EA030794B1 - Жидкая питательная среда и способ крупномасштабного производства антибактериального слитого полипептида колицина и феромона - Google Patents
Жидкая питательная среда и способ крупномасштабного производства антибактериального слитого полипептида колицина и феромона Download PDFInfo
- Publication number
- EA030794B1 EA030794B1 EA201300884A EA201300884A EA030794B1 EA 030794 B1 EA030794 B1 EA 030794B1 EA 201300884 A EA201300884 A EA 201300884A EA 201300884 A EA201300884 A EA 201300884A EA 030794 B1 EA030794 B1 EA 030794B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- antibacterial
- medium
- polypeptide
- rpm
- pbhc
- Prior art date
Links
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 title claims abstract description 62
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 58
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 56
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 51
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 31
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 108010073254 Colicins Proteins 0.000 title claims description 19
- 239000003016 pheromone Substances 0.000 title claims description 12
- 230000004927 fusion Effects 0.000 title claims description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title claims 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 title 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 27
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 20
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 claims description 15
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 claims description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 12
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 8
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 8
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 8
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 6
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 claims description 5
- -1 monosubstituted phosphate Chemical class 0.000 claims description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 5
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 4
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 4
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 4
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 4
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical class [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 33
- 239000013587 production medium Substances 0.000 abstract description 7
- 238000005457 optimization Methods 0.000 abstract description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 32
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 18
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 11
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 10
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 description 10
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 9
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000004327 boric acid Substances 0.000 description 9
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 3
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 3
- 229960001019 oxacillin Drugs 0.000 description 3
- UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N oxacillin Chemical compound N([C@@H]1C(N2[C@H](C(C)(C)S[C@@H]21)C(O)=O)=O)C(=O)C1=C(C)ON=C1C1=CC=CC=C1 UWYHMGVUTGAWSP-JKIFEVAISA-N 0.000 description 3
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 3
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 description 3
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000273 veterinary drug Substances 0.000 description 3
- WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 2,6-dimethoxybenzenecarbothioamide Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(N)=S WEEMDRWIKYCTQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000031462 Bovine Mastitis Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 2
- 241000194033 Enterococcus Species 0.000 description 2
- 241000589517 Pseudomonas aeruginosa Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 2
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 2
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 2
- 208000031320 Teratogenesis Diseases 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- 241000186064 Trueperella pyogenes Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 2
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound [Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 208000004396 mastitis Diseases 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 2
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 2
- 229960002385 streptomycin sulfate Drugs 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 108010062877 Bacteriocins Proteins 0.000 description 1
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N Lincomycin Natural products CN1CC(CCC)CC1C(=O)NC(C(C)O)C1C(O)C(O)C(O)C(SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N Methicillin Chemical compound COC1=CC=CC(OC)=C1C(=O)N[C@@H]1C(=O)N2[C@@H](C(O)=O)C(C)(C)S[C@@H]21 RJQXTJLFIWVMTO-TYNCELHUSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N Perforine Natural products COC1=C2CCC(O)C(CCC(C)(C)O)(OC)C2=NC2=C1C=CO2 KHGNFPUMBJSZSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 241001147691 Staphylococcus saprophyticus Species 0.000 description 1
- 241000192097 Staphylococcus sciuri Species 0.000 description 1
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 1
- 241000194042 Streptococcus dysgalactiae Species 0.000 description 1
- 241000194049 Streptococcus equinus Species 0.000 description 1
- 241000193998 Streptococcus pneumoniae Species 0.000 description 1
- 241000194054 Streptococcus uberis Species 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000007474 bm medium Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- XIURVHNZVLADCM-IUODEOHRSA-N cefalotin Chemical compound N([C@H]1[C@@H]2N(C1=O)C(=C(CS2)COC(=O)C)C(O)=O)C(=O)CC1=CC=CS1 XIURVHNZVLADCM-IUODEOHRSA-N 0.000 description 1
- 229960000603 cefalotin Drugs 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 1
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960005287 lincomycin Drugs 0.000 description 1
- OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N lincomycin Chemical compound CN1C[C@H](CCC)C[C@H]1C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)[C@@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](SC)O1 OJMMVQQUTAEWLP-KIDUDLJLSA-N 0.000 description 1
- 238000013332 literature search Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 229960003085 meticillin Drugs 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 230000002352 nonmutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000004409 osteocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000036284 oxygen consumption Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229930192851 perforin Natural products 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229940030998 streptococcus agalactiae Drugs 0.000 description 1
- 229940115920 streptococcus dysgalactiae Drugs 0.000 description 1
- 229940031000 streptococcus pneumoniae Drugs 0.000 description 1
- 229940115922 streptococcus uberis Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Изобретение относится к жидкой производственной среде и способу получения нового антибактериального лекарственного средства на основе рекомбинантного полипептида. Изобретение относится преимущественно к составу жидкой производственной среды, пригодной для крупномасштабного производства антибактериального полипептида, а также оптимизации параметров масштабированной культуры.
Description
Изобретение относится к жидкой производственной среде и способу получения нового антибактериального лекарственного средства на основе рекомбинантного полипептида. Изобретение относится преимущественно к составу жидкой производственной среды, пригодной для крупномасштабного производства антибактериального полипептида, а также оптимизации параметров масштабированной культуры.
030794 B1
030794
Область техники
Настоящее изобретение относится к технологии антибиотических лекарственных средств, более конкретно, к способу получения нового антибактериального лекарственного средства на основе рекомбинантного полипептида.
Известный уровень техники
Значительные усилия затрачиваются на исследования новых антибиотиков, причем относящийся к ним способ уничтожения клеток путем непосредственного формирования ионных каналов в клеточной мембране бактерий оказался перспективным подходом. В природе существует большое количество бактериальных токсинов, действующих по указанному механизму. Модельным примером такого токсина является колицин - бактериальный токсин, секретируемый Escherichia coli. Еще в 1946 г. Н. Florey et al., изобретатель пенициллина, тщательно исследовал антибактериальную активность, безопасность и токсикологию колицина (British J. of Experimental Pathology, 1946(27), 378-390). Они обнаружили, что колицин обладает высокой антибактериальной активностью с очень хорошим антибактериальным эффектом даже после разбавления в миллионы раз. Однако антимикробный спектр действия колицина является очень специфическим, будучи нацеленным только на Escherichia coli и некоторые близкородственные грамотрицательные бактерии. Колицин Ia был обнаружен Jacob et al., в 1953 г., с высокой антибактериальной активностью при рН 6-7. В 1978 г. Finkelstein et al. обнаружили индуцибельный колицин K ионных каналов, способный формировать потенциалзависимые ионные каналы в искусственной бимолекулярной липидной мембране, тем самым найдя фундаментальное объяснение антибактериального механизма действия бактериального токсина, а именно формирование фатальных ионных каналов в мембране клетокмишеней. В 1996 г. Qiu and Finkelstein et al. продемонстрировали трансмембранную пространственную структуру колицина Ia при открывании или закрывании ионных каналов, сформированных в искусственной бимолекулярной липидной мембране, тем самым создав теоретический базис для разработки и получения новых антибиотиков на молекулярном уровне. В 2001 г. Qiu сконструировал и получил спроектированное антибактериальное полипептидное лекарственное средство против резистентного Staphylococcus aureus путем слияния колицина с феромоном Staphylococcus aureus, причем указанный полипептид обладал бактерицидной активностью и селективностью как in vivo, так и in vitro. Аналогично, Qiu сконструировал антибактериальные полипептиды против ванкомицин-резистентных Enterococcus и пенициллин-резистентного Streptococcus pneumoniae, причем указанные полипептиды продемонстрировали в экспериментах in vivo и in vitro специфический, стабильный и быстрый бактерицидный эффект против патогенных бактерий, стойких к существующим в настоящее время антибиотикам, с фармацевтическим эффектом, от десятков до тысяч раз превышающим эффект ванкомицина, оксациллина или пенициллина и т.д. Соответствующие результаты были опубликованы в статьях, таких как Nature Biotechnology (21(12): 1480-85, 2003) и Antimicrobial Agents and Chemotherapy (49(3): 1184-1189, 2005), и т.д.
В данном проекте предложены новая идея исследований и подход к конструированию генномодифицированных антибактериальных полипептидов путем слияния колицина с миметиками антител против антигенов патогенных бактерий, и был успешно получен генно-модифицированный антибактериальный полипептид, антибиотическое лекарственное средство широкого спектра действия на основе феромона. Автор изобретения предлагает уникальные идеи и теоретическую новизну в области антибактериальных полипептидных лекарственных препаратов, имеет поданные патенты и разработанные способы искусственного конструирования миниатюрных миметиков антител, и соответствующие результаты опубликованы в Nature Biotechnology (25(8): 921-929, 2007). Благодаря своему особому механизму бактерицидного действия, новое эффективное лекарственное средство и феромоновый антибиотик широкого спектра действия данного проекта демонстрирует хороший бактерицидный эффект против лекарственнорезистентных бактерий, более сильный, чем у имеющихся в настоящее время антибиотиков, таких как полирезистентные Pseudomonas aeruginosa (MDRPA), метициллин-резистентные Staphylococcus aureus (MRSA) и ванкомицин-резистентный энтерококк (VRE) и т.д. Разработка и изготовление указанного лекарственного средства будет играть важную роль в решении проблем, возникающих при лечении лекарственно-резистентных бактерий, а также в здравоохранении.
Лекарственное средство широкого спектра действия на основе феромонового антибиотика по данному проекту представляет собой материал, полностью отличающийся от малых пептидных антибиотиков (например, человеческого перфорина и антибактериального пептида шелковичного червя), исследованных в нашей стране и за рубежом. Между этими двумя материалами существует несколько различий:
(1) так же, как и колицин, указанный антибактериальный генно-модифицированный полипептид работает в мономерной конформации, т.е. отдельная молекула образует полный рабочий элемент; тогда как антибиотики на основе малых пептидов действуют в полимерных конформациях, т.е. десятки молекул образуют полный рабочий элемент; (2) как и колицин, указанный антибактериальный генномодифицированный полипептид может функционировать в кровотоке и in vivo; в то время как антибиотики на основе малых пептидов не могут; (3) как и колицин, указанный антибактериальный генномодифицированный полипептид образует потенциал-зависимые ионные каналы в клеточной мембране клеток-мишеней, обеспечивая лучший механизм бактерицидного действия и более высокую эффективность, чем каналы, образуемые малыми пептидными антибиотиками в клеточных мембранах клеток- 1 030794
мишеней. Согласно литературным данным известного уровня техники по состоянию на 2010 г. почти все указанные антибиотики на основе малых пептидов имеют фатальный недостаток при экспериментах на животных in vivo, а именно разрушаются протеазами животных. Поэтому ни один лекарственный препарат, разработанный на основе прекурсоров малых пептидных антибиотиков, не прошел клинических испытаний. Однако прототип нового антибактериального генно-модифицированного полипептидного лекарственного средства, разработанного и полученного в ходе выполнения проекта, является per se бактериоцином, продуцируемым бактериями, сосуществующими в пищеварительных трактах человека и животных, со структурой и механизмом действия, полностью отличающимися от отдельно взятого малого пептида. За 8 лет испытаний как in vivo, так и in vitro лекарственное средство постоянно демонстрировало высокую бактерицидную активность и проявляло хороший бактерицидный и терапевтический эффект у крупных животных (например, дойных коров и коз) в моделях с введением местными инъекциями или внутривенными инъекциями. Таким образом, для нового лекарственного препарата на основе указанного антибактериального генно-модифицированного полипептида не существует таких ограничений при использовании in vivo, как для указанных малых пептидов.
Поиск по литературе показал, что в настоящее время колицин, бактериальные полипептиды сигнальной трансдукции, а также модификации антител исследуются за рубежом, но отсутствуют исследования, проводимые на основании такой же идеи исследований или с использованием такой же методологии, как в данном проекте, и публикации похожих работ отсутствуют. Поиск в NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) в июне 2010 г. показал существование более 2600 литературных публикаций, касающихся колицина, более 7300 - феромонов, более 2100 - восстановления антител, более 3800 - иммунотоксинов и более 94000 - резистентности к антибиотикам, среди которых отсутствовали работы с такой научной концепцией, исследовательским замыслом или практическими исследованиями, как описано в данном проекте. В июне 2010 г. поиск по новизне с помощью рабочей станции для поиска по новизне (№ 1) в Министерстве образования КНР показал, что за исключением сообщений о данном проекте, отсутствуют публикации как внутри страны, так и за рубежом, о конструировании антибактериального генно-модифицированного полипептидного лекарственного средства против бактерий-мишеней, использующего колицин для связывания с феромоном бактериальной мишени или искусственно сконструированными миметиками бактериального антитела. В то же время, отсутствуют публикации как в стране, так и за рубежом о лекарственных препаратах для людей или животных или пестицидах, изготовленных в соответствии со способом конструирования целевого антибактериального генно-модифицированного полипептида по настоящему проекту.
Указанное лекарственное средство на основе феромонового антибиотика широкого спектра действия было разработано для животных (лекарственное средство для лечения коровьего мастита) и человека (антибиотики) в соответствии с фактическими потребностями. Испытания антибактериального средства in vivo и in vitro продемонстрировали, что указанный феромон проявляет сильный антибактериальный эффект, особенно in vivo, который намного лучше, чем in vitro. В мае 2010 г. оценка безопасности Центром контроля и испытаний ветеринарных препаратов (Veterinary Drug Supervision & Test Center) Министерства сельского хозяйства КНР подтвердила, что указанное лекарственное средство имеет лучшие характеристики, является нетоксичным и не вызывает мутаций или тератогенеза. Были получены такие результаты оценки безопасности готового лекарственного средства:
(1) тест на острую токсичность у крыс и мышей показал, что указанный лекарственный препарат является нетоксичным (отчет № WTPJ20100003);
(2) испытания на обратную мутацию Salmonella typhimurium (Ames) дали негативные результаты, что указывает на немутагенность указанного препарата (отчет № WTPJ20100003 (2));
(3) микроядерный тест остеоцитов костного мозга крыс дал негативные результаты, что указывает на отсутствие мутагенности указанного лекарственного средства (отчет № WTPJ20100003 (3));
(4) тест на нарушения образования спермы у мышей дал негативные результаты, что указывает на отсутствие вызывающих тератогенез эффектов в сперме мышей (отчет № WTPJ20100003 (4));
(5) антибактериальное лекарственное средство на основе рекомбинантного полипептида было испытано на in vitro ингибирование и бактерицидный эффект на выделенные патогенные бактерии коровьего мастита.
Результаты показали, что:
A) антибактериальное лекарственное средство на основе рекомбинантного полипептида обладает эффектом антибиотика широкого спектра действия, а также хорошим ингибирующим и бактерицидным эффектом на различные патогенные бактерии коровьего мастита in vitro;
B) антибактериальное лекарственное средство на основе рекомбинантного полипептида (название патентной заявки: "Новый антибиотик и нуклеотидная последовательность, способ получения и применения" (A novel antibiotic and nucleotide sequence, preparation method and application thereof), заявка № CN200910157564.5) проявляет лучший ингибирующйй и бактерицидный эффект против Staphylococcus (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus и Staphylococcus sciuri), со значениями MIC50, равным 0,125 мкг/мл, и MBC50, равным 0,25 мкг/мл, которые очень значительно отличаются от контролей цефалотина (2 мкг/мл), оксациллина (4 мкг/мл), пенициллина, ампициллина,
- 2 030794
линкомицина и гентамицина (все более 8 мкг/мл). После нормирования по молекулярному весу лекарственного средства ингибирующий и бактерицидный эффект полипептида (М.м. 70000) против Staphylococcus в 2100 раз превышал эффект цефалотина (М.м. 523) и в 5300 раз - оксациллина (М.м. 423);
C) антибактериальное лекарственное средство на основе рекомбинантного полипептида демонстрирует эквивалентный ингибирующий и бактерицидный эффект против Streptococcus, Arcanobacterium pyogenes и Enterobacteriaceae (таких как Escherichia coli и т.д.) со значениями 1,0 мкг/мл для MIC50 и 2,0 мкг/мл для MBC50 против Streptococcus (Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis и Streptococcus bovis), 0,25 мкг/мл для MIC50 и 1,0 мкг/мл для MBC50 против Arcanobacterium pyogenes, а также 1,0 мкг/мл для MIC50 и 1,0 мкг/мл для MBC50 против Enterobacteriaceae (таких как Escherichia coli и т.д.);
D) не наблюдается значительной разницы ингибирующего и бактерицидного эффекта для антибактериального лекарственного средства на основе рекомбинантного полипептида между чувствительным штаммом и лекарственно-резистентным штаммом бактерий, и антибактериальное лекарственное средство на основе рекомбинантного полипептида проявляет высокоэффективное ингибирующее и бактерицидное действие против различных лекарственно-резистентных Staphylococcus, Streptococcus и Escherichia coli.
В предшествующих испытаниях с лечением крупных животных (экспериментальная терапия коровьего мастита) 112 животных было вылечено с показателем эффективности лечения равным 95%. Государственный центр оценки безопасности ветеринарных препаратов (State Veterinary Drug Safety Assessment Center) обнаружил, что лекарственное средство относится к нетоксичным препаратам и не вызывает токсичности или вредных эффектов у животных. В то же время, будучи разлагаемым феромоновым веществом, указанное лекарственное средство не оставляет остатков лекарственных препаратов, как нормальные антибиотики, после лечения заболеваний животных и птиц. Испытания, проведенные Пекинской контрольно-инспекционной станцией качества молочных продуктов (Beijing Dairy Quality Supervision & Inspection Station), показали, что остатки антибиотика не детектируются в молоке коров, которых лечили указанным лекарственным средством (отчет об обнаружении (Detection RepoЧ№^кАCае9;-24ft)лучения указанного рекомбинантного антибиотика, предыдущая патентная заявка (название патентной заявки: "Новый антибиотик и нуклеотидная последовательность, способ получения и применения" (A novel antibiotic and nucleotide sequence, preparation method and application thereof), заявка № CN200910157564,5) раскрывает в механизме 1 описания целостный способ получения указанного антибактериального пептида, в котором осуществляется обычный способ культивирования со стадиями экспрессии рекомбинантного белка, индуцированной обогащенными бактериями после получения рекомбинантной плазмиды и трансформации в компетентные клетки. На стадии эксперимента не выдвигалось высоких требований к производительности и количеству препарата. Однако после подтверждения медицинской ценности рекомбинантного антибактериального пептида в клинических экспериментах на животных и оценки безопасности стоимость процесса получения в указанной патентной заявке слишком высока для его использования, а также практически не позволяет получать значительные количества продуктов экспрессии рекомбинантного белка с высокой чистотой. Поэтому проведение эффективной разработки и крупномасштабное производство остаются проблемой, требующей решения для обеспечения возможности практического применения указанного лекарственного средства.
Сущность изобретения
Будучи нацеленным на отсутствие решений в указанной области и растущие потребности, изобретение обеспечивает способ получения указанного рекомбинантного антибактериального полипептида.
Предлагается способ крупномасштабного производства антибактериального слитого полипептида колицина и включает следующие стадии:
(1) культивирование генно-модифицированной Escherichia coli BL-21, содержащей рекомбинантную плазмиду pBHC-SA1, pBHC-SA2, pBHC-SA3, pBHC-SA4, pBHC-SE или pBHC-PA, которая экспрессирует указанный антибактериальный полипептид в жидкой производственной питательной среде, и замораживание для хранения;
(2) индуцирование экспрессии и очистку указанного антибактериального полипептида.
При этом указанная жидкая производственная питательная среда содержит (мас./об.): натрия фосфорнокислого двузамещенного 0,68%, калия фосфорнокислого однозамещенного 0,3%, хлорида аммония 0,1%, хлорида кальция 0,001%, сульфата магния 0,02%, пептона 2,5%, порошка дрожжевого экстракта 0,75%, глюкозы 0,2%, хлорида натрия 0,6% и остальное - воду.
Указанное расширенное культивирование включает три стадии последовательного размножения E. coli BL-21 с параметрами 220 об/мин, 37°C и 3-8 ч на каждой стадии размножения. Указанное индуцирование экспрессии указанного антибактериального полипептида представляет собой обработку указанной Е. coli в жидкой производственной питательной среде следующим образом: производят культивирование при скорости перемешивания 220 об/мин с максимальным объемным расходом кислорода, 30°C в течение 2-4 ч; 42°C в течение 0,5 ч и 37°C в течение 1-2 ч; IPTG (изопропилтиогалактозид) с конечной концентрацией 0,5 мМ прибавляют после достижения 42°C.
- 3 030794
Перед указанной стадией (1) указанную Е. coli обрабатывают следующим образом.
(1) Штамм оттаивают при 4°C, восстанавливают в течение ночи в жидкой среде LB, содержащей 50 мкг/мл AMP (ампициллина) при 220 об/мин, 37°C и затем наносят на твердую среду LB для культивирования отдельных колоний.
(2) Выбирают отдельную колонию и культивируют в 1,5 мл жидкой среды LB при 220 об/мин, 37°C в течение 5-8 ч и затем переносят в 100 мл жидкой среды LB для культивирования при 220 об/мин, 37°C, в течение 5-8 ч;
Состав и соотношение компонентов в указанной среде LB (мас./об.) являются такими: хлорида натрия 1%, пептона 1%, дрожжевого экстракта 0,5%, агара 0,8-1% и остальное - вода.
Настоящее изобретение на основе ряда рекомбинантных антибактериальных полипептидов, полученных автором ранее, предлагает способ получения рекомбинантных антибиотиков, в частности, для крупномасштабного производства рекомбинантного антибактериального полипептида с высокой чистотой. Существующие способы являются непригодными для крупномасштабного производства из-за неудовлетворительной чистоты или продуктивности, что представляет собой проблему, требующую решения для обеспечения возможности клинического применения указанных рекомбинантных антибактериальных полипептидов. Изобретение предлагает состав среды, наиболее пригодный для экспрессии чужеродных генов в Escherichia coli, определенный путем селекции и оптимизации комбинаций компонентов среды. В то же время, оба показателя чистоты и продуктивности рекомбинантного антибактериального полипептида при крупномасштабном производстве оптимизируются путем выбора оптимальных параметров для расширенного культивирования, что создает основу для крупномасштабного и промышленного производства указанного рекомбинантного антибактериального полипептида.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1 иллюстрирует сравнение AMP (ампициллина) и антибактериального пептида, полученного способом по настоящему изобретению.
Слева направо, CON (контроль): мутный после 3 ч; AMP (ампициллин): мутный после 4 ч; и образцы, приготовленные по механизму 1: 194-я партия белка и 198-я партия белка оставались прозрачными через 27 ч.
Фиг. 2 иллюстрирует анализы чистоты различных партий антибактериальных генномодифицированных полипептидов, где дорожка 1 соответствует контрольному маркеру, дорожка 2 соответствует 120-й партии, дорожка 3 - 122-й партии, дорожка 4 - 126-й партии, дорожка 5 - 246-й партии, дорожка 6 - 247-й партии, дорожка 7 - 248-й партии, дорожка 8 - 250-й партии и дорожка 9 - 252-й партии. Причем способ получения 120-й, 122-й и 126-й партий представляет собой обычный способ, а 246-й, 247-й, 249-й, 250-й и 252-й партий представляет собой новый способ по настоящему изобретению.
Фиг. 3 иллюстрирует сравнение продуктивности при различных масштабах.
Слева направо приведена продуктивность для качалочной колбы, ферментера на 42 л и ферментера на 200 л, при непрерывном производстве 10 партий.
Варианты реализации изобретения.
Способ получения по данному изобретению проиллюстрирован для нескольких конкретных рекомбинантных антибактериальных пептидов следующим образом, но способ получения не ограничен такими конкретными рекомбинантными антибактериальными пептидами.
Пример 1. Способ получения антибактериальных пептидов против Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis и Pseudomonas aeruginosa.
Среды, используемые в изобретении.
(1) Жидкая среда LB (Луриа-Бертани).
На 100 мл: хлорида натрия 1 г, пептона 1 г и дрожжевого экстракта 0,5 г прибавляют в колбу на 250 мл и добавляют 100 мл воды, растворяют и автоклавируют при 120°C в течение 8 мин.
(2) Твердая среда LB.
На 100 мл: хлорида натрия 0,5-1,5 г, пептона 0,5-2 г, дрожжевого экстракта 0,3-1 г и агара 0,8-3 г прибавляют в колбу на 250 мл и добавляют 100 мл воды, растворяют и автоклавируют при 120°C в течение 8 мин. Твердую среду LB используют для культур на чашках отдельных колоний после выделения штамма.
(3) Специальная среда для производства (700 мл, 20, 100 и 200 л).
Раствор среды содержит (мас./об.), натрия фосфорнокислого двузамещенного 0,4-0,7%, калия фосфорнокислого однозамещенного 0,1-0,6%, хлорида аммония 0,05-0,2%, хлорида кальция 0,0005-0,001%, сульфата магния 0,5-2,5%, пептона 1-3%, порошка дрожжевого экстракта 0,5-1%, глюкозы 0,1-0,5%, хлорида натрия 0,2-0,8% и остальное - воду.
Предпочтительный состав среды по изобретению приведен в табл. 1.
- 4 030794
Таблица 1
| № | Ингредиенты | Количество сырьевого материала в 700 мл среды (г) | Количество сырьевого материала в 20 л среды (г) | Количество сырьевого материала в 100 л среды (Г) | Количество сырьевого материала в 200 л среды (Г) |
| 1 | Натрий фосфорнокислый двузамещенный | 4,76 | 136 | 680 | 1360 |
| 2 | Калий фосфорнокислый однозамёщенный | 2,1 | 60 | 300 | 600 |
| 3 | Хлорид аммония | 0,7 | 20 | 100 | 200 |
| 4 | Хлорид кальция | 0,007 | 0,2 | 1 | 2 |
| 5 | Сульфат магния | 0,14 | 4 | 20 | 40 |
| 6 | Пептон | 17,5 | 500 | 2500 | 5000 |
| 7 | Порошок дрожжевого экстракта | 5,25 | 150 | 750 | 1500 |
| 8 | Глюкоза | 1,4 | 40 | 200 | 400 |
| 9 | Хлорид натрия | 4,2 | 120 | 600 | 1200 |
| 10 | Вода | 700 мл | 20 л | 100 л | 200 л |
После прибавления соответствующего количества воды среду автоклавируют при 121°C в течение 8
мин.
(4) Борно-кислотный буфер: борная кислота 0,04 М, NaCl 0,01 М, тетраборат натрия 0,04 М и ЭДТА 2 мМ.
Способ приготовления: борно-кислотный буфер (5 л) = раствор А (1 л) + раствор В (4 л).
Раствор А (1 л): борная кислота 12,368 г (0,2 М), NaCl 2,925 г (0,05 М).
Раствор В (4 л): тетраборат натрия 76,27 г (0,05 М).
Раствор А 1 л и раствор В 4 л смешивают с добавлением ЭДТА 2,9225 г до конечной концентрации 2 мМ.
Стадия 1. Получение рекомбинантных мутантных плазмид.
Рекомбинантные мутантные плазмиды pBHC-SA1, pBHC-SA2, pBHC-SA3 pBHC-SA4, pBHC-SE и рВНС-РА получают в соответствии со способом, описанным в механизме 1 в описании патента по заявке № CN200910157564.5 с названием: "Новый антибиотик и нуклеотидная последовательность, способ получения и применения" (A novel antibiotic and nucleotide sequence, preparation method and application thereof).
Стадия 2. Трансформация компетентных клеток.
Инкубируют на льду 100 нг шести рекомбинантных мутантных плазмид с 40 мкл BL-21 генномодифицированных компетентных клеток в течение 5 мин, подвергают воздействию теплового шока при 42°C в течение 30 с, инкубируют на льду в течение 2 мин, прибавляют 160 мкл среды SOC и культивируют со встряхиванием при 220 об/мин, 37°C в течение 1 ч, наносят на среду LB с 1% агара и 50 мкг/мл ампициллина и культивируют в течение ночи при 37°C. Выбирают отдельные колонии и культивируют для получения штамма, который хранят при низкой температуре.
Стадия 3. Выделение штамма.
1. Выделение штамма.
Сохраненный штамм оттаивают при 4°C; 1,5 мл штамма переносят в 10 мл среды LB (содержащей 50 мкг/мл AMP) и культивируют при 220 об/мин, 37°C в течение 5-8 ч.
2. Инокуляция единичной колонии.
Восстановленный раствор бактерий разводят в 104 или 105 раз; 10 мкл разбавленного бактериального раствора переносят с нанесением покрытия на чашку с твердой средой LB (содержащей 50 мкг/мл AMP), помещают во влажную камеру и культивируют в инкубаторе при 37°C в течение 10-12 ч до появления на поверхности среды круглых единичных колоний.
3. Выделение колоний и размножение бактерий.
(1) Единичную колонию правильной круглой формы с ровными краями подхватывают с чашки стерилизованной зубочисткой или петлей для инокуляции, помещают в 1,5 мл среды LB и культивируют со встряхиванием при 220 об/мин, 37°C в течение 5-8 ч.
(2) Переносят 1,5 мл раствора LB с бактериями в 100 мл среды LB и культивируют со встряхиванием при 220 об/мин, 37°C в течение 5-8 ч.
- 5 030794
(3) Первичное размножение: 100 мл раствора бактерий с последней стадии прибавляют к 700 мл специальной среды для производства и культивируют со встряхиванием при 220 об/мин, 37°C в течение 5-8 ч.
(4) Вторичное размножение: 700 мл раствора бактерий с последней стадии прибавляют к 6x700 мл специальной среды для производства и культивируют со встряхиванием при 220 об/мин, 37°C в течение 5-8 ч.
(5) Третье размножение: 6x700 мл раствора бактерий с последней стадии прибавляют к 20 л специальной среды для производства и культивируют в ферментере со скоростью перемешивания 220 об/мин и максимальном объемном расходе кислорода, 37°C в течение 3-5 ч.
(6) Ферментируют генно-модифицированные бактерии и индуцируют экспрессию белка: 20 л раствора бактерий с последней стадии прибавляют к 200 л специальной среды для производства и культивируют в ферментере для индуцированной экспрессии белка при скорости перемешивания 220 об/мин и максимальном объемном расходе кислорода, при 30°C в течение 2-4 ч; 42°C в течение 0,5 ч и 37°C в течение 1-2 ч, отметим, что IPTC прибавляют при 42°C до конечной концентрации 0,5 мМ.
4. Центрифугирование для сбора бактерий.
Центрифугируют 6000 г культурального раствора при 4°C в течение 20 мин. Осадок собирают и прибавляют к 50 мМ борно-кислотного буфера (рН 9,0) для ресуспендирования бактерий, которое осуществляют при 4°C, отметим, что в борно-кислотный буфер добавляют 2 мМ PMSF (фенилметилсульфонилфторид).
5. Фрагментирование таллома.
После полного ресуспендирования в рН 9,0 борно-кислотном буфере, таллом (thalli) фрагментируют с помощью гомогенизатора высокого давления (High Pressure Homogenizer) при 500-600 бар 7 раз, с интервалами в 3-5 мин.
6. Осаждение талломной ДНК.
Раствор фрагментированных бактерий центрифугируют при 55000xg, 4°C в течение 40 мин. К супернатанту добавляют стрептомицина сульфат (добавляют 16 флаконов по 1 млн единиц стрептомицина сульфата на каждые 200 мл жидкости) и перемешивают в течение 1 ч с помощью магнитной мешалки.
7. Диализ.
Раствор бактерий с последней стадии центрифугируют при 55000xg, 4°C в течение 20 мин. Супернатант помещают в мешок для диализа и диализируют в течение 8-12 ч в борно-кислотном буфере, который меняют через каждые 4 ч.
8. Очистка белкового лекарственного вещества и получение антибактериального генномодифицированного полипептидного лекарственного средства.
Диализированный раствор бактерий центрифугируют при 55000xg, 4°C в течение 20 мин. Супернатант собирают в химический стакан и белок очищают ионнообменным методом. Супернатант загружают на СМ (карбоксиметильную) ионообменную колонку, тщательно промывают и элюируют 50 мМ борнокислотным буфером, содержащим 0,3 М NaCl, для получения нового антибактериального генномодифицированного полипептида.
Пример 2. Анализ полипептидного лекарственного средства на ингибирование бактерий.
1. Помещают 10 мл среды ВМ в коническую колбу на 100 мл и автоклавируют при 121°C в течение
8 мин.
2. Чистую оптическую скамью (bench) предварительно очищают спиртом и затем стерилизуют УФ в течение 30 мин.
3. По 3 мкл ночной культуры Staphylococcus aureus помещают в каждую коническую колбу на 100 мл.
4. В конические колбы на 100 мл добавляют 10 мкл стерильного солевого раствора, 1 мкл 1 мг/мл AMP и 125 мкл 0,8 мг/мл образца полипептида pBHC-SA1, полученного по способу механизма 1, и соответственно маркируют.
5. Смеси культивируют со встряхиванием при 37°C, 220 об/мин.
6. Проводят измерения через 3, 6, 9, 12 и 24 ч.
Холостой контроль и AMP становятся мутными через 3 ч, в то время как образцы не мутнеют через
9 ч, что показывает, что приготовленный образец может эффективно противодействовать Staphylococcus aureus, как проиллюстрировано на фиг. 1. На чертеже, слева направо, CON (контроль): мутный после 3 ч; AMP: мутный после 4 ч; приготовленные образцы 194-й и 198-й партий белка по механизму 1: остаются прозрачными через 27 ч.
Пример 3. Сравнение антибактериальных пептидов, полученных способом по настоящему изобретению, и обычным способом получения.
Чистоту разных партий антибактериального пептида pBHC-SA1, полученного способом по настоящему изобретению, и исходным способом (раскрытым в CN200910157564.5) в эквивалентных производственных масштабах сравнивают методами электрофореза и окрашивания в SDS-PAGE (электрофорез на полиакриламидном геле с добавкой ДСН). Результаты показывают, что при молекулярном весе примерно
- 6 030794
75000 полосы антибактериального генно-модифицировнаного полипептида, полученного по механизму 1, на дорожках 5-8 являются относительно цельными, тогда как на дорожках 2-4 наблюдаются смешанные полосы, содержащие многочисленные вещества меньшего молекулярного веса, что свидетельствует о значительно улучшенной чистоте полипептида, полученного способом по настоящему изобретению.
Пример 4. Усовершенствование производственного процесса.
Производственный процесс непрерывно усовершенствуется и оптимизируется, а масштаб производства увеличился от качалочной колбы (8,4 л) до 42-литрового ферментера (25 л) и, наконец, до 200литрового ферментера (100 л), однако продуктивность при этом не изменилась, как демонстрирует фиг. 3. Таким образом, была создана основа для крупномасштабного промышленного производства антибактериального полипептида. Выходы и продуктивности для 10 партий при непрерывном методе производства в качалочной колбе, 42-литровом ферментере, а также 200-литровом ферментере, приведены в табл. 2 и на фиг. 3.
Таблица 2
Выход и продуктивность
| Качалочная колба | 42-литровый ферментер | 200-литровый ферментер | |
| Выход | 1893,72 | 6654,82 | 31940,00 |
| Продуктивность (мг/л) | 22,54 | 26,61 | 31,94 |
Claims (5)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Жидкая производственная питательная среда для экспрессии антибактериального слитого полипептида колицина и феромона Staphylococcus aureus в генно-модифицированной Escherichia coli BL-21, содержащая (мас./об.): натрия фосфорнокислого двузамещенного 0,68%, калия фосфорнокислого однозамещенного 0,3%, хлорида аммония 0,1%, хлорида кальция 0,001%, сульфата магния 0,02%, пептона 2,5%, порошка дрожжевого экстракта 0,75%, глюкозы 0,2%, хлорида натрия 0,6% и остальное - воду.
- 2. Способ крупномасштабного производства антибактериального слитого полипептида колицина и феромона Staphylococcus aureus, включающий:(а) культивирование генно-модифицированной Escherichia coli BL-21, содержащей рекомбинантную плазмиду pBHC-SA1, pBHC-SA2, pBHC-SA3, pBHC-SA4, pBHC-SE и рВНС-РА, которая экспрессирует указанный антибактериальный полипептид в жидкой производственной питательной среде по п.1; и(б) индуцирование экспрессии и очистку указанного антибактериального полипептида.
- 3. Способ по п.2, в котором указанное культивирование включает три стадии последовательного размножения E. coli BL-21 с параметрами: 220 об/мин, 37°C, 3-8 ч на каждой стадии размножения.
- 4. Способ по п.2, в котором указанное индуцирование экспрессии указанного антибактериального полипептида представляет собой обработку указанной Е. coli в жидкой производственной питательной среде следующим образом: производят культивирование при скорости перемешивания 220 об/мин; максимальном объемном расходе кислорода 30°C в течение 2-4 ч; 42°C в течение 0,5 ч и 37°C в течение 1-2 ч, с добавлением IPTG (изопропилтиогалактозида) до конечной концентрации 0,5 мМ при 42°C.
- 5. Способ по п.2, в котором E. coli была заморожена, а перед стадией (а) указанную E. coli обрабатывают следующим образом:(а) оттаивают при 4°C, восстанавливают в течение ночи в жидкой среде LB, содержащей 50 мкг/мл AMP (ампициллина), при 220 об/мин, 37°C и затем наносят слоем на твердую среду LB (Луриа-Бертани) для культивирования отдельных колоний;(б) выбирают единичную колонию и культивируют в 1,5 мл жидкой среды LB при 220 об/мин, 37°C в течение 5-8 ч, затем переносят в 100 мл жидкой среды LB и культивируют при 220 об/мин, 37°C в течение 5-8 ч; причем используют следующие составы и соотношение компонентов в указанной LB (мас./об.): хлорида натрия 1%, пептона 1%, дрожжевого экстракта 0,5%, агара 0,8-1% и вода - остальное.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110052238.5A CN102653779B (zh) | 2011-03-04 | 2011-03-04 | 一种新型重组抗菌多肽药物的制备方法 |
| PCT/CN2012/071825 WO2012119524A1 (zh) | 2011-03-04 | 2012-03-01 | 一种新型重组抗菌多肽药物的制备方法 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA201300884A1 EA201300884A1 (ru) | 2014-04-30 |
| EA201300884A8 EA201300884A8 (ru) | 2018-06-29 |
| EA030794B1 true EA030794B1 (ru) | 2018-09-28 |
Family
ID=46729509
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA201300884A EA030794B1 (ru) | 2011-03-04 | 2012-03-01 | Жидкая питательная среда и способ крупномасштабного производства антибактериального слитого полипептида колицина и феромона |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US9765378B2 (ru) |
| EP (1) | EP2682474B1 (ru) |
| JP (1) | JP5916769B2 (ru) |
| KR (1) | KR101566331B1 (ru) |
| CN (1) | CN102653779B (ru) |
| AP (1) | AP3486A (ru) |
| AU (1) | AU2012225088B2 (ru) |
| BR (1) | BR112013022333A2 (ru) |
| CA (1) | CA2828998A1 (ru) |
| CL (1) | CL2013002534A1 (ru) |
| CO (1) | CO6771436A2 (ru) |
| EA (1) | EA030794B1 (ru) |
| HK (1) | HK1169837A1 (ru) |
| MY (1) | MY169503A (ru) |
| SG (1) | SG193000A1 (ru) |
| TW (1) | TWI541351B (ru) |
| WO (1) | WO2012119524A1 (ru) |
| ZA (1) | ZA201306575B (ru) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103131724B (zh) * | 2011-11-25 | 2015-02-25 | 畿晋庆三联（北京）生物技术有限公司 | 一种高效表达工程菌重组蛋白的方法及应用 |
| MX364611B (es) * | 2013-03-15 | 2019-05-02 | Genzyme Corp | Poliamidas con funcionalidad amina. |
| CN104328080A (zh) * | 2014-08-04 | 2015-02-04 | 湖北文理学院 | 大肠埃希菌atcc25922增殖促进剂及其应用方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2095409C1 (ru) * | 1995-06-27 | 1997-11-10 | Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии | Способ изготовления вакцины против сибирской язвы животных |
| JP2001149068A (ja) * | 1999-10-28 | 2001-06-05 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるウリジン−５’−モノホスフェートの製造法 |
| CN1712534A (zh) * | 2004-06-25 | 2005-12-28 | 私立逢甲大学 | 用以增进重组蛋白质的生产的核酸构建体与表达载体以及用以大量生产重组蛋白质的方法 |
| CN101503659A (zh) * | 2009-03-11 | 2009-08-12 | 中国农业大学 | 一种哈茨木霉菌株及其应用 |
| WO2009126890A2 (en) * | 2008-04-10 | 2009-10-15 | Microbia, Inc. | Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi |
| CN101643501A (zh) * | 2008-11-07 | 2010-02-10 | 畿晋庆三联（北京）生物技术有限公司 | 一种新型抗生素及其核苷酸序列、制备方法与应用 |
| CN101914603A (zh) * | 2010-07-08 | 2010-12-15 | 暨南大学 | 利用乳糖诱导pMFH载体生产重组蛋白的发酵方法 |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3737157B2 (ja) * | 1994-07-11 | 2006-01-18 | 協和醗酵工業株式会社 | 光学活性γ−ヒドロキシ−Ｌ−グルタミン酸の製造法 |
| US6995297B1 (en) * | 1999-07-13 | 2006-02-07 | Deuk Hun Ahn | Herb medicine composition to be contained in sanitary materials for infants |
| CN1164612C (zh) * | 2001-09-11 | 2004-09-01 | 四川新泰克控股有限责任公司 | 人工组合的抗菌工程多肽及其制备方法 |
| CN1412312A (zh) * | 2002-08-21 | 2003-04-23 | 重庆康尔威药业股份有限公司 | 重组人快速骨骼肌型肌钙蛋白c在大肠杆菌中的表达及其在抗肿瘤治疗中的应用 |
| US8212110B2 (en) * | 2003-05-14 | 2012-07-03 | Integrated Plant Genetics, Inc. | Use of bacteriophage outer membrane breaching proteins expressed in plants for the control of gram-negative bacteria |
| RU2006107931A (ru) * | 2003-08-14 | 2006-07-27 | Дзе Байо Бэлэнс Корпорейшн (Us) | Бактериальные штаммы, включающие их композиции и их пробиотическое применение |
| DK1848431T3 (en) * | 2005-02-09 | 2016-04-18 | Santen Pharmaceutical Co Ltd | LIQUID FORMULATIONS FOR TREATMENT OF DISEASES OR CONDITIONS |
| JP2009537138A (ja) * | 2006-05-18 | 2009-10-29 | バイオバランス エルエルシー | 細菌株、この細菌株を含む組成物およびそのプロバイオティック使用 |
| KR20100109902A (ko) * | 2007-12-28 | 2010-10-11 | 로께뜨프레르 | 대규모 미생물 배양 방법 |
| US20130295171A1 (en) * | 2009-07-23 | 2013-11-07 | U.S NUTRACEUTICALS, LLC d/b/a Valensa International | Krill oil and reacted astaxanthin composition and associated method |
| CN101974548A (zh) * | 2010-08-20 | 2011-02-16 | 中国农业大学 | 一种表达重组nisin-rbLF-N融合基因的大肠杆菌工程菌 |
| US8563503B2 (en) * | 2011-02-07 | 2013-10-22 | Protein Design Lab. Ltd. | Antibiotic, its nucleotide sequence, methods of construction and uses thereof |
| US8609110B2 (en) * | 2011-06-21 | 2013-12-17 | University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education | Citrobacter freundii antibacterial agents and their use |
-
2011
- 2011-03-04 CN CN201110052238.5A patent/CN102653779B/zh not_active Expired - Fee Related
-
2012
- 2012-03-01 CA CA2828998A patent/CA2828998A1/en not_active Abandoned
- 2012-03-01 AU AU2012225088A patent/AU2012225088B2/en not_active Ceased
- 2012-03-01 SG SG2013065370A patent/SG193000A1/en unknown
- 2012-03-01 WO PCT/CN2012/071825 patent/WO2012119524A1/zh active Application Filing
- 2012-03-01 AP AP2013007193A patent/AP3486A/xx active
- 2012-03-01 JP JP2013556952A patent/JP5916769B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2012-03-01 MY MYPI2013003235A patent/MY169503A/en unknown
- 2012-03-01 US US14/001,141 patent/US9765378B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2012-03-01 EA EA201300884A patent/EA030794B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2012-03-01 BR BR112013022333A patent/BR112013022333A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2012-03-01 EP EP12754430.2A patent/EP2682474B1/en not_active Not-in-force
- 2012-03-01 KR KR1020137026054A patent/KR101566331B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2012-03-02 TW TW101106936A patent/TWI541351B/zh not_active IP Right Cessation
- 2012-10-23 HK HK12110533.9A patent/HK1169837A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2013
- 2013-09-02 ZA ZA2013/06575A patent/ZA201306575B/en unknown
- 2013-09-03 CL CL2013002534A patent/CL2013002534A1/es unknown
- 2013-09-03 CO CO13208481A patent/CO6771436A2/es unknown
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2095409C1 (ru) * | 1995-06-27 | 1997-11-10 | Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии | Способ изготовления вакцины против сибирской язвы животных |
| JP2001149068A (ja) * | 1999-10-28 | 2001-06-05 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法によるウリジン−５’−モノホスフェートの製造法 |
| CN1712534A (zh) * | 2004-06-25 | 2005-12-28 | 私立逢甲大学 | 用以增进重组蛋白质的生产的核酸构建体与表达载体以及用以大量生产重组蛋白质的方法 |
| WO2009126890A2 (en) * | 2008-04-10 | 2009-10-15 | Microbia, Inc. | Production of carotenoids in oleaginous yeast and fungi |
| CN101643501A (zh) * | 2008-11-07 | 2010-02-10 | 畿晋庆三联（北京）生物技术有限公司 | 一种新型抗生素及其核苷酸序列、制备方法与应用 |
| CN101503659A (zh) * | 2009-03-11 | 2009-08-12 | 中国农业大学 | 一种哈茨木霉菌株及其应用 |
| CN101914603A (zh) * | 2010-07-08 | 2010-12-15 | 暨南大学 | 利用乳糖诱导pMFH载体生产重组蛋白的发酵方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| RUIZ, T. et al., Cloning of the Pichia anomala SEC61 Gene and Its Expression in a Saccharomyces cerevisiae sec61 Mutant, CURRENT MICROBIOLOGY, 2003, vol. 46, p. 340-344 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2682474A1 (en) | 2014-01-08 |
| EP2682474B1 (en) | 2017-05-10 |
| AP2013007193A0 (en) | 2013-10-31 |
| EA201300884A1 (ru) | 2014-04-30 |
| US20160304927A1 (en) | 2016-10-20 |
| KR101566331B1 (ko) | 2015-11-05 |
| ZA201306575B (en) | 2016-03-30 |
| JP2014508766A (ja) | 2014-04-10 |
| CN102653779A (zh) | 2012-09-05 |
| TW201239092A (en) | 2012-10-01 |
| TWI541351B (zh) | 2016-07-11 |
| AU2012225088B2 (en) | 2015-04-09 |
| CN102653779B (zh) | 2014-02-19 |
| NZ614593A (en) | 2015-07-31 |
| CO6771436A2 (es) | 2013-10-15 |
| BR112013022333A2 (pt) | 2016-12-06 |
| AU2012225088A1 (en) | 2013-09-12 |
| EA201300884A8 (ru) | 2018-06-29 |
| US9765378B2 (en) | 2017-09-19 |
| JP5916769B2 (ja) | 2016-05-11 |
| KR20130138822A (ko) | 2013-12-19 |
| EP2682474A4 (en) | 2014-12-10 |
| HK1169837A1 (en) | 2013-02-08 |
| MY169503A (en) | 2019-04-15 |
| CA2828998A1 (en) | 2012-09-13 |
| WO2012119524A1 (zh) | 2012-09-13 |
| SG193000A1 (en) | 2013-10-30 |
| AP3486A (en) | 2015-12-31 |
| CL2013002534A1 (es) | 2014-07-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zimina et al. | Overview of global trends in classification, methods of preparation and application of bacteriocins | |
| CN108314722B (zh) | 一种抗菌肽及其应用 | |
| EA030794B1 (ru) | Жидкая питательная среда и способ крупномасштабного производства антибактериального слитого полипептида колицина и феромона | |
| CN113321708B (zh) | 一种人工设计抗菌肽的制备及其在水产上的应用 | |
| EA028912B1 (ru) | Новый антибиотик, содержащий миметическое антитело, способы его приготовления и применения | |
| US20070264247A1 (en) | Use of Human Lysozyme in Preparation of Medicine for Treating Acne | |
| ES2686341T3 (es) | Nuevo método de preparación de antibióticos y sistema de plataforma basado en el mismo | |
| Li et al. | Study on preparation of a Streptococcus suis ghost vaccine | |
| CN106387314B (zh) | 脆弱拟杆菌在动物养殖中的应用 | |
| Wu et al. | Granulin peptide GRN-41 of Mozambique tilapia is a novel antimicrobial peptide against Vibrio species | |
| CN111053890B (zh) | 来源于鳜鱼的半乳糖凝集素-8在制备抑菌剂中的应用 | |
| CN114149483A (zh) | 一种抗菌肽组合物及其应用 | |
| OA16584A (en) | Preparation method of new recombinant antibacterial polypeptide medicine. | |
| NZ614593B2 (en) | Preparation method of new recombinant antibacterial polypeptide medicine | |
| CN112724198A (zh) | 一种抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗菌肽及其制备方法和应用 | |
| TWI810805B (zh) | 複合乳酸菌組成物及其用於製備抑制抗藥性腸桿菌之口服組成物的用途 | |
| RU2733144C1 (ru) | Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae subsp.pneumoniae, обладающий способностью к биопленкообразованию | |
| CN107056948B (zh) | 抗菌肽融合蛋白及其制备方法和应用 | |
| KR20240015754A (ko) | 젖소유방염 치료용 항균단백질 조성물 | |
| Shah et al. | Synthetic antimicrobial peptide identified using artificial intelligence inhibit growth of antibiotic resistant Pseudomonas aeruginosa in vitro | |
| CN117866068A (zh) | 一种促进创面愈合的合浦珠母贝半乳糖结合凝集素蛋白pfl-96及其制备方法和应用 | |
| EP3006461A1 (en) | Human coagulation factor light-chain protein and application of same | |
| KR101830946B1 (ko) | 바실러스 리체니포미스 유래 박테리오신을 포함하는 황색포도상구균 rf122에 대한 항균용 조성물 | |
| KR20240015755A (ko) | 연쇄상구균에 대하여 용균 활성을 갖는 항균단백질 | |
| Shulga et al. | Pathogenic properties of enterobacteria isolated from calves in the Far Eastern Federal District |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |