EP0565511A1 - Verfahren zur Spaltung von Proteinen - Google Patents

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EP0565511A1
EP0565511A1 EP93890046A EP93890046A EP0565511A1 EP 0565511 A1 EP0565511 A1 EP 0565511A1 EP 93890046 A EP93890046 A EP 93890046A EP 93890046 A EP93890046 A EP 93890046A EP 0565511 A1 EP0565511 A1 EP 0565511A1
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EP
European Patent Office
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prothrombin
thrombin
trypsin
detergent
proteases
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EP93890046A
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EP0565511B1 (de
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Peter Dr. Turecek
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Oesterreichisches Institut fuer Haemoderivate
Original Assignee
Immuno AG
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Publication of EP0565511B1 publication Critical patent/EP0565511B1/de
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6429—Thrombin (3.4.21.5)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/14—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an inorganic carrier
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/06—Preparation of peptides or proteins produced by the hydrolysis of a peptide bond, e.g. hydrolysate products
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21005—Thrombin (3.4.21.5)

Definitions

  • the invention relates to a method for the controlled, restricted proteolytic cleavage of proteins, in particular proenzymes, for the production of enzymes or protein fragments, the protein being treated with a protease.
  • the invention relates to a method for obtaining thrombin from prothrombin.
  • Such a method is known from EP-A-0 378 798.
  • prothrombin from plasma or a plasma fraction is adsorbed (immobilized) on a solid support and the adsorbate is treated with Ca 2 + ions.
  • the Ca 2 + ions are used in a concentration of up to 30 mM and, together with proteases likewise derived from the plasma and adsorbed on the support, bring about the elimination of the thrombin from the adsorbate.
  • Methacrylic and acrylic copolymers are used as solid supports.
  • prothrombin cleavage products some of which can be used therapeutically (e.g. thrombin), some diagnostically and for the production of specific antibodies.
  • prothrombin e.g. thrombin
  • Another disadvantage of these multi-stage and time-consuming cleaning processes is that they are inevitably accompanied by large losses in yield.
  • the aim of the invention is to eliminate these disadvantages and to provide an improved process for the production of enzymes or protein fragments from proteins, which process should be particularly suitable for the simple production of thrombin.
  • the invention is based on the knowledge that the proteolytic cleavage of proteins, in particular proenzymes such as prothrombin, can be carried out or controlled in a targeted manner if it is carried out in the presence of a detergent or in the presence of a chaotropic substance. It has been shown that the cleavage pattern of the proteins differs depending on the type and concentration of these substances present. This finding opens up the possibility of choosing the reaction medium in such a way that only a few and very specific protein fragments are formed.
  • a preferred variant of the method according to the invention is that a proenzyme is used which is immobilized on a solid carrier material, in particular a sparingly soluble salt or chelate of a divalent metal, preferably an alkaline earth metal.
  • a proenzyme is used which is immobilized on a solid carrier material, in particular a sparingly soluble salt or chelate of a divalent metal, preferably an alkaline earth metal.
  • copolymers are used as carriers, but they have the disadvantage that they release acrylic and methacrylic monomers into the thrombin-containing solution, which are difficult to remove and thus the one to be prepared contaminate pharmaceutical preparation.
  • Such leakage is known for all types of organic polymeric carriers.
  • the targeted cleavage of a proenzyme, in particular prothrombin not only succeeds on copolymers, but also on other carriers, for example on poorly soluble salts such as Ca 3 (P0 4 ) 2 , CaS0 4 , CaC0 3 , BaS0 4 , BaC0 3 or Ba-Citrate.
  • the salts can either be added to a prothrombin-containing solution or can only be formed by precipitation in a prothrombin-containing solution.
  • carrier's divalent ions are selectively bind prothrombin via their gamma-carboxy terminus.
  • the protein fragments that arise during proteolytic treatment of prothrombin have no affinity for divalent ions and thus for the carrier due to the lack of gamma-carboxy terminus.
  • hydroxyapatite a hydroxyapatite gel or a metal chelate affinity chromatographic carrier loaded with a divalent cation (for example Pharmacia Chelating Sepharose R ).
  • proteases e.g. chymotrypsin, dispase, endopeptidase Arg-C, endoproteinase Lys-C, endoproteinase Glu-C, endoproteinase Asp-N, factor Xa, kallikrein, papain, pepsin, plasmin, pronase, proteinase K
  • proteases e.g. chymotrypsin, dispase, endopeptidase Arg-C, endoproteinase Lys-C, endoproteinase Glu-C, endoproteinase Asp-N, factor Xa, kallikrein, papain, pepsin, plasmin, pronase, proteinase K
  • proenzymes Staphylocoagulase, subtilisin, thrombin, trypsin (in particular human, bovine, porcin), trypsin-like proteases from arthropods or micro
  • Trypsin, chymotrypsin, kallikrein, dispase or the endoproteinases Glu-C, Lys-C or Asp-N are preferably used as proteases. Recombinant proteases can also be used.
  • a proenzyme can be cleaved in the presence of a detergent in such a targeted manner that the enzyme to be obtained forms the main part of the fragment mixture.
  • a detergent is deoxycholate (DOC), which is preferably used, and also others, such as dodecyl sulfate (SDS), CHAPS, polyoxyethylene derivatives such as Brij, Tween, Triton and Pluronic.
  • DOC deoxycholate
  • SDS dodecyl sulfate
  • CHAPS polyoxyethylene derivatives
  • Brij e.g., Tween, Triton and Pluronic.
  • Typical chaotropic substances that are used in the process according to the invention are, for example, urea, guanidinium hydrochloride and thiocyanates, but coagulation-active salts, such as e.g. Calcium salts, which also have a chaotropic effect, are not appropriate.
  • the supernatant obtained which contains the desired enzyme, can be subjected to further purification steps.
  • Gel permeation chromatography or affinity chromatography can advantageously be used for this.
  • affinity chromatography methods is recommended.
  • Triazine affinity chromatography supports with ligands of the type Cibacron R- Blue F3GA (manufactured by Ciba Geigy) or Procion R- Red HE-3B (manufactured by ICI) or related dyes have proven to be very suitable.
  • the protein fragments can be batched or directly from the desorption supernatant after solid phase activation to the respective affinity matrix (eg Fractogel R TSK AF-Blue (manufactured by Merck), Blue-Sepharose R CL-6B (manufactured by Pharmacia)) be adsorbed in the packed column.
  • the protein fragments are then eluted from the detergent by washing with buffer and finally with a high-molecular (eg 1 M) chaotrope (eg KSCN or NH 4 SCN).
  • the eluate can be freed of the chaotrope by geipermeation chromatography (e.g. via Sephadex G25), diafiltration or dialysis and placed in a suitable buffer or saline solution.
  • geipermeation chromatography e.g. via Sephadex G25
  • diafiltration or dialysis e.g. via diafiltration or dialysis
  • a suitable buffer or saline solution e.g., a suitable buffer or saline solution.
  • the further purification for homogeneity can be carried out in a known manner via reverse phase chromatography, affinity chromatography or gel permeation chromatography.
  • the detergent treatment achieves a marked reduction in virus activity if a starting product is used which comes from a pool contaminated with virus. It was found in one case that no vaccinia viruses were detectable in a thrombin preparation produced by the method according to the invention, although the starting material (a fermentation supernatant) had contained vaccinia.
  • additional measures for inactivating any infectious agents that may be present such as, for example, steam-heat treatment of a lyophilized product, can also be carried out within the scope of the method according to the invention.
  • the supernatant containing thrombin can be subjected to the purification steps described above.
  • Affinity chromatography with Fractogel R TSK-AF Blue (Merck) with subsequent Sephadex-G25 chromatography is preferably carried out.
  • the pure thrombin-containing solution obtained is then, if appropriate, by ultracentrifugation or lyophilization concentrated and processed into a pharmaceutical preparation.
  • Cell culture supernatant medium according to PCT application WO 91/11519, which contains recombinant human prothrombin, is mixed with 5 g powdered Ca 3 (P0 4 ) 2 per 100 IU prothrombin and stirred gently at 4 ° C. for one hour. The solid phase is then centrifuged at 5000 g, the pellet obtained is resuspended in 40 ml of 20 mM Tris / HCl buffer (pH 7.4), stirred for 10 min and centrifuged again at 5000 g. This process is repeated with 40 ml of 5% (w / v) ammonium sulfate in the buffer mentioned and finally again with 40 ml of pure buffer.
  • prothrombin-containing starting material e.g. a partial prothrombin complex, ie a mixture of factors 11, IX and X, can be used to prepare the immobilized prothrombin.
  • Example 1 Influence of the reaction environment on the tryptic cleavage of immobilized prothrombin
  • solution B active thrombin is formed as the main fragment, which does not degrade into smaller oligopeptides even after 3 hours of trypsin treatment.
  • Example 2 Cleavage of immobilized prothrombin using various proteases (in the presence of a detergent)
  • prothrombin was adsorbed on Ca 3 (P0 4 ) 2 from a cell culture supernatant medium containing prothrombin and washed.
  • the batches were incubated for two hours, in the case of kallikrein 20 hours, at room temperature with shaking. Then aliquots of the batches were mixed with SDS sample buffer (1: 1) and examined for their fragment composition by immuno-western blot.
  • thrombin time in the coagulation test with normal plasma and the amidolytic activity with the chromogenic substrate TH-1 (2 AcOH.H-D-CHG-Ala-Arg-p-nitroanilide) were each determined photometrically against an international thrombin standard (FIG. 1).
  • Fig. 1 shows that the yield of active thrombin (33 kD fragment) has a maximum at 350 mM deoxycholate.
  • the thrombin formed would not be further broken down over a period of at least 20 hours despite the presence of the trypsin.
  • a buffer-moist pellet (approx. 10 g) was mixed with 50 ml of a solution of 0.76 mg porcine trypsin (Sigma T-0134) per ml in 20 mM Tris / HCl buffer (pH 8.3) containing 200 mM Na- Deoxycholate contained, incubated for 1 hour at room temperature with gentle stirring. The Ca phosphate was then removed by centrifugation. The supernatant contained primarily thrombin, along with a few other fragments of prothrombin.
  • the supernatant containing thrombin (approx. 50 ml) was pumped through the gel for adsorption at a flow rate of 2 ml / min. Thereafter, unspecifically bound prothrombin fragments were eluted with 20 ml of 0.5 M NaCl solution, 40 ml of 1.0 M NaCl solution and 20 ml of 20 mM Tris / HCl buffer (pH 7.4) at a flow rate of 6 ml / min . In the reverse direction of flow at 1 ml / min, prothrombin fragments were then eluted with 20 mM Tris / HCl buffer containing 1 M KSCN. The eluate was measured photometrically via a flow cell at 280 nm, a total of 15 ml was collected.
  • the protein content of the eluate was 188 mg / ml.
  • 2 shows the fragment composition (densitometric immuno-western blot scan) with a dominant 33 kD fragment (active thrombin).
  • Thrombin accounts for approx. 30% of the protein content.
  • a specific activity of about 2200 IU / mg protein could be determined for the thrombin.
  • Approx. 100 IU thrombin could thus be obtained from 1 IU prothrombin by tryptic solid phase activation.
  • the thrombin-containing solution obtained can be further purified in a known manner, concentrated and further processed into a pharmaceutical preparation.

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Abstract

Zur kontrollierten, eingeschränkten proteolytischen Spaltung von Proteinen, insbesondere Proenzymen, wird eine Behandlung mit Proteasen in Gegenwart eines Detergens oder in Gegenwart einer chaotropen Substanz, ausgenommen gerinnungsaktive Salze, durchgeführt. Dabei werden Enzyme bzw. Proteinfragmente gewonnen. Das Verfahren ist insbesondere an einer einfach durchzuführenden Methode zur gezielten Spaltung von Prothrombin zur Gewinnung von Thrombin erläutert. <IMAGE>

Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kontrollierten, eingeschränkten proteolytischen Spaltung von Proteinen, insbesondere Proenzymen, zur Gewinnung von Enzymen bzw. Proteinfragmenten, wobei das Protein mit einer Protease behandelt wird. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung von Thrombin aus Prothrombin.
  • Ein derartiges Verfahren ist aus der EP-A- 0 378 798 bekannt. Nach diesem Verfahren wird Prothrombin aus Plasma oder einer Plasmafraktion an einen festen Träger adsorbiert (immobilisiert) und das Adsorbat mit Ca2+-lonen behandelt. Die Ca2+-lonen werden in einer Konzentration bis zu 30 mM eingesetzt und bewirken - zusammen mit ebenfalls aus dem Plasma stammenden und am Träger adsorbierten Proteasen - die Abspaltung des Thrombins vom Adsorbat. Als fester Träger werden Methacryl- und Acryl-Copolymere verwendet.
  • Es ist weiters bekannt, daß Trypsin gelöstes Prothrombin in Fragmente mit niedrigem Molekulargewicht abbaut, wobei ein völliger Verlust der Thrombinaktivität festzustellen ist (Biochim.Biophys.Act. 329, 221-232 (1973)); der proteolytische Abbau des Prothrombins endet somit nicht beim Thrombin, wodurch sich diese Methode nicht zur Thrombin-Gewinnung eignet.
  • Alle Verfahren der eingangs genannten Art führen je nach angewandter Protease und Behandlungsbedingungen zu unterschiedlichen Prothrombin-Spaltprodukten, welche zum Teil therapeutisch (z.B. Thrombin), zum Teil diagnostisch und zur Gewinnung spezifischer Antikörper verwendet werden können. Für alle diese Anwendungen ist es jedoch erforderlich, daß die Protein-Fragmente in hoher Reinheit vorliegen, was naturgemäß arbeitsaufwendig ist, da alle bekannten Spaltungsmethoden zu einer Vielzahl von Fragmenten führen. Ein weiterer Nachteil dieservielstufigen und zeitraubenden Reinigungsverfahren besteht darin, daß sie unvermeidlich von großen Ausbeuteverlusten begleitet sind.
  • Die Erfindung setzt sich zum Ziel, diese Nachteile zu beseitigen und ein verbessertes Verfahren zur Gewinnung von Enzymen bzw. Proteinfragmenten aus Proteinen zur Verfügung zu stellen, wobei sich dieses Verfahren insbesondere zur einfachen Gewinnung von Thrombin eignen soll.
  • Dieses Ziel wird bei dem eingangs beschriebenen Verfahren dadurch erreicht, daß die Behandlung mit der Protease in Gegenwart eines Detergens oder in Gegenwart einer chaotropen Substanz, ausgenommen gerinnungsaktive Salze, durchgeführt wird.
  • Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß die proteolytische Spaltung von Proteinen, insbesondere Proenzymen, wie Prothrombin, gezielt erfolgt bzw. gesteuert werden kann, wenn sie in Gegenwart eines Detergens oder in Gegenwart einer chaotropen Substanz durchgeführt wird. Es hat sich gezeigt, daß das Spaltungsmuster der Proteine je nach Art und Konzentration dieser anwesenden Stoffe verschieden ist. Diese Erkenntnis eröffnet die Möglichkeit, das Reaktionsmilieu so zu wählen, daß nur wenige und ganz bestimmte Protein-Fragmente gebildet werden.
  • Eine bevorzugte Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß ein Proenzym eingesetzt wird, welches an einem festen Trägermaterial, insbesondere einem schwerlöslichen Salz oder Chelat eines zweiwertigen Metalls, vorzugsweise eines Erdalkalimetalls, immobilisiert ist. Diese Variante gestattet eine erleichterte Gewinnung des vom adsorbierten Proenzym abgespaltenen Protein-Fragmentes, da der restliche Teil des Proenzyms - am Träger adsorbiert - mit dem Träger einfach von der Reaktionslösung abgetrennt werden kann.
  • Gemäß dem in der EP-A- 0 378 798 beschriebenen Verfahren werden als Träger Copolymere verwendet, welche jedoch den Nachteil haben, daß sie Acryl- und Methacrylmonomere in die Thrombin-hältige Lösung abgeben, die nur schwer wieder entfernt werden können und damit die herzustellende pharmazeutische Präparation verunreinigen. Ein solches Ausbluten ("leakage") ist für alle Arten von organischen polymeren Trägern bekannt. Es hat sich aber gezeigt, daß die erfindungsgemäße, gezielte Spaltung eines Proenzyms, insbesondere Prothrombins, nicht nur auf Copolymeren gelingt, sondern auch anderen Trägern, z.B. auf schwer löslichen Salzen wie Ca3(P04)2, CaS04, CaC03, BaS04, BaC03 oder Ba-Citrat. Die Salze können entweder einer Prothrombin-hältigen Lösung beigegeben oder auch durch Fällung in einer Prothrombin-hältigen Lösung erst gebildet werden.
  • Ein besonderer Vorteil der zweiwertigen Ionen des Trägers ist weiters, daß sie Prothrombin selektiv über ihren gamma-Carboxyterminus binden. Die Protein-Fragmente, die bei der proteolytischen Behandlung des Prothrombins entstehen, haben auf Grund des fehlenden gamma-Carboxyterminus keine Affinität zu zweiwertigen Ionen und damit zum Träger.
  • Als weitere Träger eignen sich auch Hydroxyapatit, ein Hydroxyapatitgel oder ein mit einem zweiwertigen Kation beladener metallchelat-affinitätschromatographischer Träger (z.B. Pharmacia Chelating SepharoseR).
  • Zur proteolytischen Spaltung von Proenzymen eignet sich eine Vielzahl von Proteasen (z.B. Chymotrypsin, Dispase, EndopeptidaseArg-C, Endoproteinase Lys-C, Endoproteinase Glu-C, EndoproteinaseAsp-N, Faktor Xa, Kallikrein, Papain, Pepsin, Plasmin, Pronase, Proteinase K, Staphylocoagulase, Subtilisin, Thrombin, Trypsin (insbesondere human, bovin, porcin), trypsinartige Proteasen aus Arthropoden oder Mikroorganismen, wie z.B. Streptomyces griseus-Trypsin, Serin-Proteasen aus Giftschlangen wie Angkistrodon rhodostoma, Bothrops atrox, Dispholidus typus, Echis carinatus, Naja nigrocollis, Oxyuranus scutellatus scutellatus, u.a.). Bevorzugt eingesetzt werden als Protease Trypsin, Chymotrypsin, Kallikrein, Dispase oder die Endoproteinasen Glu-C, Lys-C oder Asp-N. Es können auch rekombinante Proteasen eingesetzt werden.
  • Es hat sich gezeigt, daß ein Proenzym in Gegenwart eines Detergens so gezielt gespalten werden kann, daß das zu gewinnende Enzym den Hauptanteil des Fragmentgemisches bildet. Als Detergens eignet sich Desoxycholat (DOC), welches vorzugsweise verwendet wird, und auch andere, wie Dodecylsulfat (SDS), CHAPS, Polyoxyethylen-Derivate wie Brij, Tween, Triton und Pluronic. Die Anwesenheit des Detergens erleichert weiters die Desorption der entstandenen Protein-Fragmente vom Träger.
  • Typische chaotrope Substanzen, die im erfindungsgemäßen Verfahren zur Anwendung kommen, sind etwa Harnstoff, Guanidinium-Hydrochlorid sowie Thiocyanate, jedoch sind gerinnungsaktive Salze, wie z.B. Calciumsalze, die gleichfalls chaotrop wirken, nicht zweckmäßig.
  • Der erhaltene Überstand, der das gewünschte Enzym enthält, kann weiteren Reinigungsschritten unterworfen werden. Vorteilhaft können dafür Gel permeationschromatograph ie oder Affinitätschromatographie angewandt werden. Um möglichst konzentrierte Proben zu gewinnen, empfiehlt sich der Einsatz affinitätschromatographischer Methoden. Als gut geeignet haben sich triazinaffinitätschromatographische Träger mit Liganden vom Typ des CibacronR-Blue F3GA (hergestellt von der Firma Ciba Geigy) oder ProcionR-Red HE-3B (hergstellt von der Firma ICI) oder verwandte Farbstoffe erwiesen. Die Protein-Fragmente können direkt aus dem Desorptionsüberstand nach erfolgter Festphasenaktivierung an die jeweilige Affinitätsmatrix (z.B FractogelR TSK AF-Blue (hergestellt von der Firma Merck), Blue-SepharoseR CL-6B (hergestellt von der Firma Pharmacia)) im Batch oder in der gepackten Säule adsorbiert werden. Anschließend werden die Protein-Fragmente durch Waschen mit Puffer vom Detergens und schließlich mit einem hochmolaren (z.B. 1 M) Chaotrop (z.B. KSCN oder NH4SCN) eluiert.
  • Das Eluat kann über Geipermeationschromatographie (z.B. über Sephadex G25), Diafiltration oder Dialyse vom Chaotrop befreit und in einen geeigneten Puffer oder Salzlösung gebracht werden. Die weitere Reinigung zur Homogenität kann in bekannter Weise über Reverse-Phasen-Chromatographie, Affinitätschromatographie, oder Gelpermeationschromatographie erfolgen.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich besonders gut zur Gewinnung von reinem Thrombin. Die Erfindung betrifft deshalb auch die Herstellung einer Thrombin-hältigen, pharmazeutischen Präparation, wobei eine bevorzugte Ausführungsform dadurch gekennzeichnet ist, daß
    • - eine Prothrombin-hältige Lösung mit einem festen Träger, insbesondere einem schwerlöslichen Salz oder Chelat eines zweiwertigen Metalls, vorzugsweise eines Erdalkalimetalls, in Kontakt gebracht wird, um Prothrombin am Träger zu immobilisieren,
    • - das immobilisierte Prothrombin mit einer Protease, insbesondere Trypsin, in Gegenwart eines Detergens, vorzugsweise Desoxycholat, behandelt wird, wobei eine Thrombin-hältige Lösung erhalten wird, welche abgetrennt, gereinigt und
    • - zu einer pharmazeutischen Präparation verarbeitet wird.
  • Es wurde festgestellt, daß durch die Detergensbehandlung eine deutliche Herabsetzung einer Virusaktivität erreicht wird, falls ein Ausgangsprodukt verwendet wird, welches aus einem mit Virus kontaminierten Pool stammt. Es wurde in einem Fall gefunden, daß in einer nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Thrombinpräparation keine Vaccinia-Viren nachweisbar waren, obwohl das Ausgangsmaterial (ein Fermentationsüberstand) Vaccinia enthalten hatte. Natürlich können im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens auch zusätzliche Maßnahmen zur Inaktivierung eventuell vorhandener infektiöser Agentien, so beispielsweise eine Dampf-Hitze-Behandlung eines lyophilisierten Produktes, vorgenommen werden.
  • Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung von Thrombin wird zweckmäßigerweise folgendermaßen durchgeführt:
    • Zunächst wird eine Prothrombin-hältige Lösung mit dem festen Träger in Kontakt gebracht, um Prothrombin zu adsorbieren. Als Prothrombin-hältige Lösung können nicht nur Plasma oder Plasmafraktionen, sondern auch rekombinantes Prothrombin enthaltendes Zellkulturüberstandsmedium verwendet werden. Nach erfolgter Immobilisierung wird das am Träger gebundene Prothrombin aus der Lösung zweckmäßigerweise abgetrennt und gewaschen, um unspezifisch gebundene Proteine, die das spätere Endprodukt verunreinigen könnten, zu entfernen. Danach wird das immobilisierte Prothrombin in Gegenwart von Desoxycholat mit der Protease behandelt, um das Thrombin vom Prothrombin abzuspalten, wobei eine Thrombin-hältige Lösung und ein Festkörper erhalten werden, welcher Festkörper von der Lösung abgetrennt wird. Dies geschieht durch Sedimentation oder Filtration.
  • Der Thrombin-hältige Überstand kann den oben beschriebenen Reinigungsschritten unterworfen werden. Bevorzugt wird eine Affinitätschromatographie mit FractogelR TSK-AF Blue (Merck) mit anschließender Sephadex-G25 Chromatographie durchgeführt.
  • Anschließend wird die erhaltene reine Thrombin-hältige Lösung gegebenenfalls durch Ultrazentrifugation oder Lyophilisation konzentriert und zu einer pharmazeutischen Präparation aufgearbeitet.
  • Mit den folgenden Beispielen wird die Erfindung noch näher erläutert:
    • Bereitung des immobilisierten Prothrombins
  • Zellkulturüberstandsmedium gemäß der PCT-Anmeldung WO 91/11519, welches rekombinantes humanes Prothrombin enthält, wird mit 5 g pulverisiertem Ca3(P04)2 pro 100 IE Prothrombin versetzt und bei 4°C eine Stunde leicht gerührt. Danach wird die feste Phase bei 5000 g abzentrifugiert, das erhaltene Pellet in 40 ml 20 mM Tris/HCI-Puffer (pH 7,4) resuspendiert, 10 min gerührt und bei 5000 g erneut abzentrifugiert. Dieser Vorgang wird mit 40 ml 5 % (G/V) Ammoniumsulfat im genannten Puffer und zuletzt wieder mit 40 ml reinem Puffer wiederholt.
  • In gleicherweise kann als Prothrombin-hältiges Ausgangsmaterial z.B. ein partieller Prothrombinkomplex, also eine Mischung der Faktoren 11, IX und X, zur Bereitung des immobilisierten Prothrombins eingesetzt werden.
    • Beispiel 1: Einfluß des Reaktionsmilieus auf die tryptische Spaltung von immobilisiertem Prothrombin
  • Um den Einfluß von chaotropen Substanzen und Detergentien auf die tryptische Spaltung von Prothrombin zu dokumentieren, wurden zunächst vier Lösungen (A - D) eines Tris/HCI-Puffers (20 mM; pH 8,3) mit den folgenden Zusätzen bereitet (die vierte Puffer-Lösung (D) diente als Vergleich):
    • Lösung A: Harnstoff (0,5 M)
    • Lösung B: Na-Desoxycholat (0,05 M)
    • Lösung C: Na-Dodecylsulfat (0,05 M)
    • Lösung D: kein Zusatz
  • 1 ml der Lösungen A - D wurden anschließend je 200 mg pufferfeuchtes, gewaschenes Pellet (wie oben beschrieben hergestellt) zugegeben und mit 20 µl eines 20 mM Tris/HCI-Puffers, enthaltend 1 mg Trypsin/ml, bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach 1, und 3 Stunden wurden jeweils Aliquote der Suspensionen gezogen, die feste Phase abzentrifugiert und die Überstände mittels Immun-Western-Blot auf die jeweilige Fragmentzusammensetzung untersucht.
  • In Tabelle 1 sind die Peakflächenintegrale der Fragmentbanden bei 12, 19, 23, 25,5, 33, 35 und 44 kD nach densitometrischer Immun-Western-Blot-Messung eingetragen. Es istersichtlich, daß sich in Abhängigkeit des gewählten Reaktionsmilieus verschieden große tryptische Fragmente in unterschiedlichen Mengen nachweisen lassen. Im Gegensatz zur 3-stündigen Inkubation in reinem Tris-Puffer (Lösung D) bleiben in allen anderen Lösungen (A - C) Fragmente im Molekülmassebereich über 30 kD erhalten. Die Fragmente bei 33 kD und bei 35 kD entsprechen Thrombin, wobei 33 kD der aktiven Form zuzuordnen ist.
  • In Gegenwart von Desoxycholat (Lösung B) wird aktives Thrombin als Hauptfragment gebildet, welches auch nach 3-stündiger Trypsin-Behandlung nicht zu kleineren Oligopeptiden abgebaut wird.
    Figure imgb0001
    • Beispiel 2: Spaltung von immobilisiertem Prothrombin mittels verschiedener Proteasen (in Gegenwart eines Detergens)
  • Aus einem Prothrombin enthaltenden Zellkulturüberstandsmedium wurde, wie oben beschrieben, Prothrombin an Ca3(P04)2 adsorbiert und gewaschen.
  • 8 Proben zu je 250 mg pufferfeuchtes Adsorbat wurden in 1 ml 20 mM Tris/HCI-Puffer, pH 8,3, der 200 mM an Na-Desoxycholat enthielt, suspendiert und mit 50 ml der folgenden acht Enzymlösungen versetzt:
    • * Kallikrein aus Schweinepankreas, 250 U/ml in 20 mM TBS, pH 8,3
    • * Dispase 1 aus Bacillus polymyxa, 1 mg/ml in 20 mM TBS, pH 8,3
    • * a-Chymotrypsin aus Rinderpankreas, 350 U/ml in 20 mM TBS, pH 8,3
    • * Trypsin aus Schweinepankreas, 0,76 mg/ml in 20 mM TBS, pH 8,3
    • * Endoproteinase Glu-C aus Staphylococcus aureus V8, 1 mg/ml in 20 mM TBS, pH 8,3
    • * Endoproteinase Lys-C aus Lysobacter enzymogenes, 0,1 mg/ml in 20 mM TBS, pH 8,3
    • * Endoproteinase Asp-N aus Pseudomonas fragi, 0,04 mg/ml in 20 mM TBS, pH 8,3
    • * Faktor Xa, human, 20 U/ml
  • Die Bezeichnung 20 mM TBS (TBS = tris buffered saline) bezieht sich auf einen 20 mM Tris-HCI-Puffer (pH 8,3), welcher 0,9 % NaCI enthält.
  • Die Ansätze wurden zwei Stunden, im Falle des Kallikrein 20 Stunden, bei Raumtemperatur unter Schütteln inkubiert. Danach wurden Aliquote der Ansätze mit SDS-Probenpuffer versetzt (1 : 1) und mittels Immun-Western-Blot auf ihre Fragmentzusammensetzung untersucht.
  • Die Peakflächenintegrale der Fragmentbanden bei 12, 18, 19, 20, 23, 33, 34, 35, 44, 47, 50, 52, 54, 55, 71 und 75 kD nach densitometrischer Immun-Western-Blot-Messung sind in Tabelle 2 wiedergegeben.
  • Es ist ersichtlich, daß sich mit den genannten Proteasen eine Reihe von Fragmenten im Molekülmassenbereich von 12 bis 71 kD darstellen lassen. Das dem aktiven Thrombin entsprechende Fragment (33 kD) läßt sich mittels tryptischem Abbau von Prothrombin in besonders hoher Ausbeute gewinnen.
    Figure imgb0002
    Beispiel 3: Spaltung von immobilisiertem Prothrombin in Gegenwart von Desoxycholat in verschiedenen Konzentrationen
  • Wie oben beschrieben, wurde zunächst rekombinantes Prothrombin aus einem Fermentationsüberstand an Ca3(P04)2 adsorbiert.
  • 5 Proben zu je 0,6 g feuchtes Adsorbat wurden mit je 3 ml 20 mM Tris/HCI-Puffer, pH 8,3, der Na-Desoxycholat in den Konzentrationen 50 mM, 100 mM, 250 mM, 350 mM und 500 mM enthielt, nach Zusatz von 60 f..ll einer Lösung von 0,76 mg/ml Trypsin/ml unter Schütteln 3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden die gegen 0,9 % NaCI umgepufferten Proben auf ihre Thrombinaktivität untersucht. Dabei wurde die Thrombinzeit im Gerinnungstest mit Normalplasma sowie die amidolytische Aktivität mit dem chromogenen Substrat TH-1 (2 AcOH.H-D-CHG-Ala-Arg-p-Nitroanilid) jeweils photometrisch gegen einen Internationalen Thrombin-Standard bestimmt (Fig. 1). Die Fig. 1 zeigt, daß die Ausbeute an aktivem Thrombin (33 kD-Fragment) bei 350 mM Desoxycholat ein Maximum aufweist.
  • Weiters wurde festgestellt, daß das gebildete Thrombin trotz der Anwesenheit des Trypsins über einen Zeitraum von mindestens 20 Stunden nicht weiter abgebaut wird.
    • Reinigung von Protein-Fragmenten des gespaltenen Prothrombins
  • 1,5 ml einer Prothrombin-Fragmente enthaltenden, aus Beispiel 3 stammenden Lösung (350 mM DOC) wurden mit 0,1 % Trifluoressigsäure in H20 (Laufmittel A) an eine Reverse-Phasen-HPLC-Säule (Nucleosil 100-5C18, 125 x 4 mm) adsorbiert (Flußrate: 1,7 ml/min). Danach wurde mit 0,1 % Trifluoressigsäure in Acetonitril (Laufmittel B) mit einem linearen Gradienten von 30 bis 70 % B in 30 min bei einer Flußrate von 1,7 ml/min eluiert. Durch Detektion bei 220 nm konnten 6 Haupt-Peaks (Retentionszeiten: 10,01 min; 11,96 min; 12,68 min; 13,47 min; 13,94 min; 14,47 min) identifizert werden; sie wurden getrennt gesammelt und lyophilisiert. Die weitere Analyse der getrennten Fragmente erfolgte über SDS-PAGE mit Detektion durch Coomassie-Färbung, sowie mittels Immun-Western-Blot mit einem polyklonalen Kaninchen-anti-Humanprothrombin-Antiserum. Die Molekülmassen der Fragmente wurden für die sechs Haupt-Peaks mit 9 kD, 16 kD, 21 kD, 23 kD, 12 kD und mit 33 kD bestimmt.
    • Beispiel 4: Gewinnung von Thrombin
  • Ein pufferfeuchtes Pellet (ca. 10 g) wurde mit 50 ml einer Lösung von 0,76 mg porcinem Trypsin (Sigma T-0134) pro ml in 20 mM Tris/HCI-Puffer (pH 8,3), der 200 mM Na-Desoxycholat enthielt, 1 Stunde bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren inkubiert. Danach wurde das Ca-Phosphat durch Zentrifugation abgetrennt. Der Überstand enthielt in erster Linie Thrombin, neben einigen wenigen anderen Fragmenten von Prothrombin.
  • Zur Reinigung des Überstandes wurde eine Säule mit 8 cm2 Querschnittsfläche mit FractogelR TSK-AF Blue (Merck) in einer Höhe von 12 mm (Geivoiumen s 9,6 ml) in 20 mM Tris/HCI-Puffer (pH 8,3) gepackt und mit demselben Puffer gewaschen. Dieser und alle nachfolgenden Schritte erfolgten bei 4°C.
  • Der Thrombin enthaltende Überstand (ca. 50 ml) wurde zurAdsorption mit einer Flußrate von 2 ml/min über das Gel gepumpt. Danach wurden mit 20 ml 0,5 M NaCI-Lösung, 40 ml 1,0 M NaCI-Lösung und 20 ml 20 mM Tris/HCI-Puffer (pH 7,4) bei einer Flußrate von 6 ml/min unspezifisch gebundene Prothrombinfragmente eluiert. Bei umgekehrter Flußrichtung mit 1 ml/min wurden nun Prothrombin-Fragmente mit 20 mM Tris/HCI-Puffer, der 1 M KSCN enthielt, eluiert. Das Eluat wurde über eine Durchflußzelle bei 280 nm photometrisch gemessen, insgesamt wurden 15 ml gesammelt.
  • Der Proteingehalt des Eluates betrug nach Bradford 188 mg/ml. Fig. 2 zeigt die Fragmentzusammensetzung (densitometrischer Immun-Western-Blot-Scan) mit dominantem 33 kD-Fragment (aktives Thrombin). Auf Thrombin entfallen ca. 30 %, bezogen auf den Proteingehalt. Über Bestimmung der Thrombinzeit konnte für das Thrombin eine spezifische Aktivität von ca. 2200 IE/mg Protein ermittelt werden. Durch tryptische Festphasenaktivierung konnten somit aus 1 IE Prothrombin ca. 100 IE Thrombin gewonnen werden.
  • Die erhaltene Thrombin-hältige Lösung kann auf bekannte Weise weiter gereinigt, aufkonzentriert und zu einer pharmazeutischen Präparation weiterverarbeitet werden.
    • Beispiel 5: Spaltung von gelöstem Prothrombin
  • Zwei Proben zu je 1 ml Prothrombin enthaltender Fermentationsüberstand wurden mit je 1 ml eines 40 mM Tris/HCI-Puffers, pH 8,3, der 0,1 M Na-Desoxycholat bzw. 0,1 M Na-Dodecylsulfat enthielt, versetzt, so daß die Detergenskonzentration in der Lösung 0,05 M betrug. Als Vergleich wurde eine dritte Probe zu 1 ml Prothrombinhältigem Fermentationsüberstand mit 40 mM Tris/HCI-Puffer ohne Detergens versetzt. Nach Zusatz von jeweils 15 ml einer Lösung von 1 mg Trypsin/ml in 20 mM Tris/HCI-Puffer, pH 8,3, der 0,9 % NaCI enthielt, wurde unter Schütteln 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
  • Nach 1, 2, 3 und 4 Stunden wurde je ein Aliquot der Proben von 50 wl mit Laemmli-Puffer verdünnt (1 : 1), aufgekocht und elektrophoretisch analysiert. Der Immun-Western-Blot eines 12 % SDS-Polyacrylamidgels (1. Antikörper: Anti-human-Faktorll-Kaninchen-Serum; 2. Antikörper: Ziege-anti-Kaninchen-IgG-Peroxidase-Konjugat; Entwicklung mittels 4-Chlor-1-naphthol) wurde densitometrisch im Auflicht zur Quantifizierung der Fragmente untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 eingetragen.
    Figure imgb0003
  • Obwohl das erfindungsgemäße Verfahren im einzelnen anhand der Gewinnung von Thrombin aus Prothrombin beschrieben worden ist, ist es für den Fachmann verständlich, daß ähnliche Spaltungen anderer Proenzyme als Prothrombin in analoger Weise durchgeführt werden können; beispielsweise können auf diese Art Plasmin aus Plasminogen bzw. aktivierte Blutgerinnungsfaktoren aus ihren Proenzymen gewonnen werden.

Claims (5)

1. Verfahren zur kontrollierten, eingeschränkten proteolytischen Spaltung von Proteinen, insbesondere Proenzymen, zur Gewinnung von Enzymen bzw. Proteinfragmenten, durch Behandlung mit Proteasen, dadurch gekennzeichnet, daß die Behandlung in Gegenwart eines Detergens oder in Gegenwart einer chaotropen Substanz, ausgenommen gerinnungsaktive Salze, durchgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Proenzym eingesetzt wird, welches an einem festen Trägermaterial, insbesondere einem schwerlöslichen Salz oder Chelat eines zweiwertigen Metalls, vorzugsweise eines Erdalkalimetalls, immobilisiert ist.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Protease Trypsin, Chymotrypsin, Kallikrein, Dispase oder die Endoproteinasen Glu-C, Lys-C oder Asp-N eingesetzt wird.
4. Anwendung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 3 zur Gewinnung von Thrombin aus Prothrombin.
5. Verfahren zur Herstellung einer Thrombin-hältiger. pharmazeutischen Präparation, gekennzeichnet durch die Kombination der Maßnahmen, daß
- eine Prothrombin-hältige Lösung mit einem festen Träger, insbesondere einem schwerlöslichen Salz oder Chelat eines zweiwertigen Metalls, vorzugsweise eines Erdalkalimetalls, in Kontakt gebracht wird, um Prothrombin am Träger zu immobilisieren,
- das immobilisierte Prothrombin mit einer Protease, insbesondere Trypsin, in Gegenwart eines Detergens, vorzugsweise Desoxycholat, behandelt wird, wobei eine Thrombin-hältige Lösung erhalten wird, welche abgetrennt, gereinigt und
- zu einer pharmazeutischen Präparation verarbeitet wird.
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