RU2815049C1 - Способ получения молокосвертывающего фермента из биомассы плодовых тел высших грибов - Google Patents
Способ получения молокосвертывающего фермента из биомассы плодовых тел высших грибов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2815049C1 RU2815049C1 RU2022128076A RU2022128076A RU2815049C1 RU 2815049 C1 RU2815049 C1 RU 2815049C1 RU 2022128076 A RU2022128076 A RU 2022128076A RU 2022128076 A RU2022128076 A RU 2022128076A RU 2815049 C1 RU2815049 C1 RU 2815049C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- enzyme
- milk
- clotting
- minutes
- ratio
- Prior art date
Links
- 108010005090 rennin-like enzyme (Aspergillus ochraceus) Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- 241000233866 Fungi Species 0.000 title claims description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 22
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 title abstract 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 title description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 37
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 claims abstract description 18
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 claims abstract description 18
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 17
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 12
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 claims abstract description 12
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims abstract description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims abstract description 11
- 240000001080 Grifola frondosa Species 0.000 claims abstract description 10
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims abstract description 8
- 239000000945 filler Substances 0.000 claims abstract description 6
- 238000002137 ultrasound extraction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- 238000010257 thawing Methods 0.000 claims description 5
- 239000013049 sediment Substances 0.000 claims description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 claims 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 abstract description 21
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 abstract description 4
- 238000007710 freezing Methods 0.000 abstract description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 abstract description 3
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 abstract description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 34
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 235000007710 Grifola frondosa Nutrition 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000007738 vacuum evaporation Methods 0.000 description 5
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 4
- 240000001462 Pleurotus ostreatus Species 0.000 description 4
- 235000001603 Pleurotus ostreatus Nutrition 0.000 description 4
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 4
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 4
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical group CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000221198 Basidiomycota Species 0.000 description 2
- 241001236803 Coprinopsis lagopides Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical group CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000007685 Pleurotus columbinus Nutrition 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 229940108461 rennet Drugs 0.000 description 2
- 108010058314 rennet Proteins 0.000 description 2
- 230000005070 ripening Effects 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical class [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001507939 Cormus domestica Species 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000123150 Fomitopsis pinicola Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102220541617 HLA class II histocompatibility antigen, DQ beta 1 chain_A23S_mutation Human genes 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 241000222344 Irpex lacteus Species 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000221987 Russula Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005265 energy consumption Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000006479 glucose peptone medium Substances 0.000 description 1
- 235000011617 hard cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 1
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000015099 wheat brans Nutrition 0.000 description 1
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения молокосвертывающего фермента из плодовых тел высших грибов Grifola frondosa, включающий гомогенизацию плодовых тел и замораживание. Полученный гомогенат размораживают, осадок смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:5-1:25, проводят ультразвуковую с частотой 28 кГц, мощностью 170 Вт экстракцию водной суспензии плодовых тел при температуре 24-32°С в течение 10-30 мин, обрабатывают 5% водным раствором бентонита в течение 20 мин при перемешивании, центрифугируют, фильтруют полученную жидкость с размером пор микрофильтра 0,45 мкм, концентрируют фильтрат под вакуумом по объему в 6 раз при 28-40°C и лиофильно высушивают при (-27)-(-39)°C с наполнителем поваренной солью в концентрации 15-35%. Изобретение обеспечивает повышение молокосвертывающей активности фермента и показателя соотношения молокосвертывающей и общей протеолитической активности. 1 табл., 5 пр.
Description
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам извлечения протеолитических ферментов из биомассы грибов, и может быть использовано в пищевой и биотехнологической промышленности.
Молокосвертывающие ферменты являются одними из протеолитических ферментов и используются для расщепления белков молока, их коагуляции и последующего образования сгустка при производстве твердых сыров и творога из натурального молока. Наиболее часто для этой цели используют ферменты животного происхождения и микробные коагулянты. Биомасса грибов также содержит протеолитические ферменты, которые могут быть использованы, после выделения и очистки, в качестве молокосвертывающего фермента.
Известен способ получения молокосвертывающего фермента «Руссулин». В качестве продуцента фермента используют высшие базидиальные грибы вида Russula decoloraus (штамм 2). Культивирование биомассы мицелия производят на питательной среде, содержащей источники углеводов, азота и минеральных веществ. Полученную культуральную жидкость отделяют от мицелия, охлаждают, осаждают белки этиловым спиртом, выдерживают смесь в течение 24 часов при температуре - 15°С, декантируют надосадочную жидкость, осадок отделяют и высушивают [1].
Применение в качестве осадителя этилового спирта вызывает значительную инактивацию протеолитических ферментов и не способствует их стабильности. Также данный способ не позволяет получить фермент с высоким выходом.
Известен способ получения молокосвертывающего фермента из высших базидиальных грибов Hirschioporus laricinus ВКПМ F-263. Способ заключается в культивировании биомассы мицелия на глюкозо-пептонной среде, отделении культуральной жидкости, охлаждении ее до температуры 4-5°С, осаждении фермента сернокислым аммонием при 55-80%-ном насыщении с последующей его очисткой от низкомолекулярных веществ и белков, не растворимых в воде, методом гидролиза и дальнейшей очисткой фермента методом электрофореза [2].
Недостатком данного способа является многостадийность и невозможность получить фермент в промышленных объемах из-за сложности применяемого оборудования.
Известен также способ получения молокосвертывающих ферментов из высших грибов Fomitopsis pinicola (штамм АТСС 20036) и Irpex lacteus (штамм IFO 5367). Способ получения включает культивирование продуцентов на жидкой питательной среде, состоящей из источников углеводов (крахмал, декстрин, сахароза, лактоза, мальтоза, глюкоза, меласса, гидролизат древесины), азота (соли аммония, нитраты, кукурузный отвар, пептон, мясной экстракт, соевый порошок, пшеничные отруби, дрожжи, дрожжевой экстракт, мочевина), минеральных веществ (соли кальция, магния, натрия, цинка, меди, железа) и витаминов. После культивирования осуществляют выделение ферментов из культуральной жидкости центрифугированием с последующей фильтрацией, осаждением спиртом (этанолом, метанолом), который может быть заменен ацетоном или изопропанолом, либо сульфатом аммония (50-75% насыщения экстракта). Полученные ферменты высушивают под вакуумом или в морозильной камере [3].
Однако получаемые таким образом ферменты обладают недостаточно высокой молокосвертывающей активностью (МСА) и высокой протеолитической активностью (ПА), что приводит к разжижению молочного сгустка в процессе созревания сыра.
Существует способ получения молокосвертывающего фермента из агарикового макромицета Coprinus lagopides. Способ предусматривает глубинное культивирование продуцента на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли. По достижении максимальной молокосвертывающей активности мицелиальную биомассу отделяют фильтрованием от культуральной жидкости. Затем культуральный фильтрат концентрируют и очищают от низкомолекулярных соединений методом ультрафильтрации и лиофильно высушивают. Способ прост в исполнении, непродолжителен по времени, не требует токсичных реагентов [4].
Недостатком данного способа является использование дорогостоящего оборудования и высоких энергозатрат для осуществления процесса глубинного культивирования биомассы мицелия.
Наиболее близким техническим решением является способ, предусматривающий получение молокосвертывающих ферментов из плодовых тел вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus). Способ характеризуется тем, что плодовые тела Pleurotus ostreatus гомогенизируют, замораживают с последующим размораживанием и разделением на экстракт и осадок. Осадок соединяют с дистиллированной водой в соотношении 1:2, выдерживают при температуре (+4)-(+8)°С, отделяют вторичный экстракт и соединяют его с ранее полученным экстрактом. В смесь экстрактов добавляют уксусную или соляную кислоту до достижения рН=3,8 и осуществляют осаждение насыщением раствора хлоридом натрия при температуре (+4)-(+8)°С. Отделяют полученный осадок и высушивают вымораживанием при температуре (-18)-(-20)°С. Полученный фермент хранят в холодильнике [5, прототип].
Недостатки:
- низкая молокосвертывающая активность фермента - 0,13 ед. на мг препарата;
- низкий показатель соотношения молокосвертывающей и общей протеолитической активности - 2,6, что может привести к разжижению сыра в процессе созревания. Например, у стандартного сычужного фермента, полученного из сычугов телят отношение МСА к ПА составляет 9,1 [6].
Целью изобретения является получение сухого фермента с высокой молокосвертывающей активностью и небольшой протеолитической активностью.
Поставленная цель достигается тем, что в способе получения молокосвертывающего фермента из плодовых тел высших грибов, включающем гомогенизацию, замораживание полученного гомогената с последующим размораживанием, соединение осадка с дистиллированной водой, высушивание вымораживанием в качестве продуцента фермента используют плодовые тела Grifola frondosa, после размораживания гомогената получают суспензию добавлением дистиллированной воды в соотношении 1:5-1:25, проводят ультразвуковую экстракцию водной суспензии плодовых тел с частотой 28 кГц, мощностью 170 Вт при температуре 24-32°С в течение 10-30 минут, обрабатывают 5% водным раствором бентонита в течение 20 минут при перемешивании, центрифугируют при 3000 об/мин, микрофильтруют полученную жидкость с размером пор фильтра 0,45 мкм., концентрируют фильтрат под вакуумом по объему в 6 раз при 28-40°С и высушивают вымораживанием при (-27)-(-39)°C с наполнителем поваренная соль в концентрации 15-35% на лиофильной сушилке.
Технический результат - повышение молокосвертывающей активности фермента и показателя соотношения МСА к ПА. Результат достигается за счет того, что в качестве продуцента фермента используют плодовые тела Grifola frondosa, из которых получают суспензию гомогената добавлением дистиллированной воды в соотношении 1:5-1:25, проводят ультразвуковую экстракцию с частотой 28 кГц, мощностью 170 Вт варьируя температуру 24-32°С и время 10-30 минут, обрабатывают бентонитом, центрифугируют, проводят микрофильтрацию, концентрируют фильтрат под вакуумом при 28-40°С и лиофильно высушивают при (-27)-(-39)°C с наполнителем поваренная соль в концентрации 15-35%.
Для достижения заявленного технического результата используют плодовые тела грибов G. frondosa. Эти грибы культивируются по всему миру и при отработке технологии могут являться доступным, дешевым и нетоксичным сырьем для получения ферментных препаратов.
Также применяют ультразвуковое воздействие на биомассу плодовых тел грибов, что приводит к нарушению диффузионного слоя клеточной стенки и, как следствие, быстрому экстрагированию растворимых компонентов [7].
Также этому способствует повышенная температура 24-32°С и длительность обработки 10-30 минут. При температуре меньше 24°С скорость экстракции низкая, при температуре выше 32°С может происходить частичная денатурация ферментов. При длительности меньше 10 минут количество экстрагируемого фермента очень мало. При длительности свыше 30 минут количество экстрагируемого фермента уже не увеличивается с ростом времени обработки.
В отличие от прототипа предлагаемая ультразвуковая экстракция является одноступенчатой и, соответственно, проще реализуется, не требует смешивания экстрактов.
В отличие от прототипа предлагается использование более низких соотношений гомогената и дистиллированной воды. Получение суспензии гомогената и дистиллированной воды в соотношении 1:5-1:25 против 1:2 позволяет создать большую разность концентраций для обеспечения высокой движущей силы экстрагируемого фермента, а также приемлемую вязкость суспензии для удобной технологической обработки.
Обработка бентонитом направлена на коагуляцию тонкой взвеси твердых частиц, которая загрязняет фермент. Концентрация бентонита обусловлена обеспечением требуемой вязкости раствора. Центрифугирование позволяет эффективно отделить коагулированный осадок.
Микро фильтрация также направлена на получение требуемой степени очистки получаемого фермента. Концентрирование под вакуумом позволяет сократить количество влаги, подлежащей удалению в процессе сушки. При температуре свыше 40°С может происходить частичная денатурация белков фермента, при температуре ниже 28°С вязкость жидкости слишком велика, что очень замедляет процесс концентрирования.
Лиофильная сушка направлена на сохранение нативной структуры фермента и получение его в сухом виде. Температурный диапазон является отличным от прототипа и находится в более низком диапазоне температур (-27)-(-39)°С против (-18)-(-20)°С. Предлагаемая в настоящем способе температурный диапазон обуславливает более высокую скорость удаления влаги. Поваренная соль имеет высокую степень сродства к воде и эффективно ее сорбирует. Концентрация наполнителя обусловлена необходимостью обеспечения требуемого градиента концентраций влаги при удалении ее из раствора.
Предлагаемое изобретение позволяет повысить уровень МСА фермента в 2,5 раза и показатель МСА к ПА в 1,9 раз по сравнению с прототипом за счет обработки водной суспензии плодовых тел грибов ультразвуком, частичной очистки раствором бентонита, концентрирования фильтрата под вакуумом и лиофильной сушки с наполнителем. Достигнутые показатели сухого фермента позволяют использовать его в качестве эффективного молокосвертывающего агента в молочной отрасли промышленности.
В таблице представлены показатели МСА, ПА и их соотношение в сравнении с прототипом.
Данные таблицы показывают, что МСА фермента выше прототипа на 2,5 раза и составляет 0,325 ед/мг. Отношение МСА к ПА выше в сравнении с прототипом в 1,9 раз.
Предлагаемый способ получения молокосвертывающего фермента может быть осуществлен следующим образом. Гомогенизация, перемешивание, суспендирование, обработка бентонитом могут быть проведены в емкостном сосуде с мешалкой. Ультразвуковая экстракция может быть проведена в ультразвуковой ванне или в ультразвуковом проточном аппарате. Замораживание может быть проведено в морозильной камере, с предварительным помещением сырья в тару. Размораживание может быть проведено в дистиллированной воде в емкостном сосуде с мешалкой. Концентрированием может быть выполнено на роторном испарителе. Фильтрование и микрофильтрация могут быть выполнены на вакуум-фильтре и нутч-фильтре соответственно. Центрифугирование может быть реализовано на отстойной центрифуге.
Возможность получения заявленного технического результата подтверждаются следующими примерами.
Пример 1
Свежие плодовые тела Grifola frondosa в количестве 250 г гомогенизируют, замораживают при температуре -18°C с последующим размораживанием, добавляют дистиллированную воду в соотношении 1:10 для получения равномерной суспензии и проводят экстракцию в ультразвуковой ванне с частотой 28 кГц, мощностью 170 Вт, при температуре 26°С в течение 15 минут. Полученный экстракт фильтруют через хлопчатобумажный фильтр на установке под вакуумом. Далее полученную смесь обрабатывают 5% водным раствором бентонита в течение 20 минут при перемешивании. Отработанное бентонитовое, нерастворимое вещество отделяют центрифугированием при 3000 об/мин. Далее проводят микрофильтрацию полученной жидкости через фильтр с размером пор 0,45 мкм. Фильтрат концентрируют в 6 раз методом вакуум-выпаривания при температуре 30°С, после чего лиофильно высушивают с наполнителем поваренная соль в концентрации 20% при -30°С. Выход фермента по массе в пересчете на стандартную активность составляет 0,98 г/л водного экстракта плодовых тел. Молокосвертывающий фермент содержит 0,87 мг белка, 0,300 ед/мг МСА и 0,064 ед/мг ПА. Соотношение МСА к ПА составляет 4,7.
Пример 2
Свежие плодовые тела Grifola frondosa в количестве 250 г гомогенизируют, замораживают при температуре -18°C с последующим размораживанием, добавляют дистиллированную воду в соотношении 1:15 для получения равномерной суспензии и проводят экстракцию в ультразвуковой ванне с частотой 28 кГц, мощностью 170 Вт, при температуре 28°С в течение 20 минут. Полученный экстракт фильтруют через хлопчатобумажный фильтр на установке под вакуумом. Далее полученную смесь обрабатывают 5% водным раствором бентонита в течение 20 минут при перемешивании. Отработанное бентонитовое, нерастворимое вещество отделяют центрифугированием при 3000 об/мин. Далее проводят микрофильтрацию полученной жидкости через фильтр с размером пор 0,45 мкм. Фильтрат концентрируют в 6 раз методом вакуум-выпаривания при температуре 34°С, после чего лиофильно высушивают с наполнителем поваренная соль в концентрации 25% при -33°С. Выход фермента по массе в пересчете на стандартную активность составляет 0,83 г/л водного экстракта плодовых тел с содержанием белка 0,84 мг. Общая МСА сухого фермента составляет 0,325 ед/мг, ПА - 0,062 ед/мг. Соотношение МСА к ПА составляет 5,2.
Пример 3
Свежие плодовые тела Grifola frondosa в количестве 250 г гомогенизируют, замораживают при температуре -18°C с последующим размораживанием, добавляют дистиллированной воды в соотношении 1:20 для получения равномерной суспензии и проводят экстракцию в ультразвуковой ванне с частотой 28 кГц, мощностью 170 Вт, при температуре 30°С в течение 25 минут. Полученный экстракт фильтруют через хлопчатобумажный фильтр на установке под вакуумом. Далее полученную смесь обрабатывают 5% водным раствором бентонита в течение 20 минут при перемешивании. Отработанное бентонитовое, нерастворимое вещество отделяют центрифугированием при 3000 об/мин. Далее проводят микрофильтрацию полученной жидкости через фильтр с размером пор 0,45 мкм. Фильтрат концентрируют в 6 раз методом вакуум-выпаривания при температуре 38°С, после чего лиофильно высушивают с наполнителем поваренная соль в концентрации 30% при -36°С. Выход фермента по массе в пересчете на стандартную активность составляет 0,92 г/л водного экстракта плодовых тел. Молокосвертывающий фермент содержит 0,87 мг белка, 0,302 ед/мг МСА и 0,066 ед/мг ПА. Соотношение МСА к ПА составляет 4,6.
Пример 4
Свежие плодовые тела Grifola frondosa в количестве 250 г гомогенизируют, замораживают при температуре -18°C с последующим размораживанием, добавляют дистиллированной воды в соотношении 1:5 для получения равномерной суспензии и проводят экстракцию в ультразвуковой ванне с частотой 28 кГц, мощностью 170 Вт, при температуре 24°С в течение 10 минут. Полученный экстракт фильтруют через хлопчатобумажный фильтр на установке под вакуумом. Далее полученную смесь обрабатывают 5% водным раствором бентонита в течение 20 минут при перемешивании. Отработанное бентонитовое, нерастворимое вещество отделяют центрифугированием при 3000 об/мин. Далее проводят микрофильтрацию полученной жидкости через фильтр с размером пор 0,45 мкм. Фильтрат концентрируют в 6 раз методом вакуум-выпаривания при температуре 28°С, после чего лиофильно высушивают с наполнителем поваренная соль в концентрации 15% при -27°С. Выход фермента составляет 0,52 г/л. Молокосвертывающий фермент содержит 0,79 мг белка, 0,205 ед/мг МСА и 0,056 ед/мг ПА. Соотношение МСА к ПА составляет 3,6.
Пример 5
Свежие плодовые тела Grifola frondosa в количестве 250 г гомогенизируют, замораживают при температуре -18°C с последующим размораживанием, добавляют дистиллированной воды в соотношении 1:25 для получения равномерной суспензии и проводят экстракцию в ультразвуковой ванне с частотой 28 кГц, мощностью 170 Вт, при температуре 32°С в течение 30 минут. Полученный экстракт фильтруют через хлопчатобумажный фильтр на установке под вакуумом. Далее полученную смесь обрабатывают 5% водным раствором бентонита в течение 20 минут при перемешивании. Отработанное бентонитовое, нерастворимое вещество отделяют центрифугированием при 3000 об/мин. Далее проводят микрофильтрацию полученной жидкости через фильтр с размером пор 0,45 мкм. Фильтрат концентрируют в 6 раз методом вакуум-выпаривания при температуре 40°С, после чего лиофильно высушивают с наполнителем поваренная соль в концентрации 35% при -39°С. Выход фермента по массе в пересчете на стандартную активность составляет 0,60 г/л водного экстракта плодовых тел. Молокосвертывающий фермент содержит 0,62 мг белка, 0,258 ед/мг МСА и 0,068 ед/мг ПА. Соотношение МСА к ПА составляет 3,8.
Использование предлагаемого способа получения фермента в сравнении с существующим способом согласно прототипу имеет следующие преимущества:
1. Увеличивается молокосвертывающую активность фермента в 2,5 раза.
2. Повышается соотношение МСА к ПА в 1,9 раз.
Список использованных источников
1. Пат. 883174 Союз Советских Социалистических Республик, МПК C12N 9/50 А23С 19/032. Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата руссулин / В.М. Гуцалюк, В.Р. Кулинченко, М.Н. Нудьга, Е.Е. Каталевский, Н.П. Круглова, П.Н. Евтихов, А.Е. Епифанов, П.Н. Ручков; заявитель и патентообладатель Киевский технологический институт пищевой промышленности. - №2903964; заявл. 31.03.1980: опубл. 23.11.1981, Бюл. №43.
2. А.с. 1395672 Союз Советских Социалистических Республик, МПК C12N 9/58. Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата / М.И. Бойко, С.Ф. Негруцкий, Т.В. Мирошниченко; заявитель и патентообладатель Донецкий государственный университет. - №4153167/31-13; заявл. 29.08.1986; опубл. 15.05.1988, Бюл. №18.
3. Пат. 3858492 USA, МПК C12N 9/00. Flavoren hancement of milk food stuffs / N. Mukai; M. Kawai; заявитель и патентообладатель Kyowa Hakko Kogyo Kabushiki Kaisha. - №145515; заявл. 20.05.1971; опубл. 07.01.1975.
4. Пат. 2354698 Российская Федерация, МПК C12N 9/58. Способ получения молокосвертывающего фермента / Т.А. Дмитриева, М.М. Шамцян, Н.П. Денисова, И.В. Змитрович, А.В. Корчмарева; заявитель и патентообладатель Т.А. Дмитриева, М.М. Шамцян, Н.П. Денисова, И.В. Змитрович, А.В. Корчмарева. - №2006133208/13; заявл. 20.03.2008; опубл. 10.05.2009, Бюл. №13.
5. Пат. 2380416 Российская Федерация, МПК МПК C12N 9/58. Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата из плодовых тел вешенки обыкновенной / Г.В. Лебедева, М.Т. Проскуряков, Т.В. Бархатова, М.А. Кожухова; заявитель и патентообладатель ГОУВПО «КубГТУ». - №2008132270/13; заявл. 04.08.2008; опубл. 27.01.2010, Бюл. №3. (прототип)
6. Novel milk-clotting enzyme produced by Coprinus lagopides basidial mushroom / M. Shamtsyan, T. Dmitriyeva, B. Kolesnikov, N. Denisova // Lebensmittel-Wissenschaftund-Technologie. - 2014. - Vol. 58(2). - Pp. 343-347. DOI:10.1016/j.lwt.2013.10.009
7. Пат. 2390364 Российская Федерация, МПК B01D 11/00, B01J 19/10. Способ экстракции биологически активных веществ из растительного сырья / Е.Р. Давидов, П.С. Каныгин, О.А. Фракин, И.В. Черемнов; заявитель и патентообладатель Общество с ограниченной ответственностью «ПРОФ БИЗНЕС». - №2008151906/15; заявл. 29.12.2008; опубл. 27.05.2010, Бюл. №15.
Claims (1)
- Способ получения молокосвертывающего фермента из плодовых тел высших грибов, характеризующийся тем, что плодовые тела гомогенизируют, замораживают полученный гомогенат с последующим размораживанием, смешивают с дистиллированной водой, высушивают продукт вымораживанием, отличающийся тем, что в качестве продуцента фермента используют высшие грибы Grifola frondosa, после размораживания осадок смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:5-1:25, проводят ультразвуковую с частотой 28 кГц, мощностью 170 Вт экстракцию водной суспензии плодовых тел при температуре 24-32°С в течение 10-30 мин, обрабатывают 5% водным раствором бентонита в течение 20 мин при перемешивании, центрифугируют, фильтруют полученную жидкость с размером пор микрофильтра 0,45 мкм, концентрируют фильтрат под вакуумом по объему в 6 раз при 28-40°C и лиофильно высушивают при (-27)-(-39)°C с наполнителем поваренной солью в концентрации 15-35%.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2815049C1 true RU2815049C1 (ru) | 2024-03-11 |
Family
ID=
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2380416C1 (ru) * | 2008-08-04 | 2010-01-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кубанский государственный технологический университет" (ГОУВПО "КубГТУ") | Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата из плодовых тел вешенки обыкновенной |
| RU2657431C1 (ru) * | 2017-01-23 | 2018-06-13 | Общество с ограниченной ответственностью "Микопро" (ООО "Микопро") | Способ получения биологически активных веществ из грибов |
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2380416C1 (ru) * | 2008-08-04 | 2010-01-27 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Кубанский государственный технологический университет" (ГОУВПО "КубГТУ") | Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата из плодовых тел вешенки обыкновенной |
| RU2657431C1 (ru) * | 2017-01-23 | 2018-06-13 | Общество с ограниченной ответственностью "Микопро" (ООО "Микопро") | Способ получения биологически активных веществ из грибов |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| KAWAI M. "Studies on milk clotting enzymes produced by basidiomycetes"; Agricultural and biological chemistry, 1971, N 35 (10), 1517-1525. ASHRAF BARK et al. "Purification and characterization of milk clotting enzyme from edible mushroom (Pleurotus florida)", Letters in applied nanobioscience, 2022, v.11, issue 2, p.3362-3373. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US10010103B2 (en) | Methods for the production and use of myceliated high protein food compositions | |
| US10980257B2 (en) | Methods for lowering gluten content using fungal cultures | |
| CN106282285B (zh) | 一种以三文鱼为原料生产医药级蛋白肽粉的方法 | |
| CN112481343B (zh) | 一种以鳕鱼皮原料生产胶原蛋白肽的方法 | |
| DK146553B (da) | Fremgangsmaade til fremstilling af et dyrefoder | |
| CN108676736A (zh) | 一株可降解柠檬酸的毕赤酵母菌及其应用 | |
| CN109468357A (zh) | 一种脾氨肽的制备方法 | |
| US4725540A (en) | Process for the preparation of amine-oxidase containing material, so produced amine-oxidase containing material | |
| US20200123494A1 (en) | Method for obtaining protein from whey or molasses | |
| RU2815049C1 (ru) | Способ получения молокосвертывающего фермента из биомассы плодовых тел высших грибов | |
| CN108191991B (zh) | 一种杏鲍菇多糖的提纯方法 | |
| CN109259110A (zh) | 一种基于多次发酵提高鹅肉嫩度的方法 | |
| CN114591860A (zh) | 一种高载乳酸菌肉用直投式发酵剂及其制备方法和应用 | |
| CN111926050A (zh) | 河豚精囊胶原蛋白肽的提纯工艺 | |
| RU2758788C1 (ru) | Способ получения коллагенолитического фермента | |
| RU2800267C1 (ru) | Способ получения обогащенного концентрата сывороточных белков | |
| Al Musa et al. | Study of the chemical content and antimicrobial activity of Iraqi butter milk of cows and buffaloes | |
| RU2788920C2 (ru) | Способ получения бактериального концентрата | |
| RU2298940C2 (ru) | Способ производства белкового гидролизата | |
| CN108935926A (zh) | 一种提高肌原纤维蛋白水溶性的多肽混合物的制备方法 | |
| CN114317657A (zh) | 一种鱼骨肽及其制备方法和应用 | |
| CN118028117A (zh) | 波兰青霉及其应用 | |
| RU2380416C1 (ru) | Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата из плодовых тел вешенки обыкновенной | |
| CN112075490A (zh) | 一种酶解物滚揉改良冻藏肉品质的方法 | |
| US20240155983A1 (en) | Active Mycelium Compound Extraction Process |