut varier entre 1 et 2 microns. Afin de compléter l'isolation après la précipitation dans le réacteur, la suspension de précipité peut subir une étape de maturation. Cette étape permet d'augmenter la taille des particules de la suspension. A cet effet, on peut utiliser un réacteur type cuve agitée en continu ou un mélangeur statique. Les conditions de de durée et de vitesse de mélange sont de préférence réglées pour obtenir des particules ou aggrégats de taille suffisante. Ainsi, la suspension de précipité peut soit être mélangée à une température proche de 4°C dans une cuve agitée munie d'une hélice verticale à une vitesse de 100 à 400 tr/min (nombre de Reynolds (Re) de 1175 à 4700) pendant 10 à 60 secondes, par exemple, et de préférence à 300 tr/min (environ 3500 Re) pendant 20 secondes, soit passée à travers des mélangeurs statiques à 4°C pendant 30 secondes, par exemple. Le précipité obtenu après maturation comprend des aggrégats dont la taille peut atteindre 500 microns en moyenne. Le précipité est ensuite séparé en continu.
La séparation en continu du précipité protéique est de préférence obtenue par simple centrifugation. Le culot est récupéré puis conservé. Le surnageant peut être soit éliminé, soit traité dans une colonne de distillation et l'éthanol ainsi récupéré recyclé dans le procédé.
L'extrait enzymatique ainsi obtenu peut être alors directement congelé sans adjonction d'eau ou lyophilisé, par exemple.
On peut conserver entre 25 et 100 % de l'activité des enzymes, ces valeurs dépendent de la fragilité de l'enzyme (Tables 1 à 3). Pour la tomate, par exemple, on peut récupérer de 25 à 50 % de l'activité de la PME, de 80 à 100 % de l'activité de la POX, 70 à 100 % de l'activité de l'ADH, 80 à 100 % de l'AP. De plus, le rendement d'isolation des protéines peut être compris entre 50 et 95%.
Le procédé selon l'invention permet aussi d'obtenir un rendement d'isolation des enzymes supérieur à ce qui est habituellement obtenu par des procédés classiques ou des procédés en discontinu (batch). (Table 4). Selon un autre objet de l'invention, le réacteur est de préférence une cellule en forme de T en plexiglas, sans mélangeur, par exemple. La forme du réacteur est telle qu'il y ait le moins de zones mortes possible : les flux d'entrée se trouvent de préférence au pied du volume de mélange avec un diamètre des tubes d'entrée identiques et de préférence d'environ 1,5 mm de diamètre et le flux de sortie, perpendiculaire aux deux autres, se trouvant vers le haut. Le diamètre du tube de sortie est de préférence 1/3 plus grand que ceux des flux d'entrée. Il peut être de 2 mm, par exemple, lorsque les tubes d'entrée sont par exemple de 1,5 mm. Ces diamètres peuvent varier selon les débits à faire passer dans le réacteur, mais ils doivent de préférence être choisis afin de garantir une vitesse du flux de la source d'enzymes au moment du contact d'environ 5 à 20 cm/s, par exemple et de préférence environ 11 cm/s, afin de permettre un bon mélange tout en évitant une possible dénaturation des enzymes.
Ce dispositif permet par exemple de traiter jusqu'à 14 tonnes de tomates par jour avec des dimensions des branches du réacteur de l'ordre de 4 cm pour les entrées et environ 5,2 cm pour la sortie.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation des enzymes ou des protéines endogènes isolées selon l'invention pour la préparation de produits cosmétiques ou alimentaires.
On peut ainsi utiliser lesdites enzymes, pour régénérer leur arôme ou leur goût à des préparations telles que soupes, aliments pour enfants, jus ou purées de légumes ou charcuteries. Le procédé se révèle particulièrement efficace pour l'extraction des "actifs" de tomates, carottes, oignons, par exemple. Si l'on choisit par exemple la tomate comme matériel végétal, les enzymes extraites en continu par le procédé selon l'invention peuvent être utilisées dans les jus de tomates, la purée de tomate, tous les produits surgelés et frais à base de tomates tels que les pizza, les lasagnes, par exemple.
Ce procédé peut également être applicable dans le domaine de la biotechnologie pour le "downstream processing", c'est-à-dire la séparation d'une enzyme produite par des micro-organismes dans un bio-fermenteur, par exemple. La présente invention est décrite plus en détail ci-après à l'aide des exemples qui vont suivrent. Ces exemples sont donnés à titre d'illustration de l'objet de l'invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation. Les pourcentages y sont donnés en poids sauf indication contraire.
Exemple 1: isolation des enzymes de la tomate
Pour cela, des tomates sont lavées puis transformées en jus. Le jus est ensuite traité par une première étape dite d'extraction de manière à solubiliser la quantité maximale d'enzymes avant l'étape d'isolation proprement dite dans le réacteur spécifique. Ainsi, on homogénéise le matériel végétal puis on amène le pH de l'homogénat à 7.0 par addition d'une solution de soude. Puis on ajoute du NaCl de manière à ce que la concentration finale en sel soit de 0.5 M. On élimine ensuite les parties insolubles par centrifugation. Le surnageant ainsi obtenu peut être congelé ou directement traité dans le réacteur de manière à en isoler les protéines actives.
On introduit ensuite par une des branches d'entrée du réacteur en T, la solution contenant les enzymes à isoler. L'éthanol est directement injecté dans la cellule, par l'autre branche d'entrée de la cellule du réacteur. La concentration finale en éthanol est de 80%.
Le précipité de protéines non dénaturées obtenu est évacué en continu par la branche du T, placée à 90° par rapport aux branches d'entrée. La température du mélange est d'environ 0°C. La suspension de précipité est alors mélangée vigoureusement avec une turbine verticale pendant quelques 20 secondes (temps de contact). Le précipité est ensuite séparé en continu par centrifugation. Le culot est récupéré puis conservé. Le surnageant peut être soit éliminé, soit traité dans une colonne de distillation et l'éthanol ainsi récupéré recyclé dans le procédé.
L'extrait enzymatique est soit directement congelé (sans adjonction d'eau), soit lyophilisé.
Les enzymes ainsi isolées par le procédé selon l'invention ont un rendement d'activité très supérieur à celui qui pourrait être obtenu par des procédés traditionnels en batch par exemple. Ce procédé facile à mettre en oeuvre est donc particulièrement efficace pour l'isolation de protéines actives en continu. La Table 1, ci-dessous donne les rendements d'activités recouvrées (en %) pour la pectine méthylestérase (PME), la peroxydase (POX), l'alcool déshydrogénase (ADH) et la phosphatase acide (AP).
Table 1. Rendements d'activité recouvrée pour différentes enzymes présentes dans la tomate.
Exemple 2 : isolation des enzymes de la carotte
Les carottes sont préparées tel que décrit dans l'exemple 1. Les conditions de précipitation en continu sont de 80% d'éthanol et une température finale de 0°C.
La Table 2, ci-dessous donne les rendements d'activités recouvrées pour l'alcool déshydrogénase (ADH) et la phosphatase acide (AP).
Table 2. Rendements d'activité recouvrée pour différentes enzymes présentes dans la carotte.
Exemple 3: isolation des enzymes de l'oignon
Les oignons sont aussi préparés comme dans l'exemple 1. Les conditions de précipitation en continu sont de 80% d'éthanol et une température finale de 0°C.
La Table 3, ci-dessous donne par exemple les rendements d'activité recouvrée pour la cystéine sulfoxide lyase (CSL) et pour la peroxydase (POX).
Table 3. Rendements d'activité recouvrée pour différentes enzymes présentes dans l'oignon.
Exemple 4: Autres procédés d'isolation d'enzymes en discontinu
a) procédé de précipitation en batch avec l'éthanol
On utilise un réacteur en batch (discontinu) et une hélice verticale. De l'éthanol à 94% w/w est ajouté à l'extrait de tomate (80 g, à 4°C) initialement présent dans le réacteur, jusqu'à la concentration voulue puis on continue d'agiter le mélange.
On mesure ensuite le recouvrement d'activité de la pectine méthylestérase, par exemple. Pour une concentration finale de 77%, cette valeur varie de 0 à 20% selon la température du mélange. De plus cette enzyme est dénaturée de manière irréversible si elle reste trop longtemps en contact avec l'éthanol. Il faut également noter qu'aucune activité n'est mesurable dans le surnageant.
b) procédé de précipitation avec du polyéthylène glycol (PEG)
L'extrait de tomate est mélangé avec une solution PEG 8000 33.3% dans un réacteur batch, refroidi à 4°C. Une légère précipitation apparaît à partir d'une concentration finale en PEG de 12.35%.
La solution est alors centrifugée à 4°C pendant 10 minutes à 2000g. Le culot est récupéré et dissout dans de l'eau (comme pour les précipitations à l'éthanol) avant de mesurer les activités enzymatiques présentes après précipitation.
Les résultats sont donnés Table 4, ci-dessous.
Table 4: Rendements d'activité recouvrée pour différentes enzymes présentes dans la tomate par des procédés discontinus en batch avec du PEG 8000.
Les rendements d'activité enzymatique sont beaucoup plus faibles par de tels procédés en discontinu. Dans le cas du procédé de précipitation au PEG, la solution finale est visqueuse et difficilement centrifugeable et manipulable (pompage). Du reste, à partir de 25% en PEG, aucun culot ne peut être obtenu après centrifugation.
Exemple 5: optimisation des conditions d'extraction initiale des enzymes
De manière à optimiser l'extraction initiale de différentes enzymes à partir d'un jus de tomate, nous avons mesuré l'activité recouvrée desdites enzymes pour des valeurs de pH de 4.2 (pH naturel) à 8.5 et pour des concentrations croissantes en NaCl (de 0 à 6%).
Pour cela, 4,5 kg de tomates sont lavées puis transformées en jus. Le jus est réparti en 4 fractions de 1,1 kg, de pH initial de 4.2 (celui de la tomate). On ajuste le pH des fractions 2, 3 et 4 respectivement à 5.5, 7 et 8,5 par addition de 10, 14 et 18 g d'une solution de soude à 20%. Chaque fraction est alors répartie dans des récipients contenant des quantités croissantes de NaCl : 0, 2.25, 4.5, 6.75 et 9 g, ce qui correspond à des concentrations massiques de: 0, 1.48, 2.91, 4.31, 5.66 %.
Après une incubation de 45 minutes à 4°C sous agitation, les différentes solutions enzymatiques sont centrifugées à 2000 g pendant 10 minutes. Les surnageants sont récupérés puis on détermine pour chaque solution la quantité d'azote de provenance des protéines et les activités des enzymes suivantes : peroxydase, phosphatase acide, lipoxygénase, alcool déshydrogénase, pectine méthylestérase et polygalacturonase.
Les résultats sont présentés ci-dessous, Table 5. Ils donnent les conditions optimales d'extraction de chaque type d'enzyme. Les conditions qui donnent les résultats globaux les plus satisfaisants pour l'extraction sont: un pH de 7 et une concentration en sel de 3%.
Table 5: Conditions optimales pour l'extraction de différentes enzymes et protéines de tomate.
Exemple 6: optimisation des conditions d'isolation de différentes enzymes
Afin d'optimiser le procédé d'isolation, les différents paramètres de précipitation (concentration finale en éthanol, température dans le réacteur, agitation ou temps de maturation du précipité) ont été variés et les recouvrements d'activité des enzymes mesurés après précipitation. Les conditions optimales de précipitation pour chaque enzyme sont décrites dans le tableau ci-dessous.
Table 6: Conditions optimales de précipitation de quelques enzymes. Les conditions optimales générales: 80% éthanol, 0°C, sans agitation et un temps de contact du précipité avec le solvant d'environ 30 secondes (sous haute agitation).
Exemple 7: optimisation des conditions de maturation du précipité
Afin d'optimiser le procédé d'isolation, on soumet la suspension de précipité obtenue à la sortie du réacteur à une agitation à une température de 4°C dans une cuve agitée munie d'une turbine verticale. On mesure la taille des particules pour des vitesses de mélange comprises entre 100 et 400 tr/min (Re de
1175 à 4700).
Table 7: Taille médiane des particules du précipité (en μm) en fonction de la vitesse et du temps de mélange au cours de l'étape de maturation.
Le temps et la vitesse d'agitation ont un effet important sur la taille médiane des particules du précipité et leur aggrégation. Les conditions optimales sont une vitesse de 300 tr/min pendant environ 20 s.
Exemple 8: comparaison des rendements pour le réacteur en forme de T et un CSTR.
Différents essais de précipitation de plusieurs jus de tomates ont été réalisés dans le réacteur en T, sous des conditions optimales, c'est-à-dire 80% d'éthanol et une température finale de 0°C. Ces essais sont comparés au cas d'un CSTR
(continuous stirred-tank reactor) sous les mêmes conditions avec une vitesse de mélange de 180 rpm. Les réultats sont présentés Table 8, ci-dessous.
Table 8: Rendements d'activité enzymatique et massique pour le réacteur en T selon l'invention et un CSTR.
Ces essais comparatifs montrent l'avantage du réacteur en T par rapport au CSTR pour l'isolation de certaines enzymes plus sensibles à l'éthanol et aux conditions de mélange (PME, ...). Le rendement global (azote protéique) est nettement plus élevé dans le cas du réacteur en T, ce qui démontre une meilleure isolation dans ce cas précis.
Exemple 9: Régénération de l'arôme et du goût
Des évaluations sensorielles de produits à base de tomates traités par des enzymes endogènes isolées ont été réalisées. Pour cela, les enzymes isolées obtenues par le procédé tel que décrit dans l'exemple 1, sont solubilisées dans de l'eau avec 0,1 M NaCl, puis mélangées à différentes concentrations avec 2 substrats : tomate en pâte diluée et jus de tomate.
Les échantillons traités et non traités sont incubés une heure à 37°C. Les différents échantillons sont alors testés par un panel, comme suit:
- description du goût et de l'arôme de plusieurs échantillons et préférence des testeurs.
- pour les tests triangulaires, 3 échantillons sont préparés dont 2 identiques. Les testeurs doivent déterminer l'échantillon qui leur apparaît différent.
Dans les commentaires ci-dessous, la quantité d'enzymes ajoutée est donnée en %. Par exemple, si 100 g de pâte de tomate (ce qui correspond initialement à 600 g de tomates fraîches) sont traités avec 10% d'enzymes, cela signifie que la quantité d'enzymes recouvrée après précipitation de 60 g de tomates fraîches a été ajoutée au produit. Nous avons fait les observations suivantes:
- si moins de 10% d'enzymes est utilisé, aucune différence entre les échantillons traités et non traités est notable. - une addition de 10 à 30% entraîne un agréable goût qui correspond à la tomate fraîche (légère acidité avec des notes légères)
- pour le test triangulaire avec 20% d'enzymes, 100% de reconnaissance par le panel.
- pour des quantités supérieures à 40%, le panel a trouvé que les échantillons ainsi traités ont des notes trop acides et vertes.
Ces résultats indiquent et confirment le potentiel du précipité enzymatique obtenu selon la présente invention, pour la régénération du goût et de l'arôme dans différents produits alimentaires. Plusieurs des enzymes nécessaires au développement du goût et de l'arôme dans la tomate sont donc présentes et actives dans cet extrait.

Claims

Revendications
1. Procédé d'isolation de protéines actives de matériel végétal ou de milieu de fermentation, dans lequel on fait précipiter dans un solvant organique approprié, en continu et en une seule étape dans un réacteur spécifique, les protéines actives contenues dans une solution enzymatique extraite dudit matériel végétal ou du milieu de fermentation, les conditions dans le réacteur étant réglées de manière à obtenir un précipité de protéines non dénaturées, ledit précipité est ensuite séparé en continu.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le matériel végétal est choisi seul ou en combinaison dans le groupe des végétaux comestibles formé par les fruits et les légumes constitués des graines, racines, tubercules, tiges, feuilles ou fleurs.
3. Procédé selon les revendications 1 et 2, dans lequel les protéines actives sont des enzymes, et en particulier la peroxidase (POX), la pectine méthylestérase (PME), la polygalacturonase (PG), l'alcool déshydrogénase (ADH) ou la phosphatase acide (AP).
4. Procédé selon les revendications 1 à 3, dans lequel la solution enzymatique est obtenue en préparant un jus homogène à partir du matériel végétal ou du milieu de fermentation, ledit jus est ajusté à un pH compris entre 5 et 8,5, de préférence 7 et additionné de sel, entre 1,5 et 6%, de préférence 3%.
5. Procédé selon les revendications 1 à 4, dans lequel le précipité subit une étape de maturation avant d'être séparé en continu.
6. Procédé selon la revendication 5, dans lequel l'étape de maturation consiste à mélanger le précipité à une vitesse et pour un temps suffisant pour augmenter la taille de ses particules constitutives.
7. Procédé selon la revendication 6, dans lequel l'étape on mélange le précipité durant 10 à 60 s, à 100-400 tr/min, à une température de 4°C dans une cuve agitée, ou environ 30 s à 4°C dans un mélangeur statique.
8. Procédé selon les revendications 1 à 7, dans lequel le solvant organique est un alcool, et en particulier l'éthanol, ou tout autre solvant organique dérivé.
9. Procédé selon les revendications 1 à 8 dans lequel les conditions dans le réacteur sont une température finale comprise entre -14 et +18°C, de préférence 0°C et une concentration finale en solvant d'environ 80%.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9 dans lequel le précipité protéique est en contact avec le solvant, après le passage dans réacteur, entre 0 à 30 minutes, et de préférence 30 secondes.
11. Procédé selon les revendications 1 à 10 dans lequel le rendement d'isolation des protéines est compris entre 50 et 95%.
12. Extrait enzymatique obtenu par une isolation en continu selon les revendications 1 à 11, dans lequel les enzymes ont des activités recouvrées comprises entre 25 et 100%, et en particulier de 25 à 50% pour la PME, de 80 à 100% pour la POX, de 70 à 100% pour l'ADH et de 80 à 100% pour l'AP à partir de la tomate.
13. Dispositif d'isolation en continu de protéines actives constitué d'une cellule thermoréglable, ladite cellule ayant 2 branches "d'entrée", l'une destinée à une solution contenant les protéines actives à isoler, l'autre pour un solvant organique, et une branche de sortie pour le précipité protéique obtenu, les branches d'entrée formant un angle défini par rapport à la branche de sortie.
14. Dispositif selon la revendication 13 dans lequel la branche de sortie forme un angle de 90° par rapport aux branches "d'entrée".
15. Utilisation de l'extrait selon la revendication 12 pour la régénération du goût et de l'arôme de produits alimentaires à base de légumes tels que soupes, aliments pour enfants, plats cuisinés ou charcuterie.
EP99957301A 1998-11-20 1999-11-10 Procede d'isolation en continu de proteines actives Withdrawn EP1131339A1 (fr)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP99957301A EP1131339A1 (fr) 1998-11-20 1999-11-10 Procede d'isolation en continu de proteines actives

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP98203876 1998-11-20
EP98203876 1998-11-20
EP99957301A EP1131339A1 (fr) 1998-11-20 1999-11-10 Procede d'isolation en continu de proteines actives
PCT/EP1999/008699 WO2000031116A1 (fr) 1998-11-20 1999-11-10 Procede d'isolation en continu de proteines actives

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP1131339A1 true EP1131339A1 (fr) 2001-09-12

Family

ID=8234344

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP99957301A Withdrawn EP1131339A1 (fr) 1998-11-20 1999-11-10 Procede d'isolation en continu de proteines actives

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20020018831A1 (fr)
EP (1) EP1131339A1 (fr)
JP (1) JP2002530427A (fr)
CN (1) CN1326463A (fr)
AU (1) AU1505500A (fr)
BR (1) BR9915484A (fr)
CA (1) CA2350215A1 (fr)
WO (1) WO2000031116A1 (fr)
ZA (1) ZA200105015B (fr)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106673995A (zh) * 2015-11-09 2017-05-17 中国石油化工股份有限公司 一种精制长链二羧酸的方法
CN106673996A (zh) * 2015-11-09 2017-05-17 中国石油化工股份有限公司 一种提纯长链二羧酸的方法
CN105707407B (zh) * 2016-03-07 2019-10-25 湖北工业大学 一种印奇果浓缩蛋白的制造方法
CN111254124B (zh) * 2020-04-03 2022-06-24 大连工业大学 一种针叶樱桃渣回收提取sod的方法
CN113017140A (zh) * 2021-03-12 2021-06-25 云南瑞升烟草技术（集团）有限公司 利用新鲜烟草制备内源性总酶的方法及内源性总酶的应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2924521A (en) * 1958-12-12 1960-02-09 Eric J Hewitt Natural flavor of processed foods
DE2444524A1 (de) * 1974-09-18 1976-04-08 Oeser Henning Dr Verfahren und vorrichtung zur ausfaellung von human-blutplasma-bestandteilen

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO0031116A1 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU1505500A (en) 2000-06-13
WO2000031116A1 (fr) 2000-06-02
ZA200105015B (en) 2002-08-21
CN1326463A (zh) 2001-12-12
CA2350215A1 (fr) 2000-06-02
JP2002530427A (ja) 2002-09-17
US20020018831A1 (en) 2002-02-14
BR9915484A (pt) 2001-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2448430B1 (fr) Production d'aromes naturels de truffe a partir de mycelium truffier
FR2716884A1 (fr) Extrait protéique de cucumis melo à activité antioxydante et procédé de préparation, composition cosmétique ou pharmaceutique ou composition alimentaire contenant un tel extrait.
FR2943354A1 (fr) Procede de preparation d'une composition alcoolique a base de the et applications
EP1131339A1 (fr) Procede d'isolation en continu de proteines actives
EP0555466B1 (fr) Procede d'obtention d'arome naturel de vanille par traitement enzymatique des gousses de vanille verte et arome obtenu
US20210069279A1 (en) Antioxidant enriched distilled alcohol product and process therefor
EP0494296B1 (fr) Nouveau complexe genique utile notamment pour la modification des vegetaux tels que cucumis melo et cucumis melo incorporant ce complexe genique
EP0446151B1 (fr) Procédé pour obtenir des jus, des huiles et des tourteaux, directement stables, par pressage de produits biologiques frais
KR100519089B1 (ko) 한외여과에 의한 혼합과채쥬스의 제조방법
Hafizov Obtaining clarified juice from ripe softened persimmon fruits
FR3074998A1 (fr) Procede pour identifier et isoler des composes bioactifs a partir d'extraits d'algues
MXPA01005082A (en) Method for continuously isolating active proteins
Osokina et al. Evaluation of methods of heat treatment of black currant fruits to increase juice production
RU2257824C2 (ru) Способ производства продуктов длительного хранения из растительного сырья
WO2024088564A1 (fr) Fraction hydrosoluble de plantes limpide
RU2264759C2 (ru) Способ производства продуктов длительного хранения из растительного сырья
WO2023170004A1 (fr) Procédé de préparation d'extraits végétaux déshydratés riches en sels
RU2255617C2 (ru) Способ производства продуктов длительного хранения из растительного сырья
KR20020041268A (ko) 무화과 건과를 이용한 술 및 음료 제조방법
RU2259150C2 (ru) Способ производства продуктов длительного хранения из растительного сырья
RU2255620C2 (ru) Способ производства продуктов длительного хранения из растительного сырья
RU2255624C2 (ru) Способ производства продуктов длительного хранения из растительного сырья
EP4082356A1 (fr) Méthode de traitement de rafles à l'état végétal, non-lignifiées, et leur utilisation
KR20140045810A (ko) 매실, 과일 혼합 식초와 개똥쑥을 포함한 기능성 음료 및 이의 제조 방법
RU2255618C2 (ru) Способ производства продуктов длительного хранения из растительного сырья

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20010620

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AT BE CH CY DE DK ES FI FR GB GR IE IT LI LU MC NL PT SE

17Q First examination report despatched

Effective date: 20030707

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20031118