CN1326463A - 连续分离活性蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

从植物材料或发酵培养基中活性蛋白的一种分离方法,其中上述的植物材料或酵培养基中提取的存于酶溶液中的活性蛋白用适合的有机溶剂沉淀,在特定反应器中持续的一步反应,反应器中的条件可以调节以获得非变性蛋白的沉淀,该沉淀要经过熟化步骤后再持续分离。

Description

连续分离活性蛋白的方法

该发明主题是一种新颖的连续分离活性蛋白方法，特别是从植物，发酵培养基和抽提设备中提取的酶。

现有技术

酶在新鲜食物风味的生物合成中起着重要的作用。酶催化的合成方法，赋予了食物味道和它们特征的气味。很可惜，在食物制备中，这些味道和气味化合物常常会丢失或者热降解，并且合成这些化合物的酶失去活性。已在工业生产中，新鲜产品丧失其气味和味道，主要是为了获得稳定的和卫生的食物而进行的处理造成的。与气味相关的易挥发分子最先消失，而与新鲜味道相关的分子受到破坏，这些分子相关的酶也失去活性。这样，食物可以更容易保存，但也缺乏真实的味道。

为了解决这个问题，引入合成产生的味道增加剂。这种近似“自然”的方法是要产生一种新颖方式，恢复食物原有的味道，植物类的例如水果和蔬菜的食物尤其是如此。

有一种方法，由Hewitt等提出(US2，924，521)包括将酶从新鲜植物材料中抽取出来，在加工方法的最后再重新加入相关的酶恢复食物产品的自然味道。提取植物的酶并且用冷丙酮沉淀几次。象这样的间隔(分批)提取方法很慢，而且条件不能全部重复，从而导致低产率。

内源性酶的有效分离在味道恢复方法中是一个关键步骤，有大量的文献描述这种提取或分离内源性植物酶的方法。

例如，专利美国4728613描述了一种方法，可将酶富集在油-水互不相溶混和物两相中的一相中。但该酶仍需分离，在该专利中并未描述。该方法需要多步操作，因而较慢而且繁琐。另外，因为酶活性中的一部分在每步都有丢失，所以它的产量较低，与工业生产不一致。

一方面，这种方法并不能持续分离植物中的酶，另一方面，所获酶的产量和活性总的来说都较低。

该发明的目标是要解决这些难题。

发明概述

为了达到这种效果，依照该发明，在从植物材料或发酵培养基中分离“活性”蛋白的方法中，特定的反应器里，以合适的有机溶剂一步持续沉淀活性蛋白(活性蛋白存在于从上述植物材料和发酵培养基中提取的酶溶液中)，上述的蛋白是以植物材料的汁为基础制成的，反应器中的条件可调节从而可获得非变性的蛋白，然后上述的沉淀再持续分离。

接触时间，搅拌时间、温度和溶剂的量决定了蛋白沉淀的质量和数量。因而，可以调整这些参数，从而获得非变性蛋白的沉淀。因而，若是酶的话，可以获得“活性”分子。

在反应器中沉淀后，进行操作使蛋白沉淀熟化，从而增加组成颗粒的大小。例如，可以通过在持续反应器中用一个垂直涡轮混合或者通过静态混合方法来达到。

依照该发明，该方法能获得非变性从而有活性的蛋白提取物，特别是酶。运用这种方法，提取物的产量和酶的活性都要比那些用传统方法或分批处理方法的高。

该发明的另一个主题是一种反应器，它可以允许持续分离大量蛋白。例如，可提取活性更高的果胶甲基酯酶(pectin methylesterasePME)和过氧化物酶(peroxidase POX)以及更高产量的蛋白(见表1)。反应器是由一个有角度，优选的T-型的反应池构成。反应条件可以很容易调整，可针对每种类型蛋白优化方法。

与其它反应器相比，该反应器还有一个优点，它几何形状简单，易操作和清洗。

该发明最终是与获得的非变性蛋白提取物以及用它来重新恢复各种食物产品，例如汤和其它蔬菜产品、婴儿食物的气味和味道相关的。

该方法也能运用于“下游加工”的生物技术领域，也就是说，例如在生物发酵中分离由微生物产生的酶。发明详述

“新鲜味道或气味”可以这样理解，例如新鲜西红柿的味道和气味，即绿色，酸味和光泽，而工业西红柿汁中是没有的。

术语“活性”蛋白是指存在于西红柿中现在所知的，与气味和味道部分相关的酶，它为非变性形式。这些活性蛋白，例如酶有过氧化物酶(POX)，酸性磷酸酶(AP)，果胶甲基酯酶(PME)或乙醇脱氢酶(ADH)。

在该方法中，可使用的材料有植物材料，水果或蔬菜，也就是说，任何可以食用的植物，举例来说，不论它是种子、根、茎、叶子、花或果实。然而，优选的植物是那些需要增加其天然新鲜味道的，那些天然味道不好或需要它加工后味道的植物特别要避免使用，举例来说尤其是冬笋，豌豆、大豆、马铃薯、谷类食品，sea buckthorn berry和欧楂果。

优选植物中，值得一提地是叶菜，如韭菜，茴香，白菜，茎菜；特别是大黄，花椰菜；根菜，特别是胡萝卜，洋葱，萝卜，芹菜，甜菜，块茎，特别是木薯；果菜，特别是西红柿，小胡瓜，茄子，香蕉，苹果，杏，甜瓜，西瓜，梨，李子，桃子，草莓，猕猴桃，mirabelleplum。

也可用较高等的蘑茹，它也被认为是植物。特别是例如Agaricusbisporus，Pleurotus ostreatus，Boletus edulis或Leutinusedodes。

同样还可以有优势地运用工业植物“废物”，例如，外壳，叶子和树枝。

植物材料需制备成汁液的形式，然后处理，这样可以使溶液中含有的酶尽可能多。这种初提取步骤包含实际分离步骤前特定反应器中，溶解最大量的酶。因而，植物材料要匀浆，并调节匀浆液pH至5-8.5优选为7.0，添加盐，例如氯化钠，总盐浓度在0.25-1m之间，优选为0.5M，不溶部分可以经过离心除去。例如，对于每一种酶的最适条件列于表2。所获上清可以冻存也可以直接在反应器中处理，从而分离出活性蛋白。举例来说，西红柿酶的提取量可在50％至100％之间。

然后，待分离的酶溶液持续注入一个反应器中，该反应器包含一个池，2个“进口”(酶溶液和溶剂)分支和一个“出口”分支(以沉淀形式的酶的分离物)，“出口”分支优选的形式是和进口呈90°，也就是T-型池，其它角度也是可以运用的。

再在反应器中混和有酶的溶液和有机溶剂。

溶剂优选醇类，特别是乙醇，或其它来源的有机溶剂，有机溶剂直接通过反应池的一个进口分支注入池中。乙醇优选运用，其最终浓度在40至95％之间(质量浓度)，优选80％。

可调节反应器的条件，从而获得非变异蛋白的沉淀。优选时间和冷却温度，使混合物内部保持低温，从而酶不会变性。为了达到这种效果，温度要在-15℃至18℃之间，优选为大约0℃，在通过反应器后，蛋白沉淀与溶剂接触时间在0到30分钟，优选为30秒。

分离各种酶的最佳条件为在T型反应器中，终温度为0℃，乙醇最终浓度为80％，沉淀物与溶剂接触的时间为大约30秒。

沉淀物的悬浮液是通过出口，优选与酶溶液和溶剂的进口呈90°角，持续排出。悬浮液颗粒的大小在1到2微米之间。

在反应器中沉淀后，沉淀物悬浮液需先进行熟化步骤。该步骤可以增加悬浮液颗粒的大小。为了达到这种效果，可以运用连续搅拌的箱形反应器或一种静态混合器。持续条件和混合速率可以调整，以获得足够大小的颗粒或聚合物。因而，沉淀物悬浮液可以近于4℃下在垂直螺旋搅拌下，例如速率100到400rpm的箱中混合(雷诺数1175到4700)，10到60秒，优选为300rpm(雷诺数大约3500)20秒或放入静态混合器，4℃下30秒。熟化后的沉淀物组成聚合物，其大小平均达500微米，然后，沉淀物再持续分离。

蛋白沉淀的持续分离可优选用简单的离心获得，沉淀回收然后保存。上清可以去除也可以用一个蒸馏柱处理，因而乙醇可以回收，重新运用于方法中。

因而，举例来说所获的酶提取液可以不添加水直接冻存，也可以冻干。

酶活性可以保留25％到100％，这些值依赖于酶的易失活程度(表1到3)，例如西红柿，可以得到25％到50％活性的PME，80％到100％活性的POX，70％到100％活性的ADH，80％到100％活性的AP，另外，蛋白分离产量也可在50％到95％之间。

依照该发明的方法可以获得比常规方法或分批处理方法更多的酶(表4)。

依照该发明的另一个主题，反应器优选是T-型池(由聚甲基丙烯酸甲醋做成)，没有混和器。例如，这样形状的反应器可以使死体积尽可能地少，进口分支优选在混合容器的底部，两个进口分支直径相同，优选大约1.5毫米，出口分支在容器顶部，与两个进口分支垂直。出口分支直径优选为比进口分支大1/3。例如，如果进口分支直径为1.5毫米的话，则它为2毫米。这些分支的直径可以根据通过反应器的流通量大小而改变，但他们要优选以保证酶液在所定的接触时间中流速大约5到20厘米/秒，例如，优选11厘米/秒。要使充分混合同时避免可能存在的酶变性。

举例来说，反应器进口为4厘米，出口5.2厘米时，该装置可以每天处理14吨西红柿。

该发明的另一个主题是根据本发明的分离的酶或内源性蛋白在化妆用品或食物产品制备中的用途。

因而，可以用上述的酶去恢复产品的气味或味道，例如汤、婴儿食品、蔬菜浓汤或汁，或精制的肉制品。已证明该方法对于从例如西红柿、胡萝卜、洋葱中提取“活性试剂”特别有效。例如，用西红柿为植物材料，依照发明由该方法持续提取的酶可用在西红柿汁，西红柿浓汤，所有西红柿类深冷冻和新鲜产品，例如比萨饼，烤宽面条.

该方法也可以用于“下游加工”的生物技术领域，也就是说，例如可分离在生物发醇方法中由微生物产生的酶。

该发明可在下面例子的帮助中得以具体描述。这些实施例给出是为了阐述该发明的主题但在这并不以任何方式组成权利限制。这里如果没有特殊说明的话，所给出的百分比均质量百分比。实施例1：从西红柿中分离酶

将西红柿洗净，加工成液汁。然后处理液汁即提取的第一步，以在特定反应器中分离之前尽可能地溶解最多的酶。因而，将植物材料匀浆，匀浆液pH调至7.0(加NaOH)，添加NaCl，至终浓度为0.5M，不溶部分通过离心除去。因而，获得的上清可以冻存，也可直接在反应器中处理，从而分离活性蛋白。

待分离的酶溶液通过T型反应器的一个进口加入到反应器中。乙醇通过另外一个进口直接注入池中，乙醇终浓度为80％。

所获得的非变蛋白沉淀物通过与进口呈90°角的分支排去，混合物温度大约0℃，然后由一个垂直涡轮器剧烈混合沉淀物悬浮液大约20秒(接触时间)，然后，离心持续分离沉淀物。离心后沉淀回收，保存。上清可以去除，或者用蒸馏柱处理，回收乙醇。

酶提取液可以直接冰冻(不添加水)或冰冻干燥。

依照该发明方法分离得到的酶，其活性产量要比例如传统分批方法的高。

该方法很容易完成，因而对于持续的活性蛋白分离十分有效。下面的表1给出了果胶甲基酯酶(PME)，过氧化物酶(POX)，乙醇脱氢酶(ADH)，酸性磷酸酶(AP)所获的活性产量(％)。

酶	活性产量
		PME	25-50
POX	80-100
		ADH	70-100
AP	80-100

表1：西红柿中的各种酶回收活性的产量实施例2：从胡萝卜中分离酶

胡萝卜的处理方法见实施例1中的描述，持续沉淀的条件为80％的乙醇和0℃的终温度。

下面表2给出乙醇脱氢酶(ADH)和酸性磷酸酶(AP)回收活性的产量。

酶	活性产量[％]
		ADH	70.7
AP	90.2

表2：胡萝卜中各种酶的回收活性的产量实施例3：从洋葱中分离酶

洋葱的制备同实施例1。持续沉淀的条件为80％的乙醇和终温度为0℃。

下面表3给出的是半胱氨酸亚砜裂解酶(CSL)与过氧化物酶(POX)的回收活性产率。

酶	活性产率[％]
		CSL	73-100
POX	100

表3：洋葱各种酶回收的活性产率实施例4：分批分离酶的其他方法

a)用乙醇分批沉淀方法

运用分批反应器和一个垂直螺旋，94％(质量/质量)乙醇加到已存在于反应器中西红柿提取液中(80克，4℃以下)，至所期望的浓度，然后搅拌混合物。

然后，测定果胶甲基酯酶活性。如果终浓度为77％，依照混合物温度不同，活性0到20％。另外，如果该酶与乙醇接触时间过长，则会不可逆的变性。值得一提的是，上清中测不到活性。

b)用聚乙二醇(polyethylene glycol PEG)沉淀方法

在分批反应器中，西红柿提取液与33.3％PEG 8000溶液混合，冷却至4℃，PEG终浓度为12.35％时，有轻微沉淀出现。

4℃溶液2000g，离心10分钟，回收沉淀。测定酶活性时，重浓于水中(由乙醇沉淀)。

结果见下面表4

酶	用12.35％PEG活性产量[％]	用20％PEG的活性产量
			PME	2.4	16.4
POX	0	2
			ADH	0	0
AP	18.8	72.3

表4：西红柿中PEG8000分批回收各种酶的活性产率。

用分批处理的方法所获酶的活性产量极低。在用PEG沉淀时，终溶液粘性很大，很难离心和处理(过泵)，另外，浓度25％以上的PEG，离心后没有沉淀。实施例5：酶初提取的条件最佳化

为了最佳化西红柿液汁中各种酶的初提取，我们测定了PH由4.2(中性)到8.5，和NaCl浓度增加(从0到6％)时上述酶的回收活性。

清洗4.5公斤的西红柿，加工成液汁，液汁分成1.1公斤的4份，其最初pH为4.2(为西红柿pH)，第2、3、4份pH调为5.5、7和8.5。各组份又分批加入容器中，其中有递增的NaCl：0，2.25，4.5，6.75和9克，对应的质量浓度为0，1.48，2.91，4.31，5.66％。

不断搅拌，4℃温育5分钟后，各种酶溶液2000g离心10分钟，回收上清。然后测定蛋白中的氮量及以下酶活性：过氧化氢酶，酸性磷酶，脂氧合酶，乙醇脱氢酶，果胶甲基脂酶，多聚半乳糖酸醛酶(galacturonase)。

结果见下面表5，他们能对每种酶提供最佳条件，提取的总的最佳条件：PH为7.0，盐浓度为3％。

氮/酶	[Nacl][％]	[PH]
			氮	1.5到6	8.5
过氧化物酶	0到6	4.2
			脂氧合酶	0到6	8.5
乙醇脱氢酶	0到6	7
			果胶甲基脂酶	1.5到6	4.2到8.5
多聚半乳糖醛酸酶	3到6	4.2
			酸性磷酸酶	1.5到6	5.5或7

表5：提取西红柿中各种酶和蛋白的最佳条件实施例6：分离各种酶的最佳条件

为了使分离方法最佳，改变各种沉淀参数(最终乙醇浓度、反应器中的温度、搅拌或沉淀熟化时间)并且沉淀后测定酶活性的回收量。各种酶的最佳沉淀条件列于下表：

酶	[乙醇]f[％]	混和物中终温度Tf	搅拌[rpm]	接触时间
					过氧化物酶	70-80	-13到+18℃	不敏感	不敏感
酸性磷酸酶	＞60	-13到-7℃	不敏感	不敏感
					果胶甲基酯酶	90	-13℃	＜200	敏感
乙醇脱氢酶	＞80	-11到-0℃	＜200	不敏感

表6：一些酶沉淀的最佳条件

总的最佳条件：80％的乙醇，0℃，不搅拌，沉淀与溶剂接触时间大约30秒(并伴随剧烈搅拌)。实施例7：沉淀物熟化条件的最佳化

为了使分离方法最佳化，将反应出口所获沉淀的悬浮液，加到一个有垂直涡轮的搅拌箱中4℃搅拌。混和速率在100到400rpm(雷诺数1175到4700)中测定颗粒的大小。

时间[s]	0	10	20	30	45	60	120	240	360	600
											100rpm	1.4	17.9	63.9	132.9	393.6	410.9	471.9	534.6	561.4	466.7
200rpm	1.4	116.9	296.0	-	567.6	369.5	314.4	253.1	235.5	213.0
											300rpm	1.4	265.2	406.1	405.7	445.8	416.4	384.4	191.3	158.0	150.4
400rpm	1.4	309.3	380.6	443.6	424.1	284.5	159.6	118.5	111.7	111.3

表7：在熟化方法中对于混和速率和时间的沉淀颗粒平均大小值的函数值(微米)

搅拌时间和速率对于沉淀颗粒平均大小值及聚积有很大的影响，最佳条件是300rpm大约20秒。

实施例8：T型反应器和CSTR产量的比较

进行了各种西红柿液汁的沉淀实验，在T型反应器中，最佳条件下，也就是80％的乙醇，0℃的终温度。这些实验与同情况下的CSTR(持续搅拌箱反应器)，180rpm的搅拌速率相比较，结果见下面表8。

回收率[％]	T	CSTR
			POX	98.4	92.4
AP	78.2	81.9
			PME	32.6	29.7
ADE	78.3	86.2
			蛋白质氮	91.8	82.5

表8：依照该发明T形反应器的和CSTR的酶活性和质量产量

这些比较试验表明与CSTR比较，T一型反应器有利于对乙醇和混和条件敏感的酶，例如PME。整个产量(蛋白氮量)在T-型反应器中较高，说明在这里有一个较好的分离。实施例9：气味和味道的恢复

进行已分离内源性酶处理的西红柿类产品的感官测试。由实施例1说明方法所获的酶溶于水中，有0.1M Nacl，并以各种浓度混合2种底物：稀释的西红柿浆和西红柿汁。

处理后和未处理的样品37℃温育一小时。然后由评判小组测试不同样品，如下：

-描述各种样品的味道和气味，并且说明品尝者的喜好。

-三角测试，准备3个样品，其中有2个相同，测试者需要鉴别哪个样品与其它不同。

下面的评论，加入的酶量是以％给出。例如，如果100克的西红柿浆(最初对应600克新鲜西红柿)，用10％的酶处理，也就意味着用60克新鲜西红柿沉淀获得的酶加到产品中，可以获得以下结果：

如果运用低于10％的酶，在处理和未处理样品之间没有可识别的差别。

添加10％到30％的酶，引起令人愉快的味道，与新鲜西红柿一致(微酸，色泽偏亮)。

用20％酶进行三角测试，小组成员100％可识别出来。

用高于40％的酶处理，小组发现处理的样品太酸也太绿。

这些结果表明和证实了依照该发明所获得酶沉淀物对于恢复各种食物产品味道和气味的潜能，西红柿味道和气味发展必需的几种酶在这种提取中存在且有活性。

Claims (15)

1、从植物材料或发酵培养基中分离活性蛋白的方法，其中从上述植物材料或发酵培养基提取酶溶液中的活性蛋白用合适的有机溶剂在特定反应器中持续地一步沉淀，反应器中的条件可调节来获得非变性蛋白沉淀，该沉淀然后继续分离。

2、如权利要求1中要求的方法，其中植物材料从下述可食植物中单一选出或组合：水果、蔬菜，包括种、根、块茎、茎、叶子或花。

3、如权利要求1和2要求的方法，其中活性蛋白是酶，特别是过氧化物酶(POX)，果胶甲基酯酶(PME)，多聚半乳糖醛酸酶(PG)，乙醇脱氢酶(ADH)或酸性磷酸酶(AP)。

4、如权利要求1到3要求的方法，其中通过制备来源于植物材料或发酵培养基的匀浆汁获得酶溶液，该汁pH调至5到8.5之间，优选7，补加盐，在1.5到6％之间，优选3％。

5、如权利要求1到4要求的方法，其中在持续分离前，沉淀物要经历一个熟化步骤。

6、如权利要求5的方法，其中熟化步骤，包含特定时间内以一定速率充分混合沉淀物以增加组成颗粒的大小。

7、如权利要求6的方法，其中的沉淀物在搅拌箱中于4℃下以100-400rpm混合10到60秒，或4℃大约30秒在一个静态混合器中混合。

8、如权利要求1到7的方法，其中有机溶剂是醇类，特别是乙醇或其它来源的有机溶剂。

9、如权利要求1到8要求的方法，其中在反应器中的条件为终温度-14到+18℃之间，优选0℃，溶剂终浓度为大约80％。

10、如权利要求1到9要求方法，其中通过反应器后的蛋白沉淀与溶剂接触时间在0到30分钟，优选30秒。

11、如权利要求1到10要求的方法，其中分离蛋白的产量在50到95％之间。

12、按权利要求1到11要求的方法连续分离获得的酶提取液，其中酶回收的活性在25％到100％之间，尤其西红柿中PME为25到50％，POX为80到100％，ADH为70到100％，AP为80到100％。

13、持续分离活性蛋白装置，由一个温度可控制的池子组成，该池子有2个“进口”分支，1个进待分离的活性蛋白溶液，另1个进口进有机溶剂，有一个出口分支用于获得的蛋白沉淀，进口分支与出口分支形成特定角度。

14、如权利要求13中的装置，其中出口与进口分支呈90°角。

15、如权利要求12中的提取液在恢复蔬菜食物产品味道和气味中的用途，例如汤、婴儿食品、精制食物和精制肉食品。