EP1082429A2 - TUMORSUPPRESSORGENE DER p53-FAMILIE - Google Patents

TUMORSUPPRESSORGENE DER p53-FAMILIE

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Publication number
EP1082429A2
EP1082429A2 EP99936328A EP99936328A EP1082429A2 EP 1082429 A2 EP1082429 A2 EP 1082429A2 EP 99936328 A EP99936328 A EP 99936328A EP 99936328 A EP99936328 A EP 99936328A EP 1082429 A2 EP1082429 A2 EP 1082429A2
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EP
European Patent Office
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ket
nucleic acids
nucleic acid
fragments
seq
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP99936328A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Dieter Paul
Martin Augustin
Hartwig Schmale
Casimir Bamberger
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Forderung der Angewandten Forschung eV
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Filing date
Publication date
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Publication of EP1082429A2 publication Critical patent/EP1082429A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/172—Haplotypes

Definitions

  • the invention relates to new tumor suppressor genes of the p53 family, polypeptides that encode them and their use. It preferably relates to nucleic acids encoding KET, in particular rats, humans and mice.
  • Genes that play a significant role in tumorigenesis can be roughly classified based on their functional mode of action. If a gain-of-function mutation leads to an allele which has an activating effect on tumorigenesis, the gene in question is referred to as the oncogene. If a loss-of-function mutation on both alleles is necessary (inactivating) in order to make tumorigenic changes possible, one speaks of a tumor suppressor gene.
  • the most prominent and most studied tumor suppressor gene codes for the nuclear transcription factor p53 (over 2000 Medline entries in the past year; NCBI database) with the main function in the control of the cell cycle and apoptosis (Levine 1997). p53 is more than 50% mutated in human tumors (Hollstein et al.
  • the invention was therefore based on the object of providing corresponding genes which code for proteins which play a role in controlling the Zeil cycle and apoptosis.
  • the KET protein is involved in tumor suppression. Of particular interest were those tumors in which no changes in the p53 wild type allele have been described.
  • the chromosomal localization of the responsible Tumor suppressor genes can be predicted by cytogenetic analyzes that identify loss of heterozygosity (LOH) areas. It has been shown that the KET / Ket gene is mapped into such LOH regions in humans or mice
  • the KET / Ket gene was mapped in humans and mice with flanking markers (Fig. 2). Radiation hybrids (Radiation Hyb ⁇ ds, Ge ⁇ eB ⁇ dge 4 Panel, Research Genetics) were used for precise chromosomal localization in humans. Mapping was carried out in a mouse Muscle XM spretus jerk crossing generation The ket gene mapped between the somatostatin gene and the apolipoprotein D gene on Chr 3q of humans. The same gene sequence was confirmed on Chr 16 of the mouse.
  • the invention therefore relates to the KET nuclear acids, preferably KET cDNA from rats, humans and mice, and their fragments, variants and mutations, preferably SEQ ID No 1 (KET cDNA from rats) and SEQ ID No 2 (human KET cDNA)
  • the invention furthermore relates to the polypeptides for which the cDNAs encode, preferably SEQ ID No 3, and their structures which have been modified at one or more locations by exchanging amino acids
  • the production takes place according to known methods, such as. B. by isolation and sequencing from cDNA libraries.
  • the invention relates to the use of the KET nucleic acids and polypeptides as a starting basis for the development of specific and effective cancerostatics. They are used to build genes and vectors that form the basis for the development of these pharmaceutically relevant substances.
  • diagnostic test kits e.g. to predict cancer risk. Accordingly, the subject of diagnostic test kits.
  • mice bearing zero alleles of the ket gene required four successive processes:
  • the existing BAC was subcloned into pBluescript or pUC after digestion with suitable restriction endonucleases (optimal size of the subclones 5-10 kb).
  • suitable restriction endonucleases optimal size of the subclones 5-10 kb.
  • STS mapping Sequence Tagged Sites
  • a subclone contig was created which can be regarded as a fine mapping of the 5 'gene area.
  • the human and rat cDNA information was used for this.
  • the open reading frame can be interrupted at two points: in one case the first translated exons and in the other the entire putative DNA binding domain was switched off.
  • a ⁇ -galactosidase cassette was additionally cloned in so that it is under the control of the Ke promoter.
  • two forms of targeted gene targeting were possible: when using an insertion vector, the complete vector was integrated (a crossover event was required), with the more common replacement vector, only a part was integrated that was dependent on the choice of intragenic restriction interfaces (two crossover events required) .
  • 129 origin Most common ESCs were isolated from this mouse strain. The advantage of using isogenic material is the higher probability of homologous recombination. After transfection (electroporation), ESCs were checked by G418 selection. in the
  • Thymidine kinase cassette for negative selection (Gancyclovir) in non-homologous
  • KET cDNA 1 ⁇ 10 6 clones of a human skeletal muscle cDNA library (Stratagene) were checked with samples which originated from a rat KET cDNA (Schmale and Bamberger, 1997). A single positive clone, hu41 m, was obtained and the 3226 bp insert was sequenced in two directions using vector specific and internal primers. The insert contained an open reading frame of 1360 bp, homologous to the N-terminus of the Ratte ⁇ -KET sequence, but the coding sequence was interrupted by an unknown sequence according to the QQHQHLLQ motif at position 448.
  • PCR primers according to the 3 'end of the hU 10k cDNA clone and the 5' end of the EST clone 149663 were used.
  • the complete cDNA contains 4846 bp, including 27 bp of the most likely truncated 5 'untranslated region and 2776 bp of the 3' untranslated region.
  • PCR primers positioned according to the translation start and stop codons were used for the amplification of the complete protein coding sequences of the KET of human skin cDNA.
  • the cDNA contains an open reading frame which codes for 680 amino acids ( FIG. 1)
  • the presumptive start of methionine is preceded by a translation stop codon (not shown) in a grid.
  • a comparison of the amino acid sequences of the KET of humans and rats shows a 98% identity (Fig. 1).
  • This remarkable interspecific conservation of KET proteins extends over the Entire molecule length It is even more pronounced in the middle part, which contains the DNA binding area, 248 amino acids are completely unchanged.
  • the KET proteins are far more conserved than the corresponding p53 proteins of humans and rats, which are 79% homologous in total their identity is achieved in the DNA binding area t 91% Human p73 shows a total identity of 58% with human KET.
  • KET is an evolutionary old gene p53 may have evolved from its precursor gene as a protein that is responsible for specific functions such as monitoring genomic damage.
  • the extent of genotoxic exposure depends on the extent to which higher invertebrates and vertebrates were developed and differentiated on physiological factors and environmental factors, which are, at least in part, different for the different species.
  • the P ⁇ merpositione ⁇ were defined in such a way that fragments were formed which contained an intron flanked by exon sequences. This made it possible to identify correct PCR fragments by comparing them with the known KET cDNA sequence from rats, especially for mapping the ket gene from Mice have chosen intron-containing PCR fragments to obtain easily detectable fragment-length polymorphisms after restriction with suitable endonucleases.
  • the Exo ⁇ -Intro ⁇ limits were determined by comparing the KET amino acid sequence with that of p53 and p73 (Schmale and Bamberger, 1997, Kaghad et al, 1997). The exon sequences corresponded to the human KET amino acid sequence (Fig.
  • 3q27 is the middle part of a region of a well documented syntenia to mouse chromosome 16 that extends from CLCN2 to GAP43 or Clc2 to Gap43 in the mouse genome (DeBry and Seidin, 1996 Lengeling et al, 1995) Um y
  • the ket gene was mapped using an interspecies backcross of the mouse (C57BL / 6J wrl + xSEG / 1 + / +) * F ⁇ wrl / + x (C57BL / 6J wrl +), which was originally established for mapping the 1 / Vo ⁇ b / er gene (Kaupmann et al, 1992).
  • This interspecies backcrossing panel was characterized for over 150 loci that were distributed across all autosomes and the X chromosomes.
  • An improved map of chromosome 16 has been created for mapping the chloride channel gene Clc2 (Lengeling et al, 1995).
  • Both mouse KET-PCR fragments provided informative restriction fragment length variants (RFLVs) which were used for the segregation analysis.
  • the fragment with intron 8 (muKET ⁇ ) was cut with Msp1, muKET9 with Rsa1. KET was discovered between Smst and D16MH63 with lodserves> 8 (Fig. 2B.C).
  • the mouse homologue of human apolipoprotein D, Apod, the gene marker on human Chr 3q closely linked distal to KET was not mapped in the musculus x M. Spretus back-cross panel, but detailed mapping data are available (Reeves and Cabin, 1997; Warden et al, 1992; Reeves et al, 1997).
  • D16MH 57 was mapped distal to Apod (Reeves and Cabin, 1997) and uses a fragment-length polymorphism between the C57BU6J muscle (111 bp) and the spretus SEG / 1 muscle (135 bp). No recombination of ket and D16MH57 was found in 50 meiosis. On the back cross of M. musculus x M. spretus, the most likely gene sequences and distances were Cen - D16MH87 - 3.9 + 1, 7 cM - Smst, D16MÜ102 - 4 ⁇ 2.77 cM - Ket, D16 with 57 - 14 ⁇ 4 , 91 cM - D16MH63.
  • Comparative mapping data showed areas of a completely preserved syntenia between Chr 3q and mouse chromosomes 3, 9 and 16 (see DeBry and Seidin, 1996), two of which harbor the predicted suppressor genes Loh1 and Loh2, which are at pronounced stages of tumor development in a transgenic mouse model Islet cell carcinoma (Dietrich et al, 1994; Parangi et al, 1995; Shi et al, 1997) can be deleted.
  • the ket gene falls in the same LOH range with Loh2 (LOH about 15 cM, 14-29 cM from Ce ⁇ , flanked by the microsatellite markers D16MH35 and D16Mit39; (see Parangi et al, 1995).
  • Loh2 is believed to it encodes a suppressor of angiogenesis (Parangi et al, 1995).
  • the p53 protein has been shown to indirectly inhibit angiogenesis in fibroblasts by positively regulating thrombospondin-1 expression (Dameron et al, 1994) Loh2 candidate due to its chromosomal location and putative function.
  • mice deficient for p53 are developmentally normal but susceptible to spontaneous tumors. Nature 356, 215-21.
  • Chloride Channel 2 gene maps to chromosome 16 of the mouse, extending a region of conserved synteny with human chromosome 3q. Genet Res 66, 175-8.
  • Tumor suppressor loci on mouse chromosomes 9 and 16 are lost at distinct stages of tumorigenesis in a transgenic model of islet cell carcinoma. Cancer Res 55, 6071-6.

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Abstract

Die Erfindung betrifft neue Tumorsuppressorgene der p53-Familie, Polypeptide die sie kodieren, sowie ihre Verwendung. Bevorzugt betrifft sie KET-kodierende Nukleinsäuren, insbesondere der Ratte, des Menschen und der Maus.

Description

Tumorsuppressorgene der p53-Familie
Die Erfindung betrifft neue Tumorsuppressorgene der p53-Familie, Polypeptide, die sie kodieren sowie ihre Verwendung. Bevorzugt betrifft sie KET-kodierende Nukleinsäuren, insbesondere der Ratte, des Menschen und der Maus.
Gene, die in der Tumorigenese eine maßgebliche Rolle spielen, können aufgrund ihrer funktioneilen Wirkweise grob klassifiziert werden. Führt eine Gain-of- function-Mutation zu einem Allel, das auf die Tumorigenese aktivierend wirkt, so wird das betroffene Gen als Oncogen bezeichnet. Ist eine Loss-of-function- Mutation auf beiden Allele nötig (inaktivierend), um tumorigene Veränderungen möglich werden zu lassen, spricht man von einem Tumorsuppressor-Gen. Das prominenteste und meist untersuchte Tumorsuppressor-Gen kodiert für den nuklearen Transkriptioπsfaktor p53 (über 2000 Medline Einträge im vergangenen Jahr; NCBI-Datenbank) mit der Hauptfunktion in der Kontrolle des Zeil-Zyklus' und der Apoptose (Levine 1997). p53 liegt in humanen Tumoren zu über 50 % mutiert vor (Hollstein et al. 1991 ), vererbte p53 Mutationen führen zu einer erhöhten Tumorhäufigkeit bei den Trägern des defekten Alieis (Evans und Lozano 1997). Derzeit existieren vier p53-knock-out Mauslinien, die von mehreren Arbeitsgruppen unabhängig voneinander hergestellt wurden und als Tiermodelle für den Menschen dienen. p53-defiziente Tiere (Genotyp: +/- und -/-) zeigen schon im frühen Alter eine vermehrte Tumorrate (Donehower et al. 1992, Harvey et al. 1993b). Die Embryo- und Organogenese verläuft jedoch im allgemeinen unauffällig, so daß p53 defiziente Tiere nicht von ihren +/+ Wildtypgeschwistern zu unterscheiden sind (Donehower et al. 1992). Allerdings zeigen einige p53 -/- Embryonen am Tag 13.5 der Embryogenese einen charakteristischen Defekt in der Morphologie des Kopfbereiches, eine Exencephalie, bei der der Verschluß des Neuralrohres in Vorder und Mittelhirn nicht erfolgt. Diese Mißbildung tritt bei 16 % der homozygot-defizienten CV 129 Embryonen auf, während nur 8 % von CV129 X C57BU6- p53 -/- Hybridembryonen betroffen sind. Interessanterweise variiert auch die Tumorinzidenz im CV129 Hintergrund und CV129 X C57BL/6 Hybridhintergrund. Tumoren entwickeln sich generell schneller in CV 129 Mäusen als in CV 129 X C57BU6-Hybriden; zusätzlich kommt es in CV 129 Tieren vermehrt zu Teratomen (Donehower et al. 1995, Harvey et al. 1993a). Solche Unterschiede können nur durch die jeweils unterschiedliche Konstitution des genetischen Hintergrundes erklärt werden. Das zeigt im unterschiedlichen genetischen Hintergrund das Vorliegen differenzierter Kompeπsationseffizienz gegenüber dem p53-Verlust und die Existenz verwandter Gen-Produkte, welche die Funktion von p53 während der Embyogenese und Cancerogenese verrichten.
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, entsprechende Gene bereitzustellen, die für Proteine kodieren, welche bei der Kontrolle des Zeil-Zyklus und der Apoptose eine Rolle spielen.
Die Erfindung basiert auf der Erkenntnis, daß das Protein KET mit so bemerkenswerter Homologie in seiner Aminosäuresequenz zu p53 gefunden wurde, daß es mit p53 in einer p53-Familie zusammengefaßt werden kann. Wie p53 besitzt KET eine Transaktivierung-, eine DNA-Bindungs- und eine Oligomerisierungsdomäne. Der höchste Grad an Homologie ist in der DNA- Bindungs-Domäne zu finden. Er beträgt zwischen KET und p53 75%. Die Isolierung der kodierenden cDNAs erfolgte aus der Ratte (SEQ ID No. 1 ).
Erfindungsgemäß wurde die menschliche KET cDNA (SEQ ID No. 2) Moniert; ein Alignment der abgeleiteten Aminosäuresequenz (SEQ ID No 3) mit der aus Ratte und den Sequenzen von humanem p53 und p73 ist in Abb. 1 gezeigt. Die KET- Aminosäure-Sequenz aus der Ratte zeigt eine Homologie von 98 % zu der des Menschen.
Es wurde eine chromosomale Lokalisation des Gens auf dem Chromosom 3q des Menschen und 16 der Maus (vgl. Abb. 2 Genetische Kartierung) gefunden, woraus sich auf eine Funktion von KET als Tumorsuppressor rückschließen läßt. Interessanterweise kartiert das Ket-Gen der Maus in einen Bereich, der in frühen Stadien der Pancreaskanzerogenese deletiert ist und vermutlich einen Suppressor der Angiogenese, Loh2 (Gensymbol: Loh2), beinhaltet, für den Ket somit einen Kandidaten darstellt.
Gemäß der Erfindung wurde festgestellt, daß das KET-Protein bei der Tumorsuppression beteiligt ist. Von speziellem Interesse waren vor allem solche Tumoren, in denen bisher keine Veränderungen des p53 Wildtypallels beschrieben wurden. Die chromosomale Lokalisation der verantwortlichen Tumorsuppressorgene kann durch cytogenetische Analysen, die Loss of heterozygosity (LOH)-Bereιche identifizieren, vorausgesagt werden Es wurde nachgewiesen, daß das KET/Ket-Gen bei Mensch oder Maus in solche LOH- Regionen kartiert
Erfindungsgemaß erfolgte eine Kartierung des KET/Ket-Gens bei Mensch und Maus mit flankierenden Markern (Abb 2) Zur präzisen chromosomalen Lokalisation beim Menschen wurden Bestrahlungshybride (Radiation Hybπds, GeπeBπdge 4 Panel, Research Genetics) eingesetzt, die Kartierung bei der Maus erfolgte in einer M musculus X M spretus Ruckkreuzungsgeneration Das Ket- Gen kartiert zwischen das Somatostatin-Gen und das Apolipoprotein D Gen auf Chr 3q des Menschen Dieselbe Genreihenfolge wurde auf Chr 16 der Maus bestätigt A (links) chromosomaler Abschnitt des humanen Chromosoms 3q mit der Position des ET-Locus, B (mitte) Position des e^-Locus auf Chr 16 der Maus C (rechts) Ket-Haplotypen und Markergene auf Chr 16 Jede Säule repräsentiert zwei Haplotypen von Chr 16, die Anzahl der Backcross-Individuen ist unten angegeben (obere Zahl gefüllte Quadrate/Rechtecke SEG/1 Allel, leere Quadrate/Rechtecke C57BL6J Allel, untere Zahl das Gegenteil) Gensymbole CKCN2/Clc2 - Chlorid-Channel 2, SST/Smst - Somatostatin, KET/Ket - p53 verwandtes Protein KET, APOD/Apod - Apolipoprotein D, GAP43/Gap43 - Wachstum beeinflußendes Protein 43
Gegenstand der Erfindung sind deshalb die KET-Nuklemsauren vorzugsweise KET-cDNA der Ratte, des Menschen und der Maus sowie deren Fragmente, Varianten und Mutationen, vorzugsweise die SEQ ID No 1 (KET-cDNA der Ratte) und die SEQ ID No 2 (humane KET-cDNA)
Fragmente, Varianten und Mutationen sind durch Basenaustausche gekennzeichnet Weiterhin können auch alle T durch U ersetzt sein (Ribonukleinsäure)
Ferner sind Gegenstand der Erfindung die Polypeptide für die die cDNAs kodieren, vorzugsweise SEQ ID No 3, und deren an einer oder mehreren Stellen durch Austausch von Aminosäuren geänderte Strukturen Die Herstellung erfolgt nach an sich bekannten Verfahren, wie z. B. durch Isolierung und Sequenzierung aus cDNA-Bibliotheken.
Desweiteren betrifft die Erfindung die Verwendung der KET-Nukleinsäuren und Polypeptide als Ausgangsbasis zur Entwicklung spezifischer und wirkungsvoller Cancerostatika. Sie werden zum Aufbau von Genen und Vektoren eingesetzt, die die Basis für die Entwicklung dieser pharmazeutisch relevanten Substanzen darstellen.
Außerdem werden sie zur Entwicklung diagnostischer Kits eingesetzt, so z.B. zur Vorhersage eines Krebsrisikos. Gegenstand sind demzufolge auch diagnostische Testkits.
Weiterhin erfolgte die Charakterisierung von geπomischen Ket-Klonen des Menschen und der Maus durch die differentielle Darstellung von intron- umspannenden PCR-Fragmenten. Diese PCR-Tests wurden auch für die Identifizierung von Kef-positiven BACs (Bacterial artificial chromosome) in einer genomischen BAC-Bibliothek (Genome Systems Ine) verwendet. Diese BACs enthalten DNA aus dem CV 129/J Mausstamm, so daß Subfragmente des BAC- Klones direkt zur Konstruktion des e -Targetiπg-Vektors eingesetzt werden. Auf den bisher identifizierten BACs befanden sich auch die ersten 5'-Exons. Aus der full-length KET-cDNA Sequenz des Menschen und der Ratte wurden Pπ'mersequenzen abgeleitet, die zu Maus Exon 1 spezifischen PCR-Tests führen.
Darüber hinaus wurden /Ke -defiziente Mäuse hergestellt.
Die Herstellung von Mäusen, die Nullallele des Ket-Gens tragen, erforderte vier aufeinanderfolgende Prozesse:
• Isolierung und Charakterisierung eines geeigneten Abschnittes des Zielgenes.
• Klonierung eines Targeting-Vektors, in dem der offene Leserahmen des Zielgenes durch die Integration eines Selektionsmarkers (vollständige Transkriptionseinheit für das Neomycin-Resistenz-Gen) zerstört ist.
• Homologe Integration des Rekombinationskonstruktes in das Genom von embryonalen Stammzellen und anschließende Selektion auf die Antibiotika- Resistenz. • Injektion von ESCs in Blastocysten (oder Kokultur mit Morulae) und anschließender Uterustransfer.
Gegenstand sind auch Targeting-Vektoren. In einer Ausführungsvariante wurde der bereits vorliegende BAC nach Verdau mit geeigneten Restriktionsendonukleasen in pBluescript oder pUC subkloniert (optimale Größe der Subklone 5-10 kb). Über weitere Restriktionskartierung und STS-Mapping (Sequence Tagged Sites) mittels PCR und/oder Southern blotting wurde ein Subklon-Kontig erstellt, das als eine Feinkartierung des 5'-Genbereichs angesehen werden kann. Hierzu wurde die cDNA-Information aus Mensch und Ratte verwendet. Generell kann die Unterbrechung des offenen Leserahmens an zwei Stellen erfolgen: Es wurde in einem Fall die ersten translatierten Exons und im anderen die gesamte putative DNA-Bindungs-Domäne ausgeschaltet. Um die gewebsspezifische Expression von Ket während der Embryo- und Organogenese in Chimären und ef-defizienten Mäusen zu verfolgen, wurde zusätzlich eine ß-Galactosidase- Kassette so einkloniert, daß sie der Kontrolle des Ke -Promoters unterliegt. Generell waren zwei Formen des gezielten Gentargeting möglich: Bei Verwendung eines Insertionsvektors integrierte der komplette Vektor (ein Crossover-Ereignis war erforderlich), bei dem gebräuchlicheren Replacementvektor integrierte lediglich ein Teil, der von der Wahl intragener Restriktioπsschnittstellen abhängig war (zwei Crossover-Ereignisse erforderlich).
Genausschaltung in embryonalen Stammzellen (ESCs)
Wie schon oben aufgeführt, ist die verwendete genomische BAC-Bibliothek CV
129-Ursprungs. Aus diesem Mausstamm wurden auch die meisten gebräuchlichen ESCs isoliert. Der Vorteil der Verwendung von isogenem Material liegt in der höheren Wahrscheinlichkeit zur homologen Rekombination. ESCs wurden nach Transfektion (Elektroporation) durch G418-Selektion überprüft. Im
Falle des Replacemeπt-Vektors wurde zusätzlich eine Vektor-interne
Thymidinkinase-Kassette zur negativ-Selektion (Gancyclovir) bei nicht homologer
Integration genutzt.
Eine erfolgreiche homologe Rekombination wurde über DNA-Analysen (Southern-
Blot) geprüft.
Durch die Injektion von so geänderten ESCs in Blastocysten wurden auch Embryonalchimären hergestellt und diagnostiziert. Für die Blastocysteninjektion oder Morula-Aggregation wurden nur genotypisierte ESCs verwendet. Chimäre Präimplantations-Embryonen wurden in die Uterushörner von scheinschwangeren Rezipientenmäusen übertragen. Chimären wurden in Testverpaarungen auf eine erfolgte Keimbahntransmission von ESC- Abkömmiingen überprüft. F1/F2 Nachkommen von Chimären, die das Ket Null- Allel entweder hetero- oder homozygot tragen, wurden mittels Southem-Blot- oder PCR-Analysen genotypisiert.
Weiterhin ist die Erfindung durch ein Beispiel und ein Sequenzprotokoll näher erläutert.
Beispiel
Gewinnung der humanen KET-cDNA (SEQ ID No. 2)
Für die Gewinnung von humaner KET-cDNA wurden 1 x 106 Klone einer menschlichen Skelettmuskel-cDNA-Bibliothek (Stratagene) mit Proben überprüft, die einer Ratten-KET-cDNA entstammten (Schmale und Bamberger, 1997). Ein einziger positiver Klon, hu41 m, wurde gewonnen und das Insert von 3226 bp wurde unter Verwendung vektorspezifischer und interner Primer - in zwei Richtungen sequenziert. Das Insert enthielt einen offenen Leserahmen von 1360 bp, homolog zum N-Terminus der Ratteπ-KET-Sequenz, die Kodiersequenz war jedoch nach dem QQHQHLLQ-Motiv an Position 448 durch eine unbekannte Sequenz unterbrochen. Die Überprüfung von 6 x 105 Klonen einer menschlichen Keratiπocyten-cDNA-Bibliothek (Clontech) mit einer Probe, die vom 3'-Ende von hu41 m stammte, ergab zwei übereinandergreifende Klone, hu6k und hu10k, die mit einem Teil des cDNA-Klons hu41 identisch waren und die Sequenz zum 3'- Ende hin verlängerten. Um 3'-Endsequenzen zu erhalten, wurde die EST- Datenbank mit dem nichttranslatierten 3'-Bereich des Ratten-KET-Klons durchforscht. Nach Feststellung mehrerer homologer EST-Klone wurden zwei davon (I.M.A.G.E. Consortium Klon ID 149663 und 137665) vollständig sequenziert. Für die Amplifikation und direkte Sequenzierung eines 1 ,2 Kb- Fragmentes aus der menschlichen Haut-cDNA wurden PCR-Primer gemäß dem 3'-Ende des cDNA-Klons hu 10k und dem 5'-Ende des EST-Klons 149663 verwendet. Die vollständige cDNA enthält 4846 bp, einschließlich 27 bp des höchstwahrscheinlich verkürzten nichttranslatierten 5'-Bereichs und 2776 bp des nichttranslatierten 3'-Bereichs . Um die benachbarte Anordnung der aus verschiedenen Quellen gewonnenen Sequenzen zu demonstrieren, wurden PCR-Pπmer, die gemäß der Translationsstart- und -stoppkodons positioniert waren, für die Amplifikation der vollständigen Proteinkodierungssequenzen des KET von menschlicher Haut-cDNA verwendet Die cDNA enthalt einen offenen Leserahmen, der für 680 Aminosäuren kodiert (Abb 1) Dem vermutlichen Start Methionin geht ein Translationsstoppkodon (nicht dargestellt) im Raster voran Ein Vergleich der Aminosauresequenzeπ der KET von Menschen und Ratten zeigt eine 98 %-ιge Identität (Abb 1 ) Diese beachtliche interspezifische Konservierung von KET-Proteinen erstreckt sich über die gesamte Molekullange Sie ist im Mittelteil, der den DNA-Bindebereich enthalt, sogar noch ausgeprägter, 248 Aminosäuren sind völlig unverändert Die KET-Proteine sind weitaus konservierter als die entsprechenden p53-Proteιne vom Menschen und von Ratten, die zu insgesamt 79 % homolog sind Lediglich im DNA-Bindebereich erreicht ihre Identität 91 % Menschliches p73 zeigt eine Identität von insgesamt 58 % mit menschlichem KET Die Konservierung ist wiederum im DNA- Bindebereich mit einer Identität von 86 % am höchsten, wahrend der N-terminale Bereich, mit Ausnahme des Transaktivierungsbereichs, am meisten abweicht Außer dem Transaktivierungs- und dem DNA-Bindebereich weisen p53, p73 und KET einen gut erhaltenen Oligomensationsbereich gemeinsam auf Es ist wahrscheinlich, daß die drei Proteine in der Lage sind, Mischoligomere zu bilden, die spezifische biologische Funktionen haben
Bei Proteinen, die aus funktioneilen Gründen keine Veränderung tolerieren können, wie solche, die Mehrfachbindesteilen aufweisen, sind Ammosauresequenzen im allgemeinen so gut erhalten, wie das bei KET vom Menschen und von Ratten zu beobachten ist Diese Konservierung laßt vermuten, daß KET ein evolutionäres altes Gen sein kann, das wahrscheinlich bei der Entwicklung und Differenzierung höherer wirbelloser Tiere und Wirbeltiere in die allgemeinen Grundfunktionen einbezogen wurde p53 kann sich spater von seinem Vorlaufergen als Protein weiterentwickelt haben, das für spezifische Funktionen wie die Überwachung von Genomschaden verantwortlich ist Der Umfang der genotoxischen Belastung hangt von physiologischen Faktoren und Umweltfaktoren ab, die, zumindest teilweise bei den verschiedenen Arten unterschiedlich sind So kann die relative Vielgestaltigkeit von p53, im Vergleich zu KET, die artspezifischen Anforderungen an ein solches System widerspiegeln Für das Kartierungsverfahren auf der Grundlage von PCR wurden STS vom Menschen (hKET8) und zwei KET STS von Mausen (muKET8 und muKET)) amplifiziert (s Tab 1 )
Die Pπmerpositioneπ wurden so definiert, daß Fragmente entstanden sind, die ein Intron, flankiert von Exonsequenzen, enthalten Das ermöglichte die Identifizierung richtiger PCR-Fragmente durch einen Vergleich mit der bekannten KET-cDNA-Sequenz von Ratten Speziell für die Kartieruπg des Ket-Gens von Mausen haben wurden intronhaltige PCR-Fragmente gewählt, um nach einer Restriktion mit geeigneten Endonucleasen leicht nachweisbare Fragment- Laπgen-Polymorphismen zu erhalten Die Exoπ-Introπ-Grenzen wurden durch einen Vergleich der KET-Aminosaurensequenz mit der von p53 und p73 (Schmale und Bamberger, 1997, Kaghad et al, 1997) abgeleitet Die Exonsequenzen entsprachen der KET-Aminosaurensequenz des Menschen (Abb 1) wie folgt hKET9, Aminosaurereste 360-390, muKETδ, Aminosaurereste 360 - 400, muKET9, Aminosaurereste 383 - 438 PCRs wurden, wie bereits beschrieben (Lengeling et al, 1995), durchgeführt Nukleotidsequenzen von Pπmem für den Mit-Mikrosatellitenmarker D16Mιt57 wurden aus der MIT- Mausgenomdatenbaπk gewonnen Maussegregationsdaten wurden mit dem GENE-LINK Computerprogramm (Montagutelli, 1990) verarbeitet hKETδ, das Intron 8 umfaßt, wurde mittels der GeneBridge 4
Strahlungshybndkartierungspanels kartiert (Research Genetics, Huntsville, AL) Dieses Panel stellt 91 Strahlungshybπdklone des gesamten Humangenoms dar Das KET-Gen wurde am Humanchromosom 3q27 zwischen den Mikrosatellitenmarkem D3S1580 und D3S1314 kartiert (Abb 2A) Die wahrscheinlichste Genreihenfolge und -abstände waren D3S1580 - 2,2 cR - Wl- 6145 - 7, 1 cR - KET - 4,7 cR - W/1189 - 8,9 CR - D3S1314 Dieser Bereich ist von Somatostatm-, SST (O'Hara et al, 1988) und Apolipoprotein D, APOD (Warden et al, 1992) flankiert Informationen über die chromosomale Lokalisierung von SST und APOD und die Genreihenfolge wurden der Chromosomen 3-Karte entnommen (San Antonio Genome Center, http //genome uthcsa edu/Maps/frame html)
3q27 ist der mittlere Teil eines Bereich einer gut dokumentierten Syntenie zum Mauschromosom 16, der sich von CLCN2 nach GAP43, bzw Clc2 nach Gap43 im Mausgenom erstreckt (DeBry und Seidin, 1996 Lengeling et al, 1995) Um y
festzustellen, ob der Maus-Ket-Locus in den homologen Bereich fällt, erfolgte eine Kartierung des Ket-Gens unter Verwendung einer Interspeziesrückkreuzung der Maus (C57BL/6J wrl + xSEG/1 +/+)*Fι wrl/+ x (C57BL/6J wrl+), die ursprünglich für die Kartieruπg des 1/Voόb/er-Gens etabliert wurde (Kaupmann et al, 1992). Dieses Interspeziesrückkreuzungspanel wurde für über 150 Loci charakterisiert, die über alle Autosome und die X-Chromosomen verteilt waren. Es wurde eine verbesserte Karte des Chromosoms 16 für die Kartierung des Chloridkanalgens Clc2 geschaffen (Lengeling et al, 1995). Beide Maus-KET- PCR-Fragmente lieferten informative Restriktionsfragmentlängenvarianten (RFLVs), die für die Segregationsanalyse verwendet wurden. Das Fragment mit Intron 8 (muKETδ) wurde mit Msp1 geschnitten, muKET9 mit Rsa1. KET wurde zwischen Smst und D16MH63 entdeckt mit Lodserves > 8 (Abb. 2B.C). Das Maushomologe des menschlichen Apolipoproteins D, Apod, der Genmarker an menschlichem Chr 3q eng verbunden distal zu KET, wurde im M. musculus x M. Spretus Rückkreuzungspanel nicht kartiert, jedoch sind detaillierte Kartierungsdaten verfügbar (Reeves und Cabin, 1997; Warden et al, 1992; Reeves et al, 1997). Es wurde D16MH 57 kartiert, das distal zu Apod (Reeves und Cabin, 1997) angeordnet ist und einen Polymorphismus von Fragmentlänge zwischen dem M. musculus C57BU6J (111 bp) und M. spretus SEG/1 (135 bp) nutzt. Bei 50 Meiosen wurde keine Rekombination von Ket und D16MH57 festgestellt. Auf der Rückkreuzungstafel von M. musculus x M. spretus waren die wahrscheinlichsten Genreihenfolge und -abstände Cen - D16MH87 - 3,9 + 1 ,7 cM - Smst, D16MÜ102 - 4 ± 2,77 cM - Ket, D16Mit 57 - 14 ± 4,91 cM - D16MH63.
Der Verlust des langen Arms von Chromosom 3 wird selten festgestellt (vgl. Chitayat et al, 1996). Die Symptome mit Eliminierungen 3q27→-qter unterscheiden sich erheblich und reichen nicht aus, um ein spezifisches Syndrom abzuleiten. Während in zwei Fällen lediglich kleinere faziale Abnormitäten, Verzögerungen in der Entwicklung und Hypotonien berichtet wurden, zeigten andere ernsthafte, mehrfache kongenitale Abnormitäten, einschließlich Anophtahlmie und Himathrophie.
In einigen Humankrebsgeweben (z.B. ösophagealem Krebs und squamöse Karzinomen) wurden LOH-Bereiche an Chr 3 entdeckt, die 3q27 enthielten (Sato et al, 1994; Wang et al, 1996). Obwohl statistisch von Bedeutung, war ein Verlust von 3q, der im Vergleich zu anderen chromosomalen Abnormitäten mit einer relativ geringen Häufigkeit auftrat, bei diesen Tumoren zu beobachten. Vergleichende Kartierungsdateπ zeigten Bereiche einer völlig erhaltenen Syntenie zwischen Chr 3q und den Mauschromosomen 3, 9 und 16 (vgl. DeBry und Seidin, 1996), wovon zwei die vorhergesagten Suppressorgene Loh1 und Loh2 beherbergen, die auf ausgeprägten Stufen der Tumorentwicklung in einem transgenen Mausmodell des Inselzellkarzinoms (Dietrich et al, 1994; Parangi et al, 1995; Shi et al, 1997) deletiert werden. Das Ket-Gen fällt in den gleichen LOH- Bereich mit Loh2 (LOH etwa 15 cM, 14-29 cM von Ceπ, flankiert durch die Mikrosatellitenmarker D16MH35 und D16Mit39; (vgl. Parangi et al, 1995). Von Loh2 wird angenommen, daß es einen Suppressor der Angiogenese (Parangi et al, 1995) kodiert. Tatsächlich wurde gezeigt, daß das Protein p53 die Angiogenese in Fibroblasten indirekt hemmt durch die positive Regulierung der Thrombospondin-1 -Expression (Dameron et al, 1994). Daher ist Ket ein Kandidat für Loh2 durch seine chromosomale Lokalisierung und durch seine putative Funktion.
Tabelle 1
PCR Primer für STS aus den KET/Ket Regionen
STS Sequenz (5'→3'l Größe (bp) Temperierung Referenz
hKET8 CAGAAAGCAGCAAGTTTCGGAC 750 55°C
TGGATGTCATCTGGATACCATG
muKETδ CAGAAAGCAGCAAGTTTCGGAC 2.300 65°C
AGCTCATCATCTGGGGATCTCC
muKET9 ACACGGAATCCAGATGACTTCC 3.100 65°C
TGCTGCCTGTACGTTTCGATCG
D16Mit57 AAAAAATTTTAAACCATGTGAATGT 1 1 1 63°C MIT
TGAAGTTTAπATGAGTTGAATCATGC 135°
Größe des Amplifizierungsproduktes mit C57BU6J DNA; α(SEG/r Zitierte Referenzen
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Claims

Patentansprüche
1. KET-kodierende Nukleinsäuren, Fragmente, Varianten und Mutationen.
2. KET-Nukleinsäuren nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch die KET-cDNA der Ratte mit der Sequenz SEQ ID No. 1 sowie deren Fragmente, Varianten und Mutationen.
3. KET-Nukleinsäuren nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch die humane KET-cDNA mit der Sequenz SEQ ID No. 2 sowie deren Fragmente, Varianten und Mutationen.
4. KET-Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß T durch U ausgetauscht ist.
5. KET-Nukleinsäuren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie vollständig komplementär ist.
6. Polypeptide, für die KET-Nukleinsäuren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 kodieren.
7. Polypeptide nach Anspruch 6 gekennzeichnet durch die SEQ ID No. 3 sowie deren an einer oder mehreren Stellen durch Austausch von Aminosäuren geänderte Strukturen.
8. Vektoren, die eine KET-Nukleinsäure oder für KET-Polypeptide kodierende DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 5 enthalten.
9. Wirtszellen, die die Vektoren gemäß Anspruch 8 enthalten.
10. Verwendung von KET-Nukleinsäure oder Polypeptiden nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zum Nachweis von KET-Nukieinsäuren in biologischen Proben.
11.Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man eine biologische Probe mit mindestens einer Verbindung dieser Nukleinsäuren, vorzugsweise mit den Verbindungen der SEQ ID No. 1 , SEQ ID No. 2 und/oder SEQ ID No. 3, ggf. mit einem Trägermolekül nach an sich üblichen Methoden in Kontakt bringt und der Nachweis anhand des gebildeten Hybridisationskomplexes durch physikalische oder chemische Methoden erfolgt.
12. Verwendung nach Anspruch 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, daß die Nukieinsäure DNA ist, die ggf. eine homozygotische Deletion enthält.
13. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukieinsäure RNA ist.
14. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukieinsäure markiert ist, vorzugsweise durch ein Radioisotop, eine bioiumineszeπte, eine chemilumineszente oder fluoreszente Verbindung, ein Metallchelat oder ein Enzym.
15. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe Tumorgewebe mit erfolgter Angiogenese des Menschen oder der Maus ist.
16. Verwendung von KET-Nukieinsäuren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zum Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit des menschlichen Chromosoms 3q27 oder dessen Fragmenten anhand des Hybridationsproduktes zwischen chromsomaler DNA und der KET-Nukleinsäure.
17. Verwendung von KET-Nukieinsäuren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 zum Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit des Mauschromosoms 16 oder dessen Fragmenten anhand des Hybridationsproduktes zwischen chromsomaler DNA und der KET-Nukleinsäure.
18. Testkit zum Nachweis oder Veränderungen von KET-Nukieinsäuren enthaltend
- mindestens eine KET-Nukleinsäure oder ein Polypeptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 oder eine Hybridisationsprobe.
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