EP0868194A1 - Kombination von g-csf mit einem chemotherapeutikum zur stammzellmobilisierung - Google Patents

Kombination von g-csf mit einem chemotherapeutikum zur stammzellmobilisierung

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EP0868194A1
EP0868194A1 EP96943100A EP96943100A EP0868194A1 EP 0868194 A1 EP0868194 A1 EP 0868194A1 EP 96943100 A EP96943100 A EP 96943100A EP 96943100 A EP96943100 A EP 96943100A EP 0868194 A1 EP0868194 A1 EP 0868194A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
csf
chemotherapeutic agent
use according
combination
treatment
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP96943100A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Matthias Baumann
Peter-Paul Ochlich
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Roche Diagnostics GmbH
Original Assignee
Roche Diagnostics GmbH
Boehringer Mannheim GmbH
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Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=7781702&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EP0868194(A1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Roche Diagnostics GmbH, Boehringer Mannheim GmbH filed Critical Roche Diagnostics GmbH
Publication of EP0868194A1 publication Critical patent/EP0868194A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/193—Colony stimulating factors [CSF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid

Definitions

  • the present invention relates to the new use of G-CSF and a chemotherapeutic agent or a combination of chemotherapeutic agents for the manufacture of a pharmaceutical preparation for the increased mobilization of hematopoietic stem cells in the treatment of diseases which require peripheral stem cell transplantation, such as e.g. in high-dose
  • the invention also relates to a pharmaceutical packaging unit containing G-CSF, chemotherapeutic agent (a) and one for the application of the G-CSF and the chemotherapeutic agent or the combination of chemotherapeutic agents for increased mobilization of hematopoietic stem cells
  • peripheral stem cell extraction e.g. in leukapheresis
  • the mobilization of bone marrow stem cells largely determines the efficiency of these methods.
  • 2-3 leukaphereses are currently required, which results in considerable stress for the patient.
  • G-CSF granulocyte colony-stimulating factor
  • Bone marrow transplants found that the cyclophosphamide known as a cytostatic facilitates the permeability of the endothelial barrier to sta ⁇ im cells (Exp. Hematol., 19, 369-373 (1991)).
  • the object of the invention was to achieve a better stem cell yield or a reduction in the number of leukaphereses by increasing the mobilization of stem cells.
  • the invention therefore relates to the use of G-CSF and a chemotherapeutic agent or a combination of chemotherapeutic agents for the production of a pharmaceutical preparation for the increased mobilization of hematopoietic stem cells in the treatment of diseases which require a peripheral stain cell transplantation, G-CSF and chemotherapeutic agent in separate administration forms available ready-made, so that they can be removed individually and can be administered in succession according to the optimal application scheme.
  • the combined use of G-CSF and chemotherapeutic agent according to the invention relates to all diseases in which the extraction of stem cells from the blood is necessary for a later peripheral transplantation, in particular tumor diseases
  • G-CSF and its variants produced by recombinant methods can be used.
  • the term G-CSF or G-CSF variant according to the present invention includes all naturally occurring variants of G-CSF as well as G derived therefrom modified by recombinant DNA technology -CSF proteins, in particular fusion proteins, which contain other protein sequences in addition to the G-CSF portion.
  • Particularly preferred in this sense is a G-CSF mutein with an N-tern ⁇ inal Met residue at position-1, which is used for expression in prokaryotic
  • a recombinant memionin-free G-CSF variant, which can be produced according to WO-A-91/11520, is also suitable.
  • G-CSF variant is understood to mean those G-CSF molecules in which one or several amino acids can be deleted or replaced by other amino acids, the essential properties of G-CSF, in particular the ability of the mobilizer Bone marrow cells remain largely intact.
  • Suitable G-CSF muteins are described, for example, in EP-A-0 456 200
  • Chemotherapeutic agents in the sense of the invention are the therapeutic agents which open the endothelial barrier and make them permeable to stem cells. Chemotherapeutic agents are understood below to mean substances foreign to the body which are suitable and are used to odei microorganisms and parasites
  • cytostatics or their derivatives from the following cytostatic groups should be mentioned: alkylating agents such as cyclophosphamide, chlorambucu, melphalan, busulphan, N-lost compounds, mustarges, metal complex cytostatics such as metal complexes of platinum Palladium or ruthenium, antimetabolites, such as methotrexate. 5-riuorurac ⁇ l,
  • Cytorabm natural substances such as vinblastine, Vmc ⁇ stin, Vindesm etc., antibiotics, such as dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin, bleomycin, mitomycin, etc .; Hormones and hormone antagonists, such as, for example, diethylstilbestrol testolactone, tamoxifen, amimoglutetliiniid; other compounds such as hydroxyurea or procarbacin and corticoids such as prednisolone. Cyclophosphamide is particularly preferred.
  • G-CSF can be administered in the usual dosage forms.
  • An injection solution is preferred.
  • Water is preferably used as the injection medium, which contains the additives customary for injection solutions, such as stabilizing agents, solubilizers and buffers.
  • additives are, for example, tartrate and citrate buffers, ethanol, complexing agents such as ethylenediaminetetraacetic acid and their non-toxic salts, high molecular weight polymers such as liquid polyethylene oxide for viscosity control.
  • Liquid carriers for injection solutions must be sterile and are preferably filled into ampoules.
  • chemotherapeutic agents can be administered enterally or parenterally in liquid or solid form.
  • the usual forms of application come into question, such as tablets, capsules, dragees, syrups, solutions and suspensions.
  • the dosage can depend on various factors such as the mode of administration, species, age or individual condition. According to the invention, 5 to 300 ⁇ g / kg • day G-CSF s.c. applied. G-CSF is applied once a day for two to three days. Either immediately after the second or third G-CSF injection or on the fourth day with the application of the
  • Chemotherapy drugs started. According to the invention, 0.05-100 mg / kg • day of chemotherapeutic agent (a) is administered
  • G-CSF and a chemotherapy drug in advance also opens up the possibility of extracting the stem cells that have been mobilized in large quantities from the blood with increased efficiency (e.g. using leukapheresis), then performing antitumor therapy using cytostatics or radiation, and then performing peripheral stem cell transplantation
  • the invention also relates to a pharmaceutical packaging unit which contains at least three spatially separate components, the first component being a conventional dosage form of G-CSF, the second component representing a conventional pharmaceutical dosage form of a chemotherapeutic agent or a combination of chemotherapeutic agents, and the third component on
  • G-CSF is administered in combination with, for example, two chemotherapeutic agents
  • these chemotherapeutic agents can be separated or packaged together, so that the packaging unit consists of either three or four spatially separated components
  • G-CSF was applied on three consecutive days before the cyclophosphamide administration
  • G-CSF was applied starting 24 hours after CY injection, according to current clinical practice.
  • mice Female NMRI mice were purchased. The body weight was approximately between 26 to 28 g at the beginning. The animals were fed pellets and had free access to food and drinking water.
  • the bone marrow cells were obtained by rinsing the bone marrow cavities with 1.5 ml MEM (supplemented with periicillin / streptomycin and I ⁇ glutamine) using syringes with adapters.
  • MEM supplied with periicillin / streptomycin and I ⁇ glutamine
  • the femoral marrow cell count was adjusted to 2.5 x 10 ⁇ cells / ml in MEM (Flow). 0.2 ml of this suspension was mixed with 0.5 ml of horse serum, 0.1 ml of thioglycerol (20 mM, diluted 1: 4 with MEM), 1.0 methyl cellulose (2% in MEM), 0.6 ml of MEM (flow) and 0.1 ml of either additional medium or standardized stimulated mouse serum (1: 200 dilution of the serum, taken 3 hours after 2.5 mg / kg lipopolysaccharide (LPS) ip) or 5 ng / ml rhG-CSF.
  • LPS lipopolysaccharide
  • the well-mixed semi-solid suspension was pipetted into Petri dishes with a diameter of 4 cm and incubated for 6 days at 37 ° C, 5% CO2 and 95% H. After the addition of 0.5 ml p-iodonitrotetrazolium violet solution (0.5 mg / ml PBS), the dishes were incubated for a further 24 hours. The colonies were then counted on a colony counter and normalized to 10 ** bone marrow cells.
  • the animals were sacrificed the day after the last administration of the compounds, and spleen tissue and femoral bone from each animal were fixed in 10% neutral buffered formalin. The bone samples were taken within 2 weeks
  • endpoints CFU-C administration of G-CSF or serum, and spleen weight was determined performed the procedure of multiple endpoint analysis. Endpoints after treatment-free time (week 6) were analyzed for reversibility using a Dunnett, JASA 50: 1096, 1955 method that is applicable for comparison with controls. The calculations were carried out on SAS, version 6.10 (SAS / STAT: Changes and enhancements, Release 6.10, SAS Institute, 1994) and Statxact (Mehta et al, see above).
  • CY alone reduced the IC bone marrow cell count to approximately 60% of the control.
  • the two combinations of CY and G-CSF reduced the number to approx. 30% of the control.
  • the animals in the CY / G-CSF test group again showed increasing bone marrow cell numbers compared with the number immediately after the treatment. In the end they reached about 50% of the
  • the granulopoietic target density in the haematopoetically active areas of the femoral bone marrow increased significantly in the two groups treated with G-CSF and CY compared to the control group and the CY test group (TabeUe 3).
  • the effect is particularly clear in the G-CSF / CY test group.
  • the G-CSF / CY test group showed an increased WBC slightly above the upper limit of normal in week 1, in the following weeks 2, 3 and 4 the WBC increased significantly (7 to 8 times the control), a complete reversal this effect was observed after the treatment-free period of 2 weeks.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung von G-CSF in Kombination mit einem Chemotherapeutikum (insbesondere Cyclophosphamid) zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates zur verstärkten Mobilisierung hämatopoetischer Stammzellen aus dem Knochenmark bei der Behandlung von Erkrankungen, die eine periphere Stammzelltransplantation erfordern. Die erfindungsgemässe Verwendung erlaubt eine effizientere Leukapherese, z.B. im Vorfeld einer myeloablativen oder myelotoxischen Therapie.

Description

KOMBINATION VON G-CSF MIT EINEM CHEMOTHERAPEUTIKUM ZUR STAMMZELLMOBILISIERUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die neue Verwendung von G-CSF und einem Chemotherapeutikum oder einer Kombination von Chemotherapeutika zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates zur verstärkten Mobilisierung hämatopoetischer Stammzellen bei der Behandlung von Erkrankungen, die eine periphere Stammzelltransplantation erfordern, wie dies z.B. bei der Hochdosis-
Chemotherapie oder bei der Knochenmarksablation durch Bestrahlung der Fall ist. Gegenstand der Erfindung ist daneben eine pharmazeutische Verpackungseinheit enthaltend G-CSF, Chemotherapeutikum(a) und einen zur Applikation des G-CSF und des Chemotherapeutikums bzw. der Kombination von Chemotherapeutika zur verstärkten Mobilisierung hämatopoetischer Stammzellen vor
Beginn der entsprechenden Therapie.
Der Einsatz der Hochdosis-Chemotherapie oder die Knochenmarksablation durch Bestrahlung erfordern das nachträgliche Einbringen hämatopoetischer Stammzellen in den Patienten, was die Gewinnung solcher Zellen voraussetzt.
Bei den Verfahren der peripheren Stammzellgewinnung (z.B. bei der Leukapherese) bestimmt die Mobilisierung der Knochenmarksstammzellen zu einem ganz wesentüchen Teil die Effizienz dieser Methoden. Für eine erfolgreiche periphere Stammzelltransplantation werden gegenwärtig 2-3 Leukapheresen benötigt, woraus für die Patienten erhebliche Belastungen resultieren.
Der Erfolg einer Behandlung hängt entscheidend von der Mobilisierung der Knochenmarksstammzellen ab, durch deren spätere Rückführung die Rekonstutition eines funktionsfähigen hämatopoetischen Systems eπ eicht werden kann.
Es sind zahlreiche Substanzen bekannt, die eine solche Mobilisierung bewirken können, so z.B. G-CSF (Granulocyten-Kolonie-stimulierender Faktor). Es ist außerdem bekannt, daß einige Chemotherapeutika die Fähigkeit besitzen, Knochenrxwksstammzellen zu mobilisieren (Richman et al., Blood, Vol. 47, No. 6, 1031 (1976)).
In verschiedenen Dokumenten ist auch die Kombination von G-CSF mit weiteren
Wirkstoffen beschrieben. So sind aus EP-A-0 648 501 und WO-A-95/28178 kombinierte Behandlungen mit Antibiotika bekannt. In US 5.422.105 wird zur verstärkten Wirkung einer CSF- 1-Therapie die Kombination mit einer oder mehreren antimikrobiellen Substanzen, wie antirivale, antifungale oder antibakterielle Mittel angegeben. Darüber hinaus liegen Untersuchungen zur Anwendung von G-CSF im
Zusammenhang mit hochdosierten Chemotherapien bei autologen Knochenmarktransplantationen vor (Lymphokine Cytokine Res. (1994), 13(6), 383- 90 und Leukemia and Lymphona, (1995), 19 (5-6), 479-84).
Shirota et al. haben in anderen Untersuchungen betreffend
Knochenmarkstransplantationen festgestellt, daß das als Cytostatikum bekannte Cyclophosphamid die Durchlässigkeit der Endothel- Schranke für Staπimzellen erleichtert (Exp. Hematol., 19, 369-373 ( 1991 )).
Da im Vorfeld der Behandlung von bestimmten Erkrankungen, z.B. im Vorfeld einer myeloablatfven oder myelotoxischen Therapie, die erforderliche Anzahl von Leukapheresen für den Patienten extrem belastend ist, lag der Erfindung die Aufgabe zugrunde, über eine verstärkte Mobilisierung von Stammzellen eine bessere Ausbeute an Stammzellen bzw. eine Verringerung der Anzahl der Leukapheresen zu erreichen.
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß eine unerwartet hohe Stammzellkonzentration im Blut erreicht werden kann, wenn G-CSF in Kombination mit einem Chemotherapeutikum (Chemotherapeutika) verabreicht wird.
Gegenstand der Erfindung ist deshalb die Verwendung von G-CSF und einem Chemotherapeutikum oder einer Kombination von Chemotherapeutika zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates zur verstärkten Mobilisierung hämatopoetischer Stammzellen bei der Behandlung von Erkrankungen, die eine periphere Stainmzelltransplautation erfordern, wobei G-CSF und Chemotherapeutikum in getrennten Darreichungsformen konfektioniert vorliegen, so daß sie einzeln entnehmbar sind und nacheinander gemäß dem optimalen Applikationsschema verabreicht werden können Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, zur verstärkten Mobilisierung hämatopoetischer Stammzellen das G-CSF vor dem Beginn der Chemotherapeutikagabe zu applizieren.
Die erfindungsgemäße kombinierte Verwendung von G-CSF und Chemotherapeutikum betrifft alle Erkrankungen, bei denen die Gewinnung von Stammzellen aus dem Blut für eine spatere periphere Transplantation erforderlich ist, inbesondere Tumorerlαankungen
Gemäß der vorliegenden Erfindung können durch rekombinante Verfahren hergestelltes G-CSF und dessen Varianten verwendet werden Der Begriff G-CSF oder G-CSF-Variante gemäß vorhegender Erfindung beinhaltet alle natürlich vorkommenden Varianten von G-CSF sowie davon abgeleitete durch rekombinante DNA-Technologie modifizierte G-CSF-Proteine, insbesondere Fusionsproteine, die neben dem G-CSF-Anteil noch andere Proteinsequenzen enthalten Besonders bevorzugt ist in diesem Sinne ein G-CSF-Mutein mit einem N-ternαinalen Met-Rest an Position- 1, das zur Expression in prokaryontischen Zellen geeignet ist Ebenso geeignet ist eine rekombinante memioninfreie G-CSF-Variante, die gemäß WO-A- 91/11520 hergestellt werden kann Unter dem Begriff "G-CSF- Variante" werden solche G-CSF- Moleküle verstanden, bei denen eine oder mehrere Aminosäuren deletiert oder durch andere Aminosäuren ersetzt sein können, wobei die wesentlichen Eigenschaften von G-CSF, insbesondere die Fähigkeit der Mobilisierung von Knochenmarkszellen, weitgehend erhalten bleiben Geeignete G-CSF-Muteine sind beispielsweise in EP-A-0 456 200 beschrieben
Als Chemotherapeutika im Sinne der Erfindung sind die Therapeutika einsetzbar, die die Endothel- Schranke öffnen und für Stammzellen permeabel machen Unter Chemotherapeutika werden im folgenden körperfremde Substanzen verstanden, die geeignet sind und dazu verwendet werden, um Mikro Organismen, Parasiten odei
Tumorzellen zu schadigen oder zu zerstören Dabei sind insbesondre Cytostatika bzw deren Deπvate aus folgenden Cytostatikagruppen zu nennen Alkylantien, wie z B Cyclophosphamid, Chlorambucü, Melphalan, Busulphan, N-Lost-Verbmdungen, Mustargen, Metallkomplex-Cytostatika, wie z B Metallkomplexe des Platins, Palladiums oder Rutheniums, Antimetabolite, wie z.B Methotrexat. 5-riuoruracιl,
Cytorabm, Naturstoffe, wie z B Vinblastin, Vmcπstin, Vindesm usw , Antibiotika, wie z.B. Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Bleomycin, Mitomycin usw.; Hormone und Hormonantagonisten, wie z.B. DiethylstilböstroL Testolacton, Tamoxifen, Aπimoglutetliiniid; sonstige Verbindungen, wie z.B. Hydroxyhamstoff oder Procarbacin sowie Corticoide, wie z.B. Prednisolon. Besonders bevorzugt ist Cyclophosphamid.
G-CSF kann in den üblichen Darreichungsformen verabreicht werden. Bevorzugt ist eine Injektionslösung. Als Injektionsmedium kommt vorzugsweise Wasser zur Anwendung, das die bei Injektionslösungen üblichen Zusätze wie Stabihsierungsmittel, Lösungsveπnittler und Puffer enthält. Derartige Zusätze sind zum Beispiel Tartrat- und Citratpuffer, Ethanol, Komplexbildner wie Ethylendiamintetraessigsäure und deren nichttoxische Salze, hochmolekulare Polymere wie flüssiges Polyethylenoxid zur Viskositätsreguherung. Flüssige Trägerstoffe für Injektionslösungen müssen steril sein und werden vorzugsweise in Ampullen abgefüllt.
Die Chemotherapeutika können in flüssiger oder fester Form enteral oder parenteral appliziert werden. Hierbei kommen die üblichen Applikationsformen in Frage, wie beispielsweise Tabletten, Kapseln, Dragees, Sirupe, Lösungen und Suspensionen.
Die Dosierung kann von verschiedenen Faktoren wie Applikationsweise, Spezies, Alter oder individuellem Zustand abhängen. Erfindungsgemäß werden 5 bis 300 μg/kg • Tag G-CSF s.c. appliziert. Die Applikation von G-CSF erfolgt zwei bis drei Tage lang einmal täglich. Entweder unmittelbar nach der zweiten oder dritten G-CSF- Injektion oder am vierten Tag wird dann mit der Applikation des/der
Chemotherapeutika begonnen. Erfindungsgemäß werden 0,05 - 100 mg/kg • Tag Chemotherapeutikum (a) verabreicht
Überraschend wurde festgestellt, daß eine G-CSF-Anwendung vor einer Chemotherapeutika-induzierteii Endothelschranken-Ofmung wesentüch die
Mobilisierung der Stammzellen erhöht und damit die Effizienz der Leukapherese verbessern kann.
Durch Verabreichung von G-CSF vor Verabreichung des/der Chemotherapeutika konnte eine massive Granulopoese in der Milz und ein substantieller Anstieg des Milzgewichtes beobachtet werden, was gemäß Bungart et aL Bπt J Haem 76, 174- 179, 1990 auf die Stammzellen-Mobuisierung zurückzuführen ist
Die Gabe von G-CSF und einem Chemomerapeutikum im Vorfeld z.B. einer Antitumortherapie eröffnet desweiteren die Möglichkeit, die in großer Menge mobilisierten Stammzellen mit erhöhter Effizienz aus dem Blut zu gewinnen (z.B mittels Leukapherese), dann die Antitumortherapie mittels Cytostatikum oder Bestrahlung durchzuführen und danach die periphere Stammzelltransplantation durchzuführen
Gegenstand der Erfindung ist außerdem eine pharmazeutische Veφackungseinheit, die mindestens drei räumlich getrennte Bestandteile enthält, wobei der erste Bestandteil eine übliche Darreichungsform von G-CSF ist, der zweite Bestandteil eine übliche pharmazeutische Darreichungsform eines Chemotherapeutikums oder einer Kombination von Chemotherapeutika darstellt, und der dritte Bestandteil ein
Iriformationshinweis zur Applikation des G-CSF vor Beginn der Applikation des Chemomerapeutikums (der Chemotherapeutika) zur verstärkten Mobilisierung hämatopoetischer Stammzellen ist
Wird G-CSF in Kombination mit z B zwei Chemotherapeutika verabreicht, so können diese Chemotherapeutika getrennt oder zusammen konfektioniert sein, so daß die Verpackungseinheit entweder aus drei oder aus vier raumlich getrennten Bestandteilen besteht
In dem nachfolgenden Ausführungsbeispiel soll die Erfindung naher beschrieben werden, ohne sie darauf zu beschränken
Ausführungsbeispiel
Es wurde an Mausen die in vivo Wechselwirkungen zwischen rh G-CSF und Cyclophosphamid (CY)-Anwendungen hinsichtlich der Effekte verschiedener
Behandlungsplane auf die
- hamatopoetische Kapazität femoraler Zellen,
- femorale Knochenmark- und Milzhistologie
- Leukozyten-Zahl (WBC) untersucht Folgende Testgruppen wurden untersucht:
- G-CSF/CY-Gruppe: G-CSF- Anwendung erfolgte an drei aufeinanderfolgenden Tagen vor der Cyclophosphamid-Gabe
(CY), wobei die dritte Injektion unmittelbar vor CY-Gabe erfolgte .
- CV/G-CSF-Gruppe: G-CSF wurde beginnend 24 Sunden nach CY- Injektion applrziert, entsprechend der derzeitigen klinischen Praxis,.
- CY-Gruppe: eine Behandlung erfolgte allein mit CY.
- Kontrollgruppe
1. Materialien
a) Tiere
Weibliche NMRI-Mäuse wurden erworben. Das Körpergewicht lag am Beginn ungefähr zwischen 26 bis 28 g. Die Tiere wurden mit Pellets gefüttert und hatten freien Zugang zu Nahrung und Trinkwasser.
Sie wurden einzeln bei Raumtemperatur (23 + 1°C) und einer relativen Luftfeuchte von 55 % ( 50 - 70%) gehalten. Die Raumluft wurde ungefähr 10 mal pro Stunde gewechselt. Der Tag/Nacht-Rhythmus wurde konstant mit Licht/Dunkelphasen von jeweils 12 Stunden gehalten, beginnend 6 Uhr früh. Die Licht- Intensität von ca 60 lux wurde überall im Raum während dei Lichtperiode geschaffen Der Gesundheitszustand der Tiere wurde tägÜch aufgezeichnet und die Reinigung erfolgte in regulären Abständen Die Einteilung der Tiere in die einzelnen l estgruppen ist
Tabelle 1 zu entnehmen
b) Reagentien
Rekombinantes humanes (rh) G-CSF, Cyclophosphamid
2. Methoden:
a) Periphere Leukozvtenzahl (WBC):
Messungen wurden unter Benutzung eines Analysers durchgeführt. Es wurden 25 μl natives Vollblut mit heparinisierten Glaskapillaren
aus dem retroorbitalen Plexus unter Anästhesie entnommen und mit 3,75 ml einer isoosmolaren Lösung verdünnt und hinsichtlich WBC analysiert.
b) Femorale Knochenmark-Zellzahl (BMC):
Nach 4 Behandlungswochen bzw. nach einer anschließenden zweiwöchigen behandlungsfreien Zeit, wurden Femora von 5 Tieren (n=8, G-CSF/CY-Gruppe) der verschiedenen Testgruppen gesammelt. Sie wurden aseptisch am proximalen und distalen Ende geöffnet. Die Knochenmarkszellen wurden unter Spülen der Knochenmarkshöhlen mit 1,5 ml MEM (supplementiert mit Periicillin/ Streptomycin und I^Glutamin) unter Verwendung von Spritzen mit Adaptern gewonnen. Mit Ausnahme der G-CSF-/CY-Testgruppe, in welcher beide Femora von 3 von 8 Tieren analysiert wurden, wurde ein Femur von jedem Tier untersucht. Die Zellen wurden in einem Autolyzer- System gezählt.
c) CFU-C Test (colonv-forming units culture):
Die femorale Kuochenmark-Zellzahl wurde auf 2,5 x 10^ Zellen/ml in MEM (Flow) eingestellt. 0,2 ml dieser Suspension wurden mit 0,5 ml Pferdeserum gemischt, 0, 1 ml Thioglycerol (20mM, 1:4 verdünnt mit MEM), 1,0 Methylzellulose (2 % in MEM), 0,6 ml MEM (Flow) und 0, 1 ml entweder zusätzliches Medium oder standardisiertes stimuliertes Mausserum ( 1 :200 Verdünnung des Serums, entnommen 3 Stunden nach 2,5mg/kg Lipopolysaccharidgabe (LPS) i.p.) oder 5 ng/ml rhG-CSF. Die gut gemischte halb-feste Suspension wurde in Petrischalen mit 4 cm Durchmesser pipettiert und 6 Tage bei 37 °C, 5% CO2 und 95% H inkubiert. Nach Zugabe von 0,5 ml p-Jodnitrotetrazolium-Violett-Lösung (0,5 mg/ml PBS) wurden die Schalen weitere 24 Stunden inkubiert. Die Kolonien wurden dann an einem Kolonie-Zählgerät ausgezählt und auf 10** Knochenmarkszellen normiert.
d) Gewebepräparation und histologische Prüfung;
Die Tiere wurde am Tag nach der letzten Verabreichung der Verbindungen getötet und Milzgewebe und ein femoraler Knochen von jedem Tier wurden in 10 % neutral gepuffertem Formalin fixiert. Die Knochenproben wurden innerhalb von 2 Wochen in
5 % Ameisensäure, gelöst in Formaldehyd/Aqua dest, entkalkt. Milz und Knochen wurden routinemäßig in Paraffin gelagert, 4 μm dick geschnitten und mit Hematoxilineosin (HE) wie auch mit PAS gefärbt. Knochenmark und Milz wurden licht mikroskopisch semiquantitativ hinsichtlich Zellbeschaffenheit, Myelofibrose und zellulärer Nekrose beurteilt.
e) Statistik:
Die verschiedenen Testgruppen wurden mit Kontroll-Tieren hinsichtlich der Endpunkte BMC, CFU-C Reaktion auf G-CSF, CFU-C Reaktion auf Serum und Milzgewicht verglichen. Wiederholte Messungen des WBC (Basis 1, 2, 3 und 4 Wochen) wurden in einen Endpunkt transformiert, basierend auf der mdividuellen AUC-Näherung nach Zerbe et al, Biometrics 33:653, 1992. Untersuchungen auf annähernde Normalverteilung von WBC und Milzgewicht wurden nach dem Welch T- Test (Welch, Biometrika 34:28, 1947) analysiert, da eine auffallende Varianz in der Heterogenität beobachtet wurde. Infolge des Fehlens einer annähernd normalen Verteilung für die anderen Endpunkte wurde ein permutativer U-Test nach Mehta et aL CYTEL Software Corp. Turbo- Version, Cambridge, USA, 1992, durchgeführt.
Für die Endpunkte CFU-C, bei Gabe von G-CSF oder Serum, und Milzgewicht wurde das Verfahren der multiplen Endpunktanalyse durchgeführt. Die Endpunkte nach der behandlungsfreien Zeit (Woche 6) wurden auf Reversibilität mit einem Verfahren nach Dunnett, JASA 50: 1096, 1955, analysiert, das anwendbar für den Vergleich mit Kontrollen ist. Die Berechnungen wurden an SAS, Version 6.10 (SAS/STAT: Changes and enhancements, Release 6.10, SAS Institute, 1994) und Statxact (Mehta et al, s.o.) durchgeführt.
3. Ergebnisse
a) Effekte bezüglich der femoralen Knochenmark-ZeUzahl (BMC):
Die Effekte der unterschiedlichen Behandlungsschemata sind in Tabelle 2 enthalten.
CY allein verminderte die ICnochenmark-Zellzahl auf ca. 60 % der KontroUe. Die beiden Kombinationen von CY und G-CSF reduzierten die Zahl auf ca. 30 % der KontroUe. Zwei Wochen nach dem Behandlungsende zeigten die Tiere der CY/G- CSF-Testgruppe jedoch wieder steigende Knochenmark-Zellzahl vergUchen mit der Zahl unmittelbar nach der Behandlung. Zum Schluß erreichten sie ca. 50 % der
KontroUe. Die übrigen drei Testgruppen zeigten keine relevanten Änderungen während der behandlungsfreien Nachbeobachtungszeit.
b) Effekte im CFU-C Test:
Die Reaktion auf Serum von LPS-behandelten Mäusen und auf G-CSF war in der CY-Gruppe stark vermindert verglichen zu den KnochenmarkszeUen der KontroUen. Eine deutüche Abnahme wurde bei der G-CSF/CY Behandlung beobachtet, wogegen die CY/G-CSF Testgruppe erhöhte Koloniebüdung in Gegenwart des Serums von
LPS-behandelten Mäusen und in Gegenwart von G-CSF zeigte. Nach 2 Wochen behandlungsfreier Zeit verringerten sich die Unterschiede zwischen den beiden G-CSF Gruppen und den KontroUen. Die proliferatfve Antwort auf Serum von LPS-behandelten Mäusen in der CY Gruppe war nach diesen 2 Wochen außerordentlich erhöht im Vergleich mit der deutlichen Abnahme am Ende der
Behandlungszeit. rΛ Knochenmark-Histologie:
Am Ende der Behandlungszeit: Die granulopoetische ZeUdichte in den hämatopoetisch aktiven Gebieten des femoralen Knochenmarks stieg deutlich in den zwei Gruppen, die mit G-CSF und CY behandelt wurden, an, verglichen mit KontroUtieren und der CY-Testgruppe (TabeUe 3). Der Effekt ist besonders deutüch in der G-CSF/CY Testgruppe. Es ist jedoch festzustehen, daß eine deutlich sichtbare Abnahme der hämatopoetischen Gebiete infolge Fibröse und Ossifikation in den verschiedenen Behandlungsgruppen auftrat. In der CY Gruppe waren keinerlei Anzeichen einer gesteigerten Granulopoese vorhanden.
Die Stimulierung der Granulopoese infolge der Verabreichung von G-CSF vor CY führte zu aUen Reifestadien, wohingegen nach CY/G-CSF-Gabe Reifestadien weniger häufig zu sehen waren. Das Auftreten von EinzelzeUnekrosen war in den G-CSF/CY - und CY - Testgruppen mäßig und in der CY/G-CSF-Gruppe schwach.
d) Effekte an der Milz:
Histologie am Ende der Behandlung: Die Lichtmikroskopie von Milzgewebe offenbarte ein deutUches Ansteigen der granulopoetischen ZeUen nach 4-wöchiger Behandlung in den 2 Gruppen, die G-CSF in Kombination mit CY erhielten (TabeUe 4). Die Granulopoese umfaßte aUe Stadien der granulopoetischen ZeUreifung am ausgeprägtesten in der G-CSF/CY-Gruppe. Die granulopoetische ZeUproliferation in der CY/G-CSF-Gruppe bestand hauptsächlich aus myeloblastischen ZeUen, Reifestadien waren kaum zu sehen. Die beträchtliche Steigerung der granulopoetischen Zellen trat in Verbindung mit einem beträchtlichen Umbau der Milz-Organstruktur auf. EinzelzeUnekrosen wurden in der G-CSF/CY-Gruppe und in geringerem Maße in den Tieren der CY/G-CSF- Testgruppe beobachtet. Die Milz von
Tieren, die mit CY aUein behandelt worden waren, zeigte einen schwachen zeUulären Schwund in den FoUikeln und im Retikulum. Während einer behandlungsfreien Zeit von 2 Wochen normalisierten sich die Veränderungen. In den Gruppen, in denen G- CSF und CY gegeben wurde, waren jedoch noch Anzeichen einer minimal gesteigerten hämatopoetischen Stimulierung in Form erhöhter Granulopoese,
Erythropoese und Megakaryopoese vorhanden. e) Effekte auf das Milzgewicht:
Eine enorme Steigerung (über das 3,3-fache der KontroUe) war am Ende der Behandlungszeit in den Tieren festzusteUen, die mit G-CSF/CY behandelt worden waren (TabeUe 5), eine 1,8-fache Steigerung gegenüber der KontroUe wurde in der CY/G-CSF- Testgruppe beobachtet. Keine relevanten Effekte auf das Milzgewicht gab es in der CY-Gruppe.
fl WBC:
Blutproben wurden vor der ersten Behandlung und danach wöchentlich unmittelbar vor der Verabreichung von CY (oder Placebo) entnommen. Blutproben in der G-
CSF/CY- Testgruppe wurden somit nach Verabreichung von G-CSF entnommen.
Weitere Blutproben wurden am Ende der Behandlungszeit (nach 4 Wochen) bzw. nach der behandlungsfreien Zeit von zwei Wochen gesammelt.
Wie aus TabeUe 6 hervorgeht, traten zwischen den KontroUen und den CY - und CY/G-CSF-Gruppen keine relevanten Unterschiede im WBC auf.
Die G-CSF/CY-Testgruppe zeigte in Woche 1 einen erhöhten WBC leicht über der Obergrenze des Normalen, in den folgenden Wochen 2, 3 und 4 stieg der WBC wesentlich an (7- bis 8-faches der KontroUe), eine komplette Umkehrung dieses Effektes war nach der behandlungsfreien Zeit von 2 Wochen zu beobachten.
Insgesamt ist festzustellen, daß der Grad der Osteomyelofibrose und der multifocalen Ossification nach Behandlung mit G-CSF/CY entschieden höher war als bei den anderen Methoden. Außerdem war in dieser Testgruppe eine massive Granulopoese und ein substantieUer Milzgewichtsanstieg zu beobachten, was die erhöhte StammzeUmobüisierung unterstreicht.
Die reduzierte CFU-C Kapazität von KnochenmarkszeUen nach G-CSF/CY- Verabreichung ist als Folge einer gestiegenen Mobilisierung von Progenitorzellen in das Blut anzusehen. Dies wird durch die multiple Endpunktanalyse unterstützt. Tabelle 1 : Dosierung und Einteilung der Tiere zur Testgruppe
Nach 6 Wochen (2-wochιger behandlungsfreier Zeit) erfolgte eine weitere Untersuchung in Satelittengruppen Tabelle 2 Knochenmark-Zellzahlen (BMC) von Mausen nach 4 Wochen der Behandlung und nach 2 Wochen behandlungsfreier Zeit
( t = Tier vorzeitig gestorben)
ERSATZBLATT (REGEL 26\ Tabelle 3 Histopathologische Befunde im Knochenmark (Femur)
(+) = minimal ■+ = schwach ++ = mäßig ausgeprägt
Tabelle 4: Histopathologische Befunde in der Milz
1 Alle Reifestadien überwiegend iiiyeloblastischc Zellen Tabelle 5: Milzgewicht
( t = Tier vorzeitig gestorben)
Tabelle 6: Leukozytenzahl (WBC)
( t = Tier vorzeitig gestorben)
ERSATZBLAπ (REGEL 26)

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung von G-CSF und einem Chemotherapeutikum oder einer Kombination von Chemotherapeutika zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates zur verstärkten Mobilisierung hämatopoetischer Stammzellen bei der Behandlung von Erkrankungen, die eine periphere Stammzelltransplantation erfordern, wobei G- CSF und Chemotherapeutikum in getrennten Darreichungsformen vorliegen.
2. Verwendung gemäß Anspruch 1 bei der Behandlung von Tumorerkrankungen.
3. Verwendung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei ein Chemotherapeutikum oder eine
Kombination von Chemoterapeutika eingesetzt werden, die bei vorheriger G-CSF- Applikation zur verstärkten Öffnung der Endothel- Schranke fuhren.
4. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei als Chemotherapeutika - Cytostatika bzw. deren Derivate aus den Cytostatikagruppen Alkylantien;
Metallkomplex-Cytostatika; Antimetabolite; Naturstoffe; Antibiotika; Hormone und Hormonantagonisten sowie Corticoide eingesetzt werden.
5. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei als Cytostatika Cyclophosphamid, Chlorambucil, Melphalan, Busulphan, N-Lost- Verbindungen, Mustargen, Metallkomplexe des Platins, Palladiums oder Rutheniums, Methotrexat, 5-Fluoruracil, Cytorabin, Vinblastin, Vincristin, Vindesin,
Dactinomycin, Daunorubicin, Doxorubicin, Bleomycin, Mitomycin, Diethylstilböstrol, Testolacton, Tamoxifen, Aiiunoglutethimid, Hydroxyharastofζ Procarbacin oder Prednisolon eingesetzt werden.
6. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei als Cytostatikum
Cyclophosphamid eingesetzt wird.
7 Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei rekombinantes G-CSF eingesetzt wird. Pharmazeutische Veφackungseinheit umfassend mindestens drei räumlich getrennte Bestandteile, wobei der erste Bestandteil eine übliche Darreichungsform von G-CSF, der zweite Bestandteil eine übhche pharmazeutische Darreichungsform eines Chemotherapeutikums oder einer Kombination von Chemotherapeutika darstellt und der dritte Bestandteil ein Inforniationshinweis zur Applikation des G-CSF vor Beginn der Applikation des Chemotherapeutikums (der Chemotherapeutika) ist.
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