EP0766568A1 - Verfahren zur isolierung einer antigenpräparation - Google Patents

Verfahren zur isolierung einer antigenpräparation

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EP0766568A1
EP0766568A1 EP95924903A EP95924903A EP0766568A1 EP 0766568 A1 EP0766568 A1 EP 0766568A1 EP 95924903 A EP95924903 A EP 95924903A EP 95924903 A EP95924903 A EP 95924903A EP 0766568 A1 EP0766568 A1 EP 0766568A1
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
antigen
pellet
homogenate
glycine buffer
vzv
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP95924903A
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English (en)
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Inventor
Klaus-Dieter Nothacker
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Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Original Assignee
Behringwerke AG
Behring Diagnostics GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Behringwerke AG, Behring Diagnostics GmbH filed Critical Behringwerke AG
Publication of EP0766568A1 publication Critical patent/EP0766568A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N2770/32451—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to a method for the preparation of antigen of viral origin from infected animal cells and their use in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs).
  • ELISAs enzyme-linked immunosorbent assays
  • the determination of the antibody status against a wide variety of antigens is e.g. B. with the help of the ELISA a proven and widespread technique.
  • microtiter plates are coated with the anti-gene against which antibodies can be detected and then incubated with serum. If antigen-specific antibodies are present, they bind to the offered antigen and can then be detected by a detection system with e.g. B. peroxidase-conjugated anti-antibodies can be detected via an enzyme-mediated substrate conversion with photometrically detectable color development.
  • Animal cell cultures which form the desired product or can be stimulated to do so are preferably used for antigen production for the plate coating.
  • VZV Varicella zoster virus
  • DOCUMENTS referred to as (line) homogeneous antigens - can then be used for the coating of microtiter plates for the ELISA without further purification.
  • Antigen production - such as B. from M. Lehtinen et al., Intervirology 24, pp. 18-25 (1985) - from herpes simplex virus (HSV) -infected cells for the ELISA for the detection of anti-HSV antibodies contains comparable procedural steps.
  • HSV herpes simplex virus
  • the cell homogeneous ⁇ t (extract) antigens produced according to the prior art can be used, but they contain a very large proportion of cellular proteins which are immunologically irrelevant or even disruptive and in the coating of microtiter plates with the viral protein desired for the solid phase ⁇ nen and structures compete so that the occupancy density of the polystyrene surface with virus-specific components is limited prematurely. Because of this competition, it is no longer possible to increase the sensitivity (signal) in the ELISA even with a more concentrated homogenate antigen for the coating.
  • This task was solved by an isolation process in which cellular organelles (especially cell nuclei) and proteins are enriched and viral components by a differential centrifugation of virus-containing cell homogenate antigen, which is obtained by ultrasound treatment of VZV-infected cells in glycine buffer become.
  • the pellets with virions, capsids and precursors of the virus assembly present after ultracentrifugation are resuspended in buffer with the aid of ultrasound.
  • UZ pellet antigen With the antigen obtained in this way, hereinafter referred to as "UZ pellet" antigen, it is possible, compared to the homogenate antigen previously used, to with a significantly increased signal reserve to improve ELISA test properties such as sensitivity and P / N ratio drastically, to reduce the faulty batch rate in antigen processing, since weaker raw antigens serving as starting material can be processed to high-quality antigens with great prospects of success by strong increased coating dilution to achieve an effective saving in crude antigen consumption, as a result of which the cell culture effort is considerably reduced, keeping the work-up effort practically and economically viable on a production scale.
  • the invention therefore relates to a method for the preparation of antigens of viral origin from infected animal cells, the method including the following steps:
  • a method is preferred in which a glycine buffer, preferably a glycine buffer pH 7-10, is used in at least one of steps a) - c).
  • a glycine buffer preferably a glycine buffer pH 7-10
  • a method is also preferred in which the ultracentrifugation is carried out at 54,000 to 64,000 x g.
  • a method is also preferred, wherein a further centrifugation at 5,000-10,000 x g is inserted between step b) and c).
  • the virus used is preferably a herpes, hepatitis or mumps virus.
  • the invention further relates to the use of the antigen preparations obtained by one of the methods described above for coating solid phases, such as. B. microtitration plates or particles such as latices.
  • the starting material for the production of VZV antigens according to the method according to the invention are VZV-infected, diploid human fibroblasts, which are cultured, infected, incubated and harvested according to published instructions.
  • An embodiment of the method according to the invention is advantageous, in which 1 part of cell sediment (eg measured in graduated pointed tubes) in 1.5 to 5 parts, preferably 1.5 to 2 parts of distilled water. or glycine buffer (0.1 M glycine, 0.1 M NaCl, pH 7-10, preferably 9-10, very preferably 9.5) resuspended and treated with ultrasound in an ice bath (ultrasonic homogenizer Labsonic U-2000 from B Braun Diessel Biotech GmbH, intermediate probe, power setting to 20-60, preferably 30-50 W, optionally needle probe with preferably about 50 W).
  • the duration and frequency of the ultrasound pulses are known per se to the person skilled in the art or, if appropriate, can be easily determined by simple experiments. It is preferred for volumes of e.g. B.
  • the material to be sonicated should not exceed a total volume of about 50 ml, depending on the ultrasound transmitter used.
  • the ultrasound treatment can e.g. B. in 50 ml pointed tubes (z. B. Greiner, PP, 50 ml) so that as comparable steric conditions as possible are guaranteed.
  • the diluted cell homogenate present is then adjusted to 0.05-0.1%, advantageously 0.06%, of ⁇ -propiolactone for inactivation, 10 min-16 h. incubated at 2-8 ° C and then 120 ⁇ 10 min at 37 ° C.
  • the cell homogenate which is no longer infectious by this treatment, is pelleted at low speed at 300-500 x g and 2-8 ° C. for 10 ⁇ 2 min in order to remove non-lysed cells, cell fragments and nuclei.
  • the removed centrifugation supernatant is subjected to high-speed centrifugation at 40,000-100,000 xg, preferably 54,000-64,000 xg, over 120 ⁇ 30 min at 2-8 ° C (e.g. in a Centricon T2050 ultracentrifuge from Kontron im Rotor 50.2 Ti or 45 Ti).
  • the pellet obtained by ultracentrifugation is resuspended with preferably glycine buffer (see above) in 0.05-0.5 parts by volume of the amount of homogenate after inactivation with 0.5-1.5 minute pulses (ultrasound homogenizer LABSONIC U-2000 by B. Braun Diessel Biotech GmbH, intermediate probe or needle probe, power setting 20 - 90 W) until an even suspension is obtained.
  • the "UZ pellet” antigen obtained in this way is enriched with viral constituents and depleted in cellular proteins.
  • the buffer used in the production of the cell homogenate during the UZ run and in the resuspending of the virus pellet is of crucial importance for the process.
  • this buffer By using this buffer, a further increase in quality in the ELISA is possible when preparing VZV or Mumps "UZ pellet" antigens.
  • an antigen is obtained which, when used for the ELISA, not only enables very significant quality improvements compared to the cell homogenate antigen produced according to the prior art, but also is characterized by considerable quantitative or economic advantages.
  • Tab. 1 shows the coating according to the invention with the VZV antigen preparation in comparison to the prior art.
  • "UZ pellet” antigen and homogenate antigen were prepared from the same cellular starting material. They were diluted 1:20, 40, 80, 160, 320, 640, 1,280, 2,560 and 5,120 with PBS and then used for direct coating of microtiter test plates (96 wells) with 100 ⁇ l / well.
  • the "homogenate” corresponds to the state of the art.
  • test procedure corresponded to that in the package insert for the ELI SA sales product from Behringwerke AG, Enzygnost®-Anti-VZV / lgG (test plate), product no. OWLU, prescribed procedure with a serum dilution of 1: 231.
  • the samples were incubated with the solid phase antigen, the unbound antibodies were washed out and an enzyme was conjugated to the formed solution Antibody / antigen complexes are bound, the excess conjugate solution is washed out, the coloring is effected via the enzyme by means of a chromogenic substrate solution and the reaction is then ended with a stop solution.
  • Tab. 1 a shows the mE extinctions of both sera achieved with the individual antigen settings.
  • Tab. 1 b shows the corresponding P / N relations (quotients between the extinctions of the positive and negative serum in each case in a dilution stage).
  • Immune diagnostics in the ELISA is significantly improved by the "UZ-Pellet" antigen by optimizing the discrimination of positive and negative sera and reducing the proportion of false negative sera (increase in sensitivity).
  • the large signal reserve in the "UZ pellet” antigen is striking. If a maximum OD value of 651 mE is achieved in the case of homogen antigen with the positive serum, the "UZ pellet” antigen enables extinctions of up to 1300 - 1600 mE.
  • the reaction of the negative serum is in the dilution range of 1:80 even below the OD value of 134 mE for the 1:20 diluted homogenate antigen. Only at 1:20 (double “UZ pellet” concentrate) or 1:40 (10 times “UZ pellet” concentrate) will the range of 130 mE be reached. With this constellation it is therefore possible to use the "UZ pellet” antigen to increase the extinction level in the case of positive sera of z. B. to double approx. 650 mE to approx. 1300 mE without losing specificity in the negative reaction.
  • the "UZ pellet" antigen is characterized by an identical absorbance for the negative serum in the positive serum by OD values of approx. 1400 mE with the 2-fold concentrate or approx. 1700 mE (interpolated) with the 10-fold Concentrate from (Tab. 1 c)). With an unchanged specificity, the extinction level of the positive serum is more than doubled compared to the homogenate antigen.
  • suitable antigens can also be produced from weaker starting materials (infected cells) - which must be discarded according to the prior art.
  • Table 2 also shows the P / N ratios derived from the calculated coating dilutions. They make it clear that with "UZ-Pellet" antigen in the case of positive reactions which are identical to the homogenate antigen, the extinction values with the Negative sera can be pressed by a factor of 2-4. A test improvement is thus also conceivable in such a way that the cut-off value is corrected downward, so that previously false-negative sera react correctly positively.
  • the mixture was then centrifuged at 500 ⁇ g for 10 min (at 4 ° C.). The centrifugation supernatant was removed and subjected to centrifugation at 54,000 x g for 120 min at a temperature of 4 ° C. The pellet obtained was taken up in 24 ml glycine buffer and resuspended with ultrasound.
  • the mixture was then centrifuged at 300 ⁇ g for 10 min (at 4 ° C.).
  • the centrifugation supernatant was removed and subjected to centrifugation at 64,000 x g for 120 min at a temperature of 4 ° C.
  • the pellet obtained was taken up in 11 ml glycine buffer and resuspended with ultrasound.
  • the centrifugation supernatant was removed and subjected to centrifugation at 54,000 x g for 120 min at a temperature of 4 ° C.
  • the pellet obtained was taken up in 10 ml glycine buffer and resuspended with ultrasound.
  • Tab. 4 summarizes the absorbances measured with 6 positive and one negative serum. If the P / N ratios are formed by summing up the extinctions of 4 positive sera and dividing by the corresponding OD value of the negative serum, the homogenate antigen then has an average P / N ratio of 20.2 ⁇ 1.4 (dilution range 1: 100 - 1: 1800), while the average ratio in the "UZ pellet" antigen is almost 1.5 times higher at 29.5 ⁇ 3.5. This means gain in sensitivity with the same specificity or gain in specificity with the same sensitivity.
  • 7.5 ml of a cell sediment from human fibroblasts which were infected with HAV were resuspended in 15 ml glycine buffer and treated with ultrasound in the ice bath for 4 x 1 min (ultrasound homogenizer LABSONIC U-2000 from B. Braun Diessel Biotech GmbH at 35 W, intermediate probe). After the homogenization, 210 ml of glycine buffer were added. Subsequently, ß-propiolactone was pipetted in to a final concentration of 0.1% and the mixture was incubated with gentle stirring first at 4 ° C. for 16 hours and then at 37 ° C. for 120 minutes. The mixture was then centrifuged at 300 ⁇ g for 10 min (at 4 ° C.).
  • the centrifugation supernatant was removed and subjected to centrifugation at 54,000 x g for 120 min at a temperature of 4 ° C.
  • the pellet obtained was taken up in 12.5 ml of glycine buffer and resuspended with ultrasound.
  • the antigens were coated on the well surface of microtiter plates using a polyclonal capture antibody for HAV in dilution levels of 1:10, 1:50 and 1: 100 in PBS and then tested in an ELISA.
  • Tab. 5 summarizes the extinctions measured with an undiluted positive serum. Only with the "UZ-PelIet" antigen is a desirable extinction level of> 1000 mE still exceeded by far with an antigen dilution of 1: 100, whereas the homogenate antigen does not quite reach this value with the 1:10 antigen dilution. This makes the "UZ pellet” material, if one excludes the concentration factor of 20, far more than 5 times more economical to use than the homogenate antigen.
  • the centrifugation supernatant was removed and subjected to centrifugation at 64,000 x g for 120 min at a temperature of 4 ° C.
  • the pellet obtained was taken up in 13 ml glycine buffer and resuspended with ultrasound.
  • alkaline glycine buffer over PBS shows a significant improvement in the antigen.
  • the calculable antigen coating dilution after using glycine buffer is about 1: 2000, after using PBS, on the other hand, only about 1: 600.
  • IgG serum antigen coating dilution 1 IgG serum antigen coating dilution 1:
  • Antigen coating dilution 1

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Präparation von Antigenen viralen Ursprungs aus infizierten Animalzellen sowie deren Verwendung in Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISAs).

Description

Verfahren zur Isolierung einer Antigenpräparation
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Präparation von Antigen viralen Ursprungs aus infizierten Animalzellen sowie deren Verwendung in Enzyme-Iinked Immunosorbent Assays (ELISAs).
In der modernen Immundiagnostik an Patientenseren ist die Ermittlung des Anti¬ körperstatus gegen die verschiedensten Antigene z. B. mit Hilfe des ELISA eine be¬ währte und weit verbreitete Technik. Dabei werden Mikrotiterplatten mit dem Anti¬ gen, gegen das Antikörper nachzuweisen sind, beschichtet und anschließend mit Serum inkubiert. Sind antigenspezifische Antikörper vorhanden, so binden diese an das angebotene Antigen und können dann durch ein Detektionssystem mit z. B. Peroxidase-konjugierten Anti-Antikörpern über eine enzymvermittelte Substratum¬ wandlung mit photometrisch erfaßbarer Farbentwicklung nachgewiesen werden.
Zur Antigenproduktion für die Plattenbeschichtung werden bevorzugt Animalzellkul- turen eingesetzt, die das gewünschte Produkt bilden oder dazu angeregt werden können. Für die Erfassung der humoralen Immunitätslage gegen bestimmte Virus- spezifitäten mit einem geeigneten ELISA werden z. B. Zellkulturen mit den entspre-* chenden Viren infiziert und einige Zeit später geerntet, wenn die Infektion den gan¬ zen Zellrasen erfaßt hat. Die infizierten Zellen sind dann Ausgangsmaterial für die Herstellung des für die Testplattenbeschichtung benötigten viralen Antigens.
N.E. Cremer et al., J. Clin. Microbiol. 21 S. 869 - 874 (1985) beschreiben, daß die Antigenpräparation aus Kulturen, die mit Varicella Zoster-Virus (VZV) - einem Ver¬ treter der humanen Herpesviren - infiziert wurden, in der Weise durchgeführt wird, daß aus Animalzellen durch Aufschluß mit Ultraschall oder mehrmaliger Frier/Tau- Behandlung Zellhomogenate hergestellt werden, in denen dann Nuclei und cytoso- lische Bestandteile suspendiert vorliegen. Als Medien zur Aufnahme der Zellen vor Aufschlußbehandlung wird isotonisches Phosphat Buffered Saline (PBS) oder alkali¬ scher Glycinpuffer gewählt. Die erhaltenen Zellhomogenate werden einer nieder- tourigen Klärzentrifugation unterzogen, um Zellkerne und andere größere Bestand¬ teile zu sedimentieren. Die abgenommenen Zentnfugationsüberstände - nachfolgend
UNTERLAGEN als (Zeil) Homogenantigene bezeichnet - können daraufhin ohne weitere Aufreini¬ gung zur Beschichtung von Mikrotiterplatten für den ELISA eingesetzt werden. Die Antigenherstellung - wie z. B. von M. Lehtinen et al., Intervirology 24, S. 18 - 25 (1985) beschrieben - aus Herpes Simplex Virus (HSV)-infizierten Zellen für den ELISA zum Nachweis von Anti-HSV-Aπtikörpern beeinhaltet vergleichbare Verfah¬ rensschritte. Das Vorgehen bei Hepatitis A Virus (HAV) nach dem oben beschrie¬ benen Prinzip wird von K.-Q. Wang et al, Intervirology 24, 99 - 107 (1985) darge¬ stellt.
Die nach dem Stand der Technik hergestellten Zellhomogen^t(Extrakt)antigene sind zwar verwendbar, enthalten aber einen sehr großen Anteil zellulärer Proteine, die immunologisch irrelevant oder sogar störend sind und bei der Beschichtung von Mikrotiterplatten mit den für die Belegung der Festphase erwünschten viralen Protei¬ nen und Strukturen konkurrieren, so daß die Besetzungsdichte der Polystyrolober¬ fläche mit virusspezifischen Komponenten vorzeitig limitiert wird. Aufgrund dieser Kompetition ist auch durch ein stärker konzentriertes Homogenatantigen für die Be¬ schichtung keine Sensitivitäts(Signal)-Steigerung im ELISA mehr möglich.
Der vorliegenden Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, unter Einsatz eines geeigneten Puffers bei der Antigenaufarbeitung den Anteil der im Zellhomogenat vorhandenen zellulären Proteine wesentlich zu reduzieren, um so die Belegungs¬ dichte für virusspezifische Komponenten auf der Festphase zu erhöhen. Dies ist eine entscheidende Voraussetzung, um Testeigenschaften wie Sensitivität und posi¬ tiven Vorhersagewert bei unveränderter Spezifität verbessern zu können und mög¬ lichst gleichzeitig zu einem noch ökonomischeren Mengeneinsatz von Antigenen bei der Beschichtung von Testplatten zu kommen.
Gelöst werden konnte diese Aufgabe durch ein Isolierungsverfahren, bei dem durch eine diffententielle Zentrifugation von virushaltigem Zellhomogenat-Antigen, das durch Ultraschallbehandlung von in Glycinpuffer aufgenommenen VZV-infizierten Zellen gewonnen wird, zelluläre Organellen (vor allem Zellkerne) und Proteine ab- und virale Bestandteile angereichert werden. Die nach einer Ultrazentrifugation vor¬ liegenden Pellets mit Virionen, Capsiden und Vorstufen des Virus-Assembly werden ultraschallunterstützt in Puffer resuspendiert. Mit dem so erhaltenen Antigen, nach¬ folgend als "UZ-Pellet"-Antigen bezeichnet, ist es gegenüber dem bisher verwende¬ ten Homogenat-Antigen möglich, bei erheblich erhöhter Signalreserve ELISA-Testeigenschaften wie Sensitivität und P/N-Ratio drastisch zu verbessern, die Fehlchargenquote bei der Antigenaufarbeitung zu reduzieren, da auch schwächere, als Ausgangsmaterial dienende Rohantigene mit großer Erfolgs¬ aussicht zu qualitativ hochwertigen Antigenen aufgearbeitet werden können, durch stark erhöhte Beschichtungsverdünnungeη eine wirkungsvolle Einspa¬ rung im Rohantigen-Verbrauch zu erzielen, wodurch der Zellkulturaufwand er¬ heblich reduziert wird, den Aufarbeitungsaufwand im Produktionsmaßstab praktikabel und wirtschaft¬ lich tragbar zu halten.
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Präparation von Antigenen viralen Ursprungs aus infizierten Animalzellen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte einschließt:
a) Ultraschallhomogenisierung infizierter Zellen,
b) mindestens eine niedertourige Zentrifugation zur Abtrennung von Verun reinigungen und
c) mindestens eine Ultrazentrifugation zur Isolierung des Antigens.
Bevorzugt ist dabei ein Verfahren, wobei in mindestens einem der Schritte a) - c) ein Glycinpuffer, bevorzugterweise ein Glycinpuffer pH 7 - 10, verwendet wird.
Bevorzugt ist auch ein Verfahren, wobei die Ultrazentrifugation mit 54.000 bis 64.000 x g erfolgt.
Bevorzugt ist ferner ein Verfahren, wobei zwischen Schritt b) und c) eine weitere Zentrifugation bei 5.000 - 10.000 x g eingefügt ist.
Bevorzugterweise ist das eingesetzte Virus ein Herpes-, Hepatitis- oder Mumpsvirus.
Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der nach einem der oben beschriebenen Verfahren erhaltenen Antigenpräpartionen zur Beschichtung von Festphasen, wie z. B. Mikrotitrationsplatten oder Partikel, wie Latices. Ausgangsmaterial für die Herstellung von VZV-Antigenen nach dem erfindungsge¬ mäßen Verfahren sind VZV-infizierte, diploide Humanfibroplasten, die nach publi¬ zierten Anleitungen kultiviert, infiziert, inkubiert und geerntet werden.
Vorteilhaft ist eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, bei dem 1 Teil Zellsediment (z. B. gemessen in graduierten Spitzröhrchen) in 1 ,5 - 5, vorzugs¬ weise 1 ,5 - 2 Teilen Aqua dest. oder Glycinpuffer (0,1 M Glycin, 0,1 M NaCI, pH 7 - 10, bevorzugterweise 9 - 10, ganz bevorzugterweise 9,5) resuspendiert und im Eis¬ bad mit Ultraschall behandelt (Ultraschall-Homogenisator Labsonic U-2000 von B. Braun Diessel Biotech GmbH, Zwischensonde, Leistungseinstellung auf 20 - 60, vorzugsweise 30 - 50 W, gegebenenfalls Nadelsonde mit bevorzugterweise etwa 50 W) wird. Die Dauer und Häufigkeit der.Ultraschall-lmpulse ist dem Fachmann an sich bekannt oder gegebenenfalls durch einfache Versuche leicht zu ermitteln. Be¬ vorzugt wird, bei Volumina von z. B. etwa 10 - 50 ml, eine Beschallungsdauer von - 2 min und eine Beschallungshäufigkeit von etwa 3 - 5 Intervallen. Um einen stets ausreichenden Energieeintrag zu gewährleisten, sollte das Beschallungsgut in Ab¬ hängigkeit vom verwendeten Ultraschallgeber ein Gesamtvolumen von etwa 50 ml nicht überschreiten. Die Ultraschallbehandlung kann z. B. in 50 ml-Spitzröhrchen (z. B. Greiner, PP, 50 ml) so erfolgen, daß möglichst vergleichbare sterische Verhält¬ nisse garantiert sind. Nach Zugabe von weiteren 28 - 36 Teilen Glycinpuffer (bezogen auf Zellsedimentvolumen) wird dann das vorliegende verdünnte Zellhomo- genat zur Inaktivierung auf 0,05 - 0,1 %, vorteilhafterweise 0,06 % ß-Propiolacton eingestellt, 10 min - 16 Std. bei 2- 8 °C und danach 120 ± 10 min bei 37 °C inkubiert. Das durch diese Behandlung nicht mehr infektiöse Zellhomogenat wird niedertourig bei 300 - 500 x g und 2 - 8 °C über 10 ± 2 min pelletiert, um nicht-lysierte Zellen, Zellbruchstücke und Nuclei zu entfernen. Der abgenommene Zentrifugationsüber- stand wird einer hochtourigen Zentrifugation mit 40.000 - 100.000 x g, vorzugsweise 54.000 - 64.000 x g, über 120 ± 30 min bei 2 - 8 °C unterzogen (z. B. in einer Cent- ricon T2050-Ultrazentrifuge der Firma Kontron im Rotor 50.2 Ti oder 45 Ti).
Das über Ultrazentrifugation erhaltene Pellet wird mit bevorzugterweise Glycinpuffer (s.o.) in 0,05 - 0,5 Volumenanteilen der Homogenatmenge nach Inaktivierung ultra¬ schallunterstützt mit 0,5 - 1 ,5 Minuten-Pulsen resuspendiert (Ultraschall-Homogeni¬ sator LABSONIC U-2000 von B. Braun Diessel Biotech GmbH, Zwischensonde oder Nadelsonde, Leistungseinstellung 20 - 90 W), bis eine gleichmäßige Suspension vorliegt. Das so gewonnene "UZ-Pellet"-Antigen ist, wie wir feststellen, mit viralen Bestand¬ teilen an- und von zellulären Proteinen abgereichert.
Neben der Ultrazentrifugation ist der bei der Herstellung des Zellhomogenats wäh¬ rend des UZ-Laufs und bei der Resuspendierung des Viruspellets eingesetzte Puffer von entscheidender Bedeutung für das Verfahren. Durch die Verwendung dieses Puffers ist bei der Präparation von VZV- oder Mumps-"UZ-Pellet"-Antigen eine nochmalige Qualitätssteigerung im ELISA möglich.
Die Vorteilhaftigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens geht insbesondere auch aus dem Vergleich mit dem Stand der Technik hervor.
Durch die Anreicherung viraler Bestandteile mittels differentieller Zentrifugation nach Homogenisierung VZV-invizierter Zellen wird ein Antigen erhalten, das bei seiner Verwendung für den ELISA gegenüber dem nach dem Stand der Technik produzier¬ ten Zellhomogenat-Antigen nicht nur sehr deutliche Qualitätsverbesserungen er¬ möglicht, sondern auch durch erhebliche Quantitäts- bzw. Ökonomievorteile ge¬ kennzeichnet ist.
Tab. 1 zeigt die erfindungsgemäße Beschichtung mit der VZV-Antigenpräparation im Vergleich zum Stand der Technik. "UZ-Pellet"-Antigen und Homogenatantigen wur¬ den von dem gleichen zellulären Ausgangsmaterial ausgehend hergestellt. Sie wur¬ den 1 :20, 40, 80, 160, 320, 640, 1.280, 2.560 und 5.120 mit PBS verdünnt und dann zur Direktbeschichtung von Mikrotitertestplatten (96 Näpfe) mit 100 μl/Napf einge¬ setzt. Das "Homogenat" entspricht dem Stand der Technik.
Beim "UZ-Pellet"-Material wurde neben einem gegenüber dem Ausgangs-Homo- genatvolumen 10fach ankonzentrierten Antigen auch noch ein nur 2fach ankonzen¬ triertes Antigen verwendet.
Nach Antigenadsorption wurde ein Anti-VZV-lgG-positives und ein Anti-VZV-lgG- negatives Serum in den verschiedenen Verdünnungsstufen ausgetestet. Die Test¬ durchführung entsprach dabei dem in der Packungsbeilage für das ELI SA-Verkaufs¬ produkt der Behringwerke AG, Enzygnost®-Anti-VZV/lgG (Testplatte), Produkt-Nr. OWLU, vorgeschriebenen Ablauf mit einer Serumverdünnung von 1 :231.
Die Proben wurden mit dem Festphasen-Antigen inkubiert, die nicht gebundenen Antikörper ausgewaschen, über eine Konjugatlösung ein Enzym an den gebildeten Antikörper/Antigen-Komplexen gebunden, die überschüssige Konjugatlösung aus¬ gewaschen, mittels einer chromogenen Substratlösung die Einfärbung über das Enzym bewirkt und anschließend mit einer Stopp-Lösung die Reaktion beendet. Die so hergestellten, in Abhängigkeit vom Gehalt der virusspezifischen Antikörper einge¬ färbten Proben wurden dann bewertet, indem ihre Extinktion (E) photometrisch bei 450 nm bestimmt wurde.
Die Tab. 1 a) zeigt die bei den einzelnen Antigeneinstellungen erreichten mE-Extink- tionen beider Seren.
Tab. 1 b) zeigt die entsprechenden P/N-Relationen (Quotienten zwischen den Ex¬ tinktionen des Positiv- und Negativserums in jeweils einer Verdünnungsstufe). Lie¬ gen die Quotienten für das "UZ-Pellet"-Antigen im ELISA-relevanten Verdünnungs¬ bereich von 1 : 20 - 1 : 320 (2fach Konzentrat) bzw. 1 : 40 - 1 : 1280 (10fach Kon¬ zentrat) bei 9,0 - 13,7 (Mittelwert x = 11 ,8 + 1 ,4), so bleibt das Homgenatantigen demgegenüber mit seinen P/N-Ratios von 3,2 - 4,9 (x = 4,2 ± 0,8) im Verdünnungs¬ bereich von 1 : 20 - 1 : 160 weit zurück. Die Immundiagnostik im ELISA wird durch das "UZ-Pellet"-Antigen deutlich verbessert, indem die Diskrimierung positiver und negativer Seren optimiert und der Anteil falsch-negativer Seren reduziert wird(Sensitivitätssteigerung).
Auffallend ist die große Signalreserve beim "UZ-Pellet"-Antigen. Wird beim Homo¬ genatantigen mit dem Positivserum ein Maximal-OD-Wert von 651 mE erreicht, so ermöglicht das "UZ-Pellet"-Antigen Extinktionen bis zu 1300 - 1600 mE. Dabei liegt die Reaktion des Negativserums bis in den Verdünnungsbereich von 1 : 80 sogar unter dem OD-Wert von 134 mE beim 1 : 20 verdünnten Homogenatantigen. Erst bei 1 : 20 (2fach "UZ-Pellet"-Konzentrat) bzw. 1 : 40 (10fach "UZ-Pellet"-Konzentrat) wird dann der Bereich von 130 mE erreicht. Mit dieser Konstellation ist es also mög¬ lich, durch die Verwendung von "UZ-Pellet"-Antigen die Extinktionshöhe bei Positiv¬ seren von z. B. ca. 650 mE auf ca. 1300 mE zu verdoppeln, ohne bei der Negativre¬ aktion an Spezifität einzubüßen.
Vergleichbare Ergebnisse werden auch im IgM-Test gefunden (Tab. 1 c) und d)) Die Beschichtungs- Verdünnungen wurden wie beim IgG-Test gewählt. Die Test¬ durchführung erfolgte gemäß Packungsbeilage Enzygnost®-Anti-VZV/lgM (Testplatte), Produkt-Nr. OWLX mit einer Serumverdünnung von 1 : 42. Das "UZ- Peilef'-Antigen erlaubt OD-Werte bis 2000 E mit dem Anti-VZV-IgM-Positivserum. Beim Homogenatantigen wird ein bei der Antigenverdünnung von 1 : 20 erreichter Maximalwert von 624 mE nicht überschritten, gleichzeitig reagiert das Negativserum im ELISA-relevanten Verdünnungsbereich von 1 : 20 - 1 : 80 mit ca. 150 mE. Das "UZ-Pellet"-Antigen zeichnet sich dagegen bei identischer Extinktion für das Nega¬ tivserum beim Positivserum durch OD-Werte von ca. 1400 mE mit dem 2fach-Kon- zentrat bzw. ca. 1700 mE (interpoliert) mit dem 10fach-Konzentrat aus (Tab. 1 c)). Damit ist bei unveränderter Spezifität die Extinktionshöhe des Positivserums gegen¬ über dem Homogenatantigen mehr als verdoppelt.
Entsprechende Ergebnisse findet man bei den P/N-Relationen (Tab. 1 d)). Das "UZ- Pellef-Antigen weist beim 2fach-Konzentrat für die Verdünnungen von 1 : -40 - 1 : 640 Werte von 7,1 - 9,6 (x = 8,8 ± 1 ,5) und beim 10fach-Konzentrat im Verdün¬ nungsbereich von 1 : 40 - 1 : 5120 Quotienten von 6,0 - 10,9 (x = 8,8 ± 1 ,8) auf. Das Homogenat fällt für die interessanten Antigenverdünnungen von 1 : 20 - 1 : 80 mit Ratios von 1 ,9 - 4,2 (x = 3,2 ± 1 ,2) weit ab. Wie beim IgG-Test ist damit die Voraussetzung erfüllt, allgemein die Diskriminierung positiver und negativer Se¬ ren zu verbessern und den Anteil falsch-negativer Seren ohne Spezifitätseinbußen zu reduzieren (Sensitivitätssteigerung).
Durch das erfindungsgemäße Verfahren können auch aus schwächeren Ausgangs¬ materialien (infizierte Zellen) - die nach dem Stand der Technik verworfen werden müssen - geeignete Antigene hergestellt werden.
Legt man den für Homogenatantigene üblichen Mindest-OD-Sollwert des IgG-Posi- tivserums von ca. 650 mE zur interpolativen Berechnung der maximal möglichen Verdünnung eines Antigens bei Beschichtung an, so ergeben sich Faktoren von 1 : 20 für das Homogenat, 1 : 249 für das 2fach- und 1 : 882 für das 10fach-"UZ-Pellet"- Konzentrat (Tab. 2). Unter Berücksichtigung der Konzentrierungsfaktoren bei der Antigenpräparation über differentielle Zentrifugation ergibt sich ein 4 - 6fach öko¬ nomischerer Einsatz beim "UZ-Pellet"- Antigen gegenüber dem Homogenat, wenn man die Testeigenschaften- und anforderungen zunächst unverändert läßt. Bei gleichbleibendem Zeilkultivierungsaufwand für die Herstellung des Ausgangsmate¬ rials (Rohantigen) können demnach durch den Einsatz von "UZ-Pellet"-Antigen 4 - 6 mal mehr Testplatten mit Antigen als zuvor beschichtet werden. Entsprechendes gilt für den IgM-Test.
Die Tabelle 2 zeigt auch die bei den berechneten Beschichtungsverdünnungen ab¬ geleiteten P/N-Ratios. Sie verdeutlichen, daß mit "UZ-Pellet"-Antigen bei identisch zum Homogenatantigen einstellten Positivreaktionen die Extinktionswerte mit den Negativseren um den Faktor 2 - 4 gedrückt werden können. Damit ist eine Testver¬ besserung auch derart denkbar, daß der cut off-Wert nach unten korrigiert wird, so daß zuvor falsch-negative Seren richtig positiv reagieren.
Der Einsatz eines alkalischen Glycinpuffers bei der "UZ-Pellet"-Antigenpräparation aus VZV-infizierten Zellen wirkt sich gegenüber der Verwendung eines pH-neutra¬ len, physiologischen Phosphatpuffers (PBS) sehr vorteilhaft aus. Tab. 3 zeigt dies an den mit 3 IgG-Positiv- und einem -Negativserum gemessenen Extinktionen nach vergleichender Aufarbeitung mit beiden Puffern gemäß dem unter 1 b) beschriebe¬ nen Ablauf.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern, sie aber in keiner Weise einschränken.
Beispiele
1. Herstellung des "UZ-Pellet"-Antigen aus Varizella Zoster (VZV)-infizierten Zellen
a) 7,2 ml eines Zellsediments wurden in 10,8 ml aqua.dest. resuspendiert und im Eisbad x 1 min mit Ultraschall behandelt (Ultraschallhomogenisator LABSONIC U-2000 von B. Braun Diessel Biotech GmbH bei 50 W, Nadel¬ sonde). Nach der Homogenisation wurden 202 ml Glycinpuffer (0,1 mol. Glycin, 0,1 mol NaCI, pH 9,5 ± 0,5) hinzugegeben. Anschließend wurde ß-Propiolacton bis zu einer Endkonzentration von 0,06 % einpipettiert und die Mischung unter leichtem Rühren erst bei 4 °C über 10 min und dann bei 37 °C 120 min inku¬ biert. Anschließend wurde bei 500 x g 10 min (bei 4 °C) abzentrifugiert. Der Zentrifugationsüberstand wurde abgenommen und einer Zentrifugation bei 54.000 x g über 120 min bei einer Temperatur von 4 °C unterzogen. Das dabei erhaltene Pellet wurde in 24 ml Glycinpuffer aufgenommen und ultraschall¬ unterstützt resuspendiert.
b) 3 ml eines Zellsediments wurden in 12 ml Glycinpuffer suspendiert und im Eis¬ bad 4 x 1 min mit Ultraschall behandelt (Ultraschallhomogenisator LABSONIC U-2000 von B. Braun Diessel Biotech GmbH bei 20 W, Zwischensonde). Nach der Homogenisation wurden 84 ml Glycinpuffer (0,1 mol Glycin, 0,1 mol NaCI, pH 9,5 + 0,5) hinzugegeben. Anschließend wurde ß-Propiolacton bis zu einer Endkonzentration von 0,06 % einpipettiert und die Mischung erst 10 min bei 4 °C und dann 120 min bei 37 °C unter leichtem Rühren inkubiert. Anschließend wurde bei 300 x g 10 min (bei 4 °C) abzentrifugiert. Der Zentrifugationsüber¬ stand wurde abgenommen und einer Zentrifugation bei 64.000 x g über 120 min bei einer Temperatur von 4 °C unterzogen. Das dabei erhaltene Pellet wurde in 11 ml Glycinpuffer aufgenommen und ultraschallunterstützt resus¬ pendiert.
c) ■ Die Aufarbeitung erfolgte identisch zu 1 b) mit der Änderung, daß der Glycin¬ puffer jeweils durch PBS ersetzt wurde. 2. Präparation von "UZ-Pellet" -Antigen aus Herpes Simplex Virus (HSV)- infizierten Zellen
5,7 ml eines Zellsediments aus Vero-Zellen, die mit HSV infiziert waren, wurden in 9 ml aqua.dest. resuspendiert und im Eisbad 4 x 1 min mit Ultraschall behandelt (Ultraschallhomogenisator LABSONIC U-2000 von B. Braun Diessel Biotech GmbH bei 20 W, Zwischensonde). Nach der Homogenisation wurden 168 ml Glycinpuffer hinzugegeben. Anschließend wurde ß-Propiolacton bis zu einer Endkonzentration von 0,06 % einpipettiert und die Mischung unter leichtem Rühren erst bei 4 °C 10 min und dann bei 37 °C 120 min inkubiert. Anschließend wurde bei 500 x g 10 min (bei 4 °C) abzentrifugiert. Der Zentrifugationsüberstand wurde abgenommen und einer Zentrifugation bei 54.000 x g über 120 min bei einer Temperatur von 4 °C un¬ terzogen. Das dabei erhaltene Pellet wurde in 10 ml Glycinpuffer aufgenommen und ultraschallunterstützt resuspendiert.
Tab. 4 faßt die mit 6 Positiv- und einem Negativserum gemessenen Extinktionen zusammen. Werden die P/N-Verhältnisse durch Aufsummation der Extinktionen von jeweils 4 Positivseren und Division durch den zugehörigen OD-Wert des Negativse¬ rums gebildet, weist das Homogenatantigen danach ein mittleres P/N-Ratio von 20,2 ± 1 ,4 (Verdünnungsbereich 1 : 100 - 1 : 1800) auf, während das mittlere Verhältnis beim "UZ-Pellet"-Antigen fast 1 ,5fach höher bei 29,5 ± 3,5 liegt. Das bedeutet Sen- sitivitätsgewinn bei gleicher Spezifität bzw. Spezifitätsgewinn bei gleich eingestellter Sensitivität.
Die Austestung auf IgM führt zu einer ganz ähnlichen Einschätzung. Dabei steht dem Homogenatantigen mit einem mittleren P/N-Ratio von 16,2 ± 2,6 ein 2,1 fach höherer Quotient von 34,6 ± 2,8 beim "UZ-Pellet"-Antigen gegenüber.
3. Präparation von "UZ-PeHet"-Antigen aus Hepatitis A-Virus (HAV)-infizierten Zellen
7,5 ml eines Zellsediments aus Humanfibroblasten, die mit HAV infiziert waren, wur¬ den in 15 ml Glycinpuffer resuspendiert und im Eisbad 4 x 1 min mit Ultraschall be¬ handelt (Ultraschallhomogenisator LABSONIC U-2000 von B. Braun Diessel Biotech GmbH bei 35 W, Zwischensonde). Nach der Homogenisation wurden 210 ml Glycin¬ puffer hinzugegeben. Anschließend wurde ß-Propiolacton bis zu einer Endkonzen¬ tration von 0,1 % einpipettiert und die Mischung unter leichtem Rühren erst bei 4 °C 16 Std. und dann bei 37 °C 120 min inkubiert. Anschließend wurde bei 300 x g 10 min (bei 4 °C) abzentrifugiert. Der Zentrifugationsüberstand wurde abgenommen und einer Zentrifugation bei 54.000 x g über 120 min bei einer Temperatur von 4 °C unterzogen. Das dabei erhaltene Pellet wurde in 12,5 ml Glycinpuffer aufgenommen und ultraschallunterstützt resuspendiert.
Die Antigene wurden unter Einsatz eines polyklonalen Fängerantikörpers für HAV in Verdünnungsstufen von 1 : 10, 1 : 50 , und 1 : 100 in PBS auf die Näpfchenoberflä¬ che von Mikrotiterplatten beschichtet und dann im ELISA ausgetestet. Tab. 5 faßt die mit einem unverdünnten Positivserum gemessenen Extinktionen zusammen. Nur mit dem "UZ-PelIet"-Antigen wird eine wünschenswerte Extinktionshöhe von > 1000 mE noch bei einer Antigenverdünnung von 1 : 100 bei weitem überschritten, wäh¬ rend das Homogenatantigen diesen Wert bereits bei der 1 : 10-Antigenverdünnung nicht ganz erreicht. Damit ist das "UZ-Pellet"-Material, rechnet man den Konzentrie¬ rungsfaktor von 20 raus, weit mehr als 5fach wirtschaftlicher einsetzbar als das Ho¬ mogenatantigen. Es liefert außerdem eine große Signalreserve, die die Entwicklung eines wesentlich sensitiveren Tests als mit Homogenatantigen möglich macht. Wäh¬ rend mit Homogenatantigen bei schwächerem Ausgangsmaterial Fehlchargen unver¬ meidbar sind, wird es bei der Antigenpräpartion über differentielle Zentrifugation kaum zu Ausfällen kommen.
4. Einsatz von Glycinpuffer bei der Präparation von Mumps-"UZ-Pellet"- Antigen
a) 4 ml eines Zellsediments wurden in 16 ml Glycinpuffer resuspendiert und im Eisbad 4 x 1 min mit Ultraschall behandelt (Ultraschallhomogenisator LABSONIC U-2000 von B. Braun Diessel Biotech GmbH bei 20 W, Zwischen¬ sonde). Nach der Homogenisation wurden 144 ml Glycinpuffer hinzugegeben. Anschließend wurde ß-Propiolacton bis zu einer Endkonzentration von 0,06 % einpipettiert und die Mischung unter leichtem Rühren erst bei 4 °C 10 min und dann bei 37 °C 120 min inkubiert. Anschließend wurde bei 300 x g 10 min (bei 4 °C) abzentrifugiert. Der Zentrifugationsüberstand wurde abgenommen und einer Zentrifugation bei 64.000 x g über 120 min bei einer Temperatur von 4 °C unterzogen. Das dabei erhaltene Pellet wurde in 13 ml Glycinpuffer aufgenom¬ men und ultraschallunterstützt resuspendiert.
b) Die Aufarbeitung erfolgte identisch zu 4 a) mit der Änderung, daß der Glycinpuffer jeweils durch PBS ersetzt wurde.
Die Verwendung von alkalischem Glycinpuffer gegenüber PBS zeigt eine deutliche Verbesserung des Antigens. So liegt die errechenbare Antigen-Beschichtungsver- dünnung nach Einsatz von Glycinpuffer bei ca. 1 : 2000, nach PBS-Verwendung da¬ gegen nur bei ca. 1 : 600.
Tab. 1 a): Extinktion (mE) im ELISA mit einem Anti-VZV-positiven und -negativen IgG-Serum nach Beschich¬ tung von Testplatten mit VZV-Homogenat- und -UZ-Pellet-Antigen in den genannten Verdünnungen
IgG-Serum Antigen-Beschichtungsverdünnung 1 :
VZV-Antigen Nr. pos./neg. 20 40 80 160 320 640 1280 2560
Homogenat 413124A pos. 651 497 345 176 89 40 21 11 123948 neg. 134 104 91 55 39 26 21 11
UZ-Pellet 413124A pos. 1607 1569 1294 900 452 167 61 27 (2fach Konz.) 123948 neg. 133 141 96 70 43 24 15 11
UZ-Pellet 413124A pos. 1335 1291 1192 1252 1138 778 442 184 (10fach Konz.) 123948 neg. 231 144 116 108 83 63 36 20
Tab. 1 b): Aus den Extinktionen von Tab. 1 a) errechnete P/N-Relationen
Tab. 1 c): Extinktion (mE) im ELISA mit einem Anti-VZV-positiven und -negativen IgG-Serum nach Beschich¬ tung von Testplatten mit VZV-Homogenat- und -UZ-Pellet-Antigen in den genannten Verdünnungen
Tab. 1 d): Aus den Extinktionen von Tab. 1 c) errechnete P/N-Relationen
Tab. 2: Beschichtungsverdünnungen für VZV-UZ-Pellet- und Homogenat-Antigen bei Anlegung vorgegebener OD- Mindestsollwerte der in Tab. 1 und 3 genannten Positivseren
Tab. 3: Extinktionen (mE) im ELISA mit 3 Anti-VZV-positiven und einem -negativen IgG-Serum nach Be¬ schichtung von UZ-Pellet-Antigen, das in Glycinpuffer bzw. PBS präpariert wurde
Antigen-Beschichtungsverdünnung 1 :
IgG-Serum Glycinpuffer bei Ag-Präparation PBS bei Ag-Präparation
Nr. pos./neg. 40 80 160 320 40 80 160 320
410828 pos. 1113 1025 811 652 977 942 770 507
S-367 pos. 351 348 268 225 256 251 219 137
S-361 pos. 290 305 252 174 233 227 206 146
123948 neg. 27 27 20 17 26 20 16 15
Tab. 4: Extinktion (mE) im ELISA mit 6 Anti-HSV-positiven und einem -negativen IgG-Serum nach Beschichtung von von Testplatten mit HSV-Homogenat- und -UZ-Pellet-Antigen in den angegebenen Verdünnungen
Tab. 5: Extinktionen (mE) im ELISA mit einem Anti-HAV-positiven IgG-Serum (42651 NA) nach Beschichtung einer Testplatte mit HAV-Homogenat- und -UZ-Pellet-Antigen in den angegebenen Verdünnungen
HAV-Antigen Antigen-Beschichtungsverdünnung 1 :
10 50 100
Homogenat 946 443 353
UZ-Pellet (20 3651 3460 2536 fach) Konz.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Präparation von Antigenen viralen Ursprungs aus infizierten Animalzellen, wobei das Verfahren die folgenden Schritte einschließt:
a) Ultraschallhomogenisierung infizierter Zellen,
b) mindestens eine niedertourige Zentrifugation zur Abtrennung von Verunreinigungen und
c) mindestens eine Ultrazentrifugation zur Isolierung des Antigens.
2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 , wobei in mindestens einem der Schritte a) - c) ein Glycinpuffer, bevorzugterweise ein Glycinpuffer pH 7 - 10, verwendet wird.
3. Ein Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Ultrazentrifugation mit 54.000 bis 64.000 x g erfolgt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 3, wobei zwischen Schritt b) und c) eine weitere Zentrifugation bei 5.000 - 10.000 x g eingefügt ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 4, wobei das Virus ein Herpes-, Hepatitis- oder Mumpsvirus ist.
6. Verwendung der nach einem der Verfahren nach Anspruch 1 - 6 erhaltenen Antigenpräpartionen zur Beschichtung von Festphasen, wie z. B. Mi rotitrationsplatten oder Partikel, wie Latices.
EP95924903A 1994-06-24 1995-06-22 Verfahren zur isolierung einer antigenpräparation Withdrawn EP0766568A1 (de)

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