EP1007107A2 - Verfahren zum transport molekularer substanz in vorgegebene bereiche eukaryontischer zellen - Google Patents

Verfahren zum transport molekularer substanz in vorgegebene bereiche eukaryontischer zellen

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EP1007107A2
EP1007107A2 EP99939916A EP99939916A EP1007107A2 EP 1007107 A2 EP1007107 A2 EP 1007107A2 EP 99939916 A EP99939916 A EP 99939916A EP 99939916 A EP99939916 A EP 99939916A EP 1007107 A2 EP1007107 A2 EP 1007107A2
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EP
European Patent Office
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molecular substance
vehicle according
protein
pentamer
vehicle
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP99939916A
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English (en)
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Inventor
Wolf Bertling
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November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Original Assignee
November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
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Publication date
Application filed by November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin filed Critical November AG Novus Medicatus Bertling Gesellschaft fuer Molekular Medizin
Publication of EP1007107A2 publication Critical patent/EP1007107A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/22011—Polyomaviridae, e.g. polyoma, SV40, JC
    • C12N2710/22022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Definitions

  • the invention relates to a method for producing a vehicle and a vehicle for transporting molecular substance, such as DNA, RNA, protein, PNA, drugs of lipophilic and lipophobic character, into the cell nucleus of a eukaryotic cell.
  • molecular substance such as DNA, RNA, protein, PNA, drugs of lipophilic and lipophobic character
  • the object of the invention is to eliminate the disadvantages of the prior art.
  • a method for producing a vehicle and a vehicle for transporting molecular substance are to be specified, with which a targeted transport of the molecular substance into a predetermined region, for example the cell nucleus, of a eukaryotic cell can be carried out.
  • a method for producing a vehicle for the transport of molecular substance into the cell nucleus of a eukaryotic cell wherein at least one viral protein is modified so that it is specific for transport into the cell nucleus, and wherein the modified viral Protein is coupled or associated with the molecular substance.
  • Molecular substance is understood here to mean, for example, DNA, RNA, protein, PNA, medicinal substances lipophilic and lipophobic character.
  • the method according to the invention has the advantage that it allows the molecular substance to be transported in a specific area within a eukaryotic cell. This enables a gentle and particularly effective influencing of cell functions. With low doses of molecular substance, a highly efficient, e.g. molecular therapeutic effect can be achieved.
  • An amino-terminal section of the viral protein is advantageously modified, it being possible for at least one, preferably six, histidine residues to be coupled thereto.
  • Polylysine and / or polyasparagine and / or polyarginine can also be coupled to the amino terminal section.
  • a cell-type or differentiation-specific enzyme preferably telomerase
  • telomerase can be used as the molecular substance. Active telomerase has been demonstrated in carcinoma and leukemia. It appears that the teleomerase is normally repressed and is only activated in the case of malignant transformations. The life of the cell can be influenced in a targeted manner by transferring telomerase into the cell nucleus using the method according to the invention.
  • An enzyme preferably for substitution in the case of lysosomal diseases, preferably in the case of mucopolysaccharidosis, preferably Sanfilippo disease, and / or a protein, preferably an antibody, can also be used.
  • a peptide can be used for immunization, in particular for T cell-specific immunization.
  • Bone Morphogenic Protein-6 (BMP-6) or a mutant or a modification thereof can also be considered as a molecular substance. Conveniently, as a molecular substance
  • Transcription factor preferably NFKB, can be used.
  • NFKB is an inducible transcription factor that is activated in many different cells in response to a number of stressful situations. It is taken up into the cell nucleus via a translocation signal. NFKB leads to the rapid induction of genes that are responsible for an early defense or inflammatory response. NFKB also plays a role in the regulation and differentiation of proteins.
  • PNA phosphorothionate-derivatized oligonucleotide
  • a chimeric from PNA and DNA or a DNA-peptide complex is also conceivable.
  • the vehicle is expediently designed such that it can be introduced into a specific cell type, preferably into chondrocytes.
  • the viral protein can advantageously be synthesized, purified and isolated.
  • the viral protein can then be complexed with the molecular substance.
  • the molecular substance can also be a viral or a non-viral, preferably having a liposome, transfer system.
  • the viral protein is Virus Protein 1 (VP1) of a papovavirus, preferably of polyavirus.
  • the VP1 can be a component of a VPl pentamer, the molecular substance expediently being coupled to or associated with one side of the VPl pentamer and / or being enclosed in a capsid or a capsid-like structure using at least one further capsomer, so that one side corresponds to the inside of the capsid or the capsid-like structure.
  • the inclusion of the molecular substance in a capsid brings about an improved absorption of molecular substance into the cell.
  • the capsid-like structure can comprise at least one virus protein 2 (VP2) and / or virus protein 3 (VP3) and / or proteins derived and / or modified from the VP2 or VP3.
  • VP2 virus protein 2
  • VP3 virus protein 3
  • proteins derived and / or modified from the VP2 or VP3 it is also possible for the molecular substance to be coupled via the N-terminal end of VP2 or VP3 or a fragment thereof and for the C-terminal end to bind to the inside of the VP1 pentamer.
  • the aforementioned measures increase the stability of a construct formed from the molecular substance and the modified VP1.
  • a structure of the VPl pentamer which interacts with the molecular substance for coupling or association expediently comprises groups which increase affinity, such as 4-iodoacetamido-salicylic acid and / or p-arsonic acid-phenyldiazonium fluoroborate and / or derivatives thereof.
  • the structure which interacts with the molecular substance can be formed in particular by epitopes of the VP1 pentamer.
  • a vehicle for the transport of molecular substance into the cell nucleus of a eukaryotic cell, at least one viral protein being modified so that it is specific for the transport into the cell nucleus, and the modified viral protein with the molecular substance is coupled or associated.
  • the vehicle has the advantage that it allows molecular substance to enter predetermined areas of eukaryotic cells, especially in the cell nucleus can be transported. Because of the targeted transport, smaller amounts of molecular substance can be used.
  • the use of the vehicle according to the invention enables highly effective molecular therapy.
  • FIG. 1 shows a light micrograph of cells which have been treated with a modified VPI oligonucleotide construct
  • FIG. 3 shows a light micrograph of cells which have been treated with an unmodified VP1 oligonucleotide construct
  • FIG. 1 shows an optical micrograph of cells which have been treated with a construct composed of modified VP1 and fluorose isothiocyanate-labeled oligonucleotide.
  • ZK denotes the cell nucleus
  • ZM the cell membrane
  • ZY the cytoplasm a of a cell Z.
  • the fluorescence-labeled oligonucleotide is clearly enriched in the cell nucleus ZK.
  • VPl is called "His Day” was used.
  • the "His tag” is an artificial sequence consisting of six histidine residues, which is coupled to the amino-terminal end of VP1.
  • FIG. 2 shows an optical micrograph of cells which have been treated with fluorescence-labeled oligonucleotide. No specific enrichment of the oligonucleotide is discernible.
  • FIG. 3 shows an optical micrograph of cells which have been treated with a construct consisting of unmodified VP1 and fluorescence-labeled oligonucleotide. It can be seen that when non-modified VP1 is used, the oligonucleotide is distributed significantly more unspecifically in cell Z. The oligonucleotide is enriched both in the cytoplasm ZY and in the nucleoli N located in the cell nucleus ZK.
  • FIG. 4 shows a light micrograph of cells which have been treated with fluorescence-labeled oligonucleotide. As in FIG. 2, it can also be seen here that no specific enrichment of the oligonucleotides can be determined.
  • the cell uptake of the capsids loaded with oligonucleotides with His tag or without His tag was tested in embryonic mouse fibroblasts, namely NIH 3T3 cells. For this, the loading mixture was incubated for 1 hour at 37 ° C., then replaced with 500 ⁇ l of new cell culture medium, for 3
  • the NIH 3T3 cells used for the loading batch were fixed with methanol. The later examination was carried out in a confocal laser scanning microscope. For this purpose, the membranes of the NIH 3T3 cells were stained with concanavalin A labeled with rhodamine.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Vehikels zum Transport von molekularer Substanz in den Zellkern (ZK) einer eukaryontischen Zelle (Z), wobei mindestens ein virales Protein modifiziert wird, so daß es spezifisch für den Transport in den Zellkern (ZK) ist, und wobei das modifizierte virale Protein mit der molekularen Substanz gekoppelt oder assoziiert wird.

Description

Verfahren zum Transport molekularer Substanz in vorgegebene Bereiche eukaryontischer Zellen
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Vehikels sowie ein Vehikel zum Transport von molekularer Substanz, wie DNA, RNA, Protein, PNA, Arzneistoffe lipophilen und lipophoben Charakters, in den Zellkern einer eukaryonti- schen Zelle.
Aus der WO 97/43431 ist es bekannt, molekulare Substanz zum Transport in eukaryontische Zellen mit einem von einem Virus abgeleiteten oder stammenden Kapsomer zu koppeln. Mit einem solchen Konstrukt kann die molekulare Substanz mit einer ho- hen Aufnahmerate in eukaryontische Zellen transportiert werden. Nachteiligerweise ist es mit einem solchen Konstrukt allerdings nicht möglich, die molekulare Substanz gezielt in den Zellkern zu transportieren.
In Braun, H. et al., Biotechnol. Appl . Bioche . (1999) 29, 31-43 ist die Möglichkeit der Verpackung von Oligonulkleoti- den und Plasmid-DNA in virusähnliche Partikel von Polyoma beschrieben. Die beschriebenen Partikel erlauben ebenfalls nur einen unspezifischen Transport.
Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile des Stands der Technik zu beseitigen. Insbesondere sollen ein Verfahren zur Herstellung eines Vehikels sowie ein Vehikel zum Transport von molekularer Substanz angegeben werden, mit denen ein ge- zielter Transport der molekularen Substanz in einen vorgegebenen Bereich, z.B. den Zellkern, einer eukaryontischen Zelle durchführbar ist. Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 und 24 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 23 und 25 bis 46.
Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Vehikels zum Transport von molekularer Substanz in den Zellkern einer eukaryontischen Zelle vorgesehen, wobei mindestens ein virales Protein modifiziert wird, so daß es spezifisch für den Transport in Zellkern ist, und wobei das modi- fizierte virale Protein mit der molekularen Substanz gekoppelt oder assoziiert wird.
Unter molekularer Substanz wird hier bespielsweise DNA, RNA, Protein, PNA, Arzneistoffe lipophilen und lipophoben Charak- ters verstanden.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat den Vorteil, daß damit die molekulare Substanz in einen vorgegebenen Bereich innerhalb einer eukaryontischen Zelle gezielt transportiert werden kann. Das ermöglicht eine schonende und besonders wirkungsvolle Beeinflussung von Zellfunktionen. Es kann mit geringen Dosen an molekularer Substanz eine hocheffiziente, z.B. molekulartherapeutische Wirkung, erzielt werden.
Vorteilhafterweise wird ein aminoterminaler Abschnitt des vi- ralen Proteins modifiziert, wobei daran mindestens ein, vorzugsweise sechs, Histidin-Rest/e gekoppelt werden kann/können. An den aminoterminalen Abschnitt kann auch Po- lylysin und/oder Polyasparagin und/oder Polyarginin gekoppelt werden. Mit einer Kopplung von Histidin-Resten an den aminoterminalen Abschnitt, insbesondere das aminoterminale Ende von VP1, wird ein besonders effizienter Transport der rαoleku- laren Substanz in den Zellkern eukaryontischer Zellen erreicht.
Als molekulare Substanz kann ein zelltyp- oder differenzie- rungsspezifisches Enzym, vorzugsweise Telomerase verwendet werden. Eine aktive Telomerase ist bei Karzinomen und bei Leukämien nachgewiesen worden. Es scheint, daß die Teleomera- se normalerweise reprimiert ist und erst bei malignen Transformationen aktiviert wird. Durch einen Transfer von Telome- rase unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens in den Zellkern kann die Lebensdauer der Zelle gezielt beeinflußt werden.
Es kann auch ein Enzym, vorzugsweise zur Substitution bei ly- sosomalen Erkrankungen, vorzugsweise bei Mukopolysacharidose, vorzugsweise der Sanfilippo-Krankheit, und/oder ein Protein, vorzugsweise ein Antikörper verwendet werden. Des weiteren kann ein Peptid zur Immunisierung, insbesondere zur T- zellspezifischen Immunisierung, verwendet werden. Weiterhin als molekulare Substanz kommt das Bone Morphogenic Protein-6 (BMP-6) oder eine Mutante oder eine Modifikation davon in Betracht. Zweckmäßigerweise kann als molekulare Substanz ein
Transkriptionsfaktor, vorzugsweise NFKB, verwendet werden.
NFKB ist ein induzierbarer Transkriptionsfaktor, der in vielen unterschiedlichen Zellen als Antwort auf eine Reihe von Streßsituationen aktiviert wird. Es wird über ein Transloka- tionssignal in den Zellkern aufgenommen.NFKB führt zu einer schnellen Induktion von Genen, die für eine frühe Abwehr bzw. Entzündungsreaktion verantwortlich sind. Außerdem spielt NFKB eine Rolle bei der Regulierung und Differenzierung von Proteinen. Auch die Verwendung eines phosphorothionatderivatisierten Oligonukleotids, PNA, eines Chimärs aus PNA und DNA oder eines DNA-Peptid-Komplexes ist denkbar. Es wird in diesem Zu- sammenhang auf Braun, H. et al., Biotechnol. Appl. Biochem. (1999) 29, 31-43 verwiesen, in der das Einschleusen von Oli- gonukleotiden in die Zelle beschrieben ist. Der Inhalt der vorgenennten Veröffentlichung wird hiermit einbezogen.
Zweckmäßigerweise ist das Vehikel so ausgebildet, daß es in einen spezifischen Zelltyp, vorzugsweise in Chondrozyten, einschleusbar ist.
Das virale Protein kann vorteilhafterweise synthetisiert, aufgereinigt und isoliert werden. Sodann kann das virale Protein mit der molekularen Substanz komplexiert werden. Beim der molekularen Substanz kann es sich auch um ein virales oder ein nicht-virales, vorzugsweise Liposomen aufweisendes, Transfersystem handeln.
Als besonders vorteilhaft wird es angesehen, daß das virale Protein das Virus Protein 1 (VP1) eines Papovavirus, vorzugsweise des Polyo avirus, ist. Nach einem Ausgestaltungsmerkmal kann das VP1 Bestandteil eines VPl-Penta ers sein, wobei die molekulare Substanz zweckmäßigerweise an eine Seite des VPl- Pentamers gekoppelt oder damit assoziiert wird und/oder unter Verwendung mindestens eines weiteren Kapsomers in ein Kapsid oder ein kapsidartiges Gebilde eingeschlossen wird, so daß die eine Seite der Innenseite des Kapsids oder des kapsidar- tigen Gebildes entspricht. - Insbesondere der Einschluß der molekularen Substanz in ein Kapsid bewirkt eine verbesserte Aufnahme von molekularer Substanz in die Zelle. Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, die molekulare Substanz über bifunktionelle Gruppen an auf der einen Seite des VPl- Pentamers befindliche Cystein-Reste zu binden. Das kapsidar- tige Gebilde kann mindestens ein Virus-Protein 2 (VP2) und/oder Virus-Protein 3 (VP3) und/oder vom VP2 oder VP3 abgeleitete und/oder modifizierte Proteine umfassen. Es ist aber auch möglich, daß die Kopplung der molekularen Substanz über das N-terminale Ende von VP2 oder VP3 oder ein Fragment davon erfolgt und das C-terminale Ende an die Innenseite des VPl-Pentamers bindet. - Die vorgenannten Maßnahmen erhöhen die Stabilität eines aus der molekularen Substanz und dem modifizierten VP1 gebildeten Konstrukts.
Durch Zugabe bifunktioneller Kopplungsreagenzien kann eine kovalente Bindung zwischen dem viralen modifizierten Protein und dem Oligonukleotid gefördert werden. Eine mit der molekularen Substanz zur Kopplung oder zur Assoziierung in Wechselwirkung tretende Struktur des VPl-Pentamers umfaßt zweckmäßigerweise affinitätserhöhende Gruppen, wie 4-Iodoacetamido- salicylsäure und/oder p-Arsonsäure-phenyldiazonium-fluoro- borat und/oder Derivate davon. Die mit der molekularen Substanz in Wechselwirkung tretende Struktur kann insbesondere durch Epitope des VPl-Pentamers gebildet sein.
Nach weiterer Maßgabe der Erfindung ist ein Vehikel zum Transport von molekularer Substanz in den Zellkern einer eukaryontischen Zelle vorgesehen, wobei mindestens ein virales Protein so modifiziert ist, daß es spezifisch für den Transport in den Zellkern ist, und das modifizierte virale Protein mit der molekularen Substanz gekoppelt oder assoziiert ist.
Das Vehikel hat den Vorteil, daß damit molekulare Substanz in vorgegebene Bereiche eukaryontischer Zellen, insbesondere in den Zellkern transportiert werden kann. Wegen des zielgerichteten Transports können geringere Mengen an molekularer Substanz eingesetzt werden. Die Anwendung des erfindungsgemäßen Vehikels ermöglicht eine hochwirksame Molekulartherapie.
Die in bezug auf die verfahrensseitige Lösung beschriebenen Ausgestaltungsmerkmale sind auf das Vehikel gleichermaßen übertragbar.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und Darstellungen näher beschrieben. Es zeigen:
Fig. 1 eine lichtmikroskopische Aufnahme von Zellen, welche mit einem modifizierten VPl-Oligonukleotid- Konstrukt behandelt worden sind,
Fig. 2 eine lichtmikroskopische Aufnahme von Zellen, welche mit Oligonukleotiden behandelt worden sind,
Fig. 3 eine lichtmikroskopische Aufnahme von Zellen, welche mit einem nicht modifizierten VP1- Oligonukleotid-Konstrukt behandelt worden sind und
Fig. 4 eine lichtmikroskopische Aufnahme von Zellen, wel- ehe mit Oligonukleotiden behandelt worden sind.
Fig. 1 zeigt eine lichtmikroskopische Aufnahme von Zellen, welche mit einem Konstrukt aus modifiziertem VPl und Fluore- seeinisothiozyanath-markiertem Oligonukleotid behandelt wor- den sind. Mit ZK ist der Zellkern, mit ZM die Zellmembran und mit ZY das Zytoplas a einer Zelle Z bezeichnet. Im Zellkern ZK ist deutlich erkennbar das fluoreszenzmarkierte Oligonukleotid angereichert. In diesem Fall ist VPl mit einem söge- nannten "His-Tag" benutzt worden. Bei dem "His-Tag" handelt es sich um eine aus sechs Histidin-Resten bestehende artifi- zielle Sequenz, welche an das aminoterminale Ende von VPl gekoppelt ist.
Fig. 2 zeigt eine lichtmikroskopische Aufnahme von Zellen, welche mit fluoreszenzmarkiertem Oligonukleotid behandelt worden sind. Es ist keine spezifische Anreicherung des Oligo- nukleotids erkennbar.
Fig. 3 zeigt eine lichtmikroskopische Aufnahme von Zellen, welche mit einem aus nicht modifiziertem VPl und fluoreszenzmarkiertem Oligonukleotid bestehenden Konstrukt behandelt worden sind. Es ist erkennbar, daß bei der Verwendung von nicht modifiziertem VPl das Oligonukleotid deutlich unspezifischer in der Zelle Z verteilt ist. Das Oligonukleotid ist sowohl im Zytoplasma ZY als auch in im Zellkern ZK befindlichen Nukleoli N angereichert.
In Fig. 4 ist eine lichtmikroskopische Aufnahme von Zellen gezeigt, welche mit fluoreszenzmarkiertem Oligonukleotid behandelt worden sind. Wie in Fig. 2 zeigt sich auch hier, daß keine spezifische Anreicherung der Oligonukleotide feststellbar ist.
Beispiel ;
Für die in den Fig. 1 bis 4 gezeigten Ergebnisse wurden re- kombinant exprimierte (E.coli), in vitro assemblierte, leere Polyoma VPl-Kaspide benutzt. Zur Herstellung dieser VP1- Kapside wurden sowohl VPl-Proteine mit His-Tag als auch VP1- Proteine ohne His-Tag verwendet. Der verwendete His-Tag ist im weiter unten gezeigten Sequenzprotokoll wiedergegeben. Zur Beladung lagen die VPl-Kapside in einem Puffer mit folgender Zusammensetzung vor: 10 mM Natriumacetat, 150 mM Natriumchlorid, 5 % Glyerol (pH-Wert = 5) . Es wurde Fluorescei- nisothiocyanat-markierte Oligonukleotide eingesetzt. Die in vitro Einführung der Oligonukleotide in die VPl-Kapside mit His-Tag bzw. ohne His-Tag wurde mittels eines osmotischen Verfahrens durchgeführt (Barr S.M., Keck K., Aposhian H.V., 1979, Cell-free assembly of a polyoma-like particle from emp- ty capside and DNA, Virology 96(2); 656-659). Das molare Verhältnis von VPl-Kapsid zu Oligonukleotid betrug 1 zu 439,3.
Zu 95 μl der VPl haltigen Lösung wurden 5 μl der fluoreszenzmarkierten Oligonukleotid-Lösung zugesetzt. Diese Lösung wur- de für 20 Minuten bei 37 °C inkubiert. Der osmotische Schock erfolgte durch Zugabe von 350 μl destillierten Wassers und erneuter Inkubation für 40 Minuten bei 37 °C. Für die Zellaufnahme wurde der Wasseranteil des Beladungsansatzes mit Manni- tol isotonisiert .
Die Zellaufnahme der mit Oligonukleotiden beladenen Kapside mit His-Tag bzw. ohne His-Tag wurde in embryonalen Mausfi- broblasten, nämlich NIH 3T3-Zellen getestet. Dazu wurde der Beladungsansatz für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert, im Anschluß daran durch 500 μl neues Zellkulturmedium ausgetauscht, für 3
Stunden bei 37 °C inkubiert und erneut durch 500 μl neues Zellkulturmedium ersetzt. Nach einer Gesamtinkubationszeit von 24 Stunden bei 37 °C wurden die für den Beladungsansatz verwendeten NIH 3T3-Zellen mit Methanol fixiert. Die spätere Betrachtung erfolgte im konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop. Dazu wurden die Membranen der NIH 3T3-Zellen mit Rhodamin markiertem Concanavalin A gegengefärbt. Bezugszeichenliste
Z Zelle
ZK Zellkern
ZM Zellmembran
ZY Zytoplasma
N Nukleoli
SEQUENZPROTOKOLL
<110> november AG
<120> Verfahren zum Transport molekularer Substanz in vorgegebene Bereiche eukaryontischer Zellen
<130> 380446
<140> <141>
<160> 1
<170> Patentin Ver. 2.1
<210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Künstliche Sequenz
<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: His-Tag
<400> 1
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Ile Glu Gly Arg

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines Vehikels zum Transport von molekularer Substanz in den Zellkern (ZK) einer eukaryontischen Zelle (Z) , wobei mindestens ein virales Protein modifiziert wird, so daß es spezifisch für den Transport in den Zellkern (ZK) ist, und wobei das modifizierte virale Protein mit der molekularen Substanz gekoppelt oder assoziiert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein aminoterminaler Abschnitt des viralen Proteins modifiziert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei an den aminoterminalen Abschnitt mindestens ein, vorzugsweise sechs, Histidin-
Rest/e gekoppelt wird/werden.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei an den aminoterminalen Abschnitt Polylysin und/oder Polyasparagin und/oder Polyarginin gekoppelt wird/werden.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als molekulare Substanz ein zeiltyp- oder differenzie- rungsspezifisches Enzym, vorzugsweise Telomerase, verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als molekulare Substanz ein Enzym, vorzugsweise zur Sub- stitution bei lysosomalen Erkrankungen, vorzugsweise Mu- kopolysacharidose, vorzugsweise der Sanfilippo- Krankheit, verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als molekulare Substanz ein Protein, vorzugsweise ein Antikörper, verwendet wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als molekulare Substanz ein Peptid zur Immunisierierung, insbesondere zur T-zellspezifischen Immunisierung, verwendet wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als molekulare Substanz das Bone Morphogenic Protein-6 (BMP-6) oder eine Mutante oder eine Modifikation davon verwendet wird.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als molekulare Substanz ein Transkriptionsfaktor, vorzugsweise NFKB, verwendet wird.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als molekulare Substanz ein phosphorothionatderivati- sierte Oligonukleotid, PNA, ein Chimär aus PNA und DNA oder DNA-Peptid-Komplex verwendet wird.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Vehikel so ausgebildet ist, daß es in eine spezifischen Zelltyp, vorzugsweise Chondrozyten, einschleusbar ist.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das virale Protein synthetisiert, aufgereinigt und isoliert wird.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das virale Protein mit der molekularen Substanz komplexiert wird.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das virale Protein das Virus Protein 1 (VPl) eines Papovavirus, vorzugsweise des Polyomavirus, ist.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wo- bei das VPl Bestandteil eines VPl-Pentamers ist.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die molekulare Substanz an eine Seite des VPl- Pentamers gekoppelt oder damit assoziiert wird und/oder unter Verwendung mindestens eines weiteren Kapsomers in ein Kapsid oder ein kapsidartiges Gebildes eingeschlossen wird, so daß die eine Seite der Innenseite des Kap- sids oder des kapsidartigen Gebildes entspricht.
18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei die molekulare Substanz über bifunktionelle Gruppen an auf der einen Seite des VPl-Pentamers befindliche Cystein-Reste gebunden wird.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das kapsidartige Gebilde mindestens ein Virus- Protein 2 (VP2) und/oder Virus-Protein 3 (VP3) und/oder vom VP2 oder VP3 abgeleitete und/oder modifizierte Proteine umfaßt.
20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Kopplung der molekularen Substanz über das N- terminale Ende von VP2 oder VP3 oder ein Fragment davon erfolgt und das C-terminale Ende an die Innenseite des VPl-Pentamers bindet.
21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wo- bei durch Zugabe bifunktioneller Kopplungsreagenzien eine kovalente Bindung zwischen dem modifizierten vira- len Protein und den Oligonukleotiden erreicht wird.
22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wo- bei eine mit der molekularen Substanz zur Kopplung oder
Assozierung in Wechselwirkung tretende Struktur des VPl-Pentamers affinitätserhöhende Gruppen, wie 4- Iodoacetamido-salicylsäure und/oder p-Arsonsäure- phenyldiazonium-fluoroborat und/oder Derivate davon, umfaßt.
23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mit der molekularen Substanz in Wechselwirkung tretende Struktur durch Epitope des VPl-Pentamers ge- bildet ist.
24. Vehikel zum Transport von molekularer Substanz in den Zellkern (ZK) einer eukaryontischen Zelle (Z) , wobei mindestens ein virales Protein so modifiziert ist, daß es spezifisch für den Transport in den Zellkern (ZK) ist, und wobei das modifizierte virale Protein mit der molekularen Substanz gekoppelt oder assoziiert ist.
25. Vehikel nach Anspruch 24, wobei ein aminoterminaler Ab- schnitt des viralen Proteins modifiziert ist.
26. Vehikel nach Anspruch 25, wobei an den aminoterminalen Abschnitt mindestens ein, vorzugsweise sechs, Histidin- Rest/e gekoppelt ist/sind.
27. Vehikel nach einem der Ansprüche 24 bis 26, wobei an den aminoterminalen Abschnitt Polylysin und/oder Po- lyasparagin und/oder Polyarginin gekoppelt ist/sind.
28. Vehikel nach einem der Ansprüche 24 bis 27, wobei die molekulare Substanz ein zeiltyp- oder differenzierungsspezifisches Enzym, vorzugsweise Telomerase, ist.
29. Vehikel nach einem der Ansprüche 24 bis 28, wobei die molekulare Substanz ein Enzym, vorzugsweise zur Substi- tution bei lysosomalen Erkrankungen, vorzugsweise Muko- polysacharidose, vorzugsweise der Sanfilippo-Krankheit, ist.
30. Vehikel nach einem der Ansprüche 24 bis 29, wobei die molekulare Substanz ein Protein, vorzugsweise ein Antikörper, ist.
31. Vehikel nach einem der Ansprüche 24 bis 30, wobei die molekulare Substanz ein Peptid zur Immunisierierung, insbesondere zur T-zellspezifischen Immunisierung, ist.
32. Vehikel nach einem der Ansprüche 24 bis 31, wobei die molekulare Substanz das Bone Morphogenic Protein-6 (BMP- 6) oder eine Mutante oder eine Modifikation ist.
33. Vehikel nach einem der Ansprüche 24 bis 32, wobei die molekulare Substanz ein Transkriptionsfaktor, vorzugsweise NFKB, ist.
34. Vehikel nach einem der Ansprüche 24 bis 33, wobei die molekulare Substanz ein phosphorothionatderivatisiertes Oligonukleotid, PNA, ein Chimär aus PNA und DNA oder ein DNA-Peptid-Komplex ist.
35. Vehikel nach einem der Ansprüche 24 bis 34, wobei das Vehikel so ausgebildet ist, daß es in eine spezifischen Zelltyp, vorzugsweise Chondrozyten, einschleusbar ist.
36. Vehikel nach einem der Ansprüche 24 bis 35, wobei das virale Protein synthetisch hergestellt, aufgereinigt und isoliert ist.
37. Vehikel nach einem der Ansprüche 24 bis 36, wobei das virale Protein mit der molekularen Substanz komplexiert ist.
38. Vehikel nach einem der Ansprüche 24 bis 37, wobei das virale Protein das Virus Protein 1 (VPl) eines Papova- virus, vorzugsweise des Polyomavirus, ist.
39. Vehikel nach einem der Ansprüche 24 bis 38, wobei das VPl Bestandteil eines VPl-Pentamers ist.
40. Vehikel nach einem der Ansprüche 24 bis 39, wobei die molekulare Substanz an eine Seite des VPl-Pentamers gekoppelt oder damit assoziiert ist und/oder unter Verwendung mindestens eines weiteren Kapsomers in ein Kap- sid oder ein kapsidartiges Gebildes eingeschlossen ist, so daß die eine Seite der Innenseite des Kapsids oder des kapsidartigen Gebildes entspricht.
41. Vehikel nach Anspruch 40, wobei die molekulare Substanz über bifunktionelle Gruppen an auf der einen Seite des VPl-Pentamers befindliche Cystein-Reste gebunden ist.
42. Vehikel nach einem der Ansprüche 24 bis 41, wobei das kapsidartige Gebilde mindestens ein Virus-Protein 2 (VP2) und/oder Virus-Protein 3 (VP3) und/oder vom VP2 oder VP3 abgeleitete und/oder modifizierte Proteine umfaßt.
43. Vehikel nach einem der Ansprüche 24 bis 42, wobei die Kopplung der molekularen Substanz über das N-terminale Ende von VP2 oder VP3 oder ein Fragment davon erfolgt und das C-terminale Ende an die Innenseite des VP1- Pentamers bindet.
44. Vehikel nach einem der Ansprüche 24 bis 43, wobei durch Zugabe bifunktioneller Kopplungsreagenzien eine kova- lente Bindung zwischen dem modifizierten viralen Prote- in und den Oligonukleotiden erreicht wird.
45. Vehikel nach einem der Ansprüche 24 bis 44, wobei eine mit der molekularen Substanz zur Kopplung oder Assozie- rung in Wechselwirkung tretende Struktur des VP1- Pentamers affinitätserhöhende Gruppen, wie 4- Iodoacetamido-salicylsäure unά/oder p-Arsonsäure- phenyldiazonium-fluoroborat und/oder Derivate davon, umfaßt.
46. Vehikel nach einem der Ansprüche 24 bis 45, wobei die mit der molekularen Substanz in Wechselwirkung tretende Struktur durch Epitope des VPl-Pentamers gebildet ist.
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