EA035397B1

EA035397B1 - Мутантные гены протопорфириноген ix оксидазы (ppx)

Info

Publication number: EA035397B1
Application number: EA201390034A
Authority: EA
Inventors: Грегори Ф.В. Гокал; Питер Р. Битем; Аура Де Шопке; Сара Дамм; Джеймс Пирс; Кристиан Шопке; Кейт А. Волкер
Original assignee: Сибас Юс Ллс; Сибас Юроп Б.В.
Priority date: 2010-08-03
Filing date: 2011-08-02
Publication date: 2020-06-05
Also published as: JP6396958B2; DK2600710T3; WO2012018862A3; CL2013000341A1; CA3084764C; CN107384911A; BR112013002543A2; CN103327809A; LT2600710T; JP6965219B2; KR20130093615A; ES2688285T3; IL294685A; MX348704B; SI2600710T1; MX2020011389A; EP3441469A1; MX2013001299A; EP2600710A2; KR101920503B1

Abstract

Предложены композиции и способы, относящиеся к генным и/или белковым мутациям трансгенных или нетрансгенных растений. Согласно некоторым вариантам реализации изобретение относится к мутациям гена протопорфириногена IX (РРХ). Согласно некоторым вариантам реализации изобретение относится к устойчивым к гербицидам растениям.

Description

Область техники

Настоящее изобретение относится по меньшей мере отчасти к мутациям генов и/или белков растений.

Уровень техники

Следующее описание приведено исключительно для облегчения понимания настоящего изобретения и не предназначено для описания или представления известного уровня техники.

Известны примеры некоторых мутаций в генах PPX растений. Например, в патенте США № 5767373 описаны эукариотические последовательности ДНК, кодирующие нативную протопорфириноген оксидазу (протокс) или модифицированные формы указанного фермента, толерантные к гербицидам; в патенте США № 6282837 описаны эукариотические последовательности ДНК, кодирующие нативную протопорфириноген оксидазу (протокс) или модифицированные формы указанного фермента, толерантные к гербицидам, и способ контролирования сорных растений с применением растений с измененной активностью протокса, придающей толерантность к гербицидам; в патенте США № 6308458 описаны способы контролирования роста нежелательной растительности, включающие применение эффективного количества протокс-ингибирующего гербицида к популяции трансгенных растений или семян растений, трансформированных последовательностью ДНК, кодирующей модифицированный протокс-фермент, толерантный к протокс-ингибирующему гербициду, или к локусу, где культивируется популяция указанных трансгенных растений или семян растений; в патенте США № 6905852 описана протопорфириноген оксидаза, толерантная к фотообесцвечивающему гербициду и его производным, содержащая полипептид с аминокислотной последовательностью, представленной SEQ ID NO: 2 [белок РРХ], или мутантные пептиды, полученные из последней путем делеции, добавления, замены и т.д. одной или более аминокислоты вышеуказанной аминокислотной последовательности и обладающие активностью, по существу эквивалентной таковой протопорфириноген оксидазы; в патенте США № описаны способы придания устойчивости к протопорфириноген ингибирующим гербицидам сельскохозяйственным растениям. Устойчивость придают посредством генной инженерии указанных растений для экспрессирования ими клонированной ДНК, кодирующей протопорфириноген оксидазу, устойчивую к порфировым гербицидам; в опубликованной заявке на патент США № 20020086395 описан способ оценки способности соединения ингибировать активность протопорфириноген оксидазы, который включает этапы (1) культивирования трансформанта, экспрессирующего ген протопорфириноген оксидазы, присутствующий во фрагменте ДНК, в среде, по существу не содержащей протогемных соединений в каждой сравнительной системе в присутствии и в отсутствие тестируемого соединения для оценки скорости роста указанного трансформанта при каждом условии; указанный трансформант происходит из хозяйской клетки с недостаточной способностью к росту на основе активности протопорфириноген оксидазы, трансформированной фрагментом ДНК, в котором промотор, способный функционировать в указанной хозяйской клетке, и ген протопорфириноген оксидазы функционально связаны; и (2) определения способности указанного соединения ингибировать активность протопорфириноген оксидазы путем сравнения скоростей роста; и т.п.; у Patzoldt W.L., et al., PNAS USA, 103:12329-34 (2006) описано делеция 3 п.о., соответствующих кодону G210 РРХ; и у Li X., et al., Plant Physiology 133:736-47 (2003) описано выделение растительных генов протопорфириноген оксидазы (РРО) и выделение устойчивых к гербицидам мутантов. Термины РРО и PPX используются в настоящем орисании взаимозаменяемо.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение относится по меньшей мере отчасти к способам и композициям в области мутаций генов и белков растений. Согласно некоторым аспектам вариантам реализации настоящее изобретение также может относиться к композициям и способам получения устойчивых к гербицидам растений. Способы и композиции, раскрытые в настоящем описании, относятся по меньшей мере отчасти к мутациям гена протопорфириноген IX оксидазы (РРХ).

Согласно одному аспекту предложено(а) растение или растительная клетка, содержащее(ая) мутантный ген РРХ. Согласно некоторым вариантам реализации указанный мутантный ген PPX кодирует мутантный белок РРХ. Согласно некоторым вариантам реализации растение, содержащее растительную клетку, которая содержит мутантный ген PPX, может быть устойчиво к гербицидам, например устойчиво к ингибирующему PPX гербициду. Согласно некоторым вариантам реализации указанное растение или указанная растительная клетка являются нетрансгенными. Согласно некоторым вариантам реализации указанное растение или указанная растительная клетка являются трансгенными. В настоящем изобретении также предложены рекомбинантные векторы, содержащие такие мутантные гены PPX, а также трансгенные растения, содержащие такие мутантные гены РРХ.

В настоящем описании термин ген РРХ относится к последовательности ДНК, способной производить полипептид PPX, обладающий аминокислотной гомологией и/или идентичностью с последовательностью аминокислот SEQ ID NO: 1, и/или кодирует белок, проявляющий активность РРХ. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ген PPX на 70; 75; 80; 85; 90; 95; 96; 97; 98; 99 или на 100% идентичен конкретному гену РРХ, например митохондриальным генам PPX Рассет Бербанк, например StmPPX1 или StmPPX2; или, например, пластидному гену PPX Рассет Бербанк, например StcPPX1. Согласно некоторым вариантам реализации указанный ген PPX на 60; 70; 75; 80; 85; 90; 95; 96; 97; 98; 99

- 1 035397 или на 100% идентичен последовательности, выбранной из последовательностей на фиг. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 41, 43 и 45. Согласно некоторым вариантам реализации ген PPX представляет собой митохондриальный ген РРХ, например StmPPX1 или StmPPX2. Согласно некоторым вариантам реализации ген PPX представляет собой пластидный ген РРХ, например StcPPX1. Согласно некоторым вариантам реализации ген PPX представляет собой аллель митохондриального гена РРХ, например StmPPX2.1 или StmPPX2.2. Согласно некоторым вариантам реализации ген PPX представляет собой аллель пластидного гена РРХ, например StcPPX1 или StcPPX1.1. У некоторых растений, таких как посконник коноплевый, белковый продукт одного гена PPX является и митохондриальным и пластидным согласно описанию у Patzoldt W.L., et al., PNAS USA, 103:12329-34 (2006).

В настоящем описании термин мутация относится к изменению по меньшей мере одного нуклеотида в последовательности нуклеиновой кислоты и/или изменению одиночной аминокислоты в полипептиде по сравнению с нормальной последовательностью, или последовательностью дикого типа, или эталонной последовательностью, например SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 2. Согласно некоторым вариантам реализации мутация относится к изменению по меньшей мере одного нуклеотида в последовательности нуклеиновой кислоты и/или изменению одной аминокислоты в полипептиде по сравнению с нуклеотидной или аминокислотной последовательностью белка PPX, не устойчивого к гербицидам. Согласно некоторым вариантам реализации мутация может включать замену, делецию, инверсию или вставку. Согласно некоторым вариантам реализации замена, делеция, вставка или инверсия могут включать изменение по 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 нуклеотидам. Согласно некоторым вариантам реализации замена, делеция, вставка или инверсия могут включать изменение по 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 положениям аминокислот. Термин нуклеиновая кислота или последовательность нуклеиновой кислоты относится к олигонуклеотиду, нуклеотиду или полинуклеотиду и их фрагментам или частям, которые могут быть одноцепочечными либо двуцепочечными и представлять смысловую или антисмысловую нить. Нуклеиновая кислота может включать ДНК или РНК и может быть природного или синтетического происхождения. Например, нуклеиновая кислота может включать мРНК или кДНК. Нуклеиновая кислота может включать нуклеиновую кислоту, которая была амплифицирована (например, с применением полимеразной цепной реакции). Для указания мутации, приводящей к замене нуклеотида дикого типа NTwt в положении ### в нуклеиновой кислоте мутантным NTmut, используют выражение NTwt###NTmut. Однобуквенный код для обозначения нуклеотидов соответствует описанному в Руководстве по порядку патентной экспертизы патентного ведомства США (U.S. Patent Office Manual of Patent Examining Procedure), раздел 2422, табл. 1. Соответственно, обозначение нуклеотида R означает пурин, такой как гуанин или аденин, Y означает пиримидин, такой как цитозин или тимин (урацил в случае РНК); M означает аденин или цитозин; K означает гуанин или тимин; и W означает аденин или тимин.

В настоящем описании термин мутантный ген РРХ относится к гену PPX, содержащему одну или более мутаций по положениям нуклеотидов относительно эталонной последовательности нуклеиновой кислоты РРХ. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит одну или более мутацию по сравнению с соответствующей последовательностью PPX дикого типа. В настоящем описании термин дикий тип может применяться для обозначения стандартной аллели в локусе либо аллели, встречающейся с наибольшей частотой в конкретной популяции. В некоторых случаях аллель дикого типа может быть представлена определенной аминокислотной или нуклеиново-кислотной последовательностью. Например, пластидный белок PPX картофеля дикого типа может быть представлен SEQ ID NO: 7. Например, митохондриальный белок PPX картофеля дикого типа может быть представлен SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит одну или более мутаций по сравнению с эталонной последовательностью нуклеиновой кислоты PPX, например SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 41, 43 или 45; или в гомологичных положениях их паралогов. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX модифицирован посредством по меньшей мере одной мутации. Согласно другим вариантам реализации мутантный ген PPX модифицирован посредством по меньшей мере двух мутаций. Согласно другим вариантам реализации мутантный ген PPX модифицирован посредством по меньшей мере трех мутаций. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок РРХ. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX включает две или более мутации последовательности нуклеиновой кислоты, выбранные из табл. 2, 3A и 3B. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует один или более мутантный митохондриальный белок РРХ. Согласно другим вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует один или более мутантный пластидный белок РРХ. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX представляет собой мутантный митохондриальный ген РРХ, например мутантный StmPPX1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX представляет собой мутантный митохондриальный ген РРХ, например мутантный StmPPX2. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX представляет собой мутантный пластидный ген РРХ, например мутантный StcPPX1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX представляет собой аллель мутантного митохондриального гена РРХ, например мутантного StmPPX2.1 или мутантного StmPPX2.2. Согласно некоторым вариантам реализации

- 2 035397 мутантный ген PPX представляет собой аллель мутантного пластидного гена РРХ, например мутантного StcPPXl или мутантного StcPPX1.1. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере одна мутация присутствует в пластидном гене PPX и по меньшей мере одна мутация присутствует в митохондриальном гене РРХ. Согласно некоторым вариантам реализации одна или более мутаций в гене PPX приводят к гербицидоустойчивости, например устойчивости к ингибирующему PPX гербициду. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который повышает устойчивость к одному или более гербицидам по сравнению с эталонным белком РРХ. Согласно некоторым вариантам реализации указанные мутации в мутантном гене PPX кодируют белок, содержащий комбинацию двух или более мутаций. Согласно некоторым вариантам реализации по меньшей мере одна мутация присутствует в пластидном гене PPX и по меньшей мере одна мутация присутствует в митохондриальном гене РРХ. Согласно некоторым вариантам реализации указанные комбинации выбраны из табл. 4A и 4B. Согласно некоторым вариантам реализации указанные мутации в мутантный ген PPX кодируют белок, содержащий комбинацию трех или более мутаций, например комбинации, выбранные из табл. 4A и 4B. Согласно некоторым вариантам реализации указанная по меньшей мере одна мутация в пластидном гене PPX и указанная по меньшей мере одна мутация в митохондриальном гене PPX располагаются в одном и том же соответствующем положении. Согласно другим вариантам реализации указанная по меньшей мере одна мутация в пластидном гене PPX и указанная по меньшей мере одна мутация в митохондриальном гене PPX располагаются в разных соответствующих положениях.

В настоящем описании термин белок РРХ относится к белку, который гомологичен и/или идентичен аминокислотным последовательностям белка PPX, SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 40, 42 или 44; и/или проявляет активность РРХ. Согласно некоторым вариантам реализации указанный белок PPX на 70; 75; 80; 85; 90; 95; 96; 97; 98; 99 или на 100% идентичен конкретному белку PPX, такому как, например, митохондриальный белок PPX Рассет Бербанк или пластидные белки PPX Рассет Бербанк. Согласно некоторым вариантам реализации белок PPX на 70; 75; 80; 85; 90; 95; 96; 97; 98; 99 или на 100% идентичен последовательности, выбранной из последовательностей на фиг. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 40, 42 или 44. В настоящем описании термин мутантный белок РРХ относится к белку PPX, содержащему одну или более мутаций по положениям аминокислот относительно эталонной аминокислотной последовательности PPX, или по гомологичным положениям ее паралогов. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит одну или более мутаций по сравнению с эталонной аминокислотной последовательностью PPX, например эталонной последовательностью аминокислот PPX, соответствующей последовательностям SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 40, 42 или 44, либо их частям. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит одну или более мутацию по сравнению с соответствующим белком дикого типа. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит одну или более мутацию по сравнению с соответствующим белком, не являющимся устойчивым к гербицидам. Согласно некоторым вариантам реализации указанный белок PPX модифицирован посредством по меньшей мере одной мутации. Согласно другим вариантам реализации указанный белок PPX модифицирован посредством по меньшей мере двух мутаций. Согласно другим вариантам реализации указанный белок PPX модифицирован посредством по меньшей мере трех мутаций. Согласно некоторым вариантам реализации один или более митохондриальный белок PPX мутирован. Согласно другим вариантам реализации один или более пластидный белок PPX мутирован. Согласно еще одному варианту реализации один или более митохондриальный белок PPX и один или более пластидный белок PPX мутированы. Согласно некоторым вариантам реализации термин мутантный белок РРХ относится к белку PPX, обладающему повышенной устойчивостью к одному или более гербицидам по сравнению с эталонным белком.

Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в одном или более положениях аминокислот, соответствующих положению, выбранному из группы, состоящей из 52, 85, 105, 111, 130, 139, 143, 144, 145, 147, 165, 167, 170, 180, 185, 192, 193, 199, 206, 212, 219, 220, 221, 226, 228, 229, 230, 237, 244, 256, 257, 270, 271, 272, 305, 311, 316, 318, 332, 343, 354, 357, 359, 360, 366, 393, 403, 424, 426, 430, 438, 440, 444, 455, 457, 470, 478, 483, 484, 485, 487, 490, 503, 508 и 525 последовательности SEQ ID NO: 1.

Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в одном или более положениях аминокислот, соответствующих положению, выбранному из группы, состоящей из 58, 64, 74, 84, 93, 97, 98, 101, 119, 121, 124, 139, 150 151, 157, 164, 170, 177, 187, 188, 195, 214, 215, 229, 230, 271, 274, 278, 283, 292, 296, 307, 324, 330, 396, 404, 406, 410, 421, 423, 434, 447, 448, 449, 451, 454, 465, 470 и 500 последовательности SEQ ID NO: 9.

Согласно некоторым вариантам реализации растение или растительная клетка могут содержать мутантный ген протопорфириноген IX оксидазы (РРХ), причем указанный ген кодирует белок, содержащий мутацию в одном или более положениях аминокислот, соответствующих положению, выбранному из группы, состоящей из G52, N85, N105, E111, G130, D139, Р143, R144, F145, L147, F165, L167, I170, А180, Р185, Е192, S193, R199, V206, Е212, Y219, А220, G221, L226, М228, K229, А230, K237, S244, R256,

- 3 035397

R257, K270, Р271, Q272, S305, Е311, Т316, T318, S332, S343, А354, L357, K359, L360, А366, L393, L403,

L424, Y426, S430, K438, Е440, V444, L455, K457, V470, F478, F483, D484, I485, D487, K490, L503, V508 и

I525 последовательности SEQ ID NO: 1.

Согласно некоторым вариантам реализации растение или растительная клетка могут содержать мутантный ген протопорфириноген IX оксидазы (РРХ), отличающийся тем, что указанный ген кодирует белок, содержащий мутацию в одном или более положениях аминокислот, соответствующих положению, выбранному из группы, состоящей из D58, Е64, G74, G84, L93, K97, K98, А101, S119, F121, Т124, N139, Е150, S151, Q157, V164, D170, С177, Н187, L188, N195, Р214, I215, K229, K230, С271, D274, F283, А292, S296, С307, N324, D330, S396, А404, R406, K410, L421, А423, С434, D447, S448, V449, D451, D454, Y465, K470 и Т500 последовательности SEQ ID NO: 9.

Согласно некоторым вариантам реализации белок PPX представляет собой паралог белка PPX Arabidopsis thaliana (например, указанный белок PPX может представлять собой пластидный белок PPX картофеля) и указанный белок PPX может содержать N в положении, соответствующем положению 52 последовательности SEQ ID NO: 1, причем указанный N заменен на аминокислоту, отличную от N; K в положении, соответствующем положению 272 последовательности SEQ ID NO: 1, причем указанный K заменен на аминокислоту, отличную от K; S в положении, соответствующем положению 359 последовательности SEQ ID NO: 1, причем указанный S заменен на аминокислоту, отличную от S; и/или S в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 1, причем указанный S заменен на аминокислоту, отличную от S.

Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX включает две или более мутации, по меньшей мере одна из которых находится в положении аминокислоты, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из G52, N85, N105, Е111, G130, D139, Р143, R144, F145, L147, F165, L167, I170, А180, Р185, Е192, S193, R199, V206, Е212, Y219, А220, G221, L226, М228, K229, А230, K237, S244, R256, R257, K270, Р271, Q272, S305, Е311, Т316, T318, S332, S343, А354, L357, K359, L360, А366, L393, L403, L424, Y426, S430, K438, Е440, V444, L455, K457, V470, F478, F483, D484, I485, D487, K490, L503, V508 и I525 последовательности SEQ ID NO: 1.

Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX включает две или более мутации, по меньшей мере одна из которых находится в положении аминокислоты, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из D58, Е64, G74, G84, L93, K97, K98, А101, S119, F121, Т124, N139, Е150, S151, Q157, V164, D170, С177, Н187, L188, N195, Р214, I215, K229, K230, С271, D274, F283, А292, S296, С307, N324, D330, S396, А404, R406, K410, L421, А423, С434, D447, S448, V449, D451, D454, Y465, K470 и Т500 последовательности SEQ ID NO: 9.

Согласно некоторым вариантам реализации белок PPX представляет собой паралог белка PPX Arabidopsis thaliana (например, белок PPX может представлять собой пластидный белок PPX картофеля); указанный белок PPX содержит две или более мутации и одно или более из (1) N в положении, соответствующем положению 52 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный N заменен на аминокислоту, отличную от N; (2) K в положении, соответствующем положению 272 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный K заменен на аминокислоту, отличную от K; (3) S в положении, соответствующем положению 359 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный S заменен на аминокислоту, отличную от S; и/или (4) S в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный S заменен на аминокислоту, отличную от S.

Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX включает три или более мутации, по меньшей мере одна из которых находится в положении аминокислоты, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из G52, N85, N105, E111, G130, D139, Р143, R144, F145, L147, F165, L167, I170, А180, Р185, Е192, S193, R199, V206, Е212, Y219, А220, G221, L226, М228, K229, А230, K237, S244, R256, R257, K270, Р271, Q272, S305, Е311, Т316, T318, S332, S343, А354, L357, K359, L360, А366, L393, L403, L424, Y426, S430, K438, Е440, V444, L455, K457, V470, F478, F483, D484, I485, D487, K490, L503, V508 и I525 последовательности SEQ ID NO: 1.

Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX включает три или более мутации, по меньшей мере одна из которых находится в положении аминокислоты, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из D58, Е64, G74, G84, L93, K97, K98, А101, S119, F121, Т124, N139, Е150, S151, Q157, V164, D170, С177, Н187, L188, N195, Р214, I215, K229, K230, С271, D274, F283, А292, S296, С307, N324, D330, S396, А404, R406, K410, L421, А423, С434, D447, S448, V449, D451, D454, Y465, K470 и Т500 последовательности SEQ ID NO: 9.

Согласно некоторым вариантам реализации белок PPX представляет собой паралог белка PPX Arabidopsis thaliana (например, белок PPX может представлять собой белок PPX картофеля); указанный белок PPX содержит три или более мутации и одно или более из (1) N в положении, соответствующем положению 52 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный N заменен на аминокислоту, отличную от N; (2) K в положении, соответствующем положению 272 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный K заменен на аминокислоту, отличную от K; (3) S в положении, соответствующем положению 359 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный S заменен на аминокислоту, отличную от S; и/или (4) S в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный

- 4 035397

S заменен на аминокислоту, отличную от S.

В соответствии с описанными аспектами, вариантами реализации, композициями и способами мутантный белок PPX содержит одну или более мутацию аминокислот, выбранную из табл. 1, 2, 3A, 3B, 4A, 4B, 8A-F, 9A-D и 10. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX включает две или более мутации аминокислот, выбранные из табл. 1, 2, 3A, 3B, 4A, 4B, 8A-F, 9A-D и 10. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX включает три или более мутации аминокислот, выбранные из табл. 1, 2, 3A, 3B, 4A, 4B, 8A-F, 9A-D и 10. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит одну или более мутаций последовательности нуклеиновой кислоты, выбранных из табл. 2, 3A и 3B.

Согласно некоторым вариантам реализации указанная одна или более мутаций мутантного белка PPX включает одну или более мутацию, две или более мутации или три или более мутации, выбранные из группы, состоящей из замены глицин^лизин в положении, соответствующем положению 52 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены глутаминовая кислота^валин в положении, соответствующем положению 111 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены глицин ^аспарагин в положении, соответствующем положению 130 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аспарагиновая кислота^гистидин в положении, соответствующем положению 139 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены пролин^аргинин в положении, соответствующем положению 143 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аргинина цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аргинин^-клейцин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аргинина гистидин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены фенилаланин^клейцин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены фенилаланин^тирозин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лейцина валин в положении, соответствующем положению 147 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены фенилаланин^аспарагин в положении, соответствующем положению 165 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аланин^треонин в положении, соответствующем положению 180 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены пролин^аргинин в положении, соответствующем положению 185 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены пролина гистидин в положении, соответствующем положению 185 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены пролин^тирозин в положении, соответствующем положению 185 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены глутаминовая кислота^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 192 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены глутаминовая кислотам лизин в положении, соответствующем положению 192 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены серин^треонин в положении, соответствующем положению 193 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аргинина лейцин в положении, соответствующем положению 199 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены валин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 206 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены тирозин^серин в положении, соответствующем положению 219 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аланин^цистеин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1;

- 5 035397 замены аланин^изолейцин в положении, соответствующем положению 220 последовательности

SEQ ID NO: 1;

замены аланин^· лейцин в положении, соответствующем положению 220 последовательности

SEQ ID NO: 1;

замены аланин^треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аланин^валин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены метионин^лейцин в положении, соответствующем положению 228 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лизин^глутамин в положении, соответствующем положению 229 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аланин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 230 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены серин^глицин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены серин^треонин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аргинин^гистидин в положении, соответствующем положению 256 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аргинин^серин в положении, соответствующем положению 256 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лизин^глутаминовая кислота в положении, соответствующем положению 270 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лизин^глутамин в положении, соответствующем положению 270 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены пролин^аргинин в положении, соответствующем положению 271 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены глутамин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 272 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены серина лейцин в положении, соответствующем положению 305 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены глутаминовая кислота^аргинин в положении, соответствующем положению 311 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены SEQ ID NO: 1	треонин^глицин в ;	положении, соответствующем	положению	316	последовательности
замены SEQ ID NO: 1	треонин^глицин в ;	положении, соответствующем	положению	318	последовательности
замены	серин^цистеин в	положении, соответствующем	положению	332	последовательности

SEQ ID NO: 1;

замены лейцин^изолейцин в положении, соответствующем положению 357 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лизин^аргинин в положении, соответствующем положению 359 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лизин ^треонин в положении, соответствующем положению 359 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лейцин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 360 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лейцина лизин в положении, соответствующем положению 360 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аланин^глутаминовая кислота в положении, соответствующем положению 366 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лейцин^серин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лейцина валин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1;

- 6 035397 замены лейцин^аргинин в положении, соответствующем положению 403 последовательности

SEQ ID NO: 1;

замены лейцин^серин в положении, соответствующем положению 403 последовательности

SEQ ID NO: 1;

замены лейцин^серин в положении, соответствующем положению 424 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены тирозин^цистеин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены тирозин^изолейцин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены тирозин^·лейцин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены тирозин^аргинин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены тирозин^треонин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены тирозин^валин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены серина лейцин в положении, соответствующем положению 430 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лизинг-серии в положении, соответствующем положению 438 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены глутаминовая кнслота^лизин в положении, соответствующем положению 440 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены валин^изолейцин в положении, соответствующем положению 444 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лейцин^валин в положении, соответствующем положению 455 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лизинг-валин в положении, соответствующем положению 457 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены валин^серин в положении, соответствующем положению 470 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены валин^тирозин в положении, соответствующем положению 470 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены фенилаланин^серин в положении, соответствующем положению 478 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены фенилаланин^глицин в положении, соответствующем положению 483 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аспарагиновая кислота^аланин в положении, соответствующем положению 484 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены изолейцин^глутаминовая кислота в положении, соответствующем положению 485 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аспарагиновая кислота^глицин в положении, соответствующем положению 487 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лизинг-аспарагин в положении, соответствующем положению 490 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лейцин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 503 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены валин^треонин в положении, соответствующем положению 508 последовательности SEQ ID NO: 1; и замены изолейцин^треонин в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 1.

Согласно некоторым вариантам реализации белок PPX представляет собой паралог белка PPX Arabidopsis thaliana (например, белок PPX может представлять собой белок PPX картофеля); указанный белок PPX может содержать N в положении, соответствующем положению 52 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный N заменен на аминокислоту, отличную от N; K в положении, соответст- 7 035397 вующем положению 272 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный K заменен на аминокислоту, отличную от K; S в положении, соответствующем положению 359 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный S заменен на аминокислоту, отличную от S; и/или S в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный S заменен на аминокислоту, отличную от S.

Согласно подобным вариантам реализации указанная одна или более мутаций в мутантном белке PPX включает одну или более мутацию, две или более мутации или три или более мутации, выбранные из группы, состоящей из замены аспарагин^лизин в положении, соответствующем положению 52 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аргинин^· цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аргинин^гистидин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены фенилаланин^лейцин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены пролин^· гистидин в положении, соответствующем положению 185 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аланин^изолейцин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аланин^· лейцин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аланин^греонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лизинг-фенилаланин в положении, соответствующем положению 272 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены серина-цистеин в положении, соответствующем положению 332 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены серин^аргинин в положении, соответствующем положению 359 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены серин^-треонин в положении, соответствующем положению 359 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лейцин ^-серин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лейцина валин в положении, соответствующем положению 393 последовательности

- 8 035397

SEQ ID NO: 1;

замены лейцин^аргинин в положении, соответствующем положению 403 последовательности

SEQ ID NO: 1;

замены тирозин ^-фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены тирозин^лейцин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены изолейцин^треонин в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аспарагиновая кислота^аспарагин в положении, соответствующем положению 58 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены глутаминовая кислота^валин в положении, соответствующем положению 64 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены глицина цистеин в положении, соответствующем положению 74 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены глицин^аспарагин в положении, соответствующем положению 84 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены лейцин^гистидин в положении, соответствующем положению 93 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены лизинг-аргинин в положении, соответствующем положению 97 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены аргинин^гистидин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены аргинин^лейцин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO:9;

замены аланин^валин в положении, соответствующем положению 101 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены серин^аспарагин в положении, соответствующем положению 119 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены фенилаланина-лейцин в положении, соответствующем положению 121 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены треонин^изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены аспарагин^тирозин в положении, соответствующем положению 139 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены аспарагин^аргинин в положении, соответствующем положению 139 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены аспарагина гистидин в положении, соответствующем положению 139 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены глутаминовая кислота^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению

- 9 035397

150 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены глутаминовая кислотам лизин в положении, соответствующем положению 150 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены серин^-треонин в положении, соответствующем положению 151 последовательности

SEQ ID NO: 9;

замены глутамина лейцин в положении, соответствующем положению 157 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены валин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 164 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены валин^аланин в положении, соответствующем положению 164 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены аспарагиновая^глутаминовая кислота в положении, соответствующем положению 170 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены цистеин^серин в положении, соответствующем положению 177 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены гистидин^глутамин в положении, соответствующем положению 187 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены лейцин ^-фенилаланин в положении, соответствующем положению 188 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены аспарагина лизин в положении, соответствующем положению 195 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены пролин^серин в положении, соответствующем положению 214 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены пролина гистидин в положении, соответствующем положению 214 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены изолейцин^серин в положении, соответствующем положению 215 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены изолейцин^гистидин в положении, соответствующем положению 215 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены лизин^глутаминовая кислота в положении, соответствующем положению 229 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены лизинг-аргинин в положении, соответствующем положению 230 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены цистеина аргинин в положении, соответствующем положению 271 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены аспарагиновая кислота^глицин в положении, соответствующем положению 274 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены фенилаланин^глицин в положении, соответствующем положению 283 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены аланин^глицин в положении, соответствующем положению 292 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены серина лейцин в положении, соответствующем положению 296 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены цистеин^серин в положении, соответствующем положению 307 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 324 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены аспарагина лизин в положении, соответствующем положению 324 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены аспарагиновая^глутаминовая кислота в положении, соответствующем положению 330 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены серина лейцин в положении, соответствующем положению 396 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены аланин^серин в положении, соответствующем положению 404 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены аргинин^лизин в положении, соответствующем положению 406 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены лизинг изолейцин в положении, соответствующем положению 410 последовательности

- 10 035397

SEQ ID NO: 9;

замены лейцина валин в положении, соответствующем положению 421 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены аланин^валин в положении, соответствующем положению 423 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены цистеин^серин в положении, соответствующем положению 434 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены цистеин^тирозин в положении, соответствующем положению 434 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены аспарагиновая кнслота^глицин в положении, соответствующем положению 447 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены серин^аланин в положении, соответствующем положению 448 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены валин^глутаминовая кислота в положении, соответствующем положению 449 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены аспарагиновая кнслота^глицин в положении, соответствующем положению 451 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены аспарагиновая кнслота^аспарагин в положении, соответствующем положению 454 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 465 последовательности SEQ ID NO: 9;

замены лизин^треонин в положении, соответствующем положению 470 последовательности SEQ ID NO: 9; и замены треонин^серин в положении, соответствующем положению 500 последовательности SEQ ID NO: 9.

В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями, согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX может содержать комбинацию мутаций, например комбинацию мутаций, выбранных из табл. 4A и 4B. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит комбинацию двух или более мутаций, например комбинации, выбранные из табл. 4a и 4b. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит комбинацию трех или более мутаций, например комбинации, выбранные из табл. 4A и 4B. Согласно некоторым вариантам реализации указанная комбинация мутаций в мутантном гене PPX кодирует белок, содержащий мутацию в положении, соответствующем Y426 последовательности SEQ ID NO: 1, и мутацию в одном или более положениях аминокислот, соответствующих положению, выбранному из группы, состоящей из N85, R144, F145, А180, А220, L226 и S244 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации указанная комбинация мутаций в мутантном гене PPX кодирует белок, содержащий мутацию в положении, соответствующем L393 последовательности SEQ ID NO: 1, и мутацию в одном или более положениях аминокислот, соответствующих положению, выбранному из группы, состоящей из R144, F145, А220, S224 и S244 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации указанная комбинация мутаций кодирует белок, содержащий мутацию в положении, соответствующем L403 последовательности SEQ ID NO: 1, и мутацию в одном или более положениях аминокислот, соответствующих положению, выбранному из группы, состоящей из F145, А220 и L226 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации указанная комбинация мутаций кодирует белок, содержащий мутацию в положении, соответствующем R144 последовательности SEQ ID NO: 1, и мутацию в одном или более положениях аминокислот, соответствующих положению, выбранному из группы, состоящей из G52, N85, А220, S244, L226, М228, K272, S332, L393, L424, Y426 и I525 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации указанная комбинация мутаций кодирует белок, содержащий мутацию в положении, соответствующем N85 последовательности SEQ ID NO: 1, и мутацию в одном или более положениях аминокислот, соответствующих положению, выбранному из группы, состоящей из R144, F145, А180, А220, L226, М228, и Q272 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации указанная комбинация мутаций кодирует белок, содержащий мутацию в положении, соответствующем L424 последовательности SEQ ID NO: 1, и мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из R144, F145, А220, L226 и L393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации указанная комбинация мутаций кодирует белок, содержащий мутацию в положении, соответствующем I525 последовательности SEQ ID NO: 1, и мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению N85, F144, F145, А180, L226 и S244 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации указанная комбинация мутаций кодирует белок, содержащий мутацию в положении, соответствующем R144 последовательности SEQ ID NO: 1, и мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению А220 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации белок PPX пред

- 11 035397 ставляет собой паралог белка PPX Arabidopsis thaliana (например, белок PPX может представлять собой белок PPX картофеля); указанный белок PPX может содержать N в положении, соответствующем положению 52 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный N заменен на аминокислоту, отличную от N; K в положении, соответствующем положению 272 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный K заменен на аминокислоту, отличную от K; S в положении, соответствующем положению 359 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный S заменен на аминокислоту, отличную от S; и/или S в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный S заменен на аминокислоту, отличную от S. Согласно подобным вариантам реализации указанный мутантный белок PPX содержит комбинацию двух или более мутации, например комбинации, выбранные из табл. 4A и 4B. Согласно подобным вариантам реализации указанный мутантный белок PPX содержит комбинацию трех или более мутаций, например комбинации, выбранные из табл. 4A и 4B. Согласно некоторым вариантам реализации указанная комбинация мутаций в мутантном гене PPX кодирует белок, содержащий мутацию в положении, соответствующем Y426 последовательности SEQ ID NO: 1, и мутацию в одном или более положениях аминокислот, соответствующих положению, выбранному из группы, состоящей из N85, R144, F145, А180, А220, L226 и S244 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации указанная комбинация мутаций в мутантном гене PPX кодирует белок, содержащий мутацию в положении, соответствующем L393 последовательности SEQ ID NO: 1, и мутацию в одном или более положениях аминокислот, соответствующих положению, выбранному из группы, состоящей из R144, F145, А220, S244 и S224 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации указанная комбинация мутаций кодирует белок, содержащий мутацию в положении, соответствующем L403 последовательности SEQ ID NO: 1, и мутацию в одном или более положениях аминокислот, соответствующих положению, выбранному из группы, состоящей из F145, А220 и L226 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации указанная комбинация мутаций кодирует белок, содержащий мутацию в положении, соответствующем R144 последовательности SEQ ID NO: 1, и мутацию в одном или более положениях аминокислот, соответствующих положению, выбранному из группы, состоящей из N52, N85, А220, S244, L226, М228, K272, S332, L393, L424, Y426 и S525 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации указанная комбинация мутаций кодирует белок, содержащий мутацию в положении, соответствующем N85 последовательности SEQ ID NO: 1, и мутацию в одном или более положениях аминокислот, соответствующих положению, выбранному из группы, состоящей из R144, F145, А180, А220, L226, М228, и K272 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации указанная комбинация мутаций кодирует белок, содержащий мутацию в положении, соответствующем L424 последовательности SEQ ID NO: 1, и мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из R144, F145, А220, L226 и L393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации указанная комбинация мутаций кодирует белок, содержащий мутацию в положении, соответствующем S525 последовательности SEQ ID NO: 1, и мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению N85, F144, F145, А180, L226 и S244 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации указанная комбинация мутаций кодирует белок, содержащий мутацию в положении, соответствующем 98 последовательности SEQ ID NO: 9, и мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из 74, 93, 97, 98, 119, 121, 124, 139, 150, 151, 164, 188, 214, 229, 230, 271, 274, 292, 307, 324, 396, 410, 423, 434, 447, 448, 451, 465, 470 и 500 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации указанная комбинация мутаций кодирует белок, содержащий мутацию в положении, соответствующем 98 последовательности SEQ ID NO: 9, и мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из 271, 274, 292, 307, 324, 330, 396, 404, 406, 410, 423, 434, 447, 448, 454, 465, 470 и 500 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации указанная комбинация мутаций кодирует белок, содержащий мутацию в положении, соответствующем 98 последовательности SEQ ID NO: 9, и мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из 307 и 423 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации указанная комбинация мутаций кодирует белок, содержащий мутацию в положении, соответствующем 98 последовательности SEQ ID NO: 9, и мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из 124, 188, 214 и 229 последовательности SEQ ID NO: 9.

В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями белок PPX может представлять собой паралог белка PPX Arabidopsis thaliana (например, белок PPX может представлять собой митохондриальный белок PPX картофеля); указанный белок PPX может содержать одну или более аминокислоту PPX, соответствующую SEQ ID NO: 9. В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями, указанная одна или более мутаций в мутантном гене PPX может кодировать мутантный белок PPX, содержащий одну или более мутацию, две или более мутации, три или более мутации, выбранные из группы, состоящей из мутантного белка PPX, который может содержать одну или более мутацию в положении аминокислоты, соответствующем одному или более по- 12 035397 ложению, выбранному из группы, состоящей из положений 58, 64, 74, 84, 93, 97, 98, 101, 119, 121, 124,

139, 150 151, 157, 164, 170, 177, 187, 188, 195, 214, 215, 229, 230, 271, 274, 278, 283, 292, 296, 307, 324,

330, 396, 404, 406, 410, 421, 423, 434, 447, 448, 449, 451, 454, 465, 470 и 500 последовательности

SEQ ID NO: 9.

В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициям, растительная клетка может содержать мутантный ген РРХ. Согласно некоторым вариантам реализации указанный мутантный ген PPX кодирует мутантный белок РРХ. Согласно некоторым вариантам реализации указанная растительная клетка может представлять собой часть устойчивого к гербицидам растения. Указанный способ может включать введение в растительную клетку олигонуклеотида репарации генов (GRON), например применение GRON с направленной мутацией в гене РРХ. Согласно некоторым вариантам реализации полученная указанным способом растительная клетка может содержать ген PPX, способный экспрессировать мутантный белок РРХ. Указанный способ также может включать идентификацию растительной клетки или растения, в том числе растительной клетки, которая (1) содержит мутантный ген PPX и/или (2) обладает нормальным ростом и/или каталитической активностью по сравнению с соответствующей растительной клеткой дикого типа. Устойчивое к гербицидам растение, содержащее растительную клетку согласно настоящей заявке, может быть определено в присутствии ингибирующего PPX гербицида. Согласно некоторым вариантам реализации указанная растительная клетка является нетрансгенной. Согласно некоторым вариантам реализации указанная растительная клетка является трансгенной. Растение, которое содержит растительную клетку согласно описанию, может представлять собой нетрансгенное или трансгенное устойчивое к гербицидам растение, например указанное(ые) растение и/или растительная клетка может(гут) содержать мутантный ген PPX, что приводит к устойчивости по меньшей мере к одному гербициду. Согласно некоторым вариантам реализации растение, содержащее растительную клетку согласно описанию в настоящем документе, может быть получено путем бесполого размножения, например, из одной или более растительных клеток или из растительной ткани, состоящей из одной или более растительных клеток, например из клубня. Согласно другим вариантам реализации растение, содержащее растительную клетку согласно описанию в настоящем документе, может быть получено путем полового размножения.

Согласно другому аспекту предложен способ получения устойчивого к гербицидам растения. Указанный способ может включать введение в растительную клетку олигонуклеотида репарации генов (GRON), например, применение GRON, сконструированных с направленной мутацией в гене РРХ. Указанный мутантный ген PPX может экспрессировать мутантный белок РРХ. Указанный способ также может включать определение растения с нормальным(и) ростом и/или каталитической активностью по сравнению с соответствующей растительной клеткой дикого типа. Указанное растение может быть определено в присутствии Ингибирующего PPX гербицида. Согласно некоторым вариантам реализации указанное растение является нетрансгенным. Указанное растение может согласно некоторым вариантам реализации представлять собой нетрансгенное устойчивое к гербицидам растение, например, указанное растение может содержать мутантный ген PPX, что приводит к устойчивости или толерантности по меньшей мере к одному гербициду.

Согласно другому аспекту предложено семя, содержащее мутантный ген РРХ. Согласно некоторым вариантам реализации указанное семя содержит мутантный ген РРХ. Согласно некоторым вариантам реализации указанный мутантный PPX кодирует мутантный белок РРХ. Согласно некоторым вариантам реализации указанный мутантный белок PPX может быть устойчив к гербициду, например ингибирующему PPX гербициду. Согласно некоторым вариантам реализации растение, выращенное из указанного семени, устойчиво по меньшей мере к одному гербициду, например ингибирующему PPX гербициду.

Согласно другому аспекту предложен способ повышения устойчивости растения к гербицидам посредством (a) скрещивания первого растения со вторым растением, где указанное первое растение содержит мутантный ген PPX, и при этом указанный ген кодирует мутантный белок РРХ; (b) скрининга популяции, полученной в результате скрещивания, на повышенную устойчивость к гербицидам, например повышенную устойчивость к ингибирующему PPX гербициду; (c) отбора представителя, полученного в результате скрещивания, имеющего повышенную устойчивость к гербицидам; и/или (d) получения семян, образующихся в результате скрещивания. Согласно некоторым вариантам реализации гибридное семя получают любым способом, например, выбранным из описанных в настоящем изобретении. Согласно некоторым вариантам реализации растения выращивают из семян, полученных любым способом, например, таким как способ, описанный в настоящем изобретении. Согласно некоторым вариантам реализации указанные растения и/или семена являются нетрансгенными. Согласно некоторым вариантам реализации указанные растения и/или семена являются трансгенными. Согласно другому аспекту предложен способ контроля сорняков на поле, содержащем растения, путем применения эффективного количества по меньшей мере одного гербицида на поле, содержащем сорняки и растения. Согласно некоторым вариантам реализации указанного способа указанный по меньшей мере один гербицид представляет собой гербицид, ингибирующий РРХ. Согласно некоторым вариантам реализации указанного способа одно или более указанное растение на поле содержит мутантный ген РРХ, например, такой как описанный в настоящем изобретении. Согласно некоторым вариантам реализации указанного способа одно или

- 13 035397 более из указанных растений на поле включает нетрансгенное или трансгенное растение, имеющее мутантный ген PPX, такой как описанный в настоящем изобретении. Согласно некоторым вариантам реализации указанный мутантный ген PPX кодирует мутантный белок РРХ. Согласно некоторым вариантам реализации еще одно из указанных растений на поле является устойчивым к гербицидам, например устойчивым к ингибирующему PPX гербициду.

Согласно другому аспекту предложена выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая белок PPX или его часть. Согласно некоторым вариантам реализации указанная выделенная нуклеиновая кислота содержит одну или более мутацию гена PPX, такую как описанные в настоящем изобретении. Согласно некоторым вариантам реализации указанная выделенная нуклеиновая кислота кодирует мутантный белок PPX согласно описанию в настоящем документе. Согласно некоторым вариантам реализации указанная выделенная нуклеиновая кислота кодирует белок PPX, который является устойчивым к гербицидам, например устойчивым к ингибирующему PPX гербициду. Согласно другому аспекту предложен экспрессионный вектор, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту мутантного гена РРХ. Согласно некоторым вариантам реализации указанный экспрессионный вектор содержит выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок РРХ. Согласно некоторым вариантам реализации указанная выделенная нуклеиновая кислота кодирует белок, содержащий мутацию, выбранную из мутаций, приведенных в табл. 1, 2, 3A, 3B, 4А, 4B, 8A-F, 9A-D и 10. Согласно некоторым вариантам реализации указанная выделенная нуклеиновая кислота кодирует белок, имеющий две или более мутации. Согласно некоторым вариантам реализации указанные две или более мутации выбраны из табл. 1, 2, 3A, 3B, 4A, 4B, 8A-F, 9A-D и 10. Согласно некоторым вариантам реализации указанная выделенная нуклеиновая кислота кодирует белок PPX, который является устойчивым к гербицидам, например, устойчивым к ингибирующему PPX гербициду.

В настоящем описании термин гербицид относится к любому химикату или веществу, способному уничтожить растение или способному остановить или снизить рост и/или жизнеспособность растения. Согласно некоторым вариантам реализации гербицидоустойчивость представляет собой генетически наследуемую способность растения выживать и воспроизводиться после обработки гербицидом в концентрации, которая в норме уничтожает или серьезно повреждает немодифицированное растение дикого типа. Согласно некоторым вариантам реализации в соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями, указанный гербицид представляет собой Г ербицид, ингибирующий РРХ. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой гербицид из химического семейства, выбранные из группы химических семейств, перечисленных в табл. 5. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий РРХ гербицид представляет собой гербицид из химического семейства, выбранного из группы химических семейств, состоящей из N-фенилфталимидов, триазолинонов и пиримидиндионов. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид выбран из группы гербицидов, перечисленных в табл. 5. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид выбран из группы гербицидов, состоящей из флумиоксазина, сульфентразона и сафлуфенацила. Согласно другим вариантам реализации указанный ингибирующий PPX гербицид представляет собой гербицид флумиоксазин. Согласно другим вариантам реализации указанный ингибирующий PPX гербицид представляет собой гербицид сульфентразон. Согласно другим вариантам реализации указанный ингибирующий PPX гербицид представляет собой гербицид сафлуфенацил.

В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями указанное(ая) растение или растительная клетка происходят из урожая растений, выбранных из группы, состоящей из картофеля, подсолнечника, сахарной свеклы, кукурузы, хлопка, сои, пшеницы, ржи, овса, риса, канолы, плодовых растений, овощей, табака, ячменя, сорго, томата, манго, персика, яблони, груши, клубники, банана, дыни, моркови, салата, лука, видов сои, сахарного тростника, гороха, кормовых бобов, тополя, винограда, цитрусовых, люцерны, ржи, овса, дернообразующих и кормовых трав, льна, масличного рапса, огурца, вьюнка, бальзамина, перца, баклажана, бархатцев, лотоса, капусты, астровых, гвоздики, петунии, тюльпана, ириса, лилии и дающих орехи растений, если они уже не указаны конкретно. Согласно некоторым вариантам реализации указанное(ая) растение или растительная клетка относятся к видам, выбранным из табл. 6. Согласно некоторым вариантам реализации указанное(ая) растение или растительная клетка относятся к видам, выбранным из группы, состоящей из Arabidopsis thaliana, Solanum tuberosum, Solanum phureja, Oryza sativa, Amaranthus tuberculatus, Zea mays, Brassica napus и Glycine max.

Согласно некоторым вариантам реализации указанное(ая) растение или растительная клетка представляют собой сорт картофеля Рассет Бербанк. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует белок PPX Рассет Бербанк. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует белок PPX Arabidopsis thaliana. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует белок PPX Solanum tuberosum. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген РРХ кодирует белок PPX Solanum phureja. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует белок PPX Zea mays. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует белок PPX Oryza sativa. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген

- 14 035397

PPX кодирует белок PPX Amaranthus tuberculatus. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует белок PPX Ricinus communis. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует белок PPX Brassica napus. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует белок PPX Glycine max. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX At4g01690 кодирует белок PPX Arabidopsis thaliana. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX At5g14220 кодирует белок PPX Arabidopsis thaliana.

В любом аспекте, варианте реализации, способы или композиции, описанные в настоящем изобретении, могут включать один или более мутантных генов РРХ. Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы и композиции включают один или более мутантных генов PPX, кодирующих один или более митохондриальный белок РРХ. Согласно другим вариантам реализации указанные способы и композиции включают один или более мутантных генов PPX, кодирующих один или более пластидный белок РРХ. Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы и композиции включают один или более мутантных генов PPX, кодирующих один или более пластидный белок PPX и митохондриальный белок РРХ. Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы и композиции включают мутантный митохондриальный ген PPX StmPPX1. Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы и композиции включают мутантный митохондриальный ген PPX StmPPX2. Согласно некоторым вариантам реализации растение содержит мутантный пластидный ген PPX StcPPX1. Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы и композиции включают аллель мутантного митохондриального гена PPX StcPPX2.1. Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы и композиции включают аллель мутантного митохондриального гена PPX StcPPX2.2. Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы и композиции включают аллель мутантного пластидного гена PPX StcPPX1. Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы и композиции включают аллель мутантного пластидного гена PPX StcPPX1.1.

В настоящем описании термин ген относится к последовательности ДНК, которая содержит контрольные и кодирующие последовательности, необходимые для синтеза РНК, которая может иметь некодирующую функцию (например, рибосомальной или транспортной РНК) или кодировать полипептид или предшественник полипептида. Указанная(ый) РНК или полипептид могут кодироваться полноразмерной кодирующей последовательностью или любой частью указанной кодирующей последовательности, при условии, что сохраняется требуемая активность или функция. В настоящем описании термин кодирующая последовательность относится к последовательности нуклеиновой кислоты, или ее комплемента, или ее(его) части, которая может быть транскрибирована и/или транслирована с получением мРНК для и/или указанного полипептида или его фрагмента. Кодирующие последовательности включают экзоны в геномной ДНК или незрелые первичные транскрипты РНК, которые объединяются за счет биохимических механизмов клетки с получением зрелой мРНК. Антисмысловая нить представляет собой комплемент такой нуклеиновой кислоты, и из нее может быть выведена кодирующая последовательность.

В настоящем описании термин некодирующая последовательность относится к последовательности нуклеиновой кислоты, или ее комплемента, или ее части, не транскрибируемой в аминокислоту in vivo или характеризующейся тем, что тРНК не взаимодействует с аминокислотами для их размещения или не пытается их размещать. Некодирующие последовательности включают как интронные последовательности в геномной ДНК или незрелые первичные РНК-транскрипты, так и ассоциированные с генами последовательности, такие как промоторы, энхансеры, сайленсеры и т.д. Нуклеиновое основание/нуклеооснование представляет собой основание, которое в определенных предпочтительных вариантах реализации представляет собой пурин, пиримидин, или их производное или аналог. Нуклеозиды представляют собой нуклеиновые основания, содержащие пентозофуранозильные фрагменты, например необязательно замещенный рибозид или 2'-дезоксирибозид. Указанный фрагмент может представлять собой любую группу, увеличивающую ДНК-связывание и/или уменьшающую разложение нуклеазы по сравнению с нуклеозидом, не содержащим указанного фрагмента. Нуклеозиды могут быть связаны одним из нескольких линкерных фрагментов, которые могут содержать или не содержать фосфор. Нуклеозиды, связанные незамещенными фосфодиэфирными связями, называются нуклеотидами. В настоящем описании термин нуклеооснование включает пептидные нуклеиновые основания, субъединицы пептидных нуклеиновых кислот, морфолиновые нуклеиновые основания, а также нуклеозиды и нуклеотиды.

Олигонуклеотид представляет собой полимер, содержащий нуклеиновые основания, предпочтительно по меньшей мере часть которого способна гибридизоваться посредством спаривания оснований по Уотсону-Крику с ДНК, имеющей комплементарную последовательность. Цепь олигонуклеотида может содержать один 5'- и 3'-конец, которые представляют собой конечные нуклеиновые основания указанного полимера. Конкретная цепь олигонуклеотида может содержать нуклеиновые основания всех типов. Олигонуклеотид представляет собой соединение, содержащее одну или более цепей олигонуклеотидов, которые могут быть комплементарным и гибридизоваться по механизму спаривания оснований по Уотсону-Крику. Нуклеиновые основания рибо-типа включают пентозофуранозил-содержащие нуклеиновые основания, где 2' углерод представляет собой метилен, замещенный гидроксилом, алкилокси или галогеном. Дезоксинуклеооснования рибо-типа представляют собой нуклеиновые основания, отличаю- 15 035397 щиеся от нуклеооснований рибо-типа, и включают все нуклеиновые основания, не содержащие пентозофуранозильных фрагментов.

В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями нить олигонуклеотида может включать как цепи олигонуклеотида, так и сегменты или области цепей олигонуклеотида. Нить олигонуклеотида может иметь 5'-конец и 3'-конец, и, если длина нити олигонуклеотида равна длине цепи, 5'- и 3'-концы указанной нити являются также 5'- и 3'-концами указанной цепи.

В настоящем описании термин олигонуклеотид для репарации генов или GRON относится к олигонуклеотидам, включая смешанные дуплексные олигонуклеотиды, молекулы, содержащие фрагменты, отличные от нуклеотидов, одноцепочечные олигодезоксинуклеотиды и другие молекулы для репарации генов. В настоящем описании термин трансгенный относится к организму или клетке, который(ая) содержит ДНК, полученную из другого организма, встроенную в его(ее) геном. Например, согласно некоторым вариантам реализации трансгенный(ая) организм или клетка включают встроенную ДНК, которая содержит чужеродный промотор и/или кодирующую область.

В настоящем описании термин нетрансгенные относится к организму или клетке, который(ая) не содержат ДНК, полученной из другого организма, встроенной в его(ее) геном, хотя нетрансгенное растение или клетка могут содержать одну или более введенных искусственным образом направленных мутаций.

В настоящем описании термин выделенный в отношении нуклеиновой кислоты (например, олигонуклеотида, такого как РНК, ДНК или смешанного полимера) относится к нуклеиновой кислоте, отделенной от существенной части генома, в котором она присутствует в природе, и/или по существу отделенной от других компонентов клетки, которые сопровождают такую нуклеиновую кислоту в природе. Например, любая нуклеиновая кислота, полученная синтетическим путем (например, посредством серийной конденсации оснований), считается выделенной. Сходным образом, нуклеиновые кислоты, рекомбинантным образом экспрессируемые, клонированные, полученные с помощью реакции удлинения праймера (например, ПЦР) или иным образом вырезанные из генома, также считаются выделенными.

В настоящем описании термин аминокислотная последовательность относится к полипептидной или белковой последовательности. Выражение AAwt###AAmut используют для обозначения мутации, приводящей к замене аминокислоты дикого типа AAwt в положении ### в полипептиде мутантной AAmut.

В настоящем описании термин комплемент относится к комплементарной последовательности нуклеиновой кислоты в соответствии со стандартными правилами спаривания по Уотсону-Крику. Комплементарная последовательность может также представлять собой последовательность РНК, комплементарную последовательности ДНК или комплементарной ей последовательности, а также может представлять собой кДНК. В настоящем описании термин по существу комплементарный относится к двум последовательностям, которые гибридизуются в условиях гибридизации, близких к строгим. Специалисту в данной области техники будет понятно, что по существу комплементарные последовательности необязательно должны гибридизоваться на протяжении всей длины.

В настоящем описании термин кодон относится к последовательности трех смежных нуклеотидов (РНК или ДНК), составляющей генетический код, определяющий вставку конкретной аминокислоты в полипептидную цепь в процессе синтеза белка, или сигнал к остановке синтеза белка. Термин кодон также относится к соответствующим (и комплементарным) последовательностям трех нуклеотидов в матричной РНК, в которую транскрибируется исходная ДНК.

В настоящем описании термин гомология относится к сходству последовательностей белков и ДНК. Термин гомология или гомологичный относится к степени идентичности. Гомология может быть частичной или полной. Частично гомологичная последовательность представляет собой такую последовательность, которая менее на 100% идентична другой последовательности.

В настоящем описании термин приблизительно в количественном выражении означает плюс или минус 10%. Например, приблизительно 3% охватывает диапазон 2,7-3,3%, а приблизительно 10% охватывает 9-11%. Далее, в тех случаях, когда термин приблизительно используется в отношении количественной характеристики, понятно, что, помимо значений, соответствующих плюс или минус 10%, он также охватывает и описывает точное значение количественной характеристики. Например, термин приблизительно 3% однозначно охватывает, описывает и включает точно 3%.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлена последовательность аминокислот хлоропластного (пластидного) белка PPX Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 1).

На фиг. 2 представлена последовательность нуклеиновой кислоты кДНК Arabidopsis thaliana хлоропластного (пластидного) PPX (SEQ ID NO: 2).

На фиг. 3 представлена последовательность аминокислот митохондриального белка PPX

Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 3).

На фиг. 4 представлена последовательность нуклеиновой кислоты кДНК Arabidopsis thaliana митохондриального PPX (SEQ ID NO: 4).

- 16 035397

На фиг. 5 представлена последовательность аминокислот митохондриального белка PPX

Amaranthus tuberculatus (SEQ ID NO: 5).

На фиг. 6 представлена последовательность нуклеиновой кислоты кДНК митохондриального PPX

Amaranthus tuberculatus (SEQ ID NO: 6).

На фиг. 7 представлена последовательность аминокислот пластидного белка РРХ Solanum tuberosum StcPPX (SEQ ID NO: 7).

На фиг. 8 представлена последовательность нуклеиновой кислоты кДНК пластидного PPX Solanum tuberosum (SEQ ID NO: 8).

На фиг. 9 представлена последовательность аминокислот митохондриального белка PPX Solanum tuberosum (SEQ ID NO: 9).

На фиг. 10 представлена последовательность нуклеиновой кислоты кДНК митохондриального PPX Solanum tuberosum (SEQ ID NO: 10).

На фиг. 11 представлена последовательность аминокислот пластидного белка РРХ Zea mays (SEQ ID NO: 11).

На фиг. 12 представлена последовательность нуклеиновой кислоты кДНК пластидного PPX Zea mays (SEQ ID NO: 12).

На фиг. 13 представлена последовательность аминокислот митохондриального белка PPX Zea mays (SEQ ID NO: 13).

На фиг. 14 представлена последовательность нуклеиновой кислоты кДНК митохондриального PPX Zea mays (SEQ ID NO: 14).

На фиг. 15 представлена последовательность аминокислот пластидного белка РРХ Oryza sativa (SEQ ID NO: 15).

На фиг. 16 представлена последовательность нуклеиновой кислоты кДНК пластидного PPX Oryza sativa (SEQ ID NO: 16).

На фиг. 17 представлена последовательность аминокислот кДНК митохондриального белка PPX Oryza sativa (SEQ ID NO: 17).

На фиг. 18 представлена последовательность нуклеиновой кислоты кДНК митохондриального PPX Oryza sativa (SEQ ID NO: 18).

На фиг. 19 представлена последовательность аминокислот пластидного белка РРХ Sorghum bicolor (SEQ ID NO: 19).

На фиг. 20 представлена последовательность нуклеиновой кислоты кДНК пластидного PPX Sorghum bicolor (SEQ ID NO: 20).

На фиг. 21 представлена последовательность аминокислот митохондриального белка PPX Sorghum bicolor (SEQ ID NO: 21).

На фиг. 22 представлена последовательность нуклеиновой кислоты кДНК митохондриального PPX Sorghum bicolor (SEQ ID NO: 22).

На фиг. 23 представлена последовательность аминокислот пластидного белка РРХ Ricinus communis (SEQ ID NO: 23).

На фиг. 24 представлена последовательность нуклеиновой кислоты кДНК пластидного PPX Ricinus communis (SEQ ID NO: 24).

На фиг. 25 представлена последовательность аминокислот митохондриального белка PPX Ricinus communis (SEQ ID NO: 25).

На фиг. 26 представлена последовательность нуклеиновой кислоты кДНК митохондриального PPX Ricinus communis (SEQ ID NO: 26).

На фиг. 27 представлена последовательность аминокислот митохондриального белка PPX Solanum tuberosum StmPPX1 (SEQ ID NO: 27).

На фиг. 28 представлена последовательность нуклеиновой кислоты кДНК митохондриального PPX Solanum tuberosum StmPPX1 (SEQ ID NO: 28).

На фиг. 29 представлена последовательность аминокислот митохондриального белка PPX Solanum tuberosum StmPPX2.1 (SEQ ID NO: 29).

На фиг. 30 представлена последовательность нуклеиновой кислоты кДНК митохондриального PPX Solanum tuberosum StmPPX2.1 (SEQ ID NO: 30).

На фиг. 31 представлена последовательность аминокислот митохондриального белка PPX Solanum tuberosum StmPPX2.2 (SEQ ID NO: 31).

На фиг. 32 представлена последовательность нуклеиновой кислоты кДНК митохондриального PPX Solanum tuberosum StmPPX2.2 (SEQ ID NO: 32).

На фиг. 33 представлена последовательность аминокислот пластидного белка РРХ Brassica napus BncPPX1 (SEQ ID NO: 33).

На фиг. 34 представлена последовательность нуклеиновой кислоты кДНК РРХ Brassica napus BncPPX1 (SEQ ID NO: 34).

На фиг. 35 представлена последовательность аминокислот пластидного белка РРХ Brassica napus BncPPX2 (SEQ ID NO: 35).

- 17 035397

На фиг. 36 представлена последовательность нуклеиновой кислоты кДНК РРХ Brassica napus

BncPPX2 (SEQ ID NO: 36).

На фиг. 37 представлена часть последовательности аминокислот пластидного белка РРХ Brassica napus BncPPX3 (SEQ ID NO: 37).

На фиг. 38 представлена часть последовательности нуклеиновой кислоты кДНК РРХ Brassica napus BncPPX3 (SEQ ID NO: 38).

На фиг. 39 представлена последовательность аминокислот пластидного белка РРХ Glycine max GmcPPX1-1 (SEQ ID NO: 39).

На фиг. 40 представлена последовательность аминокислот пластидного белка РРХ Glycine max GmcPPX1-2 (SEQ ID NO: 40).

На фиг. 41 представлена последовательность нуклеиновой кислоты пластидного белка PPX Glycine max GmcPPX1 (SEQ ID NO: 41).

На фиг. 42 представлена последовательность аминокислот пластидного белка РРХ Glycine max GmcPPX2 (SEQ ID NO: 42).

На фиг. 43 представлена последовательность нуклеиновой кислоты пластидного белка PPX Glycine max GmcPPX2 (SEQ ID NO: 43).

На фиг. 44 представлена последовательность аминокислот митохондриального белка PPX Glycine max GmcPPX (SEQ ID NO: 44).

На фиг. 45 представлена последовательность нуклеиновой кислоты митохондриального белка PPX Glycine max GmcPPX (SEQ ID NO: 45).

На фиг. 46 приведено выравнивание белков PPX различных видов растений.

На фиг. 47 представлена таблица гомологичных положений аминокислот аминокислотных последовательностей PPX растений различных видов.

На фиг. 48 представлена таблица гомологичных положений аминокислот аминокислотных последовательностей PPX растений различных видов.

Подробное описание изобретения

Система быстрого проявления признака (RTDS™).

Согласно любому из различных аспектов и вариантов реализации композиций и способов, описанных в настоящем изобретении, мутации в генах и белках могут быть осуществлены с применением, например, системы быстрого проявления признака (RTDS™), технологии, разработанной Cibus. В комбинации или по отдельности, растения, содержащие любую из мутации, описанных в настоящем документе, могут формировать основу для новых устойчивых к гербицидам продуктов. Также предложены семена, полученные из мутантных растений, в которых гены PPX либо гомозиготны, либо гетерозиготны по указанным мутациям. Мутации, описанные в настоящем изобретении, могут быть скомбинированы с любой другой известной мутацией или с мутациями, которые будут открыты в будущем.

В настоящем описании термин гетерозиготный относится к присутствию разных аллелей в одном или более генном локусе в гомологичных хромосомных сегментах. В настоящем описании термин гетерозиготный может также относиться к образцу, клетке, популяции клеток или организму, в котором(ой) могут обнаруживаться разные аллели в одном или более генном локусе. Гетерозиготные образцы могут также быть определены с помощью известных в данной области техники способов, таких как, например, секвенирование нуклеиновых кислот. Так, если электрофореграмма при секвенировании показывает два пика в одном локусе и оба пика имеют примерно одинаковый размер, данный образец может быть охарактеризован как гетерозиготный. Либо, если один пик меньше другого, но его размер составляет по меньшей мере приблизительно 25% от размера большего пика, данный образец может быть охарактеризован как гетерозиготный. Согласно некоторым вариантам реализации размер меньшего пика составляет по меньшей мере приблизительно 15% от большего пика. Согласно другим вариантам реализации размер меньшего пика составляет по меньшей мере приблизительно 10% от большего пика. Согласно другим вариантам реализации размер меньшего пика составляет по меньшей мере приблизительно 5% от большего пика. Согласно другим вариантам реализации обнаруживается минимальный размер меньшего пика.

В настоящем описании термин гомозиготный относится к присутствию идентичных аллелей в одном или более генном локусе в гомологичных хромосомных сегментах. Гомозиготный может также относиться к образцу, клетке, популяции клеток или организму, в котором могут обнаруживаться одни и те же аллели в одном или более генном локусе. Гомозиготные образцы могут быть определены посредством известных в данной области техники способов, таких как, например, секвенирование нуклеиновых кислот. Так, если электрофореграмма при секвенировании показывает одиночный пик в конкретном локусе, данный образец может быть назван гомозиготным по этому локусу. Термин гемизиготный относится к гену или сегменту гена, присутствующему в генотипе клетки или организма в единственном числе ввиду того, что вторая аллель делетирована. В настоящем описании термин гемизиготный может также относиться к образцу, клетке, популяции клеток или организму, в котором аллель в одном или более генном локусе обнаруживается в генотипе в единственном числе. Согласно некоторым вариантам

- 18 035397 реализации RTDS основана на изменении гена-мишени за счет применения собственной клеточной системы репарации генов для специфичной модификации генной последовательности in situ, без встраивания чужеродной ДНК и/или контролирующих экспрессию генов последовательностей. Эта процедура позволяет вносить высокоточные изменения в генетическую последовательность, в то время как остальная часть генома остается неизменной. В отличие от общепринятых трансгенных ГМО, отсутствует встраивание чужеродного генетического материала, и никакой чужеродный генетический материал не остается в растении. Согласно многим вариантам реализации изменения в генетической последовательности, введенные с помощью RTDS, встраиваются неслучайным образом. За счет того, что подвергающиеся воздействию гены сохраняют природную локализацию, отсутствует случайное, неконтролируемое или неблагоприятное действие экспрессионного вектора.

RTDS, обеспечивающая указанное изменение, представляет собой химически синтезированный олигонуклеотид (например, с применением олигонуклеотида репарации генов (GRON)), который может состоять как из ДНК-, так и из модифицированных РНК-оснований, а также других химических фрагментов, и сконструирован так, чтобы гибридизоваться с целевой локализацией в гене с образованием ошибочно спаренных(ой) пар(ы) оснований. Такая ошибочно спаренная пара оснований действует как сигнал для привлечения клеточной собственной природной системы репарации генов к этому участку и коррекции (замены, вставки или делеции) указанного(ых) нуклеотида(ов) в составе гена. По завершении процесса коррекции молекула RTDS распадается, и новомодифицированный или репарированный ген экспрессируется под контролем нормальных для гена эндогенных контрольных механизмов.

Олигонуклеотиды генной репарации (GRON).

Способы и композиции, описанные в настоящем изобретении, могут быть применены или реализованы с использованием олигонуклеотидов для генной репарации, например, имеющих конформации и химические свойства согласно приведенному ниже подробному описанию. Олигонуклеотиды для генной репарации в контексте настоящего описания также были описаны в опубликованных научных и патентных источниках с применением других названий, включая рекомбинагенные олигонуклеотиды; РНК/ДНК гибридные олигонуклеотиды; гибридные олигонуклеотиды; смешанные дуплексные олигонуклеотиды (MDON); РНК ДНК олигонуклеотиды (RDO); олигонуклеотиды для направленного воздействия на гены (таргетинга); генопласты; одноцепочечные модифицированные олигонуклеотиды; одноцепочечные олигодезоксинуклеотидные мутационные векторы (SSOMV); дуплексные мутационные векторы и гетеродуплексные мутационные векторы.

Олигонуклеотиды, обладающие конформациями и химическими свойствами согласно описанию Kmiec в патентах США № 5565350 (Kmiec I) и № 5731181 (Kmiec II), включенных в настоящее описание посредством ссылок, подходят для применения в качестве олигонуклеотидов для генной репарации согласно настоящему изобретению. Олигонуклеотиды репарации генов по Kmiec I и/или Kmiec II содержат две комплементарные нити, одна из которых содержит по меньшей мере один сегмент нуклеотидов РНК-типа (РНК-сегмент), спаренных с нуклеотидами ДНК-типа другой нити.

Согласно описанию в Kmiec II ненуклеотиды, содержащие пуриновые и пиримидиновые основания, могут быть заменены нуклеотидами. Дополнительные молекулы для репарации генов, которые могут применяться в целях настоящего изобретения, включают, но не ограничиваясь перечисленными, описанные в патентах США № 5756325; 5871984; 5760012; 5888983; 5795972; 5780296; 5945339; 6004804 и 6010907; в международном патенте № PCT/US00/23457; и в международных патентных публикациях WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702 и WO 99/40789, включенных в настоящее описание по всей полноте.

В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями олигонуклеотиды репарации генов могут представлять собой смешанные дуплексные олигонуклеотиды (MDON), в которых нуклеотидам РНК-типа смешанного дуплексного олигонуклеотида придана устойчивость к РНКазе за счет замещения 2'-гидроксила фтор-, хлор- или бромсодержащей функциональной группой или введения заместителя по 2'-О. Подходящие заместители включают заместители, описанные в Kmiec II. Альтернативные заместители могут включать, не ограничиваясь перечисленными, заместители, описанные в патенте США № 5334711 (Sproat), и заместители, описанные в патентных публикациях ЕР 629387 и ЕР 679657 (обобщенно - заявки Martin (Martin Applications)), которые включены в настоящее описание посредством ссылок. В контексте настоящего описания 2'-фтор, хлор- или бром- производное рибонуклеотида, либо рибонуклеотида с 2'-OH, замещенным заместителем, описанным в заявках Martin или Sproat, называется 2'-замещенным рибонуклеотидом. В контексте настоящего описания термин нуклеотид РНК-типа означает 2'-гидроксил или 2'-замещенный нуклеотид, который связан с другими нуклеотидами смешанного дуплексного олигонуклеотида незамещенной фосфодиэфирной связью или любой ненатуральной связью из описанных в Kmiec I или Kmiec II. В контексте настоящего описания термин нуклеотид дезоксирибо-типа означает нуклеотид, содержащий 2'-H, который может быть связан с другими нуклеотидами олигонуклеотида репарации генов незамещенной фосфодиэфирной связью или любой ненатуральной связью согласно Kmiec I или Kmiec II.

В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации,

- 19 035397 способами и/или композициями олигонуклеотид для репарации генов может представлять собой смешанный дуплексный олигонуклеотид (MDON), связанный исключительно незамещенными фосфодиэфирными связями. Согласно альтернативным вариантам реализации связь осуществляется за счет замещенных фосфодиэфиров, производных фосфодиэфиров и связей не на основе фосфора согласно описанию в Kmiec II. Согласно еще одному варианту реализации каждый нуклеотид РНК-типа в смешанном дуплексном олигонуклеотиде представляет собой 2'-замещенный нуклеотид. В частности, предпочтительные варианты реализации 2'-замещенных рибонуклеотидов включают, не ограничиваясь перечисленными, 2'-фтор, 2'-метокси, 2'-пропилокси, 2'-аллиокси, 2'-гидроксилэтилокси, 2'-метоксиэтилокси, 2'-фторпропилокси и 2'-трифторпропилокси-замещенные рибонуклеотиды. Более предпочтительные варианты реализации 2'-замещенных рибонуклеотидов представлены 2'-фтор, 2'-метокси, 2'-метоксиэтилокси и 2'-аллиокси-замещенными нуклеотидами. Согласно другому варианту реализации смешанный дуплексный олигонуклеотид связан посредством незамещенных фосфодиэфирных связей.

Несмотря на то что смешанные дуплексные олигонуклеотиды (MDON), содержащие только один тип 2'-замещенных нуклеотидов РНК-типа, удобнее для синтеза, способы согласно настоящему изобретению могут также включать применение смешанных дуплексных олигонуклеотидов, содержащих два или более типа нуклеотидов РНК-типа. На функцию РНК-сегмента может и не влиять разрыв, вызванный введением дезоксинуклеотида между двумя тринуклеотидами РНК-типа, соответственно термин РНКсегмент охватывает такие термины, как прерванный РНК-сегмент. Непрерывный РНК-сегмент называется сплошным РНК-сегментом. Согласно альтернативному варианту реализации РНК-сегмент может содержать чередующиеся устойчивые к РНКазе и незамещенные 2'-OH нуклеотиды. Указанные смешанные дуплексные олигонуклеотиды предпочтительно содержат менее 100 нуклеотидов, более предпочтительно менее 85 нуклеотидов, но более 50 нуклеотидов. Первая и вторая нити спарены по УотсонуКрику. Согласно одному из вариантов реализации нити смешанного дуплексного олигонуклеотида ковалентно связаны линкером, таким как одноцепочечный гекса-, пента- или тетрануклеотид, таким образом, что первая и вторая нити представляют собой сегменты одной олигонуклеотидной цепи, имеющей один 3'- и один 5'-конец. Указанные 3'- и 5'-концы могут быть защищены добавлением шпилькообразного кэпа, отличающегося тем, что 3'- и 5'-концевые нуклеотиды спарены по Уотсону-Крику со смежными нуклеотидами. Второй шпилькообразный кэп может дополнительно присутствовать в месте соединения первой и второй нитей, удаленном от 3'- и 5'-концов, стабилизируя спаривание по Уотсону-Крику между первой и второй нитями. Указанные первая и вторая нити содержат две области, гомологичные двум фрагментам целевого гена, т.е. имеющие ту же последовательность, что и целевой ген. Гомологичная область содержит нуклеотиды РНК-сегмента и может содержать один или более нуклеотид ДНК-типа соединяющего ДНК-сегмента, а также может содержать нуклеотиды ДНК-типа, не входящие в состав вставочного ДНК-сегмента. Указанные две области гомологии разделены областью, содержащей последовательность, отличающуюся от последовательности целевого гена и называемую гетерологичной областью; и каждая из них примыкает к ней. Указанная гетерологичная область может содержать один, два или три ошибочно спаренных нуклеотида. Указанные ошибочно спаренные нуклеотиды могут быть сплошными или, В одном из вариантов могут быть разделены одним или двумя нуклеотидами, гомологичными целевому цену. В одном из вариантов указанная гетерологичная область может также содержать вставку из одного, двух, трех, или из пяти или менее нуклеотидов. В одном из вариантов последовательность смешанного дуплексного олигонуклеотида может отличаться от последовательности целевого гена только делецией одного, двух, трех, или пяти или менее нуклеотидов из смешанного дуплексного олигонуклеотида. Длина и расположение гетерологичной области в этом случае соответствуют длине делеции, даже если в составе указанной гетерологичной области отсутствуют нуклеотиды смешанного дуплексного олигонуклеотида. Расстояние между фрагментами целевого гена, комплементарными двум гомологичным областям, идентично длине гетерологичной области, где планируется замена или замены. Если гетерологичная область содержит вставку, указанные гомологичные области за счет этого разнесены в смешанном дуплексном олигонуклеотиде на большее расстояние по сравнению с комплементарными им гомологичными фрагментами в гене; если гетерологичная область кодирует делецию, справедливо обратное. Каждый из РНК-сегментов смешанных дуплексных олигонуклеотидов представляет собой часть гомологичной области, т.е. области, идентичной по последовательности фрагменту целевого гена; указанные сегменты в совокупности предпочтительно содержат по меньшей мере 13 нуклеотидов РНКтипа и предпочтительно от 16 до 25 нуклеотидов РНК-типа, или еще более предпочтительно 18-22 нуклеотидов РНК-типа, или наиболее предпочтительно 20 нуклеотидов. Согласно одному из вариантов реализации РНК-сегменты гомологичных областей разделены промежуточным ДНК-сегментом и смежны с ним, т.е. соединены им. Согласно одному из вариантов реализации каждый нуклеотид гетерологичной области представляет собой нуклеотид промежуточного ДНК-сегмента. Промежуточный ДНК-сегмент, который содержит гетерологичную область смешанного дуплексного олигонуклеотида, называется мутаторным сегментом.

В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями олигонуклеотид для репарации генов (GRON) может представлять собой одноцепочечный олигодезоксинуклеотидный мутационный вектор (SSOMV), например, такой как опи

- 20 035397 санный в международной заявке на патент PCT/US00/23457, патентах США № 6271360, 6479292 и 7060500, включенных в настоящее описание по всей полноте посредством ссылок. Последовательность SSOMV основана на тех же принципах, что и мутационные векторы, описанные, например, в патентах США № 5756325, 5871984, 5760012, 5888983, 5795972, 5780296, 5945339, 6004804 и 6010907 и в международных публикациях № WO 98/49350, WO 99/07865, WO 99/58723, WO 99/58702 и WO 99/40789. Последовательность SSOMV содержит две области, гомологичные целевой последовательности, разделенные областью, называемой мутаторной областью, которая содержит требуемое генетическое изменение. Указанная мутаторная область может иметь последовательность той же длины, что и последовательность, разделяющая гомологичные области в целевой последовательности, но отличающуюся. Такая мутаторная область может вызывать замену. В одном из вариантов гомологичные области в SSOMV могут быть последовательными относительно друг друга, в то время как области в целевом гене, имеющие ту же последовательность, разделены одним, двумя или более нуклеотидами. Такой SSOMV приводит к удалению из целевого гена нуклеотидов, отсутствующих в указанном SSOMV. Наконец, последовательность целевого гена, идентичная гомологичным областям, может быть смежной в целевом гене, но разделенной одним, двумя или более нуклеотидами в последовательности SSOMV. Такой SSOMV приводит к вставке в последовательности целевого гена.

Нуклеотиды SSOMV представляют собой дезоксирибонуклеотиды, связанные немодифицированными фосфодиэфирными связями, за исключением того, что 3'-конечная и/или 5'-конечная межнуклеотидная связь или в одном из вариантов две 3'-конечные и/или 5'-конечные межнуклеотидные связи могут быть фосфотиоатными или фосфоамидатными. В контексте настоящего описания межнуклеотидная связь представляет собой связь между нуклеотидами SSOMV и не включает связь между 3'-концевым нуклеотидом или 5'-концевым нуклеотидом и блокирующим заместителем. Согласно конкретному варианту реализации длина SSOMV составляет от 21 до 55 дезоксинуклеотидов, а длины гомологичных областей равны соответственно общей длине по меньшей мере 20 дезоксинуклеотидов, и по меньшей мере две гомологичные области, каждая, должны иметь длину, составляющую по меньшей мере 8 дезоксинуклеотидов.

SSOMV может быть сконструирован так, чтобы быть комплементарным либо кодирующей, либо некодирующей нити целевого гена. Если требуемая мутация представляет собой замену одного основания, предпочтительно, чтобы и мутаторный нуклеотид, и нуклеотид-мишень представляли собой пиримидин. В том случае, если это согласуется с достижением требуемого функционального результата, предпочтительно, чтобы и мутаторный нуклеотид, и нуклеотид-мишень в комплементарной нити представляли собой пиримидины. В частности, предпочтительными являются такие SSOMV, которые кодируют трансверсионные мутации, т.е. С или Т мутаторный нуклеотид ошибочно спаривается соответственно с нуклеотидом С или Т в комплементарной нити.

Помимо олигодезоксинуклеотида, SSOMV может содержать 5'-блокирующий заместитель, присоединенный к 5'-конечным углеродам через линкер. Химия линкера не критична, в отличие от его длины, которая предпочтительно составляет по меньшей мере 6 атомов, а также того, что линкер должен быть гибким. Могут применяться различные нетоксичные заместители, такие как биотин, холестерин или другие стероиды, либо неинтеркалирующий катионный флуоресцентный краситель. В частности, предпочтительными реагентами для получения SSOMV являются реагенты, продаваемые как Cy3™ и Cy5™ компанией Glen Research, Стерлинг, Виргиния (в настоящее время -GE Healthcare), которые представляют собой блокированные фосфороамидиты, при введении в олигонуклеотид дающие 3,3,3',3'-тетраметил Ν,Ν'-изопропил-замещенные индомонокарбоцианиновые и индодикарбоцианиновые красители соответственно. Cy3 особенно предпочтителен. Если индокарбоцианин является N-оксиалкил-замещенным, он может быть удобно присоединен к 5'-концу олигодезоксинуклеотида в виде фосфодиэфира с 5'-концевым фосфатом. Химия линкера красителя между красителем и олигодезоксинуклеотидом не критичная, и его выбирают исходя из удобства синтеза. При применении по назначению коммерчески доступного фосфороамидита Cy3 результирующая 5'-модификация состоит из блокирующего заместителя и линкера, которые вместе составляют N-гидроксипропил-, №-фосфатидилпропил-3,3,3',3'-тетраметилиндомонокарбоцианин.

Согласно предпочтительному варианту реализации индокарбоцианиновый краситель является тетра-замещенным по положениям 3 и 3' индольных колец. Без определенного теоретического обоснования можно считать, что указанные замещения не позволяют красителю быть интеркалирующим красителем. Природа заместителей в этих положениях не критична. SSOMV может дополнительно содержать 3'-блокирующий заместитель. В этом случае также химия указанного 3'-блокирующего заместителя не критична.

Описанные в настоящем изобретении мутации могут также быть осуществлены путем мутагенеза (случайного, соматического или направленного) и любых других техник редактирования ДНК или рекомбинации, включая, но не ограничиваясь перечисленными, направленное воздействие на гены с применением сайт-специфической гомологичной рекомбинации при помощи нуклеаз цинковые пальцы.

Доставка олигонуклеотидов репарации генов в растительные клетки.

Любой общеизвестный способ, подходящий для трансформации растительной клетки, может при

- 21 035397 меняться для доставки олигонуклеотидов репарации генов.

Примеры способов описаны ниже.

Микроносители и микроволокна.

Применение металлических микроносителей (микросфер) для введения больших фрагментов ДНК в растительные клетки с целлюлозными клеточными стенками путем проникновения бомбардирующих частиц общеизвестно специалистам в соответствующей области техники (здесь и далее - биолистической доставки). В патентах США № 4945050; 5100792 и 5204253 описаны общие методы выбора микроносителей и устройств для бомбардировки ими.

Конкретные условия применения микроносителей в способах согласно настоящему изобретению описаны в международной публикации WO 99/07865. Согласно иллюстративной методике охлажденные до температуры льда микроносители (60 мг/мл), смешанный дуплексный олигонуклеотид (60 мг/мл), 2,5 М CaCl₂ и 0,1 М спермидина добавляют в указанном порядке; смесь осторожно перемешивают, например, на вортексе в течение 10 мин и затем оставляют при комнатной температуре на 10 мин, после чего микроносители разводят в 5 объемах этанола, центрифугируют и ресуспендируют в 100% этаноле. Хорошие результаты могут быть получены при концентрации в адгезивном растворе 8-10 мкг/мкл микроносителей, 14-17 мкг/мл смешанного дуплексного олигонуклеотида, 1,1-1,4 М CaCl₂ и 18-22 мМ спермидина. Оптимальные результаты наблюдались в условиях с 8 мкг/мкл микроносителей, 16,5 мкг/мл смешанного дуплексного олигонуклеотида, 1,3 М CaCl₂ и 21 мМ спермидина. Олигонуклеотиды репарации генов могут также быть введены в растительные клетки для применения согласно настоящему описанию с использованием микроволокон для прохождения через клеточную стенку и клеточную мембрану. В патенте США № 5302523 (Coffee et al.) описано применение 30x0,5 мкм и 10x0,3 мкм волокон карбида кремния для облегчения трансформации суспензионных культур кукурузы Black Mexican Sweet. Любые физические методы, подходящие для введения ДНК для трансформации растительной клетки с применением микроволокон, могут применяться для доставки олигонуклеотидов для репарации генов для трансмутации.

Пример методики доставки олигонуклеотидов репарации генов с помощью микроволокон выглядит следующим образом. Стерильные микроволокна (2 мкг) суспендируют в 150 мкл культуральной среды для растений, содержащей приблизительно 10 мкг смешанного дуплексного олигонуклеотида. Суспензионной культуре дают осесть; равные объемы клеточного осадка и стерильной суспензии волокна/нуклеотид перемешивают на вортексе в течение 10 мин и высевают. Селективные среды применяют сразу или с задержкой до приблизительно 120 ч в зависимости от требований для конкретного признака.

Электропорация протопластов.

Согласно альтернативному варианту реализации олигонуклеотиды репарации генов могут быть доставлены в растительную клетку посредством электропорации протопласта, полученного из частей растений. Указанные протопласты получают при помощи обработки частей растений ферментами, в частности листа, в соответствии с методиками, общеизвестными специалистам в данной области техники. См., например, Gallois et al., 1996, в Methods in Molecular Biology 55:89-107, Humana Press, Totowa, N.J.; Kipp et al., 1999, в Methods in Molecular Biology 133:213-221, Humana Press, Totowa, N.J. Указанные протопласты не нуждаются в культивировании на ростовых средах перед электропорацией. Иллюстративные условия для электропорации - 3x105 протопластов в общем объеме 0,3 мл с концентрацией олигонуклеотида репарации генов от 0,6 до 4 мкг/мл.

ПЭГ-опосредованный захват ДНК протопластами.

Согласно альтернативному варианту реализации нуклеиновые кислоты захватываются растительными протопластами в присутствии мембраномодифицирующего агента полиэтиленгликоля, в соответствии с методиками, общеизвестными специалистам в данной области техники (см., например, Gharti-Chhetri et al., 1992; Datta et al., 1992).

Микроинъецирование.

Согласно альтернативному варианту реализации олигонуклеотида репарации генов могут быть доставлены инъецированием через микрокапилляр в растительные клетки или в протопласты (см., например, Miki et al., 1989; Schnorf et al., 1991).

Трансгеника.

Согласно любому из различных аспектов и вариантов реализации композиций и способов, описанных в настоящем документе, мутации в генах и белках могут быть получены с применением, например, трансгенной технологии. Согласно некоторым вариантам реализации указанные композиции и способы включают растение или растительную клетку, содержащее(ую) трансформированную конструкцию нуклеиновой кислоты, включающую промотор, функционально связанный с описанным в настоящей заявке нуклеотидом РРХ. Способы согласно настоящему изобретению могут включать введение описанной в настоящей заявке конструкции нуклеиновой кислоты PPX по меньшей мере в одну растительную клетку и регенерирование из нее трансформированного растения. Указанная конструкция нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере один нуклеотид, который кодирует устойчивый к гербицидам белок PPX согласно описанию в настоящем документе, в частности нуклеотидные последовательности из приведен

- 22 035397 ных на фиг. 2, 4, 6, 8, 10 и 12 и их фрагменты и варианты. Указанные способы также включают применение промотора, способного управлять генной экспрессией в растительной клетке. Согласно одному из вариантов реализации такой промотор представляет собой конститутивный промотор или тканеселективный промотор. Растение, полученное с помощью указанных способов, может обладать повышенной активностью PPX и/или, в частности, активностью устойчивого к гербицидам PPX по сравнению с нетрансформированным растением. Соответственно, указанные способы находят применение для усиления или увеличения устойчивости растений по меньшей мере к одному гербициду, что увеличивает активность фермента PPX, в частности, в присутствии ингибирующего PPX гербицида.

В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями способы получения устойчивого к гербицидам растения могут включать трансформирование растительной клетки конструкцией нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, функционально связанную с промотором, управляющим экспрессией в растительной клетке, и регенерирование трансформированного растения из указанной трансформированной растительной клетки. Указанная нуклеотидная последовательность выбрана из таких нуклеотидных последовательностей, которые кодируют устойчивые к гербицидам PPX, описанные в настоящем изобретении, в частности из нуклеотидных последовательностей, приведенных на фиг. 2, 4, 6, 8, 10 и 12 и их фрагментов и вариантов. Устойчивое к гербицидам растение, полученное указанным способом, обладает повышенной устойчивостью по сравнению с нетрансформированным растением по меньшей мере к одному гербициду, в частности гербициду, влияющему на активность фермента PPX, такому как, например, гербицид, ингибирующий РРХ.

Описанные молекулы нуклеиновых кислот могут применяться в конструкциях нуклеиновой кислоты для трансформации растений, например сельскохозяйственных растений, таких как Solanum tuberosum. Согласно одному из вариантов реализации такие конструкции нуклеиновой кислоты, содержащие молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему описанию, могут применяться для получения трансгенных растений, обладающих устойчивостью к гербицидам, например известным подавляющим активность PPX гербицидам, таким как РРХ-ингибирующие гербициды. Указанные конструкции нуклеиновой кислоты могут применяться в экспрессионных кассетах, экспрессионных векторах, трансформирующих векторах, плазмидах и т.п. Трансгенные растения, полученные после трансформации такими конструкциями, демонстрируют повышенную устойчивость к РРХ-ингибирующим гербицидам, таким как, например, гербициды флумиоксазин и сульфентразон.

Конструкции.

Молекулы нуклеиновых кислот, описанные в настоящем изобретении (например, мутантные гены РРХ), могут применяться при получении рекомбинантных конструкций нуклеиновой кислоты. Согласно одному из вариантов реализации молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему описанию могут применяться при получении конструкций нуклеиновой кислоты, например экспрессионных кассет для экспрессии в представляющем интерес растении.

Экспрессионные кассеты могут включать регуляторные последовательности, функционально связанные с последовательностями нуклеиновых кислот PPX, описанными в настоящем документе. Указанная кассета может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный ген, которым котрансформируют организм. В одном из вариантов указанный(ые) дополнительный(ые) ген(ы) могут быть заключены в нескольких экспрессионных кассетах.

Указанные конструкции нуклеиновой кислоты могут содержать множество сайтов рестрикции для вставки последовательностей нуклеиновой кислоты PPX, с регуляцией их транскрипции регуляторными областями. Указанные конструкции нуклеиновой кислоты могут дополнительно содержать молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие гены маркеров селекции.

При получении указанных конструкций нуклеиновой кислоты может применяться любой промотор. Указанный промотор может быть нативным или аналогичным, чужеродным или гетерологичным для растения-хозяина и/или последовательностям нуклеиновых кислот PPX, описанным в настоящем документе. Кроме того, указанный промотор может представлять собой природную последовательность или в одном из вариантов синтетическую последовательность. В том случае, если промотор является чужеродным или гетерологичным для растения-хозяина, предполагается, что указанный промотор не обнаруживается в природном растении, в которое вводят указанный промотор. В том случае, если указанный промотор является чужеродным или гетерологичным последовательностям нуклеиновых кислот PPX, описанным в настоящем документе, предполагается, что указанный промотор не является нативным или встречающимся в природе промотором для функционально связанных последовательностей нуклеиновых кислот PPX, описанных в настоящем документе. В контексте настоящего описания гибридный ген содержит кодирующую последовательность, функционально связанную с областью инициации транскрипции, гетерологичной указанной кодирующей последовательности.

В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями последовательности нуклеиновых кислот PPX, описанные в настоящем изобретении, могут быть экспрессированы с применением гетерологичных промоторов; при получении указанных конструкций могут применяться последовательности нативного промотора. Такие конструк

- 23 035397 ции изменяют уровни экспрессии белка PPX в растении или растительной клетке. Соответственно, изменяется фенотип указанного(ой) растения или растительной клетки. При получении конструкций для контроля экспрессии кодирующей последовательности PPX могут применяться любые промоторы, такие как промоторы для конститутивной, тканеселективной, индуцируемой экспрессии, или другие промоторы для экспрессии в растениях. Конститутивные промоторы включают, например, коровый промотор промотора Rsyn7 и другие конститутивные промоторы, описанные в WO 99/43838 и патенте США № 6072050; коровый промотор CaMV 35S ^'Shell et al. (1985), Nature, 313:810-812); актина риса (McElroy et al. (1990), Plant Cell, 2:163-171); убиквитина (Christensen et al. (1989), Plant Mol. Biol. 12:619632 и Christensen et al. (1992), Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991), Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984), EMBO J. 3:2723-2730); промотор ALS (патент США № 5659026) и т.п. Другие конститутивные промоторы включены, например, в патенты США № 5608149; 5608144; 5604121; 5569597; 5466785; 5399680; 5268463; 5608142 и 6177611. Тканеселективные промоторы могут применяться для направленной экспрессии PPX в определенной ткани растения. Такие тканеселективные промоторы включают, не ограничиваясь перечисленными, специфичные для листьев промоторы, специфичные для корней промоторы, специфичные для семян промоторы и специфичные для стеблей промоторы. Тканеселективные промоторы включают Yamamoto et al. (1997), Plant J. 12(2):255-265; Kawamata et al. (1997), Plant Cell Physiol. 38(7):792-803; Hansen et al. (1997), Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997), Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart et al. (1996), Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996), Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al. (1996), Plant Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994), Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994), Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993), Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138; Matsuoka et al. (1993), Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590 и Guevara-Garcia et al. (1993), Plant J. 4(3):495-505. Указанные конструкции нуклеиновой кислоты также могут включать области терминации транскрипции. При применении областей терминации транскрипции любая область терминации может применяться при получении указанных конструкций нуклеиновой кислоты. Например, указанная область терминации может быть нативной для указанной области инициации транскрипции, может быть нативной для функционально связанной представляющей интерес последовательности PPX, может быть нативной для растения-хозяина, или может быть получена из другого источника (т.е. чужеродного или гетерологичного промотору, представляющей интерес молекуле нуклеиновой кислоты PPX, растению-хозяину или любой их комбинации). Примеры областей терминации, доступных для применения в конструкциях согласно настоящему описанию, включают таковые из Ti-плазмиды A. tumefaciens, такие как области терминации октопинсинтазы и нопалинсинтазы. См. также Guerineau et al. (1991), Mol. Gen. Genet. 262:141-144; Proudfoot (1991), Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991), Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990), Plant Cell, 2:1261-1272; Munroe et al. (1990), Gene 91:151-158; Ballas et al. (1989), Nucleic Acids Res. 17:7891-7903 и Joshi et al. (1987), Nucleic Acid Res. 15:9627-9639.

В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями нуклеиновые кислоты могут быть оптимизированы для повышения экспрессии в трансформированном растении, т.е. нуклеиновые кислоты, кодирующие мутантные белки PPX, могут быть синтезированы с применением кодон-оптимизации для повышения экспрессии в растениях. См., например, описание применения хозяйской кодон-оптимизации у Campbell and Gowri (1990), Plant Physiol. 92:1-11. В данной области техники существуют способы синтеза генов, оптимизированных для растений. См., например, патенты США № 5380831 и 5436391 и Murray et al. (1989), Nucleic Acids Res. 17:477-498.

Кроме того, описанные в настоящем изобретении последовательности нуклеиновых кислот могут быть модифицированы иным образом. Например, известно, что дополнительные модификации последовательностей повышают экспрессию в клетках-хозяевах. Такие модификации включают элиминацию последовательностей, кодирующих ложные сигналы полиаденилирования, сигналы сайтов сплайсинга экзонов/интронов, транспозоноподобные повторы и другие такие хорошо изученные последовательности, которые могут оказывать отрицательное действие на генную экспрессию. Содержание G-С в указанной последовательности также может быть скорректировано до уровней, примерно соответствующих целевым клеткам-хозяевам, согласно подсчетам, основанным на сравнении с известными генами, экспрессируемыми в клетке-хозяине. Кроме того, указанная последовательность может быть модифицирована, чтобы избежать формирования предсказанных вторичных шпилечных структур мРНК. Другие последовательности нуклеиновых кислот могут также применяться при получении конструкций согласно настоящему изобретению, например, для повышения экспрессии кодирующей последовательности РРХ. Такие последовательности нуклеиновых кислот включают интроны AdhI кукурузы, ген intron1 (Callis et al. (1987), Genes and Development 1:1183-1200) и лидерные последовательности (W-последовательность) вируса табачной мозаики (TMV), вируса хлоротичной пятнистости кукурузы и вируса мозаики люцерны (Gallie et al.(1987), Nucleic Acid Res. 15:8693-8711 и Skuzeski et al. (1990), Plant Mol. Biol. 15:65-79, 1990). Было показано, что первый интрон локуса shrunken-1 кукурузы увеличивают экспрессию генов в гибридных генных конструкциях. В патентах США № 5424412 и 5593874 описано применение конкретных интронов в конструкциях для генной экспрессии; Gallie et al. ((1994), Plant Physiol. 106:929-939) также пока

- 24 035397 зали, что интроны подходят для регуляции генной экспрессии тканеспецифическим образом. Для большего усиления или оптимизации экспрессии гена PPX растительные экспрессионные векторы, описанные в настоящем изобретении, могут также содержать последовательности ДНК, содержащие участки прикрепления к матриксу (MAR). Растительные клетки, трансформированные такими модифицированными экспрессионными системами, соответственно, могут демонстрировать сверхэкспрессию или конститутивную экспрессию нуклеотидной последовательности согласно настоящему описанию.

Экспрессионные конструкции, описанные в настоящем изобретении, могут также включать последовательности нуклеиновых кислот, способные направлять экспрессию последовательности PPX в хлоропласты. Такие последовательности нуклеиновых кислот включают нацеленные на хлоропласты последовательности, которые кодируют транзитный пептид хлоропласта для направления представляющего интерес генного продукта в хлоропласты растительной клетки. Такие транзитные пептиды известны в данной области техники. В отношении нацеленных на хлоропласты последовательностей функционально связанный означает, что последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая транзитный пептид (т.е. нацеленная на хлоропласты последовательность), связана с молекулами нуклеиновых кислот PPX, описанными в настоящем патенте таким образом, что указанные две последовательности являются последовательными и находятся в пределах одной и той же рамки считывания. См., например, Von Heijne et al. (1991), Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989), J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987), Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993), Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421 и Shah et al. (1986), Science 233:478-481. В то время как белки PPX, описанные в настоящем изобретении, могут включать нативный транзитный пептид хлоропласта, любой известный в данной области техники транзитный пептид хлоропласта может быть гибридизован с последовательностью аминокислот зрелого белка PPX путем функционального связывания нацеленной на хлоропласты последовательности с 5'-концом нуклеотидной последовательности, кодирующей зрелый белок РРХ. Нацеленные на хлоропласты последовательности известны в данной области техники и включают хлоропластную малую субъединицу рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазы (Rubisco) (de Castro Silva Filho et al. (1996), Plant Mol. Biol. 30:769-780; Schnell et al. (1991), J. Biol. Chem. 266(5):3335-3342); 5-(еноилпирувил)шикимат-3фосфатсинтазу (EPSPS) (Archer et al. (1990), J. Bioenerg. Biomemb. 22(6):789-810); триптофансинтазу (Zhao et al. (1995), J. Biol. Chem. 270(11):6081-6087); пластоцианин (Lawrence et al. (1997), J. Biol. Chem. 272(33):20357-20363); хоризматсинтазу (Schmidt et al. (1993), J. Biol. Chem. 268(36):27447-27457) и светособирающий хлорофилл А/В-связывающий белок (LHBP) (Lamppa et al. (1988), J. Biol. Chem. 263:1499614999). См. также Von Heijne et al. (1991), Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989), J. Biol. Chem. 264:17544-17550; Della-Cioppa et al. (1987), Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993), Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421 и Shah et al. (1986), Science, 233 :478-481.

В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями могут быть получены конструкции нуклеиновой кислоты для направления экспрессии мутантной кодирующей последовательности PPX из хлоропласта растительной клетки. Способы трансформации хлоропластов известны в данной области техники. См., например, Svab et al. (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:913-917; Svab and Maliga (1993), EMBO J. 12:601-606. Указанный способ основан на доставке с помощью генной пушки ДНК, содержащей меркер селекции, и направленном перемещении указанной ДНК в пластидный геном посредством гомологичной рекомбинации. Дополнительно, трансформация пластид может производиться путем трансактивации молчащего трансгена пластидного происхождения посредством тканеселективной экспрессии кодируемой в ядре и направляемой в пластиды РНК-полимеразы. Такая система описана у McBride et al. (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:7301-7305.

Представляющие интерес нуклеиновые кислоты для направленного перемещения в хлоропласт могут быть оптимизированы для экспрессии в указанном хлоропласте с учетом разницы во встречаемости кодонов между ядром растительной клетки и указанной органеллой. Таким образом, представляющие интерес нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы с применением хлоропласт-оптимизированных кодонов. См., например, патент США № 5380831, включенный в настоящий документ посредством ссылки. Указанные конструкции нуклеиновой кислоты могут применяться для трансформирования растительных клеток и регенерирования трансгенных растений, содержащих кодирующие последовательности мутантного РРХ. Существуют разнообразные растительные трансформирующие векторы и способы трансформации растений. См., например, патент США № 6753458, An, G. et al. (1986), Plant Physiol., 81:301-305; Fry, J. et al. (1987), Plant Cell Rep. 6:321-325; Block, M. (1988), Theor. Appl. Genet. 76:767-774; Hinchee et al. (1990), Stadler. Genet. Symp. 203212. 203-212; Cousins et al. (1991), Aust. J. Plant Physiol. 18:481-494; Chee, P.P. and Slightom, J.L. (1992), Gene. 118:255-260; Christou et al. (1992), Trends. Biotechnol. 10:239-246; D'Halluin et al. (1992), Bio/Technol. 10:309-314; Dhir et al. (1992), Plant Physiol. 99:81-88; Casas et al. (1993), Proc. Nat. Acad Sci. USA, 90:11212-11216; Christou, P. (1993), In Vitro Cell. Dev. Biol.-Plant; 29P:119-124; Davies, et al. (1993), Plant Cell Rep. 12:180-183; Dong, J.A. and Mc Hughen, A. (1993), Plant Sci. 91:139-148; Franklin, С.Т. and Trieu, T.N. (1993), Plant. Physiol. 102:167; Golovkin et al. (1993), Plant Sci. 90:41-52; Guo Chin Sci. Bull. 38:2072-2078; Asano, et al. (1994), Plant Cell Rep. 13; Ayeres N.M. and Park, W.D. (1994), Crit. Rev. Plant. Sci. 13:219-239; Barcelo et al. (1994), Plant. J. 5:583-592;

- 25 035397

Becker, et al. (1994), Plant. J. 5:299-307; Borkowska et al. (1994), Acta. Physiol Plant. 16:225- 230; Christou, P.

(1994), Agro. Food. Ind. Hi Tech. 5:17-27; Eapen et al. (1994), Plant Cell Rep. 13:582-586; Hartman et al.

(1994), Bio-Technology 12: 919923; Ritala et al. (1994), Plant. Mol. Biol. 24:317-325; and Wan, У.С. and

Lemaux, P.G. (1994), Plant Physiol. 104:3748. Указанные конструкции могут быть трансформированы в растительных клетках с применением гомологичной рекомбинации.

Данные конструкции, содержащие описанные в настоящем изобретении последовательности нуклеиновых кислот PPX, могут применяться в различных способах получения трансгенных клеток-хозяев, таких как бактерии и дрожжи, и для трансформирования растительных клеток и в некоторых случаях регенерирования трансгенных растений. Например, способы получения трансгенного сельскохозяйственного растения, содержащего мутантные белки PPX, описанные в настоящем изобретении, отличающегося тем, что экспрессия нуклеиновой(ых) кислот(ы) в указанном растении приводит к толерантности к гербицидам по сравнению с растениями дикого типа или с известными растениями с мутантным PPX, включающий (a) введение в растительную клетку экспрессионного вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, кодирующую мутантный белок PPX, и (b) получение из указанной растительной клетки трансгенного растения, которое является гербицидотолерантным.

Мутации РРХ.

Указанные композиции и способы могут относиться по меньшей мере отчасти к мутациями в гене PPX, например мутациям, которые придают растению устойчивость или толерантность к гербициду из семейства ингибирующих PPX гербицидов. Также указанные композиции и способы согласно некоторым вариантам реализации относятся к применению олигонуклеотида репарации генов для получения требуемой мутации в хромосомных или эписомных генных последовательностях растений, кодирующего белок РРХ. Мутантный белок, который может согласно некоторым вариантам реализации в существенной мере поддерживать каталитическую активность белка дикого типа, обеспечивает повышенную устойчивость или толерантность растения к гербициду РРХ-ингибирующего семейства и, таким образом, согласно некоторым вариантам реализации обеспечивает в существенной мере нормальный рост или развитие указанного растения, его органов, тканей или клеток по сравнению с растением дикого типа независимо от присутствия или отсутствия указанного гербицида. Указанные композиции и способы также относятся к нетрансгенной или трансгенной растительной клетке, ген PPX которой подвергся мутации, регенерированному из нее нетрансгенному или трансгенному растению, а также растению, полученному в результате скрещивания с применением регенерированного нетрансгенного или трансгенного растения с растением, содержащим мутацию, например, в другом гене РРХ. Применение указанных мутаций может также быть нацелено на толерантность к данным ингибиторам в растениях, включая сельскохозяйственные растения, водоросли, бактерии, грибы и системы на основе млекопитающих.

В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями по меньшей мере одна мутация мутантного белка PPX может присутствовать в положении аминокислоты, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из положений 52, 85, 105, 111, 130, 139, 143, 144, 145, 147, 165, 167, 170, 180, 185, 192, 193, 199, 206, 212, 219, 220, 221, 226, 228, 229, 230, 237, 244, 256, 257, 270, 271, 272, 305, 311, 316, 318, 332, 343, 354, 357, 359, 360, 366, 393, 403, 424, 426, 430, 438, 440, 444, 455, 457, 470, 478, 483, 484, 485, 487, 490, 503, 508 и 525 последовательности SEQ ID NO: 1.

Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в одном или более положениях аминокислот, соответствующих положению, выбранному из группы, состоящей из положений 58, 64, 74, 84, 93, 97, 98, 101, 119, 121, 124, 139, 150 151, 157, 164, 170, 177, 187, 188, 195, 214, 215, 229, 230, 271, 274, 278, 283, 292, 296, 307, 324, 330, 396, 404, 406, 410, 421, 423, 434, 447, 448, 449, 451, 454, 465, 470 и 50 последовательности SEQ ID NO: 9.

Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 52 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 111 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 130 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 139 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 143 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 147 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX

- 26 035397 содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 165 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 180 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 185 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 192 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 193 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 199 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 206 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 219 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 228 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 229 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 230 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 256 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 270 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 271 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 272 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 305 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 311 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 316 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 318 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 332 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 357 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 359 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 360 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 366 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 403 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 424 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 438 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 440 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 444 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 455

- 27 035397 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 457 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 470 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 478 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению замены фенилаланин^глицин в положении, соответствующем положению 483 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 484 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 485 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 487 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 490 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 503 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 508 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 58 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 64 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 74 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 84 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 93 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 97 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 101 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 119 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 121 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 139 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 150 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 151 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 157 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 164 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 170 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 177 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 187 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 188 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 195 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 214 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 215

- 28 035397 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 229 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 230 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 271 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 274 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 278 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 283 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 292 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 296 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 307 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 324 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 330 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 396 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 404 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 406 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 410 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 421 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 423 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 434 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 447 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 448 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 449 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 451 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 454 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 465 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 470 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 500 последовательности SEQ ID NO: 9.

Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX включает две или более мутации, по меньшей мере одна из которых находится в положении аминокислоты, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из 52, 85, 105, 111, 130, 139, 143, 144, 145, 147, 165, 167, 170, 180, 185, 192, 193, 199, 206, 212, 219, 220, 221, 226, 228, 229, 230, 237, 244, 256, 257, 270, 271, 272, 305, 311, 316, 318, 332, 343, 354, 357, 359, 360, 366, 393, 403, 424, 426, 430, 438, 440, 444, 455, 457, 470, 478, 483, 484, 485, 487, 490, 503, 508 и 525 последовательности SEQ ID NO: 1.

Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX включает две или более мутации, по меньшей мере одна из которых находится в положении аминокислоты, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из 58, 64, 74, 84, 93, 97, 98, 101, 119, 121, 124, 139, 150 151, 157, 164, 170, 177, 187, 188, 195, 214, 215, 229, 230, 271, 274, 278, 283, 292, 296, 307, 324, 330, 396, 404, 406, 410, 421, 423, 434, 447, 448, 449, 451, 454, 465, 470 и 500 последовательности SEQ ID NO: 9.

Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX включает три или более мутации, по меньшей мере одна из которых находится в положении аминокислоты, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из 52, 85, 105, 111, 130, 139, 143, 144, 145, 147, 165, 167, 170,

- 29 035397

180, 185, 192, 193, 199, 206, 212, 219, 220, 221, 226, 228, 229, 230, 237, 244, 256, 257, 270, 271, 272, 305,

311, 316, 318, 332, 343, 354, 357, 359, 360, 366, 393, 403, 424, 426, 430, 438, 440, 444, 455, 457, 470, 478,

483, 484, 485, 487, 490, 503, 508 и 525 последовательности SEQ ID NO: 1.

Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX включает три или более мутации, по меньшей мере одна из которых находится в положении аминокислоты, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из 58, 64, 74, 84, 93, 97, 98, 101, 119, 121, 124, 139, 150 151, 157, 164, 170, 177, 187, 188, 195, 214, 215, 229, 230, 271, 274, 278, 283, 292, 296, 307, 324, 330, 396, 404, 406, 410, 421, 423, 434, 447, 448, 449, 451, 454, 465, 470 и 500 последовательности SEQ ID NO: 9.

В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями, по меньшей мере одна мутация мутантного белка PPX может присутствовать в положении аминокислоты, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из G52, N85, N105, E111, G130, D139, Р143, R144, F145, L147, F165, L167, I170, А180, Р185, Е192, S193, R199, V206, Е212, Y219, А220, G221, L226, М228, K229, А230, K237, S244, R256, R257, K270, Р271, Q272, S305, Е311, Т316, T318, S332, S343, А354, L357, K359, L360, А366, L393, L403, L424, Y426, S430, K438, Е440, V444, L455, K457, V470, F478, F483, D484, I485, D487, K490, L503, V508 и I525 последовательности SEQ ID NO: 1.

В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями, по меньшей мере одна мутация мутантного белка PPX может присутствовать в положении аминокислоты, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из D58, Е64, G74, G84, L93, K97, K98, А101, S119, F121, Т124, N139, Е150, S151, Q157, V164, D170, С177, Н187, L188, N195, Р214, I215, K229, K230, С271, D274, F283, А292, S296, С307, N324, D330, S396, А404, R406, K410, L421, А423, С434, D447, S448, V449, D451, D454, Y465, K470 и T500 последовательности SEQ ID NO: 9.

Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению G52 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению N85 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению Е111 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению G130 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению D139 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению РИЗ последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению R144 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению F145 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению L147 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению F165 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению L167 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 1170 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению А180 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению Р185 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению Е192 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению S193 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению R199 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению V206 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению Е212 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению Y219 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению А220 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный

- 30 035397 белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению G221 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению L226 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению М228 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению K229 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению А230 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению K237 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению S244 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению R256 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению R257 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению K270 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению Р271 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению Q272 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению S305 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению Е311 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению Т316 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению T318 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению S332 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению S343 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению A354 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению L357 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению K359 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению L360 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению A366 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению L393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению L403 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению L424 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению Y426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению S430 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению K438 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению Е440 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению V444 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению L455 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению K457 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению V470 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым

- 31 035397 вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению F478 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению F483 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению D484 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению I485 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению D487 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению K490 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению L503 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению V508 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению I525 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению D58 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению Е64 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению G74 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению G84 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению L93 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению K97 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению K98 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению А101 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению S119 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению F121 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению Т124 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению N139 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению Е150 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению S151 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению Q157 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению VI64 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению D170 последовательности SEQ ID NO: 9.

Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению С177 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению H187 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению L188 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению N195 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению Р214 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению 1215 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению K229 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответст- 32 035397 вующем положению K230 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению С271 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению D274 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению F283 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению А292 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению S296 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению С307 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению N324 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению D330 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению S396 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению А404 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению R406 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению K410 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению L421 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению А423 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению С434 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению D447 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению S448 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению V449 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению D451 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению D454 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению Y465 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению K470 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению Т500 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации белок PPX представляет собой паралог белка PPX Arabidopsis thaliana (например, белок PPX может представлять собой пластидный белок PPX картофеля); указанный белок PPX может содержать N в положении, соответствующем положению 52 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный N заменен на аминокислоту, отличную от N; K в положении, соответствующем положению 272 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный K заменен на аминокислоту, отличную от K; S в положении, соответствующем положению 359 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный S заменен на аминокислоту, отличную от S; и/или S в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный S заменен на аминокислоту, отличную от S. Согласно подобным вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению N52 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению N85 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению R144 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению F145 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению А180 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению Р185 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализа

- 33 035397 ции мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению А220 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению L226 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению М228 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению S244 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению K272 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению S305 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению S332 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению L357 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению S359 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению L393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению L403 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению L424 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению Y426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению F478 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит мутацию в положении аминокислоты, соответствующем положению S525 последовательности SEQ ID NO: 1.

Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX включает две или более мутации, по меньшей мере одна из которых находится в положении аминокислоты, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из G52, N85, R144, F145, А180, Р185, А220, L226, М228, S244, Q272, S305, S332, L357, K359, L393, L403, L424, Y426, F478 и I525 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации белок PPX представляет собой паралог белка PPX Arabidopsis thaliana (например, белок PPX может представлять собой белок PPX картофеля); указанный белок PPX содержит две или более мутации и одно или более из (1) N в положении, соответствующем положению 52 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный N заменен на аминокислоту, отличную от N; (2) K в положении, соответствующем положению 272 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный K заменен на аминокислоту, отличную от K; (3) S в положении, соответствующем положению 359 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный S заменен на аминокислоту, отличную от S; и/или (4) S в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный S заменен на аминокислоту, отличную от S. Согласно подобным вариантам реализации мутантный белок PPX содержит две или более мутации, по меньшей мере одна из которых находится в положении аминокислоты, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из N52, N85, R144, F145, А180, Р185, А220, L226, М228, S244, K272, S305, S332, L357, S359, L393, L403, L424, Y426, F478 и S525 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит три или более мутации, по меньшей мере одна из которых находится в положении аминокислоты, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из G52, N85, R144, F145, А180, Р185, А220, L226, М228, S244, Q272, S305, S332, L357, K359, L393, L403, L424, Y426, F478 и I525 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации белок PPX представляет собой паралог белка PPX Arabidopsis thaliana (например, белок PPX может представлять собой белок PPX картофеля); указанный белок PPX содержит три или более мутации и одно или более из (1) N в положении, соответствующем положению 52 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный N заменен на аминокислоту, отличную от N; (2) K в положении, соответствующем положению 272 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный K заменен на аминокислоту, отличную от K; (3) S в положении, соответствующем положению 359 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный S заменен на аминокислоту, отличную от S; и/или (4) S в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 1, где указанный S заменен на аминокислоту, отличную от S. Согласно подобным вариантам реализации мутантный белок PPX содержит три или более мутации, по меньшей мере одна из которых находится в положении аминокислоты, соответствующем положению, выбранному из группы, состоящей из N52, N85, R144, F145, А180, Р185, А220, L226, М228, S244, K272, S305, S332, L357, S359, L393, L403, L424, Y426, F478 и S525 последовательности SEQ ID NO: 1.

- 34 035397 способами и/или композициями мутантный белок PPX может содержать одну или более мутаций, выбранных из мутаций, приведенных в табл. 1.

Таблица 1

Мутации аминокислот в белке PPX Arabidopsis thaliana

G52K	F145Y	A220I	M228L	S332C	L393S	Y426C	Y426R
N85D	А180Т	A220L	S244G	L357I	L393V	Y426F	Y426T
R144C	Р185Н	А220Т	S244T	K359R	L403R	Y426H	Y426V
R144H	P185R	A220V	Q272F	К359Т	L403S	Y426I	F478S
F145L	А220С	L226M	S305L	L393M	L424S	Y426L	I525T
E111V	L147V	S193T	A230F	P271R	L360K	L455V	I485E
G130N	F165N	R199L	R256H	E311R	А366Е	K457V	K490N
D139H	P185Y	V206F	R256S	T318G	K438S	V470S	L503F
P143R	E192D	Y219S	К270Е	S332L	Е440К	V470Y	V508T
R144L	Е192К	K229Q	K270Q	L360D	V444I	D484A

В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями, указанная одна или более мутаций в мутантном гене PPX может кодировать мутантный белок PPX, содержащий одну или более мутацию, две или более мутации или три или более мутации, выбранные из группы, состоящей из замены глицин^лизин в положении, соответствующем положению 52 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены глицин^аспарагин в положении, соответствующем положению 130 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аргинин^тистидин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аргинин ^лейцин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лейцин^валин в положении, соответствующем положению 147 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены пролин^гистидин в положении, соответствующем положению 185 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены глутаминовая кислота^лизин в положении, соответствующем положению 192 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аргинин ^лейцин в положении, соответствующем положению 199 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены валин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 206 последовательности

- 35 035397

SEQ ID NO: 1;

замены тирозин^серин в положении, соответствующем положению 219 последовательности

SEQ ID NO: 1;

замены аланин^цистеин в положении, соответствующем положению 220 последовательности

SEQ ID NO: 1;

замены аланин^лейцин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 270 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены серин^лейцин в положении, соответствующем положению 305 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены треонин^глицин в положении, соответствующем положению 316 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены треонин^г лицин в положении, соответствующем положению 318 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены серина лейцин в положении, соответствующем положению 332 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лейцина-изолейцин в положении, соответствующем положению 357 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лизинг-аргинин в положении, соответствующем положению 359 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лизинг-треонин в положении, соответствующем положению 359 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лейцина лизин в положении, соответствующем положению 360 последовательности SEQ ID NO 1;

замены аланин^глутаминовая кислота в положении, соответствующем положению 366 последова- 36 035397 тельности SEQ ID NO: 1;

замены лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 393 последовательности

SEQ ID NO: 1;

замены лейцин^серин в положении, соответствующем положению 393 последовательности

SEQ ID NO: 1;

замены лейцин^валин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лейцин^аргинин в положении, соответствующем положению 403 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лейцин^серин в положении, соответствующем положению 403 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лизинг-серин в положении, соответствующем положению 438 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены глутаминовая кислота^лизин в положении, соответствующем положению 440 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лизин^валин в положении, соответствующем положению 457 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены валин^треонин в положении, соответствующем положению 508 последовательности SEQ ID NO: 1; и замену изолейцин^треонин в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 1.

- 37 035397 способами и/или композициями мутантный ген PPX может кодировать мутантный белок PPX, который содержит замену глицина лизин в положении, соответствующем положению 52 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену глутаминовая кислота^валин в положении, соответствующем положению 111 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену глицин^аспарагин в положении, соответствующем положению 130 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагиновая кислота^-гистидин в положении, соответствующем положению 139 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену пролин^аргинин в положении, соответствующем положению 143 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аргинин^ лейцин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аргинин^гистидин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену фенилаланина лейцин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену фенилаланин^тирозин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^валин в положении, соответствующем положению 147 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену фенилаланин^аспарагин в положении, соответствующем положению 165 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 180 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену пролин^гистидин в положении, соответствующем положению 185 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену пролин^аргинин в положении, соответствующем положению 185 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену пролин^тирозин в положении, соответствующем положению 185 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену глутаминовая кислота^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 192 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену глутаминовая кислотам лизин в положении, соответствующем положению 192 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^треонин в положении, соответствующем положению 193 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аргинина лейцин в положении, соответствующем положению 199 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену валин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 206 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^серин в положении, соответствующем положению 219 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин^цистеин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин^изолейцин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин^лейцин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению

- 38 035397

220 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин^валин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену метионин^ лейцин в положении, соответствующем положению 228 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лизин^глутамин в положении, соответствующем положению 229 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 230 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^глицин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^треонин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аргинин^гистидин в положении, соответствующем положению 256 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аргинин^серин в положении, соответствующем положению 256 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лизин^глутаминовая кислота в положении, соответствующем положению 270. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лизин^глутамин в положении, соответствующем положению 270. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену пролин^аргинин в положении, соответствующем положению 271 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену глутамин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 272 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^треонин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^лейцин в положении, соответствующем положению 305 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену глутаминовая кислота^аргинин в положении, соответствующем положению 311 последовательности SEQ ID NO: I. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену треонин^глицин в положении, соответствующем положению 316 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену треонин^глицин в положении, соответствующем положению 318 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^цистеин в положении, соответствующем положению 332 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^лейцин в положении, соответствующем положению 332 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^изолейцин в положении, соответствующем положению 357 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лизин^аргинин в положении, соответствующем положению 359 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лизин^треонин в положении, соответствующем положению 359 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^лизин в положении, соответствующем положению 360 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 360 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин^глутаминовая кислота в положении, соответствующем положению 366 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам

- 39 035397 реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^валин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^аргинин в положении, соответствующем положению 403 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 403 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 424 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^цистеин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозина гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^изолейцин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^ лейцин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^аргинин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^·треонин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^валин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лизинг-серин в положении, соответствующем положению 438 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену глутаминовая кислотам лизин в положении, соответствующем положению 440 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену валин^изолейцин в положении, соответствующем положению 444 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^валин в положении, соответствующем положению 455 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лизинг-валин в положении, соответствующем положению 457 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену валин^серин в положении, соответствующем положению 470 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену валин^тирозин в положении, соответствующем положению 470 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену фенилаланин^серин в положении, соответствующем положению 478 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену фенилаланин^глицин в положении, соответствующем положению 483 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагиновая кнслота^аланин в положении, соответствующем положению 484 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену изолейцин^глутаминовая кислота в положении, соответствующем положению 485 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лизинг-аспарагин в положении, соответствующем положению 490 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 503 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену валин^треонин в положении, соответствующем положению 508 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вари- 40 035397 антам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену изолейцин>треонин в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 1.

В табл. 2 приведен обзор нуклеотидных/кодонных мутаций в пластидном гене PPX Arabidopsis, приводящих к заменам аминокислот, которые придают толерантность к ингибиторам РРХ. Номера положений основаны на нумерации в пластидном гене PPX Arabidopsis No. At4g01690 (SEQ ID NO: 1).

Таблица 2

AK	НК мтц
МТЦ
G52K	GGG -> AAA
N85D	AAT -+ GAT
R144C	AGG -+ TGC AGG -+ TGT
R144H	AGG -+ CAC AGG -+ CAT
F145L	TTT -+ CTT
F145Y	TTT -+ TAT
A180T	GCA -+ АСА
P185H	CCG -+ CAC CCG -+ CAT
P185R	CCG -+ CGG
A220C	GCT -+ TGT

AK МТЦ	НК мтц
A220I	GCT -+ ATT
A220L	GCT -+ CTT
A220T	GCT -+ ACT
A220V	GCT -+ GTT
L226M	GTG -+ ATG
M228L	ATG -+ CTG
S244G	AGC -+ GGC
S244T	AGC -+ ACC
Q272F	CAG -+ TTC CAG -+ TTT
S305L	TCA -+ TTA

AK МТЦ	НК мтц
S332C	TCT -+ TGT
L357I	CTC -+ АТС
K359R	AAA -+ AGA
K359T	AAA -+ ACT
L393M	TTG -+ ATG
L393S	TTG -+ TCG
L393V	TTG -+ GTG
L403R	TTA -+ CGA
L403S	TTA -+ TCA
L424S	TTG -+ TCG

AK МТЦ	НК мтц
Y426C	TAC —>	TGC
Y426F	TAC —>	TTC
Y426H	TAC —>	CAC
Y426I	TAC —>	АТС
Y426L	TAC -+ TAC —>	TTA CTC
Y426R	TAC —> CGC
Y426T	TAC —>	ACC
Y426V	TAC —>	GTC
F478S	TTT -+	TCT
S525T	ATT —>	ACT

АК мтц относится к мутации аминокислоты;

НК мтц относится к мутации нуклеиновой кислоты.

В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями мутантный ген PPX может содержать замену GGG >AAA, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену глицин>лизин в положении, соответствующем положению 52 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты AAT >GAT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагин>аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты AGG >TGC или TGT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аргинин>цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты AGG >САС или CAT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аргинин>гистидин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ТТТ>СТТ, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену фенилаланин>лейцин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ТТТ>ТАТ, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену фенилаланин>тирозин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GCA>ACA, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин>треонин в положении, соответствующем положению 180 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты CCG>CAC или CAT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену пролин>аргинин в положении, соответствующем положению 185 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты CCG>CGT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену пролин>гистидин в положении, соответствующем положению 185 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты CCG>CGG, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену пролин>аргинин в положении, соответствующем положению 185 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GCT>TGT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин>цистеин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GCT>ATT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену ала- 41 035397 нин^изолейцин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GCT^-СТТ, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланина лейцин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GCT^ACT. которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GCT^GTT. которая кодирует мутантный белок PPX. который содержит замену аланин^валин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GTG^ATG. которая кодирует мутантный белок PPX. который содержит замену лейцина метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ATG^CTG. которая кодирует мутантный белок PPX. который содержит замену метионина лейцин в положении, соответствующем положению 228 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты AGC^GGC. которая кодирует мутантный белок PPX. который содержит замену серин^глицин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты AGC^-АСС. которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^треонин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты CAG^-ТТС или ТТТ, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену глутамин^аспарагин в положении, соответствующем положению 272 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ТСА^ТТА. которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^лейцин в положении, соответствующем положению 305 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ТСТ^ТОТ, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^цистеин в положении, соответствующем положению 332 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты СТС^АТС. которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^изолейцин в положении, соответствующем положению 357 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты AAA^AGA. которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лизинг-аргинин в положении, соответствующем положению 359 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты AAA^ACT. которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лизин^треонин в положении, соответствующем положению 359 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты TTG^ATG. которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты TTG^TCG. которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин ^-серин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты TTG^GTG. которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^валин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты TTA^CGA. которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^аргинин в положении, соответствующем положению 403 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ТТА^ТСА. которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 403 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты TTG^TCG. которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 424 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ТАС^-TGC. которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^цистеин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ТАС^ТТС. которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тиро

- 42 035397 зин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ТАС^САС, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ТАС^АТС, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^изолейцин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ТАС^ТТА или СТС, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^лейцин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ТАС^-C’GC’, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^аргинин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ТАС^АСС, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^треонин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ТАС^-GTC, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^валин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ТТТ^ТСТ, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену фенилаланин^серин в положении, соответствующем положению 478 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ATTRACT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену изолейцин^треонин в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 1.

В табл. 3A приведен обзор нуклеотидных/кодонных мутаций в пластидном гене PPX картофеля, приводящих к заменам аминокислот, которые придают толерантность к ингибиторам РРХ. Номера положений основаны на нумерации пластидного гена PPX Arabidopsis No. At4g01690 (SEQ ID NO: 1).

Таблица 3A

АК мтц	НК мтц
N52K	ААТ—> ААА
N85D	ААТ -+ GAT
R144C	CGC -+ TGC
R144H	CGC -+ САС
F145L	ттт -+ стт
F145Y	ТТТ -+ ТАТ
А180Т	GCC -+ АСС
Р185Н	ССТ -> CAT
P185R	ССТ -> CGT
А220С	GCC -+ TGC

АК мтц	НК мтц
A220I	GCC -+ АТС
A220L	GCC -+ СТС
А220Т	GCC -+ АСС
A220V	GCC -+ GTC
L226M	TTG -+ ATG
M228L	ATG -> CTG
S244G	AGC -+ GGC
S244T	AGC -+ АСС
K272F	ААА -+ ТТТ ААА -+ ТТС
S305L	ТСТ -+ СТТ

АК мтц	НК мтц
S332C	AGT -+ TGT
L357I	СТТ -+ АТТ
S359R	AGT -> AGA
S359T	AGT -> ACT
L393M	TTG -+ ATG
L393S	TTG -+ TCG
L393V	TTG -+ GTG
L403R	СТА -+ CGA
L403S	СТА -+ TCA
L424S	TTG -+ TCG

AK МТЦ	НК мтц
Y426C	TAC -+ TGC
Y426F	TAC -+ TTC
Y426H	TAC -+ CAC
Y426I	TAC -+ АТС
Y426L	TAC -+ TTA TAC -+ CTC
Y426R	TAC -+ CGC
Y426T	TAC -+ ACC
Y426V	TAC -+ GTC
F478S	TTT -+ TCT
S525T	TCT -+ ACT

АК мтц относится к мутации аминокислоты;

Согласно некоторым вариантам реализации в соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями, указанная одна или более мутаций в мутантном гене PPX может кодировать мутантный белок PPX, содержащий одну или более мутацию, две или более мутации, или три или более мутации, выбранные из группы, состоящей из замены аспарагин^лизин в положении, соответствующем положению 52 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аргинин^·цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены фенилаланин^лейцин в положении, соответствующем положению 145 последовательности

- 43 035397

SEQ ID NO: 1;

замены фенилаланин^гирозин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены аланин^треонин в положении, соответствующем положению 180 последовательности

SEQ ID NO: 1;

замены аланин^-треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены лейцин^-метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены серин^-треонин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены серина цистеин в положении, соответствующем положению 332 последовательности SEQ ID NO: 1;

замены тирозин^лейцин в положении, соответствующем положению 426 последовательности

- 44 035397

SEQ ID NO: 1;

замены тирозин^аргинин в положении, соответствующем положению 426 последовательности

SEQ ID NO: 1;

замены тирозин^треонин в положении, соответствующем положению 426 последовательности

SEQ ID NO: 1;

замены фенилаланин^серин в положении, соответствующем положению 478 последовательности SEQ ID NO: 1; и замены изолейцин^треонин в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 1.

Согласно некоторым вариантам реализации в соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями, мутантный ген PPX может кодировать мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагина лизин в положении, соответствующем положению 52 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аргинин^гистидин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену фенилаланина лейцин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену фенилаланин^тирозин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 180 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену пролин^гистидин в положении, соответствующем положению 185 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену пролин^аргинин в положении, соответствующем положению 185 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин^цистеин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин^изолейцин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланина лейцин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин^валин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену метионин^лейцин в положении, соответствующем положению 228 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^глицин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^треонин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лизинг-фенилаланин в положении, соответствующем положению 272 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^треонин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^лейцин в положении, соответствующем положению 305 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный бе- 45 035397 лок PPX, который содержит замену серин^цистеин в положении, соответствующем положению 332 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^изолейцин в положении, соответствующем положению 357 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^аргинин в положении, соответствующем положению 359 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^треонин в положении, соответствующем положению 359 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^валин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^аргинин в положении, соответствующем положению 403 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 403 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 424 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^цистеин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^·изолейцин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозина лейцин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^аргинин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^треонин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^валин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену фенилаланин^серин в положении, соответствующем положению 478 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену изолейцин^треонин в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 1.

Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты AAT^AAA. которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагин^лизин в положении, соответствующем положению 52 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты AAT^GAT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты CGC^TGC, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты CGC^-САС, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аргинин^гистидин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ТТТ^СТТ, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену фенилаланин^лейцин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ТТТ^ТАТ, которая кодирует мутант

- 46 035397 ный белок PPX, который содержит замену фенилаланин^тирозин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GCC^ACC, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин ^треонин в положении, соответствующем положению 180 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты CCT^CAT. которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену пролин^аргинин в положении, соответствующем положению 185 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты CCT^-CGT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену пролин^гистидин в положении, соответствующем положению 185 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GCC^TGC, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин^цистеин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GCC^ATC, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин^изолейцин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GCC^-CTC, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланина лейцин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GCC^ACC, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GCC^GTC, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин^валин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты TTG^ATG, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ATG^CTG, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену метионина-лейцин в положении, соответствующем положению 228 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты AGC^GGC, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^глицин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты AGC^ACC, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^треонин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты AAA^AAT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лизинг-фенилаланин в положении, соответствующем положению 272 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ТСТ^-СТТ, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серина-лейцин в положении, соответствующем положению 305 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты AGT^TGT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^цистеин в положении, соответствующем положению 332 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты СТТ^АТТ, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^изолейцин в положении, соответствующем положению 357 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты AGT^AGA, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^аргинин в положении, соответствующем положению 359 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты AGT^ACT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^треонин в положении, соответствующем положению 359 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты TTG^ATG, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты TTG^-TCG, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нук

- 47 035397 леиновой кислоты TTG^-GTG, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^валин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты СТА^-CCjA, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^аргинин в положении, соответствующем положению 403 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты СТАЙТСА, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 403 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты TTG^TCG, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 424 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты TAC^TGC, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^цистеин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты TAC^AAC, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты TAC^CAC, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты TAC^ATC, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^изолейцин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты TAC^TTC, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозина лейцин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты TAC^CGC, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^аргинин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты TAC^ACC, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^треонин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты TAC^GTC, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^валин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты TTT^TCT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену фенилаланин^серин в положении, соответствующем положению 478 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты TCT^ACT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену изолейцин^треонин в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 7.

В табл. 3B приведен обзор нуклеотидных/кодонных мутаций в митохондриальном гене PPX картофеля, приводящих к заменам аминокислот, которые придают толерантность к ингибиторам РРХ. Номера положений основаны на нумерации митохондриального гена PPX Solanum tuberosum No. AJ225108 (SEQ ID NO: 9).

Таблица 3B

AK мтц	НК мтц	AK МТЦ	НК мтц	AK МТЦ	НК мтц	AK МТЦ	НК мтц
D58N	GAT -μ AAT	S151T	AGT -+ ACT	K229Q	AAG -+ CAG	R406K	AGG -+ AAG
E64V	GAA -μ GTA	Q157L	CAG -+ CTG	K230R	AAG -+ AGG	K410I	AAA—> ATA
G74C	GGT -> TGT	V164F	GTT -+ TTT	F283G	GAC -+ GGC	A423V	GCT -+ GTT
G84N	GGA -> GAT	D170E	GAT -+ GAA	A292G	GCA -+ GGA	C434S	TGC -+ AGC
R98C	CGC -μ CAC	H187Q	AAG -+ CAG	S296L	TCA -+ TTA	C434Y	TGC -+ TAC
R98H	CGC -+ TGC	L188F	CTT -+ TTT	C307S	TGT -+ AGT	S448A	TCA -+ GCA
R98L	CGC -+ CTC	N195K	AAT—> AAA	N324D	AAT -+ GAT	D451G	GAT -+ GGT
N139Y	CCT -+ TAT	P214H	CCT -+ CAT	N324K	AAT—> AAA	D454N	GAC -+ AAC
E150D	GAA -+ GAT	P214S	CCT -+ TCT	D330E	GAT -+ GAA	Y465F	TAT -+ TTT
E150K	GAA—> AAA	K229E	AAG -+ GAG	A404S	GCC -+ TCC	K470T	AAG -+ ACG
T500S	ACC -+ AGC

- 48 035397

АК мтц относится к мутации аминокислоты;

В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями мутантный ген PPX может кодировать мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагиновая кислота^аспарагин в положении, соответствующем положению 58 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену глутаминовая кислота^валин в положении, соответствующем положению 64 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену глицин^цистеин в положении, соответствующем положению 74 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену глицин^аспарагин в положении, соответствующем положению 84 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^гистидин в положении, соответствующем положению 93 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лизинг-аргинин в положении, соответствующем положению 97 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аргинин^гистидин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аргинина лейцин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин^валин в положении, соответствующем положению 101 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^аспарагин в положении, соответствующем положению 119 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену фенилаланина лейцин в положении, соответствующем положению 121 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену треонин^изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагин^-тирозин в положении, соответствующем положению 139 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену глутаминовая кислота^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 150 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену глутаминовая кислотам лизин в положении, соответствующем положению 150 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^треонин в положении, соответствующем положению 151 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену глутамина лейцин в положении, соответствующем положению 157 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену валин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 164 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену валин^аланин в положении, соответствующем положению 164 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагиновая кислота^глутаминовая кислота в положении, соответствующем положению 170 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену цистеин^серин в положении, соответствующем положению 177 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену гистидин^глутамин в положении, соответствующем положению 187 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 188 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагин^лизин в положении, соответствующем положению 195 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, кото- 49 035397 рый содержит замену пролина гистидин в положении, соответствующем положению 214 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену пролин^серин в положении, соответствующем положению 214 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену изолейцин^гистидин в положении, соответствующем положению 215 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену изолейцин^серин в положении, соответствующем положению 215 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лизин^глутаминовая кислота в положении, соответствующем положению 229 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лизин^глутамин в положении, соответствующем положению 229 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лизин^аргинин в положении, соответствующем положению 230 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену цистеин^аргинин в положении, соответствующем положению 271 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагиновая кислота^глицин в положении, соответствующем положению 274 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагиновая кислота^глицин в положении, соответствующем положению 278 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену фенилаланин^глицин в положении, соответствующем положению 283 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин^глицин в положении, соответствующем положению 292 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^лейцин в положении, соответствующем положению 296 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену цистеин^серин в положении, соответствующем положению 307 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 324 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагин^лизин в положении, соответствующем положению 324 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагиновая кислота^глутаминовая кислота в положении, соответствующем положению 330 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серина лейцин в положении, соответствующем положению 396 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин^серин в положении, соответствующем положению 404 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аргинин^лизин в положении, соответствующем положению 406 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лизин^изолейцин в положении, соответствующем положению 410 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^валин в положении, соответствующем положению 421 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин^валин в положении, соответствующем положению 423 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену цистеин^серин в положении, соответствующем положению 434 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену цистеин^тирозин в положении, соответствующем положению 434 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагиновая кислота^глицин в положении, соответствующем положению 447 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^аланин в положении, соответствующем положению 448 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутант

- 50 035397 ный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену валин^глутаминовая кислота в положении, соответствующем положению 449 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагиновая кислота^глицин в положении, соответствующем положению 451 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагиновая кислота^аспарагин в положении, соответствующем положению 454 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 465 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лизин^-треонин в положении, соответствующем положению 470 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену треонин^серин в положении, соответствующем положению 500 последовательности SEQ ID NO: 9.

В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GAT^AAT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагиновая кислота^аспарагин в положении, соответствующем положению 58 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GAA^GTA, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену глутаминовая кислота^валин в положении, соответствующем положению 64 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GGT^TGT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену глицин^цистеин в положении, соответствующем положению 74 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GGA^GAT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену глицин^аспарагин в положении, соответствующем положению 84 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты CGC^TGC, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты CGC^GAG, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аргинин^гистидин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты CGC^GTG, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аргинин^лейцин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ААТ^ТАТ, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагин^-тирозин в положении, соответствующем положению 139 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GAA^GAT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену глутаминовая кислота^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 150 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GAA^AAA, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену глутаминовая кислота^лизин в положении, соответствующем положению 150 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты AGT^ACT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^-треонин в положении, соответствующем положению 151 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты CAG^CTG, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену глутамин^лейцин в положении, соответствующем положению 157 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GTT^-TTT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену валин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 164 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GAT^GAA, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагиновая кислота^глутаминовая кислота в положении, соответствующем положению 170 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты СAС^CAG, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену гистидина глутамин в положении, соответствующем положению 187 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит

- 51 035397 мутацию нуклеиновой кислоты СТТ^-ТТТ, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лейцин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 188 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты AAT^AAA, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагин^лизин в положении, соответствующем положению 195 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты CCT^-CAT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену пролин^гистидин в положении, соответствующем положению 214 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ССТ^ТСТ. которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену пролин^серин в положении, соответствующем положению 214 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты AAG^GAG, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лизинг-глутаминовая кислота в положении, соответствующем положению 229 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты AAG^CAG, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты AAG^AGG, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лизинг-аргинин в положении, соответствующем положению 230 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GAC^-GGC, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагиновая кислота^глицин в положении, соответствующем положению 283 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ТСА^ТТА. которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^· лейцин в положении, соответствующем положению 296 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты TGT^AGT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену цистеин^серин в положении, соответствующем положению 307 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты AAT^GAT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 324 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты AAT^AAA, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагина лизин в положении, соответствующем положению 324 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GAT^GAA, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагиновая кислота^глутаминовая кислота в положении, соответствующем положению 330 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GC'C'^-ТСС. которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин^серин в положении, соответствующем положению 404 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты AGG^AAG, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аргинин^лизин в положении, соответствующем положению 406 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ЛЛЛ^АТА. которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лизинг изолейцин в положении, соответствующем положению 410 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты XXX GCT^GTT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аланин^валин в положении, соответствующем положению 423 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты TGC’^AGC. которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену цистеин^серин в положении, соответствующем положению 434 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты TGC'^-ТАС. которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену цистеин^тирозин в положении, соответствующем положению 434 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ТСА^-GCA, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену серин^аланин в положении, соответствующем положению 448 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GAT^GGT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагиновая кислота^глицин в положении, соответствующем положению 451 по

- 52 035397 следовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты GAC >ААС, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагиновая кислота>аспарагин в положении, соответствующем положению 454 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ТАТ>ТТТ, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену тирозин>фенилаланин в положении, соответствующем положению 465 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты AAG>ACG, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену лизин>треонин в положении, соответствующем положению 470 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты ACC>AGC, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену треонин>серин в положении, соответствующем положению 500 последовательности SEQ ID NO: 9.

В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями, мутантный ген PPX может содержать замену GGG >AAA, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену глицин>лизин в положении, соответствующем положению 52 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный ген PPX содержит мутацию нуклеиновой кислоты AAT >GAT, которая кодирует мутантный белок PPX, который содержит замену аспарагин>аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации в соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями мутантный ген PPX может включать комбинацию мутаций, например, двух или более, трех или более, четырех или более, пяти или более или шести или более мутаций в гене РРХ. Согласно некоторым вариантам реализации указанная комбинация мутаций выбрана из комбинаций мутаций, приведенных в табл. 4A и 4B.

Таблица 4А

Комбинации мутаций аминокислот (каждая строка каждой группы из трех столбцов представляет комбинацию мутаций). Номера положений основаны на нумерации _____________пластидного гена Arabidopsis PPX No. At4g01690 (SEQ ID NO: 1)______

R144C	А220Т
R144H	S332C
R144C	Q272F
R144C	K272F
G52K	R144H	S244T
N52K	R144H	S244T
N85D	А220Т
R144H	S244T
R144C	L226M
N85D	L226M
N85D	F145Y
R144C	M228L
N85D	А180Т
N85D	R144C
N85D	Q272F
N85D	K272F
N85D	M228L
А180Т	Y426F
F145L	Y426H
S244G	Y426F
F145L	L403R
F145Y	L424S
R144C	L424S
L226M	Y426H
А220Т	L424S
F145Y	Y426F
R144C	L393V
S244G	I525T
А180Т	I525T
S244G	L393V
L226M	L403R

L226M	L424S
L226M	Y426F
А220Т	Y426F
А220Т	Y426H
R144C	Y426F
N85D	Y426H
R144C	Y426H
S244T	Y426H
S244G	Y426H
А180Т	Y426H
L226M	Y426H
F145L	Y426H
А220Т	Y426H
N85D	Y426H
F145L	L393V
L226M	L424S
L226M	Y426F
А220Т	L393V
А220Т	Y426F
R144C	Y426F
N85D	I525T
L226M	I525T
F145Y	I525T
F145L	I525T
R144C	I525T
R144C	Y426H
А180Т	Y426H
А220Т	Y426H
L226M	Y426H
S244T	L393V
F145Y	Y426H

F145L	L424S
А220Т	Y426H
F145Y	L393V
S244T	Y426F
F145Y	L424S
А220Т	L403R
L226M	Y426F
N85D	Y426H
L226M	L424S
F145Y	L403R
S244G	L393V
А180Т	Y426H
R144C	Y426H
N85D	S525T
L226M	S525T
F145Y	S525T
F145L	S525T
S244G	S525T
А180Т	S525T
R144C	S525T

В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями мутантный белок PPX содержит замену аргинин>цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену аланин>треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин>гистидин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену серин>цистеин в положении, соответствующем положению 332 последовательности SEQ ID NO: 1. В то же время, согласно другим

- 53 035397 вариантам реализации мутантный белок РРХ содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену глутамин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 272 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену глицина лизин в положении, соответствующем положению 52 последовательности SEQ ID NO: 1, замену аргннин^гистндин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену серин^треонин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^гистидин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену серин^треонин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену фенилаланин^тирозин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену метионина лейцин в положении, соответствующем положению 228 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 180 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену глутамин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 272 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену метионин^лейцин в положении, соответствующем положению 228 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 180 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^лейцин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозина гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену серин^глицин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^лейцин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^аргинин в положении, соответствующем положению 403 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^тирозин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 424 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 424 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену ала

- 54 035397 нин^треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 424 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^тирозин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^валин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену серин^глицин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^валин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^аргинин в положении, соответствующем положению 403 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 424 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозина гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену серин^треонин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену серин^глицин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозина гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 180 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^· гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^· гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^лейцин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^·гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^·гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^лейцин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^валин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит

- 55 035397 замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 424 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^валин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 180 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену серин^треонин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^валин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^тирозин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену изолейцин^треонин в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^лейцин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 424 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^тирозин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^валин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену серин^треонин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^тирозин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 424 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^аргинин в положении, соответствующем положению 403 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последова

- 56 035397 тельности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 424 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^тирозин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^аргинин в положении, соответствующем положению 403 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену серин^глицин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^валин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин ^треонин в положении, соответствующем положению 180 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену серин^глицин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену изолейцин^треонин в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 180 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену изолейцин^треонин в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^лейцин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену изолейцин^треонин в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^тирозин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену изолейцин^треонин в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену изолейцин^треонин в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену изолейцин^треонин в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 1.

В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями, мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^гистидин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену серин ^цистеин в положении, соответствующем положению 332 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 7, и замену лизинг-фенилаланин в положении, соответствующем положению 272 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аспарагина лизин в положении, соответствующем положению 52 последовательности SEQ ID NO: 7, замену аргинин^гистидин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 7, и замену серин^треонин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^гистидин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену серин^треонин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^метионин в положении, соответствующем

- 57 035397 положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену фенилаланин^тирозин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену метионин^лейцин в положении, соответствующем положению 228 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 180 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лизинг-фенилаланин в положении, соответствующем положению 272 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену метионин^лейцин в положении, соответствующем положению 228 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 180 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^лейцин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену серин^глицин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^лейцин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^аргинин в положении, соответствующем положению 403 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^тирозин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 424 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинина цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 424 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозина гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 424 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^тирозин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин ^-цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^валин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену серин^глицин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^валин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^аргинин в положении, соответствующем положению 403 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 424 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1, и

- 58 035397 замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^· гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинина цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозина гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену серин^треонин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозина гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену серин^глицин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозина гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^греонин в положении, соответствующем положению 180 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозина гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозина гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^леицин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозина гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозина гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозина гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^лейцин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^валин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 424 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^валин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^· треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^треонин в

- 59 035397 положении, соответствующем положению 180 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену серин^треонин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^валин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^тирозин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 7, и замену изолейцин^треонин в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^лейцин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 424 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^тирозин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^валин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену серин^треонин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^тирозин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 424 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^аргинин в положении, соответствующем положению 403 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозина гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^серин в положении, соответствующем положению 424 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^тирозин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^аргинин в положении, соответствующем положению 403 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену серин^глицин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену лейцин^валин в положении, соответствующем положению 393 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^треонин в положении, соответствующем положению 180 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену тирозин^гистидин в положении, соответствующем положению 426 последовательности SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену серин^глицин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену изолейцин^треонин в положении, соответствующем положению 525 последовательности

- 60 035397

SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену серин^глицин в положении, соответствующем положению 244 последовательности SEQ ID NO: 7, и замену изолейцин^треонин в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аланин^-треонин в положении, соответствующем положению 180 последовательности SEQ ID NO: 7, и замену изолейцин^треонин в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^лейцин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 7, и замену изолейцин^треонин в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланин^тирозин в положении, соответствующем положению 145 последовательности SEQ ID NO: 7, и замену изолейцин^треонин в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 85 последовательности SEQ ID NO: 7, и замену изолейцин^треонин в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 7. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену лейцин^метионин в положении, соответствующем положению 226 последовательности SEQ ID NO: 7, и замену изолейцин^треонин в положении, соответствующем положению 525 последовательности SEQ ID NO: 7.

Таблица 4B

Комбинации мутаций аминокислот (каждая строка каждой группы из двух столбцов представляет комбинацию мутаций). Номера положений основаны на нумерации митохондриального гена PPX Solanum tuberosum No. AJ225108 (SEQ ID NO: 9)

G74C	R98C				R98C	Р214Н
L93H	V164A					R98C	T124I	L188F	K229Q
R98L	Р214Н					R98C	T124I	Р214Н	K229Q
R98L	T124I	L188F	K229Q			R98C	T124I	K229Q
R98L	T124I	Р214Н	K229Q			R98C	Р214Н	A423V
R98L	T124I	K229Q				R98C	T124I	L188F	K229Q	A423V
S119N	N139Y					R98C	T124I	Р214Н	K229Q	A423V
F121L	E150D					R98C	T124I	K229Q	A423V
S151T	К229Е	K230R				R98C	Р214Н	C307S
Q157L	H187Q					R98C	T124I	L188F	K229Q	C307S
C271R	D274G					R98C	T124I	Р214Н	K229Q	C307S
C307S	A423V					R98C	T124I	K229Q	C307S
S396L	K410I					R98H	Р214Н
C434S	T500S					R98H	T124I	L188F	K229Q
D447G	A292G					R98H	T124I	Р214Н	K229Q
S448A	N324D					R98H	T124I	K229Q
Y465F	К470Т					R98H	Р214Н	A423V
R98L	Р214Н	A243V				R98H	T124I	L188F	K229Q	A423V
R98L	T124I	L188F	K229Q	A243V		R98H	T124I	Р214Н	K229Q	A423V
R98L	T124I	Р214Н	K229Q	A243V		R98H	T124I	K229Q	A423V
R98L	T124I	K229Q	A423V			R98H	Р214Н	C307S
R98L	Р214Н	C307S				R98H	T124I	L188F	K229Q	C307S
R98L	T124I	L188F	K229Q	C307S		R98H	T124I	Р214Н	K229Q	C307S
R98L	T124I	Р214Н	K229Q	C307S		R98H	T124I	K229Q	C307S
R98L	T124I	K229Q	C307S

В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями, мутантный белок PPX содержит замену глицин^цистеин в положении, соответствующем положению 74 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену лейцин^гистидин в положении, соответствующем положению 93 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену валин^аланин в положении, соответствующем положению 164 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^лейцин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену пролин^гистидин в положении, соответствующем положению 214 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^лейцин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9, замену треонин^изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9, замену лейцин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 188 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену лизин^глутамин в положении, соответствующем положению 229 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым

- 61 035397 ветствующем положению 229 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^-лейцин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9, замену треонин^изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9, замену пролин^гистидин в положении, соответствующем положению 214 и замены лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^лейцин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9, замену треонин^изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9 и замены лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену серин ^-аспарагин в положении, соответствующем положению 119 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену аспарагин^тирозин в положении, соответствующем положению 139 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену фенилаланина лейцин в положении, соответствующем положению 121 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену глутаминовая кислота^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 150 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену серин ^треонин в положении, соответствующем положению 151 последовательности SEQ ID NO: 9, замену лизин^глутаминовая кислота в положении, соответствующем положению 229 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену лизинг-аргинин в положении, соответствующем положению 230 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену глутамина лейцин в положении, соответствующем положению 157 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену гистидин^глутамин в положении, соответствующем положению 187 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену цистеин ^-аргинин в положении, соответствующем положению 271 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену аспарагиновая кислота^глицин в положении, соответствующем положению 274 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену цистеин ^-серин в положении, соответствующем положению 307 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену аланин^валин в положении, соответствующем положению 423 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену серина лейцин в положении, соответствующем положению 396 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену лизин^изолейцин в положении, соответствующем положению 410 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену цистеин^серин в положении, соответствующем положению 434 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену треонин^серин в положении, соответствующем положению 500 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аспарагиновая кислота^глицин в положении, соответствующем положению 447 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену аланин^глицин в положении, соответствующем положению 292 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену серин^аланин в положении, соответствующем положению 448 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену аспарагин^аспарагиновая кислота в положении, соответствующем положению 324 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену тирозин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 465 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену лизинг-треонин в положении, соответствующем положению 470 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^-лейцин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9, замену пролин^гистидин в положении, соответствующем положению 214 последовательности SEQ ID NO: 9 и замены аланин^валин в положении, соответствующем положению 243 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^-лейцин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9, замену треонин ^-изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9, замену лейцин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 188 последовательности SEQ ID NO: 9, замену лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену аланин^валин в положении, соответствующем положению 243 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинина лейцин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9, замену треонин^изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9, замену пролин^гистидин в положении, соответствующем положению 214 последовательности SEQ ID NO: 9, замену лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену аланин^валин в положении, соответствующем

- 62 035397 положению 243 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинина лейцин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9, замену треонин^изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9, замену лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену аланин^валин в положении, соответствующем положению 243 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинина лейцин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9, замену пролин^гистидин в положении, соответствующем положению 214 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену цистеин^серин в положении, соответствующем положению 307 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^лейцин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9, замену треонин^изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9, замену лейцин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 188 последовательности SEQ ID NO: 9, замену лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену цистеин^серин в положении, соответствующем положению 307 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^лейцин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9, замену треонин^изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9, замену пролин^гистидин в положении, соответствующем положению 214 последовательности SEQ ID NO: 9, замену лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену цистеин^серин в положении, соответствующем положению 307 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^лейцин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9, замену треонин^изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9, замену лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену цистеин^серин в положении, соответствующем положению 307 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену пролин^гистидин в положении, соответствующем положению 214 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9; замену треонин^изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9; замену лейцин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 188 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9; замену треонин^изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9; замену пролина-гистидин в положении, соответствующем положению 214 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 SEQ ID NO: 9.

Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9; замену треонин ^-изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9; и замену лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9; замену пролин^гистидин в положении, соответствующем положению 214 последовательности SEQ ID NO: 9; и замену аланин^валин в положении, соответствующем положению 423 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9; замену треонин^изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9; замену лейцин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 188 последовательности SEQ ID NO: 9; замену лизин^глутамин в положении, соответствующем положению 229 SEQ ID NO: 9; и замену аланин^валин в положении, соответствующем положению 423 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9; замену треонин^изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9; замену пролин^гистидин в положении, соответствующем положению 214 последовательности SEQ ID NO: 9; замену лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 SEQ ID NO: 9; и замену аланин^валин в положении, со

- 63 035397 ответствующем положению 423 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9; замену треонин^изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9; замену лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 SEQ ID NO: 9; и замену аланин^валин в положении, соответствующем положению 423 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9; замену пролин^гистидин в положении, соответствующем положению 214 последовательности SEQ ID NO: 9; и замену цистеин^серин в положении, соответствующем положению 307 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9; замену треонин ^-изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9; замену лейцин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 188 последовательности SEQ ID NO: 9; замену лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 SEQ ID NO: 9; и замену цистеин^серин в положении, соответствующем положению 307 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9; замену треонин^изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9; замену пролин^гистидин в положении, соответствующем положению 214 последовательности SEQ ID NO: 9; замену лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 SEQ ID NO: 9; и замену цистеин^серин в положении, соответствующем положению 307 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX содержит замену аргинин^цистеин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9; замену треонин^изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9; замену лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 SEQ ID NO: 9; и замену цистеин^серин в положении, соответствующем положению 307 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX включает замену аргинин^гистидин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену пролин^гистидин в положении, соответствующем положению 214 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX включает замену аргинин^гистидин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9; замену треонин ^-изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9; замену лейцин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 188 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX включает замену аргинин^гистидин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9; замену треонин^изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9; замену пролин ^-гистидин в положении, соответствующем положению 214 последовательности SEQ ID NO: 9, и замену лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX включает замену аргинин^гистидин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9; замену треонин^изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9; и замену лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX включает замену аргинин^гистидин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9; замену пролин^гистидин в положении, соответствующем положению 214 последовательности SEQ ID NO: 9; и замену аланин^валин в положении, соответствующем положению 423 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX включает замену аргинин^гистидин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9; замену треонин^изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9; замену лейцин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 188 последовательности SEQ ID NO: 9; замену лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 SEQ ID NO: 9; и замену аланин^валин в положении, соответствующем положению 423 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX включает замену аргинин^гистидин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9; замену треонин^изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9; замену пролин^гистидин в положении, соответствующем положению 214 последовательности SEQ ID NO: 9; замену лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 SEQ ID NO: 9; и замену аланин^валин в положении, соответствующем положению 423 последователь

- 64 035397 ности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX включает замену аргинин^гистидин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9; замену треонин^изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9; замену лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 SEQ ID NO: 9; и замену аланин^валин в положении, соответствующем положению 423 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX включает замену аргинин^гистидин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9; замену пролин^гистидин в положении, соответствующем положению 214 последовательности SEQ ID NO: 9; и замену цистеин^серин в положении, соответствующем положению 307 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX включает замену аргинин^гистидин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9; замену треонин^изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9; замену лейцин^фенилаланин в положении, соответствующем положению 188 последовательности SEQ ID NO: 9; замену лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 SEQ ID NO: 9; и замену цистеин^серин в положении, соответствующем положению 307 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX включает замену аргинин^гистидин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9; замену треонин^изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9; замену пролина гистидин в положении, соответствующем положению 214 последовательности SEQ ID NO: 9; замену лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 SEQ ID NO: 9; и замену цистеин^серин в положении, соответствующем положению 307 последовательности SEQ ID NO: 9. Согласно некоторым вариантам реализации мутантный белок PPX включает замену аргинин^гистидин в положении, соответствующем положению 98 последовательности SEQ ID NO: 9; замену треонин^изолейцин в положении, соответствующем положению 124 последовательности SEQ ID NO: 9; замену лизинг-глутамин в положении, соответствующем положению 229 SEQ ID NO: 9; и замену цистеин^серин в положении, соответствующем положению 307 последовательности SEQ ID NO: 9.

Паралоги.

Рассматриваемые мутации в гене PPX, как правило, описаны в настоящем документе с применением пластидных генов и белков PPX Solanum tuberosum (см., например, фиг. 8 и 7 соответственно) с привязкой положений аминокислот к положениям в Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 1). Указанные композиции и способы также охватывают мутантные гены и белки PPX других видов (паралоги). Однако из-за изменчивости генов PPX разных видов номер заменяемого аминокислотного остатка для одного вида может отличаться для других видов. Тем не менее, аналогичное положение легко может быть идентифицировано специалистом в данной области техники благодаря гомологии последовательностей. Так, в табл. 6 приведен обзор гомологичных положений аминокислот в различных растительных паралогах кодирующей последовательности PPX, а на фиг. 33 представлено выравнивание последовательностей аминокислот PPX для паралогов из различных растений. Соответственно, аналогичные положения в указанных и других паралогах могут быть идентифицированы и мутированы.

Гербициды.

Предложенные в настоящем изобретении композиции и способы включают гены PPX и белки PPX, которые придают устойчивость к РРХ-ингибирующим гербицидам. Согласно некоторым вариантам реализации РРХ-ингибирующие гербициды включают химические семейства дифенилэфиров, фенилпиразол N-фенилфталимидов, тиадиазолов, оксадиазолов, триазолинонов, оксазолидиндионов, пиримидиндионов. Обзор типовых активных ингредиентов Ингибирующих PPX гербицидов и соответствующих им химических семейств приведены в табл. 5.

- 65 035397

Таблица 5

Типовые РРХ-ингибирующие гербициды

Химическое семейство	Активный ингредиент гербицида
Дифенилэфиры	ацифлуорфен-содиум
	Бифенокс
	Хлометоксифен
	флуорогликофен-этил
	Фомесафен
	Галосафен
	Лактофен
	Оксифлуорфен
Фенилпиразолы	Флуазолат
	пирафлуфен-этил
Ν-φ енилфталимиды	цинидон-этил
	Флумиоксазин
	флумиклорак-пентил
Тиадиазолы	флутиацет-метил
	Тидиазимин
Оксадиазолы	Оксадиазон
	Оксадиаргил
Т риазолиноны	Азафенидин
	карфентразон-этил
	Сульфентразон
Оксазолидиндионы	Пентоксазон
Пиримидиндионы	Бензфендизон
	Бутафенацил
	Сафлуфенацил
Другие	Пиразогил
	Профлуазол

Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой ацифлуорфен-содиум. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой бифенокс. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой хлометоксифен. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой флуорогликофен-этил. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой фомесафен. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой галосафен. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой лактофен. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой оксифлуорфен. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой флуазолат. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой пирафлуфен-этил. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой цинидон-этил. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой флумиоксазин. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой флумиклорак-пентил. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой флутиацет-метил. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой тидиазимин. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой оксадиазон. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой оксадиаргил. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой азафенидин. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой карфентразон-этил. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой сульфентразон. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой пентоксазон. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой бензфендизон. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой бутафенацил. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой сафлуфенацил. Согласно неко- 66 035397 торым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой пиразогил. Согласно некоторым вариантам реализации ингибирующий PPX гербицид представляет собой профлуазол.

Также предложено^) трансгенное или нетрансгенное растение или растительная клетка, содержащий(ая) одну или более мутацию в гене PPX, например, такие как описанные в настоящем изобретении. Согласно некоторым вариантам реализации указанное(ая) растение или растительная клетка, содержащий(ая) одну или более мутацию в гене PPX, обладает повышенной устойчивостью или толерантностью к представителю ингибирующих PPX гербицидов. Согласно некоторым вариантам реализации указанное(ая) растение или растительная клетка, содержащий(ая) одну или более мутацию в гене PPX, может демонстрировать, по существу, нормальный рост или развитие указанного растения, его органов, тканей или клеток относительно соответствующего(ей) растения или клетки дикого типа. Согласно частным аспектам и вариантам реализации предложены трансгенные или нетрансгенные растения, содержащие мутацию в гене PPX, например, такую как описанные в настоящем изобретении, которые согласно некоторым вариантам реализации обладают повышенной устойчивостью или толерантностью к одному или более члену химических семейств ингибирующих PPX гербицидов и могут демонстрировать, по существу, нормальный рост или развитие указанного растения, его органов, тканей или клеток относительно соответствующего(ей) растения или клетки дикого типа, т.е. в присутствии одного или более гербицида, такого как, например, флумиоксазин, сульфентразон или сафлуфенацил, мутантный белок PPX обладает, по существу, такой же каталитической активностью, что и белок PPX дикого типа. Также предложены способы получения растения, содержащего мутантный ген PPX, например, содержащий одну или более мутацию согласно описанию в настоящем документе; предпочтительно, указанное растение, по существу, сохраняет каталитическую активность белка дикого типа, независимо от присутствия или отсутствия соответствующего гербицида. Согласно некоторым вариантам реализации указанные способы включают введение в растительную клетку олигонуклеотида репарации генов с одной или более направленной мутацией в гене PPX (например, такой как описанные в настоящем изобретении) и идентификацию клетки, семени или растения, содержащей(его) мутантный ген РРХ. Виды растений

В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями, растения согласно описанию в настоящем документе могут представлять собой любые виды двудольных, однодольных или голосеменных растений, включая любые виды древесных растений, произрастающих в форме деревьев или кустарников; любые травянистые виды; или любые виды, дающие съедобные плоды, семена или овощи; или любые виды, дающие декоративные или ароматические цветы. Например, указанное(ая) растение или растительная клетка могут быть выбрано^) из видов растений группы, состоящей из картофеля, подсолнечника, сахарной свеклы, кукурузы, хлопка, сои, пшеницы, ржи, овса, риса, канолы, плодовых растений, овощей, табака, ячменя, сорго, томата, манго, персика, яблони, груши, клубники, банана, дыни, моркови, салата, лука, видов сои, сахарного тростника, гороха, кормовых бобов, тополя, винограда, цитрусовых, люцерны, ржи, овса, дернообразующих и кормовых трав, льна, масличного рапса, огурца, вьюнка, бальзамина, перца, баклажана, бархатцев, лотоса, капусты, астровых, гвоздики, петунии, тюльпана, ириса, лилии и дающих орехи растений, если они уже конкретно не указаны. Указанное(ая) растение или растительная клетка также могут представлять собой вид, выбранный из табл. 6. Указанное(ая) растение или растительная клетка также могут представлять собой вид, выбранный из группы, состоящей из Arabidopsis thaliana, Solanum tuberosum, Solanum phureja, Oryza sativa, Amaranthus tuberculatus, Sorghum bicolor, Ricinus communis и Zea mays.

В табл. 6 приведен обзор гомологичных положений аминокислот в аминокислотных последовательностях PPX растений различных видов. См. также обзоры дополнительных гомологичных положений аминокислот на фиг. 47 и 48.

- 67 035397

Таблица 6

Вид	№ доступа в базе Genbank	Лок али зац ИЯ	G 52	N 85	R 144	F 145	180	Р 185	220	226	М 228	S 244	Q 272	S 305	S 332	357	К 359	393	L 403	L 424	Y 426	F 478	I 525
Arabidopsis thaliana - At4g01690	AX084732	Р	52	85	144	145	180	185	220	226	228	244	272	305	332	357	359	393	403	424	426	478	525
Arabidopsis thaliana - At5gl4220	NM 121426	м	Н.о.	41	101	Y 102	Р 137	К 142	182	188	190	206	G 235	L 269	н 298	F 323	L 325	358	371	Т 392	F 394	Y 444	D 489
Amaranthus tuberculatus	DQ386117	в	Н.о.	Н.о.	128	Y 129	Р 164	К 169	G 210	216	218	234	R 261	L 295	324	F 349	L 351	384	397	Т 418	F 420	Y 470	Е 515
Solanum tuberosum	AJ225107	Р	N 76	105	164	165	200	205	240	246	248	264	К 292	325	352	377	S 379	413	423	444	446	498	S 545
Solanum tuberosum	H.o., см. Фиг. 27.	м	Н.о.	Н.о.	98	99	134	N 139	G 178	184	186	202	R 231	L 265	296	F 321	323	356	369	390	F 392	442	D 487
Zea mays	AF218052	Р	Н.о.	Н.о.	142	143	178	Р18	218	224	226	242	К 270	303	330	355	R 357	391	401	422	424	476	S 523
Zea mays	AF273767	м	Н.о.	70	130	131	166	К 171	215	221	I 223	239	N 268	302	336	361	363	396	410	431	F 433	483	D 528
Oryza saliva 0s01g028660 0	ΝΜ 0010493 12		G 51	Н.о.	143	144	179	Р 184	219	225		243	К 271	Т 304	Т 331	L 356	I 358	392	402	423	425	477	S 524
Oryza sativa 0s04g049000 0	H.o., cm. Фиг. 17.	м	D 50	Q 79	139	140	175	К 180	G 224	230	I 232	248	N 277	L	345	F 370		405	419	440	F 442	492	D 537
Sorghum bicolor - Sb03g011670	XM_0024554 39	Р	Н.о.	Н.о.	143	144	179	184	219	225	227	243	К 271	304	331	356	R 358	392	402	423	425	477	524
Sorghum bicolor - Sb06g020950	XM 0024466 65	м	Н.о.	70	130	131	166	К 171	215	221	I 223	239	N 268	L 302	336	F 361	363	396	410	431	F 433	483	D 528
Ricinus communis - RC1343150	XM 0025151 27	р	N 51	84	143	144	179	184	219	225	227	243	К 271	304	331	356	358	392	402	423	425	477	524
Ricinus communis - Rcl678480	XM 0025095 02	м	Н.о.	Н.о.	99	Y 100	Р 135	К 140	181	187	189	205	234	F 268	299	F 324	L 326	359	372	Т 393	F 395	Y 445	D 490

tG210 делеция в DQ386118 приводит к толерантности к ингибитору РРХ.

P - пластидный; M - митохондриальный; B - и там, и там.

Олигонуклеотид для репарации генов может быть введен в растительную клетку с применением любого способа, широко применяемого в данной области техники, включая, но не ограничиваясь перечисленными, микроносители (биолистическая доставка), микроволокна, полиэтиленгликоль(ПЭГ)опосредованный захват, электропорацию и микроинъекции.

Также предложены способы и композиции, относящиеся к области культур клеток, мутированных в соответствии с описанными в настоящем документе способами для получения растения, дающего семена, здесь и далее - фертильного растения, и получение семян и дополнительных растений из такого фертильного растения.

Также предложены способы селективного контроля семян в поле, отличающиеся тем, что указанное поле содержит растения с описанными изменениями в гене PPX и семенами, и указанный способ включает применение в поле гербицида, устойчивость к которому была придана указанным растениям.

Также предложены мутации в гене PPX, придающие растению устойчивость или толерантность к представителю соответствующих гербицидов, или отличающиеся тем, что мутантный ген PPX обладает, по существу, такой же ферментативной активностью, что и PPX дикого типа.

Отбор устойчивых к гербицидам растений и применение гербицида.

Растения и растительные клетки могут быть протестированы на устойчивость или толерантность к гербициду с применением общеизвестных в данной области техники способов, например, выращиванием указанного(ой) растения или растительной клетки в присутствии гербицида и измерением скорости роста по сравнению со скоростью роста в отсутствие указанного гербицида.

Используемое в настоящем описании выражение по существу, нормальный рост растения, органа растения, ткани растения или растительной клетки определяется как скорость роста или скорость деления клеток указанного растения, органа растения, ткани растения или растительной клетки, составляющая по меньшей мере 35%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60% или по меньшей мере 75% от скорости роста или скорости деления клеток соответствующего растения, органа растения, ткани растения или растительной клетки, экспрессирующих белок PPX дикого типа.

Используемое в настоящем описании выражение по существу, нормальное развитие растения, органа растения, ткани растения или растительной клетки определяется как наступление одного или более относящегося к развитию события в указанном растении, органе растения, ткани растения или растительной клетке, по существу тождественного происходящему в соответствующем растении, органе растения, ткани растения или растительной клетке, экспрессирующей(ей) белок PPX дикого типа.

В соответствии с любыми описанными в настоящем документе аспектами, вариантами реализации, способами и/или композициями предложенные в настоящем изобретении органы растения могут включать, но не ограничиваясь перечисленными, листья, стебли, корни, вегетативные почки, цветочные бутоны, меристемы, зародыши, семядоли, эндосперм, чашелистики, лепестки, пестики, плодолистики, тычинки, пыльники, микроспоры, пыльцу, пыльцевые трубки, семязачатки, завязи и плоды или полученные из них фрагменты, срезы или пластинки. Ткани растений включают, но не ограничиваясь перечисленными, каллусные ткани, покровные ткани, сосудистые ткани, запасающие ткани, меристемные ткани, ткани листа, ткани побега, ткани корня, ткани галлов, ткани растительных опухолей и репродуктивные ткани.

- 68 035397

Растительные клетки включают, но не ограничиваясь перечисленными, выделенные клетки с клеточными стенками, их совокупности различного размера и протопласты.

Растения, по существу, толерантны к соответствующему гербициду, если при контакте с ним кривая зависимости доза-эффект для них сдвинута вправо по сравнению с такой кривой для нетолерантного растения при сходном контакте. При построении таких кривых зависимости доза-эффект дозу отмечают на оси X и процент гибели, гербицидный эффект и т.д. отмечают на оси y. Для определенного гербицидного действия на толерантные растения требуется больше гербицида, чем для вероятно нетолерантных растений. У растений, по существу устойчивых к указанному гербициду, не наблюдаются либо наблюдаются немногочисленные некротические, литические, хлоротические или другие повреждения при контакте с гербицидом в концентрациях и количествах, обычно применяемых в агрохимии для уничтожения сорняков на полях. Растения, устойчивые к гербициду, также толерантны к указанному гербициду.

Согласно некоторым вариантам реализации повышенная устойчивость к гербициду или повышенная толерантность к гербициду относится к уровню устойчивости или толерантности, которой обладает растение, семя или часть растения, содержащее(ая) мутантный ген PPX или белок согласно описанию в настоящем документе, по отношению к растительным гербицидам в концентрации выше определенного эталонного уровня. Указанный определенный эталонный уровень устойчивости к гербициду представляет собой уровень устойчивости, проявляемый растением того же вида без соответствующей(их) мутации(ий). Согласно некоторым вариантам реализации устойчивость по существу повышена относительно определенного эталонного уровня, например, более чем или ровно на 20% выше, 50% выше, 75% выше или на 100% выше определенного эталонного уровня.

Примеры

Ниже приведены примеры, которые иллюстрируют процедуры реализации изобретения. Эти примеры не должны рассматриваться как ограничивающие. Все указанные процентные доли представляют собой проценты по массе, все пропорции для смесей растворителей являются объемными, если не указано иное.

Пример 1. Клонирование и исследование пластидного и митохондриального гена РРХ.

Пластидный и митохондриальные гены PPX амплифицировали как из кДНК, так и геномной ДНК сорта Рассет Бербанк. Клоны пластидного PPX делятся на два класса, обозначенные как StcPPX1 и StcPPX1.1, по-видимому, представляющие аллели единственного гена PPX картофеля. По кодирующей последовательности аминокислот эти клоны отличаются 10 полиморфизмами, три из которых приводят к аминокислотным отличиям; только два из которых обнаруживаются в зрелом белке. Одно аминокислотное отличие находится в транзитном пептиде хлоропласта. В одном из клонов StcPPX1.1 интрон 3 был несплайсирован.

Был получен полноразмерный не содержащий ошибок геномный клон пластидного РРХ. Анализ приблизительно 5 т.п.н. геномной последовательности 5 независимых клонов и секвенирование кДНК StcPPX показали, что рассматриваемая разновидность Рассет Бербанк гетерозиготна, с очень немногочисленными полиморфизмами между двумя аллелями.

Во-первых, пять полноразмерных клонов StmPPX геномной ДНК клонировали и секвенировали. Указанные пять клонов представляли обе аллели, содержащие однонуклеотидные полиморфизмы, идентичные обнаруживаемым в кДНК. Фрагменты геномной ДНК более короткого ампликона клонировали и секвенировали для проверки на дополнительные аллели. Клонирование этого внутреннего ампликона митохондриального PPX показало присутствие трех аллелей; 6 из 22 клонов содержали делецию в одном из интронов, а в других 16 клонах были равномерно распределены два аллеля, обнаруживаемые в клонах кДНК. Затем секвенировали другие 12 полноразмерных клонов StmPPX геномной ДНК.

Полное секвенирование митохондриальных генов PPX картофеля Рассет Бербанк показало наличие двух генов, которые авторы обозначили StmPPX1 и StmPPX2. Имеется две аллели StmPPX2, различающиеся 8 обнаруженными SNP (однонуклеотидными полиморфизмами). StmPPX 1 и StmPPX2.1 отличаются 1 вставкой, 4 делециями и 30 однонуклеотидными полиморфизмами, при этом StmPPX1 и StmPPX2.2 отличаются 1 вставкой, 4 делециями и 29 однонуклеотидными полиморфизмами. Дополнительные подробности представлены в табл. 7.

Генные последовательности пластидных и митохондриальных генов PPX картофеля Рассет Бербанк (Solanum tuberosum) сравнивали с применением инструмента Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) с подгруженной авторами локальной базой данных, основанной на структуре недавно выпущенного первого полного генома картофеля (Solanum phureja). Обнаружены только одиночный пластидный и одиночный митохондриальный гены РРХ.

- 69 035397

Таблица 7

Аллельные различия между митохондриальными формами PPX картофеля Рассет Бербанк

StmPPX пол ожени еНТ	НТ ген 1	АК ген 1	НТ ген 2, Аллель 1	АК ген 2, Аллель 1	НТ ген 2, Аллель 2	АК ген 2, Аллель 2	StmPPX положени е АК	AtcPPX положени е АК
296	А (ТАС)	Y	А (ТАС)	Y	Т (ТТС)	F	99	145
360	С(ААС)	N	Т (ААТ)	N	Т(ААТ)	N	120	166
402	Т (ССТ)	Р	А (ССА)	Р	А (ССА)	Р	134	180
528	G (ACG)	т	А (АСА)	т	А (АСА)	т	176	218
680	Т (GTA)	V	Т (GTA)	V	A(GAA)	Е	227	269\|270
692	А (САС)	н	G (CGC)	R	G (CGC)	R	231	272

Пример 2. Комплементация РРХ.

StcPPX1, за исключением транзитного пептида хлоропласта, клонировали из кДНК в коммерческий вектор для функционального скрининга от Cibus. Этот вектор может применяться как для функционального скрининга, так и для контроля качества GRON. Гены PPX картофеля применяли для комплементации мутантного штамма Е.сой HemG с отсутствующим функциональным геном HemG, бактериальным гомологом РРХ. В отсутствие комплементирующего гена среда должна быть дополнена гематином для роста Е.сой. Клоны пластидного гена PPX (pACYStcPPX Col6) и митохондриального гена PPX (pACYStmPPX Col6, 12 и 21) трансформировали; показано, что все гены /аллели комплементируют мутантный штамм Е.сой HemG, позволяя последнему расти в отсутствие гематина.

Для оценки мутаций, которые придают толерантность к ингибиторам PPX, таким как Chateau (флумиоксазин -Valent/Sumitomo), Naja (дифенилэфир - MAI) или Kixor (Киксор) (сафлуфенацил - BASF) в табл. 5 приведены РРХ-ингибирующие гербициды. Были получены чистые активные ингредиенты ингибирующих PPX гербицидов Chateau (флумиоксазин -Valent/Sumitomo), Spartan (сульфентразон - FMC) и Kixor/Sharpen (сафлуфенацил - BASF). Клон пластидного PPX картофеля дикого типа (pACYStcPPX Col6) трансформировали для комплементирования мутантного по hemG штамма Е.сой и провели отбор с применением серийных разведений активного ингредиента ингибирующего PPX гербицида Spartan (сульфентразон - FMC) для определения концентрации, при которой комплементированный лишенный HemG штамм не растет. Конструкт дикого типа не рос при 2,5 мМ сульфентразона, таким образом, отбор толерантных мутантов проводили при этой концентрации. В дальнейшем было произведено уточнение, и для отбора на толерантность использовали также концентрацию сульфентразона 0,75 мМ. Конструкт дикого типа демонстрировал ограниченный рост при 10 мМ флумиоксазина при отборе на жидких средах и не рос при 0,3 мМ сафлуфенацила при отборе на чашках; указанные концентрации применяли для испытания мутантов на устойчивость. Все митохондриальные гены и аллели PPX картофеля тестировали на природную толерантность к сульфентразону и флумиоксазину, но ни один не был толерантным.

Пример 3. ПЦР-мутагенез PPX и отбор мутировавших клонов.

Эксперименты с мутагенезом изначально проводили на двух перекрывающихся фрагментах (5' и 3') пластидного гена PPX картофеля для идентификации мутаций в пластидной кодирующей последовательности PPX картофеля, придающих толерантность к гербицидам.

Стандартизация отбора на жидких средах.

Условия отбора в жидких культурах разрабатывали как для сульфентразона, так и для флумиоксазина. Культуры объемом 1 мл тестировали с концентрациями сульфентразона и флумиоксазина в диапазоне от 0 до 10 мМ. Образцы с 0 мМ содержали 25 мкл ДМСО (2,5%) для имитации концентрации ДМСО в образцах, содержащих 10 мМ гербицида. Каждую пробирку инокулировали 10 мкл ночной культуры клеток HemG с добавлением плазмиды с PPX дикого типа для обеспечения однородности. Спектрофотометрические показания (ОП600) снимали для каждого образца (разведение 1:4); образец каждого высевали на чашки со средой LB-хлор-IPTG, чтобы определить, коррелирует ли ОП600 с числом жизнеспособных колоний. 10% разведение ночной культуры высевали в качестве обработанных сульфентразоном клеток; также высевали 1% разведение клеток, обработанных флумиоксазином. (см. результаты в табл. 8A-F и 9А-О).

И сульфентразон, и флумиоксазин выпадали в осадок в жидкой среде, что приводило к ее непрозрачности еще до инокуляции бактериями. Как показывает ОП для сульфентразона, этот гербицид в конечном счете растворяется, тогда как флумиоксазин - нет. Недостаточная растворимость флумиоксазина искажает показатели ОПво всех случаях флумиоксазин демонстрировал неизменно снижающееся количество колоний относительно гена дикого типа, что указывает на способность клетки всасывать флумиоксазин из среды. 5'-концевой мутагенез 5'-конец гена PPX мутировали с применением набора для случайного мутагенеза GeneMorph II Random Mutagenesis Kit от Stratagene и клонировали в XL-1 Blue для проверки степени мутирования. Результаты показали, что 14 из 16 секвенированных колоний были мутантами. Чашки с 90% XL-1 Blue (примерно 4000 колоний) соскабливали, готовили плазмиду, трансформировали в HemG и высевали на 2,5 мМ сульфентразон. На чашках с сульфентразоном выросло пример- 70 035397 но по 200 колоний; на чашках с 10% LB-хлор-IPTG вырос газон колоний. В табл. 9A-D представлены нуклеотидные и аминокислотные замены, обнаруженные в толерантных клонах. Отбор мутагенизированных клонов

Случайным образом мутированные плазмиды (5' и 3'-концы) трансформировали в клетки XL I-Blue E.coli. Полученные колонии объединяли, плазмидную ДНК выделяли и трансформировали в клетки HemG (мутантная по PPX Е. coli). Для отбора с флумиоксазином клетки восстанавливали в течение 1 ч в жидкой минимальной среды, после чего добавляли гербицид и оставляли клетки для восстановления на ночь. На следующий день указанные клетки высевали в подходящем разведении на чашки с LB, содержащие антибиотик, для отбора комплементирующей плазмиды. Колонии из каждой чашки были секвенированы. После отбора на жидкой среде при 10 мМ флумиоксазина примерно 30 колоний появилось на чашках с PPX дикого типа (WT), по сравнению с примерно 200-1200 колониями с мутагенизированными плазмидами. При отборе с сульфентразоном культуры культивировали на минимальной среде в течение ночи, разводили и высевали на чашки с концентрацией сульфентразона 0 и 0,75 мМ. Для указанных двух концентраций сравнивали количество колоний и определяли толерантность мутаций на основании процентного количества колоний на чашках с 0,75 мМ сульфентразона относительно чашек с 0 мМ. Число колоний, обнаруживаемых на чашках, использовали для ранжирования мутаций. 3'-концевой мутагенез

Проводили мутагенез на 3'-конце гена РРХ. Клоны трансформировали в HemG и культивировали в течение ночи в 2,5; 5 и 10 мМ флумиоксазине для отбора. Отбор при 5 мМ флумиоксазине давал значительно больше колоний, чем на 10 мМ селективных чашках. Отбор мутировавших клонов с применением 10 мМ флумиоксазина давал четыре клона. Отбор мутировавших клонов с применением 5 мМ флумиоксазина давал 200 колоний. Проводили скрининг в 10 мМ флумиоксазине верхней трети 200 колоний, полученных 3'-концевым мутагенезом. Все толерантные колонии (примерно 130) секвенировали и наиболее флумиоксазин-устойчивые мутанты, по оценке числа колоний на флумиоксазине, 3'-конец оценивали на толерантность к сульфентразону.

Пример 4. Анализ замен аминокислот, придающих толерантность.

Толерантность проверяли для всех возможных замен аминокислот по каждому положению, проявляющих толерантность к сульфентразону или флумиоксазину. Далее, одиночные замены аминокислот комбинировали во всех перестановках и сочетаниях для оценки комплементации и толерантности к гербицидам. Результаты комбинаций одиночных и множественных мутаций к флумиоксазину приведены в табл. 8А-8С, где в последнем столбце показано число колоний, замеченных при каждой мутации на 10 мМ флумиоксазине. Результаты комбинаций одиночных и множественных мутаций на сульфентразоне приведены в табл. 9А и 9B, где в последнем столбце показано число колоний, замеченных при каждой мутации на 0,75 мМ сульфентразоне. Результаты комбинаций одиночных и множественных мутаций на сафлуфенациле показаны в табл. 10, где в четвертом столбце показано число колоний, замеченных при каждой мутации на 0,3 мМ сафлуфенациле.

- 71 035397

Т аблица 8А

Толерантность комбинаций одиночных и множественных мутаций в пластидной кодирующей последовательности PPX картофеля к флумиоксазину

Мутация	Плазмида	Средн, кол-во устойчивых к
флумиоксазину клонов
___	L393V	F1125	0
___	L403R	F1155	2
А180Т	Y426F	SD5083	2
___	L424S	F1154	2
F145L	Y426H	SD5055	3
S244G	Y426F	SD5087	10
F145L	L403R	SD5115	10
___	Y426F	F1165	И
F145Y	L424S	SD5106	13
R144C	L424S	SD5102	41
L226M	Y426H	SD5059	55
А220Т	L403R	SD5114	69
___	Y426H	F1180	71
А220Т	L424S	SD5104	72
F145Y	Y426F	SD5086	75
R144C	L393V	SD5092	81
А220Т	L393V	SD5094	107
S244G	L393V	SD5097	114
L226M	L403R	SD5119	123
А180Т	Y426H	SD5053	129
L226M	L424S	SD5109	137
L226M	Y426F	SD5089	143
А220Т	Y426F	SD5084	147
А220Т	Y426H	SD5054	151
R144C	Y426F	SD5082	155
—	—	wt	0

Таблица 8B

Мутация	Плазмида	Средн, кол-во устойчивых к
флумиоксазину клонов
R144C	А220Т		SD5011 Col 1	701
А220Т			F113	667
R144H	S332C		F76	517
R144C	K272F		SD5014 Col 1	300
N52K	R144H	S244T	F72	202
N85D	А220Т		SD5007 Col 1	196
R144H	S244T		F96	174
R144C			S7	139
R144C	L226M		SD5012 Col 1	117
M228L			S3 7	107
L226M			F114	102
N85D	L226M		SD5008 Col 2	50
F145Y			S32	38
N85D	F145Y		SD5004 Col 3	37
S244G			S120	31
R144C	M228L		SD5013 Col 2	31
P185R			SD5016 Col 1	27
N52K			SD5001 Col 3	23
N85D	А180Т		SD5005 Col 1	23
А180Т			F17	22
N85D	R144C		SD5002 Col 1	21
S332C			SD5019 Col 1	20
F145L			S118	19
N85D			F80	16
K272F			F7	15
S244T			SD5018 Col 3	10
N85D	K272F		SD5010Col4	7
N85D	M228L		SD5009 Col 3	6
			WT	43

- 72 035397

Таблица 8С

Мутация	Плазмида	Средн, кол-во устойчивых к флумиоксазину клонов
N85D	Y426H	SD5051	30
R144C	Y426H	SD5052	48
F145Y	Y426H	SD5056	52
S244T	Y426H	SD5058	73
S244G	Y426H	SD5057	80
А180Т	Y426H	SD5053	128
L226M	Y426H	SD5059	228
F145L	Y426H	SD5055	305
А220Т	Y426H	SD5054	391
___	Y426H	F1180	210
—	—	wt	32

Таблица 8D

Толерантность комбинаций одиночных и множественных мутаций в митохондриальной кодирующей последовательности PPX картофеля к 5 мМ флумиоксазину

A404S
C271R	D274G
C307S	A423V
C434S	T500S
C434Y
D330E
D447G	A292G
D454N
N324K
R406K
S396L	K410I
S448A	N324D
Y465F	К470Т

Таблица 8Е

A101V
C177S
D170E
D58N
Е150К
E64V
F121L	E150D
G74C	R98C
G84N
K97R
L93H	V164A
N195K
P214S
Q157L	H187Q
R98C
R98H
R98L
R98L	Р214Н
R98L	T124I	L188F	K229Q
S119N	N139Y
S151T	К229Е	K230R
V164F

- 73 035397

Таблица 8F

Толерантность комбинаций одиночных и множественных мутаций в митохондриальной кодирующей последовательности

PPX картофеля к 10 мМ флумиоксазину

Мутант	Число колоний с 10 мМ флумиоксазином
wt	42
R98L	83
Р214Н	51
R98L/P214H	88
R98L/P214H/T124I	110
R98L/P214Н/Т124I/K229Q	109

Таблица 9А

Толерантность комбинаций одиночных и множественных мутаций в пластидной кодирующей последовательности PPX картофеля к сульфентразону

Мутация	Плазмида	В средн. 0.75 мМ Сульф.	В средн. 0 мМ	0,75мМ/0мМ
___	Y426F	F1165	8	91	0,8%
___	L393V	F1125	6	57	1,0%
L226M	Y426H	SD5059	14	79	1,8%
S244T	L393V	SD5098	11	53	2,1%
F145Y	Y426H	SD5056	16	72	2,2%
___	L403R	F1155	16	72	2,2%
R144C	S525T	SD5072	19	76	2,6%
А220Т	L393V	SD5094	20	55	3,6%
___	L424S	F1154	21	56	3,7%
F145L	L424S	SD5105	18	48	3,8%
___	Y426H	F1180	29	68	4,2%
А220Т	Y426H	SD5054	19	39	5,0%
F145Y	L393V	SD5096	55	86	6,3%
S244T	Y426F	SD5088	58	88	6,5%
F145Y	L424S	SD5106	49	69	7,1%
А220Т	L403R	SD5114	50	63	7,9%
L226M	Y426F	SD5089	117	67	17,4%
N85D	Y426H	SD5051	200	92	21,8%
L226M	L424S	SD5109	91	40	22,6%
F145Y	L403R	SD5116	315	110	28,5%
F145L	L393V	SD5095	381	121	31,6%
L226M	L403R	SD5119	252	75	33,8%
R144C	Y426F	SD5082	400	117	34,3%
S244G	L393V	SD5097	433	125	34,7%
___	S525T	F1061	278	79	35,3%
А180Т	Y426H	SD5053	331	80	41,4%
R144C	Y426H	SD5052	709	125	56,6%
—	—	wt	0	85	0,0%

- 74 035397

Таблица 9B

Мутация(и		Плазмида	Средн, кол-во сульфентразонустойчивых клонов
R144C	M228L		SD5013 Col 2	267
R144C	А220Т		SD5011 Col 1	260
F145Y			S32	233
R144C	L226M		SD5012 Col 1	186
А220Т			F113	149
P185R			SD5016Col 1	133
R144C	K272F		SD5014 Col 1	118
N52K			SD5001 Col 3	90
M228L			S37	78
N85D	А180Т		SD5005 Col 1	75
S244G			S120	68
R144H	S332C		F76	64
N85D	F145Y		SD5004 Col 3	62
K272F			F7	61
L226M			F114	57
R144C			S7	55
S244T			SD5018 Col 3	32
R144H	S244T		F96	31
F145L			S118	29
S332C			SD5019Col 1	28
N85D	R144C		SD5002 Col 1	25
N85D	А220Т		SD5007 Col 1	19
N85D	L226M		SD5008 Col 2	18
А180Т			F17	18
N52K	R144H	S244T	F72	18
N85D	M228L		SD5009 Col 3	12
N85D			F80	6
N85D	K272F		SD5010 Col 4	6
			WT	23

Таблица 9С

PPX картофеля к сульс	эентразону
Конц. сульф.	Мутант(ы)	Колонии	%
0 мМ	R98L/P214H	1341
0,5 мМ	R98L/P214H	349	26,0%
0,9 мМ	R98L/P214H	127	9,5%
1,0 мМ	R98L/P214H	77	5,7%
1,1 мМ	R98L/P214H	67	5,0%
1,2 мМ	R98L/P214H	48	3,6%
0 мМ	R98L	1541
0,5 мМ	R98L	339	22,0%
0,9 мМ	R98L	145	9,4%
1,0 мМ	R98L	110	7,1%
1,1 мМ	R98L	76	4,9%
1,2 мМ	R98L	54	3,5%
0 мМ	R98L/T124I/K229Q	1220
0,5 мМ	R98L/T124I/K229Q	312	25,6%
0,9 мМ	R98L/T124I/K229Q	88	7,2%
1,0 мМ	R98L/T124I/K229Q	66	5,4%
1,1 мМ	R98L/T124I/K229Q	40	3,3%

- 75 035397

Таблица 9D

Толерантность комбинаций одиночных и множественных мутаций в митохондриальной кодирующей последовательности _________PPX картофеля к сульфентразону_________

Конц. сульф.	Мутант(ы)	Колонии	%
0 мМ	R98L/P214H	1088
0,4 мМ	R98L/P214H	251	23,1%
0,5 мМ	R98L/P214H	150	13,8%
0,6 мМ	R98L/P214H	105	9,7%
0,7 мМ	R98L/P214H	108	9,9%
0,8 мМ	R98L/P214H	51	4,7%
0 мМ	R98L	1171
0,4 мМ	R98L	174	14,9%
0,5 мМ	R98L	104	8,9%
0,6 мМ	R98L	98	8,4%
0,7 мМ	R98L	92	7,9%
0,8 мМ	R98L	51	4,4%
0 мМ	R98L/T124I/P214H/K229Q	1134
0,4 мМ	R98L/T124I/P214Н/К229Q	724	63,8%
0,5 мМ	R98L/T124I/P214Н/К229Q	654	57,7%
0,6 мМ	R98L/T124I/P214Н/К229Q	402	35,4%
0,7 мМ	R98L/T124I/P214Н/К229Q	302	26,6%
0,8 мМ	R98L/T124I/P214Н/К229Q	280	24,7%
0 мМ	Р214Н	1184
0,4 мМ	Р214Н	0	0,0%
0,5 мМ	Р214Н	0	0,0%
0,6 мМ	Р214Н	0	0,0%
0,7 мМ	Р214Н	0	0,0%
0,8 мМ	Р214Н	0	0,0%

Таблица 10

Толерантность комбинаций одиночных и множественных мутаций в пластидной кодирующей последовательности PPX картофеля к сафлуфенацилу, измеренная по числу отмеченных колоний

Мутация	Плазмида	Средн, кол-во сафлуфенацилустойчивых клонов	Средн. 0 мМ	0,ЗмМ/0мМ
___	S525T	F1061	0	69	0,0%
N85D	Y426H	SD5051	0	64	0,0%
F145L	L393V	SD5095	0	114	0,0%
S244G	L393V	SD5097	0	111	0,0%
F145Y	L403R	SD5116	0	104	0,0%
L226M	L424S	SD5109	6	50	1,3%
L226M	Y426F	SD5089	15	96	1,5%
А220Т	L393V	SD5094	116	99	11,7%
А220Т	Y426F	SD5084	190	87	22,0%
L226M	L403R	SD5119	225	69	32,5%
R144C	Y426F	SD5082	319	61	52,6%
R144C	Y426H	SD5052	415	75	55,4%
А180Т	Y426H	SD5053	394	60	65,7%
А220Т	Y426H	SD5054	356	46	77,5%
—	—	wt	0	96	0,0%

Пример 5. Культивирование растительных клеток - кривые уничтожения для гербицидов.

Кривые уничтожения для флумиоксазина.

Для определения концентрации гербицида, необходимой для уничтожения полученных из протопластов микрокаллусов за определенный период воздействия, проводили эксперименты по отбору с гербицидами. С учетом результата для первичной кривой уничтожения, где концентрация 125 мкМ была достаточной для уничтожения всех клеток в течение недели, конструировали новую кривую уничтожения с применением более низких концентраций флумиоксазина с целью определения концентрации, при которой погибают 99% клеток (см. табл. 11). Указанный гербицид суспендировали в ДМСО до конечной концентрации ДМСО при обработке гербицидом, составляющей 1%. Развитие клеток оценивали под микроскопом еженедельно. Исключая контрольную обработку, деление при всех воздействиях флумиок- 76 035397 сазином предотвращалось через одну неделю; через месяц микрокаллусов при любой из протестированных концентраций не развивалось. Концентрация флумиоксазина 0,032 мМ достаточна для предотвращения развития микрокаллусов из протопластов картофеля.

В табл. 11 приведен обзор результатов экспериментов с кривой уничтожения для флумиоксазина с суспензией клеток и полученными из верхушек побегов протопластами. Протопласты подвергались действию флумиоксазина на протяжении одного месяца.

Таблица 11

Необработанный протопласт + ПЭГ	Число каллусов в 3 шариках	Стоп-GFP + Корректирующий GRON	Число каллусов в 3 шариках
Конц, флумиоксазина, мкМ	Число	%	Конц, флумиоксазина, мкМ	Число	%
Контроль #1*	185		Контроль	230
Контроль #2**	150		Контроль	190
Ср. Контр. 1 + Контр. 2	157,5	100	Ср. Контр. 1 + Контр. 2	210	100
0,0156	40	25	0,0156	83	39
0,0312	8	5	0,0312	И	4
0,0468	0,0	0,0	0,0468	0,0	0,0
0,0624	0	0	0,0624	0	0

* Культуральная среда, без гербицида.

* * Культуральная среда с 1% ДМСО, без гербицида.

Кривые уничтожения для сульфентразона.

Кривые уничтожения для сульфентразона на полученных из верхушек побегов протопластах и суспензии клеток показывают, что концентрации 7,8 мкМ сульфентразона достаточны для уничтожения всех полученных из протопластов клеток (см. табл. 12).

Таким образом, новые кривые уничтожения начинались с более низких концентраций: 0; 0,5; 0,6; 0,7 и 0,8 мкМ сульфентразона, как показано в табл. 13. Эти результаты показывают, что обработанные GRON протопласты можно отбирать при концентрациях указанного гербицида от 0,6 до 0,7 мкМ.

В табл. 12 приведен обзор результатов экспериментов с кривой уничтожения для сульфентразона с суспензией клеток и полученными из верхушек побегов протопластами. Протопласты подвергались действию сульфентразона на протяжении одного месяца.

Таблица 12

Обработка сульфентразоном [мкМ]	Образование микрокаллуса
Контроль: 1*	Да; обильное
Контроль: 2**	Да; обильное
62,5	Нет
31,25	Нет
15,6	Нет
7,8	Нет

* Культуральная среда, без гербицида.

В табл. 13 приведен обзор результатов экспериментов с кривой уничтожения для сульфентразона с суспензией клеток и полученными из верхушек побегов протопластами. Протопласты подвергались воздействию указанного гербицида на протяжении одного месяца.

Таблица 13

Необработанный протопласт + ПЭГ	Число каллусов в 3 шариках	Стоп-GFP + Корректирующий GRON	Число каллусов в шариках
Конц-я сульфентразона, мкМ	Число	%	Конц-я сульфентразона, мкМ	Число	%
0,0	115	100	0,0	125	100%
0,5	45	30	0,5	38	30,2
0,6	8	6,9	0,6	12	9,6
0,7	2	1,7	0,7	7	5,6
0,8	0,0	0,0	0,8	0,0	0,0

* Культуральная среда, без гербицида.

** Культуральная среда с 1% ДМСО, без гербицида.

Пример 6. Кривые уничтожения листовых дисков.

С целью установления концентрации сульфентразона, подавляющей образование каллуса в эксплантатах листовых дисков, из выращенных in vitro растений картофеля возрастом 5 недель вырезали стерильным дыроколом листовые диски. Указанные листовые диски культивировали в чашках Петри с твердой культуральной средой Haberlach, содержащей различные концентрации сульфентразона в конечной концентрации ДМСО 1%. Шесть листовых дисков культивировали при каждой из концентраций гербицида. Чашки запечатывали микрокопористой лентой и инкубировали при комнатной температуре (примерно 23°C). В стартовом эксперименте концентрация сульфентразона 7,8 мкМ - самая низкая из

- 77 035397 протестированных в этом эксперименте, была достаточной для прекращения образования каллуса и обесцвечивания всех листовых дисков в течение 20 дней. Результаты для кривой уничтожения при более низких концентрациях сульфентразона показали, что концентрация сульфентразона 3,0 мкМ была достаточной для подавления образования каллуса практически во всех листовых дисках через 20 дней, при этом через 13 дней каллус появлялся на жилках некоторых листовых дисков, растущих на 2,0 мкМ сульфентразоне. Аналогичные эксперименты с кривой уничтожения листовых дисков проводили с применением сафлуфенацила, при этом концентрация указанного гербицида 0,5 мкМ была достаточной для подавления образования каллуса практически во всех листовых дисках через 20 дней.

Пример 7. Материалы и способы культивирования клеток и введения GRON.

Таблица 14

Последовательности GRON

GRON	Последовательность
StcPPXl 144/C/47/5’Cy3/3’idC	VGTTGGGAGATCCTGATGCGCCTTGCTTTGTCTTG TGGAAGGATAAACH (SEQ ID NO: 33)
StcPPXl 144/NC/47/5’Cy3/3’idC	VGTTTATCCTTCCACAAGACAAAGCAAGGCGCATC AGGATCTCCCAACH (SEQ ID NO: 34)
StcPPX 1220/C/47/5 ’Cy3/3 ’idC	VCATCATTTTACAGGTGTTTACACCGGTGACCCCT CAAAATTGH (SEQ ID NO: 35)
StcPPX 1220/NC/47/5 ’ Cy3/3 ’idC	VCAATTTTGAGGGGTCACCGGTGTAAACACCTGTA AAATGATGH (SEQ ID NO: 36)

Конвертирующее основание выделено жирным шрифтом. V=CY3; H=3'DMT dC CPG.

Описание процесса культивирования клеток.

Побеги, например, полученные из семян, клубней, пазушных почек, листьев, стеблей, корней, каллуса или из происходящих из микроспор зародышей, проращивают в стерильных условиях in vitro. Эксплантаты пересевают, например, каждые 3-4 недели и культивируют в сосудах для культивирования Magenta GA7 (Phytotechnology Laboratories, Шони Мишн, Канзас, США) с вентилируемыми крышками в составляющем приблизительно 100 мл объеме культуральной среды, например среды MS no Murashige и Skoog (Модифицированная среда для быстрого роста и биоанализа культур табака). Physiol. Plant 15 (1962) 473-49) или ее модификации. Указанные сосуды могут быть запечатаны микропористой лентой (Micropore tape) (3M Company). Для выделения протопластов могут быть использованы молодые листья, верхушки побегов, корни, микроклубни или длинные сегменты стеблей с листовыми и пазушными почками, а также каллус, полученный из указанных тканей. Протопласты могут также быть выделены из клеток суспензионной культуры, полученных из молодых листьев, верхушек побегов, корней, микроклубней или длинных сегментов стеблей с листовыми и пазушными почками, а также каллуса, полученного из указанных тканей.

Выделение протопластов из верхушек побегов.

Приблизительно 200 верхушек 2-8-недельных in vitro побегов, которые культивировали в обычном режиме день/ночь либо предпочтительно выдерживали в течение двух дней до выделения протопластов в темноте, побеги могут быть разрезаны с помощью скальпеля на маленькие кусочки в чашке Петри со стерильной водой. После разрезания всех верхушек воду заменяют культуральной средой для протопластов, предпочтительно BN (среда с солями и витаминами В5 Salts and Vitamins (Phytotechnology Laboratories), 20 г/л глюкозы, 70 г/л маннита, 5 мг/л α-нафталинуксусной кислоты, дополнительно CaCl2x2H2O 600 мг/л, 250 мг/л казеинового гидролизата, 10 мг/л цистеин-HCl, 5 г/л поливинилпирролидона (ММ 10 000). Приблизительно через 1-2 ч указанную культуральную среду для протопластов заменяют ферментным раствором, например, состоящим из среды BN, в котором растворено 0,5% (мас./об.) целлюлазы Cellulase YC и 0,75% (мас./об.) мацерозима Macerozyme R10 (оба от Karlan Research Products, Коттонвуд, Аризона), 1 г/л альбумина бычьей сыворотки и 1 г/л 2-морфолиноэтансульфоновой кислоты. Отношение числа верхушек побегов к объему ферментного раствора может составлять от 10 до 16, предпочтительно, 13. Чашку с кусочками верхушек побегов в ферментном растворе инкубируют при 25-30°C, предпочтительно 28°C, в темноте, на шейкере, установленном приблизительно на 50 об/мин. После инкубирования в течение ночи суспензию протопластов очищают с применением градиента плотности йодиксанол (по адаптированной инструкции Optiprep Application Sheet C18; Purification of Intact Plant Protoplasts (Очищение интактных растительных протопластов); Axis-Shield США, Коммерс Уэй (Commerce Way), 10, Нортон, Массачусетс 02776). После центрифугирования в градиенте плотности полосу с очищенными протопластами извлекают вместе с приблизительно 5 мл среды W5 (Frigerio et al., 1998). Плотность и выход протопластов определяют с помощью гемоцитометра. Плотность протопластов доводят до 1х10⁶/мл в среде BN, содержащей 2 мг/л 2,6-дихлорбензонитрила (ингибитора целлюлозосинтазы), и протопласты культивируют в темноте при 30°C в течение приблизительно 16 ч.

Выделение протопластов из суспензий клеток.

Выделение протопластов из суспензий клеток проводят согласно тому же протоколу, что и описанный для выделения протопластов из верхушек побегов, со следующими исключениями.

- 78 035397

1. Применяют суспензии быстро растущих клеток, предпочтительно через три дня после последнего пересева. Объем осевших клеток 1,5 мл переносят приблизительно в 15 мл среды BN, которую через 2 ч замещают ферментным раствором.

2. После очищения протопластов немедленно проводят обработку GRON/ПЭГ.

Введение олигонуклеотидов для генной репарации (GRON).

Суспензию протопластов смешивают с равным объемом среды W5, переносят в центрифужную пробирку объемом 50 мл и центрифугируют в течение 10 мин при минимальном для клинического центрифугирования значении (приблизительно 50xg). Супернатант удаляют и замещают средой ТМ (Klaus, S. Markerfreie transplastome Tabakpflanzen (Транспластомные растения табака без маркеров). PhD Dissertation, 2002, Ludwig-Maximilians-Universitat Mtlnchen, 109 pp), доводят плотность протопластов до 5х10⁶/мл. Аликвоты по 100 мкл, содержащие 5х10⁵ протопластов, каждая, распределяли по круглодонным центрифужным пробиркам объемом 12 мл. Затем в протопласты с применением обработки ПЭГ вводили GRON (такие как приведенные в табл. 14), нацеленные на одну или более мутацию в одном или обоих митохондриальном и пластидном генах РРХ. Для введения указанных GRON в протопласты добавляют 12,5 мкг GRON, растворенных в 25 мкл очищенной воды, и 125 мкл раствора полиэтиленгликоля (5 г ПЭГ с ММ 1500, 638 мг маннита, 207 мг CaNO₃х4Н₂О и 8,75 мл очищенной воды; рН доводили приблизительно до 9,0). Через 10-30 мин инкубации на льду суспензию протопластов и ПЭГ промывают средой W5 и ресуспендируют в среде BN. Указанную суспензию выдерживают в течение ночи в темноте при комнатной температуре.

GRON могут быть введены в протопласты с применением электропорации, катионных липидов, наночастиц, поликатионов, таких как гексаметрина бромид (полибрен) или спермидин, или с применением GRON, связанных в комплексы с разнообразными проникающими в клетки пептидами (СРР/ПКП), включая, но не ограничиваясь перечисленными, ТАТ, pVEC, транспортан, нона-аргинин, ВАХингибирующий пептид (VPMLK), или такие как перечисленные у Patel et al. Cell Penetrating Peptides: Intracellular Pathways and Pharmaceutical Perspectives (Проникающие в клетки пептиды: внутриклеточные пути и перспективы фармацевтического применения). Pharmaceutical Research, 24 (2007), 1977-1992, или у Veldhoen et al. Recent developments in peptide-based nucleic acid delivery (Последние достижения в области доставки нуклеиновых кислот на основе пептидов). International Journal of Molecular Science (2008) 1276-1320. Согласно другому варианту реализации GRON вводят в протопласты с помощью отрицательно заряженных полимеров, включая дендримеры, такие как полиамидоамин (РАМАМ), но не ограничиваясь ими.

GRON также могут быть доставлены в целые ткани либо клетки с применением способов, которые могут включать микроинъекции, биолистику покрытыми GRON носителями, такими как золото, или непосредственно в форме капель суспензии GRON, покрытых GRON вискеров, либо с применением GRON в комплексах с разнообразными проникающими в клетки пептидами (СРР), отрицательно заряженными полимерами, упомянутыми в предыдущем параграфе. Другие варианты реализации предполагают применение ультразвука, пропитывание в GRON-содержащих растворах или пермеабилизацию клеточных стенок, например, с помощью таких агентов, как толуол или сапонин.

Внедрение протопластов в альгинат кальция.

Через день после введения GRON протопласты внедряют в альгинат кальция. Было показано, что внедрение протопластов в гелевые субстраты (например, агарозу, альгинат) повышает выживаемость протопластов и увеличивает частоту деления полученных из протопластов клеток. Применяемый способ основан на описанном у Dovzhenko et al. (Thin-alginate-layer technique for protoplast culture of tobacco leaf protoplasts: shoot formation in less than two weeks (Методика культивирования культуры протопластов табачного листа на тонком слое альгината: формирование побегов менее за две недели). Protoplasma 204 (1998), 114-118).

Культивирование протопластов и отбор устойчивых к гербицидам каллусов Отбор устойчивых к гербицидам каллусов проводят с применением последовательного субкультивирования альгинатов в жидкой среде по Pelletier et al. (1983). Отбор можно начинать через неделю после обработки ПЭГ/GRON при подходящей концентрации ингибирующего PPX гербицида, например, 32 мкМ флумиоксазина или 0,25, 0,5, 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 7,8; 15,6; 31,2 или 62,5 мкМ сульфентразона. До окончания фазы отбора в жидкой среде клетки и колонии извлекают из альгината обработкой в течение 30-45 мин культуральной средой, содержащей 50 мМ цитрата натрия. К моменту переноса извлеченных колоний из жидкой среды на твердую среду Cul (Haberlach et al. Isolation, culture and regeneration of protoplasts from potato and several related Solanum species. Plant Science, 39 (1985) 67-74) большинство колоний либо могут погибнуть, либо состоят из зеленоватого центра, покрытого внешними слоями мертвых клеток. На отвержденной селективной среде (Cul + гербицид) большинство микрокаллусов, которые все еще содержат живые клетки, могут прекратить рост и побуреть. Ограниченный рост отдельных каллусов иногда продолжается, но все неустойчивые каллусы в конечном итоге буреют и погибают. Спустя две-три недели после переноса на отвержденную селективную среду (иногда ранее) активно растущие каллусы могут появляться на фоне побуревших клеток и микрокаллусов. Проводят регенерацию растений из полученных из протопластов

- 79 035397 гербицидотолерантных каллусов с подтвержденной мутацией в гене РРХ. Толерантные к ингибирующему PPX гербициду каллусы, развивающиеся на отвержденной селективной среде, анализ ДНК которых показывает наличие мутаций, переносили в не содержащую гербицидов среду Cul для ускорения развития. Скорости роста и морфология индивидуальных каллусных линий варьируют. В целом развитие в направлении регенерации побегов проходит следующие этапы:

Недифференцированный зеленый каллус^каллус с темно-зелеными участками^развитие зачатков побегов^развитие растения.

Развитие индивидуальных каллусных линий изменчиво, но многие в итоге дают побеги при непрерывном субкультивировании и размножении на среде Cul или за счет изменения состава среды на дифференцирующую среду, включая дифференцирующую среду Haberlach, но не ограничиваясь ей, на протяжении подходящего периода времени (1-6 месяцев) с последующим переносом указанных каллусных линий на среду для регенерации, включая среду для регенерации Bokelmann (Bokelmann G.S. and Roest S.Z. Pflanzenphysiol. vol. 109, p. 259-265 (1983)), но не ограничиваясь ею.

После того как на среде для регенерации сформировались побеги с тремя-четырьмя листьями, их переносят на среду для размножения, включая среду MS, но не ограничиваясь ей. На указанной среде со временем развиваются морфологически нормальные побеги и листья. После того как полученные in vitro ростки дают корни, применяют стандартные протоколы адаптации к условиям теплицы. Молекулярный скрининг

Для мониторинга частоты мутаций PPX после обработки RTDS могут применяться стандартные молекулярные техники и более чувствительные основанные на ПЦР технологии. Указанные молекулярные техники включают, но не ограничены перечисленными, аллель-специфичную ПЦР, секвенирование ДНК и другие технологии идентификации SNP с применением не задействующих ПЦР техник. Указанные техники позволяют проводить мониторинг частоты направленных мутаций PPX на раннем этапе процедуры. Согласно некоторым вариантам реализации указанные мутации могут оцениваться в популяциях одиночных клеток. Указанные техники затем могут применяться на протяжении всего процесса культивирования для подтверждения и отслеживания наличия мутаций в отобранных каллусах и регенерированных растениях.

Пример 8. Опрыскивание гербицидами.

Растения картофеля Solanum tuberosum или сорта Рассет Бербанк по достижении ими 2-6 дюймов в высоту (как правило, на этапе 5-6 листов) опрыскивают различными РРХ-ингибирующими гербицидами. Гербициды распыляют в присутствии 0,25% поверхностно-активного агента AU391. Указанные гербициды распыляют, например, в следующих количествах:

флумиоксазин 2 унций активного ингредиента на акр (а.и./акр);

сульфентразон 4,5 унций а.и./акр Сафлуфенацил 1-13 унций а.и./акр.

Гербициды применяют, опрыскивая листья; контрольные растения не опрыскивают. Эксперименты с РРХ-ингибирующим гербицидом оценивают спустя 14 дней после опрыскивания с применением шкалы поврежденности от 1 до 10, где 1 соответствует гибели, а 10 соответствует неповрежденным неопрыскиваемым контролям. Линии индивидуальных растений сравнивают для каждой интенсивности опрыскивания с результатами для контроля при данной конкретной интенсивности. РРХ-ингибирующие гербициды потенциально имеют широкий диапазон применения и могут использоваться для пре- или пост- обработки урожаев, в том числе картофеля. Исследования с гербицидами проводят как в теплицах, так и в поле для мониторинга ущерба, наносимого растениям (сельскохозяйственным культурам), и/или контроля сорняков. Продукты с использованием RTDS могут позволить фермерам при посеве сельскохозяйственных культур, таких как картофель, применять РРХ-ингибирующие гербициды для устранения или контролирования сорняков на полях, не нанося при этом ущерба культурам. Если не указано иное, все используемые в настоящем описании технические и научные термины имеют те же значения, в общем случае подразумеваемые средним специалистом в той области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение.

Изобретения, иллюстративно описанные в настоящем изобретении, могут быть подходящим образом осуществлены в отсутствие какого-либо элемента или элементов, ограничения или ограничений, конкретно не описанных в настоящем документе. Соответственно, например, термины содержащий, включающий, имеющий в составе и т.д. должны пониматься в широком смысле и без ограничения. Кроме того, термины и выражения, использованные в настоящем описании, применены в качестве описательных, но не ограничительных терминов, без намерения применения таких терминов и выражений для исключения любых эквивалентов представленных и описанных в настоящем документе признаков или их элементов. Следует понимать, что в объем заявленного изобретения могут входить различные модификации. Таким образом, необходимо понимать, что, хотя настоящее изобретение описано конкретным образом с использованием предпочтительных вариантов и возможных признаков, специалисты в данной области техники могут прибегать к модификациям, улучшению и вариациям описанных изобретений, и предполагается, что такие модификации, улучшения и вариации входят в объем настоящего изобретения. Приведенные в настоящем документе материалы, способы и примеры представляют пред- 80 035397 почтительные варианты реализации, являются иллюстративными и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

В настоящем документе изобретение было описано в широком и общем смысле. Каждый(ое) из более ограниченных видов и подклассовых групп, входящих в общее раскрытие, также является частью настоящего изобретения. Это касается и общего описания настоящего изобретения с оговоркой или отрицательным ограничением, удаляющим(ей) любой объект указанного класса, независимо от того, упоминается или нет конкретный исключенный материал в данном описании.

Кроме того, в тех случаях, когда свойства или аспекты настоящего изобретения описаны в терминах групп Маркуша, специалистам в данной области техники будет ясно, что настоящее изобретение, таким образом, также описывается в терминах любого индивидуального представителя или подгруппы представителей группы Маркуша. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие упоминаемые в настоящем описании источники явным образом во всей полноте включены в него посредством ссылок, в том же объеме, как если бы каждый их них был включен посредством индивидуальной ссылки. В случае конфликта настоящее описание, включая определения, будет иметь преимущество. Другие варианты реализации приведены в нижеследующей формуле изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Растение, устойчивое к одному или более гербицидам, ингибирующим PPX, содержащее мутантный ген протопорфириноген IX оксидазы (РРХ), причем указанный ген кодирует белок, содержащий замену в положении аминокислоты, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену в положении аминокислоты, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1, причем замена в положении аминокислоты, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, представляет собой замену аргинина на цистеин, или лейцин, или гистидин; и при этом замена в положении аминокислоты, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1, представляет собой замену аланина на треонин.
2. Растение по п.1, отличающееся тем, что указанный мутантный ген PPX кодирует белок, содержащий замены R144C и А220Т.
3. Растение по п.1 или 2, отличающееся тем, что указанное растение выбрано из группы, состоящей из картофеля, подсолнечника, сахарной свеклы, кукурузы, хлопка, пшеницы, ржи, овса, риса, канолы, плодовых растений, овощей, табака, ячменя, сорго, томата, манго, персика, яблони, груши, клубники, банана, дыни, моркови, салата, лука, видов сои, включая сою культурную, сахарного тростника, гороха, кормовых бобов, тополя, винограда, цитрусовых, люцерны, дернообразующих и кормовых трав, льна, масличного рапса, огурца, вьюнка, бальзамина, перца, баклажана, бархатцев, лотоса, капусты, астровых, гвоздики, петунии, тюльпана, ириса, лилии и дающих орехи растений, в частности, указанное растение является видом, выбранным из группы, состоящей из Solanum tuberosum, Oryza saliva и Zea mays, или сортом картофеля Рассет Бербанк.
4. Растение по любому из пп.1-3, отличающееся тем, что указанное растение устойчиво к одному или более гербицидам, ингибирующим PPX, выбранным из следующих: аксифлуорфен-Na, бифенокс, хлорметоксифен, флуоргликофен-этил, фомесафен, халосафен, лактофен, оксифлуорофен, флуозолат, пирафлуфен-этил, цинидон-этил, флумиоксазин, флумиклорак-пентил, флутиасет-метил, тидиазимин, оксадиазон, оксадиаргил, азафенидин, карфентразон-этил, сульфентразон, пентоксазон, бензфендизон, бутафенацил, сафлуфецил, пиразогил, профлуазол, в частности, указанное растение устойчиво к одному или более гербицидам, выбранным из группы, состоящей из флумиоксазина, сулфенетразона и сафлуфенацила.
5. Растение по любому из пп.1-4, которое является нетрансгенным растением.
6. Растительная клетка, устойчивая к одному или более гербицидам, ингибирующим PPX, содержащая мутантный ген протопорфириноген IX оксидазы (РРХ), причем указанный ген кодирует белок, содержащий замену в положении аминокислоты, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену в положении аминокислоты, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1, причем замена в положении аминокислоты, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, представляет собой замену аргинина на цистеин, или лейцин, или гистидин; и при этом замена в положении аминокислоты, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1, представляет собой замену аланина на треонин.
7. Растительная клетка по п.6, отличающаяся тем, что указанный мутантный ген PPX кодирует белок, содержащий замены R144C и А220Т.
8. Растительная клетка по п.6 или 7, которая является нетрансгенной клеткой.
9. Способ получения нетрансгенной растительной клетки с мутантным геном PPX, включающий введение в растительную клетку олигонуклеотида репарации генов (GRON) с направленной мутацией в гене протопорфириноген IX оксидазы (РРХ) с получением растительной клетки с геном PPX, которая экспрессирует белок PPX, содержащий замену в положении аминокислоты, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, и замену в положении аминокислоты, соответствующем по-

- 81 035397 ложению 220 последовательности SEQ ID NO: 1, причем замена в положении аминокислоты, соответствующем положению 144 последовательности SEQ ID NO: 1, представляет собой замену аргинина на цистеин, или лейцин, или гистидин; и при этом замена в положении аминокислоты, соответствующем положению 220 последовательности SEQ ID NO: 1, представляет собой замену аланина на треонин.
10. Способ получения устойчивого к гербицидам растения, включающий получение растительной клетки способом по п.9 и регенерацию нетрансгенного устойчивого к гербицидам растения, содержащего мутантный ген PPX, из указанной растительной клетки.
11. Способ по п.9 или 10, отличающийся тем, что указанный мутантный ген PPX кодирует белок, содержащий замены R144C и А220Т.
12. Способ по пп.9-11, отличающийся тем, что указанная растительная клетка является клеткой растения, выбранного из группы, состоящей из картофеля, подсолнечника, сахарной свеклы, кукурузы, хлопка, пшеницы, ржи, овса, риса, канолы, плодовых растений, овощей, табака, ячменя, сорго, томата, манго, персика, яблони, груши, клубники, банана, дыни, моркови, салата, лука, видов сои, включая сою культурную, сахарного тростника, гороха, кормовых бобов, тополя, винограда, цитрусовых, люцерны, дернообразующих и кормовых трав, льна, масличного рапса, огурца, вьюнка, бальзамина, перца, баклажана, бархатцев, лотоса, капусты, астровых, гвоздики, петунии, тюльпана, ириса, лилии и дающих орехи растений, в частности, указанная растительная клетка относится к виду, выбранному из группы, состоящей из Solanum tuberosum, Oryza sativa, Sorghum bicolor, Ricinus communis, Brassica napus, Glycine max и Zea mays, или указанная растительная клетка является сортом картофеля Рассет Бербанк.
13. Способ по любому из пп.9-12, отличающийся тем, что указанное растение устойчиво к одному или более гербицидам, ингибирующим PPX, выбранным из следующих: аксифлуорфен-Na, бифенокс, хлорметоксифен, флуоргликофен-этил, фомесафен, халосафен, лактофен, оксифлуорофен, флуозолат, пирафлуфен-этил, цинидон-этил, флумиоксазин, флумиклорак-пентил, флутиасет-метил, тидиазимин, оксадиазон, оксадиаргил, азафенидин, карфентразон-этил, сульфентразон, пентоксазон, бензфендизон, бутафенацил, сафлуфецил, пиразогил, профлуазол, в частности, указанное растение устойчиво к одному или более гербицидам, выбранным из группы, состоящей из флумиоксазина, сулфентразона и сафлуфенацила.