EP0602026A1 - Nouveau derive organique d'un metal a structure phospholipidique, utilisation de ce derive comme agent biomediateur, procede d'isolement de ce derive et compositions pharmaceutiques le contenant - Google Patents

Nouveau derive organique d'un metal a structure phospholipidique, utilisation de ce derive comme agent biomediateur, procede d'isolement de ce derive et compositions pharmaceutiques le contenant

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Publication number
EP0602026A1
EP0602026A1 EP90917273A EP90917273A EP0602026A1 EP 0602026 A1 EP0602026 A1 EP 0602026A1 EP 90917273 A EP90917273 A EP 90917273A EP 90917273 A EP90917273 A EP 90917273A EP 0602026 A1 EP0602026 A1 EP 0602026A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
derivative
organic
metal
linked
acid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP90917273A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jean-Claude Maurel
Jean-Pierre Masse
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ir2m
Original Assignee
Ir2m
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ir2m filed Critical Ir2m
Publication of EP0602026A1 publication Critical patent/EP0602026A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
    • C07F9/02—Phosphorus compounds
    • C07F9/06—Phosphorus compounds without P—C bonds
    • C07F9/08—Esters of oxyacids of phosphorus
    • C07F9/09—Esters of phosphoric acids
    • C07F9/10—Phosphatides, e.g. lecithin
    • C07F9/106—Adducts, complexes, salts of phosphatides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders

Definitions

  • New organic derivative of a metal with a phospholipid structure use of this derivative as a biomediation agent, process for the isolation of this derivative and pharmaceutical compositions containing it.
  • the invention essentially relates to a new organic derivative of a metal with a phospholipid structure, the use of this derivative as a biomediating agent, a process for isolating this derivative and pharmaceutical compositions containing it.
  • this new formulation must be simple to prepare and be sufficiently stable over time to allow therapeutic use under the best conditions.
  • the present invention solves the technical problems stated above in an extremely simple manner, by providing the formulation of a metal, preferably a metal of valence at least equal to 3, which exhibits remarkable bioavailability, as well as very low toxicity and excellent stability over time.
  • the present invention provides a new organic derivative of a metal, characterized in that it consists of a derivative of a metal, preferably of valence at least equal to 3, with an organic compound comprising at least one phospholipid which confers water-solubility or hydromiscibility on the organic derivative of said metal.
  • the aforementioned metal is linked to the phosphate function of the phospholipid.
  • the aforementioned metal is linked to a porphyrin group.
  • the phospholipid comprises at least one unsaturated fatty acid, preferably in the ⁇ or ⁇ position relative to the phosphoric acid.
  • this unsaturated fatty acid is a polyunsaturated fatty acid, preferably without conjugation of the ethylenic bonds.
  • this polyunsaturated fatty acid without conjugation of the ethylenic bonds has a C 18 to C 20 chain and is chosen from 9, 12-linoleic acid, 9, 12, 15-linolenic acid, 5 acid. , 8, 11, 14-arachidonic.
  • the above-mentioned phopholipid comprises at least one phosphoric acid function, preferably combined with an unsaturation of the phospholipid chain.
  • This acid function can be either in free form or in form linked to an unsubstituted or substituted quaternary ammonium group, or an alkylamine in which the alkyl group is a lower C 1 -C 5 , preferably C 1 -C 3, alkyl group. .
  • the alkylamine substituent is linked by its amino function to a phenol or a phenolic acid, preferably from the series of caffeic acids.
  • caffeic acid mention will be made of caffeic, ferulic, chlorogenic, salicylic acid as well as its derivatives such as cyclic salt aldehyde, lower C 1 -C 5 alkyl salicylate, in particular methyl salicylate, monotropitoside, spireoside, hyperoside, salicoside or salicine.
  • the alkylamine substituent can be linked to a phenol or a phenolic acid itself linked to a C 5 or C 6 sugar, in particular mannitol or mannose.
  • the phospholipid chain is preferably at most 60 carbon atoms.
  • the aforementioned metal preferably of valence at least equal to 3, is advantageously attached to a phosphate function or to a porphyrin group.
  • the metals M of valence at least equal to 3 are preferably chosen from Se, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Ga, Ge, Sb, Sn, In, Pd, Rh, Ru, Tc , Mo, Nb, Zr, Y, Hf, Ta, W, Re, Os, Ir, Pt, Au, Tl, Pb, Bi, Po.
  • a second acid function of phosphoric acid can be salified by an ion with a valence of less than 3 lighter than the preceding metals and chosen, for example, from Ca, Sr, Li, Cd, Zn, Mg and Ag.
  • the organic derivative of a metal is characterized in that it has the following chemical formula: in which :
  • R 1 - either a C 16 to C 20 fatty acid advantageously having a low degree of unsaturation, in particular a double bond
  • R 2 either an unsaturated fatty acid of C 16 to C 20 preferably having at least 2 degrees of unsaturation
  • R 3 either an unsaturated C 16 to C 20 fatty acid as defined for R 1 or R 2 ,
  • R 4 either H, or a quaternary ammonium group (unsubstituted or substituted, in particular with a positive ionic group itself linked to R 5 , in which R 5 equals a minimum C 5 organic compound preferably chosen from a sugar , phenolic acid); or a C 1 -C 5 alkyl group free or linked to R 5 ;
  • a free acid function of the phosphate group of R 2 or R 3 can be salified with a metal M 3 of valence less than or equal to 2, in particular chosen from Ca, Sr, Li, Cd, Zn, Mg and Ag; M 2 being hydrogen or a metal similar to M 1 .
  • a 1 , A 2 , A 3 , A 4 , A 5 , A 6 , A 7 , A 8 are independently chosen from the usual substituents of chlorophylls, in particular hydrogen, lower C 1 -C 5 alkyl straight chain, branched or cyclic, a vinyl radical, formyl and its esters, acetyl and its esters, propionyl and its esters, acrylyl and its esters, and cyclopentanoyles,
  • M 1 being a metal of valence at least equal to 3, as previously defined,
  • a 1 to A 8 being necessarily a phospholipid substituent as defined above.
  • the valence of at least one metal M 1 or M 2 is equal to 3.
  • the new organic metal derivative according to the invention as defined above is isolated from a plant, preferably from the following families:
  • - Legumes in particular soybeans, broad beans, peas, chickpeas, alfalfa, oats;
  • Urticaceae in particular nettle dioica, urens and parietaries;
  • the present invention relates to a process for isolating the new organic derivative of a metal, as previously defined, characterized in that it includes:
  • the crude pulverulent product obtained is redissolved in a minimum of non-ionized water, or distilled, then subjected to precipitation with an organic solvent, preferably chosen from solvents miscible with water, and selected according to the hydrophilicity of the metal compound sought;
  • the precipitate obtained containing the organic derivative of metal sought in the pure state is subjected to a metal exchange to obtain the salt of a new metal different from that initially contained in the plant.
  • the crude pulverulent product is subjected to precipitation using '' a saturated solution of cadmium chloride to obtain a precipitate which is separated by centrifugation, then redissolved in a carbonated solution, for example of ammonium carbonate, then reprecipitated with an organic solvent miscible with water, preferably an alcohol or a ketone, in particular a lower alcohol such as methanol, ethanol or propanol.
  • M 3 second metal
  • the last precipitate contains the organic derivative of the metal according to the invention, sought, in the pure state, optionally mixed with small proportions of other metals.
  • the precipitated product obtained is redissolved in an aqueous solution containing the metal which it is desired to incorporate, then a new precipitation is carried out with organic solvent miscible with the aforementioned water, which makes it possible to obtain the organic derivative of the desired metal, according to the invention.
  • the extraction solvent used to obtain the crude extract of the plant is advantageously chosen from water / alcohol mixtures lower in C 1 -C 6 , preferably chosen from methanol, ethanol, propanol, isopropanol, n-butanol or iso-butanol.
  • the water / alcohol proportion is advantageously between 75 and 99% water / 1 to 25% alcohol, by weight.
  • organic metal derivative according to the invention can be identified by a silica gel thin layer chromatography technique which is well known to those skilled in the art, in particular using the three solvents mentioned below. below:
  • the chromatogram is then revealed to ninhydrin. There is normally only one task.
  • the organic derivative of purified metal is first dissolved, as obtained according to the process described above, in an aqueous solution which is then added separately. equal with a 2N hydrochloric acid solution and then in an oven at 80 ° C for several hours, in particular about 8 h.
  • fatty acids are identified by gas chromatography
  • the sugars and the glycerides are identified by HPLC and detection by an apparatus capable of measuring a number of particles after elimination of the solvent by vaporization, for example a device marketed by TOUZART and MATIGNON, having the trade name SEDEX 45;
  • Porphyrin is identified by thin layer chromatography according to conventional techniques for identifying porphyrin,
  • the metal is identified by atomic absorption spectroscopy and plasma torch, the device being naturally adjusted according to the metal to be identified, for example device from Applied Research Laboratories, USA, model 3 580 OES.
  • the new organic metal derivative according to the invention described above can naturally be prepared synthetically from the corresponding constituents which are reacted under operating conditions known to those skilled in the art.
  • sources easily accessible for the preparation of this new organic metal derivative according to the invention are constituted not only by plants mentioned above, but also by parts derived from biotechnologies such as the in vitro culture of plants, or so-called callus cultures, that is to say differentiated cell blocks, multiplied from cells rich in complex or fraction of complex , or parts of animal organs. These various parts of organs or cellular organisms are subjected to specific extraction treatments.
  • the invention also covers a use of the organic metal derivative according to the invention, preferably having a valence at least equal to 3, as a biomedical agent or as an active principle for the manufacture of a product for therapeutic use.
  • the organic metal derivatives according to the invention have an immunomodulatory activity and can in this context be usefully used to treat all immune deficiencies, including AIDS, or a neuromodulatory activity, or an anti-inflammatory activity or else anti rheumatic activity, in particular to fight against rheumatoid arthritis.
  • the present invention also covers a pharmaceutical composition, characterized in that it comprises, as active ingredient, at least one organic derivative of a metal according to the invention as defined above.
  • this pharmaceutical composition is characterized in that it is a pharmaceutical composition with immunomodulatory or neuromodulatory activity, or anti-inflammatory or anti-rheumatic activity, in particular anti-rheumatoid arthritis or with activity hypoglycemic or anti-multiple sclerosis.
  • Particularly preferred compounds are an organic derivative of a metal according to the invention in which a gold atom is linked to a phospholipid having anti rheumatoid activity, in particular against rheumatoid arthritis.
  • Another particularly preferred derivative is a derivative of a metal according to the invention in which the metal is aluminum linked to a phospholipid, whose fatty acid is ⁇ -linolenic acid while a ferrulic group choline is linked at the top of the phosphoric or phospholipid chain, this compound being extracted from Reseda phyteuma and having a marked anti-inflammatory activity.
  • Another preferred compound according to the invention is a compound whose metal is Sb or an Sb / Sn pair preferably obtained from the species Angelica, in particular Angelica archangelica, and Angelica sinensis having a particularly effective immunomodulating activity in particular against the HIV virus.
  • Still a particularly preferred compound of the invention is a compound whose metal is vanadium, obtained from urtica dioica, having a persistent hypoglycemic activity.
  • the doses of use of the new organic derivative of a metal according to the invention are from 100 to 300 mg of a final lyophilisate containing at most 5% of the organic derivative of metal according to the invention, for a gastro-resistant capsule.
  • a dose of 200 mg of purified pulverulent product, for example in the form of lyophilisate has a metal content of less than 1 mg.
  • This pulverulent, purified product for example in the form of lyophilisate can be dissolved in an aqueous solvent at a dose of 5% so as to produce injectable galenical forms, or instillable or allowing for example an aerosol use.
  • One of the preferred routes of administration is that of the mucous routes (perlingual, pernasal, suppository, eye drops).
  • the Angelica archangelica plant is picked whole at the maturity of the seeds then dried in the rules of the art and coarsely crushed then agitated mechanically for 4 to 6 days in a mixture at 60oC of ten times its weight of water and once its weight 95% by volume ethanol.
  • tangential filtration is carried out in a filter having a pore diameter of 0.2 ⁇ m, then concentrated on average ten times by reverse osmosis.
  • hydroalcoholic solvent is removed completely by lyophilization, thereby obtaining a crude extract in the form of lyophilisate.
  • the crude extract is redissolved in a minimum of distilled water, at a rate of 5 g per 10 ml.
  • the aqueous solution obtained is subjected to ethanol or methanol precipitation. And we separate the precipitate. Three times are repeated and the last precipitate constitutes the organic derivative of Sb according to the invention.
  • This organic derivative in practice comprises a mixture of
  • this purified product thus obtained are the following: blackish oily product, miscible with water in which the metal can be identified after nitric digestion, either by the reaction with Rhodamine B well known to the analyst chemist, or by spectrography atomic emission.
  • This precipitate constitutes the organic derivative of aluminum according to the invention, having mainly aluminum fixed by a phosphate bond to a phosphatidylcholine structure, itself linked to ferrulic acid.
  • This organic aluminum derivative according to the invention has the following physicochemical characteristics: fatty product of green color, miscible with water and having the reactions of choline, of aluminum and in which the phospholipid by thin layer chromatography.
  • the physicochemical characteristics of this organic derivative of vanadium according to the invention are as follows: brown crystalline powder, soluble in water, the solution of which has a hypoglycemic activity, the powder does not have a melting point but decomposes .
  • This oorganic gold derivative has the following characteristics: Au 3+ form, green brown powder, soluble in water, no melting point but decomposes.
  • Example 5
  • the organic metal derivative according to the purified invention obtained at the end of the procedure of any one of Examples 1 to 4, is dissolved in a weakly acidic solution of mineral acid such as 2N hydrochloric acid and then precipitated by an organic solvent. having allowed its extraction, for example ethanol or methanol.
  • the oily precipitate is isolated by centrifugation, washed with pure acetone, taken up in a volume of distilled water, then lyophilized in the presence of 10% maltodextrin (weight / volume).
  • an organic metal derivative according to the invention comprising an alkylamine function linked to a phenolic acid 'chosen from ferrulic, caffeic or chlorogenic acids.
  • the amino function can be linked to a phenolic acid in the following manner.
  • the lyophilisate obtained from Spirea ulmaria is redissolved in 2 parts of distilled water, then reprecipitated with acetone in sufficient quantity.
  • the precipitate separated by centrifugation is solubility in a solution of 2N hydrochloric acid, then reprecipitated again with a solution of ethanol at 95% by volume in sufficient quantity. After centrifugation, a sample of the mass obtained is taken up in distilled water, then cold titration with an ethanolic solution of 0.1% ferrulic acid in sufficient quantity until a cloudiness appears, or at using a potentiograph, checking the inflection point.
  • the concentration of ferrulic acid to be added to the rest of the precipitate is deduced from the above dosage.
  • Example 9 The procedure is the same as in Example 7, an amorphous product, yellowish white, soluble in water with a very characteristic odor, is obtained.
  • Example 9 An amorphous product, yellowish white, soluble in water with a very characteristic odor, is obtained.
  • a biomediation agent according to the invention is formed by the product obtained directly in the raw state in any one of Examples 1 to 9.
  • the crude extract obtained in any one of Examples 1 to 9, in the form of a dry product is mixed with 5% of its weight of maltodextrin until perfect homogeneity, then stored.
  • This mixture constitutes the active principle of a pharmaceutical composition according to the invention as formulated for example in the following examples.
  • the product obtained according to any one of Examples 1 to 9, is added with its weight of magnesium stearate and ten times its weight with microcrystalline cellulose then intimately homogenized, the mixture obtained is distributed using suitable distribution equipment in gelatin capsule module 2 at a rate of 240 mg per unit.
  • the capsules thus dosed with 25 mg of extract are coated using an apparatus of gum arabic, cellulose ester and titanium oxide. After drying, the capsules obtained are gastro-resistant and packaged in a blister in blister packs of 15 grouped in cases of 2.
  • the product obtained in any one of Examples 1 to 9 is dissolved in a proportion of 5 mg per ml in an excipient for use as a nasal nebulization based on physiological saline, glycerin monoethyl ether of diethyleneglycol.
  • the preparation is packaged in a 30 ml polyethylene bottle fitted with a nasal spray cannula delivering 0.1 ml by pressure. Free on 12
  • Example 1 A - Search for an immunomodulatory activity
  • the organic derivative of an Sb / Sn metal obtained in Example 1 is subjected to tests to demonstrate immunomodulatory activity, according to the following procedure.
  • lymphocytes - monocytes and macrophages The desired effects will be tested in vitro on the cells involved in the immune response (lymphocytes - monocytes and macrophages).
  • membrane antigens will be studied in a flow cytometer in the presence and absence of each of the products.
  • lymphocyte population From the peripheral blood taken from EDTA or heparin, separation of the lymphocyte population.
  • markers are identified by the corresponding monoclonal antibodies which, after fixation, are visualized by an anti-human IgG antibody conjugated to a fluochrome (GAM-FITC).
  • lymphocyte markers
  • Human lymphocytes are collected from peripheral blood by centrifugation on a Ficoll gradient.
  • the cells are: - on the one hand put in the presence of the 2 doses of each product for 24 h and then tested by comparison with untreated cells,
  • Activated lymphocytes may or may not proliferate under the influence of certain drugs.
  • the protocol is the same as above.
  • the activation of macrophage monocytes stimulates their oxidative metabolism which can easily be studied by flow cytometry by taking advantage of the oxidation of dichlorofluorescein, of which only the oxidized form is fluorescent, therefore only the activated cells become fluorescent and are identified by the cytometer. flow.
  • Leukocytes separated from peripheral blood are first contacted with DCF and then:
  • the contacts are made in a thermostatic water bath with continuous stirring and the readings are made with a flow cytometer every 5 min and up to 1 h 30, the oxidative burst not exceeding this duration.
  • Example 1 The product of Example 1 (500 ⁇ g), incubated with the lymphocytes separated by Ficoll gradient and activated by PHA (Phytohemagglutinin) for 24 h, shows an inhibitory effect on the appearance of IL2 receptors.
  • PHA Physicalhemagglutinin
  • Example 2 The product of Example 1, in solution at 5 g per 100 ml, brought into contact with the lymphocytes separated by Ficoll gradient and cultured with the PHA lectin for 72 h, shows a significant inhibition of lymphocyte proliferation.
  • Example 1 (500 ⁇ g) incubated for 1 h with the lymphocytes separated by Ficoll gradient, does not give any significant change in the expression of the lymphocytic Ag of the 2 subjects studied.
  • Anti-inflammatory activity is sought with the organic aluminum derivative according to the invention obtained in Example 2, according to the following procedure based on edema with kaolin.
  • mice Male Wistar layer rats (12 per batch) from the Jardin breeding center were used in this study. The animals are kept under observation for 4 days before the start of the tests. At the start of the test, the animals weigh an average of 90 g. During the observation period, the animals, divided into cages of 5, receive food and drinking water ad libitum and are subjected to a temperature between 21 and 23 C and to a day / dark cycle of 12 h.
  • the animals are fasted the day before.
  • the rats are anesthetized with ether.
  • An incision is made in the upper abdomen and the nebulisate injected into the duodenal loop using a syringe.
  • the muscle wall is then saturated and the skin closed with 2 staples.
  • the kaolin suspension is injected 1/2 h after (0.1 ml - 10g% solution in physiological saline) into the plantar pad of the right hind paw.
  • a batch of control animals serves as a control and receives the excipient.
  • the concentrations of the suspensions used are adjusted so as to administer exactly 1 ml per 100 g of body weight.
  • the swelling percentages are analyzed by the F tests of SNEDECOR and Student t (3).
  • the anti-inflammatory activity is expressed by the percentage reduction in edema in the treated rats compared to the controls according to the following formula:
  • the aluminum derivative Given its activity and its low toxicity, the aluminum derivative therefore presents a real therapeutic interest.
  • mice Male rats of Wistar strain (12 per batch), coming from the Jardin breeding center were used in this study. The animals are kept under observation for 4 days before the start of the tests. At the start of the test, the animals weigh an average of 140 g. During the observation period, the animals, distributed in cages of 5, receive food and drinking water ad libitum and are subjected to a temperature between 21 and 23 ° C and to a day / dark cycle of 12 h.
  • the daily glycemic control did not allow us to demonstrate any hypoglycemic effect during the first 2 days of treatment.
  • a significant and significant drop in blood sugar compared to that of control rats appears from the third day and is maintained on the following days. This is accompanied by an equally significant reduction in weight gain, polyphagia and polydipsia, food and water consumption recovering values tending to approximate that of non-diabetic control rats
  • Figures 1 to 4 report changes in weight (Figure 1), changes in blood sugar (Figure 2), food consumption (Figure 3) and water consumption (Figure 4), based on the indications The above clearly show the effects indicated below.
  • Joint impotence results in a limitation of active movements, or even a fixation of the joint in its relaxed position.
  • Certain anti-inflammatory substances can stop the worsening of arthritis, or even lead to a return to normal joint morphology.
  • mice Male rats of Wistar strain (12 per batch), coming from the Jardin breeding center were used in this study. The animals are kept under observation for 4 days before the start of the tests. At the start of the test, the animals weigh on average 180 g. During the observation period, the animals, divided into cages of 5, receive food and drinking water ad libitum and are subjected to a temperature between 21 and 23 ° C and to a day / dark cycle of 12 h.
  • a suspension in the paraffin of bacteria of the mycobacterium tuberculosis strain is injected into the lower third of the rat tail.
  • the 21 th day after the injection the rats are sorted by morphological signs of arthritic damage they present. Only animals with unilateral or bilateral swelling of the hind legs are retained.
  • a measurement of the volumes of the right and left hind legs is carried out using a piethismometer on the rats previously selected. Homogeneous batches in weight and in% increase in volumes of the right and left hind legs are then formed.
  • Treatment starts on 21 th day after the formation of lots and continues for 13 days at a daily administration.
  • the last measurement (D14) is carried out 24 hours after the last administration.
  • the volume of the hind legs is evaluated before and throughout the duration of the paral treatment in conjunction with a morphological examination; this examination makes it possible to assess and quantify:
  • Ankylosis reflects the limitation or disappearance of the articular movement of the hind legs is credited with an index of 0 to 2 for each of the legs.
  • the basic volume is the volume of the hind legs measured on day 0, before treatment.
  • the protection percentage is determined relative to the volume of the hind legs of the control animals.
  • the effectiveness of the treatment is evaluated as a percentage of swelling of the hind legs of the treated lots (patho animals logic treated) in relation to the volume of the hind legs of the absolute control group in which the arthritis was not carried out (healthy animals).
  • the fractions indicate the nomore of animals affected by swelling of the front legs on the total nomore of animals in each crack.
  • ex. 4 - 400 mg / kg - intraperitoneal route we note a significant regression of the edema; the volume of the hind legs goes from 78 to 59 mm Hg (ie - 25% compared to the initial volume); the% of swelling compared to the absolute control animals is only 19.93% at the end of treatment. Impotence (2.11 to 1.44), ankylosis (1.41 to 0.99) regressed significantly. The number of animals with an attack on the forelegs is reduced (7/9 to 4/9). The% of swelling compared to the absolute control lot goes from 61.9 (D0) to 19.9 (D14). Finally, the% of protection compared to the arthritic control group is 34.65% (D14).
  • Indomethacin - 3 then 1.5 mg / kg - intragastric route the results obtained are quantitatively similar to those of the previous batch; significant decrease from D4 on the volume of the hind legs (76 to 56 mm Hg) or - 26%.
  • The% swelling compared to the absolute test animals is 14.28% at the end of treatment. Impotence (2.00 to 1.30), ankylosis (1.44 to 0.99) and edema of the forelegs (4/9 to 1/5) decrease significantly.
  • The% of swelling compared to the absolute control batch goes from 57.35 (D0) to 14.28 (D14).
  • The% protection compared to the arthritic control group is 37.73% (D14).
  • the gold derivative of the invention in our experimental conditions, did not present any apparent sign of toxicity except for a slight abdominal bloating at the end of treatment: although the statistical analysis did not reveal no significant difference, the indomethacin batch presents a more favorable weight development.
  • the limited weight gain in animals treated with the gold derivative can be interpreted by the intraperitoneal administration of a large quantity of substance, the absorption of which may be problematic and explain the bloating mentioned above.

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Abstract

L'invention concerne un nouveau dérivé organique d'un métal. Ce dérivé organique de métal est caractérisé en ce qu'il est constitué par un dérivé d'un métal de préférence de valence au moins égale à 3, avec un composé organique comprenant un phospholipide conférant une hydrosolubilité ou hydromiscibilité au dérivé organique dudit métal. Avantageusement, ce phospholipide comprenant au moins un acide gras insaturé du type acide alpha-linolénique ou gamma-linolénique. Les dérivés organiques de métal selon l'invention constituent des agents biomédiateurs précieux et à ce titre constituent des principes actifs de compositions pharmaceutiques ayant diverses activités et notamment une activité immunomodulatrice.

Description

Nouveau dérivé organique d'un métal à structure phospholipidique, utilisation de ce dérivé comme agent biomédiateur, procédé d'isolement de ce dérivé et compositions pharmaceutiques le contenant.
L'invention concerne essentiellement un nouveau dérivé organique d'un métal à structure phospholipidique, l'utilisation de ce dérivé comme agent biomédiateur, un procédé d'isolement de ce dérivé et des compositions pharmaceutiques le contenant.
Dans l'état actuel de la technique, on a réalisé diverses formulations du vanadium en vue de le rendre biodisponible dans le cadre du traitement de l'hyperglycémie. Les formulations réalisées jusqu'à présent sont encore très insuffisantes par le fait que leur biodisponibilité est très faible, voire inexistante.
Par ailleurs, il est connu d'utiliser divers extraits de plantes comme agents thérapeutiques. Par exemple, dans le document EP-A-0 266 468 (Natura Médica), il est décrit une composition thérapeutique comportant un extrait organique de plante de la famille des résédacées utile comme agent anti-inflammatoire. De même, dans le document FR-A-2 611 502 (Natura Médica), il est décrit un extrait de racine d'ombellifère obtenu par extraction hydro-alcoolique et son utilisation comme agent thérapeutique ayant une activité diurétique, cardio-vasculai re, antalgique ou antiinflammatoire. Egalement, il est décrit dans le document FR-A-2 624 737 (Natura Médica), un extrait de feuille de cassis obtenu par extraction hydro-alcoolique et son utilisation comme agent thérapeutique ayant une activité antalgique et anti- inflammatoire.
Ces extraits de plantes décrits dans ces documents sont t rès i ntéressant s mai s i ls ne pe rmettent pas de t ra i te r eff i ca- cernent des affections qui nécessitent l'emploi de métaux possédant une valence au moins égale à 3. Or, dans l'état actuel de la technique, les propositions de formulation de métaux possédant une valence au moins égale à 3 en vue de les rendre biodisponibles ont échoué car leur biodisponibilité est faible et leur toxicité élevée. La présente invention a donc pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une nouvelle formulation de métaux, de préférence de métaux possédant une valence au moins égale à 3, présentant une excellente biodisponibilité ainsi qu'une très faible toxicité.
De préférence, cette nouvelle formulation doit être simple à préparer et être suffisamment stable dans le temps pour permettre l'utilisation thérapeutique dans les meilleures conditions.
La présente invention résoud les problèmes techniques énoncés ci-dessus d'une manière extrêmement simple, en fournissant la formulation d'un métal, de préférence d'un métal de valence au moins égale à 3, qui présente une biodisponibilité remarquable, ainsi qu'une très faible toxicité et une excellente stabilité dans le temps.
Ainsi, selon un premier aspect, la présente invention fournit un nouveau dérivé organique d'un métal, caractérisé en ce qu'il est constitué par un dérivé d'un métal, de préférence de valence au moins égale à 3, avec un composé organique comprenant au moins un phospholipide conférant une hydrosolubilité ou hydromiscibi lité au dérivé organique dudit métal.
Selon une variante de réalisation avantageuse, le métal précité est lié à la fonction phosphate du phospholipide.
Selon une autre variante de réalisation, le métal précité est lié à un groupe porphyrine.
Selon un mode de réalisation avantageux, le phospholipide comprend au moins un acide gras insaturé, de préférence en position α ou β par rapport à l'acide phosphorique.
Selon un mode de réalisation avantageux, cet acide gras insaturé est un acide gras poly-insaturé, de préférence sans conjugaison des liaisons éthyléniques. Avantageusement, cet acide gras poly-insaturé sans conjugaison des liaisons éthyléniques a une chaîne en C18 à C20 et est choisi parmi l'acide 9, 12-linoléique, l'acide 9, 12, 15-linolénique, l'acide 5, 8, 11, 14-arachidonique.
Encore de préférence, il s'agit de l'acide α-linolénique ou γ-linolénique. Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, le phopholipide précité comprend au moins une fonction acide phosphorique, de préférence conjuguée avec une insaturation de la chaîne phospholipidique. Cette fonction acide peut être soit sous forme libre, soit sous forme liée à un groupement ammonium quaternaire non substitué ou substitué, oualkylamine dans lequel le groupe alkyle est un groupe alkyle inférieur en C1-C5, de préférence en C1-C3.
Selon une autre variante de réalisation particulièrement avantageuse, le substituant alkylamine est lié par sa fonction aminé à un phénol ou un acide phénolique de préférence de la série des acides caféiques. Comme acide caféique particulièrement préféré, on citera l'acide caféique, férulique, chlorogénique, salicylique ainsi que ses dérivés tels que l'aldéhyde sali cylique, le salicylate d'alkyle inférieur en C1-C5, en particulier le salicylate de méthyle, le monotropitoside, le spiréoside, l'hyperoside, le salicoside ou le salicine.
Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, le substituant alkylamine peut être lié à un phénol ou un acide phénolique lui-même lié à un sucre en C5 ou C6, en particulier le mannitol ou le mannose.
La chaîne phospholipidique est de préférence au maximum de 60 atomes de carbone.
Le métal précité, de préférence de valence au moins égale à 3 est avantageusement fixé à une fonction phosphate ou à un groupe porphyrine. Les métaux M de valence au moins égale à 3 sont de préférence choisis parmi Se, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Ga, Ge, Sb, Sn, In, Pd, Rh, Ru, Tc, Mo, Nb, Zr, Y, Hf, Ta, W, Re, Os, Ir, Pt, Au, Tl, Pb, Bi, Po.
Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, une deuxième fonction acide de l'acide phosphorique peut être salifiée par un ion de valence inférieure à 3 plus léger que les métaux précédents et choisis, par exemple, parmi le Ca, Sr, Li, Cd, Zn, Mg et Ag.
Selon un autre mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, le dérivé organique d'un métal est caractéri sé en ce qu' i l présente la formule chimi que généra le suivante : dans laquelle :
R1- = soit un acide gras en C16 à C 20 ayant avantageusement un faible degré d' insaturation, en particulier une double liaison),
= soit un noyau porphyrine lié à un métal M1 ayant une valence supérieure ou égale à 3 telle que précédemment définie,
= soit un groupe X-OH dans lequel X = (CH2)n, n étant égal à 0, 1 ou 2.
R2 = soit un acide gras insaturé de C16 à C20 de préférence ayant au moins 2 degrés d' insaturation,
= soit une fonction phosphate de formule :
-
R3 = soit un acide gras insaturé en C16 à C20 tel que défini pour R1 ou R2,
= soit un groupe phosphate de formule :
à la condition que R2 et R3 ne peuvent pas être simultanément un groupe phosphate. R4 = soit H, soit un groupe ammonium quaternaire (non substitué ou substitué, en particulier avec un groupe ionique positif lui-même lié à R5, dans lequel R5 égale un composé organique en C5 minimum de préférence choisi parmi un sucre, un acide phénolique) ; soit un groupe alkyl en C1-C5-amino libre ou lié à R5 ;
dans la formule précédente, une fonction acide libre du groupe phosphate de R2 ou R3 peut être salifiée par un métal M3 de valence inférieure ou égale à 2, en particulier choisi parmi le Ca, Sr, Li, Cd, Zn, Mg et Ag ; M2 étant l'hydrogène ou un métal similaire à M1.
Dans le cas d'une substitution en R1 par un noyau porphyrine, ce cycle est caractérisé par la formule générale suivante :
dans laquelle A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8 sont choisis indépendamment parmi les substituants usuels des chlorophylles, en particulier l'hydrogène, un alkyle inférieur en C1-C5 à chaîne droite, ramifiée ou cyclique, un radical vinyle, formyle et ses esters, acétyle et ses esters, propionyle et ses esters, acrylyle et ses esters, et cyclopentanoyles,
M1 étant un métal de valence au moins égale à 3, tel que précédemment défini,
et l'un au moins parmi A1 à A8 étant obligatoirement un substituant phospholipidique tel que précédemment défini.
Les substituants précités usuels de la chlorophylle sont en particulier ceux décrits par Hendry et Jones dans la revue Journal of Médical Genetics, 1980, 17, 1-14, et en particulier au tableau 1, page 5.
De préférence, la valence d'au moins un métal M1 ou M2 est égale à 3. Selon une autre caractéristique avantageuse de l'invention, le nouveau dérivé organique de métal selon l'invention tel que précédemment défini est isolé à partir d'une plante, de préférence issue des familles suivantes :
- Légumineuses, en particulier le soja, la fève, le pois, le pois chiche, la luzerne, l'avoine ;
- les Plantaginées, en particulier les plantains,
- les Crucifères, en particulier le colza, le chou, le cresson,
- les Salsolacées, en particulier l'épinard,
- les Urticacées, en particulier les orties dioica, urens et les pariétaires ;
- les Oπbellifères, en particulier angelica archangelica et angelica sinensis, et foeniculum dulce ;
- les Résédacées, en particulier Réséda, phyteuma, lutea, alba, luteola.
Selon un second aspect, la présente invention concerne un procédé d'isolement du nouveau dérivé organique d'un métal, tel que précédemment défini, caractérisé en ce qu'il comorend :
a) l'extraction d'une plante appropriée connue pour contenir l'un des métaux Drécités, par macération dans un solvant hydro-alcoolique pendant une durée suffisante pour extraire ledit dérivé organique de méta l , en obtenant ai ns i un ext ra i t brut ;
b) on é l i mi ne le solvant de l'extrait brut pour obtenir un produit pulvérulent brut contenant ledit dérivé organique de métal ;
c) le produit pulvérulent brut obtenu est redissous dans un minimum d'e.au non ionisée, ou distillée, puis soumis à une précipitation par un solvant organique, de préférence choisi parmi des solvants miscibles à l'eau, et sélectionné en fonction de l'hydrophilicite du composé métallique recherché ;
d) et éventuellement, le précipité optenu contenant le dérivé organique de métal recherché à l'état pur, est soumis à un échange métallique pour obtenir le sel d'un nouveau métal différent de celui contenu initialement dans la plante.
Selon une variante de réalisation préférée, pour laquelle la fonction acide phosphorique est liée à un second métal (M3), de valence inférieure ou égale à 2, de préférence choisi parmi le groupe consistant du calcium, du strontium, du zinc, du lithium, magnésium ou argent, le produit pulvérulent brut est soumis à une précipitation à l'aide d'une solution saturée en chlorure de cadmium pour obtenir un précipité qui est séparé par centrifugation, puis redissous dans une solution carbonatée, par exemple de carbonate d'ammonium, puis reprécipité avec un solvant organique miscible à l'eau, de préférence un alcool ou une cétone, en particulier un alcool inférieur tel que le méthanol, l'éthanol ou le propanol. On peut améliorer la purification de manière classique par plusieurs étapes de précipitation au solvant organique - dissolution dans l'eau.
Le dernier précipité contient le dérivé organique du métal selon l'invention, recherché, à l'état pur, éventuellement mélangé avec de faibles proportions d'autres métaux.
Selon un mode de réalisation particulier de ce procédé, lorsqu'on désire changer le métal lié au phospholipide, le produit précipité obtenu est redissous dans une solution aqueuse contenant le métal que l'on souhaite incorporer, puis on réalise une nouvelle précipitation au solvant organique miscible à l'eau précité, qui permet d'obtenir le dérivé organique du métal souhaité, selon l'invention.
Selon une autre variante de réalisation du procédé selon l'invention, le solvant d'extraction utilisé pour obtenir l'extrait brut de la plante est avantageusement choisi parmi les mélanges eau/alcool inférieurs en C1-C6, de préférence choisi parmi le méthanol, l'éthanol, le propanol, l'isopropanol, le n-butanol ou l'iso-butanol. En particulier, la proportion eau/alcool est avantageusement comprise entre 75 et 99% d'eau/1 à 25% d'alcool, en poids.
L'identification du dérivé organique du métal selon l'invention peut être réalisée par une technique de chromatographie sur couche mince de gel de silice qui est bien connue à l'homme de l'art, en particulier à l'aide des trois solvants ci-dessous :
- chloroforme/méthanol à 90/10 en volume
- isopropanol/eau 95/5 en volume - éther éthylique/méthanol 50/50 en volume
Le chromatogramme est ensuite révélé à la ninhydrine. On observe normalement une seule tâche.
Selon une autre variante d'identification du nouveau dérivé organique de métal selon l'invention, on redissout tout d'abord le dérivé organique de métal purifié tel qu'obtenu selon le procédé précédemment décrit, dans une solution aqueuse qui est ensuite additionnée à part égale avec une solution d'acide chlorhydrique 2N puis à l'étuve à 80°C pendant plusieurs heures, en particulier environ 8 h.
La solution obtenue est ensuite soumise à des techniques habituelles d'identification des composés recherchés.
Par exemple, les acides gras sont identifiés par chromatographie en phase gazeuse ;
- les phénols et acides phénoliques sont identifiés par chromatographie liquide à haute performance et détection dans l'ultraviolet ;
- les sucres et les glycérides sont identifiés par HPLC et détection par un appareillage capable de mesurer un nombre de particules après élimination du solvant par vaporisation, par exemple un appareil commercialisé par TOUZART et MATIGNON, ayant la dénomination commerciale SEDEX 45 ;
- La porphyrine est identifiée par chromatographie sur couche mince selon les techniques classiques d'identification de la porphyrine,
- le métal est identifié par spectroscopie d'absorption atomique et torche à plasma, l'appareil étant naturellement réglé en fonction du métal à identifier, par exemple appareil de Applied Research Laboratories, USA, modèle 3 580 OES.
Le nouveau dérivé organique de métal selon l'invention précédemment décrit, peut naturellement être préparé par voie de synthèse à partir des constituants correspondants que l'on fait réagir dans des conditions opératoires connues de l'homme de l'art.
On observera que des sources aisément accessibles à la préparation de ce nouveau dérivé organique de métal selon l'invention sont constituées non seulement par les plantes précitées, mais également par des parties issues des biotechnologies comme la culture in vitro des végétaux, ou des cultures dites de cals, c'est-à-dire des blocs de cellule différenciés, multipliés à partir de cellules riches en complexe ou fraction de complexe, ou des parties d'organes animaux. Ces diverses parties d'organes ou organismes cellulaires sont soumises à des traitements d'extraction spécifiques. Comme il résulte de la discussion précédente, dans le cadre de l'invention, seuls les extraits réalisés à partir d'un solvant présentant une polarité par rapport à la silice du même ordre que celle d'un solvant préparé à base d'eau et d'éthanol dans les proportions précédemment indiquées de 75 à 99% d'eau et de 1 à 25% d'éthanol, permet d'obtenir un dérivé organique de métal brut qui permet d'isoler directement ou indirectement le nouveau dérivé organique de métal selon l'invention.
Selon un troisième aspect, l'invention couvre également une utilisation du dérivé organique de métal selon l'invention, présentant de préférence une valence au moins égale à 3, comme agent biomédiateur ou comme principe actif pour la fabrication de produit à usage thérapeutique.
En effet, les dérivés organiques de métal selon l'invention, présentent une activité immunomodulatrice et peuvent dans ce cadre être utilement utilisés pour traiter toutes les déficiences immunitaires, y compris le sida, ou une activité neuromodulatrice, ou une activité anti-inflammatoire ou encore une activité anti rhumatismale, en particulier pour lutter contre la polyarthrite rhumatoîde.
Ainsi, selon un quatrième aspect, la présente invention couvre encore une composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre d'ingrédient actif, au moins un dérivé organique d'un métal selon l'invention tel que précédemment défini.
Selon une caractéristique particulièrement avantageuse, cette composition pharmaceutique est caractérisée en ce qu'il s'agit d'une composition pharmaceutique à activité immunomodulatrice ou neuro-modulatrice, ou anti-inflammatoire ou anti- rhumatismale, en particulier anti-polyarthrite rhumatoîde ou à activité hypoglycémiante ou anti-sclérose en plaque. Des composés particulièrement préférés sont un dérivé organique d'un métal selon l'invention dans lequel un atome d'or est lié à un phospholipide ayant une activité anti rhumatoîde, en particulier contre 'la polyarthrite rhumatoîde.
Un autre dérivé particulièrement préféré est un dérivé d'un métal selon l'invention dans lequel le métal est l'aluminium lié à un phospholipide, dont l'acide gras est l'acide α-linolénique tandis qu'un groupement ferrulique choline est lié en haut de chaîne phosphorique ou phospholipide, ce composé étant extrait à partir de Réséda phyteuma et ayant une activité anti-inflammatoire marquée.
Un autre composé préféré selon l'invention est un composé dont le métal est Sb ou un couple Sb/Sn de préférence obtenu à partir de l'espèce Angelica, en particulier Angelica archangelica, et Angelica sinensis ayant une activité immuno-modulatrice particulièrement efficace notamment contre le virus HIV.
Encore un composé particulièrement préféré de l'invention est un composé dont le métal est le vanadium, obtenu à partir d'urtica dioica, ayant une activité hypoglycémiante rémanente.
Les doses d'utilisation du nouveau dérivé organique d'un métal selon l'invention sont de 100 à 300 mg d'un lyophilisât final contenant au plus 5% du dérivé organique de métal selon l'invention, pour une gélule gastro-résistante. Habituellement, une dose de 200 mg de produit pulvérulent purifié, par exemple sous forme de lyophilisat, a une teneur en métal inférieure à 1 mg.
Ce produit pulvérulent, purifié, par exemple sous forme de lyophilisât peut être dissous dans un solvant aqueux à la dose de 5% de façon à réaliser des formes galéniques injectables, ou instillable ou permettant par exemple une utilisation en aérosol. Une des voies d'administration préférée est celle des voies muqueuses (perlinguale, pernasale, suppositoire, collyre).
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à la lumière de la description explicative qui va suivre faite en référence à plusieurs exemples de l'invention donnés simplement à titre d'illustration et qui ne sauraient donc en aucune façon limiter la portée de l'invention. Dans les exemples les pourcentages sont donnés en poids, sauf indication contraire.
Exemple 1
Dérivé organique de Sb à partir d'Angelica archangelica
La plante Angelica archangelica est cueillie entière à la maturité des graines puis séchée dans les règles de l'art et grossièrement broyée puis agitée mécaniquement pendant 4 à 6 jours dans un mélange à 60ºC de dix fois son poids d'eau et une fois son poids d'éthanol à 95% en volume.
Après refroidissement à la température ambiante, on réalise une filtration tangentielle dans un filtre ayant un diamètre de pore à 0,2 μm, puis on concentre en moyenne dix fois par osmose inverse.
On procède enfin à l'enlèvement total du solvant hydroalcoolique par lyophilisation, en obtenant ainsi un extrait brut sous forme de lyophilisât.
On redissout l'extrait brut dans un minimum d'eau distillée, à raison de 5 g pour 10 ml.
Après dissolution complète dans l'eau, on soumet la solution aqueuse obtenue à une précipitation par l'éthanol ou le méthanol. Et on sépare le précipité. On recommence trois fois et le dernier précipité, constitue le dérivé organique de Sb selon l'invention.
Ce dérivé organique comprend en pratique un mélange de
Sb/Sn en quantité sensiblement égale.
Les caractéristiques de ce produit purifié ainsi obtenu sont les sui vantes : produit huileux noirâtre, miscible à l'eau dans lequel on peut identifier après digestion nitrique le métal, soit par la réaction à la Rhodamine B bien connue du chimiste analyste, soit par spectrographie d'émission atomique.
Exemple 2
Dérivé organique d'aluminium à partir de Réséda phyteuma
En partant de la plante Réséda phyteuma, on procède comme décrit à l'exemple 1, mais le dernier précipité est ensuite dissous dans une solution diluée d'acide minéral tel que l'acide chlorhydrique 2N puis précipité par le solvant organique ayant permis sont extraction, par exemple l'éthanol ou l'acétone.
Ce précipité constitue le dérivé organique de l'aluminium selon l'invention, ayant principalement l'aluminium fixé par une liaison phosphate à une structure phosphatidylcholine, elle-même liée à l'acide ferrulique.
Ce dérivé organique d'aluminium selon l'invention présente les caractéristiques physico-chimiques suivantes : produit gras de couleur verte, miscible à l'eau et présentant les réactions de la choline, de l'aluminium et dans lequel on peut mettre en évidence le phospholipide par chromatographie sur couche mince.
Exemple 3
Dérivé organique de vanadium à partir d'Urtica dioica
On procède comme décrit à l'exemple 1 en partant de la plante Urtica dioica, jusqu'à l'obtention du dernier précipité.
Celui-ci constitue le dérivé organique de vanadium selon l'invention, dans lequel le vanadium, sous forme V3+, est inclus soit dans le cycle porphyrinique qui est lui-même substitué par un phospholipide salifié par un ion vanadyle.
Les caractéristiques physico-chimiques de ce dérivé organique de vanadium selon l'invention sont les suivantes : poudre cristalline brune, soluble à L'eau, dont la solution présente une activité hypoglycémiante, la poudre ne présente pas de poi nt de fusion mais se décompose.
Exemple 4
Dérivé organique d'or à partir de Ribes nigrum On procède comme décrit à l'exemple 1 en partant de la plante Ribes nigrum jusqu'au dernier précipité qui constitue le dérivé organique d'or selon l'invention qui comprend principalement de l'or s us la forme Au3+ fixé sur le phospholipide.
Ce dérivé oorganique d'or présente les caractéristiques suivantes : forme Au3+, poudre brun vert, soluble à l'eau, pas de point de fusion mais se décompose. Exemp le 5
Dérivé organique d'un métal ayant une valence au moins égale à 3 inclus dans un cycle porphyrinique
On peut obtenir un dérivé organique de Se, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Ga, Ge, In, Pd, Rh, Ru, Te, Mo, Nb, Zr, Y, Hf, Ta,
W, Re, Os, Ir, Pt, Tl, Pb, Bi, Po, en partant du dérivé organique de métal selon l'invention tel qu'obtenu à l'un quelconque des exemples 1 à 4, en procédant ensuite de la manière suivante.
Le dérivé organique de métal selon l'invention purifié obtenu en fin de procédure de l'un quelconque des exemples 1 à 4, est dissous dans une solution faiblement acide d'acide minéral tel que l'acide chlorhydrique 2N puis précipité par un solvant organique ayantpermis son extraction, par exemple l'éthanol ou le méthanol.
Ce précipité après centrifugation est redissous dans une solution aqueuse contenant le métal que l'on souhaite incorporer à la porphyrine. Une dernière précipitation par ledit solvant organique permet d'obtenir le dérivé organique de métal selon l'invention présentant au minimum 50% de la dose théorique en métal souhaitée, possédant une valence au moins égale à 3.
Exemple 6
Préparation d'un dérivé organique de métal selon l'invention comportant une fonction alkylamine
Le lyophilysat obtenu après extraction de Reseda Phyteuma selon la technique décrite à l'exemple 1 est repris par de l'eau distillée puis reprécipité par de l'acétone en proportion volumique
1/1.
Le précipité huileux est isolé par centrifugation, lavé par de l'acétone pure, repris par un volume d'eau distillée, puis lyophilysé en présence de 10 % de maltodextrine (poids/volume).
Après identification et dosage du métal par absorption atomique selon la technique d'absorption atomique classique à l'aide de l'appareil commercialisé par la société Américaine Applied Research Laboratories, modèle 3 580 OES.
La poudre liophylisée obtenue peut être utilisée directement à des fins thérapeutiques, comme décrit plus loin. Exemp le 7
Préparation d'un dérivé organique de métal selon l'invention, comportant une fonction alkylamine liée à un acide phénolique' choisi parmi les acides ferruliques, caféiques, ou chlorogéniques.
A partir du dérivé de l'exemple 6 précédent comportant une fonction alkylamine, la fonction aminé peut être liée à un acide phénolique de la manière suivante.
Le lyophilisat obtenu à partir de Spirea ulmaria est remis en solution dans 2 parties d'eau distillée, puis reprécipité au moyen d'acétone en quantité suffisante.
Le précipité séparé par centrifugation est solubilité dans une solution d'acide chlorhydrique 2N, puis reprécipité à nouveau par une solution d'éthanol à 95 % en volume en quantité suffisante. Après centrifugation, un échantillon de la masse obtenue est repris par de l'eau distillée, puis on titre à froid par une solution éthanolique d'acide ferrulique à 0,1 % en quantité suffisante jusqu'à apparition d'un trouble, ou à l'aide d'un potentiographe, en vérifiant le point d'inflexion.
La concentration en acide ferrulique à rajouter au reste du précipité est déduite du dosage ci-dessus.
On procède de manière similaire avec l'acide caféique, ou l'acide chlorogénique.
Exemple 8
Préparation d'un dérivé organique de métal selon l'invention lié à une fonction alkylamine elle-même liée à un dérivé de l'acide salycilique
On procède de la même manière qu'à l'exemple 7, on obtient un produit amorphe, blanc jaunâtre, soluble à l'eau à odeur très caractéristique. Exemple 9
Exemple de formulation d'agent biomédiateur selon l'invention
Selon une première variante de réalisation, un agent biomédiateur selon l'invention est formé par le produit obtenu directement à l'état brut dans l'un quelconque des exemples 1 à 9.
Selon une autre variante de réalisation avantageuse, l'extrait brut obtenu à l'un quelconque des exemples 1 à 9, sous forme de produit sec, est mélangé avec 5% de son poids de maltodextrine jusqu'à parfaite homogénéité, puis stocké. Ce mélange constitue le principe actif d'une composition pharmaceutique selon l'invention tel que formulé par exemple dans les exemples suivants.
Exemple 10
Composition pharmaceutique selon l'invention Exemple de spécialité de gélule gastrorésitance
Le produit obtenu selon l'un quelconque des exemples 1 à 9, est additionné de son poids de stéarate de magnésium et de dix fois son poids de cellulose microcristalline puis intimement homogénéisé, le mélange obtenu est réparti au moyen d'un équipement adapté de répartition en gélule de gélatine module 2 à raison de 240 mg par unité.
Les gélules ainsi dosées à 25 mg d'extrait sont enrobées au moyen d'un appareil de gomme arabique, d'ester de cellulose et d'oxyde de titane. Après séchage, les gélules obtenues sont gastro- résistantes et conditionnées sous blister en plaquettes de 15 regroupées en étui de 2.
Exemple 11
Composition pharmaceutique selon l'invention
Spécialité de soluté nasale
Le produit obtenu à l'un quelconque des exemples 1 à 9 est dissous en raison de 5 mg par ml dans un excipient à usage de nébulisation nasale à base de sérum physiologique, de glycérine de monoéthyléther de diéthyleneglycol. La préparation est conditionnée en flacon polyéthylène de 30 ml équipé d'une canule de pulvérisation nasale délivrant 0,1 ml par pression. Exemp le 12
Essai pharmacologique
A - Recherche d'une activité immuno-modulatrice Le dérivé organique d'un métal Sb/Sn obtenu à l'exemple 1 est soumis à des essais de mise en évidence d'activité immuno- modulatrice, selon la procédure suivante.
1 - Protocole
Les effets recherchés seront testés in vitro sur les cellules impliquées dans la réponse immune (lymphocytes - monocytes et macrophages).
I. Cellule (cellules humaines) :
Paramètres et fonctions cellulaires étudiés :
- Marqueurs membranaires,
- Activation lymphocytaire et prolifération lymphocytaire,
- Métabolisme oxydatif des monocytes.
1. Marqueurs membranaires :
L'expression d'antigènes membranaires sera étudiée en cytomètre de flux en présence et en absence de chacun des produits.
Protocole utilisé :
A partir du sang périphérique prélevé sur EDTA ou héparine, séparation de la population lymphocytaire.
Marqueurs étudiés :
- CD3 - CD4 - CD8 - B4 pour les lymphocytes,
- MO2 pour les monocytes
Ces marqueurs sont repérés par les anticorps monoclonaux correspondants qui, après fixation, sont visualisés par un anticorps anti-Igl humain conjugué à un fluochrome (GAM-FITC).
L'étude de la répartition des cellules portant les marqueurs est faite au cytomètre de flux dont dispose le laboratoire (COULTER Epies profile). - les doses testées : Di lut i ons f i na les 1 /20 - 1 / 100
* durée d ' i ncubat i on :
. courte TO-730 mi n - T60 mi n
. longue TO 18 h - 24 h .
Matéri e l nécessaire :
- cytof luomètrie de flux (COULTER epics profile),
- incubateur à CO2,
- réactifs :
. milieu RPMI
. marqueurs lymphocytai res :
* anticorps monoclonaux anti CD3
* anticorps monoclonaux anti CD4
* anticorps monoclonaux anti CD8
* anticorps monoclonaux anti B4
* anticorps anti MO2
* GAM FITC.
2. Activateur et prolifération lymphocytaire
Les lymphocytes humains sont recueillis du sang périphérique par centrifugation sur gradient de Ficoll.
2.1 Activation
L'activation est testée dans deux circonstances :
- effet d'activation directe du produit sur les cellules,
- effet modulateur du produit vis-à-vis de l'activation par des substances activatrices = PHA - conA - PMA (phorbo myristate acétate).
Dans les deux cas, l'activation est appréciée par l'apparition des marqueurs membranaires de l'activation des lymphocites :
- CD25 (ou récepteur de l'I12),
- antigène HLA-DR : 12.
Ces deux marqueurs sont évalués en cytomètrie de flux. Protocole :
Les cellules sont : - d'une part mises en présence des 2 doses de chaque produit pendant 24 h et testées ensuite par comparaison avec des cellules non traitées,
- d'autre part, cultivées en présence de PHA, de conA et PMA avec ou sans produit pendant 24 h.
L'incubation à lieu à 37°C en atmosphère humide avec 5 % de CO2. Les résultats sont appréciés au cytomètre de flux.
Matériel nécessaire :
- cytof luorimètre de flux,
- incubateur à CO2,
- milieu RPMI,
- milieu Ficoll-hypaque, - Réactifs :
* phytohémagglutinine
* PMA
* anticorps monoclonal anti CD25
* anticorps monoclonal anti 12
2.2 Prolifération :
Les lymphocytes activés peuvent, ou non, proliférer sous l'effet de certaines drogues.
Comme l'activation, la prolifération sera testée dans les 2 circonstances :
- prolifération directe sous l'effet du produit,
- modulation par chaque produit de la prolifération obtenue par les mitogέnes PHA et conA.
Le protoco le est le même que ci -dessus .
La prolifération est évaluée au 4e jour d'incubation par incorporation dans le noyau des cellules proliférantes de précurseur radioactif du DNA (thymidine tritiée) : l'importante prolifération est indiquée par la radioactivité appréciée dans l'extrait cellulaire obtenue au 5 jour de l'incubation. Matériel nécessaire :
- incubateur à CO2,
- extracteur d'ADN type SKATRON,
- compteur isotypique à scintillation liquide,
- Réactifs :
* mi lieu RPMI
* Ficoll hypaque
* sérum foetal de veau
* PHI
* thymidine tritiée
3. Métabolisme oxydatif des monocytes :
L'activation des monocytes macrophages stimule leur métabolisme oxydatif qui peut facilement être étudié par cytomètrie de flux en mettant à profit l'oxydation du dichlorof luorescéine dont seule la forme oxydée est fluorescente, donc seule les cellules activées deviennent fluorescentes et sont repérées par le cytomètre de flux.
Par ce moyen, il sera donc possible d'étudier :
- l'activation directe des cellules par le produit,
- l'effet modulateur du produit sur leur activation par PMA.
Protocole
Les leucocytes séparés du sang périphérique sont d'abord mises en contact avec DCF puis :
- soit avec seulement le produit : à différentes concentrations des cellules non traitées par PMA de témoins positifs,
- soit avec le produit et PMA les contacts sont faits en bain-marie thermostaté en agitation continue et les lectures sont faites au cytomètre de flux toutes les 5 min et jusqu'à 1 h 30, le burst oxydatif n'excédant pas cette durée.
Les cinétiques d'activation sont ensuite comparées : Matériel nécessaire :
- cytofluorimètre de flux, - bain-marie thermostaté à agitation continue, - Réactifs :
* Ficoll hypaque * dichlorof luorescéine,
* PMA.
2 - Résultat
2-1 Effet du dérivé de S /Sn de l'exemple 1 sur le marqueur d'acti- vation CD25 récepteur d'IL2 :
Le produit de l'exemple 1 (500 μg), incubé avec les lymphocytes séparés par gradient de Ficoll et activés par la PHA (Phyto hémagglutinine) pendant 24 h, montre un effet inhibiteur sur l'apparition des récepteurs d'IL2.
Résultats exprimés en % de récepteurs d'IL2 (CD25) :
2-2 Effet de Sb/Sn de l'exemple 1 sur la prolifération des lymphocytes mis en culture avec la lectine PHA pendant 72 h :
Le produit de l'exemple 1, en solution à 5 g pour 100 ml, mis en contact avec les lymphocytes séparés par gradient de Ficoll et cultivés avec la lectine PHA pendant 72 h, montre une inhibition importante de la prolifération lymphocytaire.
Après incorporation de thymidine tritiée, les résultats sont exprimés en nombre de coups par minute (cpm).
2-3 Effet de Sb/Sn de l'exemple 1 sur l'expression des Ag membranaires lymphocytai res :
Le produit de l'exemple 1 (500 μg) incubé pendant 1 h avec les lymphocytes séparés par gradient de Ficoll, ne donne pas de modification significative au niveau de l'expression des Ag lymphocytaires des 2 sujets étudiés.
Résultats exprimés en pourcentage :
2-4 Effet de Sb/Sn de l'exemple 1 sur le métabolisme oxydatif des leucocytes humains, étudié en cytomètrie de flux :
L'étude cinétique des leucocytes humains, en présence de dichloro fluorescine, marqueur de l'H202 intracellulaire, et stimulés par le Phorbol myristate acétate, montre un métabolisme oxydatif diminué au cours du temps lorsque le produit de l'exemple 1 leur est ajouté, comme cela résulte des courbes de la figure 5. A la figure 5, les courbes •—•, •—•, •...• représentent la réponse immunitaire à l'action de stimulation causée par le Phorbol myristate acétate seul, respectivement pour les polynucléaires, les monocytes et les lymphocytes, tandis que les courbes
représentent les réponses immunitaires respectivement causées
par le Phorbol myristate acétate en présence du produit de l'invention Sb/Sn de l'exemple 1.
On constate une diminution très si gni f i cat i ve de la réponse immunitaire. B - Activité anti-inflammatoire
On recherche une activité anti-inflammatoire avec le dérivé organique d'aluminium selon l'invention obtenu à l'exemple 2, selon la procédure suivante basée sur l'oedème au kaolin.
Oedème au kaolin - technique de Winter modifiée (1) Introduction
L'injection de kaolin sous L'aponévrose plantaire de la patte postérieure du rat provoque une réaction inflammatoire aigue qui peut être réduite par les substances anti-inflammatoires. Cette réaction inflammatoire se traduit par un oedème d'installation rapide et persistant 48 h ce qui permet d'obtenir une cinétique d'activité des anti-inflammatoires. Matériel et méthodes
1 - Animaux
Des rats mâles de couche Wistar (12 par lot) provenant du centre d'élevage de Montpellier ont été utilisés dans cette étude. Les animaux sont maintenus en observation pendant 4 jours avant le début des essais. En début d'essai les animaux pèsent en moyenne 90 g. Pendant la période d'observation les animaux, répartis par cage de 5, reçoivent nourriture et eau de boisson ad libitum et sont soumis à une température comprise entre 21 et 23 C et a un cycle jour/obscurité de 12 h.
2 - Produits
- Dérivé organique d'aluminium de l'exemple 2,
- Indometacine (INDOCID® 250),
- Kaolin tamisé,
- Excipients,
- sérum physiologique.
3 - Protocole
Les animaux sont mis à jeun de nourriture la veille. Le jour du test les rats sont anesthésiés à l'éther. Une incision est pratiquée dans la partie supérieure de l'abdomen et le nebulisat injecté dans l'anse duodénale à l'aide d'une seringue. la paroi musculaire est ensuite saturée et la peau refermée a l'aide de 2 agrafes. La suspension de kaolin est injectée 1/2 h après (0,1 ml - solution 10g% dans du sérum physiologique) dans le coussinet plantaire de la patte postérieure droite. Un lot d'animaux témoins sert de contrôle et reçoit l'excipient. Pour chaque dose de substance, les concentrations des suspensions utilisées sont aj ustées de mani è re à admi ni st rer exactement 1 m l pa r 100 g de poids corporel.
Les mesures pléthysmographiques (2) sont faites avant
1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 5 h, 6 h après l'administration de la suspension de kaolin.
4 - Doses utilisées
Du dérivé organique de l'aluminium de l'exemple 2,
- 100 mg/kg voie intra-duodéna le.
Indométacine
- 5 mg/kg voie intra-duodénale. 5 - Expression ces résultats
Le pourcentage d'augmentation du volume de la patte est obtenu pour chaque animal selon la formule suivante :
Volume mesuré - Volume initial
% =__________________________x 100
Volume initial
Les pourcentages d'enflure sont analysés par les tests F de SNEDECOR et t de Student (3).
L'activité anti-inflammatoire est exprimée par le pourcentage de réduction de l'oedème chez les rats traités par rapport aux témoins selon la formule suivante :
% Enflure témoins - % Enflure traités
% =________________________________x 100
Enflure témoins Résultats
Les résu ltats sont consignés dans le tableau II et la figure 2.
Conclusion
L'examen des résultats montre dans nos conditions expérimentales, que le dérivé d'aluminium de l'exemple 2 à la dose de 100 mg/kg présente une activité anti-inflammatoire marquée. Cette activité est maximale dès la deuxième heure et reste significative durant 5 h. L'efficacité du dérivé d'aluminium est , d'autre part comparable à celle obtenue avec 5 mg/kg d'indométacine.
Compte tenu de son activité et de sa faible toxicité le dérivé d'aluminium présente donc un réel intérêt thérapeutique.
Bibliographie
(1) WINTER C.A. RISLEY. E.A. et NUSS. G.W. 1962
Carrageenin induced oedema in hind paw of the rat as an assay for anti-inf lammatory drugs. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1 : 1 : S44-547
(2) LENCE. P. 1962 A new device for plethysmographic measuring of small objects. Arch. Int. Pharmacodyn. 36 : 237-241
(3) SCHARTZ. D. Méthodes statistics à l'usage des médecin et biologiste. Edition Flammarion. C - Détermination d'un effet hypoglycémiant
A L'aide du dérivé organique de vanadium obtenu à l'exemple 3 on détermine la présence d'une activité hypoglycémiante, selon la procédure suivante : 1 - Animaux
Des rats mâles de souche Wistar (12 par lot), provenant du centre d'élevage de Montpellier ont été utilisés dans cette étude. Les animaux sont maintenus en observation pendant 4 j avant le début des essais. En début d'essai, les animaux pèsent en moyenne 140 g. Pendant la période d'observation les animaux, répartis par cage de 5, reçoivent nourriture et eau de boisson ad libitum et sont soumis à une température comprise entre 21 et 23°C et à un cycle jour/obscurité de 12 h.
2 - Produits
- Dérivé porphyrinométallique (Va) selon l'exemple n° 3
- Streptozotocine
- Excipients - tampon citrate pH 4,5
- sérum physiologique
3 - Protocole
20 animaux d'un poids moyen de 190 g sont anesthésiés à L'éther. Une injection intraveineuse de streptozotocine est pratiquée au niveau de la veine du pénis ; une glycémie de contröle est effectuée 48 h après l'administration de la streptozotocine.
Seuls les animaux présentant une glycémie supérieure ou égale à 2 g sont sélectionnés et soumis au traitement par la substance testée. L'administration du dérivé selon l'exemple 3 a été biquotidienne (8-18 h) pendant 3 j, puis quotidienne (18 h). Le contrôle de la glycémie est effectué le matin à 9 h, moment de la journée où la glycémie des rats diabétiques témoins ou traités, soumise à de grandes variations durant la journée, est la plus élevée. Des rats diabétiques ne reçoivent que l'excipient (sérum physiologique) et servent de témoins diabétiques. Enfin, des rats "témoins blancs" de même poids, n'ayant par reçu d'injection de streptozotocine sont conservés à fin de comparaison des consommations d'eau et de nourriture. Résultats
Le contrôle quotidien de la glycémie ne nous a pas permis de mettre en évidence d'effet hypoglycemiant durant les 2 premiers jours du traitement. Une chute importante et significative de la glycémie par rapport à celle des rats témoins apparaît dès le troisième jour et se maintient les jours suivants. Celle-ci est accompagnée d'une réduction également significative de la prise de poids, de la polyphagie et de la polydipsie, les consommarions de nourriture et d'eau recouvrant des valeurs tendant à se raoprocher de celle des rats témoins non diabétiques
- 1/ Evolution du poids des animaux témoins, diabétiques et des animaux truites durant les 12 jours de traitement (en g).
JOURS J00 J03 J05 J07 J10 J12
TEMOINS 189 215 225 233 255 271
DIABETIQUES 191 199 218 226 232 246
TRAITES ex. 3 171 194 198 215 220 227
- 2/Evolution de la glycémie des animaux témoins, diabétiques et des animaux traités durant les 12 j de traitement (mg/100 nl).
JOURS J00 J03 J05 J07 J10 J12
TEMOINS 104 106 104 98 100 96
DIABETIQUES 368 460 437 474 560 610
TRAITES 330 366 256 272 267 250
- 3/Consommation moyenne de nourriture (g).
JOURS J00 J03 J05 J07 J10 J12
TEMOINS 20,8 19,7 20,1 24,1 20 25
DIABETIQUES 21,9 30 34,2 38,2 34,2 32,6
TRAITES ex. 3 18,9 14 25 26 20,3 20,5 - 4/Consommation moyenne d'eau de boisson (ml). JOURS J00 J03 J05 J07 J10 J12 TEMOINS 40 40 43,3 46,6 41 ,7 41 ,7 DIABETIQUES 88,6 128 141 164 136 150
TRAITES ex. 3 75 55 87,5 75 66 43
Les figures 1 à 4 rapportent l'évolution pondérale (figure 1), l'évolution de la glycémie (figure 2), la consommation de nourriture (figure 3) et la consommation d'eau (figure 4), sur la base des indications précédentes émettent clairement en évidence les effets indiqués ci-dessous.
En regard des quatres paramètres objectifs ci-dessus, ainsi qu'en regard des pa ramèt res subjectifs, tels l'aspect et le comportement des animaux, il apparaît que le traitement, dans les conditions opératoires retenues, a eu un effet hypoglycémiant, et que celui-ci est majeur. Il a pu également être observé un effet thérapeutique rémanent même après l'arrêt du traitement. D - Activité anti-polyarthrite
Par le test à l'adjuvant de Freund
On détermine la présence d'une activité anti-polyarthrite avec le dérivé organique d'or obtenu à l'exemple 4, de la manière suivante :
Introduction
L'injection d'une suspension de mycobactérium butyricum chez le rat, entraîne le développement d'une polyarthrite chronique expérimentale d'origine antigénique dont les caractéristiques sont proches de la pathologie de la polyarthrite rhumatoide chez l'homme. Elle évolue de façon chronique avec des poussées au cours desquelles se constitue des destructions articulaires génératrices de déformations ; la destruction articulaire est la conséquence d'une synovite proliférante, siège d'une inflammation chronique d'origine immunologique. En l'absence de traitement, l'évolution est irréversible et se traduit par une tuméfaction diffuse. régulière, effaçant les reliefs articulaires et localisées aux pattes postérieures ; l'atteinte des pattes antérieures est également pssible.
L'impotence articulaire se traduit par une limitation des mouvements actifs, voire une fixation de la jointure dans sa position de relâchement.
Enfin, d'autres signes comme la présence de nodules sur la queue et les oreilles, un érythème localisé sur les zones tuméfiées en particulier les articulations, une conjonctivite ou une atteinte génitale sont autant de signes révélateurs de l'évolution de l'arthrite vers laa chronicité.
Certaines substances anti-inflammatoires peuvenr enrayer l'aggravation de l'arthrite, voire même entraîner le retour à une morphologie articulaire normale.
Matériel et méthodes
1 - Animaux
Des rats mâles de souche Wistar (12 par lot), provenant du centre d'élevage de Montpellier ont été utilisés dans cette étude. Les animaux sont maintenus en observation pencant 4 j avant le début des essais. En début d'essai les animaux pèsent en moyenne 180 g. Pendant la période d'observation les animaux, répartis par cage de 5, reçoivent nourriture et eau de boisson ad libitum et sont soumis à une température comprise entre 21 et 23°C et a un cycle jour/obscurité de 12 h.
2 - Produits -
- Dérivé d'or de l'exemple 4,
- Indométacine sous forme de gélules (INDOCID® 250),
- Suspension de mycobactérium butyrique DIFCO® ,
- Excipients,
- sérum physiologique,
- eau gommeuse à 3%,
- eau pour préparation injectable,
- huile de paraffine. 3 - Protocole
Induction de l'arthrite
Une suspension dans la paraffine de bactéries de la souche mycobactérium tuberculosis est injectée dans le tiers inférieur de la queue de rat. Le 21éme jour suivant l'injection, les rats sont triés en fonction des signes morphologiques de l'atteinte arthritique qu'ils présentent. Seul les animaux présentant une tuméfaction unilatérale ou bilatérale des pattes postérieures sont retenus.
Constitution des lots
Une mesure des voLumes des pattes postérieures droite et gauche est réalisée à l'aide d'un piethismométre sur les rats précédemment sélectionnés. Des lots homogènes en poids et en % d'augmentation des volumes des pattes postérieures droite et gauche sont ensuite constitués.
Traitement
Le traitement débute le 21éme jour après la constitution des lots et se poursuit durant 13 jours à raison d'une administration quotidienne. La dernière mesure (J14) est effectuée 24 h après la dernière administration.
Nature des lots
Cinq lots de 9 animaux chacun ont été constitués selon l'ordre suivant :
- un lot arthritique témoin
- un lot arthritique traité indométacine 3 mg/kg
- un lot arthritique traité 803 200 mg/kg
- un lot arthritique traité 803 400 mg/kg
- un lot non arthritique ne recevant aucun traitement.
Evaluation de l'arthrite
Le volume des pattes postérieures fait l'objet d'une évaluation avant et pendant toute la durée du traitement paral lèlement à un examen morphologique ; cet examen permet d'évaluer et de quantifier :
- L'impotence qui traduit une limitation voire la disparition des déplacements de l'animal lorsqu'il est placé sur une surface plane est créditée d'un indice de 0 à 3.
. 0 pas d'impotence
. 1 impotence moyenne
. 2 impotence forte
. 3 impotence totale.
- L'ankylose traduit la limitation ou la disparition du mouvement articulaire des pattes postérieures est créditée d'un indice de 0 à 2 pour chacune des pattes.
. 0 pas d'ankylose
. 1 ankylose moyenne
. 2 ankylose totale.
- L'oedème des pattes antérieures qui traduit une extension de l'arthrite est crédité des indices 0 et 1.
. 0 absence d'oedème
. 1 présence d'un oedème.
- Présence éventuelle de nodules sur les oreilles.
. 0 absence
. 1 présence
- Présence de nodule sur la queue localisé au point initial d'injection de l'adjuvant.
. 0 absence
. 1 présence
- Atteinte génitale.
. 0 absence
. 1 présente. - Atteinte oculaire se traduisant par la présence d'une conjonctivite unilatérale ou bilatérale.
. 0 absence
. 1 présence.
Résultats
1 - Homogénéité des lots avant traitements
Tableau III
Volume des pattes postérieures
* Dérivé d'or de l'exemple 4
Tableau IV
% d'enflure par rapport au lot témoin absolu
Une analyse de variance du volume des pattes postérieures ainsi que du poids des animaux des différents lots ne met en évidence aucune différence significative avant traitement. 2 - Evolution pondérale
3-1-2 Evolution du volume de la patte en % du volume de base.
Le volume de base est le volume des pattes postérieures mesuré au jour 0, avant traitement.
3-1-3 Pourcentage de protection.
Le pourecntage de protection est déterminé par rapport au volume des pattes posrérieures des animaux témoins.
3-1-4 Evaluation de l'efficacité du traitement.
L'efficacité du traitement est évalué en pourcentage d'enflure des pattes postérieures des lots traités (animaux patho logiques traités) par rapport au volume des pattes postérieures du lot témoins absolus chez lesquelles l'arthrite n'a pas été conduite (animaux sains).
3-2 Evolution de l'impotence et de l'ankylose.
3-3 Evolution des facteurs secondaires :
présence d'oedème sur les pattes avant, de nodule sur la queue et les oreilles, atteinte génitale et conjonctivite.
A l'exception de la présence ou de l'absence d'oedème sur les pattes antérieures, l'exploitation des autres facteurs n'a pas donné d'indications significatives quant à l'efficacité des traitements.
Evolution de l'oedème des pattes avant durant le traitement :
Les fractions indiquent le nomore d'animaux atteint d'cedéme des pattes avant sur le nomore total d'aninaux dans craque lot.
Analyse des résultats - discussion
Témoins arthritiques : le volume des pattes postérieures passe de 76 à 90 mm de Hg de qui reorésente une aggravation de 18%. D'autre part, le % d'enflure par rapport aux animaux témoins absolus évolue de 58,23 (JO) à 83,55 (J14) ; il y a donc, en l'absence du traitement, aggravation de l'arthrite. Cette constation se trouve confirmé par la progression de l'impotence (2,25 à 2,40), de l'ankylose (1,05 à 1,39) et de l'extension de l'arthrite aux membres antérieurs (5/9 à 7/9) traduisant dans l'ensemble une évolution en phase chronique. Or, ex 4, - 200 mg/kg - voie intrapéritonéale : nous constatons une stabilisation de l'évolution de l'arthrite ; le volume des pattes postérieures reste aux environs de 72 mm de Hg ; le % d'enflure par rapport animaux témoins absolus reste également stable (48%). Enfin, l'impotence (2,33 à 2,00), l'ankylose (1,35 à 1,44) et l'atteinte des membres antérieures (4/9 à 4/9) confirment également cette stabilité.
A cette dose le dérivé de l'invention de l'ex. 4 présente donc une efficacité comparable à celle d'un traitement de fond. Or, ex. 4 - 400 mg/kg - voie intrapéritonéale : nous notons une régression significative de l'oedème ; le volume des pattes postérieures passe de 78 à 59 mm de Hg (soit - 25% par rapport au volume initial) ; le % d'enflure par rapport aux animaux témoins absolus n'est plus que de 19,93% en fin de traitement. L'impotence (2,11 à 1,44), l'ankylose (1,41 à 0,99) régresse de façon significative. Le nombre d'animaux présentant une atteinte des pattes antérieures est réduit (7/9 à 4/9). Le % d'enflure par rapport au lot témoin absolu passe de 61,9 (J0) à 19,9 (J14). Enfin le % de protection par rapport au lot témoin arthritique est de 34,65% (J14).
Indométacine - 3 puis 1,5 mg/kg - voie intragastrique : les résultats obtenus sont quantitativement similaires à ceux du lot précédent ; diminution significative dès J4 du volume des pattes postérieures (76 à 56 mm de Hg) soit - 26%. Le % d'enflure par rapport aux animaux témoi ns absolus est de 14,28% en fin de traitement. L'impotence (2,00 à 1,30), l'ankylose (1,44 à 0,99) et l'oedème des pattes antérieures (4/9 à 1/5) diminuent de façon significative. Le % d'enflure par rapport au lot témoin absolu passe de 57,35 (J0) à 14,28 (J14). Le % de protection par rapport au lot témoin arthritique est de 37,73% (J14).
L'activité du dérivé d'or est donc, sur deux semaines d'observations, globalement similaire à celle de l'indométacine. Si les doses, 3 mg pour l'indométacine contre 400 mg/kg pour le 803, sont sans communes mesures, il est à souligner que l'indométacine a provoquée la mort par perforation gastrique de 4 animaux dès le quatrième jour de traitement nous contraignant à ramener la dose à 1,5 mg/kg.
Le dérivé d'or de l'invention, dans nos conditions expérimentales, n'a pas présenté de signe apparent de toxicité si ce n'est un léger ballonnement abdominal en fin de traitement : bien que l'analyse statistique n'ait laissé apparaître aucune différence significative, le lot indométacine présente une évolution pondérale plus favorable. La progression pondérale limitée des animaux traités par le dérivé d'or peut s'interpréter par l'administration intra-péritonéale d'une quantité importante de substance dont la résorption peut présenter problème et expliquer le ballonnement signalé plus haut.
Conclusion
L'analyse des résultats montre que, dans nos conditions expérimentales, le dérivé d'or selon l'invention présente une efficacité significative dans le modèle de l'arthrite à l'adjuvant de FREUND. Aux doses utilisées son activité est comparable à celle de l'indométacine.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dérivé organique d'un métal, caractérisé en ce qu'il est constitué par un dérivé d'un métal, de préférence de valence au moins égale à 3, avec un composé organique comprenant au moins un phospholipide conférant une hydrosolubilité ou hydromiscibilité au dérivé organique dudit métal.
2. Dérivé organique selon la revendication 1, caractérisé en de que le métal précité est lié à la fonction phosphate du phospholipide.
3. Dérivé organique selon la revendication 2, caractérisé en de que le phospholipide comprend au moins un acide gras insaturé, de préférence en position α ou β par rapport à la fonction phospnate.
4. Dérivé organique selon la revendication 3, caractérisé en de que l'acide gras insaturé précité est un acide gras polyinsaturé, de préférence sans conjugaison des liaisons éthyléniques, encore ce préférence à au moins deux doubles liaisons.
5. Dérivé organique selon la revendication 4, caractérisé en de que l'acide gras insaturé précité a au moins trois doubles liaisons, de type acide α- l i no léni que ou α-linolénique.
6. Dérivé organiαue selon la revendication 4, caractérisé en de qu'il est choisi parmi le groupe consistant de l'acide 9, 12-linoléique, l'acide 9, 12, 15-linolénique et l'acide 5, 8, 11, 14-arachidonique.
7. Dérivé organique selon l'une des revendications 2 à 6, caractérisé en ce que le phospholipide comprend au moins une fonction acide phosphorique de préférence conjuguée avec une insaturation de la chaîne phospholipidique, cette fonction acide étant soit libre, soit liée à un groupement ammonium non substitué ou substitué, ou alkylamine dans lequelle groupe alkyle est un alkyle inférieur en C1-C5, de préférence en C1-C3.
8. Dérivé organique selon l'une des revendications 2 à 7, caractérisé en ce que le métal ayant une valence au moins égale à 3 est choisi parmi le groupe consistant de Se, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Ga, Ge, Sb, In, Pd, Rh, Ru, Te, Mo, Nb, Zr, Y, Hf, Ta, W, Re, Os, Ir, Pt, Au, Tl, Pb, Bi, Po.
9. Dérivé organique selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en de que la fonction aminé précitée est liée à un phénol ou un acide phénolique, de préférence choisi parmi l'acide caféique, ferrulique, chlorogénique, salycilique ou les dérivés de l'acide salycilique, en particulier la salicine, un salycoside, un hyperosice, un spyréoside, un mono-tropitoside, l'adéhyde salycilique ou un salycilate d'alkyle inférieur en C1-C5, de préférence en C1-C3, en particulier le salycilate de méthyle.
10. Dérivé organique selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en de que l'acide phénolique est lui-même lié à un sucre en C5 cu C6, en particulier le mannitol ou le mannose.
11. Dérivé organique selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le composé organique présente la formule chimicue générale suivante :
dans laquelle :
R1 = soit un acide gras en C16 à C2 0 ayant avantaaeusement un faiple degré d'fnsaturation, en particulier une double liaison ,
= soit un noyau porpnyrine lié à un métal M1 ayant une valence supérieure ou égale à 3 telle que précédemment définie,
= soit un groupe X-OH dans lequel X = (CH2)n, n étant égal à 0, 1 ou 2.
R2 = soit un acide gras insaturé de C1 6 à C20 de préférence ayant au moins 2 degrés d' insaturation,
= soit une fonction phosphate de formule :
R3 = soit un acide gras insaturé en C1 6 à C20 tel que défini pour
R1 ou R2,
= soit un groupe phosphate de formule :
- à la condition que R2 et R3 ne peuvent pas être simultanément un groupe phosphate.
R4 = soit H, soit un groupe ammonium quaternaire (non substitué ou substitué, en particulier avec un groupe ionique positif lui-même lié à R5 dans lequel R5 égale un ccrnposé organique en C5 minimum de préférence choisi parmi un sucre, un acide phénolique) ; soit un groupe alkyle en C1-C5-amino libre ou lié à R5 ;
dans la formule précédente, une fonction acide libre du groupe phosphate de R2 ou R3 peut être salifiée par un métal M3 de valence inférieure ou égale à 2, en partidulier dnoisie parmi le Ca, Sr, Li, Cd, Zn, Mg et Ag ; M2 étant l'hydrogène ou un métal similaire à M1.
12. Dérive erganique selon l'une des revendications 1 à 11, daractérisé en de que le phospnolipide précité est lié à un groupe porphyrine.
13. Dérivé organique selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisé en de qu'il présente la formule chimique générale suivante :
dans laquelle A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7, A8 sont choisis indépendamment parmi les substituants usuels des chlorophylles, en particulier l'hydrogène, un alkyle inférieur en C1-C5 à chaîne droite, ramifiée ou cyclique, un radical vinyle, formyle et ses esters, acétyle et ses esters, propionyle et ses esters, acrylyle et ses esters, et cyclopentanoyles ;
M1 étant un métal de valence au moins égale à 3, tel que précédemment défini.
Et l'un au moins parmi A1 à A8 est obligatoirement un substituant phospholipidique tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 12.
14. Dérivé organique selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, daractérisé en de que la fonction phospnorique du phospholipide est liée à un cation d'un second métal de valende inférieure à 3, de préférende le calcium, le strontium, le zinc, le cacmium, le lithium, le magnésium et l'argent.
15. Dérivé organique de métal, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un dérivé organique d'or lié à un phospholipide tel que défini a l'une quelconque des revendications 1 à 13, en particulier cptenυ a cartir de la plante Rybes nigrum.
16. Dérivé organique de métal, caractérisé en ce qu'il s'agit du dérivé organique de Sb lié à un phospholipide tel que défini à l'une duelconque des revendications 1 à 13, en particulier obtenu à partir de la plante Angelica archangelica.
17. Dérivé organique de métal, caractérisé en de qu'il s'agit du dérivé organique de vanadium lié à un phoscholipide tel que défini à l'une cuelconque des revendications 1 à 13, en particulier obtenu à partir de la plante Urtica dioica.
18. Dérivé crganique de métal, caractérisé en ce qu'il s'agit du dérivé organique d'aluminium lié à un phospholipide de préférence la phosohatidylcholine tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 13, en particulier obtenu à partir de la plante Reseda phyteuma.
19. Agent biomédiateur à activité immunomodulatrice, à activité anti- inflammatoire, à activité hypoglycémiante, à activité anti-rhumatismale en particulier à activité anti-polyarthrite et rhumatoide, caractérisé en ce qu' il comprend au moins un dérivé organique de métal tel que défini à l 'une quete des revendications 1 à 18.
20. Composition pharmaceutique, caractérisée en de qu'elle comprend à titre de principe actif un dérivé organique de métal tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 18.
21. Composition pharmaceutique à activité immunomodulatrice, caractérisée en ce qu'elle comprend un dérivé organique de métal tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 18, éventuellement dans un excipient, support ou véhicule pharmaceutiquement acceptable.
22. Composition pharmaceutique à activité immuno- modulatrice,, caractérisée en de qu'elle comprend une quantité pharmaceutiquement efficace d'au moins un dérivé de Sb ou Sb/Sn, de préférence extrait de l'espèce Angelica, en particulier Angelica archangelica, et Angelica sinensis, éventuellement dans un excipient, support ou véhicule pharmaceutiquement acceptable.
23. Composition pharmaceutique à activité antiinflammatoire, caractérisée en ce qu'elle comprend à titre de principe actif un dérivé organique de métal tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 18, dans un véhicule, excipient ou support pharmaceutiquement acceptable.
24. Composition pharmaceutique à activité hypoglycémi ante, caractéri sée en ce qu ' e l l e comprend à t i t re de pri nc i pe actif un dérivé organique de métal tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 18, éventuellement dans un véhicule, excipient ou support pharmaceutiquement acceptable.
25. Composition pharmaceutique à activité antirhumatismale, en particulier à activité anti-polyarthrite rhumatoîde, caractérisé en ce qu'elle comprend un dérivé organique d'un métal tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 18, à titre de principe actif, éventuellement dans un excipient, véhicule ou support pharmaceutiquement acceptable.
26. Procédé de préparation d'une composition pharmaceutique, caractérisé en ce qu'il comprend l'incorporation d'au moins un dérivé organique de métal tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 18, dans un excipient, véhicule ou support pharmaceutiquement acceptable.
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