EP0979094A2 - Mittel zur steigerung der herzkraft - Google Patents

Mittel zur steigerung der herzkraft

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EP0979094A2
EP0979094A2 EP98933445A EP98933445A EP0979094A2 EP 0979094 A2 EP0979094 A2 EP 0979094A2 EP 98933445 A EP98933445 A EP 98933445A EP 98933445 A EP98933445 A EP 98933445A EP 0979094 A2 EP0979094 A2 EP 0979094A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
peptide
amino acids
halc
actin
plasmid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP98933445A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ingo Morano
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Original Assignee
Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft filed Critical Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
Publication of EP0979094A2 publication Critical patent/EP0979094A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4716Muscle proteins, e.g. myosin, actin
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61PSPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to a new agent for increasing cardiac strength. Areas of application are medicine and the pharmaceutical industry.
  • Cardiac output is essential for human health and performance. Numerous heart diseases are associated with a reduction in the pumping power of the heart, which lead to considerable stress on the patient and are also one of the main causes of death. It is therefore of great interest to keep the performance of the heart at the necessary level and, if necessary, to increase it, in order to design the healthcare system effectively.
  • Myosin is a hexamer of two heavy (MHC) and 4 light chains, 2 so-called essential (MLC-1) and two regulatory (MCL-2).
  • MHC heavy
  • MLC-1 and ALC-2 essential and MCL-2
  • ALC-1 and ALC-2 atrium-specific and ALC-2
  • VLC-1 and VLC-2 ventricle-specific
  • the MHC has a molecular weight of approximately 200 kDa and consists of an amino-terminal globular domain in which the actin binding center and the catalytic (ATPase) center are located, and an approximately 150 nm long filiform carboxy-terminal domain.
  • the binding of the myosin light chain l (MLC-l) to the C-terminus of actin is necessary for the movement of the heart, but it stresses the cross bridges and therefore leads to a reduction in performance.
  • the aim of the invention is to provide a means for increasing the heart strength. It is based on the task of relieving the cross bridges and thus increasing the performance of the heart muscle.
  • Specific embodiments of the invention are agents which contain the peptides KPEPKKEAAK and KPEPKKDDAK.
  • the invention also includes agents containing peptides of the formula I or their decamers (5-14) with a mutation in the start or end position.
  • the peptide as such, ie all peptides of the general formula I, are also within the scope of the invention.
  • X and Y have the meaning given above, and especially the peptides KPEPKKEAAK and KPEPKKDDAK. In all cases, mutations are included at one point on the peptide, preferably in the initial or final position.
  • a further embodiment of the invention consists in using genes which code for these and analog peptides instead of the peptides according to the invention.
  • plasmids are also constructed that
  • Both minigenes are generated as in 1). However, not the entire cDNA of the light myosin chains is cloned into the plasmids between the heart-specific promoter and the polyadenylation signal, but only the cDNA encoding the first 15 amino acids of the hVLC-1 and hALC-1.
  • GAGATCT ( ZAGCTGGACGTCCTTAAGAGAATGATAGTTTCCCTTTGACTCAGTACGTGGAC
  • TCTATCTGCCC TCTATCTGCCC ⁇ TCGGCCCTTTGGGGAGGAGGAATGTGCCCAAGGAC ⁇ AAAAAAAGGCCC
  • GGAGGGTCC ( ⁇ GCAGATGACTCOlAATTTAGGCAGC ⁇ GGC ⁇ CGTGGAATGAGCTATAAAG
  • GGGCI AGOSCTGAGAGCTGTC ⁇ GAC SAGATTTCTCCATCCC ⁇ GGTAAGAAGGAGTTT
  • GTCGA f ZAATCGACCCGTTCTCCTACGGTTACCGACGTAGTTAATACTTCGGAAACAGTTC 1690 1700 1710 1720 1730 1740
  • GAAATCGG ( ⁇ AATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTT
  • a synthetic oligonucleotide of the sequence is cloned, which corresponds to the coding sequence amino acids 1-15 of hALC-1 and has the following sequence:
  • a construct is generated which, instead of the coding hALC-1 sequence in p ⁇ MHC-hALC-1, has the coding sequence of the first 15 amino acids of the hVLC-1:
  • an in vitro actin binding assay consisting of aminohexyl agarose covalently coupled to a synthetic peptide corresponding to the N-terminal actin binding domain 4-14 of VLC-1, pre-incubated with free ALC-1 or VLC-1 peptides (or the corresponding scrambled peptides) to maintain a balance between bound and free actin.
  • the equilibrium complex is then incubated with the affinity gel that binds the free G-actin.
  • the prediction was that a higher fraction of free G-actin exists in the equilibrium reaction with low affinity peptides, which can be determined by subsequent incubation with the affinity gel.
  • G-actin binds to affinity gel. This shows for the first time that the N-terminal sequence 4-14 of human cardiac VLC-1 actually reacts with actin. Pre-incubation of G-actin with the N-terminal peptide 5-14 of VLC-1 prevents actin binding to the affinity gel at a peptide concentration of approximately 1 ⁇ M. The corresponding scrambled peptide was without at the same concentration Effect, which shows that the binding of the N-terminal MLC-1 peptide is highly specific.
  • a synthetic peptide with the N-terminal sequence 4-14 (KKPEPKKDDAK) of VLC-1 was covalently coupled to an agarose gel.
  • the peptide was synthesized with an N-terminal monochloroacetylglycyl residue. This peptide was then immobilized on activated w-aminohexyl agarose via activation by 2-iminothiolane hydrochloride as described (Calovini T. et al. (1995) J. Cell Biochem. 59: 69-78).
  • the coupling reaction was carried out in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.4) within 3 hours at room temperature and a peptide concentration of 6 mg / ml packed gel.
  • the peptide-resin was then incubated with 5 ml of 40 mM iodoacetamide for 1 hour to block the remaining active groups.
  • the MLC affinity gel was washed thoroughly with PBS and stored in the presence of 1% bovine serum albumin and 0.02% sodium.
  • MLC affinity gels (15 ⁇ l of the gel) are incubated with 50 ⁇ g G-actin in a final volume of 500 ⁇ l actin buffer for 1 hour at +4 ° C. in a rotating flask. Comparative experiments are carried out by incubating different concentrations of ventricular MLC peptide 5-14 of the atrial MLC peptide 5-14 or the corresponding scrambled peptides with G-actin for 12 hours at +4 ° C before binding to the affinity gel for 1 hour at +4 ° C as above
  • REPLACEMENT BUTT (RULE 26) described, carried out. After actin binding, the gel is washed three times with actin buffer, extracted with 20 ml SDS buffer (5% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 250 mM sucrose, 75 M urea, 60 mM ⁇ -mercaptoethanol) and for 2 heated to 95 ° C for min. The supernatants obtained are further treated with SDS-PAGE while the affinity gel is discarded.
  • SDS buffer 5% SDS, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 250 mM sucrose, 75 M urea, 60 mM ⁇ -mercaptoethanol
  • Samples are separated electrophoretically on 8% polyacrylamide gels at 4 ° C for 3 hours and put on nitrocellulose (Hybond-C, 45 ⁇ m, Amersham, Germany) in a buffer containing 40 M Tris, 300 mM glycine, 0.01% SDS and Contains 20% (v / v) methanol.
  • the blots are then diluted with the monoclonal antibody against a-sarcoma actin (Sig a, Kunststoff, Germany) in a solution of 1: 500 for 90 min and the second peroxidase-conjugated antibody (anti-mouse IgG, BioGenes, Germany: 10,000) incubated for 1 hour at room temperature.
  • the 43 kDa actin band was visualized on an X-ray film using an enhanced chemiluminescence reaction kit (Amersham, Germany).
  • the synthetic peptide binds to the N-terminal VCL-1 sequence 4-14, covalently linked to aminohexyl agarose, G-actin in a time-dependent manner. At +4 ° C maximum actin binding be measured after an hour. No G-actin binding to the aminohexyl agarose matrix alone was observed under the same experimental conditions.
  • G-actin with different peptide concentrations was used for 12 hours incubated at +4 ° C before incubation with the agarose gel. Different peptide affinities should result in different fractions of unbound G-actin concentrations, which can subsequently be separated from the affinity gels and detected in the Western blot.
  • Figure la shows the time-dependent binding of G-actin to affinity gels, which appears after elution and Western blot (ECL signal).
  • a peptide corresponding to human VLC-I sequence 4-14 was covalently linked to aminohexyl agarose to bind G-actin, a, b, and c correspond to the signals after 10 min, 30 min, 60 min and 120 min.
  • Figure lb The ECL signals according to Figure la (optical density OD in comparison units) are plotted against the incubation time of the affinity gels with G-actin.
  • FIG. 2a Recovery of G-actin from affinity gels (ECL signals).
  • G-actin was incubated with various concentrations (in mol / 1) of synthetic peptides that correspond to the N-terminal domains of 5-14 (P5-14) of the atrial and ventricular myosin light chain 1 (corresponding to ALC-1 and VLC-1) ) of the human heart.
  • 1, 2, 3 and 4 correspond to 3 ⁇ M, l ⁇ M, 0.3 ⁇ M and 0, l ⁇ M peptide.
  • 5 relates to actin alone
  • 6 and 7 relates to 3 ⁇ M ALC-1 and VLC-1 scrambled peptides.
  • Figure 2b G-actin recovered from affinity gels (% of maximum ECL signal obtained without competing peptide) against various concentrations of ALC-1 (circles) and VLC-1 (fields) peptides corresponding to N-terminal domains 5-14 ( P5-14) of the human heart.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein neues Mittel zur Steigerung der Herzkraft. Anwendungsgebiete sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie. Das erfindungsgemässe Mittel ist gekennzeichnet durch ein Peptid der allgemeinen Formel (I): MAPKKPEPKKXYAK, in welcher X = E oder D und Y = A oder D bedeuten, oder Teile davon oder durch Punktmutationen an einer Stelle veränderte Varianten dieses Peptids bzw. ein Gen, das für diese und analoge Peptide kodiert. Mit dem erfindungsgemässen Mittel kann der Kontraktilitätsstatus des menschlichen Herzens verbessert werden.

Description

Mittel zur Steigerung der Herzkraft
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein neues Mittel zur Steigerung der Herzkraft. Anwendungsgebiete sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.
Die Herzleistung ist von wesentlicher Bedeutung für die Gesundheit und für die Leistungsfähigkeit des Menschen. Zahlreiche Herzerkrankungen sind mit einer Herabsetzung der Pumpleistung des Herzens verbunden, die zu erheblichen Belastungen des Patienten führen und außerdem eine der Haupttodesursachen sind. Es ist daher von großem Interesse, auch für eine effektive Gestaltung des Gesundheitswesens, die Leistung des Herzens auf dem notwendigen Stand zu halten und ggf. zu erhöhen.
Die Muskelkontraktion und die Zellbewegung des Herzens wird durch das 'Motorprotein' Myosin durch zyklische Interaktion mit Aktin und Hydrolyse von ATP bewirkt. Myosin ist ein Hexamer aus zwei schweren (MHC) und 4 leichten Ketten, 2 sog. essentielle (MLC-1) und zwei regulatorische (MCL-2). Im Humanherzen werden verschiedene Isoformen der leichten Myosinketten quasi gewebespezifisch exprimiert, nämlich atrium-spezifische (ALC-1 bzw. ALC-2) und ventrikelspezifische (VLC-1 und VLC-2). Die dreidimensionale Struktur der MHC und die Assoziation der MHC mit den MLC wurden vor kurzem aufgeklärt (Rayment et al., 1993). Die MHC hat ein Molekulargewicht von etwa 200 kDa und besteht aus einer aminoterminalen globulären Domäne, in der sich das AktinbindungsZentrum und das katalytische (ATPase-) Zentrum befinden, und einer etwa 150 nm langen fadenförmigen carboxyterminalen Domäne. Die Bindung der Myosin-Leichtkette l(MLC-l) an den C-Terminus von Aktin ist für die Bewegung des Herzens notwendig, belastet jedoch die Querbrücken und führt dadurch prinzipiell zu einer Verminderung der Leistung.
Die Erfindung hat das Ziel, eine Mittel zur Steigerung der Herzkraft zur Verfügung zu stellen. Ihr liegt die Aufgabe zugrunde, die Querbrücken zu entlasten und damit eine Leistungssteigerung des Herzmuskels zu erreichen.
Das Ziel der Erfindung wird gemäß den Ansprüchen l und 8 erreicht, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten.
Das erfindungsgemäße Mittel zur Steigerung der Herzkraft ist dadurch gekennzeichnet, daß es ein Peptid der allgemeinen Formel I
MAPKKPEPKKXYAK (I) umfaßt
in welcher X = E oder D und Y = A oder D bedeuten, oder Teile davon oder durch Punktmutationen an einer Stelle veränderte Varianten dieses Peptids.
Eine bevorzugte Variante des Mittels ist gekennzeichnet durch ein Dekamer der Sequenz
KPEPKKXYAK,
wobei X und Y die oben genannte Bedeutung haben.
Spezielle Ausführungsformen der Erfindung sind Mittel, die die Peptide KPEPKKEAAK und KPEPKKDDAK enthalten.
Zur Erfindung gehören auch Mittel, enthaltend Peptide der Formel I bzw. ihre Dekamere (5-14) mit einer Mutation in Anfangs- oder in Endstellung. Im Schutzbereich der Erfindung liegen auch die Peptid als solche, d. h. alle Peptide der allgemeinen Formel I
MAPKKPEPKKXYAK ( I )
in welcher X = E oder D und Y = A oder D bedeuten, oder Teile davon oder durch Punktmutationen an einer Stelle veränderte Varianten dieser Peptide. Bevorzugt sind Dekamere der Sequenz
KPEPKKXYAK,
wobei X und Y die oben genannte Bedeutung haben, sowie speziell die Peptide KPEPKKEAAK und KPEPKKDDAK. In allen Fällen sind Mutationen an einer Stelle des Peptids, bevorzugt in Anfangs-oder Endstellung, eingeschlossen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, anstelle der erfindungsgemäßen Peptide Gene einzusetzten, die für diese und analoge Peptide kodieren.
Neben Peptiden, welche die aminoterminalen Domänen der leichten kardialen Myosinketten imitieren werden also Plasmide konstruiert, die
- die atriale leichte Myosinkette (hALC-1) des Humanherzen und
- mindestens die ersten 15 Aminosäuren der ventrikulären leichten Myosinkette (hVLC-1/1-15) bzw. mindestens die ersten 15 Aminosäuren der atrialen leichten Myosinkette (hALC-1/1- 15) des Menschen kodieren.
Diese Konstrukte werden in gentechnologischen Experimenten eingesetzt. Die therapeutische Expression der hALC-l im Ventrikel imitiert und unterstützt den zelleigenen Anpassungsmechanismus und verbessert die Ventrikelfunktion.
In solchen gentechnologischen Ansätzen werden ferner auch die Minigene, die nur für die ersten 15 Aminosäuren der hVLC-1 bzw. hALC-1 kodieren, eingesetzt. Dies führt zur zelleigenen Produktion der Light-Chain Peptide, die dann über eine Hemmung der Aktin-Light-Chain-Interaktion die Ventrikelfunktion steigern.
Im folgenden werden dazu nähere Erläuterungen gegeben.
1) Konstrukt mit der atrialen leichten Myosinkette (hALC-1) des Humanherzen
Hierbei handelt es sich um Plasmide, in denen h-ALC-1 cDNA vor einen herzspezifischen Promoter kloniert wird. Downstream schließt sich ein Polyadenylierungssignal an.
2) Minigene, welche die ersten 15 N-terminalen Aminosäuren der h-ALC-1 und h-VLC-1 kodieren
Beide Minigene werden wie in 1) erzeugt. Allerdings wird nicht die gesamte cDNA der leichten Myosinketten in die Plasmide zwischen herzspezifischen Promoter und Polyadenylierungssignal kloniert, sondern lediglich die cDNA, welche die ersten 15 Aminosäuren der hVLC-1 und hALC-1 kodieren.
Zu 1) Beispiel für die Erzeugung des hALC-1 Konstruktes (p MHC-hALC-1)
Teile der Promoterregion der schweren alpha-Myosinkette (- 614—+-425) wurden in die Multikloningsite von pBluescript II SK kloniert. Downstream wurde eine hALC-1 cDNA dann vor den alpha-Myosinpromoter kloniert (-82 - +768) und danach ein Polyadenylierungssignal (SV40IntronpA) eingesetzt. Das Konstrukt ist schematisch (Abbildung 3) gezeigt. Es wurde bereits vollständig sequenziert (siehe Sequenz und Klonierungskarte) . CONSTRUCT : pαMHC-hALC-1
START : α-MHC PROMOTER
CTCTAGAGTCGACCTGCAGGAATTCTCTTACTATCAAAGGGAAACTGAGTCATGCACCTG
GAGATCT(ZAGCTGGACGTCCTTAAGAGAATGATAGTTTCCCTTTGACTCAGTACGTGGAC
10 20 30 40 50 60
CAAAATGAATGCCCTCCCTGGACÄTCÄTGACTTTGTCCCTGGGGAGCCÄGC1ACTGTGGAA
GTTTTACTTACGGGAGGGACCTGTAGTACTGAAACAGGGACCCCTCGGTCGTGACACCTT
70 80 90 100 110 120
CTCCAGGTCTGAGAGTAGGAGGCACCCCTCAGCCTGAAGCTGTGCAGATAGCTAGGGTGT
GAGGTCCAGACTCTCATCCTCCGTGGGGAGTCGGACTTCGACACGTCTATCGATCCCACA
130 140 150 160 170 180
AAAGGAGGGAAGGGGGGAGGCTGGAATGGGAGCTTGTGTGTTGGAGACÄGGGGA^AATA
TTTCCTCCCTTCCCCCCTCCGACCTTACCCTCGAACACACAACCTCTGTCCCCTGTTTAT
190 200 210 220 230 240
TTAGGCCTGTAAGAGAAGGTGACCCTTACCCÄGTGTGTTCAACTCAGCCTTCAGATTAAA AATCCGGACÄTTCTCTTC(^CTGGGAATGGGTCΑCÄα^GT
250 260 270 280 290 300
AATAACTAAGGTAAGGGCCATGTGGGTAGGGGAGGTGGTGTGAGACGGTCCTGTCTCTCC TTATTGATTCCÄTTCCCGGTACΑCCCATCCCCTCC^CCACÄ^
310 320 330 340 350 360
TCTATCTGCCCΆTCGGCCCTTTGGGGAGGAGGAATGTGCCCAAGGAC^AAAAAAAGGCCC
AGATAGAσGGGTAGCCGGGAAACCCCTCCTCCTTAC^CGGGTTCCriOAl^rrTl'I'CCGGG 370 380 390 400 410 420
TGGAGCCΑGAGGGGOSAGGGCΑGCÄGACCTTTCΑTGGGαy^CCTCΑGGGCTGCTGTCCT
ACCTCGGTCTCCCCGCTCCCGTCGTCTGGAAAGTACCCGTTTGGAGTCCCGACGACAGGA
430 440 450 460 470 480
CCTGTCACCTCCΆGAGCC^^GGGATCΆAAGGAGGAGGAGCCAGGACAGGAGGGATGGGAG GGACAGTGGAGGTCTCGGTTCCCTAGTTTCCTCCTCCTCGGTCCTGTCCTCCCTACCCTC
490 500 510 520 530 540
GGAGGGTCC(^GCAGATGACTCOlAATTTAGGCAGCΑGGCΑCGTGGAATGAGCTATAAAG
CCTCCCAGGσTCGTCTACTGAGGTTTAAATCCGTCGTCCGTσCACCTTACTCGATATTTC
550 560 570 580 590 600
GGGCI^AGOSCTGAGAGCTGTCΑGAC SAGATTTCTCCATCCCΑGGTAAGAAGGAGTTT
CCCGACCTCGCGACTCTCGA(^GTCTGGCTCTAAAGAGGTAGGGTC<ATTCTTCCTCAAA
610 620 630 640 650 660
AGCGTGGGGGCrCTC^^CCGCACCAGACCTGTCCCCACCTAGAGGGAAAGTGTCTTCCC
TCX3CACCCCCGAGAGGTTGGCGTGGTCTGGACAGGGGTGGATCTCCCTTTCACAGAAGGG
670 680 690 -700 710 720
TGGAAGTGGGGCTCCTCCC^CCGGCCTGGGAAGTTCTCXSGTGGCAGGATGTTTCTACTGG
ACCTTCACCCCGAGGAGGGTGGCCGGACCCTTCAAGAGCCACCGTCCTACAAAGATGACC
730 740 750 760 770 -780
ATGCCCCTTCCCT CCACTGCCTCCTCCCTCCCTTGTCTTGATTAATCTTGGCTCTTAGT
TAX^3GGAAGGGAAGGTGACGGAGGAGGGAGGGAACAGAACTAATTAGAACCGAGAATCA
790 800 810 820 830 840
GTTCΑGAAAGATTTGCCCGGTGCTGTCTACTCCÄTCTGTCTCTACTCTCTCTGCCTTGCC CAAGTCTTTCTAAACGGGCCACGACAGATGAGGTAGACAGAGATGAGAGAGACGGAACGG 850 860 870 880 890 900
TTCTTGTGTGTTCTCCTTTTCCΑCGTGTTTCT
AAGAACACACAAGAGGAAAAGGTGCACAAAGAGTGAGGTGACGGAGGGGGGGGGGAAGTA 910 920 930 940 950 960
TTTTATCCTTCCTTTCTTTCTGTGTCΑGAATGCTGσGAATC
AAAATAGGAAGGAAAGAAAGACACΑGTCTTACGACCCTTAGTTTGGGTCCCGAAGTATGT 970 980 990 1000 1010 1020
END: -MHC-
CGTC ^GTCY^GOATCTCCCΑGTGAGCCAAAGCTTAGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTC GCΆGTTCΆGTTCGTTAGAGGGTCΆCTCGGTTTCGAATCTAGGGGGCCCGACGTCCTTAAG
1030 1040 1050 1060 1070 1080 -^ START: hALC-1 PROMOTER
CGCTTCTGGGTTTCCACα lTTGGCÄAGAAGGGATCAGCCTGTCCTAGAGATCACTCCTC
GCGAAGACCCAAAGGTGGTTAACCGTTCTTCCCTAGTCGGACAGGATCTCTAGTGAGGAG
1090 1100 1110 1120 1130 1140 r^ START: hALC-1 CODING REGION
TGCCΑAAGATCCCAACAAGAα^c TGGCTCCCAAGAAGCCTGAGCCTAAGÄAGGAGGCA
ACGGTTTCTAGGGTTGTTCTGTTGTACCGAGGGTTCTTCGGACTCGGATTCTTCCTCCGT
1150 1160 1170 1180 1190 1200
GCCAAGCCAGCTCCAGCTCCAGCTCCAGCCCCTGCACCAGCCCCTGCCCCAGCTCCTGAG
CGGTTCGGTCGAGGTCGAGGTCGAGGTCGGGGACGTGGTCGGGGACGGGGTCGAGGACTC
1210 1220 1230 1240 1250 1260
GCTCCCAAGGAACCTGCCTTTGACCCCÄAGAGTGTAAAGATAGACT^CACTGCCGACCAG
CGAGGGTTCCTTGGACGGAAACTGGGGTTCTCACÄTTTCTATCTGAAGTGACGGCIOGTC
1270 1280 1290 1300 1310 1320
ATTGAAGAGTTC^UΛGAGGCCTTTTCATTGTTTGACCGGACCCCGACTGGAGAGATGAAG TAACTTCKÄAGTTTCTCCS^
1330 1340 1350 1360 1370 1380
ATCACCTACGGCCAGTGCGGGGATGTACTGCGGGCCCTGGGCCAGAACCCTACCAATGCC
TAGTGGATGCCGGTCΑCGCCCCTACATGACGCCCGGGACCCGGTCTTGGGATGGTTACGG
1390 1400 1410 1420 1430 1440
GAGGTGCTGCGTGTGCTGGGCAAGCCCAAGCCTGAAGAGATGAATGTCAAGATGCTGGAC
CrCCΑCGACGCAC^CGACCCGTTCGGGTTCGGACTTCTCTACTTACΑGTTCTACGACCTG
1450 1460 1470 1480 1490 1500
TTTGAGAOSTTCTTGCCCATCCTGGAGCΑCÄTT^
AAACTCTGαAGAACGGGTAGGACGTCGTGTAAAGGGCGTTGTTCCTCGTCCCGTGGATA 1510 1520 1530 1540 1550 1560
GAGGACTTCGTGGAGGGCCTGCGTGTCTTTGACAAGGAGAGCAATGGCACGGTCATGGGT
CTCCTGAAGC^CCTCCCGGACGαiCAGAAACTGTTCCTCTCGTTACCGTGCCAGTACCCA
1570 1580 1590 16C» 1610 1620
GCTGAGC^TCGGC^CGTCCTTGCCACCCTGGGAGAGAAGATGACTGAGGCTGAAGTGGAG
CGACTCGAAGCCGTGCAGGAACGGTGGGACCCTCTCTTCTACTGACTCCGACTTCACCTC
1630 1640 1650 1660 1670 .1580
GAGCTGTTAGCTGGGCAAGAGGATGCCAATGGCTGCΑTα^
GTCGAfZAATCGACCCGTTCTCCTACGGTTACCGACGTAGTTAATACTTCGGAAACAGTTC 1690 1700 1710 1720 1730 1740
CACATCATGTCΑGGGTGAAGCAGAGTCTTCCAGGTGCCTGGCCCTTGGCTTTAGCCATAC
ERSATZBLA REGEL 26 CODING REGION
GTGTAGTACAGTCCCACTTCGTCTCAGAAGGTCCACGGACCGGGAACCGAAATCGGTATG
1750 1760 1770 1780 1790 1800 END —,
CΑGGGTGAGTTAAAGAGAGGCCCGGCTGGGTGAGCTGAGATGGAGTCCTCGACTTATCAC
GTCCÄCTCÄATTTCTCTCCGGGCCGACCCACTCGACTCTACCTCAGGAGCTGAATAGTG
1810 1820 1830 1840 1850 1860
CAΆCCÄCTGCCCCAAGGACCTTACAGGCCCTCCCTGTTAATAAACAGCTCTAACACGGC GTGTGGTGACGGGGTTCCTGGAATGTCCGGGAGGGAC^ TTATTTGTσjAGATTG
1870 1880 1890 1900 1910 1.920 f START: POLY A CAGGCTGGGCTCTGGGATTCTGAAAGAATTCGATATO^GCTTATCG-AA^ GTCOTACCCGAGACCCTAAGACTTTCTTAAGCTATAGTTCGAATAGCTTGAACAAATAAC
1930 1940 1950 1960 1970 1980
CAGCTTATAATGGTTACAATAAAGCΆATAGCΆTCΆCÄ^
GTCGAATATTACC^^TGTTTATTTCGTTATCGTAGTGTTTAAAGTGTTTATTTCGTAAAA 1990 2000 2010 2020 2030 2040
TTTÄCTGΑTTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATC ATGTATCTTATCATGTCTGCG
AAAGTGACGTAAGATCAACACCÄAACAGGTTTGAGTAGTTACATAGAATAGTACAGACGC
2050 2060 2070 2080 2090 2100
GCTCTAGAGTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCG CGAGATCΓCΆGCTCCCCCCCGGGCCΆTGGGTTAAGCGGGATATCACTCAGCATAATGCGC
2110 2120 2130 2140 2150 2160
CGCTCÄCTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCG TACCCAACTT GCGAGTGAC ^C^GOlAAATGTTGΑGCΑCTGACCCTTTTGGGACCGαA
2170 2180 2190 2200 2210 2220
AATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACC
TTAGCGGAACGTCGTGTAGGGGGAAAGCGGTCGACCGCΑTTATCGCTTCTCCGGGCGTGG
2230 2240 2250 2260 2270 2280
GATCGCCCTTCCCΑACAGTTGCGCΑGCCTGAATGGCGAATGGAAATTGTAAGCGTTAATA CTAGCGGGAAGGGTTGTCAACGCGTCGGACTTACCGCTTACCTTTAACATT∞CΑAT^
2290 2300 2310 2320 2330 2340
TTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCΑT^ AAAAC^TTTTAAGCGC^TTTAAAAACAATTTAGTCG
2350 2360 2370 2380 2390 2400
GAAATCGG(^^AATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTT
CTTTAGCCGTTTTAGGGAATATTTAGTTTTCTTATCTGGCTCTATCCCAA
2410 2420 2430 2440 2450 Zu 2) Anstelle der kodierenden Sequenz der hALC-1 in pαMHC- hALC-1 wird ein synthetisches Oligonucleotid der Sequenz kloniert, das der kodierenden Sequenz Aminosäuren 1-15 der hALC-1 entspricht und die folgende Sequenz besitzt:
AGCTTGCCACCATGGCTCCCAAGAAGCCTGAGCCTAAGAAGGAGGCAGCCAAGCCATGAA
Desweiteren wird ein Konstrukt erzeugt, das Anstelle der kodierenden hALC-1 Sequenz in pαMHC-hALC-1 die kodierende Sequenz der ersten 15 Aminosäuren der hVLC-1 besitzt:
AGCTTGCCACCATGGCCCCCAAAAAGCCAGAGCCCAAGAAGGATGATGCCAAGGCATGAA
Die Wirkung des erfindungsgemäßen Mittels wird nachfolgend näher dargestellt.
Gemäß der Erfindung wurde ein in vitro Aktin-Bindungsassay entwickelt, bestehend aus Aminohexylagarose, das mit einem synthetischen Peptid entsprechend der N-terminalen Aktin Bindungsdomäne 4-14 von VLC-1 kovalent gekoppelt wurde, vorinkubiert mit freiem ALC-1 oder VLC-1 Peptiden (oder den entsprechenden scrambled Peptiden) , um ein Gleichgewicht zwischen gebundenem und freiem Aktin zu erhalten. Der Gleichgewichtskomplex wird dann mit dem Affinitätsgel inkubiert, das das freie G-Aktin bindet. Die Vorhersage war, daß in der Gleichgewichtsreaktion mit niederer Affinität Peptiden eine höhere Fraktion von freiem G-Aktin existiert, welches durch nachfolgende Inkubation mit dem Affinitätsgel bestimmt werden kann.
Es wurde demonstriert, daß G-Aktin an Affinitätsgel bindet. Damit ist zum 1. Mal gezeigt, daß die N-terminale Sequenz 4- 14 von human cardiac VLC-1 tatsächlich mit Aktin reagiert. Vorinkubation von G-Aktin mit dem N-terminalen Peptid 5-14 von VLC-1 verhindert die Aktin-Bindung an das Affinitätsgel bei einer Peptidkonzentration von etwa lμM. Das entsprechende scrambled Peptid war bei der selben Konzentration ohne Effekt, was zeigt, daß die Bindung des N-terminalen MLC-1 Peptids hochspezifisch ist. Der wichtigste Befund liegt darin, daß sich die Aktinaffinität der N-terminalen Peptide 5-14 von ALC-1 und VLC-1 unterscheidet: im gewählten Assaysyste war die halb-maximale effektive Dosis von P5-14 von VLC-1 0,32 μM, während die halb-maximale effektive Dosis von P5-14 von ALC-1 0,71μM war. Daraus ist abzuleiten, daß die Aminosäuren 7 und 8 des MLC-1 die Affinität des N- Terminus von MLC-1 zu Aktin regulieren. Das unterstützt die Hypothese, daß die höhere Querbrückenkinetik in Gegenwart von ALC-1 auf der schwachen Aktin-Bindung seines N-Terminus beruht. Deshalb übt ALC-1 eine schwächere 'Last' auf die Querbrücke aus als VLC-1, und erhöht seine Kinetik und seine Kraftentwicklung.
Zusammenfassend zeigen die in den Ausführungsbeispielen näher erläuterten Daten, daß die Interaktion zwischen den N- terminalen Domänen von ALC-1 mit Aktin die Querbrückenkinetik und die Kraft pro Querbrücke fördert, was den Kontraktilitätsstatus des menschlichen Herzens verbessert.
Die Erfindung soll nachfolgend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.
Aktinreinigung
Aktin wurde aus Kaninchen psoas (Pardee JD et al. (1982) In: Methods in Enzymology Vol 85, pp 164-182, Academic Press, New York, London) gewonnen. Lyophilisiertes Aktin (100 mg) wurde in 3 ml Aktinpuffer, enthaltend 5 mM Hepes, pH 7,5, 1 mM ATP, 0,2 M CaCl2, 0,5 mM NaN3 ^ suspendiert und durch einen Glas- Teflon-Homogenisator homogenisiert. Nachfolgende Zentrifugation bei 200 000 g in 1 Stunde ergab G-Aktin im Überstand. Die Konzentration wurde durch Messung der optischen Dichte bei 290 nm:0,63 = lmg/ml geschätzt. Synthetische Peptide
Die N-terminalen Säuresequenzen 5-14 von VLC-1 (KPEPKKDDAK) und ALC-1 (KPEPKKEAAK) (humane Herzsequenz) (Kurabayashi M et al. (1988) J. Biol. Chem. 263: 13930-13936) und die entsprechenden scrambled Peptide (PKDKEAKPKD) für VLC-1 und PKEKEAKPKA für ALC-1) wurden in einer Reinheit von 98 % hergestellt (bestimmt durch HPLC und Massenspektroskopie) .
MLC Affinitätsgel
Ein synthetisches Peptid mit der N-terminalen Sequenz 4-14 (KKPEPKKDDAK) von VLC-1 wurde kovalent an ein Agarosegel gekoppelt. Um diese Kopplung zu erreichen, wurde das Peptid mit einem N-terminalen Monochlor-acetyl-glycyl-Rest synthetisiert. Dieses Peptid wurde dann an aktivierte w- Aminohexylagarose über Aktivierung durch 2-Iminothiolane- Hydrochloride immobilisiert wie beschrieben (Calovini T. et al. (1995) J. Cell Biochem. 59: 69-78). Die Kopplungsreaktion wurde in Phosphat-gepufferter Saline (PBS, pH 7,4) innerhalb von 3 Stunden bei Raumtemperatur und einer Peptid- konzentration von 6 mg/ml gepacktem Gel durchgeführt. Das Peptid-Harz wurde dann für 1 Stunde mit 5 ml von 40 mM Jodacetamid inkubiert, um die verbleibenden aktiven Gruppen zu blockieren. Das MLC Affinitätsgel wurde gründlich mit PBS gewaschen und in Gegenwart von 1 % bovinem Serum-Albumin und 0,02 % Natrium aufbewahrt.
Aktinbindung an Affinitätsgel
MLC Affinitätsgele (15 μl des Gels) werden mit 50 μg G-Aktin in einem Endvolumen von 500 μl Aktinpuffer für 1 Stunde bei +4 °C in einem rotierenden Kolben inkubiert. Vergleichs- Experimente werden durch Inkubation verschiedener Konzentrationen von ventrikulärem MLC Peptid 5-14 des atrialen MLC Peptids 5-14 oder der entsprechenden scrambled Peptide mit G-Aktin für 12 Stunden bei +4 °C vor Bindung an das Affinitätsgel für 1 Stunde bei +4 °C wie oben
ERSATZBUTT(REGEL26) beschrieben, durchgeführt. Nach der Aktinbindung wird das Gel dreimal mit Aktinpuffer gewaschen, mit 20 ml SDS Puffer (5% SDS, 50 mM Tris-HCL, pH 7,5, 250 mM Sucrose, 75 M Harnstoff, 60 mM ß-Mercaptoethanol ) extrahiert und für 2 min auf 95 °C erhitzt. Die erhaltenen Überstände werden weiter mit SDS-PAGE behandelt, während das Affinitätsgel verworfen wird.
SDS-PAGE und Immunoblot Analyse
Proben werden elektrophoretisch auf 8% Polyacrylamidgelen bei 4 °C für 3 Stunden getrennt und auf Nitrozellulose (Hybond-C, 45 μm, Amersham, Germany) in einen Puffer gebracht, der 40 M Tris, 300 mM Glycin, 0,01% SDS und 20% (V/V) Methanol enthält. Die Blots werden dann mit dem monoklonalen Antikörper gegen a-sarcomerisches Aktin (Sig a, München, Germany) in einer Lösung von 1:500 für 90 min und dem zweiten Peroxidase-konjugierten Antikörper (Anti-Maus IgG, BioGenes, Germany diluted 1:10.000) für 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die 43-kDa Aktin-Bande wurde durch einen verstärkten Chemolumineszenz-Reaktions-Kit (Amersham, Germany) auf einem Röntgenfilm sichtbar gemacht.
Statistische Analyse
Die statistische Analyse wurde mit dem kommerziell erhältlichen statistischen Programm 'Instat2' auf einem IBM kompatiblen PC (Mittel, Standard deviation (SD), Students's t-Test für unpaare Werte). Alle Werte sind als Mittel + SEM ausgedrückt.
Ergebnisse
1. Bindung von G-Aktin an Affinitätsgel
Wie in Abbildung 1 gezeigt, bindet das synthetische Peptid entsprechend der N-terminalen VCL-1 Sequenz 4-14, kovalent gebunden an Aminohexylagarose, G-Aktin in einer zeitabhängigen Weise. Bei +4 °C konnte maximale Aktinbindung nach einer Stunde gemessen werden. Unter den selben experimentellen Bedingungen wurde keine G-Aktin-Bindung an die Aminohexylagarose-Matrix allein beobachtet.
2. Bindung von N-terminalem ALC-1 und VLC-1 an G-Aktin
Zur Demonstration, daß Peptide, abgeleitet von den N- terminalen Domänen 5-14 (P5-14) von ALC-1 und VLC-1, G-Aktin mit verschiedener Affinität binden, wurde G-Aktin mit verschiedenen Peptid-Konzentrationen für 12 Stunden bei +4 °C vor der Inkubation mit dem Agarosegel inkubiert. Verschiedene Peptidaffinitäten sollten verschiedene Fraktionen von ungebundenen G-Aktin Konzentrationen ergeben, welche nachfolgend von den Affinitätsgelen abgetrennt und im Western-blot nachgewiesen werden können.
Vorinkubation von G-Aktin mit 1 μM von P5-14 von VLC-1 gesättigtem Aktin Interaktionsorte verhindern dabei die nachfolgende Bindung an die Affinitätsgele (Abbildung 2). Das entsprechende VLC-1 scrambled Peptid (3 μM) bindet nicht an Aktin. Die Western-blots in Abbildung 2 zeigen, daß das G- Aktinsignal , erhalten nach Inkubation mit 3 μM scrambled Peptid, ungefähr das gleiche war wie das G- Aktinbindungssignal allein (siehe die Gele Nr. 5 und 7 in Abbildung 2a). Diese Resultate weisen darauf hin, daß die Bindung der N-terminalen Domäne 5-14 von VLC-1 zu Aktin ortsspezifisch ist. Halbmaximale effektive Dosierung von VLC- 1 Peptid war 0,32+0,02 μM (6 verschiedene Experimente, Abbildung 2b) .
Wahrscheinlich entfernt die N-terminale Sequenz 5-14 das G- Aktin aus der Gleichgewichtsreaktion in einer konzentrationsabhängigen Weise, während das entsprechende scrambled Peptid bis zu 3μM nicht effektiv war (Abbildung 2): Western-blots (Abbildung 2a) zeigen, daß das G-Aktinsignal, erhalten nach Inkubation mit 3 μM scrambled Peptid, ungefähr dasselbe war, wie das bei alleiniger G-Aktinbindung (siehe Gele Nr. 5 und 6 in Abbildung 2a). Jedoch die Bindung des ALC-1 Peptids an G- Aktin war deutlich schwächer als die Bindung des VLC-1 Peptids. Selbst bei 3 μM ALC-1 Peptid konnte eine bedeutende Menge von G-Aktin von den Affinitätsgelen eluiert werden. Die halbmaximale effektive Konzentration von ALC-l Peptid wurde mit 0,7+0,02 (Abbildung 2b) bestimmt und war deutlich (p<0,01) höher als verschieden von VLC-1 Peptid.
Legende zu den Abbildungen:
Abbildung 1:
Abbildung la: stellt die zeitabhängige Bindung von G-Aktin an Affinitätsgelen dar, die nach Elution und Western-blot (ECL- Signal) erscheint. Ein Peptid entsprechend der humanen VLC-l Sequenz 4-14 war kovalent an Aminohexylagarose gekoppelt, um G-Aktin zu binden, a, b, und c korrespondieren mit den Signalen nach 10min, 30min, 60min und 120 min. Abbildung lb: Die ECL Signale gemäß Abbildung la (optische Dichte OD in Vergleichseinheiten) werden gegen die Inkubationszeit der Affinitätsgele mit G-Aktin aufgetragen.
Abbildung 2:
Abbildung 2a: Rückgewinnung von G-Aktin aus Affinitätsgelen (ECL-Signale) . G-Aktin wurde mit verschiedenen Konzentrationen (in mol/1) von synthetischen Peptiden inkubiert, die den N-terminalen Domänen von 5-14 (P5-14) der atrialen und ventrikulären Myosin Leichtkette 1 (entsprechend ALC-l und VLC-1)) des menschlichen Herzens. 1, 2, 3 und 4 entsprechen 3μM, lμM, 0,3μM und 0,lμM Peptid. 5 betrifft Aktin allein, 6 und 7 betrifft 3μM ALC-l und VLC-1 scrambled Peptide.
Abbildung 2b: G-Aktin zurückgewonnen aus Affinitätsgelen (in % des maximalen ECL-Signals erhalten ohne konkurrierendes Peptid) gegen verschiedene Konzentrationen von ALC-l (Kreise) und VLC-1 (Felder) Peptiden entsprechend den N-terminalen Domänen 5-14 (P5-14) des menschlichen Herzens.

Claims

Patentansprüche
1. Mittel zur Steigerung der Herzkraft, umfassend ein Peptid der allgemeinen Formel I
MAPKKPEPKKXYAK, I
in welcher X = E oder D und Y = A oder D bedeuten, oder Teile davon oder durch Punktmutationen an einer Stelle veränderte Varianten dieses Peptids bzw. ein Gen, das für diese und analoge Peptide kodiert.
2. Mittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein Dekamer der Sequenz
KPEPKKXYAK,
wobei X und Y die oben genannte Bedeutung haben.
3. Mittel nach Anspruch 1 und 2 , gekennzeichnet durch das Peptid
KPEPKKEAAK
4. Mittel nach Anspruch 1 und 2 , gekennzeichnet durch das Peptid
KPEPKKDDAK
5. Mittel nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet durch ein Peptid der Formel I mit einer Mutation in Anfangs- oder in Endstellung.
6. Mittel nach Anspruch 1 und 3 , gekennzeichnet durch ein Peptid mit einer Mutation in Anfangs- oder in Endstellung.
7. Mittel nach Anspruch 1 und 4 , gekennzeichnet durch ein Peptid mit einer Mutation in Anfangs- oder in Endstellung.
8. Mittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein Plasmid, das die atriale leichte Myosinkette (hALC-1) des Humanherzen und mindestens die ersten 15 Aminosäuren der ventrikulären leichten Myosinkette (hVLC-1/1-15) des Menschen kodiert.
9. Mittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein Plasmid, das die atriale leichte Myosinkette (hALC-1) des Humanherzen und mindestens die ersten 15 Aminosäuren der atrialen leichten Myosinkette (hALC-1/1-15) des Menschen kodiert.
10. Mittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein Plasmid, das die ersten 15 N-terminalen Aminosäuren der ventrikulären leichten Myosinkette (h-VLC-1) kodiert.
11. Mittel nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch ein Plasmid, das die ersten 15 N-terminalen Aminosäuren der atrialen leichten Myosinkette (h-ALC-l) kodiert.
12. Peptid der allgemeinen Formel I
MAPKKPEPKKXYAK, I
in welcher X = E oder D und Y = A oder D bedeuten, oder Teile davon oder durch Punktmutationen an einer Stelle veränderte Varianten dieses Peptids.
13. Dekamer der Sequenz
KPEPKKXYAK,
wobei X und Y die oben genannte Bedeutung haben.
14.Peptid
KPEPKKEAAK
15.Peptid
KPEPKKDDAK
ERSATZBUTT (REGEL 26)
16. Peptid der Formel I mit einer Mutation in Anfangs- oder in Endstellung.
17. Peptid nach Anspruch 10 mit einer Mutation in Anfangsoder in Endstellung.
18. Peptid nach Anspruch 11 mit einer Mutation in Anfangsoder in Endstellung.
19. Plasmide, umfassend Gene, die für Peptide gemäß Anspruch 12-18 und analoge Peptide kodieren.
20. Plasmide nach Anspruch 19, gekennzeichnet durch die atriale leichte Myosinkette (hALC-1) des Humanherzen und mindestens die ersten 15 Aminosäuren der ventrikulären leichten Myosinkette (hVLC-1/1-15) des Menschen kodierenden Elemente.
21. Plasmide nach Anspruch 19, gekennzeichnet durch die atriale leichte Myosinkette (hALC-1) des Humanherzen und mindestens die ersten 15 Aminosäuren der atrialen leichten Myosinkette (hALC-1/1-15) des Menschen kodierenden Elemente.
22. Plasmide nach Anspruch 19, gekennzeichnet durch ein Plasmid, das die ersten 15 N-terminalen Aminosäuren der h- VLC-1 kodiert.
23. Plasmide nach Anspruch 19, gekennzeichnet durch ein Plasmid, das die ersten 15 N-terminalen Aminosäuren der h- ALC-1 kodiert.
24. Verwendung des Mittels nach Anspruch 1-11 zur Behandlung von Herzmuskelschwächen.
ERSATZBUπ(REGEL26)
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