EA037815B1 - ПОЛУЧЕНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ФАКТОРА Xa - Google Patents
ПОЛУЧЕНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ФАКТОРА Xa Download PDFInfo
- Publication number
- EA037815B1 EA037815B1 EA201990052A EA201990052A EA037815B1 EA 037815 B1 EA037815 B1 EA 037815B1 EA 201990052 A EA201990052 A EA 201990052A EA 201990052 A EA201990052 A EA 201990052A EA 037815 B1 EA037815 B1 EA 037815B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- seq
- acid sequence
- amino acid
- heavy chain
- chain consisting
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 3
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 title description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 89
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 17
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 14
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims abstract description 14
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 12
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 12
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 claims abstract description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 103
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 98
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 97
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 claims description 38
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 38
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 35
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 33
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 30
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 26
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 claims description 26
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims description 26
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 24
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 24
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 claims description 23
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 22
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 claims description 21
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 17
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 claims description 16
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 13
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 claims description 13
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 claims description 13
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 13
- 229940123583 Factor Xa inhibitor Drugs 0.000 claims description 12
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 12
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 claims description 11
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 claims description 11
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 claims description 11
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 claims description 11
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 10
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 10
- KWTQSFXGGICVPE-WCCKRBBISA-N Arginine hydrochloride Chemical compound Cl.OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N KWTQSFXGGICVPE-WCCKRBBISA-N 0.000 claims description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 9
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 8
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 claims description 8
- GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 3-octoxypropane-1,2-diol Chemical compound CCCCCCCCOCC(O)CO GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 7
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000013017 sartobind Substances 0.000 claims description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 6
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 claims description 5
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 5
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims description 5
- 239000003014 ion exchange membrane Substances 0.000 claims description 4
- OZBJWQQAAQSQPL-WCCKRBBISA-N acetic acid;(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid Chemical compound CC(O)=O.OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N OZBJWQQAAQSQPL-WCCKRBBISA-N 0.000 claims description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N ether Substances CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- -1 p- (1,1,3,3-tetramethylbutyl) phenyl Chemical group 0.000 claims description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 abstract description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 11
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 abstract description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 61
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 38
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 36
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 27
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 21
- 239000000729 antidote Substances 0.000 description 19
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 19
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 16
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 14
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 14
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 13
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 13
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 11
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 11
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000013011 aqueous formulation Substances 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 10
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 10
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 10
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 9
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 9
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 8
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 8
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 8
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 8
- 108010018682 PRT064445 Proteins 0.000 description 7
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 7
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 229950011103 betrixaban Drugs 0.000 description 6
- XHOLNRLADUSQLD-UHFFFAOYSA-N betrixaban Chemical group C=1C=C(Cl)C=NC=1NC(=O)C1=CC(OC)=CC=C1NC(=O)C1=CC=C(C(=N)N(C)C)C=C1 XHOLNRLADUSQLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 101001045455 Proteus vulgaris Antitoxin HigA Proteins 0.000 description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 239000003055 low molecular weight heparin Substances 0.000 description 5
- 229940127215 low-molecular weight heparin Drugs 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 4
- 229960003589 arginine hydrochloride Drugs 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 4
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 239000012931 lyophilized formulation Substances 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 4
- STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N tributyl phosphate Chemical compound CCCCOP(=O)(OCCCC)OCCCC STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 101001018085 Lysobacter enzymogenes Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 3
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 3
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 3
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 3
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 3
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 3
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229960000610 enoxaparin Drugs 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- KANJSNBRCNMZMV-ABRZTLGGSA-N fondaparinux Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](NS(O)(=O)=O)[C@@H](OC)O[C@H](COS(O)(=O)=O)[C@H]1O[C@H]1[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O[C@@H]4[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O4)NS(O)(=O)=O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O2)NS(O)(=O)=O)[C@H](C(O)=O)O1 KANJSNBRCNMZMV-ABRZTLGGSA-N 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000012561 harvest cell culture fluid Substances 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 3
- 229960001148 rivaroxaban Drugs 0.000 description 3
- KGFYHTZWPPHNLQ-AWEZNQCLSA-N rivaroxaban Chemical compound S1C(Cl)=CC=C1C(=O)NC[C@@H]1OC(=O)N(C=2C=CC(=CC=2)N2C(COCC2)=O)C1 KGFYHTZWPPHNLQ-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- LJCBAPRMNYSDOP-LVCYMWGESA-N (2s)-3-(7-carbamimidoylnaphthalen-2-yl)-2-[4-[(3s)-1-ethanimidoylpyrrolidin-3-yl]oxyphenyl]propanoic acid;hydron;chloride;pentahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.Cl.C1N(C(=N)C)CC[C@@H]1OC1=CC=C([C@H](CC=2C=C3C=C(C=CC3=CC=2)C(N)=N)C(O)=O)C=C1 LJCBAPRMNYSDOP-LVCYMWGESA-N 0.000 description 2
- PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 16-Epiaffinine Natural products C1C(C2=CC=CC=C2N2)=C2C(=O)CC2C(=CC)CN(C)C1C2CO PXFBZOLANLWPMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NPBKHEMDWREFJJ-UHFFFAOYSA-N 2-[(7-carbamimidoylnaphthalen-2-yl)methyl-[4-(1-ethanimidoylpiperidin-4-yl)oxyphenyl]sulfamoyl]acetic acid Chemical compound C1CN(C(=N)C)CCC1OC1=CC=C(N(CC=2C=C3C=C(C=CC3=CC=2)C(N)=N)S(=O)(=O)CC(O)=O)C=C1 NPBKHEMDWREFJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QNZCBYKSOIHPEH-UHFFFAOYSA-N Apixaban Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1N1C(C(=O)N(CC2)C=3C=CC(=CC=3)N3C(CCCC3)=O)=C2C(C(N)=O)=N1 QNZCBYKSOIHPEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HGVDHZBSSITLCT-JLJPHGGASA-N Edoxaban Chemical compound N([C@H]1CC[C@@H](C[C@H]1NC(=O)C=1SC=2CN(C)CCC=2N=1)C(=O)N(C)C)C(=O)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C=N1 HGVDHZBSSITLCT-JLJPHGGASA-N 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 2
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 2
- 229960002054 acenocoumarol Drugs 0.000 description 2
- VABCILAOYCMVPS-UHFFFAOYSA-N acenocoumarol Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 VABCILAOYCMVPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 2
- 229940127090 anticoagulant agent Drugs 0.000 description 2
- 229960003886 apixaban Drugs 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 108010055460 bivalirudin Proteins 0.000 description 2
- OIRCOABEOLEUMC-GEJPAHFPSA-N bivalirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 OIRCOABEOLEUMC-GEJPAHFPSA-N 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 2
- IJNIQYINMSGIPS-UHFFFAOYSA-N darexaban Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(=O)NC1=CC=CC(O)=C1NC(=O)C1=CC=C(N2CCN(C)CCC2)C=C1 IJNIQYINMSGIPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 2
- 238000011118 depth filtration Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 229960000622 edoxaban Drugs 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- QQBKAVAGLMGMHI-WIYYLYMNSA-N eribaxaban Chemical compound N1([C@H](C[C@H](C1)OC)C(=O)NC=1C(=CC(=CC=1)N1C(C=CC=C1)=O)F)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C=C1 QQBKAVAGLMGMHI-WIYYLYMNSA-N 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 229960001318 fondaparinux Drugs 0.000 description 2
- 229940087051 fragmin Drugs 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- FIBJDTSHOUXTKV-BRHMIFOHSA-N lepirudin Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](Cc1ccccc1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]cn1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@@H]2NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC2=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](Cc2ccc(O)cc2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O FIBJDTSHOUXTKV-BRHMIFOHSA-N 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000011140 membrane chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- VYNKVNDKAOGAAQ-RUZDIDTESA-N n-[(1r)-2-[4-(1-methylpiperidin-4-yl)piperazin-1-yl]-2-oxo-1-phenylethyl]-1h-indole-6-carboxamide Chemical compound C1CN(C)CCC1N1CCN(C(=O)[C@H](NC(=O)C=2C=C3NC=CC3=CC=2)C=2C=CC=CC=2)CC1 VYNKVNDKAOGAAQ-RUZDIDTESA-N 0.000 description 2
- MVPQUSQUURLQKF-MCPDASDXSA-E nonasodium;(2s,3s,4s,5r,6r)-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-6-[(2r,3s,4s,5r,6r)-2-carboxylato-4,5-dimethoxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6s)-6-methoxy-4,5-disulfonatooxy-2-(sulfonatooxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-disulfonatooxy-2-(sulfonatooxymethyl)oxan-3-yl]oxy-4,5-di Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]S(=O)(=O)O[C@@H]1[C@@H](OS([O-])(=O)=O)[C@@H](OC)O[C@H](COS([O-])(=O)=O)[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](OS([O-])(=O)=O)[C@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](O[C@@H]4[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COS([O-])(=O)=O)O4)OC)[C@H](O3)C([O-])=O)OC)[C@@H](COS([O-])(=O)=O)O2)OS([O-])(=O)=O)[C@H](C([O-])=O)O1 MVPQUSQUURLQKF-MCPDASDXSA-E 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- PFGVNLZDWRZPJW-OPAMFIHVSA-N otamixaban Chemical compound C([C@@H](C(=O)OC)[C@@H](C)NC(=O)C=1C=CC(=CC=1)C=1C=C[N+]([O-])=CC=1)C1=CC=CC(C(N)=N)=C1 PFGVNLZDWRZPJW-OPAMFIHVSA-N 0.000 description 2
- 229950009478 otamixaban Drugs 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000011020 pilot scale process Methods 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 238000011045 prefiltration Methods 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 2
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 2
- 108010014806 prothrombinase complex Proteins 0.000 description 2
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 2
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 2
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 229940019333 vitamin k antagonists Drugs 0.000 description 2
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- GEHAEMCVKDPMKO-HXUWFJFHSA-N 1-[1-[(2s)-3-(6-chloronaphthalen-2-yl)sulfonyl-2-hydroxypropanoyl]piperidin-4-yl]-1,3-diazinan-2-one Chemical compound O=C([C@@H](CS(=O)(=O)C=1C=C2C=CC(Cl)=CC2=CC=1)O)N(CC1)CCC1N1CCCNC1=O GEHAEMCVKDPMKO-HXUWFJFHSA-N 0.000 description 1
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KGIGUEBEKRSTEW-UHFFFAOYSA-N 2-vinylpyridine Chemical compound C=CC1=CC=CC=N1 KGIGUEBEKRSTEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 244000045232 Canavalia ensiformis Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000034656 Contusions Diseases 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- JYGLAHSAISAEAL-UHFFFAOYSA-N Diphenadione Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C1C(=O)C(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 JYGLAHSAISAEAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940123688 Direct Factor Xa inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 1
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 description 1
- 108010071241 Factor XIIa Proteins 0.000 description 1
- 108010080805 Factor XIa Proteins 0.000 description 1
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010055847 Haemorrhage urinary tract Diseases 0.000 description 1
- 108010007267 Hirudins Proteins 0.000 description 1
- 102000007625 Hirudins Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 101150011817 KTI3 gene Proteins 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000283986 Lepus Species 0.000 description 1
- 108010053229 Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 241000282342 Martes americana Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 108010064983 Ovomucin Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 235000010617 Phaseolus lunatus Nutrition 0.000 description 1
- 108090000113 Plasma Kallikrein Proteins 0.000 description 1
- 102000003827 Plasma Kallikrein Human genes 0.000 description 1
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 206010038063 Rectal haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 1
- 102400000827 Saposin-D Human genes 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940122388 Thrombin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100030951 Tissue factor pathway inhibitor Human genes 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229940003354 angiomax Drugs 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003011 anion exchange membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002429 anti-coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 229940075522 antidotes Drugs 0.000 description 1
- 229960004676 antithrombotic agent Drugs 0.000 description 1
- KXNPVXPOPUZYGB-XYVMCAHJSA-N argatroban Chemical compound OC(=O)[C@H]1C[C@H](C)CCN1C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NS(=O)(=O)C1=CC=CC2=C1NC[C@H](C)C2 KXNPVXPOPUZYGB-XYVMCAHJSA-N 0.000 description 1
- 229960003856 argatroban Drugs 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 229940104697 arixtra Drugs 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 238000005842 biochemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960001500 bivalirudin Drugs 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000012512 bulk drug substance Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N carboxyglutamic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229960001307 clorindione Drugs 0.000 description 1
- NJDUWAXIURWWLN-UHFFFAOYSA-N clorindione Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C1C(=O)C2=CC=CC=C2C1=O NJDUWAXIURWWLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007820 coagulation assay Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000008139 complexing agent Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 229940072645 coumadin Drugs 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 229960004969 dalteparin Drugs 0.000 description 1
- 229960003828 danaparoid Drugs 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229960001912 dicoumarol Drugs 0.000 description 1
- DOBMPNYZJYQDGZ-UHFFFAOYSA-N dicoumarol Chemical compound C1=CC=CC2=C1OC(=O)C(CC=1C(OC3=CC=CC=C3C=1O)=O)=C2O DOBMPNYZJYQDGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 229940019332 direct factor xa inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 208000001780 epistaxis Diseases 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- JCLHQFUTFHUXNN-UHFFFAOYSA-N ethyl biscoumacetate Chemical compound C1=CC=C2OC(=O)C(C(C=3C(OC4=CC=CC=C4C=3O)=O)C(=O)OCC)=C(O)C2=C1 JCLHQFUTFHUXNN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003090 exacerbative effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000004 hemodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 229940006607 hirudin Drugs 0.000 description 1
- WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N hirudin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(OS(O)(=O)=O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]2CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N2)=O)CSSC1)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C(C)C)C(C)C)[C@@H](C)O)CSSC1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WQPDUTSPKFMPDP-OUMQNGNKSA-N 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 description 1
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 108010002230 lepirudin Proteins 0.000 description 1
- 229960004408 lepirudin Drugs 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 108010013555 lipoprotein-associated coagulation inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 229940118179 lovenox Drugs 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- PGOYJYHMBCZDLN-UHFFFAOYSA-N n-(5-chloropyridin-2-yl)-2-[[4-[(dimethylhydrazinylidene)methyl]benzoyl]amino]-5-methoxybenzamide Chemical compound C=1C=C(Cl)C=NC=1NC(=O)C1=CC(OC)=CC=C1NC(=O)C1=CC=C(C=NN(C)C)C=C1 PGOYJYHMBCZDLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000014508 negative regulation of coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036963 noncompetitive effect Effects 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 229920002114 octoxynol-9 Polymers 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000280 phenindione Drugs 0.000 description 1
- NFBAXHOPROOJAW-UHFFFAOYSA-N phenindione Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C1C1=CC=CC=C1 NFBAXHOPROOJAW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 235000019422 polyvinyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 1
- 230000006916 protein interaction Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 229940030915 refludan Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000003421 short acting drug Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical group O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000011285 therapeutic regimen Methods 0.000 description 1
- 239000003868 thrombin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229960005062 tinzaparin Drugs 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001195 ultra high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004865 vascular response Effects 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6432—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
- A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
- A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
- A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
- A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/18—Ion-exchange chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/20—Partition-, reverse-phase or hydrophobic interaction chromatography
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Detergent Compositions (AREA)
Abstract
Изобретение предлагает способы крупномасштабного производства производного белка fXa, которые приводят к высокому выходу высокочистого белкового продукта. Способ может включать добавление детергента к образцу, который содержит полинуклеотидную конструкцию, кодирующую белок, и очистку белка с помощью хроматографа для аффинной хроматографии на основе ингибитора трипсина сои (STI), хроматографа с ионным обменом и смешанным режимом и хроматографа с гидрофобным взаимодействием.
Description
Перекрестная ссылка на родственные заявки
В данной заявке испрашивается приоритет по предварительной заявке на патент США № 62351841, поданной 17 июня 2016 г., полное содержание которой включено в данном документе посредством ссылки.
Уровень техники
Разработано модифицированное производное белка фактора Ха (fXa), которое применимо в качестве антидота против антикоагулянтов, нацеленных на fXa. Производное было разработано в качестве универсального нейтрализующего средства для пациентов с состоянием антикоагуляции при введении перорально или посредством инъекции ингибитора фактора Ха, которые нуждаются в нейтрализации состояния антикоагуляции.
Сущность изобретения
В настоящем раскрытии представлены способы крупномасштабного производства полипептидаантидота fXa, которые приводят к высокому выходу высокочистых белковых продуктов. В одном варианте осуществления предложен способ получения полипептидного продукта, экспрессированного из полинуклеотидной конструкции, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 7 или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, кодируемой SEQ ID NO: 7. Способ может включать добавление детергента к образцу, который содержит полинуклеотидную конструкцию, и очистку кодированного белка-антидота с помощью хроматографа для аффинной хроматографии на основе ингибитора трипсина сои (STI), хроматографа с ионным обменом и смешанным режимом и/или хроматографа с гидрофобным взаимодействием.
В одном варианте осуществления предложен способ получения полипептидного продукта, экспрессируемого из полинуклеотидной конструкции, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 7 или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, кодируемой SEQ ID NO: 7, включающий добавление детергента к образцу, который содержит полинуклеотидную конструкцию и полипептидный продукт, экспрессированный из полинуклеотидной конструкции; загрузку образца в хроматограф для аффинной хроматографии на основе ингибитора трипсина сои (STI) и элюирование полипептида первым элюирующим буфером для получения первого элюированного образца, причем загруженный образец не содержит органического растворителя; загрузку первого элюированного образца в хроматограф с ионным обменом и смешанным режимом и элюирование полипептида вторым элюирующим буфером, содержащим по меньшей мере 1М неорганической соли, для получения второго элюированного образца; и загрузку второго элюированного образца в хроматограф с гидрофобным взаимодействием и элюирование полипептида третьим элюирующим буфером, содержащим по меньшей мере 2 мМ хлорида натрия, с получением очищенного образца, содержащего полипептидный продукт.
В некоторых вариантах осуществления детергент содержит Тритон Х-100 (полиэтиленгликоль-п(1,1,3,3-тетраметилбутил)фениловый эфир). В некоторых вариантах осуществления первый элюирующий буфер содержит от 0,5 до 2М аргинина. В некоторых вариантах осуществления первый элюирующий буфер обладает рН от около 5 до 5,4. В некоторых вариантах осуществления хроматограф с ионным обменом и смешанным режимом включает в себя хроматограф с керамическим гидроксиапатитом типа I.
В некоторых вариантах осуществления второй элюирующий буфер содержит по меньшей мере 2М неорганической соли. В некоторых вариантах осуществления неорганическая соль представляет собой хлорид натрия. В некоторых вариантах осуществления хроматограф с гидрофобным взаимодействием включает в себя хроматограф с октилсефарозой.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает этап очистки с помощью анионообменного хроматографа. В некоторых вариантах осуществления анионообменный хроматограф содержит ионообменную мембрану Sartobind™.
В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает фильтрование одного или более образцов через фильтр из нанофлиса. В некоторых вариантах осуществления фильтрование с помощью фильтра из нанофлиса проводится до загрузки образца в хроматограф для аффинной хроматографии на основе STI.
В некоторых вариантах осуществления очищенный образец содержит менее чем около 1% загрязняющих белков, не экспрессированных с помощью полинуклеотидной конструкцией. В некоторых вариантах осуществления полипептидный продукт экспрессируется в клетке, которая содержит полинуклеотидную конструкцию. В некоторых вариантах осуществления клетку выращивают в среде в условиях, пригодных для получения по меньшей мере 100 мг полипептидного продукта на 1 л среды. В некоторых вариантах осуществления клетку выращивают в среде в условиях, пригодных для получения по меньшей мере 200 мг полипептидного продукта на 1 л среды. В некоторых вариантах осуществления очищенный образец содержит более чем около 50% полипептидного продукта, полученного в среде. В некоторых вариантах осуществления очищенный образец содержит более чем около 100 мг полипептидного продукта из каждого литра полученной среды.
- 1 037815
В некоторых вариантах осуществления полипептидный продукт представляет собой двухцепочечный полипептид, содержащий легкую цепь и тяжелую цепь. В некоторых вариантах осуществления от около 20 до 50% полипептидного продукта в очищенном образце содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления около 5-95% тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, содержит два Освязанных гликозилирования и около 5-95% тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, содержит одно О-связанное гликозилирование. В некоторых вариантах осуществления около 40-80% полипептидного продукта в очищенном образце содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере около 90% тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, содержит одно О-связанное гликозилирование. В некоторых вариантах осуществления около 212% полипептидного продукта в очищенном образце содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления около 0,1-1,5% полипептидного продукта в очищенном образце содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах осуществления около 2-8% полипептидного продукта в очищенном образце содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления около 35-60% полипептидного продукта в очищенном образце содержит легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.
В одном варианте осуществления также предложен полипептид, полученный с помощью способа по любому из вариантов осуществления.
В одном варианте осуществления предложена фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и полипептидную часть двухцепочечных полипептидов, в которой около 35-60% двухцепочечных полипептидов содержат легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4; около 20-60% двухцепочечных полипептидов содержат тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5; около 40-60% двухцепочечных полипептидов содержат тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8; и менее чем 10% двухцепочечных полипептидов содержат тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9.
В некоторых вариантах осуществления менее чем 5% двухцепочечных полипептидов содержат тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления менее чем 3% двухцепочечных полипептидов содержат тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления около 0,11,5% двухцепочечных полипептидов содержат тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах осуществления около 2-8% двухцепочечных полипептидов содержат тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления около 30-70% тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, содержит два O-связанных гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления около 30%-70% тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, содержит одно O-связанное гликозилирование. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере около 90% тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, содержит одно O-связанное гликозилирование.
В некоторых вариантах осуществления препарат является лиофилизированным. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит L-аргинина HCl или L-аргинина ацетат. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит сахарозу. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно содержит маннит.
В одном варианте осуществления также предложен способ нейтрализации или ингибирования состояния антикоагуляции у пациента, подвергающегося антикоагуляционному лечению ингибитором фактора Ха, включающий введение пациенту фармацевтической композиции по любому из вариантов осуществления настоящего изобретения.
Подробное описание изобретения
Определения.
Следующее описание предлагает примерные варианты осуществления настоящей технологии. Однако следует признать, что такое описание не предназначено для ограничения объема настоящего раскрытия, а вместо этого предлагает описание примерных вариантов осуществления.
Все числовые обозначения, например рН, температура, время, концентрация и молекулярная масса, включая диапазоны, являются приблизительными значениями, которые варьируются (+) или (-) с шагом 0,1 или 10%. Следует понимать, хотя это не всегда указывается в явном виде, что всем числовым обозначениям предшествует термин около. Также следует понимать, хотя это не всегда указывается в явном виде, что реагенты, описанные в данном документе, являются примерными и что их эквиваленты известны в данной области техники.
При использовании в настоящем описании и прилагаемой формуле изобретения формы единствен- 2 037815 ного числа включают ссылки на множество, если в контексте явным образом не указано иное. Например, термин фармацевтически приемлемый носитель включает в себя множество фармацевтически приемлемых носителей, включая их смеси.
Используемый в данном документе термин содержащий предназначен для обозначения того, что композиции и способы включают перечисленные элементы, но не исключают другие. Термин по существу состоящий из, когда он используется для определения композиций и способов, должен означать исключение других элементов, имеющих какое-либо существенное значение для комбинации для предполагаемого использования. Таким образом, композиция, по существу, состоящая из элементов, как определено в данном документе, не исключает следовые загрязнения, возникающие из способа выделения и очистки, и фармацевтически приемлемые носители, такие как забуференный фосфатом физиологический раствор, консерванты и т.п. Термин состоящий из означает исключение более чем следовых элементов других ингредиентов и существенные этапы способа для введения композиций по настоящему раскрытию. Варианты осуществления, определенные каждым из данных переходных терминов, входят в объем настоящего раскрытия.
Термины белок и полипептид используются взаимозаменяемо и в их самом широком смысле для обозначения соединения из двух или более субъединичных аминокислот, аналогов аминокислот или пептидомиметиков. Субъединицы могут быть связаны пептидными связями. В другом варианте осуществления субъединица может быть связана с помощью других связей, например сложноэфирной связью, связью, включающей простой эфир и т.д. Белок или пептид должен содержать по меньшей мере две аминокислоты и не ограничивается максимальным количеством аминокислот, которые может включать последовательность белка или пептида. Используемый в данном документе термин аминокислота относится к природным и/или неприродным или синтетическим аминокислотам, включая глицин и оптические изомеры как D, так и L, аналоги аминокислот и пептидомиметики. Однобуквенные и трехбуквенные сокращения встречающихся в природе аминокислот перечислены ниже.
Фактор Ха или fXa или белок fXa представляет собой сериновую протеазу в каскаде коагуляции крови, которая вырабатывается из неактивного фактора X (fX, SEQ ID NO. 1, табл. 1). Нуклеотидная последовательность, кодирующая человеческий фактор X (fX), может быть найдена в GenBank под номером доступа NM_000504. После каталитического отщепления первых 52 остатков тяжелой цепи, fX активируется в fXa. fXa содержит легкую цепь и тяжелую цепь. Первые 45 аминокислотных остатков (остатки 1 45 SEQ ID NO: 1) легкой цепи называются Gla-доменом, поскольку он содержит 11 посттрансляционно-модифицированных остатков у карбоксиглутаминовой кислоты (Gla). Он также содержит короткую (6 аминокислотных остатков) последовательность ароматических стэков (остатки 40 45 SEQ ID NO: 1). При расщеплении химотрипсином селективно удаляются остатки 1 44, что приводит к fXa с отсутствующим Gla-доменом. Каталитический домен сериновой протеазы fXa находится в Сконцевой тяжелой цепи. Тяжелая цепь fXa высоко гомологична таковым у других сериновых протеаз, таких как тромбин, трипсин и активированный белок С.
Термин нативный fXa или fXa дикого типа относится к fXa, естественно присутствующему в плазме или выделенному в его исходной немодифицированной форме, биологическая активность которой приводит к активации протромбина, следовательно, способствует образованию сгустка крови. Термин включает в себя встречающиеся в природе полипептиды, выделенные из образцов тканей, а также рекомбинантно получаемый fXa. Термин активный fXa относится к fXa, обладающему прокоагулянтной активностью активации протромбина. Термин активный fXa может относиться к нативному fXa или модифицированному fXa, который сохраняет прокоагулянтную активность.
Используемый в данном документе термин антидот fXa, антидот или производное fXa относится к модифицированному белку fXa, который не конкурирует с fXa при сборке в комплекс протромбиназы и обладает пониженной или отсутствующей прокоагулянтной или каталитической активностями и все же связывает и/или существенно нейтрализует антикоагулянты, такие как ингибиторы fXa. Термин прокоагулянтная активность белка fXa или производного fXa в некоторых аспектах относится к ферментативной активности, которой обладает активный полипептид fXa дикого типа. Примеры производных fXa представлены в патенте США № 8153590 и публикациях PCT WO 2009/042962 и WO 2010/056765 и дополнительно представлены в данном документе, например SEQ ID NO: 2 и 3 и их биологические эквиваленты.
Термин ферментативная активность полипептида fXa или его производных относится к способности полипептида катализировать биохимическую реакцию с субстратом посредством прямого взаимодействия с субстратом.
SEQ ID NO: 2 содержит 3 мутации по сравнению с fXa дикого типа. Первая мутация представляет собой делецию 6 39 аминокислот в Gla-домене fX. Вторая мутация представляет собой замену 143 194 аминокислот в последовательности активации пептида с RKR. В результате образуется линкер RKRRKR (SEQ ID NO: 6), соединяющий легкую цепь (SEQ ID NO: 4) и тяжелую цепь (SEQ ID NO: 5). При секреции данный линкер расщепляется, что приводит к образованию двухцепочечного полипептида SEQ ID NO: 3 (r-антидот). Третья мутация представляет собой мутацию остатка активного сайта S379 в остаток Ala. Данная аминокислотная замена соответствует аминокислотам 296 и 290 SEQ ID NO: 1 и 3 соответст
- 3 037815 венно.
Примером антидота является r-антидот, который относится к продукту процессинга процессированного двухцепочечного полипептида SEQ ID NO: 2, после отщепления линкера, что описывается SEQ ID NO: 3. r-Антидот раскрыт, например, в патенте США 8153590, содержание которого включено в настоящее описание посредством ссылки. r-Антидот включает в себя легкую цепь (SEQ ID NO: 4) и тяжелую цепь (SEQ ID NO: 5), связанные одной дисульфидной связью между цистеином 98 (Cys98) легкой цепи и цистеином 108 (Cys108) тяжелой цепи. Подобно fXa дикого типа в определенных промышленных партиях r-антидот претерпевает посттрансляционные модификации, приводящие к гликозилированию по определенным аминокислотным остаткам, например Ser56, Ser72, Ser76 и Thr82 легкой цепи и Thr249 тяжелой цепи, и модификации остатка легкой цепи Asp29 в (3R)-3-гидрокси Asp. Кроме того, помимо дисульфидной связи между цепями могут образовываться дисульфидные связи внутри цепи между цистеинами 16 и 27, 21 и 36, 38 и 47, 55 и 66, 62 и 75, а также 77 и 90 легкой цепи и между цистеинами 7 и 12, 27 и 43, 156 и 170 и 181 и 209 тяжелой цепи.
Таблица 1 Полипептидная последовательность неактивного фактора X человека (SEQ ID NO: 1)
ANSFLEEMKK GHLERECMEE TCSYEEAREV FEDSDKTNEF WNKYKDGDQC ETSPCQNQGK
CKDGLGEYTC TCLEGFEGKN CELFTRKLCS LDNGDCDQFC HEEQNSWCS CARGYTLADN
121 GKACIPTGPY PCGKQTLERR KRSVAQATSS SGEAPDSITW KPYDAADLDP TENPFDLLDF
181 NQTQPERGDN NLTRIVGGQE CKDGECPWQA LLINEENEGF CGGTILSEFY ILTAAHCLYQ
241 AKRFKVRVGD RNTEQEEGGE AVHEVEWIK HNRFTKETYD FDIAVLRLKT PITFRMNVAP
301 ACLPERDWAE STLMTQKTGI VSGFGRTHEK GRQSTRLKML EVPYVDRNSC KLSSSFIITQ
361 NMFCAGYDTK QEDACQGDSG GPHVTRFKDT YFVTGIVSWG EGCARKGKYG IYTKVTAFLK 421 WIDRSMKTRG LPKAKSHAPE VITSSPLK
Таблица 2
Полипептидная последовательность предшественника r-антидота перед удалением
RKRRKR (SEQ ID NO: 6) линкера (SEQ ID NO: 2)
Легкая цепь (SEQ ID NO: 4)
ANSEL F WNKYKDGDQC ETSPCQNQGK
CKDGLGEYTC TCLEGFEGKN CELFTRKLCS LDNGDCDQFC HEEQNSWCS CARGYTLADN
121 GKACIPTGPY PCGKQTLER
Линкер (SEQ ID NO: 6)
RKRRKR
Тяжелая цепь (SEQ ID NO:5)
181 IVGGQE CKDGECPWQA LLINEENEGF CGGTILSEFY ILTAAHCLYQ
241 AKRFKVRVGD RNTEQEEGGE AVHEVEWIK HNRFTKETYD FDIAVLRLKT PITFRMNVAP
301 ACLPERDWAE STLMTQKTGI VSGFGRTHEK GRQSTRLKML EVPYVDRNSC KLSSSFIITQ
361 NMFCAGYDTK QEDACQGDAG GPHVTRFKDT YFVTGIVSWG EGCARKGKYG IYTKVTAFLK
421 WIDRSMKTRG LPKAKSHAPE VITSSPLK
Таблица 3
Полипептидная последовательность тройного мутанта фактора Ха человека после удаления ______________RKRRKR (SEQ ID NO: 6) линкера (SEQ ID NO: 3)______________
Легкая цепь (SEQ ID NO: 4)
ANSFL F WNKYKDGDQC ETSPCQNQGK
CKDGLGEYTC TCLEGFEGKN CELFTRKLCS LDNGDCDQFC HEEQNSWCS CARGYTLADN
121 GKACIPTGPY PCGKQTLER
Тяжелая цепь (SEQ ID NO: 5)
181 IVGGQE CKDGECPWQA LLINEENEGF CGGTILSEFY ILTAAHCLYQ
241 AKRFKVRVGD RNTEQEEGGE AVHEVEWIK HNRFTKETYD FDIAVLRLKT PITFRMNVAP
301 ACLPERDWAE STLMTQKTGI VSGFGRTHEK GRQSTRLKML EVPYVDRNSC KLSSSFIITQ
361 NMFCAGYDTK QEDACQGDAG GPHVTRFKDT YFVTGIVSWG EGCARKGKYG IYTKVTAFLK
421 WIDRSMKTRG LPKAKSHAPE VITSSPLK
- 4 037815
Таблица 4
Нуклеотидная последовательность, кодирующая предшественник r-антидота (SEQ ID NO: 7) ATGGGGCGCC CACTGCACCT CGTCCTGCTC AGTGCCTCCC TGGCTGGCCT CCTGCTGCTC GGGGAAAGTC TGTTCATCCG CAGGGAGCAG GCCAACAACA TCCTGGCGAG GGTCACGAGG GCCAATTCCT TTCTTTTCTG GAATAAATAC AAAGATGGCG ACCAGTGTGA GACCAGTCCT TGCCAGAACC AGGGCAAATG TAAAGACGGC CTCGGGGAAT ACACCTGCAC CTGTTTAGAA GGATTCGAAG GCAAAAACTG TGAATTATTC ACACGGAAGC TCTGCAGCCT GGACAACGGG GACTGTGACC AGTTCTGCCA CGAGGAACAG AACTCTGTGG TGTGCTCCTG CGCCCGCGGG TACACCCTGG CTGACAACGG CAAGGCCTGC ATTCCCACAG GGCCCTACCC CTGTGGGAAA CAGACCCTGG AACGCAGGAA GAGGAGGAAG AGGATCGTGG GAGGCCAGGA ATGCAAGGAC GGGGAGTGTC CCTGGCAGGC CCTGCTCATC AATGAGGAAA ACGAGGGTTT CTGTGGTGGA ACCATTCTGA GCGAGTTCTA CATCCTAACG GCAGCCCACT GTCTCTACCA AGCCAAGAGA TTCAAGGTGA GGGTAGGGGA CCGGAACACG GAGCAGGAGG AGGGCGGTGA GGCGGTGCAC GAGGTGGAGG TGGTCATCAA GCACAACCGG TTCACAAAGG AGACCTATGA CTTCGACATC GCCGTGCTCC GGCTCAAGAC CCCCATCACC TTCCGCATGA ACGTGGCGCC TGCCTGCCTC CCCGAGCGTG ACTGGGCCGA GTCCACGCTG ATGACGCAGA AGACGGGGAT TGTGAGCGGC TTCGGGCGCA CCCACGAGAA GGGCCGGCAG TCCACCAGGC TCAAGATGCT GGAGGTGCCC TACGTGGACC GCAACAGCTG CAAGCTGTCC AGCAGCTTCA TCATCACCCA GAACATGTTC TGTGCCGGCT ACGACACCAA GCAGGAGGAT GCCTGCCAGG GGGACGCAGG GGGCCCGCAC GTCACCCGCT TCAAGGACAC CTACTTCGTG ACAGGCATCG TCAGCTGGGG AGAGGGCTGT GCCCGTAAGG GGAAGTACGG GATCTACACC AAGGTCACCG CCTTCCTCAA GTGGATCGAC AGGTCCATGA AAACCAGGGG CTTGCCCAAG GCCAAGAGCC ATGCCCCGGA GGTCATAACG TCCTCTCCAT TAAAGTGA
Другими примерами антидотов могут быть биологические эквиваленты r-антидота (или их предшественники, представленные SEQ ID NO: 2) или альтернативно полипептиды, обладающие определенной идентичностью последовательности с SEQ ID NO: 3. В одном аспекте такие биологические эквиваленты сохраняют структурные характеристики SEQ ID NO: 3, т.е. модифицированный активный сайт и удаленный или модифицированный домен Gla. В другом аспекте такие биологические эквиваленты сохраняют функциональные особенности SEQ ID NO: 3, т.е. не конкурируют с fXa при сборке в комплекс протромбиназы и обладают пониженной или отсутствующей прокоагулянтной (например, ферментативной или каталитической) активностями.
Термин активный сайт относится к части фермента или антитела, где происходит химическая реакция. Термин модифицированный активный сайт относится к активному сайту, который был структурно модифицирован для обеспечения активного сайта с повышенной или пониженной химической активностью или специфичностью. Примеры активных сайтов включают, но не ограничиваются ими, каталитический домен фактора X человека, содержащий 235 488 аминокислотных остатков, и каталитический домен фактора Ха человека, содержащий 195 448 аминокислотных остатков. Примеры модифицированного активного сайта включают в себя, но не ограничиваются ним, каталитический домен фактора Ха человека, содержащий 195 448 аминокислотных остатков в SEQ ID NO: 1 по меньшей мере с одной аминокислотной заменой в положении Arg306, Glu310, Arg347, Lys351, Lys414 или Arg424.
Получение антидотов.
Экспериментальные примеры (примеры 1 и 2) демонстрируют разработку способов культивирования и очистки для получения антидотов fXa. Культивируемые клетки содержат полинуклеотидную конструкцию, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 7 или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% идентичности последовательности (или по меньшей мере 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичности последовательности) к аминокислотной последовательности, кодируемой SEQ ID NO: 7. Клетка обычно представляет собой клетку яичника китайского хомячка (СНО).
Один из способов очистки изображен на фиг. 1. После сбора клеток (этап 101) и осветления с использованием глубинного фильтра для удаления примесей с высокой молекулярной массой (HWM) образец концентрируют (например, около 10-кратно) (этап 102). На этапе концентрирования может без ограничения использоваться регенерированная целлюлоза. На этапе 103 может быть проведена вирусная инактивация (например, с помощью детергента/растворителя, такого как 1% Тритон Х-100, 0,3% трибутилфосфат (конечная концентрация)) для инактивации оболочечных вирусов в культуре клеток. После удаления вирусов выполняются этапы 104 (катионный обмен в смешанном режиме), 105 (анионный обмен в смешанном режиме) и 106 (ионный обмен в смешанном режиме) для удаления белков и ДНК клетки-хозяина и захвата антидота. На этапе 107 для дополнительного удаления оставшихся белков клеткихозяина может использоваться смола с гидрофобным взаимодействием. Необязательно, после указанных этапов очистки можно использовать конечную стадию фильтрования для удаления вирусов с целью удаления любых оставшихся вирусов.
В другом варианте осуществления способ очистки является таким, как проиллюстрировано на фиг.
- 5 037815 и продемонстрировано в примере 2. В некоторых вариантах осуществления способ включает добавление детергента к образцу, который содержит полинуклеотидную конструкцию (например, SEQ ID NO: 7) и полипептидный продукт, экспрессированный из полинуклеотидной конструкции (например, SEQ ID NO: 3). В некоторых вариантах осуществления детергент включает в себя Тритон Х-100. В некоторых вариантах осуществления растворитель не используется для обработки образца до того, как образец подвергается последующей аффинной очистке. В некоторых вариантах осуществления органический растворитель не используется для обработки образца до того, как образец подвергается последующей аффинной очистке. В некоторых вариантах осуществления трибутилфосфат не добавляют к образцу до того, как образец подвергается последующей аффинной очистке.
В некоторых вариантах осуществления образец затем загружают в хроматограф для аффинной хроматографии на основе ингибитора трипсина сои (STI) и элюируют элюирующим буфером, чтобы получить элюированный образец. В некоторых вариантах осуществления загруженный образец не обрабатывали органическим растворителем или он не содержит органического растворителя.
STI или ингибитор трипсина сои относится к ингибиторам трипсина, выделенным из сои, или их биологическим эквивалентам. Ингибиторы трипсина имеют размер около 20 кДа и снижают активность трипсина (протеолитического фермента), а также калликреина в плазме, фактора Ха и активность плазмина. STI коммерчески доступны от таких поставщиков, как Life Technologies (г. Гранд Айленд, штат Нью-Йорк, США). Примером STI является ингибитор трипсина KTI3 Куница из Glycine max (соя), с регистрационным номером GenBank NP_001238611.
STI может быть иммобилизован на твердой смоле-носителе для очистки определенных белков. В дополнение к ингибитору трипсина сои можно также использовать другие белки-ингибиторы трипсина, такие как белки, выделенные из сыворотки, бобов лимы, поджелудочной железы крупного рогатого скота, или овомукоид, или их модифицированные формы. Также предполагается, что определенные ингибиторы протеаз, в частности ингибиторы сериновых протеаз, могут быть использованы для получения аффинной смолы для очистки антидота. Затем антидот можно элюировать буфером, который содержит аргинин. В некоторых вариантах осуществления элюирующий буфер содержит по меньшей мере 0,2, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5 или 2М аргинина. В некоторых вариантах осуществления элюирующий буфер содержит от около 0,5 до 2М аргинина, или от около 0,7 до 1,5 М аргинина, или от 0,8 до 1,2М аргинина. В некоторых вариантах осуществления элюирующий буфер обладает рН от около 4,5 до 6, или от 4,6 до 5,6, или от 4,7 до 5,5, или от 4,8 до 5,4, или от 5 до 5,4, или от 5,1 до 5,3, или около 5,2. В одном варианте осуществления элюирующий буфер содержит 25 мМ ацетата натрия и 1,0М аргинина при рН 5,2.
В некоторых вариантах осуществления образец затем загружают в хроматограф с ионным обменом и смешанным режимом. Неограничивающие примеры хроматографа с ионным обменом и смешанным режимом включают хроматограф с керамическим гидроксиапатитом типа I. Затем образец может быть элюирован элюирующим буфером, который содержит неорганическую соль. В некоторых вариантах осуществления неорганическая соль представляет собой хлорид натрия или хлорид калия. В некоторых вариантах осуществления концентрация соли в элюирующем буфере составляет по меньшей мере 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 или 3М.
В некоторых вариантах осуществления элюирование включает использование градиента, создаваемого между уравновешивающим буфером и элюирующим буфером. В некоторых вариантах осуществления уравновешивающий буфер содержит более низкую концентрацию соли, например менее чем 0,2М, менее чем 0,1М, менее чем 50 мМ, менее чем 20 мМ, менее чем 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления градиент содержит по меньшей мере 5-кратное, или 10-кратное, или 20-кратное, или 50-кратное, или 100-кратное увеличение концентрации соли. В некоторых вариантах осуществления уравновешивающий буфер содержит 50 мМ MES (2-(N-морфолино)этансульфокислоты), 5 мМ фосфата натрия при рН 7,0. В некоторых вариантах осуществления элюирующий буфер содержит 50 мМ MES, 5 мМ фосфата натрия, 2М хлорида натрия при рН 7,0. В некоторых вариантах осуществления градиент начинается примерно с 90% уравновешивающего буфера и заканчивается примерно 90% элюирующим буфером.
В некоторых вариантах осуществления образец дополнительно загружают в хроматограф с гидрофобным взаимодействием. В некоторых вариантах осуществления хроматограф с гидрофобным взаимодействием включает в себя хроматограф с октилсефарозой. В некоторых вариантах осуществления образец элюируют элюирующим буфером, который содержит по меньшей мере 2 мМ хлорида натрия или, альтернативно, по меньшей мере 1М, 1,5М, 2,5М, 3М, 4М или 5М хлорида натрия.
В некоторых вариантах осуществления один из промежуточных образцов, описанных выше, дополнительно подвергают этапу очистки с помощью анионообменной хроматографии. В некоторых вариантах осуществления анионообменный хроматограф содержит ионообменную мембрану Sartobind™. В некоторых вариантах осуществления анионообменный хроматограф используют после аффинного хроматографа.
В некоторых вариантах осуществления один из промежуточных образцов, описанных выше, дополнительно подвергают фильтрованию с помощью фильтра с нанофлисом. В некоторых вариантах осуществления фильтрование с помощью нанофлиса применяется перед загрузкой образца в хроматограф для
- 6 037815 аффинной хроматографии на основе STI.
В некоторых вариантах осуществления очищенный образец содержит менее чем около 1% загрязняющих белков, не экспрессированных с помощью полинуклеотидной конструкции, таких как белки клетки-хозяина или STI, которые высвобождаются из аффинной смолы/колонки.
Способ очистки по любому из вышеуказанных вариантов осуществления может быть способен извлекать по меньшей мере около 50% (или по меньшей мере около 40, 45, 55, 60, 65, 70, 75, 80 или 85%) белка-антидота, экспрессированного в клеточной культуре. В некоторых вариантах осуществления клетку выращивают в среде в условиях, пригодных для получения по меньшей мере 100 мг полипептидного продукта на 1 л среды. В некоторых вариантах осуществления клетку выращивают в среде в условиях, пригодных для получения по меньшей мере 120 мг (или по меньшей мере 210, 220, 230, 240, 250, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340 или 350 мг) полипептидного продукта на 1 л среды. В некоторых вариантах осуществления очищенный образец содержит более чем около 50 мг (или по меньшей мере 55, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 или 200 мг) полипептидного продукта на каждый литр полученной среды.
Изомеры антидота в очищенном продукте.
Предполагается, что очищенный антидотный продукт, полученный с помощью способа по любому из вариантов осуществления настоящего описания, содержит легкую цепь и тяжелую цепь. Однако способы выращивания и очистки могут вносить изменения в фактический белок.
Как показано в примере 3, от около 20 до 50% полипептидного продукта в очищенном образце содержит интактную тяжелую цепь (SEQ ID NO: 5). Среди полипептидного продукта, который содержит интактную тяжелую цепь, около 5-95% тяжелой цепи содержит два О-связанных гликозилирования и около 5-95% тяжелой цепи содержит одно О-связанное гликозилирование.
В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере около 20, 25, 30, 35, 40 или 45% полипептидного продукта в очищенном образце содержит интактную тяжелую цепь. В некоторых вариантах осуществления не более чем около 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 или 80% полипептидного продукта в очищенном образце содержит интактную тяжелую цепь.
В некоторых вариантах осуществления около 40-80% полипептидного продукта в очищенном образце содержит тяжелую цепь, которая несет делецию С-концевого лизина (SEQ ID NO: 8). В некоторых вариантах осуществления SEQ ID NO: 8 составляет по меньшей мере около 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50% в очищенном образце. В некоторых вариантах осуществления SEQ ID NO: 8 составляет не более чем около 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 или 90% в очищенном образце. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере около 90% тяжелой цепи SEQ ID NO: 8 содержит одно О-связанное гликозилирование.
В некоторых вариантах осуществления около 2%-12% полипептидного продукта в очищенном образце содержит тяжелую цепь, которая несет делецию 13 С-концевых аминокислотных остатков (SEQ ID NO: 9). В некоторых вариантах осуществления SEQ ID NO: 9 составляет, по меньшей мере около 0,5%, 1%, 1,5%, 2%, 2,5%, 3% или 5% в очищенном образце. В некоторых вариантах осуществления SEQ ID NO: 9 составляет не более чем около 2, 3, 4, 5, 7, 10, 15, 17 или 20% в очищенном образце.
В некоторых вариантах осуществления около 0,1-1,5% полипептидного продукта в очищенном образце содержит тяжелую цепь, которая несет делецию 14 С-концевых аминокислотных остатков (SEQ ID NO: 10). В некоторых вариантах осуществления SEQ ID NO: 10 составляет по меньшей мере около 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25, 0,3 или 0,5% в очищенном образце. В некоторых вариантах осуществления SEQ ID NO: 10 составляет не более чем около 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,5, 2, 2,5 или 3% в очищенном образце.
В некоторых вариантах осуществления около 2-8% полипептидного продукта в очищенном образце содержит тяжелую цепь, которая несет делецию 15 С-концевых аминокислотных остатков (SEQ ID NO: 11). В некоторых вариантах осуществления SEQ ID NO: 11 составляет по меньшей мере около 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 или 5% в очищенном образце. В некоторых вариантах осуществления SEQ ID NO: 11 составляет не более чем около 5, 6, 7, 8, 9 или 10% в очищенном образце.
Пример 3 также показывает, что около 35-60% полипептидного продукта в очищенном образце содержит интактную легкую цепь (SEQ ID NO: 4), тогда как остальные цепи могут быть модифицированы или усечены. В некоторых вариантах осуществления количество интактной легкой цепи в общем количестве легкой цепи составляет по меньшей мере около 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50%. В некоторых вариантах осуществления количество интактной легкой цепи в общем количестве легкой цепи составляет не более чем около 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80 или 90%.
В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие относится к фармацевтическому препарату, содержащему фармацевтически приемлемый носитель и полипептидную часть двухцепочечных полипептидов, в которой около 35-60% двухцепочечных полипептидов содержат легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления около 20-50% двухцепочечных полипептидов содержат тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления около 40-80% двухцепочечных полипептидов содержат тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления менее чем около 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 или 3% двухцепочечных по- 7 037815 липептидов содержат тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9.
В некоторых вариантах осуществления около 0,1-1,5% двухцепочечных полипептидов содержат тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах осуществления около 2-8% двухцепочечных полипептидов содержат тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11.
В некоторых вариантах осуществления около 5-95% тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, содержит два О-связанных гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления около 5-95% тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, содержит одно O-связанное гликозилирование. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере около 90% тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, содержит одно O-связанное гликозилирование.
Составы, способы и дозировки.
Также предложены составы, полученные из очищенных антидотных белковых продуктов. В некоторых вариантах осуществления предлагается водный состав, который подходит для лиофилизации. В одном варианте осуществления состав содержит антидот, а также солюбилизирующий агент, стабилизирующий агент (или стабилизатор) и кристаллический агент. Состав может дополнительно содержать поверхностно-активное вещество и/или буфер. В некоторых аспектах присутствие каждого из указанных агентов предотвращает разрушение антидота во время лиофилизации, например, когда температура лиофилизации выше -40, -30, -20, -10, 0, 5°, 10 или 15°С и до 20 или 25°С.
Термин кристаллический компонент относится к молекуле, которая образует кристаллическую матрицу в составе, которая заключает полипептид, во время сублимационной сушки. Неограничивающие примеры кристаллических компонентов включают маннит и глицин.
В некоторых аспектах кристаллический компонент представляет собой маннит (например, кристаллический маннит). В одном аспекте концентрация кристаллического компонента в водном составе составляет по меньшей мере 1% (мас./об.). В одном аспекте концентрация кристаллического компонента в водном составе составляет по меньшей мере 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5 или 4% (мас./об.). В одном аспекте концентрация кристаллического компонента в водном составе составляет не более чем 8% или, альтернативно, не более чем 7, 6,5, 6, 5,5, 5, 4,5 или 4% (мас./об.). В одном аспекте концентрация кристаллического компонента в водном составе составляет от около 1 до около 8%, или от около 2 до около 6%, или от около 3 до около 5,5%, или от около 4,5 до около 5,5%, или от около 4,6 до около 5,4%, или от около 4,7 до около 5,3%, или от около 4,8 до около 5,2%, или от около 4,9 до около 5,1%, или около 4, 4,5 или 5% (мас./об.).
В некоторых аспектах солюбилизирующий агент включен в водный состав. Термин солюбилизирующий агент относится к солям, ионам, углеводам, комплексообразующему агенту, полимерам и другим соединениям, которые, когда присутствуют в растворе, увеличивают растворимость другого вещества (например, активного ингредиента) в растворе. Неограничивающие примеры солюбилизирующих агентов включают в себя аргинин и цитрат. В одном аспекте солюбилизирующий агент представляет собой аргинин. В одном аспекте солюбилизирующий агент представляет собой цитрат.
Присутствие солюбилизирующего агента может быть полезным для поддержания растворимости и стабильности полипептида fXa в составе. В некоторых аспектах концентрация солюбилизирующего агента (например, аргинина) составляет по меньшей мере 10 мМ или, альтернативно, по меньшей мере 20, 25, 30, 36 или 40 мМ. В некоторых аспектах концентрация солюбилизирующего агента (например, аргинина) не превышает 100, 96, 90, 80, 70, 60 или 50 мМ. В некоторых аспектах концентрация солюбилизирующего агента составляет от около 10 или 20 мМ до около 60 мМ, от около 10 или 20 мМ до около 55 мМ, от около 35 до около 55 мМ, от около 40 до около 50 мМ, от около 41 до около 49 мМ, от около 42 до около 48 мМ, от около 43 до около 47 мМ, от около 44 до около 46 мМ, или около 40, 45 или 50 мМ. Следует отметить, что используемый в данном документе термин аргинин относится к аминокислоте, а также к ее солям (например, аргинина HCl). Аргинин обладает молекулярной массой около 174,2 Да, а аргинина HCl (например, L-аргинина HCl, L-аргинина ацетат) обладает молекулярной массой около 210,7 Да.
В одном варианте осуществления солюбилизирующий агент представляет собой цитрат или его соль. Соль цитрата представляет собой цитрат натрия. В одном аспекте концентрация цитрата составляет от около 1,0 до около 200,0 мМ. В дополнительном аспекте концентрация цитрата составляет около 25 мМ. В другом аспекте концентрация цитрата составляет около 50 мМ. В дополнительном варианте осуществления концентрация цитрата составляет около 5, 10 или 20 мМ. В другом варианте осуществления концентрация цитрата составляет от около 0,05 до около 0,2М.
В некоторых аспектах в водный состав включен стабилизатор. Термин стабилизатор обозначает фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, которое защищает активный ингредиент (например, полипептиды-производные fXa) и/или состав от химической и/или физической деградации во время производства, хранения и применения. Примеры стабилизаторов могут включать сахарозу, аргинин, цитрат, маннит, трегалозу, глицин, хлорид натрия, декстран и глюкозу. В одном аспекте стабилизатором является сахароза.
В одном аспекте концентрация стабилизатора в водном составе (например, сахарозы) составляет по
- 8 037815 меньшей мере около 0,5% (мас./об.). В одном аспекте концентрация стабилизатора в водном составе (например, сахарозы) составляет по меньшей мере около 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 или 2% (мас./об.). В одном аспекте концентрация стабилизатора в водном составе (например, сахарозы) не превышает около 5, 4,5, 4, 3,5, 3, 2,5 или 2% (мас./об.). В одном аспекте концентрация стабилизатора в водном составе (например, сахарозы) составляет от около 1 до около 5%, или от около 1 до около 4%, или от около 1 до около 3%, или от около 1,5 до около 2,5%, или от около 1,6 до около 2,4%, или от около 1,7 до около 2,3%, или от около 1,7 до около 2,2%, или от около 1,9 до около 2,1%, или около 1, 1,5, 2, 2,5 или 3% (мас./об.).
В некоторых аспектах водный состав может дополнительно содержать поверхностно-активное вещество, буфер, регулятор тоничности, криопротектор, поверхностно-активное вещество, лиопротектор, консервант или их комбинации.
В некоторых аспектах водный состав обладает значением рН, которое составляет 6 или больше, или 6,5 или больше, или 7 или больше, или 7,5 или больше. В некоторых аспектах рН не превышает 9, 8,5 или 8. В некоторых аспектах рН составляет от 6 до 9, от 6,5 до 8,5, от 7 до 8,5, от 7,5 до 8,2, от 7,6 до 8,1, от 7,7 до 7,9 или около 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 или 8.
В одном аспекте водный состав содержит около 45 мМ аргинина, около 2% сахарозы (мас./об.), около 5% маннита (мас./об.) и около 10 мг/мл двухцепочечного r-антидота, причем состав обладает рН около 7,8. В одном аспекте водный состав содержит около 45 мМ аргинина, около 2% сахарозы (мас./об.), около 5% маннита (мас./об.) и около 20 мг/мл двухцепочечного r-антидота, причем состав обладает рН около 7,8. В одном аспекте водный состав содержит около 45 мМ аргинина, около 2% сахарозы (мас./об.), около 5% маннита (мас./об.) и около 40 мг/мл двухцепочечного r-антидота, причем состав обладает рН около 7,8.
В одном аспекте водный состав дополнительно содержит 0,01-0,02% (мас./об.) полисорбата 80 и буфер.
В некоторых аспектах также предложены лиофилизированные композиции, полученные лиофилизацией водного состава по настоящему раскрытию. На основании концентраций каждого агента в водном составе можно легко определить относительное содержание агента в лиофилизированной композиции.
В одном аспекте лиофилизированная композиция содержит по меньшей мере 5% или, альтернативно, по меньшей мере 10, 15, 20, 25, 30 или 35% (мас./мас.) антидота fXa. Затем относительно других основных ингредиентов, например, для L-аргинина HCl:сахарозы:маннита может быть массовое соотношение в диапазоне (0,5-1,4):(1-3):(2-6). В некоторых аспектах массовое соотношение L-аргинина HCl:сахарозы:маннита находится в диапазоне (0,9-1):(1,5-2,5):(4,5-5,5), или (0,91-0,99):(1,6-2,4):(4,6-5,4), или (0,92-0,98):(1,7-2,3):(4,7-5,3), (0,93-0,97):(1,8-2,2): (4,8-5,2), или (0,94-0,96):(1,9-2,1):(4,9-5,1). В некоторых аспектах лиофилизированная композиция дополнительно содержит поверхностно-активное вещество и/или твердую часть буфера.
Настоящее изобретение также относится к терапевтическим способам лечения, предотвращения или уменьшения кровотечения у субъекта, подвергающегося антикоагулянтной терапии ингибитором fXa, включающим введение субъекту эффективного количества лиофилизированного состава после растворения в подходящем растворителе. Предполагается, что антидоты или производные по настоящему изобретению могут представлять собой лекарственные средства кратковременного действия для применения в элективных или экстренных ситуациях, которые могут безопасно и специфически нейтрализовать обычные антикоагулянтные свойства ингибитора fXa, не вызывая вредных побочных эффектов на гемодинамику или обострения пролиферативного сосудистого ответа на травму.
Используемые в данном документе термины лечить, лечение и т.п. используются в данном документе для обозначения достижения желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффект может быть профилактическим с точки зрения полного или частичного предотвращения расстройства или его признака или симптома и/или может быть терапевтическим с точки зрения частичного или полного излечения расстройства и/или неблагоприятного эффекта, связанного с расстройством.
Термин лечение также охватывает любое лечение расстройства у млекопитающего и включает в себя: (а) предотвращение возникновения расстройства у субъекта, который может быть предрасположен к расстройству, но возможно еще не имеет поставленного диагноза, например предотвращение кровотечения у пациента с передозировкой антикоагулянта; (б) ингибирование расстройства, т.е. прекращение его развития, например ингибирование кровотечения; или (с) ослабление или облегчение расстройства, например уменьшение кровотечения.
Используемый в данном документе термин лечение дополнительно включает в себя системное улучшение симптомов, связанных с патологией и/или задержкой появления симптомов. Клинические и субклинические признаки лечения будут варьироваться в зависимости от патологии, индивидуума и лечения.
Введение может осуществляться посредством одной дозы, непрерывно или периодически в течение всего курса лечения. Способы определения наиболее эффективных средств и дозировки введения известны специалистам в данной области техники и будут варьироваться в зависимости от композиции, используемой для терапии, цели терапии, клетки-мишени, подвергаемой лечению, и субъекта, которого
- 9 037815 лечат. Однократное или многократное введение может осуществляться с помощью уровня дозы и схемы, выбранной лечащим врачом. Подходящие лекарственные формы и способы введения агентов известны в данной области техники. Субъектом диагностики или лечения является клетка или млекопитающее, включая человека. Животные, не являющиеся людьми, подлежащие диагностике или лечению, включают в себя, например, представителей мышиных, таких как крысы, мыши, собачьих, такие как собаки, зайцевых, такие как кролики, домашний скот, спортивных животных и домашних животных.
Агенты и композиции по настоящему изобретению могут быть использованы при производстве лекарственных средств и для лечения людей и других животных путем введения в соответствии с обычными процедурами, так как активный ингредиент в фармацевтических композициях.
Агент по настоящему изобретению может вводиться для терапии любым подходящим путем, особенно с помощью парентерального введения (включая подкожное, внутримышечное, внутривенное и внутрикожное введение). Также следует понимать, что предпочтительный путь будет варьироваться в зависимости от состояния и возраста реципиента и заболевания, которое подвергается лечению.
Фраза фармацевтически приемлемый полимер относится к группе соединений, которые могут быть конъюгированы с одним или несколькими полипептидами, описанными в данном документе. Предполагается, что конъюгация полимера с полипептидом способна увеличивать период полувыведения полипептида in vivo и in vitro.
Неограничивающие примеры включают полиэтиленгликоли, поливинилпирролидоны, поливиниловые спирты, производные целлюлозы, полиакрилаты, полиметакрилаты, сахара, полиолы и их смеси.
Антикоагулянтные агенты или антикоагулянты представляют собой агенты, которые ингибируют образование сгустков крови. Примеры антикоагулянтов включают, но не ограничиваются ими, специфические ингибиторы тромбина, фактора IXa, фактора Ха, фактора XIa, фактора XIIa или фактора VIIa, гепарин и его производные, антагонисты витамина К и антитела против тканевого фактора. Примеры конкретных ингибиторов тромбина включают гирудин, бивалирудин (Angiomax®), аргатробан и лепирудин (Refludan®). Примеры гепарина и его производных включают нефракционированный гепарин (НФГ), низкомолекулярный гепарин (НМГ), такой как эноксапарин (Lovenox®), дальтепарин (Fragmin®) и данапароид (Orgaran®); и синтетический пентасахарид, такой как фондапаринукс (Arixtra®). Примеры антагонистов витамина К включают варфарин (Coumadin®), фенокумарол, аценокумарол (Sintrom®), клориндион, дикумарол, дифенадион, этилбискумацетат, фенпрокумон, фениндион и тиокломарол. В одном варианте осуществления антикоагулянт представляет собой ингибитор фактора Ха. В одном варианте осуществления антикоагулянт представляет собой бетриксабан.
Термин антикоагулянтная терапия относится к терапевтическому режиму, который применяется к пациенту для предотвращения возникновения нежелательных сгустков крови или тромбоза. Антикоагулянтная терапия включает в себя введение одного или комбинации двух или более антикоагулянтных агентов или других агентов в дозировке и схеме, подходящей для лечения или предотвращения возникновения нежелательных сгустков крови или тромбоза у пациента.
Термин ингибиторы фактора Ха относится к соединениям, которые могут прямо или косвенно ингибировать активность фактора Ха свертывания крови, катализирующую превращение протромбина в тромбин in vitro и/или in vivo.
Прямые ингибиторы фактора Ха связываются с fXa непосредственно, и неограничивающие примеры включают NAP 5, rNAPc2, ингибитор каскада тканевого фактора (TFPI), DX DX-9065a (как описано, например, в Herbert, J.M., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1996 276 (3):1030-8), YM-60828 (как описано, например, в Taniuchi, Y., et al, Thromb Haemost. 1998 79 (3):543-8), YM-150 (как описано, например, в Eriksson, B.I. et al., Blood 2005;106(11), Abstract 1865), апиксабан, ривароксабан, TAK 442, PD-348292 (как описано, например, в Pipeline Insight: Antithrombotics - Reaching the Untreated Prophylaxis Market, 2007), отамиксабан, эдоксабан (как описано, например, в Hylek Е.М., Curr. Opin. Invest Drugs 2007 8 (9): 778-783), LY517717 (как описано, например, в Agnelli, G., et al., J. Thromb. Haemost. 2007 5(4):746-53), GSK913893, разаксабан, бетриксабан или их фармацевтически приемлемая соль и их комбинации. В конкретном аспекте прямым ингибитором фактора Ха является ривароксабан. В некоторых аспектах прямой ингибитор fXa представляет собой низкомолекулярное химическое соединение.
Ингибирование косвенными ингибиторами фактора Ха активности fXa опосредуется одним или несколькими другими факторами. Неограничивающие примеры косвенных ингибиторов фактора Ха включают фондапаринукс, идрапаринукс, биотинилированный идрапаринукс, эноксапарин, фрагмин, тинзапарин, низкомолекулярный гепарин (НМГ) и их комбинации. В конкретном аспекте косвенным ингибитором фактора Ха является эноксапарин.
В одном варианте осуществления ингибитор фактора Ха выбран из бетриксабана, ривароксабана, НМГ, DX-9065a, YM-60828, YM-150, PD-348292, отамиксабана, эдоксабана, LY517717, GSK913893, разаксабана, апиксабана и их комбинаций.
Термин бетриксабан относится к соединению [2-({4-[(диметиламино)иминометил]фенил}карбониламино)-5-метоксифенил]-N-(5-хлор-(2-пиридил))карбоксамид или его фармацевтически приемлемым солям. Бетриксабан описан в патентах США №№ 6376515, 6835739 и 7598276, содержание которых
- 10 037815 включено в настоящий документ посредством ссылки. Бетриксабан, как известно, является специфическим ингибитором фактора Ха.
Термины нейтрализовать, обращать или противодействовать активности ингибитора fXa или аналогичные фразы относятся к ингибированию или блокированию ингибиторной или антикоагулянтной функции фактора Ха ингибитора fXa. Такие фразы относятся к частичному ингибированию или блокированию функции, а также к ингибированию или блокированию большей части или всей активности ингибитора fXa in vitro и/или in vivo.
Термин эффективное количество относится к количеству производного, достаточному для достижения желаемого биологического и/или терапевтического результата. Таким результатом может быть смягчение признаков, симптомов или причин заболевания или любое другое желаемое изменение биологической системы. В настоящем изобретении результат, как правило, включает одно или несколько из следующего: нейтрализацию ингибитора fXa, который ввели пациенту, изменение антикоагулянтной активности ингибитора fXa, удаление ингибитора fXa из плазмы, восстановление гемостаза, а также уменьшение или прекращение кровотечения. Эффективное количество будет варьироваться в зависимости от конкретного используемого антидота, конкретного ингибитора fXa, который ввели субъекту, режима дозирования ингибитора fXa, времени введения антидота, субъекта и болезненного состояния, которое лечат, веса и возраста субъекта, серьезности болезненного состояния, способа введения и т.п., и все это может быть легко определено специалистом в данной области техники.
В определенных аспектах вводят раствор для доставки количества антидота fXa от около 10 мг до около 2 г. Другие количества используемого r-антидота включают в себя от около 100 мг до около 1,5 г; от около 200 мг до около 1 г и от около 400 до около 900 мг. В некоторых аспектах количество используемого r-антидота составляет около 400 мг или 960 мг. В некоторых аспектах количество используемого r-антидота составляет от около 10 до около 100 мг; от около 15 до около 95 мг и от около 20 до около 80 мг.
Композиция при введении нейтрализует ингибитор фактора Ха по меньшей мере на около 20%, или по меньшей мере на около 50%, или по меньшей мере на около 75%, или по меньшей мере на около 90%, или по меньшей мере на около 95%.
Можно определить, достигается ли результат способа, т.е. ингибирование или нейтрализация ингибитора фактора Ха, с помощью ряда анализов in vitro, таких как анализ образования тромбина, и клинических анализов свертывания, таких как АЧТВ, ПВ и ABC.
Один аспект настоящего изобретения относится к способам селективного связывания и ингибирования экзогенно вводимого ингибитора fXa у субъекта, подвергающегося антикоагулянтной терапии ингибитором fXa, включающим введение субъекту эффективного количества раствора лиофилизированного состава. Пациенты, подходящие для данной терапии, подвергались предшествующей антикоагулянтной терапии, например им вводили один или несколько антикоагулянтов, таких как прямой или косвенный ингибитор fXa.
В другом аспекте в данном документе предлагается способ избирательного связывания и ингибирования экзогенно введенного ингибитора фактора Ха у субъекта, проходящего антикоагулянтную терапию ингибитором фактора Ха, включающий введение субъекту раствора лиофилизированного препарата. Субъектом может быть клетка или млекопитающее, такое как человек.
Субъекты, которым будет полезно введение растворенного лиофилизированного состава, описанного в настоящем документе, и сопутствующих способах, включают тех, которые испытывают или предрасположены к клинически значимому кровотечению или клинически значимому незначительному кровотечению. Примеры клинически значимых кровотечений выбраны из группы, состоящей из кровоизлияния, кровотечения в жизненно важные органы, кровотечения, требующего повторной операции или новой терапевтической процедуры, и индекса кровотечения >2,0 с ассоциированным явным кровотечением (Turpie AGG, et al., NEJM, 2001, 344: 619-625). Кроме того, субъект может испытывать или быть предрасположенным к незначительному кровотечению, выбранному из группы, состоящей из носового кровотечения, которое является постоянным или периодическим, и происходит в значительном количестве или не останавливается без вмешательства, кровотечения из прямой кишки или мочевыводящих путей, которое не перерастает до степени, требующей терапевтической процедуры, значительных гематом в местах инъекций или в других местах, которые являются спонтанными или возникают после тривиальной травмы, значительной потери крови, более чем обычно связанной с хирургической процедурой, не требующей дренирования, и кровотечения, требующего незапланированного переливания.
В некоторых вариантах растворенный лиофилизированный состав вводят после передозировки введения ингибитора fXa или перед операцией, которая может подвергать субъектов риску кровотечения.
Примеры
Следующие примеры включены для демонстрации конкретных вариантов осуществления раскрытия. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что методики, раскрытые в следующих примерах, представляют собой методики, которые хорошо функционируют при практическом осуществлении данного описания и, таким образом, могут рассматриваться как составляющие конкретные способы для его практического применения. Однако специалистам в данной области техники в свете настоящего раскрытия должно быть понятно, что в конкретных раскрытых вариантах осуществления мо- 11 037815 жет быть выполнено множество изменений, и все же может быть получен тот же или аналогичный результат без отклонения от сущности и объема раскрытия.
Пример 1. Очистка r-антидота из клеточной культуры.
Данный пример демонстрирует разработку условий культивирования и способа выделения и очистки для производства r-антидота. Коммерческую культуральную среду, специально предназначенную для клеток СНО, тестировали клетками СНО, трансфицированными конструкцией, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 7), которая кодирует предшественник r-антидота (SEQ ID NO: 2), который после удаления -RKRRKR- линкера (SEQ ID NO: 6) генерирует двухцепочечный rантидот (SEQ ID NO: 3). Среда ProCHO™ в подходящих условиях могла обеспечивать значение титра до 75-95 мг/л.
Способ выделения и очистки (способ выделения) был разработан для очистки антидота от культивируемых клеток. На нескольких начальных этапах разработки были протестированы различные мембраны и колонны.
В двух испытаниях было обнаружено, что осветленный сбор загрязняет мембраны, когда продукт концентрируется ультрафильтрацией (УФ), или загрязняет хроматографическую среду, если УФ пропускают и продукт концентрируют на первом этапе хроматографии. Эксперименты проводились для определения причины загрязнения и определения шагов по его устранению, поскольку в начале способа неизбежно обращали внимание на концентрацию продукта. Впоследствии было определено, что загрязнение вызвано примесью белка с высокой молекулярной массой (HMW), который выделялся в среду во время культивирования клеток. Данный белок HMW был только частично растворимым в осветленном сборе и после концентрации становился все более и более нерастворимым, вызывая недопустимое загрязнение мембраны для УФ или хроматографической колонки.
После оценки нескольких глубинных фильтров, ионообменных мембран и хроматографических сред было обнаружено, что один конкретный глубинный фильтр (фильтр Millipore™ класса ХОНС) может удалять большую часть примесей при достижении приемлемого выхода продукта. Затем продукт может быть сконцентрирован с помощью УФ до 10 раз. Данный фильтр заменил один из исходных фильтров в способе осветления и был использован для двух дополнительных испытаний.
Фиг. 1 иллюстрирует результирующий способ 100 очистки, полученный в результате данной разработки. После сбора клеток (стадия 101) и осветления с использованием фильтра ХОНС Millipore™ для удаления примеси HMW образец концентрировали в 10 раз (стадия 102). Для концентрации можно использовать регенерированную целлюлозу. На этапе 103 может выполняться вирусная инактивация (с помощью детергента/растворителя; конечная концентрация: 1% Тритон Х-100, 0,3% трибутилфосфат) для инактивации оболочечных вирусов в культуре клеток. После удаления вирусов выполняются этапы 104 (катионный обмен в смешанном режиме), 105 (анионный обмен в смешанном режиме) и 106 (ионный обмен в смешанном режиме) для удаления белков и ДНК клетки-хозяина и захвата антидота. На этапе 107 для дополнительного удаления оставшихся белков клетки-хозяина может использоваться смола с гидрофобным взаимодействием.
Необязательно, после указанных этапов очистки можно использовать конечную стадию фильтрования для удаления вирусов с целью удаления любых оставшихся вирусов.
Данный способ позволил извлечь около 30-35% антидота, экспрессированного в клеточной культуре, что привело к получению около 22-33 мг белка-антидота из каждого литра культуры клеток.
Пример 2. Масштабирование промышленного способа.
На основе способа, описанного в примере 1, был разработан модифицированный способ с целью масштабирования производства.
Культуральная среда примера 1 была способна генерировать титр около 75-95 мг/л. Для увеличения производства был протестирован ряд других культуральных сред для СНО. Одна из них продемонстрировала 2-3-кратное увеличение роста клеток и пиковую плотность клеток (титр=200-225 мг/л), а также позволила увеличить масштабы до 10000 л.
Аффинный хроматограф был разработан для экстракции антидота в больших объемах. Аффинный лиганд включал ингибитор трипсина Куница (21 кДа; pI=4,5), экстрагированный из цельной сои или муки сои. Ингибитор трипсина сои (STI) образует комплекс 1:1 с антидотом. Для масштабируемости и совместимости были определены неконкурентные условия элюирования ингибитора, которые включали 25 мМ Na-ацетат, 1M аргинин, при рН 5,2.
В способе, разработанном в примере 1, для удаления примеси HMW использовался этап осветления сбора с глубинным фильтром с последующим 10-кратным концентрированием. Кроме того, на стадии инактивации вирусов использовали детергент (Тритон Х-100), а также растворитель (трибутилфосфат). Пригодность и эффективность данных этапов оценивали для проведения аффинного захвата.
Данные показывают, что глубинная фильтрация не требовалась и что использование растворителя и этап 10-кратного концентрирования снижали степень извлечения продукта.
Следовательно, при дальнейшей разработке глубинная фильтрации и этап концентрирования были исключены, и при инактивации вирусов использовался только детергент (Тритон Х-100) без растворите- 12 037815 ля. Инактивация вирусов была достигнута путем добавления 10% Тритона Х-100 в соотношении 52,7 мл буфера на каждый литр продукта (конечная концентрация: 0,5% Тритон Х-100). Данный результат был неожиданным, так как для подготовки образцов перед загрузкой на аффинную колонну обычно используются растворители. Также отмечено, что когда собирали клеточную культуру, для удаления осадков использовался этап центрифугирования.
После времени перемешивания в 15 мин и минимального периода выдерживания в течение 1 ч при комнатной температуре обработанный продукт фильтровали через ряд фильтров, состоящий из предварительного фильтра Sartogruad NF Filter (0,8/0,2 мкм), на предварительный фильтр Sartopore 2 (0,45/0,22 мкм) в 500 л емкость со встроенным фильтром на 0,22 мкм, при этом каждая загрузка на колонну фильтруется в день использования.
Для элюирования продукта из аффинных смол с STI использовали элюирующий буфер, который содержал аргинин (25 мМ ацетат натрия/1,0М аргинин, рН 5,2).
После аффинного захвата использовали несколько этапов доочистки для удаления оставшихся примесей, включая ДНК, белки клеток-хозяев (НСР) и вымывание аффинного лиганда. Были протестированы два варианта хроматографии, включая катионный обмен и ионный обмен в смешанном режиме. Однако не было доступно никакого специфичного анализа белков клетки-хозяина для определения параметров. Таким образом, коммерческие ИФА, используемые в качестве заменителя, и количественное определение специфических НСР с помощью ЖХ-МС/МС были использованы в качестве дополнительного определения параметров. И дополнительно оценка методом 2D-элеkтрофореза с окрашиванием серебром для качественной характеризации.
На фиг. 3 изображена оценка трех предполагаемых способов выделения и очистки (DSP). Три DSP были идентифицированы на основе очистки от вымытого аффинного лиганда. Для оценки качества продукта и очистки от примесей, связанных с технологическим процессом, один и тот же пул аффинного элюата подвергался прямой обработке в каждом потоке и сравнивался для определения степени извлечения продукта и очистки от белков клетки-хозяина СНО (НСР; выражается в долях на миллион (м.д.)). Элюаты из каждого способа DSP дополнительно тестировались на качество продукта (таблица ниже).
- 13 037815
| Образец Аффинный элюат | Кислотный пик 27,8% | Пик 1 17,8 | Пик 2 12,9 | Пик 3 16, 6 | Основный пик 13,9% | |
| % пика | Катионный обмен | 24, 9% | 14,5 | 26,9 | 20,8 | 13,1% |
| по ИОХ | Элюат | % | % | % | ||
| ИО в смеш. реж. | 23, 4% | 15,7 | 17,3 | 20,4 | 13,3% | |
| Элюат DSP-2 | % | % | % | |||
| ИО в смеш. реж. | 23, 6% | 15,2 | 26,9 | 20,0 | 13,3% | |
| Элюат DSP-1 |
пика по ОФХ мономера по основного
| Образец Аффинный | 0, | HMW 29% | мономера 99,71% | ||
| элюат Катионный | |||||
| обмен Элюат ИО в смеш. | 4, | 30% | 95,70% | ||
| реж. Элюат DSP-2 ИО в смеш. | 0, | 13% | 99,87% | ||
| реж. Элюат DSP-1 Аффинный элюат Катионный обмен Элюат ИО в смеш. реж. Элюат DSP-2 ИО в смеш. реж. Элюат DSP-1 | 0% | ; 100% Пик перед основным пиком 0, 8% 1,2% 0,5% 0, 9% | Основной пик 93,4% 92,9% 94,2% 93,4% | Бета пик 5,7% 5,9% 5,3% 5,8% |
Примечания к таблице. Оценка качества продукта из трех оцениваемых способов выделения и очистки. Элюаты, взятые из трех DSP (фиг. 3), оценивали на влияние на качество продукта. Никакого влияния вследствие неоднородности зарядов при ионном обмене (ИО) или при очистке с обратной фазой (ОФ) не наблюдалось. Однако образцы из DSP-2, которые были очищены на этапе катионообменной доочистки, показали увеличение % высокомолекулярного агрегата методом эксклюзионной хроматографии (ЭХ).
На основе тестирования был разработан способ выделения и очистки увеличенного масштаба, который изображен на фиг. 2. Данный способ является проще, чем тот, который изображен на фиг. 1. Тем не менее, выход был в 2 раза выше. В сочетании с новой системой культивирования клеток, которая привела к увеличению выработки белка в 2-3 раза, описанный в примере 2 способ дал возможность увеличить общую выработку антидота в 4-6 раз и обеспечил масштаб производства по меньшей мере 10000 л.
На фиг. 2 способ 200 выделения и очистки использует этап инактивации вирусов (202) после сбора (201), в котором используется только детергент (Тритон Х-100) без растворителя. На этапе 203 аффинного захвата используют смолы с лигандом STI и антидот элюируют элюирующим буфером с аргинином (рН 5). Дополнительный этап ультрафильтрации/диафильтрации (УФ/ДФ) может использоваться после аффинного захвата, что может обеспечить концентрирование белка и доведения рН до приблизительно 7.
На этапе 204 анионная мембрана используется для удаления определенных примесей из образца (например, ДНК, НСР). Примером протестированной анионной мембраны была мембрана Sartobind Q, которая не оказывала вредного воздействия на антидот.
На этапе 205 примерным типом ионного обмена в смешанном режиме является смешанный режим
- 14 037815
ИО с СНТ (керамический гидроксиапатит). Примером элюирующего буфера является фосфатно-солевой буфер. Данный этап полезен для удаления вымытого STI.
На этапе 206 гидрофобное разделение может быть достигнуто с помощью хроматографии с октилсефарозой в качестве примера, и белок может быть элюирован буфером, который содержит NaCl. Данный этап полезен для удаления оставшихся НСР.
Следующая таблица показывает выход очистки и извлечения в нескольких испытаниях.
| Лабораторный масштаб (10 л) | Пилотный масштаб 1 (400 л) | Пилотный масштаб 2 (400 л) | |
| Аффинный захват | 178 мг/л культуры клеток | 122 мг/л куль туры клеток | 150 мг/л куль туры клеток |
| Диафиль трация | 95% | 98% | 99% |
| Sartobind-Q | - | - | 95% |
| ИО-смешанный режим | 92% | 95% | 93% |
| Гидрофобное взаимодействие (октил) | 100% | 103% | 99% |
| Фильтрация вирусов | 95% | 92% | 94% |
| Конечная УФ/ДФ Нерасфасованное лекарственное вещество | 89% | 91% | 92% |
| Общий выход | 60% | 69% | 66% |
Пример 3. Определение параметров промышленно полученного белка.
В данном примере были разработаны способы для определения параметров белкового продукта, полученного в результате разработанных выше способов. Способы исследования включали изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ), обратную фазу в восстанавливающих условиях (Red-ОФ) и пептидную карту в восстанавливающих условиях (РМАР).
Изоэлектрическое фокусирование использовали для определения гетерогенности зарядов антидотабелка. Изоэлектрическое фокусирование представляет собой электрофоретический способ разделения белков на основе их изоэлектрической точки (pI) или рН, при котором белок не имеет суммарного заряда. Изоэлектрическое фокусирование проводили с использованием гелей с рН 3-10 и реагентов в соответствии с инструкциями производителя Life Technologies для электрофореза (Novex IEF Gels) и окрашивания с использованием набора для окрашивания коллоидным синим (Invitrogen). Результаты сравнивали с маркерами Serva 3-10 pI.
Тестовые партии разбавляли до 1,6 мг/мл в воде, затем 1:1 в буфере для образцов ИЭФ, рН 3 10. Каждый образец загружали в количестве 10 мкл (8,0 мкг) и проводили электрофорез при 100 В в течение 1 ч, затем при 200 В в течение 1 ч и при 500 В в течение 30 мин. Гели фиксировали в течение 30 мин в фиксирующем растворе (Sigma-Aldrich), окрашивали в течение 1 ч красителем коллоидным синим и оставляли в воде на ночь.
Обратная фаза в восстанавливающих условиях представляет собой способ ВЭЖХ, который использует хроматографическое разделение с обратной фазой для обнаружения как полноразмерных, так и усеченных форм белка. В образцах заменяли буфер на 6М гуанидина-HCl/50 мМ Трис, рН 7,5 и восстанавливали с помощью DTT до инкубации при 50°С в течение 30 мин. Образцы затем алкилировали с использованием винилпиридина при комнатной температуре в течение 90 мин в темноте с последующим гашением 1М DTT. В данном способе используется колонка ВЭЖХ Agilent Zorbax C18 для связывания белков с неподвижной фазой и градиент от 15 до 95% убывающей по полярности подвижной фазы (0,1% трифторуксусной кислоты в ацетонитриле) для разделения белков на основе их гидрофобности. Длина волны УФ-излучения составляет 214 нм.
Для получения пептидной карты с расщепленнием Lys-C использовали УВЭЖХ-УФ/МСЕ анализ расщепленных Lys-C образцов. Данный способ был способен обеспечить охват более чем 98% последовательности и характеризовать посттрансляционные модификации, такие как гликозилирование, гидро- 15 037815 ксилирование аспартата и усечение С-концевого лизина. Данный способ также был способен контролировать показатели, указывающие на стабильность, такие как дезамидирование аспарагина и окисление метионина. Каждая партия образцов была восстановлена, алкилирована и обработана лизилэндопептидазой (Lys-C). Пептиды, полученные ферментативным расщеплением, разделяли с помощью ОФ-УВЭЖХ и анализировали с помощью масс-спектроскопии.
В следующих таблицах показан тип изоформ белка, обнаруженных в очищенных белковых продуктах, а также их процентные содержания и последовательности (партия № 1: со способом выделения и очистки, разработанным в примере 1; партия № 1: со способом выделения и очистки, разработанным в примере 2). Интересно отметить, что по сравнению со способом примера 1 способ примера 2 значительно уменьшил процентное содержание SEQ ID NO: 9 (с 9,0 до 2,7%), вероятно, из-за повышенной эффективности очистки.
Изоформы легкой цепи:________________________________________________
| Партия №1 | Партия №2 | |
| Интактная легкая цепь (SEQ ID NO: 4) | 46, 8% | 37, 9% |
| Модифицированная или усеченная легкая цепь | 53,2% | 62, 1% |
Изоформы тяжелой цепи:
| Партия №1 | Партия № 2 | |
| Интактная тяжелая цепь (SEQ ID NO: 5) с 2 0- связанными гликозилированиями | 10,2% | 22,0% |
| Интактная тяжелая цепь (SEQ ID NO: 5) с 1 0- связанным гликозилированием | 18,3% | 22, 6% |
| С-терминальная усеченная | 57,8% | 46, 9% |
- 16 037815
| по К (SEQ ID NO: 8) с 1 О- связанным гликозилированием | ||
| Без 13 С-терминальных остатков (SEQ ID NO: 9) | 9, 0% | 2,7% |
| Без 14 С-терминальных остатков (SEQ ID NO: 10) | 0, 6% | 0, 8% |
| Без 15 С-терминальных остатков (SEQ ID NO: 11) | 4,0% | 5, 0% |
Тяжелая цепь без С-терминального К (SEQ ID NO: 8) 181 IVGGQE CKDGECPWQA LLINEENEGF CGGTILSEFY ILTAAHCLYQ
241 AKRFKVRVGD RNTEQEEGGE AVHEVEWIK HNRFTKETYD FDIAVLRLKT PITFRMNVAP
301 ACLPERDWAE STLMTQKTGI VSGFGRTHEK GRQSTRLKML EVPYVDRNSC KLSSSFIITQ
361 NMFCAGYDTK QEDACQGDAG GPHVTRFKDT YFVTGIVSWG EGCARKGKYG IYTKVTAFLK
421 WIDRSMKTRG LPKAKSHAPE VITSSPL
Тяжелая цепь без 13 С-терминальных остатков (SEQ ID NO: 9)
181 IVGGQE CKDGECPWQA LLINEENEGF CGGTILSEFY ILTAAHCLYQ
241 AKRFKVRVGD RNTEQEEGGE AVHEVEWIK HNRFTKETYD FDIAVLRLKT PITFRMNVAP
301 ACLPERDWAE STLMTQKTGI VSGFGRTHEK GRQSTRLKML EVPYVDRNSC KLSSSFIITQ
361 NMFCAGYDTK QEDACQGDAG GPHVTRFKDT YFVTGIVSWG EGCARKGKYG IYTKVTAFLK
421 WIDRSMKTRG LPKAK
Тяжелая цепь без 14 С-терминальных остатков (SEQ ID NO: 10)
181 IVGGQE CKDGECPWQA LLINEENEGF CGGTILSEFY ILTAAHCLYQ
241 AKRFKVRVGD RNTEQEEGGE AVHEVEWIK HNRFTKETYD FDIAVLRLKT PITFRMNVAP
301 ACLPERDWAE STLMTQKTGI VSGFGRTHEK GRQSTRLKML EVPYVDRNSC KLSSSFIITQ
361 NMFCAGYDTK QEDACQGDAG GPHVTRFKDT YFVTGIVSWG EGCARKGKYG IYTKVTAFLK
421 WIDRSMKTRG LPKA
Тяжелая цепь без 15 С-терминальных остатков (SEQ ID NO: 11)
181 IVGGQE CKDGECPWQA LLINEENEGF CGGTILSEFY ILTAAHCLYQ
241 AKRFKVRVGD RNTEQEEGGE AVHEVEWIK HNRFTKETYD FDIAVLRLKT PITFRMNVAP
301 ACLPERDWAE STLMTQKTGI VSGFGRTHEK GRQSTRLKML EVPYVDRNSC KLSSSFIITQ
361 NMFCAGYDTK QEDACQGDAG GPHVTRFKDT YFVTGIVSWG EGCARKGKYG IYTKVTAFLK 421 WIDRSMKTRG LPK
Пример 4. Валидация масштабированного способа.
Данный пример описывает способ для дальнейшей валидации, основанный на способах, описанных в примерах 1 и 2.
Инактивация вирусов с помощвю детергента.
Этап инактивации вирусов осуществляли путем добавления 10% Тритона Х-100 к собранному белку. Собранный белок, соответствующий 1 циклу Capto STI (как описано ниже), фильтровали из резервуара для сбора в резервуар для добавления 10% Тритона Х-100 через фильтры 4x30 Sartoguard NF, которые использовались в качестве предварительных фильтров, а затем фильтровали через фильтры 3x20 Sartoguard NF 0,8/0,2 мкм. После добавления 10% Тритона Х-100 пул смешивали и затем переносили в резервуар для хранения через фильтры 3x30 Sartoguard NF 0,8/0,2 мкм. По истечении времени удерживания инактивированный пул загружали в колонну Capto STI через фильтр 6x30 Sartoguard NF 0,8/0,2 мкм последовательно с фильтрами 3x30 Sartopore 2 0,45/0,2 мкм. Данная последовательность повторялась до тех пор, пока не были завершены 4 цикла, которые должны быть выполнены во время операции Capto STI. Фильтры 6x30 Sartoguard NF 0,8/0,2 мкм были заменены после загрузки второго цикла.
Хроматография с Capto STI.
Аффинную колоночную хроматографию проводили с использованием смолы Capto STI при температуре окружающей среды. Во время фазы загрузки продукт связывался со смолой, в то время как загрязняющие вещества проходили без удерживания. Продукт извлекали, нарушая белковые взаимодействия с помощью высокой концентрации аргинина в элюирующем буфере. Перед использованием колонну промывали водой для инъекций (WFI), очищали 100 мМ фосфорной кислотой с рН 3,0 и промывали WFI. Сначала колонну предварительно уравновешивали буфером для предварительного уравновешивания (20 мМ Трис-HCl, рН 7,4), затем уравновешивали буфером для уравновешивания (20 мМ Трис-HCl, 200 мМ NaCl, рН 7,4) и как только рН и проводимость колонны оказывалась в пределах спецификации на нее загружали обработанный Тритоном-Х 100 (HCCF) осветленный сбор (HCCF). Каждый цикл материала HCCF переносился из резервуара для выдерживания при инактивации вирусов непосредственно на колонну.
После загрузки колонну промывали уравновешивающим буфером и элюировали элюирующим буфером с высоким содержанием аргинина и низким рН (элюирующий буфер: 25 мМ ацетата натрия 1,0М аргинина, рН 5,2). В конце цикла и перед следующим циклом колонну промывали WFI, снова очищали
- 17 037815
100 мМ фосфорной кислотой с рН 3,0 и снова промывали WFI. Все элюаты, полученные из нескольких циклов, объединяли. После того как был собран материал последнего цикла, в обход колонки подавали буфер, чтобы вымыть элюированный продукт из линий ниже по потоку от колонны в накопительный сосуд. После завершения всех циклов колонку промывали WFI, очищали 100 мМ фосфорной кислотой с рН 3,0, промывали WFI, нейтрализовали буфером для предварительного уравновешивания и буфером для уравновешивания и хранили в этанольном растворе хранения.
Пул элюата Capto STI смешивали с 1,0М аргинина HCl с рН 7,0 до конечной концентрации 100 мМ аргинина HCl для стабилизации пула. Затем полученный пул концентрировали и подвергали диафильтрованию на мембране Ultracel Pellicon 3 на 10 кДа для удаления большей части аргинина, что позволяло проводить загрузку на следующий этап хроматографии.
Мембранная хроматография на Sartobind Q.
Анионообменную мембранную хроматографию проводили с использованием картриджа Sartobind Q Jumbo при температуре окружающей среды. Во время фазы загрузки продукт проходит через мембрану, в то время как загрязняющие вещества связываются. Перед использованием картридж промывали уравновешивающим буфером для удаления увлажнителя для хранения. Картридж очищали 0,5М NaOH. Затем картридж уравновешивали уравновешивающим буфером и, когда рН и проводимость картриджа оказывались в пределах спецификации, на него загружали концентрированный диафильтрованный элюат Capto STI. Один цикл загрузки материала был непосредственно загружен из накопительного резервуара УФ/ДФ. После загрузки картридж промывали уравновешивающим буфером. После того как продукт был собран, в обход картриджа подавали буфер, чтобы вымыть продукт из линий ниже по потоку от картриджа в накопительный сосуд.
Хроматография на керамическом гидроксиапатите (СЕТ).
Колоночную хроматографию в смешанном режиме проводили с использованием смолы СНТ типа I размером 40 мкм при температуре окружающей среды. Во время фазы загрузки продукт связывался со смолой, в то время как некоторые загрязняющие вещества проходили без удерживания. Продукт извлекали путем увеличения концентрации натрия в линейном градиенте. Перед использованием колонну очищали 1,0М NaOH и промывали небольшим объемом уравновешивающего буфера. Сначала колонну предварительно уравновешивали буфером для предварительного уравновешивания, а затем уравновешивали буфером для уравновешивания, и как только рН и проводимость колонны оказывались в пределах спецификации, на нее загружали элюат Sartobind Q.
Каждый цикл загрузки переносили из накопительного резервуара непосредственно на колонну. После загрузки колонну промывали уравновешивающим буфером. Затем проводили элюирование в градиенте от 90% уравновешивающего буфера (50 мМ MES, 5 мМ фосфата натрия, рН 7,0) до 90% элюирующего буфера (50 мМ MES, 5 мМ фосфата натрия, 2М хлорида натрия, рН 7,0).
В конце цикла и перед следующим циклом колонну промывали уравновешивающим буфером, а затем освобождали промывочным буфером с высоким содержанием фосфата после элюирования, промывали уравновешивающим буфером, снова очищали 1,0М NaOH и снова промывали уравновешивающим буфером. Все элюаты, полученные из нескольких циклов, объединяли. После того как был собран материал последнего цикла, в обход колонки подавали буфер, чтобы вымыть элюированный продукт из линий ниже по потоку от колонны в накопительный сосуд. После того как все циклы были завершены, колонну промывали уравновешивающим буфером, очищали 1,0М NaOH и хранили в растворе для хранения, содержащим едкий натр/фосфат.
Хроматография на октилсефарозе 4FF.
Хроматографию с гидрофобным взаимодействием проводили с использованием смолы октилсефарозы FF при температуре окружающей среды. Во время фазы загрузки продукт проходит сквозь смолу, в то время как загрязняющие вещества связываются. Перед использованием колонну очищали 1,0М NaOH. Колонну сначала предварительно уравновешивали WFI, а затем уравновешивали уравновешивающим буфером, и как только рН и проводимость колонны оказывались в пределах спецификации, на нее загружали элюат СНТ. Каждый цикл загрузки переносили из накопительного резервуара непосредственно на колонну. После загрузки колонну промывали уравновешивающим буфером. В конце цикла и перед следующим циклом колонну освобождали WFI и снова очищали 1,0М NaOH. После того как был собран материал последнего цикла, в обход колонны подавали буфер, чтобы вымыть элюированный продукт из линий ниже по потоку от картриджа в накопительный сосуд. После того как все циклы были завершены, колонну освобождали WFI, очищали 1,0М NaOH и хранили в растворе для хранения, содержащим едкий натр.
Фильтрование на Planova 20N для снижения вирусной нагрузки (VRF).
Фильтрование для снижения вирусной нагрузки осуществляли на фильтре Planova 20N для уменьшения количества вирусов. Фильтр работал в тупиковом режиме, продукт проходил через фильтр, в то время как оставшиеся вирусные частицы оставались в волокнах. Перед использованием фильтр промывали уравновешивающим буфером для октилсефарозы. Затем продукт пропускали через фильтр и затем промывали дополнительной порцией уравновешивающего буфера. Фильтр был проверен на целостность и утилизирован после использования.
- 18 037815
Фильтрат VRF концентрировали на мембране Ultracel Pellicon 3 на 10 кДа. После частичного концентрирования проводили его диафильтрацию с получением готового состава. Затем продукт концентрировали до конечной целевой концентрации и извлекали.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимают специалисты в области техники, к которой относится данное изобретение.
Изобретения, иллюстративно описанные в данном документе, могут быть соответствующим образом осуществлены на практике в отсутствие какого-либо элемента или элементов, ограничения или ограничений, конкретно нераскрытых в данном документе. Таким образом, например, термины состоящий, включающий, содержащий и т.д. следует читать в широком смысле и без ограничений. Кроме того, примененные в данном документе термины и выражения использовались в качестве терминов описания, а не ограничения, и при использовании таких терминов и выражений нет намерения исключать какиелибо эквиваленты показанных и описанных признаков или их частей, но признается, что возможны различные модификации в пределах объема заявленного изобретения.
Таким образом, следует понимать, что хотя настоящее изобретение было конкретно раскрыто в предпочтительных вариантах осуществления и необязательных аспектах, специалистами в данной области могут быть использованы модификация, усовершенствование и вариант изобретений, воплощенных в настоящей описанной заявке, и что такие модификации, усовершенствования и варианты находятся в рамках настоящего изобретения. Представленные в данном документе материалы, способы и примеры представляют собой предпочтительные варианты осуществления, являются иллюстративными и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.
В данном документе было широко и в общих чертах описано изобретение. Каждый из более узких видов и подвидовых групп, входящих в общее описание, также образует часть изобретения. Это включает в себя общее описание изобретения с оговоркой или отрицательным ограничением, удаляющим какойлибо объект изобретения из рода, независимо от того, указан конкретно или нет опущенный материал в данном документе.
Кроме того, когда признаки или аспекты изобретения описаны в терминах групп Маркуша, специалисты в данной области техники поймут, что изобретение также описано таким образом в терминах любого отдельного члена или подгруппы членов группы Маркуша.
Все публикации, патентные заявки, патенты и другие источники, упомянутые в данном документе, явно включены в качестве ссылки во всей их полноте в той же степени, как если бы каждая из них была включена в данный документ посредством ссылки отдельно. В случае конфликта настоящее описание, включая определения, является превалирующим.
Следует понимать, что хотя данное раскрытие описано в связи с вышеприведенными вариантами осуществления, приведенное выше описание и примеры предназначены лишь для иллюстрации и не ограничивают объем раскрытия. Для специалистов в данной области техники, к которой принадлежит данное описание, будут очевидны другие аспекты, преимущества и модификации в рамках раскрытия настоящего изобретения.
Claims (40)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ очистки полипептидного продукта, экспрессируемого из полинуклеотидной конструкции, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 7 или последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности с аминокислотной последовательностью, кодируемой SEQ ID NO: 7, включающий добавление детергента к образцу, который содержит полинуклеотидную конструкцию и полипептидный продукт, экспрессированный из полинуклеотидной конструкции;загрузку образца в хроматограф для аффинной хроматографии на основе ингибитора трипсина сои (STI) и элюирование полипептида первым элюирующим буфером для получения первого элюированного образца, причем загруженный образец не содержит органического растворителя;загрузку первого элюированного образца на хроматограф с ионным обменом и смешанным режимом и элюирование полипептида вторым элюирующим буфером, содержащим по меньшей мере 1М неорганической соли, для получения второго элюированного образца; и загрузку второго элюированного образца на хроматограф с гидрофобным взаимодействием и элюирование полипептида третьим элюирующим буфером, содержащим по меньшей мере 2 мМ хлорида натрия, с получением, тем самым, очищенного образца, содержащего полипептидный продукт.
- 2. Способ по п.1, в котором детергент содержит тритон Х-100 (п-(1,1,3,3- тетраметилбутил)фениловый эфир полиэтиленгликоля).
- 3. Способ по п.1 или 2, в котором первый элюирующий буфер содержит от 0,5 до 2М аргинина.
- 4. Способ по п.3, в котором первый элюирующий буфер обладает рН от около 5 до 5,4.- 19 037815
- 5. Способ по любому из пп.1-4, в котором хроматограф с ионным обменом и смешанным режимом включает хроматограф с керамическим гидроксиапатитом типа I.
- 6. Способ по любому из пп.1-5, в котором второй элюирующий буфер содержит по меньшей мере2М неорганической соли.
- 7. Способ по п.6, в котором неорганическая соль представляет собой хлорид натрия.
- 8. Способ по любому из пп.1-7, в котором хроматограф с гидрофобным взаимодействием включает хроматограф с октилсефарозой.
- 9. Способ по п.1, дополнительно включающий стадию очистки с помощью анионообменного хроматографа.
- 10. Способ по п.9, в котором анионообменный хроматограф содержит ионообменную мембрану Sartobind™.
- 11. Способ по любому из пп.1-10, дополнительно включающий фильтрацию одного или более образцов с помощью фильтра из нанофлиса.
- 12. Способ по п.11, в котором фильтрацию с помощью фильтра из нанофлиса проводят перед загрузкой образца на хроматограф для аффинной хроматографии на основе STI.
- 13. Способ по любому из пп.1-12, в котором очищенный образец содержит менее чем приблизительно 1% загрязняющих белков, неэкспрессированных полинуклеотидной конструкцией.
- 14. Способ по любому из пп.1-13, в котором полипептидный продукт экспрессируется в клетке, которая содержит полинуклеотидную конструкцию.
- 15. Способ по п.14, в котором клетку выращивают в среде в условиях с получением по меньшей мере 100 мг полипептидного продукта на 1 л среды.
- 16. Способ по п.15, в котором клетку выращивают в среде в условиях, подходящих для получения по меньшей мере 200 мг полипептидного продукта на 1 л среды.
- 17. Способ по п.15 или 16, в котором очищенный образец содержит более чем приблизительно 50% полипептидного продукта, продуцированного в среде.
- 18. Способ по п.15 или 16, в котором очищенный образец содержит более чем приблизительно 100 мг полипептидного продукта на каждый литр полученной среды.
- 19. Способ по любому из пп.1-18, в котором полипептидный продукт представляет собой двухцепочечный полипептид, содержащий легкую цепь и тяжелую цепь.
- 20. Способ по п.19, в котором приблизительно от 20 до 50% полипептидного продукта в очищенном образце содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5.
- 21. Способ по п.20, в котором приблизительно 5-95% тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, содержит два О-связанных гликозилирования и приблизительно 595% тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, содержит одно Освязанное гликозилирование.
- 22. Способ по любому из пп.19-21, в котором приблизительно 40-80% полипептидного продукта в очищенном образце содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8.
- 23. Способ по п.22, в котором по меньшей мере приблизительно 90% тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, содержит одно О-связанное гликозилирование.
- 24. Способ по любому из пп.19-23, в котором приблизительно 2-12% полипептидного продукта в очищенном образце содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9.
- 25. Способ по любому из пп.19-24, в котором приблизительно 0,1-1,5% полипептидного продукта в очищенном образце содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.
- 26. Способ по любому из пп.19-25, в котором приблизительно 2-8% полипептидного продукта в очищенном образце содержит тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11.
- 27. Способ по любому из пп.19-26, в котором приблизительно 35-60% полипептидного продукта в очищенном образце содержит легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.
- 28. Фармацевтическая композиция, содержащая фармацевтически приемлемый носитель и полипептидную часть из двухцепочечных полипептидов, в которой при близительно 35-60% двухцепочечных полипептидов содержат легкую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4;при близительно 20-60% двухцепочечных полипептидов содержат тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5;приблизительно 40-60% двухцепочечных полипептидов содержат тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8; и менее чем 10% двухцепочечных полипептидов содержат тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9.- 20 037815
- 29. Фармацевтическая композиция по п.28, в которой менее чем 5% двухцепочечных полипептидов содержат тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9.
- 30. Фармацевтическая композиция по п.28, в которой менее чем 3% двухцепочечных полипептидов содержат тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 9.
- 31. Фармацевтическая композиция по любому из пп.28-30, в которой приблизительно 0,1-1,5% двухцепочечных полипептидов содержат тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 10.
- 32. Фармацевтическая композиция по любому из пп.28-31, в которой приблизительно 2-8% двухцепочечных полипептидов содержат тяжелую цепь, состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 11.
- 33. Фармацевтическая композиция по любому из пп.28-32, в которой приблизительно 30-70% тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, содержит два O-связанных гликозилирования.
- 34. Фармацевтическая композиция по любому из пп.28-33, в которой приблизительно 30-70% тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 5, содержит одно O-связанное гликозилирование.
- 35. Фармацевтическая композиция по любому из пп.28-34, в которой по меньшей мере приблизительно 90% тяжелой цепи, состоящей из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 8, содержит одно О-связанное гликозилирование.
- 36. Фармацевтическая композиция по любому из пп.28-35, в которой препарат лиофилизирован.
- 37. Фармацевтическая композиция по любому из пп.28-36, дополнительно содержащая L-аргинина HCl или L-аргинина ацетат.
- 38. Фармацевтическая композиция по любому из пп.28-37, дополнительно содержащая сахарозу.
- 39. Фармацевтическая композиция по любому из пп.28-38, дополнительно содержащая маннит.
- 40. Способ нейтрализации или ингибирования состояния антикоагуляции у пациента, подвергающегося антикоагуляционному лечению ингибитором фактора Ха, включающий введение пациенту фармацевтической композиции по любому из пп.28-39.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201662351841P | 2016-06-17 | 2016-06-17 | |
| PCT/US2017/038169 WO2017219034A2 (en) | 2016-06-17 | 2017-06-19 | Preparation of factor xa derivatives |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201990052A1 EA201990052A1 (ru) | 2019-05-31 |
| EA037815B1 true EA037815B1 (ru) | 2021-05-25 |
Family
ID=60663351
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201990052A EA037815B1 (ru) | 2016-06-17 | 2017-06-19 | ПОЛУЧЕНИЕ ПРОИЗВОДНЫХ ФАКТОРА Xa |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US10604748B2 (ru) |
| EP (2) | EP3926044A1 (ru) |
| JP (3) | JP6959268B2 (ru) |
| KR (1) | KR102373215B1 (ru) |
| CN (2) | CN116425860A (ru) |
| AU (2) | AU2017283720B2 (ru) |
| BR (1) | BR112018075964A2 (ru) |
| CA (1) | CA3027457A1 (ru) |
| CL (2) | CL2018003654A1 (ru) |
| CO (1) | CO2019000120A2 (ru) |
| DK (1) | DK3472314T3 (ru) |
| EA (1) | EA037815B1 (ru) |
| ES (1) | ES2875538T3 (ru) |
| HU (1) | HUE054597T2 (ru) |
| IL (1) | IL263591B2 (ru) |
| MX (1) | MX2018015873A (ru) |
| PE (1) | PE20190661A1 (ru) |
| PH (1) | PH12018502614A1 (ru) |
| PL (1) | PL3472314T3 (ru) |
| PT (1) | PT3472314T (ru) |
| SG (1) | SG11201810915QA (ru) |
| SI (1) | SI3472314T1 (ru) |
| WO (1) | WO2017219034A2 (ru) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3604510A1 (en) * | 2009-03-30 | 2020-02-05 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
| EP2948168B1 (en) * | 2013-01-24 | 2018-07-18 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Inhibition of tissue factor pathway inhibitor with factor xa derivatives |
| DK3472314T3 (da) * | 2016-06-17 | 2021-07-26 | Alexion Pharma Inc | Fremstilling af faktor-xa-derivater |
| EP3810187A4 (en) * | 2018-06-19 | 2022-08-31 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | ANTIDOTES FOR FACTOR XA INHIBITORS |
| KR102337683B1 (ko) * | 2018-09-21 | 2021-12-13 | 주식회사 녹십자 | 고효율 항-tfpi 항체 조성물 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5189019A (en) * | 1990-04-23 | 1993-02-23 | Merck & Co., Inc. | Antistasin derived anticoagulant protein |
| US5589571A (en) * | 1994-10-28 | 1996-12-31 | Cor Therapeutics, Inc. | Process for production of inhibited forms of activated blood factors |
| WO2014116275A1 (en) * | 2013-01-24 | 2014-07-31 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | INHIBITION OF TISSUE FACTOR PATHWAY INHIBITOR WITH FACTOR Xa DERIVATIVES |
| US20150025011A1 (en) * | 2009-07-15 | 2015-01-22 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Unit dose formulation of antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH1066572A (ja) * | 1996-08-29 | 1998-03-10 | Showa Sangyo Co Ltd | 高純度の大豆トリプシンインヒビターの製造方法 |
| DK1259485T3 (da) | 2000-02-29 | 2006-04-10 | Millennium Pharm Inc | Benzamider og beslægtede inhibitorer for faktor Xa |
| PE20070717A1 (es) | 2005-11-08 | 2007-08-17 | Millennium Pharm Inc | Sal de maleato y polimorfo de [2-({4-[(dimetilamino)iminometil]fenil}carbonilamino)-5-metoxifenil]-n-(5-cloro-(2-piridil))carboxamida |
| EP2915564B1 (en) | 2007-09-28 | 2020-11-04 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes for factor XA inhibitors and methods of using the same |
| EP2364165B1 (en) | 2008-11-14 | 2018-01-03 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same in combination with blood coagulating agents |
| EP3604510A1 (en) | 2009-03-30 | 2020-02-05 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
| KR102100629B1 (ko) * | 2012-06-14 | 2020-04-16 | 포톨라 파마슈티컬스, 인코포레이티드 | 재조합 인자 Xa 유도체의 정제방법 |
| US20140346397A1 (en) * | 2012-12-27 | 2014-11-27 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Compounds and methods for purification of serine proteases |
| MY173548A (en) * | 2013-09-24 | 2020-02-04 | Pfizer | Fxa variant compositions |
| CN107073082B (zh) * | 2014-08-20 | 2021-04-30 | 博尔托拉制药公司 | Xa因子解毒剂的冻干制剂 |
| DK3472314T3 (da) * | 2016-06-17 | 2021-07-26 | Alexion Pharma Inc | Fremstilling af faktor-xa-derivater |
-
2017
- 2017-06-19 DK DK17814267.5T patent/DK3472314T3/da active
- 2017-06-19 EP EP21164923.1A patent/EP3926044A1/en active Pending
- 2017-06-19 CN CN202310427500.2A patent/CN116425860A/zh active Pending
- 2017-06-19 US US15/626,813 patent/US10604748B2/en active Active
- 2017-06-19 SG SG11201810915QA patent/SG11201810915QA/en unknown
- 2017-06-19 WO PCT/US2017/038169 patent/WO2017219034A2/en unknown
- 2017-06-19 SI SI201730865T patent/SI3472314T1/sl unknown
- 2017-06-19 EP EP17814267.5A patent/EP3472314B1/en active Active
- 2017-06-19 IL IL263591A patent/IL263591B2/en unknown
- 2017-06-19 MX MX2018015873A patent/MX2018015873A/es unknown
- 2017-06-19 AU AU2017283720A patent/AU2017283720B2/en active Active
- 2017-06-19 BR BR112018075964-3A patent/BR112018075964A2/pt unknown
- 2017-06-19 PE PE2018003241A patent/PE20190661A1/es unknown
- 2017-06-19 HU HUE17814267A patent/HUE054597T2/hu unknown
- 2017-06-19 PL PL17814267T patent/PL3472314T3/pl unknown
- 2017-06-19 JP JP2018565888A patent/JP6959268B2/ja active Active
- 2017-06-19 CN CN201780041530.2A patent/CN110167575B/zh active Active
- 2017-06-19 KR KR1020197000840A patent/KR102373215B1/ko active IP Right Grant
- 2017-06-19 ES ES17814267T patent/ES2875538T3/es active Active
- 2017-06-19 EA EA201990052A patent/EA037815B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2017-06-19 CA CA3027457A patent/CA3027457A1/en active Pending
- 2017-06-19 PT PT178142675T patent/PT3472314T/pt unknown
-
2018
- 2018-12-11 PH PH12018502614A patent/PH12018502614A1/en unknown
- 2018-12-17 CL CL2018003654A patent/CL2018003654A1/es unknown
-
2019
- 2019-01-09 CO CONC2019/0000120A patent/CO2019000120A2/es unknown
-
2020
- 2020-01-10 US US16/740,001 patent/US10954504B2/en active Active
- 2020-06-25 CL CL2020001733A patent/CL2020001733A1/es unknown
-
2021
- 2021-03-09 US US17/196,172 patent/US11845966B2/en active Active
- 2021-10-07 JP JP2021165271A patent/JP7273918B2/ja active Active
-
2023
- 2023-02-14 AU AU2023200825A patent/AU2023200825A1/en active Pending
- 2023-04-28 JP JP2023074627A patent/JP2023086970A/ja active Pending
- 2023-11-08 US US18/505,022 patent/US20240076642A1/en active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5189019A (en) * | 1990-04-23 | 1993-02-23 | Merck & Co., Inc. | Antistasin derived anticoagulant protein |
| US5589571A (en) * | 1994-10-28 | 1996-12-31 | Cor Therapeutics, Inc. | Process for production of inhibited forms of activated blood factors |
| US20150025011A1 (en) * | 2009-07-15 | 2015-01-22 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | Unit dose formulation of antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same |
| WO2014116275A1 (en) * | 2013-01-24 | 2014-07-31 | Portola Pharmaceuticals, Inc. | INHIBITION OF TISSUE FACTOR PATHWAY INHIBITOR WITH FACTOR Xa DERIVATIVES |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| JUSTESEN et al. "Recombinant chymosin used for exact and complete removal of a prochymosin derived fusion tag releasing intact native target protein," Protein Science, 16 March 2009 (16.03.2009), Vol. 18, Pgs. 1023-1032, entire document * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11845966B2 (en) | Preparation of factor Xa derivatives | |
| JP7000394B2 (ja) | 補因子の非存在下で凝固活性を有する、及び／又は、第ｉｘ因子凝固活性が増加した第ｉｘ因子変異体、並びに、出血性疾患を処置するためのその使用 | |
| JP5037331B2 (ja) | 出血性障害の処置のための第ｉｘａ因子 | |
| CA2767858C (en) | Unit dose formulation of antidotes for factor xa inhibitors and methods of using the same | |
| EA002149B1 (ru) | Улучшенные способы приготовления активированного белка с | |
| US20050181978A1 (en) | Therapeutic use of factor XI | |
| JP2024056926A (ja) | 第Ｘａ因子阻害剤に対する解毒剤 | |
| CN110612350A (zh) | 源自血液的谷氨酸-纤溶酶原的制备和使用 | |
| US8822654B2 (en) | Mutated antithrombins, a process for preparing the same and their use as drugs | |
| CA2540986A1 (en) | Therapeutic use of factor xi | |
| EP3419650B1 (en) | Lyophilized formulations for factor xa antidote | |
| JP2007068497A (ja) | プラスミンの精製法 | |
| CZ373799A3 (cs) | Zlepšené způsoby zpracování aktivovaného proteinu C | |
| JP2008189574A (ja) | 膵島移植補助薬剤 | |
| MXPA06005477A (en) | Therapeutic use of factor xi |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM |