EA030709B1 - Производное фенантролинфосфоновой кислоты и способ его получения и применения - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к новому соединению фенантролинфосфоновой кислоты и его фармацевтической соли, а также к применению соединения и его фармацевтической соли в качестве ингибиторов коллагенпролилгидроксилазы в получении лекарственных средств для предупреждения или лечения заболевания, связанного с коллагенпролил-4-гидроксилом.

Description

Изобретение относится к новому соединению фенантролинфосфоновой кислоты и его фармацевтической соли, а также к применению соединения и его фармацевтической соли в качестве ингибиторов коллагенпролилгидроксилазы в получении лекарственных средств для предупреждения или лечения заболевания, связанного с коллагенпролил-4-гидроксилом.

030709 B1

030709

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области фармацевтики, в частности к новому соединению фенантролинфосфоновой кислоты и к его фармацевтической соли, получению соединения, а также применению соединения и его фармацевтической соли в качестве ингибиторов коллагенпролил-4гидроксилазы при получении лекарственных средств для предупреждения или лечения заболевания, связанного с коллагенпролил-4-гидроксилазой.

Предпосылки создания изобретения

Следующее описание предпосылок настоящего изобретения представлено для облегчения понимания настоящего изобретения, но не предназначено для представления или описания предшествующего уровня техники настоящего изобретения. Все приведенные публикации включены посредством ссылки во всей своей полноте.

В основе фиброза печени лежит синтез избыточного коллагена (в частности, коллагена I) (Clin. Sci. 1997, 92, 103) в печени, который откладывается на внеклеточном матриксе (ЕХМ). Биосинтез коллагена включает ряд посттрансляционных модификаций проколлагена. В данный процесс вовлечены пять ферментов: 3 коллагенгидроксилазы и 2 коллагенгликозилтрансферазы. В числе данных гидроксилаз пролил-4-гидроксилаза (Р4Н) представляет собой тетрамер 2 α-субъединиц (Р4На1, Р4На2) и 2 βсубъединиц. β-Субъединица представляет собой дисульфидизомеразу, и основные части, имеющие каталитический эффект, расположены в β-субъединице, а основная роль α-субъединицы состоит в определении активности фермента. Пролил-4-гидроксилаза представляет собой ограничивающий скорость фермент в синтезе 21 различного коллагена (Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 2010, 45, 106). P4H расположена в эндоплазматическом ретикулюме и катализирует образование 4гидроксипролина из остатка пролина в последовательности X-Pro-Gly в присутствии Fe²'. O₂, 2оксоглутарата и аскорбата.

Р4Н гидроксилирует пролин до 4-гидроксипролина (4-HYP) в некоторых положениях проколлагена, усиливая, таким образом, стабильность коллагена путем образования тройных спиралей в физиологических условиях. С другой стороны, при меньшем содержании 4-HYP, коллаген не способен образовывать стабильную структуру тройных спиралей и разлагается (Matrix Biol. 2003, 22, 15). Следовательно, ингибирование активности Р4Н получило широкое признание в качестве действенного способа контроля синтеза избыточного коллагена (фиброза). (Hepatol. 1998, 28, 404). Подтверждено, что некоторые низкомолекулярные ингибиторы Р4Н являются эффективными в предотвращении синтеза коллагена in vitro и in vivo (J. Hepatol. 1997, 27, 185; Hepatol. 1996, 23, 755; Hepatol. 1998, 28, 404; Biochem. J. 1994, 300, 525; J. Hepatol. 1991, 13, S35). Например, ингибитор Р4Н HOE077 ингибирует экспрессию мРНК проколлагена и снижает пролиферацию звездчатых клеток печени (Hepatol. Res. 2002, 23, 1; J. Hepatol. 1997, 27, 185), а также ингибирует активацию звездчатых клеток печени (Hepatol. 1996, 23, 755). Ингибиторный эффект НОЕ077 относительно гена и белка проколлагена был дозозависимым, но не наблюдалось никакого эффекта относительно синтеза общего белка клетки. Ингибиторный эффект НОЕ077 возможно вызван ингибированием экспрессии гена TIMP для ускорения процесса разложения коллагена (J. Gastroenterol. 1999, 34, 376). Некоторые ингибиторы Р4Н продемонстрировали противофиброзный эффект в различных животных моделях фиброза печени (CCl₄, TAA и т.д.). (Hepatol. 1998, 28, 404; Hepatol 1996, 23, 755; J. Hepatol 1997, 27, 185). Сообщалось, что другой ингибитор Р4Н FG-041 (1,4-дигидрофенантрол-4-он-3карбоновая кислота) предотвращает инфаркт миокарда в эксперименте на животных (Circulation 2001, 104, 2216). Также сообщалось, что ингибиторы Р4Н предотвращают закупорку мочевого пузыря (Urology 2012, 80, 1390).

Р4Н встречается по всему организму. Таким образом, ингибиторы Р4Н, которые направленно доставляются в пораженный болезнью орган, тогда как другой нормальный орган не подвергается воздействию, являются ключом к успешной разработке безопасных и эффективных ингибиторов Р4Н. В 1990-х в компании HOECHST (которая на данный момент представляет собой Sanofi, Франция) впервые был разработан НОЕ077 для лечения цирроза печени (Hepatol. 1996, 23, 755: J. Hepatol. 1997, 27, 185). Доклинические исследования продемонстрировали перспективные результаты, несмотря на то, что в клинических исследованиях наблюдались тяжелые побочные эффекты (катаракта). Сообщалось, что ингибирование синтеза коллагена может оказывать серьезное влияние на функцию органа, такого как глаза и почки (J. Biol. Chem. 2010, 285, 42023). Синтез коллагена широко распространен в клеточном матриксе, следовательно, подавление синтеза коллагена клеточного матрикса органа приводит к выделению макромолекул, что вызывает изменение функции органа. Таким образом, решением для разработки ингибиторов Р4Н, применяемых для лечения фиброза органа (такого как фиброз печени), является определение того, как доставить ингибиторы Р4Н в указанный орган. Пролекарства широко применялись в целевых терапевтических областях (J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005, 312, 554). 1,3-Пропандиолы могут образовывать циклические сложные фосфонатные эфиры с фосфоновыми кислотами, которые, как сообщалось, нацеливаются на печень (J. Med. Chem. 2008, 51, 666). Система доставки пролекарства в печень, которая применяется в настоящем изобретении, состоит в модификации активного компонента лекарственного средства в неактивное пролекарство. Пролекарство может быть метаболизировано только под действием катализа спе- 1 030709

цифичных для печени ферментов, например, цитохрома Р450, для высвобождения активного компонента в печень, следовательно, активный компонент оказывает воздействие на печень.

Описание настоящего изобретения

Целью настоящего изобретения является обеспечение нового соединения фенантролинфосфоновой кислоты и его фармацевтической соли. Другой целью настоящего изобретения является обеспечение получения соединения и его фармацевтической соли. Другой целью настоящего изобретения является обеспечение применения соединения и его фармацевтической соли в качестве ингибиторов коллагенпролил-4-гидроксилазы при получении лекарственных средств для предупреждения или лечения заболевания, связанного с коллагенпролил-4-гидроксилазой.

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает соединения формулы I или формулы II и их фармацевтически приемлемые соли:

где в формуле I

X представляет собой -Cl или -OR³;

R³ представляет собой -Н, -С(О)-(С1-С₆ алкил), -РО(ОН)₂ или -СН₂ОРО(ОН)₂;

каждый из R¹ и R² может быть независимо выбран из Н, С1-С₆-алкила, -СН₂ОСО-(С1-С₆-алкила) и СН₂ОСОО-(С1-С₆-алкила); или R¹ и R² соединены с образованием группы, характеризующейся формулой

где Y представляет собой арил или гетероарил.

В одном аспекте X может быть выбран из -С1 и -OR³, R³ представляет собой -Н, -С(О)-(С₁-С₆алкил), -РО(ОН)2 или -СН2ОРО(ОН)2.

В другом аспекте каждый из R¹ и R² может быть независимо выбран из Н, С₁-С₆-алкила, -СН₂ОСО(С₁-С₆-алкила) и -СН₂ОСОО-(С₁-С₆-алкила); или R¹ и R² соединены с образованием группы, характеризующейся формулой

где Y представляет собой арил, гетероарил; при этом в формуле II

Z представляет собой -Н или -СН₂ОРО(ОН)₂;

каждый из R¹ и R² независимо выбран из Н, С₁-С₆-алкила, -СН₂ОСО-(С₁-С₆-алкила) и -СН₂ОСОО(С₁-С₆-алкила); или R¹ и R² соединены с образованием группы, характеризующейся формулой

где Y представляет собой арил или гетероарил.

В одном аспекте Z может быть выбран из -Н и -СН₂ОРО(ОН)₂.

12

В другом аспекте каждый из R и R может быть независимо выбран из Н, С₁-С₆-алкила, -СН₂ОСО(С₁-С₆-алкила) и -СН₂ОСОО-(С₁-С₆-алкила); или R¹ и R² соединены с образованием группы, характеризующейся формулой

где Y представляет собой арил, гетероарил.

В предпочтительном варианте осуществления соединение характеризуется формулой

- 2 030709

В другом предпочтительном варианте осуществления характеризуется формулой

В другом предпочтительном варианте осуществления соединение характеризуется формулой

Второй аспект настоящего изобретения предусматривает способ получения соединения фенантролинфосфоновой кислоты и его фармацевтической соли.

Третий аспект настоящего изобретения предусматривает применение соединения фенантролинфосфоновой кислоты и его фармацевтической соли в качестве ингибиторов коллагенпролил-4-гидроксилазы при получении лекарственных средств для предупреждения или лечения заболевания, связанного с коллагенпролил-4-гидроксилазой.

Настоящее изобретение предусматривает применение соединений формулы I или формулы II или их фармацевтической соли при получении лекарственных средств для предупреждения или лечения заболевания, связанного с коллагенпролил-4-гидроксилазой.

Настоящее изобретение предусматривает применение соединений формулы I или формулы II или их метаболита in vivo, или их фармацевтической соли в качестве ингибиторов коллагенпролил-4гидроксилазы.

Настоящее изобретение может сохранять функцию печени путем введения пациенту с хроническими поражениями печени терапевтически эффективного количества соединения формулы I и формулы II или их фармацевтически приемлемой соли.

Настоящее изобретение может обеспечивать предупреждение и лечение фиброза печени путем введения пациенту с хроническими поражениями печени терапевтически эффективного количества соединения формулы I и формулы II или их фармацевтически приемлемой соли.

Настоящее изобретение может обеспечивать предупреждение фиброза печени путем введения пациенту с риском развития диабета терапевтически эффективного количества соединения формулы I и формулы II или их фармацевтически приемлемой соли.

Описание фигур

Фиг. 1. IC₅₀ соединения 9с в сравнении с ферментом Р4Н.

Фиг. 2. Кривая зависимости концентрации от времени соединения 16с в плазме после iv (внутривенного) дозированного введения 16с (3 мг/кг) и РО (перорального) дозированного введения 27 (39 мг/кг).

Фиг. 3. Окрашивание Н&Е печени крысы (группа SHAM).

Фиг. 4. Окрашивание Н&Е печени крысы (2 недели BDL).

Фиг. 5. Окрашивание Н&Е печени крысы (BDL, PO введение 27, 30 мг/кг, 2 недели).

Подробное описание предпочтительного варианта осуществления

Определения терминов.

В соответствии с настоящим изобретением и как применяется в данном документе, следующие термины определены следующими значениями, если четко не указано иное.

Термин "алкил" относится к насыщенным алифатическим группам, в том числе к группам с прямой цепью, разветвленной цепью и к циклическим группам не более чем, причем включительно, с 20 атомами углерода. Подходящие алкильные группы включают метил, этил, н-пропил, изопропил и циклопро- 3 030709

пил. Алкил может быть необязательно замещен 1-3 заместителями.

Термин "арил" относится к ароматическим группам, которые содержат 5-14 кольцевых атомов и при этом по меньшей мере одно кольцо содержит сопряженную пи-электронную систему и включает карбоциклический арил, гетероциклический арил, конденсированный арил и биарильный арил, все из которых могут быть необязательно замещены. Арил может быть необязательно замещен 1-6 заместителями.

Гетероциклические арильные или гетероарильные группы представляют собой группы, которые содержат 5-14 кольцевых атомов, где 1-4 гетероатома являются кольцевыми атомами в ароматическом кольце и оставшиеся кольцевые атомы представляют собой атомы углерода. Подходящие гетероатомы включают кислород, серу, азот и селен. Подходящие гетероарильные группы включают фуранил, тиенил, пиридил, пирролил, N-низший алкил-пирролил, пиридил-Ы-оксид, пиримидил, пиразинил, имидазолил и т.п., при этом все из них необязательно замещены.

Термин "необязательно замещенный" или "замещенный" относится к группам, замещенным однимчетырьмя заместителями, независимо выбранными из низшего алкила, низшего арила, низшего аралкила, низшего циклического алкила, низшего гетероциклоалкила, гидрокси, низшего алкокси, низшего арилокси, пергалогеналкокси, аралкокси, низшего гетероарила, низшего гетероарилокси, низшего гетероарилалкила, низшего гетероаралкокси, азидо, амино, галогена, низшего алкилтио, оксо, низшего ацилалкила, низших сложных эфиров карбоновых кислот, карбоксила, карбоксамидо, нитро, низшего ацилокси, низшего аминоалкила, низшего алкиламиноарила, низшего алкиларила, низшего алкиламиноалкила, низшего алкоксиарила, низшего ариламино, низшего аралкиламино, сульфонила, низшего карбоксамидоалкиларила, низшего карбоксамидоарила, низшего гидроксиалкила, низшего галогеналкила, низшего алкиламиноалкилкарбокси, низшего аминокарбоксамидоалкила, циано, низшего алкоксиалкила, низшего пергалогеналкила и низшего арилалкилоксиалкила.

"Замещенный арил" и "замещенный гетероарил" относятся к арилу и гетероарильным группам, замещенным 1-6 заместителями. Данные заместители выбраны из низшего алкила, низшего алкокси, низшего пергалогеналкила, галогена, гидрокси и амино.

Термин "галогенид" или "галоген" относится к -F, -Cl, -Br и -I.

Выражение "терапевтически эффективное количество" означает количество соединения или комбинации соединений, необходимое для улучшения, смягчения, устранения или предупреждения, модификации, замедления одного или более симптомов конкретного заболевания.

Термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к солям, образованным путем смешивания соединений формулы I или формулы II и их пролекарства с органическими или неорганическими кислотой или основанием. Подходящие кислоты включают уксусную кислоту, адипиновую кислоту, бензолсульфоновую кислоту, (+)-7,7-диметил-2-оксобицикло[2.2.1]гептан-1-метансульфоновую кислоту, лимонную кислоту, 1,2-этандисульфоновую кислоту, додецилсульфоновую кислоту, фумаровую кислоту, глюкогептоновую кислоту, глюконовую кислоту, глюкуроновую кислоту, гиппуровую кислоту, гидрохлоридгемиэтаноловую кислоту, HBr, HCl, HI, 2-гидроксиэтансульфоновую кислоту, молочную кислоту, лактобионовую кислоту, малеиновую кислоту, метансульфоновую кислоту, метилбромидную кислоту, метилсерню кислоту, 2-нафталинсульфоновую кислоту, азотную кислоту, олеиновую кислоту, 4,4'метиленбис[3-гидрокси-2-нафталинкарбоновую кислоту], фосфорную кислоту, полигалактуроновую кислоту, стеариновую кислоту, янтарную кислоту, серную кислоту, сульфосалициловую кислоту, дубильную кислоту, виннокаменную кислоту, терфталовую кислоту и п-толуолсульфоновую кислоту. Соль, образованная путем смешивания с подходящим основанием, представляет собой соль натрия, соль калия, соль кальция, соль магния, соль лития, соль цезия, соль аминокислоты.

Термин "пациент" относится к животному-млекопитающему мужского или женского пола, подвергающемуся лечению, такому как собака, кошка, корова, лошадь, овца и человек.

Термин "пролекарство", применяемый в данном документе, относится к любому соединению, которое при введении в биологическую систему, образует биологически активное соединение в результате самопроизвольной химической реакции(реакций), катализируемой ферментом химической реакции(реакций) и/или метаболической химической реакции(реакций), или комбинации каждой из них. Стандартные пролекарства образованы с использованием групп, прикрепленных к функциональной группе, например, НО-, HS-, НООС-, R₂N-, связанной с лекарственным средством, которое расщепляется in vivo. Стандартные пролекарства включают без ограничения карбоксилатные сложные эфиры, где группа представляет собой алкил, арил, аралкил, ацилоксиалкил, алкоксикарбонилоксиалкил, а также ацил, алкоксикарбонил, аминокарбонил, фосфат или сульфат, которые прикреплены к гидроксилу, тиолу и аминам. Приведенные группы являются иллюстративными, не являются исчерпывающими, и специалист в данной области может получить другие известные разновидности пролекарств. Такие пролекарства соединений формулы I и II входят в данный объем. Пролекарства должны подвергаться некоторой форме химической трансформации с получением соединения, которое является биологически активным или представляет собой предшественник биологически активного соединения. В некоторых случаях пролекарство является, как правило, менее биологически активным, чем само по себе лекарственное средство, и служит для улучшения эффективности или безопасности лекарственного средства посредством

- 4 030709

улучшенной биодоступности при пероральном приеме, фармакодинамического периода полувыведения и т.д. Пролекарственные формы соединений могут быть использованы, например, для улучшения биодоступности, улучшения переносимости субъектом путем скрытия или уменьшения нежелательных характеристик, таких как горький вкус или раздражение желудочно-кишечного тракта, изменения растворимости для внутривенного применения, обеспеченного для длительного или непрерывного высвобождения или доставки, улучшения облегчения составления, или обеспечения специфичной для данного участка доставки соединения. Пролекарства описаны в The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action, Richard B. Silverman, Academic Press, San Diego, 1992. Chapter 8: "Prodrugs and Drug delivery Systems" pp.352-401; Design of Prodrags, edited by H. Bundgaard, Elsevier Science, Amsterdam, 1985; Design of Biopharmaceutical Properties through Prodrags and Analogs, Ed. by E. B. Roche, American Pharmaceutical Association, Washington, 1977; and Drug Delivery Systems, ed. by R. L. Juliano, Oxford Univ. Press, Oxford, 1980.

Термин "процентный энантиомерный избыток (% ее)" относится к оптической чистоте. Его получают с помощью следующей формулы:

iRl-fSl

_r ^L J ^Lr ^Jxl00=%R-%S

[R]+[S] ,

где [R] представляет собой количество R-изомера, a [S] представляет собой количество S-изомера. Данная формула обеспечивает % ее, если R является преобладающим изомером.

Термины "осуществление лечения" или "лечение" заболевания включают предупреждения возникновения заболевания (профилактическое лечение), ингибирование заболевания (замедление или прекращение его развития), обеспечивающее облегчение симптомов или побочных эффектов заболевания (в том числе паллиативное лечение), и ослабление заболевания (обеспечение регрессии заболевания).

Составы соединения по настоящему изобретению.

Соединения по настоящему изобретению вводят в общей суточной дозе от 0,01 до 2500 мг. В одном аспекте диапазон составляет от приблизительно 5 мг до приблизительно 500 мг. Дозу можно вводить в виде разделенных на несколько частей доз, как будет удобно.

Соединения по настоящему изобретению при применении в комбинации с другими средствами можно вводить в виде суточной дозы или соответствующей части суточной дозы (например, дважды в сутки). Соединения по настоящему изобретению можно применять в качестве части схемы комбинированного лекарственного лечения, также известной как комбинированная или "коктейльная" терапия, при этом несколько средств можно вводить совместно, можно вводить раздельно в одно и то же время или с различными интервалами, или вводить последовательно. Соединения по настоящему изобретению можно вводить после курса лечения другим средством, в течение курса лечения другим средством, вводить в виде части терапевтической схемы или можно вводить перед лечением другим средством в программе лечения.

Для достижения цели лечения соединения по настоящему изобретению можно вводить с помощью различных средств, в том числе перорально, парентерально, путем распыления ингаляционного раствора, местно или ректально в составах, содержащих фармацевтически приемлемые носители, вспомогательные средства и наполнители. Термин "парентеральный", применяемый в данном документе, включает подкожные, внутривенные, внутримышечные и внутриартериальные инъекции с различными методиками инфузий. Внутриартериальная и внутривенная инъекция, применяемая в данном документе, включает введение посредством катетеров. Внутривенное введение, как правило, является предпочтительным.

Фармацевтически приемлемые соли включают соль натрия, соль калия, соль кальция, соль магния, соль лития, соль цезия, соль аминокислоты, ацетат, адипат, безилат, бромид, камсилат, гидрохлорид, цитрат, эдизилат, эстолат, фумарат, глюцептат, глюконат, глюкоранат, гиппурат, гиклат, бромид, хлорид, йодид, изетионат, лактат, лактобионат, малеат, мезилат, метилбромид, метилсульфат, напсилат, нитрат, олеат, пальмоат, фосфат, полигалактуронат, стеарат, сукцинат, сульфат, сульфосалицилат, таннат, тартрат, терфталат, тозилат и трийодид.

Активный ингредиент лекарственного средства имеет различные формы для разных способов введения. Например, для перорального применения могут быть получены таблетки, пастилки, таблетки для рассасывания, водные или масляные суспензии, диспергируемые порошки или гранулы, эмульсии, твердые или мягкие капсулы, сиропы или настойки. Способ получения препарата для перорального применения может относиться к способу производства известного лекарственного препарата. С целью обеспечения привлекательного препарата препарат может содержать одно или более средств, включая подсластители, ароматизаторы, красители и консерванты. Таблетки, содержащие активный ингредиент в смеси с нетоксичным фармацевтически приемлемым вспомогательным средством, которое пригодно для производства таблеток, являются приемлемыми. Данные вспомогательные средства могут представлять собой, например, инертные разбавители, такие как карбонат кальция или натрия, лактозу, фосфат кальция или натрия; гранулирующие и диспергирующие средства, такие как кукурузный крахмал или альгиновая кислоты; связывающие средства, такие как крахмал, желатин или камедь; и смазывающие средства, такие как стеарат магния, стеариновая кислота или тальк. Таблетки могут быть непокрытыми или могут быть

- 5 030709

покрыты с использованием известных методик, в том числе с использованием микроинкапсулирования для замедления распада и поглощения в желудочно-кишечном тракте и обеспечения таким образом непрерывного действия в течение более длительного периода. Например, может быть использован материал для задержки во времени, такой как глицерил моностеарат или глицерил моностеарат отдельно или с воском.

Составы для перорального применения могут быть в форме твердых желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с инертным твердым разбавителем, например, фосфатом кальция или каолином, или в виде мягких желатиновых капсул, в которых активный ингредиент смешан с водной или масляной средой, такой как арахисовое масло, жидкий парафин или оливковое масло.

Активные ингредиенты по настоящему изобретению также могут быть смешаны со вспомогательными средствами, подходящими для промышленного производства, с получением водных суспензий. Такие вспомогательные средства включают суспендирующие средства, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, метилцеллюлоза, этилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакантовая камедь и аравийская камедь; диспергирующие или смачивающие средства, такие как природные фосфатиды (например, лецитин), продукты конденсации алкиленоксидов с жирными кислотами (например, полиоксиэтиленстеарат), продукты конденсации этиленоксидов с длинноцепочечными алифатическими спиртами (например, гептадецилэтиленоксиэтанол), продукты конденсации этиленоксида с неполным сложным эфиром, полученным из жирных кислот и гекситангидридов (например, полиоксиэтиленсорбитанмоноолеат). Водная суспензия также может содержать один или более консервантов, таких как этил или н-пропил пара-гидрокси-бензоат, красители, ароматизаторы и подсластители, такие как сахароза и сахарин.

Масляные суспензии могут быть составлены путем суспендирования активного ингредиента в растительном масле (таком как арахисовое масло, оливковое масло, кунжутное масло или кокосовое масло) или в минеральном масле (таком как жидкий парафин). Суспензии для перорального применения также могут содержать загуститель (такой как пчелиный воск, твердый парафин или цетиловый спирт). Для обеспечения привлекательного препарата для перорального применения можно добавлять подсластители, такие как средства, приведенные выше, и ароматизаторы. Данные композиции могут быть законсервированы путем добавления антиоксиданта, такого как аскорбиновая кислота.

Диспергируемые порошки и гранулы по настоящему изобретению, подходящие для получения водной суспензии путем добавления воды, обычно содержат активный ингредиент вместе с диспергирующим или смачивающим средством, суспендирующим средством и одним или более консервантами. Подходящие диспергируемые или смачивающие средства и суспендирующие средства проиллюстрированы теми, которые раскрыты выше. Также могут присутствовать дополнительные вспомогательные средства, например, подсластители, ароматизаторы и красители.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению также могут быть представлены в форме эмульсий типа "масло в воде". Масляная фаза может представлять собой растительное масло, такое как оливковое масло и арахисовое масло, минеральное масло, такое как жидкий парафин, или их смесь. Подходящие эмульгирующие средства включают природные камеди, такие как аравийская камедь и трагакантовая камедь, природные фосфатиды, такие как соевый лецитин, сложные эфиры или неполные сложные эфиры, образованные из жирных кислот и гекситангидридов, таких как моноолеат сорбита, и продуктов конденсации данных неполных сложных эфиров с этиленоксидом, таким как полиоксиэтиленсорбитмоноолеат. Эмульсия также может содержать подсластители и ароматизаторы.

Сиропы и настойки могут быть составлены с подсластителями, такими как глицерин, сорбит или сахароза. Такие составы также могут содержать смягчающее средства, консервант, ароматизатор или краситель.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть в форме стерильного препарата для инъекции, такого как стерильная водная или масляная суспензия для инъекции. Данная суспензия может быть составлена в соответствии с известным уровнем техники с использованием таких подходящих диспергирующих или смачивающих средств и суспендирующих средств, которые упоминались выше. Стерильный препарат для инъекции также может представлять собой раствор или суспензию, которая получена с помощью нетоксичного разбавителя или растворителя для инъекции, например, получения лиофилизированного порошка и растворения в 1,3-бутан-диоле. Приемлемые наполнители и растворители могут представлять собой воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, стерильные нелетучие масла обычно можно использовать в качестве растворителя или суспендирующей среды. Может быть использовано любое легкое нелетучее масло, в том числе синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, в препарате для инъекции подобным образом могут быть использованы жирные кислоты, такие как олеиновая кислота.

Количество активного ингредиента, которое может быть объединено с материалом носителя для получения единичной дозированной формы, будет варьировать в зависимости от хозяина, поддающегося лечению, и конкретного режима введения. Например, состав с замедленным высвобождением, предназначенный для перорального введения людям, может содержать 20-2000 мкмоль (примерно 10-1000 мг) активного ингредиента и соответствующего материала носителя который может варьировать от прибли- 6 030709

зительно 5 до приблизительно 95% от общей композиции. Предпочтительно, чтобы была получена фармацевтическая композиция, которая обеспечивает легко измеряемые количества для введения. Например, водный раствор, предназначенный для внутривенной инфузии, должен содержать от приблизительно 0,05 до приблизительно 50 мкмоль (примерно 0,025-25 мг) активного ингредиента на миллилитр раствора для того, чтобы была возможность инфузии подходящего объема со скоростью приблизительно 30 мл/час.

Как указано выше, препарат для перорального применения может быть представлен в виде отдельных единиц, таких как капсулы, крахмальных капсул или таблеток, при этом каждая из них содержит предварительно определенное количество активного ингредиента; в виде порошка или гранул; в виде раствора или суспензии в водной или неводной жидкости; или в виде жидкой эмульсии типа "масло в воде" или в виде жидкой эмульсии типа "вода в масле". Активный ингредиент также можно вводить в виде болюсной инъекции, электуария или пасты.

Таблетка может быть изготовлена путем прессования или формования, необязательно с одним или более вспомогательными ингредиентами. Прессованные таблетки могут быть получены путем прессования в подходящем аппарате активного ингредиента в свободно текучей форме, такой как порошок или гранулы, необязательно смешанного со связывающим средством (например, повидоном, желатином, гидроксипропилметилцеллюлозой), смазывающим средством, инертным разбавителем, консервантом, разрыхлителем (например, натриевой солью гликолята крахмала, сшитым повидоном, сшитой карбоксиметилцеллюлозой натрия) поверхностно-активным или диспергирующим средством. Формованные таблетки могут быть изготовлены путем формования в подходящем аппарате смеси порошкообразного соединения, смоченного инертным жидким разбавителем. Таблетки необязательно могут быть покрыты или отмечены при получении с целью обеспечения медленного или контролируемого высвобождения активного ингредиента в нем с использованием, например, гидроксипропилметилцеллюлозы в варьирующих пропорциях с обеспечением необходимого профиля высвобождения. Таблетки могут необязательно быть представлены с энтеросолюбильным покрытием с обеспечением высвобождения в отделах кишечника, отличных от желудка. Это особенно важно для соединений формулы I, если такие соединения подвержены кислотному гидролизу.

Составы, подходящие для местного введения в ротовую полость включают пастилку, содержащую активный ингредиент в ароматизированной основе, обычно в сахарозе, аравийской камеди или трагакантовой камеди; пастилки, содержащие активный ингредиент в инертной основе, такой как желатин, глицерин, сахароза и аравийская камедь; и ополаскиватели для ротовой полости, содержащие активный ингредиент в подходящем жидком носителе.

Составы для ректального введения могут быть представлены в виде суппозитория, содержащего активное соединение в подходящей основе, содержащей масло какао или салицилат.

В составы, подходящие для вагинального введения, может быть добавлен активный ингредиент и известные подходящие носители в пессариях, тампонах, кремах, гелях, пастах, пенах или составе для распыления.

Составы, подходящие для парентерального введения, включают водные и неводные изотонические стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические средства и растворенные вещества, которые делают состав изотоническим относительно крови предполагаемого реципиента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие средства и загустители. Составы могут быть представлены в герметичных контейнерах с единичной дозой или несколькими дозами, например, в ампулах и флаконах, и могут храниться в высушенном сублимацией (лиофилизированном) состоянии, требуя только добавления стерильного жидкого носителя, например, воды для инъекций, непосредственно перед применением. Растворы и суспензии для инъекций могут быть получены из вида стерильных порошков, гранул и таблеток, описанного ранее.

Составы, подходящие для парентерального введения, можно вводить посредством способа непрерывной инфузии с помощью постоянно пребывающего насоса или с помощью инфузионного пакета. Инфузии можно осуществлять посредством катетера Хикмана или PICC или любого другого средства, подходящего для парентерального и i.v. введения.

Предпочтительные составы единичной дозы содержат суточную дозу или единицу, каждую дозу и суточную частоту.

Следует понимать, однако, что конкретный уровень дозы для любого определенного пациента будет зависеть от различных факторов, в том числе активности конкретного используемого соединения; возраста, веса тела, общего состояния здоровья, пола и режима питания индивида, подвергающегося лечению; времени и способа введения; скорости выведения; других лекарственных средств, которые были введены ранее; и тяжести определенного заболевания, подвергающегося лечению, что хорошо известно специалистам в данной области техники.

Синтез соединений формулы I и формулы II.

Соединения по настоящему изобретению могут быть получены посредством способов, описанных в следующих обсуждениях, а также соответствующих процедур, описанных в литературе, которые применяются специалистами в данной области техники. Следует понимать, что следующие обсуждения пред- 7 030709

ставлены исключительно с целью иллюстрации и не ограничивают настоящее изобретение, которое определено формулой изобретения. Как правило, синтез соединения формулы I включает следующие пять общих стадий (приведенных в обратном порядке): (1) получение пролекарства; (2) снятие защитных групп сложного фосфонатного эфира; (3) модификации присутствующего хинолина; (4) конструкция хинолина; и (5) получение ключевого предшественника. Соединения формулы II можно синтезировать с помощью соединений формулы I, вступающих в реакцию с подходящими группами. Защита и снятие защитных групп в схемах может осуществляться в соответствии с процедурами, в целом известными в данной области (например, "Protecting Groups in Organic Synthesis," 3rd Edition, Wiley, 1999).

Все стереоизомеры соединений по настоящему изобретению рассматриваются либо в смеси, либо в чистой или по сути чистой форме. Соединения по настоящему изобретению могут иметь стереогенные центры на атоме фосфора и на любом из атомов углерода, включая любые заместители R. Следовательно, соединения формулы I могут существовать в энантиомерной или диастереомерной формах или в их смесях. В способах получения в качестве исходных материалов могут применяться рацематы, энантиомеры или диастереомеры. Если получают энантиомерные или диастереомерные продукты, их можно разделить посредством обычных способов. Например, для разделения диастереомерных смесей можно использовать хроматографию или фракционную кристаллизацию, тогда как производные энантиомерных изомеров могут быть разделены посредством хроматографии.

1) Получение пролекарства.

Пролекарства можно вводить на разных стадиях синтеза. Чаще всего данные пролекарства вводят на поздней стадии синтеза в связи с неустойчивостью различных пролекарств, тогда как пролекарства также можно вводить на ранней стадии синтеза в связи с другими соображениями.

Соединения формулы I могут представлять собой фосфоновые кислоты, в которых как R¹, так и R² представляют собой Н, а также могут быть в соответствующим образом защищенной форме. Фосфоновые кислоты могут быть алкилированы с помощью электрофилов, таких как алкилгалогениды и алкилсульфонаты в условиях нуклеофильного замещения с получением сложных фосфонатных эфиров. Например, соединения формулы I, где R¹ и R² представляют собой ацилоксиалкильные группы, могут быть получены путем прямого алкилирования соединений формулы I, где как R¹, так и R² представляют собой Н с соответствующим ацилоксиалкилгалогенидом (например, Cl, Br, I; Phosphorus Sulfur 1990, 54, 143; Synthesis 1988, 62) в присутствии подходящего основания (например, пиридина, TEA, диизопропилэтиламина) в подходящих растворителях, таких как DMF (J. Med. Chem. 1994, 37, 1875). Карбоксилатный компонент данных ацилоксиалкильных галогенидов включает без ограничения ацетат, пропионат, изобутират, пивалат, бензоат, карбонат и другие карбоксилаты.

Реакционноспособные дихлорфосфонаты могут быть образованы из соответствующих фосфоновых кислот с хлорирующим средством (например, тионилхлоридом, J. Med. Chem. 1994, 1857; оксалилхлоридом, Tetrahedron Lett. 1990, 31, 3261; пентахлоридом фосфора, Synthesis 1974, 490). В качестве альтернативы, дихлорфосфонат может быть образован из его соответствующих дисилилфосфонатных сложных эфиров (Synth. Commun. 1987, 17, 1071) и диалкилфосфонатных сложных эфиров (Tetrahedron Lett. 1983, 24, 4405; Bull. Soc. Chim. 1993, 130, 485).

Циклические фосфонатные сложные эфиры замещенных 1,3-пропандиолов могут быть синтезированы посредством либо реакций соответствующего дихлорфосфоната с замещенным 1,3-пропандиолом, либо реакций сочетания с использованием подходящих связующих реагентов (например, DCC, EDCI, РуВОР; Synthesis 1988, 62).

В качестве альтернативы, данные циклические фосфонатные сложные эфиры замещенных 1,3пропандиолов получают из фосфоновых кислот путем связывания диолов в условиях реакции Мицунобу (Synthesis 1 (1981); J. Org. Chem. 52:6331 (1992)), и других кислотных связующих реагентов, включая без ограничения карбодиимиды (Collect. Czech. Chem. Commun. 59:1853 (1994); Bioorg. Med. Chem. Lett. 2:145 (1992); Tetrahedron Lett. 29:1189 (1988)), и РуВОР (Tetrahedron Lett. 34, 6743 (1993)).

Один аспект настоящего изобретения обеспечивает способы синтезирования и выделения отдельных изомеров пролекарств фосфоновых кислот формулы I. Поскольку фосфор представляет собой стереогенный атом, образование пролекарства с рацемическим замещенным 1,3-пропан-диолом будет обеспечивать смесь изомеров. Например, образование пролекарства с рацемическим 1-(У)-замещенным 1,3пропандиолом обеспечивает рацемическую смесь цис-пролекарств и рацемическую смесь транспролекарств. В другом аспекте применение обогащенного энантиомерами замещенного 1,3-пропандиола с R-конфигурапией обеспечивает обогащенные энантиомерами R-цис- и R-транс-пролекарства. Данные соединения могут быть разделены посредством комбинации колоночной хроматографии и/или фракционной кристаллизации.

Другая группа пролекарств может быть введена для обеспечения ожидаемых свойств. Соединения формулы I (Х=ОН) можно объединять с различными защитными группами на атоме О или атоме N гидроксипиридинового кольца. Например, соединения формулы I (R³ представляет собой карбоксильную группу) могут быть получены из соединения формулы I (R³ представляет собой Н) с соответствующим карбоксилгалогенидом в подходящих условиях реакции (J. Org. Chem. 1989, 54, 166); соединения формулы I (Х представляет собой Cl) могут быть образованы из соединения формулы I (Х представляет собой

- 8 030709

ОН) с различными хлорирующими реагентами (например, POCl₃, J. Org. Chem. 1950, 15, 1224; CCl₃CN, Tetrahedron Lett. 2012, 53, 674) в соответствующих условиях.

2) Снятие защитных групп фосфонатного сложного эфира.

Соединения формулы I, где R¹ представляет собой Н, могут быть получены из фосфонатных сложных эфиров с использованием известных условий расщепления фосфатного и фосфонатного сложного эфира. Силилгалогениды обычно применяют для расщепления различных фосфонатных сложных эфиров и последующий мягкий гидролиз полученных в результате силилфосфонатных сложных эфиров обеспечивает необходимые фосфоновые кислоты. При необходимости, кислотные акцепторы (например, 1,1,1,3,3,3-гексаметилдисилазан, 2,6-лутидин) можно применять для синтеза кислотно-неустойчивых соединений. Такие силилгалогениды включают хлортриметилсилан J. Org. Chem., 1963, 28: 2975), и бромтриметилсилан (Tetrahedron Lett., 1977, 155), и йодтриметилсилан (J. Chem. Soc., Chem. Commun., 1978, 870). В качестве альтернативы, фосфонатные сложные эфиры могут расщепляться в сильно кислотных условиях (например, HBr или HCl, Moffatt, et al., U.S. Patent 3,524,846, 1970). Данные сложные эфиры также могут расщепляться посредством дихлорфосфонатов, полученных путем обработки сложных эфиров галогенирующими средствами (например, пентахлоридом фосфора, тионилхлоридом, BBr3, Pelchowicz et al., J. Chem. Soc., 1961, 238) с последующим водным гидролизом с получением фосфоновых кислот. Арильные и бензильные фосфонатные сложные эфиры могут расщепляться в условиях гидрогенолиза (Lejczak, et al., Synthesis, 1982, 412; Elliott, et al., J. Med. Chem., 1985, 28: 1208; Baddiley, et al., Nature, 1953, 171: 76) или в условиях восстановления металла (Shafer, et al., J. Am. Chem. Soc, 1977, 99: 5118). Электрохимические условия (Shono, et al., J. Org. Chem., 1979, 44: 4508) и условия пиролиза (Gupta, et al., Synth. Commun., 1980, 10: 299) также применялись для расщепления различных фосфонатных сложных эфиров.

(3) Синтез содержащих фосфор фенантролинов.

Конструкцию фенантролинового ядра можно осуществлять с использование общепризнанных описанных в литературе способов. Например, принцип термической кристаллизации проиллюстрирован в следующей схеме.

9

Обработка ариламина 1 3-нитробензолсульфонатом натрия, серной кислотой и глицерином обеспечивала хинолин 2. Бромирование хинолина 2 с использованием NBS в уксусной кислоте обеспечивало соединение 3, которое восстанавливали с использованием железа с получением соединения 4. Фосфонилирование соединения 4 обеспечивало фосфонат 5, который обрабатывали соединением 17, а затем посредством реакции термической кристаллизации с получением фенантролина 7, где R представляет собой Н (соединения формулы I, где X представляет собой ОН, R¹⁼R²=Et). Обработка соединения 7 гидроксидом натрия обеспечивала соединение 8, где R представляет собой Н (соединения формулы I, где X представляет собой ОН, Е'=Н, R²=Et); с другой стороны, обработка соединения 7 с помощью 48% HBr обеспечивала соединение 9, где R представляет собой Н (соединения формулы I, где X представляет собой ОН, R^x=R²=K). В некоторых случаях необходимые заместители не совместимы с последующими ре- 9 030709

акциями и, следовательно, предусмотрены модификации присутствующего фенантролина с использованием обычных химических способов (Larock, Comprehensive organic transformations, VCH, New York, 1989; Trost, Comprehensive organic synthesis; Pergamon press, New York, 1991).

Пролекарства зачастую вводят на поздней стадии синтеза, тогда как некоторые пролекарства также можно вводить на ранней стадии синтеза в связи с другими соображениями. Например, пролекарства на основе циклического фосфонатного сложного диэфира можно получать, как проиллюстрировано в следующей схеме.

Фосфонилирование соединения 3 обеспечивало фосфонат 10, который освобождали от защитной группы с использованием 48% HBr с получением фосфоновой кислоты 11. Обработка соединения 11 с помощью POCl₃ обеспечивала реакционноспособные дихлорфосфонаты 12, которые сразу связывали с диолом 20 (J. Am. Chem. Soc. 2004, 5154) с получением соединения 13. Восстановление нитро-группы в соединении 13 с последующей реакцией с соединением 17, а затем термическим замыканием кольца с получением фенантролина 16, где R представляет собой Н (соединения формулы I, где X представляет собой ОН, R¹ и R² вместе образуют циклическую группу).

Другая группа пролекарств может быть введена для обеспечения ожидаемых свойств. Например, соединение 16с вступает в реакцию с хлорфосфатом при наличии подходящего основания (например, Et₃N) и катализатора (например, 4-диметиламинопиридина) в подходящем растворителе (например, CH₂Cl₂) с получением фосфата 21. Снятие защитной группы диэтилфосфата можно осуществлять при использовании обычного реагента снятия защитной группы фосфата. Например, снятие защитной группы фосфата 21 с помощью триметилсилилбромида обеспечивало фосфорную кислоту 22, которая может быть преобразована в необходимую соль. Например, соединение 22, смешанное с бикарбонатом натрия в воде и метаноле, может обеспечивать динатриевую соль 23.

В другом примере другие типы пролекарств могут быть образованы для различных ожидаемых свойств. Например, ди-трет-бутилхлорметилфосфат вступал в реакцию с фенантролином 16с в присутст- 10 030709

вии подходящего основания (например, К₂СО₃) в подходящем растворителе (например, DMSO) с получением фосфатного сложного эфира 24 и 25. Обычный реагент снятия защитной группы трет-бутила можно применять для удаления ди-трет-бутильных групп. Например, снятие защитной группы 24 и 25 с помощью трифторуксусной кислоты в дихлорметане обеспечивало фосфорную кислоту 26 и 27, соответственно.

Соединение 26 и 27 может быть дополнительно преобразовано в необходимые соли.

Примеры

Соединения, применяемые в настоящем изобретении, и их получение будут более понятны с помощью примеров. Данные примеры, однако, не должны рассматриваться как конкретно ограничивающие настоящее изобретение, и считается, что вариации соединений, известные на данный момент или разработанные позже, входят в объем настоящего изобретения, как заявляется далее в данном документе.

Пример 1. Синтез соединений.

Получение 8-нитрохинолина (2с).

no₂

2с

Получали смесь, в которую добавляли 47 г H₂SO₄, 20 мл Н₂О, 23,4 г (0,104 моль) 3нитробензолсульфоната натрия и 22 мл глицерина в таком порядке. Ее аккуратно нагревали до образования раствора и добавляли частями 11 г 2-нитроанилина 1с (0,08 моль). Смесь нагревали с обратным холодильником в течение 5 ч. После охлаждения до комнатной температуры смесь выливали в 600 мл Н2О на ледяной бане, регулировали до рН 6-7 с помощью водного раствора аммиака и фильтровали с помощью всасывающего фильтра. Осадок высушивали и очищали посредством хроматографии (ЕА:РЕ=1: 5). Желтое твердое вещество 2с 6,177 г получали в 44%.

¹Н ЯМР (300 МГц, CDC1з) δ 9,09 (dd, J=1,8 Гц, 4,5 Гц, 1H), 8,28 (dd, J=1,8 Гц, 8,4 Гц, 1H), 8,05 (d, J=9 Гц, 2Н), 7,66-7,55 (m, 2Н).

8-Нитрохинолин 2с 6,177 г (35,5 ммоль) добавляли к 110 мл уксусной кислоты, а затем добавляли 6,651 г NBS (35,5 ммоль). Смесь вступала в реакцию при 50°С в течение 2 ч. Реакционную смесь охлаждали и выливали в 600 мл Н2О, фильтровали с помощью всасывающего фильтра. Осадок высушивали и очищали посредством хроматографии (ЕА:РЕ=1:15) с получением желтого твердого вещества 3с 2,625 г в 29%.

'H ЯМР (300 МГц, CDC1з) δ 9,06 (d, J=2,1 Гц, 1Н), 8,44 (d, J=2,4 Гц, 1Н), 8,06 (d, J=7,5 Гц, 1Н), 7,98 (d, J=8,1 Гц, 1H), 7,67 (t, J=7,8 Гц, 1Н).

Получение 3-бромхинолин-8-амина (4с).

Соединение 3с (13,0 г, 51,6 ммоль) добавляли к EtOH (150 мл), а затем добавляли порошок железа (11,6 г, 206,4 ммоль), NH₄Q (11,0 г, 206,4 ммоль). Полученную в результате смесь нагревали с обратным холодильником в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали и фильтровали через целит. Фильтрат

- 11 030709

выпаривали до сухости и очищали посредством хроматографии (ЕА:РЕ=1:5). Желтое твердое вещество 4с 8,23 г получали в 72%.

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 8,72 (d, J=2,1 Гц 1H), 8,21 (d, J=2,1 Гц, 1H), 7,35 (t, J=7,8 Гц, 1H), 7,05 (dd, J=1,2 Гц, 8,1 Гц, 1H), 7,61 (dd, J=1,2 Гц, 7,5 Гц, 1H), 4,98 (s, 2H).

Получение фосфоната диэтил-8-аминохинолин-3-ила (5 с).

Соединение 4с (4,0 г, 17,9 ммоль) добавляли к EtOH (53 мл) в атмосфере N₂, a затем добавляли HPO(OEt)₂ (3,0 мл, 23,3 ммоль), TEA (3,7 мл, 26,9 ммоль), Ph₃P (1,27 г, 4,8 ммоль) и Pd(OAc)₂ (0,8 г, 3,58 ммоль). Полученную в результате смесь нагревали с обратным холодильником в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и заполняли с помощью Н₂О (100 мл), экстрагировали с помощью ЕА. Органические слои объединяли, промывали солевым раствором, высушивали над безводным Na₂SO₄, концентрировали и очищали посредством хроматографии (ЕА:РЕ=1:1). Желтое масло 5с 1,4 г получали в 25%.

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl3) δ 8,98 (dd, J=1,8 Гц, 4,2 Гц, 1H), 8,59 (dd, J=2,1 Гц, 15,3 Гц, 1H), 7,38 (d, J=7,8 Гц, 1H), 7,21 (d, J=7,5 Гц, 1H), 7,01 (t, J=7,5 Гц, 1H), 4,20-4,07 (m, 4Н), 1,35 (t, J=6,9 Гц, 6Н).

Получение фосфоната диэтил-8-((2,2-диметил-4,6-диоксо-1,3-диоксан-5-илиден)метиламино)хинолин-3-ила (6с).

Соединение 5с (1,4 г, 5 ммоль) добавляли к EtOH (40 мл) в атмосфере N₂, а затем добавляли соединение 17. Реакционную смесь нагревали с обратным холодильником в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, выпаривали растворитель и очищали посредством хроматографии (ЕА:РЕ=1:1). Желтое твердое вещество 6с 1,125 г получали в 52%.

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 12,8 (d, J=15 Гц, 1H), 9,20 (dd, J=1,8 Гц, 4,2 Гц, 1H), 8,91 (d, J=14,7 Гц, 1H), 8,74 (dd, J=1,8 Гц, 15,3 Гц 1H), 7,80-7,76 (m, 2H), 7,67 (t, J=7,8 Гц, 1H), 4,30-4,09 (m, 4Н), 1,81 (s, 6Н), 1,35 (t, J=6,9 Гц, 6Н).

Получение фосфоната диэтил-7-гидрокси-1,10-фенантролин-3-ила (7с).

Дифениловый эфир нагревали до кипения, быстро добавляли соединение 6с (1,1 г, 2,5 ммоль). Полученную в результате смесь перемешивали в течение 2 мин. При температуре флегмы. Смесь охлаждали до 100°C, выливали в РЕ (640 мл) при перемешивании, фильтровали с помощью всасывающего фильтра. Осадок очищали посредством хроматографии (МеОН: DCM, J=1:20). Желтое твердое вещество 7с 650 мг получали в 77%.

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 10,8 (s, 1H), 9,31 (dd, J=1,8 Гц, 5,1 Гц, 1H), 8,72 (dd, J=1,8 Гц, 14,7 Гц, 1H), 8,49 (d, J=8,7 Гц, 1H), 7,94 (d, J=7,5 Гц, 1H), 7,71 (d, J=9 Гц, 1H), 6,62 (d, J=7,5 Гц, 1H), 4,35-4,14 (m, 4Н), 1,39 (t, J=6,9 Гц, 6Н).

Получение 7-гидрокси-1,10-фенантролин-3-илфосфоновой кислоты (9с).

Соединение 7с (650 мг) добавляли к 48% водн. HBr. Полученную в результате смесь нагревали с обратным холодильником в течение ночи. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, выпаривали растворитель, перемешивали с небольшим количеством воды, фильтровали с помощью всасывающего фильтра и высушивали. Серое твердое вещество 9с 513 мг получали в 95%.

¹H ЯМР (300 МГц, D₂O) δ 8,99 (dd, J=4,5 Гц, 1,8 Гц, 1H), 8,30 (dd, J=12,6 Гц, 1,8 Гц, 1H), 7,62 (d,

- 12 030709

J=6,9 Гц, 1H), 740 (d, J=8,7 Гц, 1H), 7,26 (d, J=8,7 Гц, 1H), 6,19 (d, J=7,2 Гц, 1H). Получение фосфоната диэтил-8-нитрохинолин-3-ила (10c).

Соединение 3c (30 г), KOAc (23,4 г), HPO(OEt)₂ (18,4 мл), толуол (300 мл) и Pd(dppf)₂Cl₂-CH₂Cl₂ (1 г) последовательно добавляли в колбу в атмосфере N₂. Полученную в результате смесь нагревали с обратным холодильником в течение 3 ч, разводили EtOAc, фильтровали через силикагель и концентрировали с получением 10с 46 г.

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 9,28 (dd, J=1,8 Гц, 4,2 Гц, 1H), 8,82 (dd, J=1,8 Гц, 15 Гц, 1H), 8,16 (t, J=6 Гц, 2Н), 7,21 (d, J=7,5 Гц, 1H), 7,74 (t, J=8,1 Гц, 1H), 4,33-4,11 (m, 4Н), 1,37 (t, J=6,9 Гц, 6Н).

Получение 8-нитрохинолин-3-илфосфоновой кислоты (11с).

Соединение 10с (44,5 г) добавляли к 48% водн. HBr (230 мл). Полученную в результате смесь нагревали с обратным холодильником в течение 4 часов. Смесь охлаждали, выпаривали до сухости. Твердое вещество промывали с помощью EtOH/EtOAc в течение 2 часов и фильтровали с помощью всасывающего фильтра. Получали 31,5 г желтого твердого вещества 11с.

¹H ЯМР (300 МГц, D₂O) δ 9,18 (dd, J=1,8 Гц, 6 Гц, 1H), 8,98 (dd, J=1,8 Гц, 13,2 Гц, 1H), 8,54 (d, J=7,8 Гц, 1H), 8,36 (d, J=8,4 Гц, 1H), 7,81 (t, J=7,8 Гц, 1H).

Получение 8-нитрохинолин-3-илфосфинового дихлорида (12с).

Соединение 11с (50,3 г) добавляли к дихлорэтану (650 мл), а затем добавляли DMF (3,6 мл). Затем по капле добавляли (COCl)₂ (42 мл) на ледяной бане. После завершения добавления полученную в результате смесь нагревали с обратным холодильником в течение ночи. Смесь охлаждали и выпаривали до сухости с получением 12с, которое сразу применяли в последующей реакции.

Получение (48)-4-(3-хлорфенил)-2-(8-нитрохинолин-3-ил)-1,3,2-диоксафосфинан-2-она (13c).

(8)-1-(3-хлорфенил)пропан-1,3-диол (36,95 г) 20 добавляли к CH₂Cl₂ (540 мл). Затем по капле добавляли TiCl₄ (22 мл) при -78°C. Смесь перемешивали в течение 5 мин, а затем перемешивали в течение 5 мин на ледяной бане. К смеси добавляли TEA (110 мл). Полученную в результате смесь по капле добавляли к раствору соединения 12с в дихлорметане. После завершения добавления обеспечивали реакцию полученной в результате смеси при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную смесь разводили CH₂Cl₂ (700 мл), заполняли с помощью 10% виннокаменной кислоты (210 мл) и перемешивали в течение 2 мин. Смесь фильтровали через целит, экстрагировали с помощью CH₂Cl₂. Органический слой высушивали над Na₂SO₄ и удаляли растворитель. Остаток перекристаллизовывали дважды из CH₃CN. Желтое твердое вещество 13с 35,5 г получали в 44%. Масса/заряд: 405,1 [М+1];

Получение (4S)-4-(3-хлорфенил)-2-(8-аминохинолин-3-ил)-1,3,2-диоксафосфинан-2-она (14с).

Соединение 13с (62,9 г) добавляли к EtOH (160 мл) и АсОН (160 мл). Затем добавляли Fe (43,6 г). Обеспечивали реакцию полученной в результате смеси при 40°C в течение 10 мин, охлаждали, регулиро- 13 030709

вали до рН 6 с помощью насыщ. раствора NaHCO₃, экстрагировали с помощью CH₂Cl₂. Органический слой высушивали над Na₂SO₄ и выпаривали. Желтое твердое вещество 14с 50 г получали в 86%. Масса/заряд: 375,0 [М+1].

Получение ^)-4-(3-хлорфенил)-2-(8-((2,2-диметил-1,3-диоксан-4,6-дион)-5-метилен)амино хинолин-3 -ил)-1,3,2-диоксафосфинан-2-она (15с).

Соединение 14с (49 г) добавляли к EtOH (320 мл), затем добавляли 5-(этоксиметилен)-2,2-диметил1,3-диоксан-4,6-дион 17 (31,4 г). Полученную в результате смесь нагревали с обратным холодильником в течение 2 ч, охлаждали и фильтровали с помощью всасывающего фильтра. Желтое твердое вещество 15с 60 г получали в 87%. Масса/заряд: 529,0 [М+1], найденное значение 471,0.

Получение ^)-4-(3-хлорфенил)-2-(7-гидрокси-1,10-фенантролин-3-ил)-1,3,2-диоксафосфинан-2она (16с).

Дифениловый эфир нагревали до кипения, быстро добавляли соединение 15с (3 г). Полученную в результате смесь нагревали с обратным холодильником в течение 50 с. Смесь охлаждали до 100°C, выливали в петролейный эфир и фильтровали с помощью всасывающего фильтра. Осадок очищали посредством хроматографии (DCM:MeOH=30:1). Желтое твердое вещество 16с 1,676 г получали в 70%.

¹H ЯМР (300 МГц, DMSO) δ 12,53 (s, 1H), 9,34 (dd, J=2,1 Гц, 5,1 Гц, 1H), 9,15 (dd, J=1,8 Гц, 15,3 Гц, 1H), 8,27 (d, J=8,7 Гц, 1H), 8,12-7,98 (m, 2H), 7,56 (s, 1H), 7,47-7,43 (m, 3H), 6,36 (d, J=7,2 Гц, 1H), 5,96 (d, J=11,1 Гц, 1H), 4,88-4,76 (m, 1H), 4,65-4,55 (m, 1H), 2,68-2,54 (m, 1H), 2,34-2,22 (m, 1H).

Получение метил-3-(3-хлорфенил)-3-оксопропаноата (18).

о

ci

.COOCH3

18

трет-Бутоксид калия (15 г) добавляли к THF (50 мл) в атмосфере азота. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 15 мин. 1-(3-Хлорфенил)этанон (10 г) и диметилкарбонат (11 мл) медленно добавляли в колбу на водяной бане. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1,5 часов. Реакционную смесь заполняли водой (40 мл) и концентрированной хлористоводородной кислотой (1,3 мл) и перемешивали в течение 15 мин.

Органические слои разделяли и водную фазу снова экстрагировали толуолом. Объединенные органические экстракты промывали насыщенным солевым раствором, высушивали с помощью NaSO4, фильтровали и выпаривали до сухости. Коричневое масло 18 13,22 г получали в 96%.

Получение ^)-метил-3-(3-хлорфенил)-3-гидроксипропаноата (19).

он

01 х^ЛхСООСНз

19

Триэтиламин (5,38 г) по капле медленно добавляли к муравьиной кислоте (9,8 г) в атмосфере азота на ледяной бане. После завершения добавления смесь перемешивали в течение 20 мин, а затем обеспечивали реакцию при комнатной температуре в течение 1 ч. Соединение 18 (11,3 г), DMF (45 мл) и (S,S)-TsDPEN-Ru-Cl-(пара-цимен) (68 мг) добавляли в колбу. Обеспечивали реакцию полученной в результате смеси при 60°C в течение ночи, охлаждали до комнатной температуры, заполняли водой (100 мл), экстрагировали с помощью ЕА. Органический слой промывали с помощью солевого раствора, высушивали над безводным Na2SO4, фильтровали, выпаривали до сухости и очищали посредством хроматографии (ЕА:РЕ=1:10). Гиацинтовое масло 10,434 г получали в 91%.

¹H ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 7,45 (s, 1H), 7,37-7,27 (m, 3H), 5,16 (t, J=6,9 Гц, 1H), 3,78 (s, 3H), 2,78 (d, J=1,8 Гц, 1H), 2,76 (s, 1H).

- 14 030709

Получение (^)-1-(3-хлорфенил)пропан-1,3-диола (20).

он

20

Боргидрид натрия (1,84 г) и воду (0,62 мл) добавляли к 1-бутанолу (37,5 мл), а затем по капле добавляли раствор соединения 19 (10,4 г) в 1-бутаноле (3,8 мл) на ледяной бане. После завершения добавления смесь перемешивали в течение 0,5 ч и обеспечивали реакцию при 90°C в течение 4 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, заполняли водным раствором карбоната калия (10%, 23 мл) и перемешивали в течение 10 мин. Органические слои разделяли, промывали водным раствором карбоната калия (10 вес/об. %, 8 мл) и солевым раствором (8 мл), высушивали над безводным Na₂SO₄, фильтровали, выпаривали до сухости и очищали посредством хроматографии (DCM:CH₃OH=30:1). Желтое масло 20 7,75 г получали в 85,5%.

^JH ЯМР (300 МГц, CDCl₃) δ 7,36 (s, 1H), 7,30-7,20 (m, 3H), 4,92 (q, J=4,5 Гц, 7,8 Гц, 1H), 3,90-3,79 (m, 2Н), 2,82 (s, 2Н), 2,03-1,85 (m, 2Н).

Получение 3-(4-4-(3-хлорфенил)-1,3,2-диоксафосфинан-2-он-2-ил)-1,10-фенантролин-7-ил фосфорной кислоты (22).

Соединение 16с (2 г) растворяли в дихлорметане (100 мл). Триэтиламин (2 мл) и 4диметиламинопиридин (57 мг) добавляли к реакционной смеси. Реакционную смесь помещали на ледяную баню. Диэтилхлорфосфат (2 мл) в дихлорметане (20 мл) по капле медленно добавляли к реакционной смеси. Обеспечивали возможность реакции смеси в течение одного часа на ледяной бане, а затем 2 часов при комнатной температуре. Реакционную смесь выливали в насыщенный солевой раствор (200 мл). Органический слой разделяли и водный слой экстрагировали с помощью дихлорметана. Органические слои объединяли, высушивали над безводным сульфатом натрия, выпаривали в роторном испарителе до сухости и очищали посредством хроматографии (DCM: СН₃ОН=100:1) с получением 21 1,7 г. 21 (1,7 г) растворяли в DCM (2 мл). Триметилсилилбромид (4 мл) добавляли за один раз к смеси на ледяной бане. После реакции в течение 1 ч на ледяной бане к реакционной смеси добавляли диэтиловый эфир (50 мл). Полученную в результате смесь фильтровали. Осадок собирали, растворяли в метаноле (20 мл), и перемешивали в течение 10 мин. Реакционную смесь выпаривали в роторном испарителе до сухости и очищали посредством хроматографии (DCM:CH₃OH:CH₃COOH=20:1:0.05 ~DCM:CH₃OH=4:1). Белое твердое вещество 22 600 мг получали с выходом 25%.

Масса/заряд: 507,0 [М+1];

^JH ЯМР (300 МГц, DMSO) δ 13,84 (m, 1H), 9,27 (dd, J=4,8, 1,8 Гц, 1H), 8,99 (dd, J=14,3, 1,8 Гц, 1H), 8,39 (d, J=7,1 Гц, 1H), 8,30 (d, J=8,9 Гц, 1H), 8,13 (d, J=9,0 Гц, 1H), 7,50 (s, 1H), 7,45-7,38 (m, 1H), 7,35-7,25 (m, 2H), 6,85 (d, J=7,1 Гц, 1H), 5,35 (dd, J=9,0, 5,9 Гц, 1H), 4,11-3,98 (m, 2H), 2,68-2,55 (m, 1H), 2,50-2,34 (m, 1H).

Получение динатрия 3-^-4-(3-хлорфенил)-1,3,2-диоксафосфинан-2-он-2-ил)-1,10-фенантролин-7ила фосфата (23).

Соединение 22 (500 мг) суспендировали в метаноле (10 мл), к смеси медленно добавляли 1 н. раствор NaHCO₃ (2 мл) при комнатной температуре. Обеспечивали перемешивание реакционной смеси в течение 20 мин и выпаривали до сухости. Белое твердое вещество 23 540 мг получали с выходом 100%.

Масса/заряд:550,0 [М+1], найденное значение 507;

^JH ЯМР (300 МГц, DMSO) δ 9,27 (dd, J=4,8, 1,8 Гц, 1H), 8,99 (dd, J=14,3, 1,8 Гц, 1H), 8,39 (d, J=7,1 Гц, 1H), 8,30 (d, J=8,9 Гц, 1H), 8,13 (d, J=9,0 Гц, 1H), 7,50 (s, 1H), 7,45-7,38 (m, 1H), 7,35-7,25 (m, 2Н), 6,85 (d, J=7,1 Гц, 1H), 5,35 (dd, J=9,0, 5,9 Гц, 1H), 4,11-3,98 (m, 2Н), 2,68-2,55 (m, 1H), 2,50-2,34 (m, 1H).

Получение ди-трет-бутил-(3-(4S-4-(3-хлорфенил)-1,3,2-диоксафосфинан-2-он-2-ил)-1,10фенантролин-7-окси)-7-метилфосфата (24) и ди-трет-бутил-(3-^-4-(3-хлорфенил)-1,3,2диоксафосфинан-2-он-2-ил)-1,10-фенантролин-7-он)-10(7Н)-метилфосфата (25).

- 15 030709

Соединение 16с (200 мг, 0,47 ммоль) растворяли в DMSO (2 мл). К реакционной смеси добавляли карбонат калия (195 мг, 1,41 ммоль). Полученную в результате смесь перемешивали в течение 15 мин при 30°C. Ди-трет-бутилхлорметилфосфат (146 мг, 0,56 ммоль) добавляли к реакционной смеси и обеспечивали реакцию полученной в результате смеси при 30°C в течение ночи. Реакционную смесь выливали в насыщенный солевой раствор (20 мл). Органический слой разделяли и водный слой экстрагировали с помощью дихлорметана. Органические слои объединяли, высушивали над сульфатом натрия, выпаривали с помощью роторного испарителя до сухости и очищали посредством хроматографии (ЕА) с получением промежуточного соединения 24 и 25.

Масса/заряд: 649,2 [М+1].

Соединение 24:

¹H ЯМР (300 МГц, DMSO) δ 9,48 (dd, J=4,9, 1,9 Гц, 1H), 9,14 (dd, J=15,4, 1,9 Гц, 1H), 9,10 (d, J=5,3 Гц, 1H), 8,31 (d, J=9,1 Гц, 1H), 7,63-7,58 (m, 2H), 7,55-7,41 (m, 3H), 6,11-5,91 (m, 3H), 4,92-4,75 (m, 1H), 4,71-4,53 (m, 1H), 2,73-2,55 (m, 1H), 2,36-2,19 (m, 1H), 1,37 (s, 18H).

¹³C ЯМР (75 МГц, DMSO) δ 158,59, 151,37, 150,71, 150,54, 147,15, 146,18, 142,12, 142,01, 141,71, 133,29, 130,57, 128,41, 126,26, 125,79, 124,59, 121,53, 120,83, 106,97, 87,59, 82,98, 77,56, 66,24, 33,30, 29,38.

Соединение 25:

¹H ЯМР (300 МГц, DMSO) δ 9,39 (dd, J=4,6, 2,1 Гц, 1H), 9,19 (dd, J=15,6, 2,0 Гц, 1H), 8,43 (d, J=8,7 Гц, 1H), 8,22 (d, J=8,1 Гц, 1H), 8,18 (d, J=8,4 Гц, 1H), 7,58 (s, 1H), 7,50-7,44 (m, 3H), 7,18-6,99 (m, 2Н), 6,49 (d, J=7,9 Гц, 1H), 5,98 (d, J=11,2 Гц, 1H), 4,93-4,72 (m, 1H), 4,69-4,49 (m, 1H), 2,72-2,52 (m, 1H), 2,34-2,19 (m, 1H), 1,21 (s,9H), 1,19 (s, 9H).

¹³С ЯМР (75 МГц, DMSO) δ 176,22,148,52, 147,50, 142,91, 141,99, 141,88, 136,23, 133,28, 130,54, 129,08, 128,91, 128,46, 125,72, 125,00, 124,60, 124,08, 121,52, 112,53, 82,30, 80,38, 77,54, 66,52, 33,21, 29,16.

(3-^-4-(3-Хлорфенил)-1,3,2-диоксафосфинан-2-он-2-ил)-1,10-фенантролин-7-окси)-7 метилфосфорная кислота (26).

Соединение 24 (50 мг, 0,08 ммоль) растворяли в дихлорметане (3 мл). TFA (1 мл) добавляли к смеси при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Реакционную смесь выпаривали до сухости. К остатку добавляли метанол (1 мл) и смесь фильтровали с помощью всасывающего фильтра с получением соединения 26.

¹H ЯМР (300 МГц, DMSO) δ 9,46 (dd, J=5,0, 1,8 Гц, 1H), 9,23-9,05 (m, 2H), 8,37-8,21 (m, 2Н), 7,68 (d, J=5,6 Гц, 1H), 7,56 (s, 1H), 7,51-7,36 (m, 3H), 6,12-5,90 (m, 3H), 4,90-4,74 (m, 1H), 4,71-4,50 (m, 1H), 2,712,54 (m, 1H), 2,33-2,21 (m, 1H).

Получение (3 -(4S-4-(3 -хлорфенил)-1,3,2-диоксафосфинан-2-он-2-ил)-1,10-фенантролин-7-он)10(7Н)-метилфосфорной кислоты (27).

Соединение 25 (50 мг, 0,08 ммоль) растворяли в дихлорметане (3 мл). TFA (1 мл) добавляли к смеси при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение 30 мин при комнатной температуре. Реакционную смесь выпаривали до сухости. К остатку добавляли метанол (1 мл) и смесь фильтровали с помощью всасывающего фильтра с получением соединения 27.

¹H ЯМР (300 МГц, DMSO) δ 9,38 (dd, J=4,5, 2,0 Гц, 1H), 9,13 (dd, J=15,6, 2,0 Гц, 1H), 8,40 (d, J=8,7 Гц, 1H), 8,19 (d, J=8,3 Гц, 1H), 8,13 (d, J=8,7 Гц, 1H), 7,58 (s, 1H), 7,54-7,35 (m, 3H), 7,04 (t, J=9,9 Гц, 1H), 6,91 (t, J=9,8 Гц, 1H), 6,43 (d, J=7,8 Гц, 1H), 5,95 (d, J=10,8 Гц, 1H), 4,88-4,76 (m, 1H), 4,69-4,45 (m, 1H), 2,74-2,56 (m, 1H), 2,31-2,22 (m, 1H).

- 16 030709

Пример 2. Экспрессия и очистка Р4Н.

Человеческая рекомбинантная Р4Н экспрессировалась в Е. coli. Вкратце, ДНК, кодирующую сигнальную последовательность Р4Н, клонировали в pET28_N-His_TEV, полученную в результате плазмиду pET28_N-His_TEV_P4HA1/PDI переносили в E.coli Origami2(DE3) для совместной экспрессии. Полученный фермент очищали с помощью ионообменной колонки MonoQ, TEV классифицировали и подтверждали путем MS, пропускали через колонку Histrap HP и наконец очищали с помощью колонки Hiload 16/60 Superdex 200.

Пример 3. Анализы ферментативной активности Р4Н и влияния соединения по настоящему изобретению на ферментативную активность.

Измерение ферментативной активности очищенного белкового фермента Р4Н и анали влияния соединения на ферментативную активность осуществляли в следующей системе ферментативной реакции сочетания: 100 мМ Tris (pH 7,0), 0,1 мМ (NH₄)₂Fe(SO₄)₂, 0,1 мМ аскорбиновой кислоты, 0,2 мМ СоА, 0,2 мМ АТР, 0,5 мкмоль сукцинил-СоА-синтазы, 100 мкмоль 2-оксоглутарата, 100 мкмоль (Pro-ProО^Допептида, 50 нМ фермента Р4Н, 50 мкл в общем. Через 45 мин реакции при 25°C добавляли 10 мкл MLG R1 и обеспечивали реакцию в течение 10 мин, добавляли 10 мкл MLG R2 и обеспечивали реакцию в течение 20 мин. Р4Н катализирует 2-оксоглутаровую кислоту и полипептид посредством кофермента и подходящей среды для ферментативной реакции с получением продукта в виде янтарной кислоты. Полученная янтарная кислота затем обеспечивала образование сукцинил-СоА и фосфорную кислоту при воздействии сукцинил-СоА-синтазы. Уровень образованной фосфорной кислоты можно измерить с помощью MLG, который отображает уровень Р4Н. Образованный зеленый продукт (MG+)(H₂PMo₁₂O₄₀) измеряли при OD 630 нм.

Оценку ингибирования соединения относительно фермента Р4Н осуществляли в 96-луночных планшетах. У каждой концентрации было два повторных образца (n=2). Соединение 9с добавляли к системе ферментативной реакции в следующих концентрациях (в последовательности и перед добавлением фермента Р4Н): 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 30, 10, 300 нМ. Анализ данных и статистические данные получали с помощью Prism. IC₅₀ соединения 9с для фермента составляет 8,1 мкМ (фиг. 1). На фиг. 1 показано что ингибирование с помощью соединения 9с активности человеческого фермента Р4Н повышается с повышением концентрации 9с.

Пример 4. Исследования фармакокинетики in vivo.

Крыс Wistar (200±20 г) разделяли на 2 группы, по 6 особей в каждой, поровну самок и самцов в каждой группе, со свободным доступом к еде и воде. Первой группе в хвостовую вену вводили 3 мг-кг^-1 соединения 16с. Второй группе перорально вводили динатриевую соль соединения 27 (39 мг-кг^-1). Кровь (0,3 мл) собирали из ретроорбитальной вены в моменты времени 0, 0,08, 0,17, 0,33, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 3, 5, 7 ч, помещали в охлажденные гепаринизированные пробирки Эппендорфа. Образцы центрифугировали при 4°C (15000 об/мин) в течение 5 мин. 100 мкл образцов плазмы переносили в морозильную камеру при -80°C для тестирования.

Способы количественного анализа LC-MS/MS соединения 9с и пролекарства 16с в плазме настраивали с использованием в качестве внутреннего стандарта диазепама и милдроната соответственно. (В плазме пролекарство 27 не было обнаружено в условии эксперимента.) Образец плазмы тестировали и анализировали (результат см. в табл. 1 и на фиг. 2).

Таблица 1

Концентрация соединения 16с в плазме после i.v. дозированного введения соединения 16с и РО дозированного введения соединения 27

Соединение	Способ введения	с * '-max (нг-мл'1)	tl/2** (ч.)	AUC0_t*** (мкг-ч.-л'1)	AUCo-oo**** (мкг-ч.-л'1)
16с	IV	1617,80	1,50	2064,58	2136,40
27	РО	1440	2,79	5235,70	6805,74

* C_max относится к максимальной концентрации в плазме.

** t_1/2 относится к периоду полувыведения лекарственного средства в плазме.

*** AUC_0-t относится к области под кривой зависимости концентрации от времени до конечного времени теста.

**** AUC_0-/ относится к области под кривой зависимости концентрации от времени до общего выведения лекарственного средства.

Биодоступность при пероральном приеме.

Биодоступность при пероральном приеме рассчитывали относительно соединения 16с в плазме.

- 17 030709

Область под кривой зависимости концентрации от времени (ЛИС) РО дозированного введения разделяли на ЛИС i.v. дозированного введения того же количества лекарственных средств и выражали в проценте поглощения: Биодоступность (Р)=ЛиСро-МЦ/ЛиСЦ-Мрох100%о. При этом Miv означает молярную концентрацию лекарственных средств при i.v. дозированном введении, а Мро означает молярную концентрацию лекарственных средств при РО дозированном введении. ЛИС₀₄ соединения 16с в плазме.

После внутривенного введения соединения 16с (3 мг-кг^-1) и перорального введения соединения 27 (39 мг-кг^-1), ЛИСоч соединения 16с в плазме составляло 2064,58 г-ч/мл и 5235,70 г-ч/мл соответственно. Основываясь на концентрации соединения 16с в плазме, биодоступность (F) соединения 27 составляет 25,4% (т.е. 5235,70/(2064,58х10)х100%).

Концентрация соединения 16с и 9с в печени.

16 крыс Wistar (200±20 г) перед экспериментом случайным образом разделяли на 4 группы, поровну самок и самцов в каждой группе в каждой группе, со свободным доступом к еде и воде. После РО дозированного введения соединения 27 (39 мг-кг^-1) крыс умерщвляли в каждый момент времени 15 мин, 45 мин, 8 ч, 24 ч. Образцы печени собирали, вымывали кровь и содержимое с помощью солевого раствора, нарезали на небольшие кусочки и равномерно перемешивали. Взвешивали 1 г. Добавляли 1 мл метанола/воды. После гомогенизации добавляли дополнительный 1 мл метанола/воды. Смесь обрабатывали ультразвуком в течение 15 с, центрифугировали (4500 об/мин) в течение 10 мин. Верхний прозрачный раствор тестировали с использованием способа БС-MS/MS с получением концентрации соединения 16с и 9с в печени в разные моменты времени после введения (табл. 2). Результаты указывают на то, что пролекарство 27 превращалось в соединение 16с у крысы после РО дозированного введения, а соединение 16с преобразовалось в соединение 9с в печени.

Таблица 2

Концентрация соединения 16с и 9с (нг-г^-1) в печени в разные моменты времени после перорального введения соединения 27

	0,25 ч.	0,75 ч.	8 ч.	24 ч.
16с	521,50	662,5	584,50	50,88
9с	16,13	64,25	44,68	3,55

Пример 5. Исследование фармацевтической активности in vivo.

В данном эксперименте применяли перевязку желчных протоков для индуцирования модели фиброза печени у крыс. Исследовали лечение крыс с BDL при РО дозированном введении пролекарства 27.

Вкратце, крыс Wistar (200±20 г) разделяли на 3 группы, поровну самок и самцов в каждой группе.

Группа SHЛM: 6 крыс анестезировали, выбривали кожу на животе и стерилизовали обычным способ, общий желчный проток выделяли посредством верхнего брюшного срединного разреза при стерильной операции. На мышцы и кожу швы накладывали раздельно.

Группа модели фиброза печени: 12 крыс анестезировали, выбривали кожу на животе и стерилизовали обычным способом, общий желчный проток выделяли и перевязывали посредством верхнего брюшного срединного разреза при стерильной операции. На мышцы и кожу швы накладывали раздельно.

Группа дозированного введения: 12 крыс анестезировали, выбривали кожу на животе и стерилизовали обычным способом, общий желчный проток выделяли и перевязывали посредством верхнего брюшного срединного разреза при стерильной операции. На мышцы и кожу швы накладывали раздельно. После операции динатриевую соль соединения 27 (30 мг/кг) растворяли в воде и перорально дозированно вводили крысам один раз в сутки

Тестовые индексы.

Через 2 недели измеряли ЛLT и ЛST в сыворотке и гомогенате печени.

Через 2 недели крыс умерщвляли и проводили окрашивание печени НЕ окрашивание и окрашивание по Массону.

Влияние соединения 27, вводимого перорально, на ЛLT и ЛST в сыворотки и гомогенате печени крыс с BDL, имеющих фиброз печени.

ЛLT и ЛST в настоящее время представляют собой индекс функции печени в обычном клиническом применении. ЛLT в основном находится в цитозоле гепатоцита, ЛST в основном находится в митохондрии гепатоцита. Если гепатоцит поврежден, то уровень ЛLT и ЛST в сыворотке возрастает, что может отображать уровень повреждения гепатоцита. ЛLT и ЛST сыворотки и гомогената печени крыс в модельной группе с BDL значительно возрастали. После того, как соединения 27 вводили в течение 14 дней животных умерщвляли.

ЛLT и ЛST в сыворотки и гомогенате печени данных животных значительно снижались, что значительно отличалось от модельной группы (**Р<0,01, см. табл. 3 и 4). Указано, что соединение 27 снижало уровень повреждения функции печени с BDL и обладает защитным эффектом относительно поврежде- 18 030709

ния печени, образованного в результате регургитации желчи.

Таблица 3

Влияние соединения 27 на ALT (МЕ/л) в сыворотке крыс с BDL, имеющих фиброз печени

Группы	ALT в сыворотке	ALT в печени
SHAM	67,1+5,45	68,2+8,33
МОДЕЛЬНАЯ ГРУППА	144,4+15,94	136,8+16,48
Соединение 27 (30 мг/кг)	74,4+17,82**	76,4+11,35**

**Р<0,01, по сравнению с модельной группой.

Таблица 4

Влияние соединения 27 на AST (МЕ/л) сыворотки крыс с BDL, имеющих фиброз печени

Группы	AST в сыворотке	AST в печени
SHAM	67,7+4,67	67,40+5,28
МОДЕЛЬНАЯ ГРУППА	207,2+30,96	198,75+27,70
Соединение 27 (30 мг/кг)	87,2+12,51**	91,42+8,79**

**Р<0,01, по сравнению с модельной группой.

Влияние соединения 27, вводимого перорально, на окрашивание НЕ крыс с BDL, имеющих фиброз печени.

Результаты окрашивания Н&Е являются следующими.

Группа SHAM: как показано на фиг. 3, структура дольки печени является нормальной, гепатоциты сосредоточены в центральных венах и расходятся лучами во всех направлениях. Гепатоциты в дольке печени варьируют в порядках. Гепатоциты одинаковые по размеру. Дегенерация и некроз гепатоцитов отсутствует.

Модельная группа: как показано на фиг. 4, структура дольки печени является неупорядоченной. Набухание гепатоцитов. Цитоплазма гепатоцитов является проницаемой. Быстро распространяется соединительная ткань фиброза.

Группа дозирования: как показано на фиг. 5, в обработанной группе варьируют патологические изменения ткани печени.

Claims (14)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Соединение формулы (I) или формулы (II) или его фармацевтически приемлемая соль

   где X представляет собой -Cl или -OR³; где R³ выбран из -Н, -С(О)-(C₁-C₆-алкила), -РО(ОН)₂ и -СН2ОРО(ОН)2;

   каждый из R¹ и R² может быть независимо выбран из Н, ^-^-алкила, -СН^СО-^^-алкила) и -СН₂ОСОО-(C₁-C₆-алкила); или R¹ и R² соединены с образованием группы, характеризующейся формулой

   где Y представляет собой необязательно замещенный 5-14-членный арил или необязательно заме- 19 030709

   щенный 5-14-членный гетероарил, содержащий 1-4 кольцевых гетероатома, выбранных из кислорода, серы, азота и селена; при этом заместители арила и гетероарила независимо выбраны из галогена, гидрокси и амино;

   где Z выбран из -Н и -СН₂ОРО(ОН)₂;

   каждый из R¹ и R² может быть независимо выбран из Н, Сх-С_б-алкила, -СН₂ОСО-(Сх-С₆-алкила) и -СН₂ОСОО-(Сх-С_б-алкила); или R¹ и R² соединены с образованием группы, характеризующейся формулой

   где Y представляет собой необязательно замещенный 5-14-членный арил или необязательно замещенный 5-14-членный гетероарил, содержащий 1-4 кольцевых гетероатома, выбранных из кислорода, серы, азота и селена; при этом заместители арила и гетероарила независимо выбраны из галогена, гидрокси и амино.
2. 2. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п.1, где X в формуле (I) представляет собой -ОН, -ОРО(ОН)2 или -ОСН2ОРО(ОН)2.
3. 3. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п.1, где R¹ и R² в формуле (I) представляют собой Н;

   в качестве альтернативы R¹ и R² в формуле (I) вместе образуют группу, характеризующуюся формулой

   где Y представляет собой арил;

   в качестве альтернативы R¹ и R² в формуле (I) вместе образуют группу, характеризующуюся формулой

   где Y представляет собой гетероарил.
4. 4. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п.1, где соединение выбрано из:

   структурой

   - 20 030709
5. 6. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п.5, где соединение выбрано из:
6. 7. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п.4, где соединение выбрано из:
7. 10. Соединение по п.1, где R¹ и R² в формуле (II) представляют собой Н; в качестве альтернативы R¹ и R² в формуле (II) вместе образуют группу, характеризующуюся формулой

   γ^γ

   9

   где Y представляет собой арил;

   в качестве альтернативы R¹ и R² в формуле (II) вместе образуют группу, характеризующуюся формулой

   - 21 030709

   где Y представляет собой гетероарил.
8. 11. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п.1, где соединение характеризуется структурой
9. 12. Соединение или его фармацевтически приемлемая соль по п.11, где соединение выбрано из:
10. 13. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1-12 в качестве ингибиторов коллагенпролил-4-гидроксилазы.
11. 14. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1-12 в получении лекарственных средств для предупреждения или лечения заболевания, связанного с коллагенпролил-4-гидроксилазой.
12. 15. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1-12 в получении лекарственных средств для предупреждения или лечения фибропролиферативного заболевания.
13. 16. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1-12 в получении лекарственных средств для предупреждения или лечения фиброза печени.
14. 17. Применение соединения или его фармацевтически приемлемой соли по любому из пп.1-12 в получении лекарственных средств для защиты функций печени.

    - 22 030709