EA029703B1 - Новый аллерген из пыльцы амброзии и его применение - Google Patents

Abstract

Изобретение, в частности, касается нового основного аллергена из пыльцы амброзии, названного Amb a X, а также его изоаллергенов и изоформ. Фрагменты вышеупомянутых полипептидов и гомологичные полипептиды, в частности гомологичные полипептиды у родственных видов растений, также являются частью изобретения. Изобретение также касается применения данных полипептидов, в частности, для диагностики и профилактики или лечения аллергии.

Description

Настоящее изобретение, в частности, касается нового белка, который является одним из основных аллергенов пыльцы амброзии и называется ЛтЬ а X, а также его изоаллергенов и изоформ. Фрагменты вышеупомянутых белков, полипептиды и гомологичные полипептиды, в частности гомологичные белки и полипептиды у родственных видов растений, также являются частью изобретения. Изобретение также касается антител против данных полипептидов, а также применения данных белков, полипептидов и антител, в частности, для диагностики, профилактики или лечения аллергии.

Сорняки, в особенности сорняки, принадлежащие к родам ЛтЬго81а, ЛПстыа и Рапей-та, часто связаны с поллинозом у подверженного им населения.

Амброзией именуются растения рода АтЬгоЪа. Среди растений этого рода основными источниками поллиноза являются амброзия короткая (полыннолистная), т.е. АтЬгоЪа аг1ет181т£о11а, которая также называется АтЬгоча е1айог, амброзия западная (голометельчатая), т.е. АтЬгоча рзПоМасНуа, и амброзия гигантская (трехнадрезанная), т.е. ЛтЬгоча йтйба. В частности, пыльца короткой амброзии (ЛтЬгоча апет181ЙоНа) является клинически наиболее важным источником сезонных аэроаллергенов в Северной Америке, так как она ответственна за большую часть и наиболее тяжелые случаи сенной лихорадки (аллергического ринита). Из-за усиленного распространения этого растения, а также большой продолжительности опыления, люди стали значительно чаще подвергаться воздействию пыльцы короткой амброзии, поэтому резко возросло число зарегистрированных случаев сенной лихорадки, вызванной короткой амброзией.

Растения из родов ЛтЬго81а, ЛПетыа и Рапе1апа составляют гомологичную группу источников аллергенов, так как их аллергены проявляют гомологию последовательностей и/или перекрестную реактивность (Богеп/ е1 а1., Ιηΐ. ЛгсЬ. Л11ег§у 1ттипо1. 2009, 148:1-17).

Аллергены пыльцы ЛтЬгоча апет18и1о11а, которые были идентифицированы до настоящего времени, включают АтЬ а 1 и АтЬ а 2, которые являются основными аллергенами, а также АтЬ а 3, АтЬ а 4, АтЬ а 5, АтЬ а 6, АтЬ а 7, АтЬ а 8, АтЬ а 9 и АтЬ а 10. Пыльца АтЬгоча р811о81асЬуа, в частности, содержит основной аллерген АтЬ р 5, а пыльца АтЬгоча Ргйба, в частности, содержит основной аллерген АтЬ ΐ 5.

Аллергены именуются по систематической номенклатуре аллергенов Подкомитета по номенклатуре аллергенов (А11егдеп №тепс1аШге БиЬ-СоттШее) Всемирной организации здравоохранения и Международного союза иммунологических обществ, которая была пересмотрена в 1994 г. (ЛУНО Ви11ейп уо1. 72, АищМ 1994; Кш§ еΐ а1., А11ег§еп пошепс1аШге. А11ег§у 1995, 9:765-74).

По систематической номенклатуре аллергены обозначаются в соответствии с общепринятым таксономическим названием своего источника. Номенклатура аллергенов состоит из трех букв, за которыми следуют одна буква и арабская цифра, и пробелов после каждого из первых двух элементов. Три буквы соответствуют первым трем буквам рода, одна буква соответствует первой букве вида, а номера присваиваются аллергенам в порядке их идентификации. Таким образом, аллергены короткой амброзии АтЬго81а аПетыТоПа обозначаются "АтЬ а", а последующий номер соответствует порядку их идентификации.

Обычно для обозначения гомологичных аллергенов из родственных видов используется один и тот же номер. При этом аллергены, обозначенные одним и тем же номером, как-то АтЬ а 5, АтЬ р 5 и АтЬ ΐ 5, образуют "группы" родственных аллергенов из разных видов. Например, АтЬ а 5, АтЬ р 5 и АтЬ ΐ 5 принадлежат к V группе аллергенов АтЬгоча.

Кроме того, аллерген из одного вида может состоять из нескольких очень близких молекул. Эти похожие молекулы обозначаются как "изоаллергены", если они имеют следующие общие биохимические свойства: (а) близкие молекулярные размеры; (Ь) идентичные биологические функции, напр., ферментативное действие; и (с) идентичность аминокислотных последовательностей >67% (Кш§ еΐ а1., А11ег§у 1995, 50:765-774).

Кроме того, при клонировании кДНК аллергенов часто выявляются нуклеотидные мутации, которые либо являются молчащими, либо могут вызвать замену одной или нескольких аминокислот. Таким образом, каждый изоаллерген может иметь несколько форм с очень близкими последовательностями, которые обозначаются как "изоформы". Более того, АтЬ а X и его изоаллергены могут иметь различные профили гликозилирования.

Принципы номенклатуры аллергенов представлены на фиг. 1. Соответственно, вновь идентифицированный аллерген, представитель нового семейства гомологичных аллергенов одного и того же вида, составляет первую изоформу первого изоаллергена из семейства гомологичных аллергенов.

Авторы изобретения идентифицировали новый белок, который является одним из основных аллергенов пыльцы амброзии (АтЬгоча аПетыТоПа). Этот белок составляет первую изоформу первого изоаллергена нового семейства гомологичных аллергенов под названием "АтЬ а X".

Идентификация новых аллергенов необходима, так как она способствует как диагностике и характеристике аллергии, так и лечению данной аллергии с помощью аллерген-специфичной иммунотерапии. Идентификация основных аллергенов, то есть таких аллергенов, для которых у более чем 50% обследованных пациентов имеется соответствующий аллерген-специфичный 1дЕ, имеет еще большее значение для диагностики и лечения распространенных аллергий. Аллерген-специфичная иммунотерапия (8ΙΤ)

- 1 029703

или десенсибилизация является одной из форм иммунотерапии аллергических заболеваний, при которой пациенту вводится препарат аллергена с целью вызвать иммунологическую толерантность. Недавно в области 8ΙΤ было апробировано сублингвальное (подъязычное) введение. Аллерген-специфичная сублингвальная иммунотерапия (8ЫТ) в самом деле представляет безопасную и эффективную неинвазивную альтернативу подкожной иммунотерапии (8С1Т).

Раскрытие сущности изобретения

Авторы изобретения провели исследование профиля аллергенной сенсибилизации у пациентов с аллергией на пыльцу амброзии. Они проанализировали аллергенный профиль по расположению наиболее часто распознаваемых аллергенов для сыворотки 28 пациентов на синтетической карте и идентифицировали их методом масс-спектрометрии. Этот анализ привел авторов изобретения к идентификации нового белка амброзии в 30-35 кДа, реагирующего с 1дЕ от пациентов с аллергией на амброзию, который они назвали ЛшЬ а X, при этом X означает еще неустановленный номер, соответствующий порядку идентификации этого нового аллергена. Кроме того, авторы изобретения впоследствии охарактеризовали этот аллерген. В частности, они показали, что ЛшЬ а X принадлежит к семейству цистеиновых протеаз.

ЛшЬ а X, который не числится в базах данных по белкам и аллергенам, реагирует с сывороткой 54% пациентов с аллергией на амброзию и поэтому является основным аллергеном. Таким образом, авторы изобретения выделили новый основной аллерген из пыльцы амброзии.

Как показано в примере 2, авторы изобретения клонировали методом КАСЕ вновь идентифицированный аллерген АтЬ а X амброзии с помощью ДНК-праймеров, составленных по последовательностям пептидов, идентифицированных 2Э-электрофорезом с последующей масс-спектрометрией и Ν-концевым секвенированием по Ебтап. На основании различных фрагментов АтЬ а X они установили следующую консенсусную последовательность:

МЩ! ΝΚΕ УС Г ЗР ЗЬ УЦЕОЬУЕЗутРззНУНЕКЕЬЕЗЕЕОРМОМУРКУУКЕОНХЕМКЗРЕКР ΝνΡΚΥΝνΚΚΙΗΕ8ΝΚΜΟΚΡΥΚΕΚνΝΕΡΑϋΜΤΝΕΕΡνΝΤΥΑΝ3ΚΙ8ΗΡρΑΕΚιο8θιο9δΑΡ

ΟδΙΟΤΟΡΝΚϋΒΊΥΑΝνΤΚΙΡϋΚνΟΧνΚΕΚΝΑνΤΟνΚΟΟσσοσδΟΧνΑΓΑΑννΑΕΕσΐ

ХАтТСКЬУКРЗЕООЕУОСОМТХАССОССЬМЕРАРТУУЦСНССЬкРЕАЗУРУУСК

ΙίΕΚΙ)ΚΛΙ<ΙΚΙ)νΕΙ<ΙΙ)(,Κ9Χ\Ι4,ΕΙ)ΕΕΑΡΚΚΛ\ΛΙΙ9Ι’\ΑΙ(,Ι9Ε8(,ΙΚ,Ι.9Ρλ8Ε(,

УУТ(Л)С(/ЕЕР\ЕКЛС1УСУСЕ\Е1<(Л1<Р\¥ЕУ1<\8\¥(,РЕ\¥СЕ1<СУ1Е1ЕОИСАК1<Е

ΟΕ<:θνΑΜΗ88ΓΡΙΜΝΟΡΝΡΡΚϋΟΡΝΟΡΚ0ϋΡϋΑΡΚΟΡΚΓΚΤΤ<3ΚΕ<3ΟΙΚΤΚΕΕΕ

Ьзвб (8Е() ГО N0:28).

Последовательность 8Е^ II) N0: 28 представляет собой последовательность пре-про-АтЬ а X, в которой аминокислоты в положениях 1-22 определяют предполагаемую сигнальную последовательность, аминокислоты в положениях 23-108 определяют проучасток, а аминокислоты в положениях 109-386 определяют последовательность зрелого полипептида.

Под "консенсусной последовательностью" имеется в виду последовательность, определяемая по наиболее часто встречающимся аминокислотам или нуклеотидам в каждом положении, при выравнивании доступных полных последовательностей, кодирующих белок, или последовательностей нуклеиновой кислоты.

Таким образом, консенсусная последовательность зрелого полипептида АтЬ а X такова: Ο5ΑΡΘ8ΙΟΤΟΡΝΚΟΡΙΥΑΝνΤΚΙΡΟΚνΕ>λνΚΕΚΝΑνΤθνΚΟ()ΘΟ0Θ80λνΑΕΑΑννΑΕΕ ΘΙΝΑΙΚΤΘΚΕνΚΡ3Ε()()ΕνθΟΟΜΤΝΑΟΟΟΟθΕΜΕΡΑΡΤΥνΐΚΗθθΙΑΡΕΑ3ΥΡΥνθΚΡΕ Τ0ϋΚΑΚΙΚϋνΕΚΙΟΟΚ()ΝνΡΘΕΟΕΕΑΕΚΚΑνΑΗ<3ΡνΑΤΟΙ()Ε5ΟΗΘΕ()ΡΥ5ΕθνΥΤΟΟ ΟΟΤΕΡΝΗθνθΙΥΟΥΟΕΝΕΙ<ΟΠ<Ρ\ντνΐ<Ν8\νθΡΤ\νθΕΙ<ΟΥΙΗΕΟΕΟΑΕΙ<ΕΟΕΟθνΑΜΗ δδΡΡΙΜΝϋΡΝΡΡΚΟϋΡΝΟΡΚΟΟΡΟΑΡΚΟΡΚΡΚΤΤΟΚΕΟΟΙΚΤΚΕΕΕΕ (8Ε0 ГО ΝΟ: 1).

Нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность пре-про-аллергена амброзии АтЬ а X, приведена ниже:

АТООАААТСААСААОТТАОТТТОТТТТТСАТТТТСТТТООТТТТОАТТТТАООАСТТО

ТАОАОАОСТТССАТТАССАТОАОАОАОАОСТСОААТСООАООАООООТТТАТОООО

АТОТАТОАТАОАТООАОООАОСААСАСААТАТСОАААТОАОААОСССООААСООТТ

СААТОТОТТСААОТАСААТОТТАООСОСАТТСАСОААТСОААТААОАТООАСААОС

СОТАТААОТТОААООТОААСОАОТТТОСТОАСАТОАСТААССТТОАОТТСОТТААСА

СОТАТОСТААСТСОААОАТТАОССАТТТТСААОСССТССОАООАТСАОСАССТООСТ

СОАТТОАТАССОАСССТААТАААОАТТТСАТАТАТОСАААТОТСАСТААААТСССАО

АТААООТСОАТТООАОООАОАААААСОСТОТСАСТОАТОТСААОООТСААООСООА

ТОТООААОТТОТТОООСОТТТОССОСТОТООТТОСАСТООААООААТАААСОСОАТС

АОААССОООААОСТООТААААТТТТССОААСААСААСТТОТСОАТТОТОАСАТОАС

- 2 029703

ОААСОСАООАТОСОАСООАОООСТААТООААССТОСАТТСАСАТАСОТСАТАААОС

АТООАООТАТАОСТССАОААОСОАОСТАСССТТАСОТАООСААААОАОАААССТОС

ОАСАААОСАААОАТТАААОАТОТОТТОААОАТСОАТООТАОАСААААТОТОССТОО

АСТТОАСОААОААОСАСТААООААООСАОТТОСАСАССАОССТОТАОСТАССООТА

ТАСААСТТАОСООССАТООТТТОСАОТТСТАТТССОАОООТОТАТАТАССООАОАТТ

С-ТС-С-ТАСАС-АС-ССС-ААТСАТСС-ТС-ТТС-С-ААТТС-ТС-С-С-АТАСС-С-ТС-АС-ААТС-ААААСОООАТТАААТТСТООАССОТОААОААСТСАТООООАССААСАТООООАОАОААОО

ОАТАСАТАСАТТТАСААСОСООАОСТАООАААОАОООАСТАТОСООАОТАОСААТО

САТТСТТСТТТТССТАТТАТОААСОАСССАААСССАССТАААОАСОАССССААТООА

ССТАААОАСОАСССТОАТОСАССТААООАССССАААТТТААААСОАСТСАОАООТТ

ОСААОООАТААООАСТАААТТОТТООАОТТОТОА (ЗЕЦ ГО N0: 29).

Полипептиды

Таким образом, изобретение касается выделенного белка или полипептида, включающего или состоящего из:

a) последовательности 8НС) ГО N0: 1 (ЛшЬ а X), или

b) последовательности, которая по меньшей мере на 57% идентична последовательности 8НС) ГО N0: 1 и обладает такой же биологической активностью, что и полипептид с последовательностью 8НС) ГО N0: 1, или

c) варианта последовательности, определенной в а) или Ь), который проявляет сниженную аллергенность или сниженную ферментативную активность по сравнению с последовательностью, определенной в а) или Ь), или

ά) производной от последовательности, определенной в а), Ь) или с), которая была модифицирована путем термической, химической или физической обработки, или

е) фрагмента последовательности, определенной в а), Ь) или с), причем данный фрагмент содержит по меньшей мере 250 смежных аминокислот из последовательности, определенной в а), Ь) или с), или является эпитопным фрагментом последовательности, определенной в а), Ь) или с).

Здесь и далее "АтЬ а X" означает зрелую форму белка.

Полипептид по изобретению может быть гликозилированным, в частности, в положении Ν₁₉ 8НС) ΙΌ N0: 1, которое было определено в качестве уникального сайта Ν-гликозилирования.

Белок или полипептид, содержащий или состоящий из последовательности, по меньшей мере на 57% идентичной последовательности 8НС) ГО N0: 1, и обладающий такой же биологической активностью, что и полипептид с последовательностью 8НС) ГО N0: 1, предпочтительно содержит или состоит из такой последовательности, которая по меньшей мере на 60, 67, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности 8НС) ГО N0: 1 (такой полипептид, содержащий или состоящий из последовательности, которая по меньшей мере на 57% идентична последовательности 8НС) ГО N0: 1, в дальнейшем именуется "гомологичным полипептидом").

Гомологичный полипептид является "аллергеном", то есть таким полипептидом, который способен индуцировать Ι§Ε при введении млекопитающим, в частности людям, сенсибилизированным к нему.

Под белком или полипептидом, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 95% "идентична" последовательности 8НС) ГО N0: 1, имеется в виду то, что аминокислотная последовательность полипептида после глобального попарного выравнивания с последовательностью 8НС) ГО N0: 1 может содержать вплоть до пяти модификаций аминокислот на каждые 100 аминокислот в последовательности 8НС) ГО N0: 1. Иными словами, для получения полипептида, аминокислотная последовательность которого по меньшей мере на 95% идентична последовательности 8НС) ГО N0: 1, до 5% (5 из 100) аминокислотных остатков в данной последовательности могут быть вставлены, удалены или заменены другой аминокислотой.

Процент идентичности между двумя последовательностями можно определить при глобальном попарном выравнивании по алгоритму №е<Летап-Шип5с1т Например, процент идентичности последовательностей можно легко определить с помощью программы №еШе с матриксом ВЕ08ГМ62 при следующих параметрах: дар-ореп=10, §ар-ех!;епб=0.5.

Гомологичный полипептид по изобретению может отличаться от 8НС) ГО N0: 1 одной или несколькими модификациями, такими как добавление, удаление и/или замена одной или нескольких аминокислот. Например, белок или полипептид по изобретению может отличаться от 8НС) ГО N0: 1 по 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20 или 30 аминокислотам. В частности, белок или полипептид по изобретению может представлять собой природную последовательность, которая отличается от эталонной последовательности 8НС) ГО N0: 1 некоторыми точечными мутациями типа тех, что приведены в табл. 1 (ниже).

Таким образом, используя 8НС) ГО N0: 1 в качестве референсной последовательности для нумерации положений аминокислот, мутации предпочтительно располагаются в одном или нескольких из положений аминокислот 97, 104 (это природные положения мутаций у зрелой формы АтЬ а X), 249 и 252.

029703

Аминокислотные замены могут быть консервативными или не консервативными.

Предпочтительно замены являются консервативными заменами, при которых одна аминокислота

заменяется на другую аминокислоту с аналогичными структурными и/или химическими свойствами, как указано в табл. 1.

Таблица 1. Описание , консервативных замен аминокислот

Консервативные замены	Тип аминокислот
А1а, Уа1, Ьеи, Не, Мер Рго, РИе, Тгр	аминокислоты с алифатическими гидрофобными боковыми цепями
8ег, Туг, Азп, О1п, Суз	аминокислоты с незаряженными, но полярными боковыми цепями
Азр, Сг1и	аминокислоты с кислыми боковыми цепями
Ьуз, Агд, Из	аминокислоты с основными боковыми цепями
Сг1у	нейтральная боковая цепь

Гомологичный белок или полипептид, содержащий или состоящий из последовательности, которая по меньшей мере на 57, 60, 67, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности 8Н() ГО N0: 1, и обладающий такой же биологической активностью, что и полипептид с последовательностью 8 НС) ГО N0: 1, предпочтительно отличается от последовательности 8НС) ГО N0: 1 только консервативными заменами.

Гомологичный белок или полипептид предпочтительно содержит или состоит из последовательности:

ΐ) которая по меньшей мере на 57, 60, 67, 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична последовательности 8ЕР ГО N0: 1, и

ΐΐ) которая обладает такой же биологической активностью, что и полипептид с последовательностью 8Ер ГО N0: 1, и

ΐΐΐ) которая кодируется геномом растительного вида, в частности вида растений, родственного АтЬго§1а аДепшпГоПа. Предпочтительно данный вид растений, родственный АтЬго§1а аг1ет18п£оНа, представлен другим видом растений амброзии, таким как АтЬго81а р8ЙО81асЬуа или АтЬго81а 1пПс1а, или сорняков, в частности сорняков, принадлежащих к роду Лг1ет18Ш (в частности, полыни Лг1ет181а уц1§ап8) или РапеКапа (в частности, Рале1шта дкНиса или Раг1е1аг1а о£йстаЙ8).

Под "кодируется геномом растительного вида" подразумевается то, что данный вид растений не подвергался генетической модификации или инженерии (путем вставки трансгена) для экспрессии по гомологичного белку или полипептиду по изобретению.

Данный гомологичный белок или полипептид является аллергеном, принадлежащим к той же группе аллергенов, к которой принадлежит АтЬ а X.

В некоторых воплощениях гомологичный белок или полипептид по изобретению содержит или состоит из последовательности, которая отличается от 8НС) ГО N0: 1, по крайней мере, следующими мутациями:

a) I вместо V в положении 97 в 8ЕР ГО N0: 1 (положение 205 в 8ЕР ГО N0: 28); или

b) V вместо А в положении 104 в 8ЕР ГО N0: 1 (положение 212 в 8ЕР ГО N0: 28); или

c) А вместо О в положении 249 в 8ЕР ГО N0: 1 (положение 357 в 8ЕР ГО N0: 28); или ά) V вместо О в положении 249 в 8ЕР ГО N0: 1 (положение 357 в 8ЕР ГО N0: 28); или е) Е вместо Ό в положении 252 в 8ЕР ГО N0: 1 (положение 360 в 8ЕР ГО N0: 28); или

ί) I вместо V в положении 97 в 8ЕР ГО N0: 1 (положение 205 в 8ЕР ГО N0: 28) и V вместо А в положении 104 в 8ЕР ГО N0: 1 (положение 212 в 8ЕР ГО N0: 28); или

д) V вместо О в положении 249 в 8ЕР ГО N0: 1 (положение 357 в 8ЕР ГО N0: 28) и Е вместо Ό в положении 252 в 8ЕР ГО N0: 1 (положение 360 в 8ЕР ГО N0: 28); или

Ε) I вместо V в положении 97 в 8ЕР ГО N0: 1 (положение 205 в 8ЕР ГО N0: 28) и А вместо О в положении 249 в 8ЕР ГО N0: 1 (положение 357 в 8ЕР ГО N0: 28); или

ΐ) I вместо V в положении 97 в 8ЕР ГО N0: 1 (положение 205 в 8ЕР ГО N0: 28) и V вместо О в положении 249 в 8ЕР ГО N0: 1 (положение 357 в 8ЕР ГО N0: 28) и Е вместо Ό в положении 252 в 8ЕР ГО N0: 1 (положение 360 в 8Ер ГО N0: 28).

У гомологичного белка или полипептида аминокислотные модификации по сравнению с 8НС) ГО N0: 1 предпочтительно располагаются в таких положениях, что они существенно не ухудшают биологическую активность полипептида. Так, полипептид по изобретению, который по меньшей мере на 57% идентичен 8НС) ГО N0: 1, проявляет такую же биологическую активность, что и полипептид с последовательностью 8ЕР ГО N0: 1.

"Такая же биологическая активность" может означать одинаковую биологическую функцию. Так, в контексте настоящего изобретения полипептид, обладающий такой же биологической активностью, что и полипептид с последовательностью 8НС) ГО N0: 1, может, к примеру, представлять собой полипептид, проявляющий такую же протеазную функцию, предпочтительно такую же функцию цистеиновой протеазы. Активность соединения может быть легко определена ΐπ νίΐΐΌ или ΐπ у1уо специалистом в данной области, в частности, при помощи следующих тестов: зимограмма или анализ расщепления синтетиче- 4 029703

ского меченого субстрата в присутствии и в отсутствие специфического ингибитора цистеиновых протеаз типа Е-64.

Альтернативно, полипептид с "такой же биологической активностью", что и полипептид с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 1, может означать полипептид, проявляющий "такую же аллергенность", т.е. полипептид, проявляющий перекрестную реактивность с антителами типа 1дЕ, связывающимися с последовательностью 8Е0 ГО N0: 1. В частности, полипептид с такой же аллергенностью, что и АтЬ а X, должен содержать один или несколько эпитопов 1дЕ, идентичных тем, которые содержатся в полипептиде с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 1. Эпитопы 1дЕ, содержащиеся в последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1, могут быть идентифицированы такими методами, как ингибирование пептидной матрицы ЕЬ18А, рентгеновская кристаллография, ЯМР или масс-спектрометрия обмена водород/дейтерий, используя 1§Ек, специфичные к АтЬ а X, например, полученные из сыворотки пациентов с аллергией на амброзию.

Гомологичным полипептидом, в частности, может быть белок, который является изоаллергеном последовательности 8Е0 ГО N0: 1.

В соответствии с номенклатурой аллергенов (Κίη§ с1 а1., А11егду 1995, 50:765-774), два аллергена из одного вида являются "изоаллергенами", если а) их последовательности идентичны по меньшей мере на 67%, Ь) они имеют одинаковую молекулярную массу, и с) они выполняют такую же биологическую функцию.

В настоящем изобретении "полипептид с такой же молекулярной массой" обозначает полипептид, у которого теоретическая молекулярная масса отличается примерно не более, чем на 10% от молекулярной массы полипептида, состоящего из 8ЕЦ ГО N0: 1. Теоретическая молекулярная масса белка или полипептида рассчитывается на основе аминокислотного состава без учета возможного гликозилирования.

Теоретическая молекулярная масса зрелого АтЬ а X (8ЕЦ ГО N0: 1) составляет 30 кДа, а теоретическая молекулярная масса пре-про-формы АтЬ а X (8ЕЦ ГО N0: 28) составляет 43 кДа.

Таким образом, белок или полипептид по изобретению, в частности, может содержать или состоять из изоаллергенного полипептида, который:

(ί) по меньшей мере на 67% идентичен 8ЕЦ ГО N0: 1, в частности, по меньшей мере на 70, 75, 80, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичен последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1; и

(ίί) молекулярная масса данного изоаллергенного полипептида отличается не более чем на 10% от молекулярной массы полипептида, состоящего из 8ЕЦ ГО N0: 1; и

(ίίί) данный изоаллергенный полипептид обладает такой же биологической активностью, что и полипептид с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 1.

Гомологичный белок или полипептид также может представлять собой изоформу аллергена: ί) данного аллергена с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 1 (АтЬ а X), или ίί) изоаллергена АтЬ а X.

В настоящем описании два аллергена из одного вида являются "изоформами", если их последовательности идентичны по меньшей мере на 85, 86, 87, 88, 89% или предпочтительно по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%. Изоформы являются природными аллельными или полиморфными вариантами аллергена.

В частности, изоформа полипептида с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 1 содержит или состоит из последовательности 8Е0 ГО N0: 1, в которой 11е заменяет Уа1 в положении 97 (У>1₉₇).

Изоформа полипептида с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 1 также может содержать или состоять из последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1, в которой 11е заменяет Уа1 в положении 97 в 8ЕЦ ГО N0: 1 и/или Уа1 заменяет А1а в положении 104 в 8ЕЦ ГО N0: 1 и/или А1а заменяет 01у в положении 249 в 8ЕЦ ГО N0: 1 и/или Уа1 заменяет 01у в положении 249 в 8ЕЦ ГО N0: 1 и/или 01и заменяет Акр в положении 252 в 8ЕС ГО N0: 1.

По определению, изоаллергены и изоформы полипептида с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 1, а также изоформы изоаллергенов полипептида с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 1 являются аллергенами пыльцы АтЬток1а аПетЪПГоПа.

Полипептид по изобретению также может быть модифицированным аллергеном. В частности, той характеристикой природного аллергена, которая была модифицирована, может быть его способность стимулировать иммунную систему. Способность стимулировать иммунную систему может включать в себя модификации Т-клеточных эпитопов, свойств связывания с антителами, т.е. В-клеточных эпитопов, а также другие модификации, ведущие к модулированию способности стимулировать иммунную систему.

Таким образом, изобретение также касается "вариантов полипептида", содержащих или состоящих из варианта:

a) последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1 или

b) последовательности, по меньшей мере на 57% идентичной последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1 и обладающей такой же биологической активностью, что и полипептид с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 1, как определено выше,

причем данный вариант полипептида проявляет сниженную аллергенность по сравнению с полипептидом, определенным в а) или Ь), как надлежит. Это означает, что данный вариант полипептида, со- 5 029703

держащий или состоящий из варианта с последовательностью δΕφ ΙΌ N0: 1, проявляет сниженную аллергенность по сравнению с полипептидом с последовательностью δΕφ ГО N0: 1. Это также означает, что данный вариант полипептида, содержащий или состоящий из варианта с данной последовательностью, определенной в Ь), проявляет сниженную аллергенность по сравнению с полипептидом с последовательностью, определенной в Ь).

Предпочтительно последовательность, определенная в Ь), является последовательностью изоаллергена полипептида с последовательностью δΕφ ΙΌ N0: 1 (АтЬ а X) или изоформы АтЬ а X или изоформы изоаллергена АтЬ а X. Также предпочтительно последовательность, определенная в Ь), является последовательностью аллергена, принадлежащего к той же группе аллергенов, к которой принадлежит АтЬ а X, или аллергена, который в природе экспрессируется или кодируется геномом вида растений, родственного АтЬгола аПетЫНоПа. как описано выше.

Предпочтительно данный вариант полипептида сохраняет иммуногенность, то есть он способен стимулировать В-клеточный ответ, практически не вызывая или вообще не вызывая аллергической реакции на основе 1дЕ. Такой полипептид может быть полезным для диагностики и/или терапии аллергии.

В контексте настоящего изобретения термин "сниженная аллергенность" означает, что этот вариант полипептида проявляет значительное сниженную аллергенную активность при анализе ίη νίΐτο или ίη νίνο, предназначенном для измерения такой аллергенности. Такие методы анализа хорошо известны в данной области и включают, к примеру, анализ высвобождения гистамина из базофилов у чувствительных к аллергену пациентов или на модели у животных, сенсибилизированных к природному аллергену, после обработки этим вариантом полипептида, и измерение гиперчувствительности дыхательных путей. Аллергенность также можно определять путем анализа 1дЕ-связывающей способности у варианта полипептида, к примеру, с использованием объединенной сыворотки больных, чувствительных к природному аллергену, методом иммуноанализа типа ЕЫ8А или КА8Т.

Выражение "сохраняет иммуногенность" (в любой грамматической форме) означает то, что вариант полипептида вызывает иммунный ответ не типа 1дЕ, который сопоставим с иммунным ответом не типа 1дЕ, вызванным природным аллергеном. Предпочтительно Ι§Οδ, вызываемые вариантом полипептида по изобретению, должны давать перекрестную реакцию с эпитопами, присутствующими на природном аллергене. Такой 1§С-ответ может блокировать связывание 1дЕ, тем самым уменьшая или предотвращая аллергические реакции на природный аллерген. Кроме того, вариант полипептида может вызвать анергию Т-клеток и другие иммунные реакции, подавляющие аллергию.

В частности, характеристиками, подлежащими модификации, могут быть свойства связывания с антителами у полипептида, такие, к примеру, как свойства связывания 1дЕ полипептидом. Такая модификация может осуществляться с использованием трехмерной структуры для идентификации потенциальных сайтов связывания антител типа 1дЕ (В-клеточных эпитопов) на поверхности молекулы с последующей заменой или модификацией одной или нескольких аминокислот идентифицированного сайта с тем, чтобы разрушить один или несколько эпитопов для 1дЕ.

Трехмерная структура полипептида может быть определена физическими методами, хорошо известными в данной области, в том числе рентгеновской кристаллографии, ЯМР-спектроскопии и электронной кристаллографии. Трехмерная структура полипептида также может быть выведена путем сравнения с гомологичным полипептидом, структура которого была установлена эмпирически физическим методом, как-то, к примеру, путем выравнивания и сравнения аминокислотных последовательностей.

Как правило, 1§Е-связывающие свойства варианта полипептида можно модифицировать с целью получения гипоаллергенных аллергенов, т.е. полипептидов с пониженной способностью вызывать нежелательную стимуляцию иммунной системы, в частности анафилактические реакции. В контексте изобретения выражение "снижение 1дЕ-реактивности" может означать то, что полипептид или антиген вызывает значительно меньший 1дЕ-преобладающий гуморальный иммунный ответ по сравнению с иммунным ответом, вызванным природным аллергеном, при измерении, к примеру, при анализе ίη νίΐτο на крови или плазме, взятой от чувствительного к аллергену пациента или от экспериментального животного после обработки. Такие анализы ίη νίΐτο хорошо известны в данной области и включают, к примеру, анализ высвобождения гистамина или такие методы иммуноанализа, как ЕЫ8А или КА8Т.

Например, полипептид по изобретению может быть гибридным полипептидом аллергена с пониженной аллергенностью, но сохраняющим иммуногенность в отношении природного аллергена, как описано в ЕР 1499349. Так, полипептид, проявляющий снижение 1дЕ-реактивности, может быть гибридным полипептидом аллергена АтЬ а X, содержащим эпитопный фрагмент природного аллергена АтЬ а X и каркасный белок, структурно гомологичный полипептиду аллергена АтЬ а X, причем гибридный полипептид имеет нативную конформацию, а пептидная последовательность эпитопа находится на выходящем на поверхность участке гибридного полипептида, соответствующем его положению в природном аллергене АтЬ а X.

Альтернативно, полипептид по изобретению может быть мутантом природного аллергена АтЬ а X, имеющим по меньшей мере четыре замены одного выходящего на поверхность аминокислотного остатка на другой остаток, причем данные замены взаимно разнесены по меньшей мере на 15 А и располагаются таким образом, что по меньшей мере один кольцевой участок поверхности площадью 800 А² не содержит

- 6 029703

мутаций. Способы получения данного мутанта описаны в ЕР 1373510.

В качестве альтернативы или в дополнение, подлежащей модификации характеристикой полипептида может быть его протеолитическая активность. Такая модификация может осуществляться путем изучения трехмерной структуры полипептида, определения области активного сайта молекулы и изменения её путем замены или химической модификации одной или нескольких аминокислот в области активного сайта. В частности, авторы изобретения показали, что ЛтЬ а X обладает функцией цистеиновой протеазы.

Таким образом, изобретение также касается варианта полипептида, содержащего или состоящего из варианта:

a) последовательности §ЕЦ ГО N0: 1 или

b) последовательности, по меньшей мере на 57% идентичной последовательности §ЕЦ ГО N0: 1 и обладающей такой же биологической активностью, что и полипептид с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 1, как определено выше,

причем данный вариант полипептида проявляет сниженную ферментативную активность по сравнению с полипептидом, определенным в а) или Ь), как надлежит.

В контексте настоящего изобретения выражение "сниженная ферментативная активность" означает, что полипептид или антиген проявляет значительно сниженную протеолитическую активность при анализе ίη νίίτο, предназначенном для измерения такой протеолитической активности. Такие методы анализа ίη νίίτο хорошо известны в данной области и включают, к примеру, зимограмму или анализ расщепления меченого синтетического субстрата. В частности, полипептид, проявляющий снижение ферментативной активности по изобретению, может содержать один или несколько мутированных цистеинов, располагающихся в каталитическом сайте и/или участвующих в его функции цистеиновой протеазы.

Каталитическая триада АтЬ а X состоит из аминокислот С₄₇, Н₁₈₁, Ν₂₀₂ в §ЕЦ ГО N0: 1. Таким образом, вариант полипептида, проявляющий снижение ферментативной активности по сравнению с полипептидом с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 1, предпочтительно получают путем модификации по меньшей мере одной аминокислоты в положении 47, 181 или 202 в §ЕЦ ГО N0: 1.

Вариант полипептида, как изложено здесь, предпочтительно проявляет сниженную аллергенность и сниженную ферментативную активность.

Полипептид по изобретению также может быть производным аллергена, таким, к примеру, как "аллергоид". Такой аллергоид может быть создан путем инкубации белка или полипептида по изобретению в присутствии сшивающих реагентов типа формальдегида или глутарового альдегида. Эти химические вещества реагируют с первичными аминогруппами на определенных аминокислотных остатках полипептида, что приводит к разрушению 3Ό и линейных эпитопов. Так, аллергоиды предпочтительно презентируются на антиген-представляющих клетках Т-клеткам и в меньшей степени В-клеткам по сравнению с природными аллергенами. Такая обработка также приводит к внутри- и межмолекулярным сшивкам, что ведет к образованию высокомолекулярных комплексов с пониженной способностью к связыванию 1дЕ и тем самым сводит к минимуму высвобождение медиаторов, вызывающих анафилаксию. Кроме того, процесс получения аллергоидов положительно влияет на стабильность экстрактов путем снижения собственной ферментативной активности экстрактов аллергена и снижения его склонности к деградации путем образования очень стабильных комплексов. Аллергоиды также можно получить путем термической или физической обработки белка или полипептида по изобретению, как описано в Реттейа с1 а1., Ιηйатт. А11егду Эгид ТагдеЪ 2006, 5:5-14; и Еддег еί а1., Ρτοηί Βίοδα. 2009, 1:77-90.

Любые фрагменты выделенного полипептида, содержащего или состоящего из: а) последовательности §ЕЦ ГО N0: 1 или Ь) последовательности, по меньшей мере на 57% идентичной последовательности §ЕЦ ГО N0: 1 и обладающей такой же биологической активностью, что и полипептид с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 1, или с) варианта последовательности, определенной в а) или Ь), проявляющего сниженную аллергенность или сниженную ферментативную активность по сравнению с последовательностью, определенной в а) или Ь), которые содержат по меньшей мере 250, предпочтительно 255, более предпочтительно 260 смежных аминокислот с последовательностью, определенной в а), Ь) или с), или являются эпитопными фрагментами последовательности, определенной в а), Ь) или с), также составляют часть настоящего изобретения.

В контексте изобретения "фрагмент" последовательности данного полипептида означает такую цепочку смежных аминокислот из последовательности данного полипептида, которая короче, чем полная последовательность полипептида. В частности, фрагмент может состоять по меньшей мере из 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35 или 40 последовательных аминокислот из последовательности данного полипептида. Предпочтительно фрагмент содержит не более 250, 200, 150, 100, 50 или 25 последовательных аминокислот из последовательности данного полипептида.

Фрагментом по изобретению, в частности, может быть эпитопный фрагмент полипептида по изобретению. В настоящем изобретении "эпитопный фрагмент" полипептида означает такую цепочку смежных аминокислот данного полипептида, которая распознается иммунной системой, а именно антителами, Β-клетками или Т-клетками, а предпочтительно 1дС или 1дЕ. Эпитопы можно картировать, к примеру, методами белковых микроматриц, ЕЫ8Р0Т или ЕЫ8А. "Эпитопный фрагмент" по изобретению означа- 7 029703

ет такую цепочку смежных аминокислот, которая распознается антителом против полипептида по изобретению. Как правило, эпитопы представляют собой пептиды длиной от 5 до 40 аминокислот, предпочтительно от 6 до 15 аминокислот, еще более предпочтительно от 8 до 11 аминокислот. В частности, эпитопный фрагмент может содержать или состоять из фрагмента последовательности ОЗАРОЗГОТОРМСОР (ЗЕЦ ГО N0:30), _в частности, содержать или состоять из фрагмента последовательности Ο8ΑΡΟ3ΙΟΤΟΡΝΚϋΡΙΥΑΝνΤΚΙΡΌ (ЗЕР ГО ΝΟ: 31).

Эпитопным фрагментом также может быть предсказанный эпитопный фрагмент, который может быть идентифицирован с помощью алгоритма прогнозирования эпитопов. Например, эпитопным фрагментом по изобретению может быть любой предсказанный эпитопный фрагмент, установленный с помощью алгоритма 8у1рейЫ, в частности, фрагмент одной из последовательностей 8ЕЦ ГО N0: 32-41, которые были установлены для молекул МНС II - ИЕЛГОКВ1*0101, ИЕЛГОКВ 1*0401 или ΙΙΙ.ΆЭКВ1*1501.

С другой стороны, фрагментом по изобретению может быть фрагмент калибровочного стандарта, применимый в качестве эталона для количественного определения аллергена методом массспектрометрии.

Под "выделенным" полипептидом имеется в виду то, что он больше не находится в своем естественном окружении в ЛтЬгоз1а аг1еш1зп1оНа. По отношению к полипептиду "очищенный" означает то, что данная молекула присутствует практически в отсутствие других биологических макромолекул того же типа. Термин "очищенный" в настоящем описании предпочтительно означает то, что присутствует по меньшей мере 75 мас.%, более предпочтительно по меньшей мере 85 мас.%, еще более предпочтительно по меньшей мере 95 мас.%, и наиболее предпочтительно по меньшей мере 98 мас.%, биологических макромолекул того же типа.

Полипептид по изобретению может быть получен любым хорошо известным способом. Например, полипептид по изобретению может быть очищен или выделен из натурального сырья из пыльцы амброзии или природных экстрактов аллергенов пыльцы амброзии. Сырье из пыльцы или экстракты аллергенов пыльцы могут быть получены любым способом, включающим экстрагирование аллергенов из пыльцы амброзии. В частности, сырье из пыльцы или экстракты аллергенов могут быть получены путем экстрагирования аллергенов из пыльцы водным раствором, напр., водным раствором бикарбоната, с последующим разделением, осветлением путем фильтрования и ультрафильтрацией через мембрану на 1-10 кДа с промывкой по меньшей мере 2,5 объемами очищенной воды или любым другим подходящим промывочным буфером.

Полученные при этом экстракты аллергенов могут быть подвергнуты дополнительной очистке, в особенности для уменьшения количества флавоноидов, содержащихся в экстрактах пыльцы, которые могут вызывать генотоксичность, в соответствии со способом, описанным в патентной заявке ΑΌ 2010/139809. Данный способ включает стадию ультрафильтрации экстракта аллергена через мембрану на 5-10 кДа, по меньшей мере 5 объемами, предпочтительно 10-30 объемами очищенной воды, необязательно содержащей буферный раствор типа раствора бикарбоната аммония или раствора с фосфатным буфером.

Экстракт аллергена естественным образом может содержать одну или несколько изоформ одного и того же аллергена. В предпочтительном воплощении аллерген находится в виде экстракта.

Полипептид также может быть химически синтезирован, в частности, если его длина не превышает, например, 50 аминокислот, еще более предпочтительно 40, 30 или 20 аминокислот.

Примерами технологий химического синтеза служат твердофазный синтез и синтез в жидкой фазе. При твердофазном синтезе, к примеру, аминокислота, соответствующая С-концу синтезируемого пептида, связывается с носителем, не растворимым в органических растворителях, и путем поочередного повторения реакций - одной, при которой аминокислоты с их аминогруппами и функциональными группами боковых цепей, блокированными соответствующими защитными группами, подвергаются конденсации одна за другой в порядке от С-конца к Ν-концу, и другой, при которой аминокислоты, связанные со смолой или защитными группами у аминогрупп пептидов, высвобождаются, при этом пептидная цепь таким образом удлиняется. Методы твердофазного синтеза в основном относятся к методам 1Вос и методам Тшос, в зависимости от типа защитной группы. Типичные защитные группы включают 1Вос (третбутоксикарбонил), С1-/ (2-хлорбензилоксикарбонил), Вг-Ζ (2-бромбензилоксикарбонил), Βζΐ (бензил), Тшос (9-фторенилметоксикарбонил), МЬй (4,4'-диметоксидибензгидрил), М1г (4-метокси-2,3,6триметилбензолсульфонил), Тг1 (тритил), Тоз (тозил), Ζ (бензилоксикарбонил), и Οζ-Βζΐ (2,6дихлорбензил) для аминогрупп; Ν0₂ (нитро) и Ртс (2,2,5,7,8-пентаметилхроман-6-сульфонил) для гуанидиногрупп; и ТЬи (трет-бутил) для гидроксильных групп. После синтеза требуемого пептида он подвергается реакции деблокирования и отрезается из твердой подложки. Такая реакция отрезания пептида может проводиться с помощью фтористого водорода или трифторметансульфоновой кислоты для метода Вос и ТТЛ для метода Ттос.

Способ получения пептидов необязательно может включать стадии химической модификации данного пептида для улучшения его стабильности и/или его биопроницаемости. Такие химические модификации направлены на получение пептидов с повышенной защитой от ферментативного расщепления ΐη

- 8 029703

νίνο и/или повышенной способностью к пересечению мембранных барьеров, тем самым увеличивая период их полураспада и сохраняя или улучшая их биологическую активность. В соответствии с настоящим изобретением можно использовать любые химические модификации, известные в данной области. Такие химические модификации включают, без ограничения:

модификации по Ν-концам и/или С-концам пептидов, такие, например, как Ν-концевое ацилирование (предпочтительно ацетилирование) или дезаминирование, либо модификации С-концевой карбоксильной группы в амидную или спиртовую группу;

модификации по амидной связи между двумя аминокислотами: ацилирование (предпочтительно ацетилирование) или алкилирование (предпочтительно метилирование) по атому азота или а-углерода амидной связи, соединяющей две аминокислоты;

модификации по а-углероду амидной связи, соединяющей две аминокислоты, такие, например, как ацилирование (предпочтительно ацетилирование) или алкилирование (предпочтительно метилирование) по а-углероду амидной связи, соединяющей две аминокислоты;

изменения хиральности, такие, например, как замена одной или нескольких природных аминокислот (Ь-энантиомеров) на соответствующие Ό-энантиомеры;

ретроинверсии, при которых одна или несколько природных аминокислот (Ь-энантиомеров) заменяются на соответствующие Ό-энантиомеры, вместе с инверсией аминокислотной цепи (с С-конца на Νконец);

азапептиды, у которых один или несколько а-атомов углерода заменены на атомы азота и/или бетапептиды, у которых аминогруппа одной или нескольких аминокислот связана с β-углеродом, а

не с а-углеродом.

Полипептид по изобретению также может быть рекомбинантным полипептидом, т.е. синтезированным рекомбинантными методами. В этом случае нуклеиновую кислоту, кодирующую данный полипептид (в дальнейшем именуется как "нуклеиновая кислота по изобретению"), клонируют в экспрессионный вектор. Нуклеиновая кислота по изобретению предпочтительно находится под контролем сигналов экспрессии (напр., промотора, терминатора и/или энхансера), что обеспечивает её экспрессию. Затем экспрессионный вектор вводится в клетку-хозяина (напр., бактериальные типа Е. сой, дрожжевые типа ΡίεΗ1а ра51оп5. растительные, клетки-хозяева из насекомых или млекопитающих), и полученные клеткихозяева культивируются в условиях, подходящих для экспрессии полипептида. Рекомбинантный аллерген обычно представляет собой только одну изоформу аллергена. В предпочтительном воплощении аллергеном является рекомбинантный аллерген. В предпочтительном воплощении аллергеном является рекомбинантный мутант с низким уровнем связывания 1дЕ.

Полипептид по изобретению может дополнительно включать в себя один или несколько тегов, которые могут облегчать его очистку.

Нуклеиновые кислоты, векторы, клетки-хозяева и методы получения полипептидов

Выделенная нуклеиновая кислота, которая содержит или состоит из последовательности, кодирующей полипептид по изобретению, такой, к примеру, как последовательность, кодирующая 8ЕО Ш N0: 1, последовательность, кодирующая аминокислоты 23-386 из 8Е0 Ш N0: 28, или последовательность, кодирующая 8Е0 Ш N0: 28, в частности, данная последовательность, содержащая или состоящая из 8ЕБ ΙΌ N0: 29, также является частью изобретения. Вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид по изобретению, функционально связанную с элементами, контролирующими экспрессию, и клетки-хозяева, содержащие данный вектор, также являются частью изобретения.

Выделенные нуклеиновые кислоты по изобретению, которые также именуются полинуклеотидами, могут представлять собой молекулы ДНК или РНК, кодирующие определенный выше полипептид, с учетом вырожденности генетического кода. Они могут быть получены стандартными методами, хорошо известными специалистам в данной области, такими как амплификация или полимеризация ДНК ίη νίίτο, синтез генов ίη νίίτο, лигирование олигонуклеотидов или же комбинации этих методов.

Нуклеиновые кислоты по изобретению предпочтительно находятся в выделенном или очищенном виде. "Очищенный" и "выделенный" имеют такие же значения, как определено выше.

Как должно быть понятно специалистам, в некоторых случаях может быть выгодным получение нуклеотидных молекул, кодирующих полипептид, обладающих такими кодонами, которые не встречаются в природе в кодируемом полипептиде. Например, можно выбрать кодоны, предпочтительные у определенных прокариотических или эукариотических клеток-хозяев, чтобы увеличить скорость экспрессии рекомбинантного полипептида. Также может быть выгодным, к примеру, использовать сайтнаправленный мутагенез для изменения сайтов ^гликозилирования, активных центров ферментов, Вили Т-клеточных эпитопов, в том числе эпитопов связывания с 1дЕ. В частности, авторы изобретения показали наличие уникального сайта ^гликозилирования в положении Ν₉ (нумерация по последовательности зрелого белка 5>Е0 ГО N0: 1).

Нуклеиновая кислота по настоящему изобретению также может включать последовательности, кодирующие теги, белки-носители, сигнальные пептиды либо нетранслируемые или нетранскрибируемые

- 9 029703

последовательности, повышающие экспрессию или увеличивающие стабильность молекулы.

Изобретением также предусмотрены последовательности нуклеиновых кислот, которые гибридизуются с последовательностями, кодирующими ЛтЬ а X, или комплементарными им последовательностями, при стандартных условиях гибридизации, предпочтительно условиях высокой жесткости.

Молекула нуклеиновой кислоты "гибридизуется" с другой молекулой нуклеиновой кислоты, если одноцепочечная форма молекулы нуклеиновой кислоты гибридизуется с другой молекулой нуклеиновой кислоты при соответствующих условиях температуры и ионной силы раствора (см. §атЬтоок с1 а1., 1989). Условия температуры и ионной силы определяют "жесткость" гибридизации. Для гибридизации нужно, чтобы две нуклеиновые кислоты содержали комплементарные последовательности, хотя в зависимости от жесткости гибридизации возможно и несоответствие между основаниями. Надлежащая жесткость для гибридизации нуклеиновых кислот зависит от длины нуклеиновых кислот и степени комплементарности, т.е. переменных, хорошо известных в данной области. Для гибридов длиной более 100 нуклеотидов были выведены уравнения для расчета Тт (см §атЬтоок с1 а1., 8ирга, 9.50-9.51). Минимальная длина для гибридизующейся нуклеиновой кислоты составляет по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 нуклеотидов; предпочтительно по меньшей мере 20, 21, 22, 23, 24, 25 нуклеотидов; более предпочтительно она составляет по меньшей мере 26, 27, 28, 29, 30 нуклеотидов.

В одном воплощении термин "стандартные условия гибридизации" означает Тт 55°С при использовании вышеприведенных условий. В предпочтительном воплощении Тт составляет 60°С или еще более предпочтительно 65°С. В одном воплощении "высокая жесткость" означает условия гибридизации и/или промывки при 68°С в 0,2х§§С, при 42°С в 50% формамиде, 4х§§С, либо в таких условиях, которые дают уровни гибридизации, эквивалентные тем, что наблюдаются при любом из этих двух условий.

В частности, гибридизуемые нуклеиновые кислоты по изобретению могут представлять собой праймеры или зонды. Таким образом, изобретение также касается праймеров и зондов, которые гибридизуются с нуклеиновой кислотой по изобретению в условиях гибридизации высокой жесткости.

В настоящем изобретении термины "праймер" и "зонд" относятся к функции нуклеиновой кислоты. Праймер представляет собой олигонуклеотид, используемый для амплификации заданной последовательности, как правило, путем наращивания олигонуклеотида после гибридизации с заданной последовательностью или путем лигирования нескольких олигонуклеотидов, которые будут смежными при гибридизации с заданной последовательностью. Олигонуклеотидный зонд применяется для захвата или обнаружения искомой последовательности, с которой он гибридизуется. Однако один и тот же олигонуклеотидный зонд может функционировать и в качестве праймера. Поэтому следует иметь в виду, что любая из последовательностей, приведенных здесь для амплификации, детектирования или количественного определения нуклеиновой кислоты, может использоваться и в качестве гибридизационного зонда, и в качестве праймера для детектирования или амплификации.

Праймеры и зонды по изобретению преимущественно используются для амплификации нуклеиновой кислоты, такой, напр., как нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по изобретению. Данные праймеры и зонды также могут использоваться для детектирования последовательностей нуклеиновых кислот, гомологичных нуклеиновой кислоте по изобретению, у других видов растений, чем ЛтЬгома аПстРиГоНа. в частности, у родственных видов растений.

Такими праймерами могут быть, к примеру, праймеры, состоящие из последовательности, выбранной из группы, состоящей из δΕφ ΙΌ N0: 2-26.

Праймер или зонд по изобретению может по возможности содержать дополнительные последовательности, соединенные с 5'- и/или З'-концом последовательности, гибридизующейся с нуклеиновой кислотой по изобретению, как-то метящие молекулы. Такие олигонуклеотиды все же способны гибридизироваться в условиях высокой жесткости с комплементарными нуклеиновыми последовательностями по изобретению. Например, эти дополнительные последовательности могут служить в качестве спейсера, линкера или последовательности для мечения или связывания фермента.

Мечение зонда особенно предпочтительно для облегчения обнаружения амплифицируемой нуклеиновой кислоты при реакции амплификации/обнаружения в "реальном времени", т.е. в процессе ПЦР, при этом искомая последовательность детектируется и/или количественно определяется во время протекания реакции амплификации. Для этой цели могут применяться стандартные метящие реагенты (например, ферменты, радиоактивные или флуоресцентные молекулы).

Такое детектирование может осуществляться, к примеру, по технологии Мо1еси1аг Веасоп для нуклеиновых кислот (Туаф апй Кгатег, 1996; Сауоиейе е1 а1., 1999). Согласно технологии Мо1еси1аг Веасоп, к каждому концу последовательности зонда присоединяется либо флуорофор, либо гаситель. В отсутствие искомой нуклеиновой кислоты концевые последовательности гибридизуются друг с другом с образованием структуры типа петли и шпильки с ножкой, которая сводит вместе флуорофор и гаситель. При контакте с искомой нуклеиновой кислотой комплементарные последовательности зонда и последовательность мишени будут гибридизироваться. Поскольку шпилька с ножкой не может сосуществовать с жесткой двойной спиралью, образующейся при гибридизации, то происходит конформационное изменение, которое отводит концевые последовательности друг от друга и разделяет флуорофора и гасителя. При разделении флуорофора и гасителя детектируется флуоресцентный сигнал.

- 10 029703

Можно использовать все красители и гасители, известные в данной области. В соответствии с изобретением, краситель предпочтительно выбирается из группы, состоящей из Рат, Те!, Нех, Татга, Техак Кеб и Су5, а гаситель предпочтительно выбирается из группы, состоящей из ОаЬеу1. Есйрке Эагк Оиепекег и В1аск Но1е Онепскегк. Такие молекулы легко доступны от Еигодеи!ес, Вюкеатсй Тескио1оду, РтоНд.

Как правило, нуклеиновая кислота по изобретению включается в какой-нибудь подходящий вектор типа плазмиды, космиды, эписомы, искусственной хромосомы, фагового или вирусного вектора.

Термины "вектор", "клонирующий вектор" и "экспрессионный вектор" означают носители, с помощью которых последовательность ДНК или РНК (например, чужеродный ген) может быть введена в клетку-хозяина с тем, чтобы трансформировать хозяина и способствовать экспрессии (например, транскрипции и трансляции) введенной последовательности.

Экспрессирующий вектор по изобретению может содержать функциональную экспрессионную кассету, которая также является объектом настоящего изобретения. Экспрессионная кассета содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид по изобретению, которая функционально связана с элементами, необходимыми для её экспрессии. Такой вектор предпочтительно содержит последовательность промотора, сигналы для инициации и терминации трансляции, а также соответствующие участки для регуляции трансляции типа промотора, энхансера, терминатора и т. п., которые вызывают или направляют экспрессию данного полипептида при введении субъекту. Примеры промоторов и энхансеров, используемых в экспрессионных векторах для животных клеток, включают ранний промотор и энхансер 8У40 (Μί/икат! Т. е! а1., 1987), промотор и энхансер ЬТК из вируса лейкоза мышей Мо1оиеу (Кюуапа Υ. е! а1., 1987), промотор (Макои ГО е! а1., 1985), и энхансер (Сййек δΌ е! а1., 1983) Нцепи иммуноглобулина и др.

Введение такого вектора в клетку-хозяина может быть кратковременным или стабильным. Вектор также может содержать последовательности, кодирующие специфические сигналы, которые запускают секрецию транслируемого белка или его таргетинг в клеточные компартменты или органеллы (напр., аппарат Гольджи, эндосомы, периплазму). Эти различные контролирующие сигналы выбирают в соответствии с клетками хозяина и могут быть вставлены в векторы, которые самореплицируются в клетках хозяина, или в векторы, которые встраиваются в геном данного хозяина.

Можно использовать любые экспрессирующие векторы для клеток животных. Примеры подходящих векторов включают рЛСЕ107 (М1уац Н. е! а1., 1990), рЛСЕ103 (М|/икат1 Т. е! а1., 1987), рН§С274 (Вгабу С е! а1., 1984), рКСК (О'Наге К. е! а1., 1981), р§С1 Ье1а й2-4-(М1уац Н. е! а1., 1990) и др.

Примеры плазмид включают реплицирующиеся плазмиды, содержащие начало (огтд1и) репликации, или встраивающиеся плазмиды, такие, к примеру, как рИС, рсПМЛ, рВК и др.

Примеры вирусных векторов включают аденовирусные, ретровирусные, герпесвирусные и векторы на основе АЛУ. Такие рекомбинантные вирусы могут быть получены методами, известными в данной области, как-то путем трансфекции упаковочных клеток или путем кратковременной трансфекции с хелперными плазмидами или вирусами. Типичные примеры упаковочных клеток для вирусов включают клетки РА317, клетки РкГОКТР, клетки СРеиу+, клетки 293 и др. Подробные методики для получения таких дефектных по репликации рекомбинантных вирусов приведены, к примеру, в АО 95/14785, АО 96/22378, И8 5882877, υδ 6013516, υδ 4861719, υδ 5278056 и АО 94/19478.

Следующим объектом настоящего изобретения являются клетки, которые были трансфецированы, инфицированы или трансформированы нуклеиновой кислотой и/или вектором по изобретению. Следовательно, настоящее изобретение также касается клеток-хозяев, содержащих нуклеиновую кислоту и/или вектор по изобретению, а также потомства и/или производных таких клеток-хозяев.

Термин "трансформация" означает введение "чужеродного" (т.е. гетерологичного) гена, последовательности ДНК или РНК в клетку-хозяина с тем, чтобы клетка-хозяин экспрессировали введенный ген или последовательность и вырабатывали требуемое вещество, как правило, белок или фермент, кодируемый введенным геном или последовательностью.

Нуклеиновые кислоты по изобретению могут использоваться для получения рекомбинантного полипептида по изобретению в подходящей системе экспрессии. Термин "система экспрессии" обозначает клетку-хозяина и совместимый вектор при подходящих условиях, например, для экспрессии белка, кодируемого чужеродной ДНК, которая переносится вектором и вводится в клетку-хозяина.

Клетки-хозяева могут быть прокариотическими или эукариотическими, в том числе, но без ограничения, бактерии, дрожжевые, клетки растений, клетки животных, клетки насекомых, клетки млекопитающих, включая клеточные линии, которые имеются в продаже. Предпочтительными примерами экспрессирующих хозяев являются ЕксйейсЫа сой, Тас!оЬасйй, пробиотические бактерии, РюЫа ракййк, δ;·ι^1ι;·ιΐΌΐη\^5 сегеу151ае, клетки насекомых, клетки растений, в частности растений табака, клетки СОδ и клетки СНО.

Распространенные системы экспрессии включают клетки-хозяева Е. сой и плазмидные векторы, клетки-хозяева насекомых и векторы из ВасЫоуиик, и клетки-хозяева и векторы млекопитающих. Конкретные примеры включают клетки Е. сой, дрожжей К1иууеготусек или δассйа^отусе5, линии клеток млекопитающих (например, клетки Уего, клетки СНО, клетки 3Т3, клетки СОδ и др.), а также первичные

- 11 029703

или устоявшиеся культуры клеток млекопитающих (например, полученные из лимфобластов, фибробластов, эмбриональных клеток, эпителиальных клеток, нервных клеток, адипоцитов и др.). Примеры также включают мышиные клетки 8Р2/0-А§14 (АТСС СКЫ581), мышиные клетки Р3Х63-А§8.653 (АТСС СКЫ580 Р3Х63-А§8.653 (АТСС СКЫ580), клетки СНО с дефектным геном дигидрофолатредуктазы (в дальнейшем именуется "ген ЭНРР") (Иг1аиЬ О. с1 а1., 1980)), крысиные клетки УВ2/3НБ.Р2.С11.16А§.20 (АТСС СКЫ662, в дальнейшем именуются "клетки ΥΒ2/0") и др.

Трансфекция клеток хозяина может осуществляться любым стандартным методом, таким как химическая трансформация, электропорация, осаждение фосфатом кальция или липофекция.

Настоящее изобретение также касается способа получения полипептида по изобретению, который включает:

a) культивирование клеток хозяина по изобретению в условиях, подходящих для экспрессии полипептида по изобретению; и

b) выделение экспрессированного полипептида.

Затем рекомбинантный полипептид может быть очищен с помощью хорошо известных процедур очистки: он может быть очищен из лизатов или клеточных экстрактов, телец включения или из супернатанта культуры такими методами, как хроматография НРЬС, иммуноаффинные методы со специфичными антителами и др.

С другой стороны, полипептид по изобретению может быть экспрессирован ίη νίίτο в бесклеточной системе транскрипции и трансляции из ДНК или РНК матрицы, содержащей необходимые элементы для его экспрессии, в клеточном лизате или в реконструированной системе (к примеру, КарМ Тгапйабоп 8у§1ст®. КосЬе Οίαβηοδίίοδ. или Кейс БуъаЮ 1УТ™. АтЬюп).

Изобретение также касается организмов, предпочтительно растений, например, растений табака, в геном которых встроена, предпочтительно в стабильной форме, молекула нуклеиновой кислоты по изобретению под контролем регулирующей последовательности таким образом, чтобы полипептид по изобретению экспрессировался в растениях или в заданной части растения, такой как плоды, семена, зерна, пыльца, листья или клубни. Организм по изобретению может быть представлен, к примеру, полевыми культурами (пшеница, рапс, подсолнечник, горох, соя, ячмень, кукуруза и т. д.) или овощами или цветами. Трансгенные растения по изобретению могут быть получены путем трансформации растительных клеток молекулой нуклеиновой кислоты, а затем регенерации растения из трансформированных клеток.

Изобретение также касается способа получения ίη νίνο полипептида, определенного в любом из пп.1-3, который включает:

a) культивирование растений, трансформированных нуклеиновой кислотой по изобретению или вектором по изобретению, в таких условиях и в течение такого времени, которое достаточно для экспрессии данного полипептида, и

b) выделение полипептидов, полученных из трансформированных организмов. Нуклеиновая кислота по изобретению может быть вставлена в конструкцию из нуклеиновой кислоты, именуемую "экспрессионная кассета", и функционально связана с элементами, способствующими её экспрессии и необязательно её регуляции. Среди этих элементов можно привести промоторы, активаторы и терминаторы транскрипции.

Предпочтительно применяются конститутивные промоторы, такие как промотор актина риса, с последующим интроном актина риса (КАР-КА1), содержащиеся в плазмиде рАсН-Р4, или промотор 358, либо тканеспецифичные промоторы. В качестве примера можно привести промотор пшеницы НМ\УО или промотор гена круциферина редьки, РСКИ, которые оба позволяют экспрессировать нужный белок в семенах. При этом предпочтительно применяются последовательности промоторов, индуцирующих экспрессию в водных условиях. Среди терминаторов, которые можно использовать в конструкциях по изобретению, можно привести, в частности, 3'-конец гена нопалинсинтазы АдтоЬас1егшт ШтеГааещ. Также можно привести терминатор полиА 358 вируса мозаичности цветной капусты (СаМУ).

Экспрессия полипептида по изобретению также может регулироваться с помощью таких последовательностей, как сигналы адресации пептидов (сигналы адресации для хлоропластов, сигналы адресации для вакуолей, сигналы адресации для эндоплазматического ретикулума и др.), или таких, как последовательности интронов, энхансеров или лидерные последовательности.

Экспрессионная кассета может быть вставлена в нуклеотидный вектор типа плазмиды, которая также может содержать ген маркера, к примеру, гена, позволяющего проводить отбор между трансформированными растениями и растениями, не содержащими трансфецированной чужеродной ДНК. В качестве маркерного гена можно привести гены, придающие устойчивость к антибиотикам, например, к гигромицину, или устойчивость к гербицидам типа сульфонамида асулама.

Такой вектор или любая последовательность, кодирующая полипептид по изобретению, может использоваться для трансформации растительных клеток по методикам, хорошо известным специалистам, а затем из трансформированных клеток можно регенерировать растения, экспрессирующие полипептид по изобретению.

Растительные клетки можно трансформировать вектором, как определено выше, перенести в клетки-хозяева, способные инфицировать данные клетки путем встраивания в их геном нуклеотидных после- 12 029703

довательностей, представляющих интерес, первоначально содержащихся в геноме данного вектора. Предпочтительно в качестве клеток хозяина используются бактериальным штаммы типа АдгоЪасЮгшт 1нте£ас1еп8, в частности, в соответствии со способом, описанным в статье Ап е! а1. (1986), или же АдгоЪас!етшт г1н/одепс5. в частности, в соответствии со способом, описанным в статье Сиегске е! а1. (1987).

Например, растительные клетки можно трансформировать путем переноса Т-области внехромосомной, кольцевой, маркирующей опухоли плазмиды Τι АдтоЪас1егшт ЩтеГааещ с помощью бинарной системы (ХУаЬоп е! а1., 1994). Для этого конструируют два вектора. В одном из них Т-область удаляют путем делеции, за исключением левой и правой границ, а между ними вставляют маркерный ген с тем, чтобы проводить отбор растительных клеток. Другим партнером бинарной системы является вспомогательная плазмида Τι, то есть модифицированная плазмида, которая не содержит Т-область, но все еще содержит гены вирулентности νίτ, необходимые для трансформации растительных клеток.

Можно использовать метод, описанный ЪЫба е! а1. (1996) для трансформации однодольных растений.

Также можно использовать методы прямого переноса генов в клетки растений, такие как прямая микроинъекция в эмбриоиды растений (ЫеиЬаик е! а1., 1987), инфильтрация под вакуумом (ВесШоИ е! а1., 1993) или электропорация (Скиреаи е! а1., 1989), либо прямое осаждение с помощью ПЭГ (Зскоскет е! а1., 1986) или бомбардировка частицами, покрытыми данной плазмидной ДНК, с помощью "пушки" для частиц (М. Рготт е! а1., 1990).

По другой методике трансформация проводится в соответствии с методом, описанным Ршет е! а1. (1992), с помощью "пушки" для частиц из вольфрама или золота.

В частном случае экспрессии рекомбинантных полипептидов в клетках растений табака проводится отбор клеток, экспрессирующих нужный полипептид, методом иммунодетекции с помощью антител по изобретению. Рекомбинантные полипептиды локализуются путем фракционирования клеток. Затем проводится их очистка из суспензий трансгенных клеток методом иммунодетекции с помощью антител по изобретению. Способ в соответствии с изобретением также может включать структурный и иммунологический анализ полученных полипептидов.

Изобретением также предусмотрены трансгенные млекопитающие, кроме человека, в геном которых встроены, предпочтительно в стабильной форме, молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, поставленные под контроль регуляторной последовательности таким образом, чтобы экспрессировался полипептид по изобретению. Предпочтительно трансгенные животные по изобретению экспрессируют полипептид по изобретению в своем молоке. Например, трансгенное животное по изобретению может содержать трансген, включающий нуклеиновую кислоту по изобретению, функционально связанную по меньшей мере с одной регуляторной последовательностью, способствующей экспрессии нуклеиновой кислоты по изобретению в клетках молочной железы трансгенного животного, и нуклеиновую кислоту, кодирующую сигнальный пептид, функционирующий в секреторных клетках молочных желез трансгенного млекопитающего по изобретению. У взрослых особей млекопитающего или у женских потомков трансгенного млекопитающего трансген способен экспрессировать рекомбинантный полипептид по изобретению в клетках молочной железы и вырабатывать такую форму полипептида по изобретению, которая секретируется секреторными клетками молочной железы в молоко трансгенного млекопитающего. Далее секретируемый полипептид по изобретению может быть очищен из молока.

Таким образом, изобретение также касается способа получения ш νίνο полипептида, определенного в любом из пп.1-3, который включает:

a) разведение трансгенных млекопитающих, трансформированных нуклеиновой кислотой по изобретению или вектором по изобретению, в таких условиях и в течение такого времени, которое достаточно для экспрессии данного полипептида, и

b) выделение полипептидов, полученных из трансформированных организмов.

Антитела и их применение

Настоящее изобретение также касается выделенных антител, которые специфически связываются с полипептидом по изобретению.

В настоящем изобретении термины "антитело" и "иммуноглобулин" имеют одинаковые значения и применяются в самом широком смысле, а конкретно охватывают интактные моноклональные антитела, поликлональные антитела, химерные, гуманизированные или человеческие антитела, диатела, мультиспецифичные антитела (напр., биспецифичные антитела), полученные из по меньшей мере двух интактных антител, а также фрагменты антител.

В частности, антитела по изобретению могут содержаться в антисыворотке.

В частности, изобретение касается антител, направленных против последовательности 8ЕО ГО N0: 30 или против последовательности 8Е0 ГО N0: 31, или же против любого из эпитопных фрагментов, идентифицированных по алгоритму ЗуГрейЫ, в частности, фрагментов одной из последовательностей 9ЕС ГО N0: 32-41.

У природных антител две тяжелые цепи соединяются друг с другом дисульфидными связями, а также каждая тяжелая цепь соединяется с легкой цепью дисульфидной связью. Существует два типа легких цепей: лямбда (λ) и каппа (к). Существует пять основных классов (или изотипов) тяжелых цепей,

- 13 029703

которые определяют функциональную активность молекул антител: 1дМ. Ι§Ό. 1дС. 1дА и 1дЕ. Каждая цепь содержит особые домены последовательности. Легкая цепь включает два домена: вариабельный домен (У_ь) и константный домен (С_ъ). Тяжелая цепь включает четыре домена: один вариабельный домен (У_н) и три константных домена (С_н1. С_н2 и С_н3. которые собирательно именуются С_н). Вариабельные области легкой (У_ъ) и тяжелой (У_н) цепей определяют антигенсвязывающий сайт. а тем самым распознавание и специфичность к антигену. Домены константной области легкой (Сь) и тяжелой (С_н) цепей придают такие важные биологические свойства. как ассоциация цепей антител. секреция. трансплацентарная мобильность. связывание комплемента и связывание с Ре-рецепторами (РсК). Фрагмент Ρν является Νконцевой частью РаЬ-фрагмента иммуноглобулина и состоит из вариабельных участков одной легкой цепи и одной тяжелой цепи.

Термин "моноклональное антитело" или "тАЬ" в настоящем изобретении обозначает молекулы антитела одного аминокислотного состава. которые направлены против конкретного антигена и вырабатываются одним клоном В-клеток или гибридомы. Моноклональные антитела также могут быть рекомбинантными. т.е. полученными методами белковой инженерии. Рекомбинантные антитела могут вырабатываться в линии клеток млекопитающих типа СнО. N80. РЕКС6 или любых других клеток после трансфекции.

Термин "поликлональные антитела" обозначает комбинации иммуноглобулинов. направленных против конкретного антигена. причем каждый иммуноглобулин может связываться с различными эпитопами на антигене. Поликлональные антитела обычно получают путем иммунизации подходящих млекопитающих. как-то мышей. кроликов или коз.

Термин "химерное антитело" обозначает искусственные антитела. которые включают домен У_н и домен У_ъ антитела. полученного из другого животного. чем человек. в сочетании с доменом С_н и доменом Сь из другого антитела. в частности. антитела человека. Другими животными. чем человек. могут быть мыши. крысы. хомяки. кролики и пр.

Выражение "биспецифичное антитело" относится к искусственным антителам. обладающим двумя разными антигенсвязывающими участками. В предпочтительном воплощении изобретения по меньшей мере одна СЭЗ-связывающая молекула и по меньшей мере одна нЬА-ОК-связывающая молекула по изобретению являются биспецифическими антителами. способными связываться с СЭ5 и нЬА-ЭК.

Термин "диатела" относится к небольшим фрагментам антител с двумя антигенсвязывающими сайтами. причем эти фрагменты содержат вариабельный домен тяжелой цепи (У_н). соединенный с вариабельным доменом легкой цепи (У_ъ) в одной и той же полипептидной цепи (У_н-У). В общем. с помощью такого линкера. который слишком короткий. чтобы позволить спаривание между двумя доменами на одной и той же цепи. домены вынуждены спариваться с комплементарными доменами другой цепи и создавать два антиген-связывающих сайта. Предпочтительно диатела способны распознавать СЭ5 и нЬА-ΌΚ.

Выражение "гуманизированное антитело" предпочтительно относится к таким антителам. у которых каркасные или "определяющие комплементарность участки" (СОК) модифицированы так. чтобы они содержали СОК из донорского иммуноглобулина с другой специфичностью по сравнению с исходным иммуноглобулином. В предпочтительном воплощении в каркасную область антитела человека вставляют СОК мыши. получая "гуманизированное антитело". Антитела по изобретению предпочтительно являются "гуманизированными антителами".

Выражение "человеческое антитело" предпочтительно относится к полностью человеческим антителам. которые были 1) получены путем иммунизации у мышей с репертуаром генов иммуноглобулина человека или 2) получены путем иммунизации у различных линий иммунодефицитных мышей. восполненных иммунными/гемопоэтическими клетками человека. либо 3) к антителам человека. выделенным из В-клеток иммунизированных лиц и трансформированных ЕВУ. или 4) полученным из комбинации генов. полученных из библиотек У_н и У_ъ человека.

Выражение "фрагменты антител" охватывает части интактных антител. предпочтительно антигенсвязывающие или вариабельные области интактных антител. Примеры фрагментов антител включают Ρν. РаЬ. Р(аЬ')₂. РаЬ'. άδΡν. 8сΡν. δ^Ρν)₂. диатела и мультиспецифичные антитела. образованные из фрагментов антител.

Другой аспект настоящего изобретения касается способа обнаружения полипептида по изобретению в образцах ίη νίΐΓΟ. который включает следующие стадии:

a) инкубации образца с антителом по изобретению;

b) детектирования наличия или отсутствия иммунных комплексов. содержащих данное антитело; причем наличие иммунных комплексов. содержащих данное антитело. является показателем присутствия полипептида по изобретению в данном образце.

"Образцом" может быть экстракт аллергена. в частности экстракт аллергена пыльцы амброзии. или фармацевтическая композиция. которая может содержать полипептид по изобретению и может предназначаться для диагностики и/или профилактики или лечения аллергии. В частности. фармацевтическая композиция может содержать полипептид по изобретению. полученный рекомбинантным методом.

Специалисты могут использовать любой подходящий качественный или количественный метод. из- 14 029703

вестный в данной области, для выявления наличия или отсутствия иммунных комплексов. В частности, "детектирование наличия иммунных комплексов, содержащих антитело по изобретению" может означать определения уровня, т.е. измерение количества или концентрации полипептида по изобретению в образце.

Такие иммунные комплексы можно легко обнаружить, к примеру, с помощью вторичного антитела, являющегося антителом против иммуноглобулина.

Анализ может проводиться путем иммобилизации полипептида на твердой фазе или же с полипептидом в жидкой фазе.

Для оценки аллергенной активности водного препарата аллергена, например, для стандартизации препаратов экстракта аллергена, может применяться метод "непрямого ΚΑδΤ" или "ингибирования ΚΑδΤ". При таком непрямом ΚΑδΤ связывание аллерген-специфичного 1дЕ с аллергенами в твердой фазе ингибируется добавлением свободного аллергена в исследуемый раствор. Степень ингибирования может затем использоваться для измерения биологической активности, проявляемой свободным аллергеном (Рийопеи е! а1., С1ш А11егду 1981, 11(2): 139-45). Принцип метода ΚΑδΤ более подробно описан в разделе "Диагностическое применение".

В методе "ΑΙΚΑδΤ" (ΚΑδΤ с гидроксидом алюминия) твердофазный сорбент заменен гелем гидроксида алюминия, при этом устраняется ковалентное связывание, используемое при обычном ΚΑδΤ. Такой метод может с успехом применяться тогда, когда ковалентное связывание аллергена с твердофазным сорбентом может маскировать некоторые его антигенные детерминанты (РоиКеи е! а1., А11егду 1985, 40(6): 405-16).

В частности, "детектирование наличия или отсутствия иммунных комплексов, содержащих данное антитело" может включать стадии определения уровня иммунных комплексов, содержащих антитело по изобретению, и сравнение данного уровня с контрольным уровнем.

Кроме того, настоящим изобретением также предусмотрен способ количественного определения иммунологической активности экстракта аллергена или препарата вакцины против аллергии.

Например, для стандартизации препаратов аллергена может применяться метод "ингибирования ΚΑδΤ". Могут быть установлены тест-системы в сочетании с исследованием иммунологической активности контрольного препарата аллергена.

Таким "контрольным препаратом аллергена" может быть, к примеру, экстракт аллергена, препарат вакцины против аллергии или препарат для количественной кожной пробы у 20 аллергических пациентов с подтвержденной историей аллергического заболевания. Затем можно исследовать сыворотки этих пациентов, чтобы установить, что они охватывают весь спектр чувствительности к аллергену и могут быть использованы для создания пула сыворотки, который вместе с контрольным препаратом аллергена составит основу тест-системы.

Затем можно оценить иммунологическую активность исследуемого экстракта аллергена или препарата вакцины против аллергии и стандартизировать относительно контрольного препарата с помощью тест-системы. Относительная активность, к примеру, может определяться по значениям 50%-го ингибирования. Параллельные линии регрессии могут служить одним из признаков того, что препараты содержат сопоставимые спектры аллергенных детерминант.

Экстракт аллергена или препарат вакцины против аллергии для анализа, в частности, может включать физически модифицированный аллерген после адсорбции на таких носителях, как гидроксид алюминия и фосфат кальция, или рецептурный аллерген, например, после инкапсуляции в микрочастицы. Иммунологическая активность данного экстракта или препарата может определяться непосредственно по ингибированию ΚΑδΤ, которое служит признаком гиперэкспрессии 1дЕ-связывающих эпитопов. В частности, препарат можно сравнить с экстрактом немодифицированного аллергена или препаратом, стандартизированным относительно контрольного препарата природного аллергена, а затем повторно оценивать через определенные промежутки времени для проверки на стабильность. Относительная активность модифицированного препарата может оказаться меньше, чем у исходного материала, но это может объясняться стерическими препятствиями при связывании эпитопов с твердой фазой.

Кроме того, активность экстрактов или препаратов, содержащих химически модифицированные аллергены, также можно оценить по ингибированию ΚΑδΤ в целях контроля качества. Например, обработка формальдегидом экстрактов или препаратов аллергена может привести к существенному снижению 1дЕ-связывающей способности, напр., от 50 до 1000 раз в зависимости от экстракта аллергена. Таким образом, ингибирование ΚΑδΤ может использоваться для оценки стабильности химической модификации, так как увеличение 1дЕ-связывающей активности со временем может свидетельствовать об обращении химической модификации.

Далее, настоящим изобретением также предусмотрен способ количественного определения полипептида по изобретению в образцах ίη νίίτο, который включает следующие стадии:

a) обеспечение известного количества полипептида, определенного в п.1, необязательно помеченного, в качестве калибровочного стандарта;

b) деградирование образца, содержащего определяемый полипептид, с получением смеси полипептидов, необязательно помеченных;

- 15 029703

причем, по крайней мере, полипептиды в деградируемом образце или в калибровочном стандарте помечены, а если помечены оба полипептида, то метящий реагент, используемый для полипептидов в калибровочном стандарте, отличается от метящего реагента, используемого для полипептидов в деградируемом образце,

с) количественная оценка абсолютного количества полипептида по изобретению в образце путем сопоставления количества полипептида в калибровочном стандарте с количеством соответствующего полипептида в деградированном образце методом масс-анализа.

Стадия количественного измерения, к примеру, может выполняться методом масс-спектрометрии, введение метки, к примеру, может осуществляться методом 1ТРЛС'™. а стадия деградирования, к примеру, может выполняться с помощью такого протеолитического фермента, как трипсин, папаин, пепсин, АКСС, ЬукС, протеаза У8, Акр^ проназа, химотрипсин или карбоксипептидаза С, либо их комбинации, как описано в \У0 2007/031080.

Полипептидом калибровочного стандарта может быть полипептид с аминокислотной последовательностью, идентичной последовательности либо вариабельной, либо константной области у группы изоаллергенов или гомологичных аллергенов, в зависимости от того, будет ли он использоваться для количественного определения аллергена, состоящего из более чем одного изоаллергена или гомологичных аллергенов, или же определенного аллергена или изоаллергена. При количественном определении абсолютного количества аллергена в образце, полипептидом калибровочного стандарта может служить участок аминокислотной последовательности константной области, т.е. идентичной у той группы изоаллергенов или гомологичных аллергенов, которая подлежит определению. При количественном анализе определенного аллергена или изоаллергена в образце, полипептидом калибровочного стандарта может служить участок аминокислотной последовательности вариабельной области, т. е. уникальной для того изоаллергена или аллергена, который подлежит определению.

Полипептид для калибровочного стандарта предпочтительно получают методом пептидного синтеза. Количество аминокислот у пептида для калибровочного стандарта аллергена предпочтительно составляет 2-20 аминокислот, более предпочтительно 4-15 и наиболее предпочтительно 6-15 аминокислот. Это количество зависит от оптимального сайта ферментативного расщепления, совпадающего с аминокислотной последовательностью в образце, т.е. последовательности константной или вариабельной области, при расщеплении образца ферментом. Кроме того, калибровочный стандарт аллергена зависит от метки и используемого способа количественного определения с тем, чтобы получить детектируемый сигнал и четкую фрагментацию при анализе на приборе для Μδ.

Терапевтическое применение

Настоящее изобретение также касается фармацевтических композиций, содержащих полипептид или антитело по изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.

Настоящее изобретение также касается полипептидов или антител по изобретению для применения в качестве медикамента.

Настоящее изобретение также касается полипептидов или антител по изобретению для применения для профилактики или лечения аллергических реакций на пыльцу амброзии.

Антитела для применения по изобретению предпочтительно являются антителами типа 1§С.

Полипептид предпочтительно представлен δΕφ ΙΌ N0: 1 либо его изоаллергеном или изоформой, вариантом с пониженной аллергенностью и/или ферментативной активностью либо производным.

Предпочтительно фармацевтические композиции, полипептиды или антитела по изобретению применяются для лечения аллергий немедленного типа или мастоцитоза.

Термин "аллергия немедленного типа" или "гиперчувствительность I типа" в настоящем изобретении означает антительную реакцию в ответ на аллерген, которая отличается от нормального гуморального ответа тем, что плазматические клетки секретируют 1дЕ.

Среди клинических проявлений, вызываемых аллергией немедленного типа, подлежащей лечению с помощью фармацевтических композиций, полипептидов или антител по изобретению, числятся, к примеру, системная анафилаксия, локализованная анафилаксия (атопия), аллергический ринит, астма, атопический дерматит, конъюнктивит, экзема, вызванный мастоцитозом анафилактический шок.

В соответствии с изобретением, подлежащие лечению аллергии вызываются воздействием на индивидуума аллергена АтЬ а X либо гомологичного белка или полипептида, как определено выше, в частности, его изоаллергена или изоформы, либо при воздействии пыльцы, содержащей одно из них.

"Фармацевтическая композиция" может представлять собой "иммунную композицию" или "вакцинную композицию". В настоящем изобретении термин "иммунная композиция" обозначает такую композицию, которая должна индуцировать иммунный ответ при введении индивидууму. В настоящем описании термин "вакцинная" относится к способности вещества предотвращать или лечить патологические реакции иммунной системы.

В контексте изобретения термины "лечить" или "лечение" означают обращение вспять, ослабление или торможение течения патологической реакции иммунной системы либо одного или нескольких её симптомов. В контексте изобретения термины "предотвращать" или "предотвращение" означают возникновение патологической реакции иммунной системы либо одного или нескольких её симптомов.

- 16 029703

Термин "аллергическая реакция" относится к любым аномально гиперчувствительным реакциям иммунной системы на некоторые вещества типа пыльцы, пищевых продуктов или микроорганизмов. Такие вещества, вызывающие реакцию, называются аллергенами. Общие признаки аллергии могут включать чихание, зуд и высыпания на коже. Аллергические реакции часто связаны с избыточной продукцией иммуноглобулинов Е (1дЕ) и активацией тучных клеток и базофилов.

В настоящем изобретении термин "индивидуум" предпочтительно означает человека, но в более общем смысле может означать млекопитающих, как-то грызунов, кошек, собак и приматов.

Подходящими иммунными или вакцинными композициями, в частности, могут быть изотонические, стерильные солевые растворы (мононатриевого или динатриевого фосфата натрия, хлорида натрия, калия, кальция или магния и др., либо смеси таких солей), или сухие, в особенности лиофилизованные композиции, которые при добавлении, в зависимости от конкретного случая, стерилизованной воды или физиологического раствора, позволяют получать растворы для инъекций.

Фармацевтическая композиция может дополнительно включать по меньшей мере еще одно активное вещество, в частности по меньшей мере еще один аллерген типа аллергена из пыльцы, аллергена из пищи, аллергена из домашней пыли, аллергена из клещей, аллергена из плесени, аллергена из яда либо аллергена из перхоти животных, шерсти животных, меха животных или слюны животных, как описано более подробно ниже в разделе, касающемся диагностического применения.

Фармацевтическая композиция, к примеру, может содержать по меньшей мере два различных типа аллергенов, происходящих либо из одного и того же источника, либо из разных источников аллергенов.

"Фармацевтически" или "фармацевтически приемлемый" относится к таким молекулярным объектам и композициям, которые не вызывают вредных, аллергических или других отрицательных реакций при введении животным или человеку, как надлежит.

В настоящем изобретении термин "фармацевтически приемлемый наполнитель" охватывает растворители, дисперсионные среды, покрытия, антибактериальные и противогрибковые средства, изотонические и замедляющие всасывание средства, мукоадгезивные наполнители и др., которые не вызывают вредных или других неблагоприятных реакций при введении животным или человеку, как надлежит. Наполнители также могут включать, без ограничения, разрыхлители, связующие, смазывающие вещества, ароматизаторы, красители, консерванты. Подходящие разрыхлители включают сухой крахмал, карбонат кальция, сложные эфиры полиоксиэтиленсорбитана и жирных кислот, лаурилсульфат натрия, моноглицериды стеариновой кислоты, лактозу, а также сшитые поливинилпирролидоны, такие как кросповидон (напр., ΡοΓρΗδύο^™, ХЬ, которые могут быть получены от САР), сшитые карбоксиметилцеллюлозы, такие как кроскармелоза (напр., Ас-ύί-δοΐ™, которые могут быть получены из РМС), альгиновая кислота и натриевый карбоксиметилкрахмал (напр., Еxρ1οίаЬ™, которые могут быть получены от ЕйетагД МеДе11 Сс., 1пс.), метилцеллюлоза, агар, бентонит и альгиновая кислота. Связующими веществами, если они используются, являются те, которые усиливают адгезию. Примеры таких связующих включают, без ограничения, крахмал, желатин и такие сахара, как сахароза, декстроза, патока и лактоза. Предпочтительными смазывающими веществами являются стеараты и стеариновая кислота. Предпочтительными наполнителями являются лактоза, маннит и кроскармелоза.

Если предусматривается введение через слизистую оболочку, то фармацевтически приемлемым наполнителем преимущественно может быть "мукоадгезивный носитель". При этом "мукоадгезивный носитель" позволяет осуществлять тесный и длительный контакт со слизистой оболочкой, в частности, слизистой оболочкой полости рта, более конкретно подъязычной слизистой оболочкой, тем самым усиливая индукцию антиген-специфичной толерантности. К предпочтительным мукоадгезивными носителям в настоящем изобретении относятся, в частности, хитозан, полимеры мальтодекстрина или карбоксиметилцеллюлоза.

В рамках способов профилактики или лечения аллергических реакций фармацевтические композиции или медикаменты по изобретению могут включать в себя любые стандартные адъюванты. В настоящем изобретении предполагается, что "адъювант" усиливает индукцию антиген-специфичной толерантности. Адъювант на протяжении многих лет использовались для усиления иммунного ответа, к примеру, на вакцины. К адъювантам в настоящем изобретении относятся любые обычные или исследовательские, синтетические или биологические адъюванты для вакцинации, в том числе термолабильный энтеротоксин (ЬТ), холерный токсин (СТ), Β-субъединица холерного токсина (СТВ), полимеризованные липосомы, мутантные токсины, пробиотические бактерии, сапонины в комплексе с мембранными белковыми антигенами (иммуностимулирующие комплексы), полимеры Р1иготс с минеральным маслом, убитые микобактерии в минеральном масле, полный адъювант Фрейнда, такие бактериальные продукты, как мурамилдипептид (МЭР) и липополисахарид (ЬР8), а также липид А или биологические либо синтетические лиганды ^И-подобных рецепторов (напр., ТЬК2, 4, 5, 7 или 9).

Для оромукозального введения адъювантами предпочтительно могут служить Β^ίϊάοЬасίе^^ит, молочнокислые бактерии (в виде суспензии клеток, лиофилизованных клеток, лизатов, очищенных субкомпонентов или очищенных молекул) или комбинации кортикостероида с витамином Ό3 или любым его метаболитом или аналогом.

- 17 029703

Предпочтительно, если предусматривается мукозальное введение, то адъювантом могут служить частицы синтетического носителя-вектора, содержащего нежидкостное гидрофильное ядро, содержащее сшитый полисахарид. Соответственно, полипептид по изобретению может быть составлен в виде мукоадгезивной формы на основе частиц синтетического носителя, которая включает (ί) частицы, содержащие нежидкостное гидрофильное ядро, содержащее сшитый полисахарид; и (ίί) полипептид по изобретению. Такая форма оказалась особенно эффективной в индукции иммунной толерантности. Частицы, которые можно использовать, описаны в международной патентной заявке νθ 2008/023233.

Вкратце, сшитый полисахарид может происходить из любых мономеров сахаридов, предпочтительно глюкозы. Полисахариды предпочтительно имеют молекулярную массу от 2000 до 100000 Да, наиболее предпочтительно от 3000 до 10000 Да. Предпочтительными полисахаридами являются крахмал (а-14-полимеры глюкозы) и декстран (α-1-б-полимеры глюкозы, полученные из бактерий) либо их гидролизаты типа декстринов или мальтодекстринов.

На ядро сшитого полисахарида необязательно нашиты ионные группы, т.е. анионные (например, сульфаты или карбоксилаты) или катионные группы (например, ионы четвертичного аммония, первичные, вторичные или третичные амины) (предпочтительно от 0 до 3 мэкв., более предпочтительно от 0 до 2 мэкв. ионного заряда на 1 г).

Необязательно ядро сшитого полисахарида, по крайней мере, частично покрыто слоем амфифильных соединений и/или слоем липидных соединений.

Диаметр частиц может составлять от 10 нм до 5 мкм, предпочтительно от 20 до 200 нм.

Для парентерального введения в водном растворе, к примеру, раствор должен быть соответственно забуферен, если нужно, а жидкий разбавитель сначала доведен до изотоничности достаточным количеством солевого раствора или глюкозы. Такие водные растворы особенно подходят для внутримышечного и подкожного введения. В этой связи стерильные водные среды, которые можно использовать, должны быть известны специалистам в свете настоящего описания.

Предпочтительно фармацевтическая композиция или лекарственное средство вводится мукозально (через слизистую оболочку), более предпочтительно оромукозально и наиболее предпочтительно сублингвально. При этом фармацевтическая композиция или лекарственное средство предпочтительно составляются таким образом, чтобы они были приспособлены для таких способов введения.

Мукозальное введение обозначает такой способ введения, при котором лекарственная форма частично или полностью вступает в контакт со слизистой оболочкой. Слизистая оболочка относится к эпителиальной ткани, выстилающей внутренние полости организма. Слизистая оболочка может быть выбрана из группы, состоящей из носовой, щечной, ротовой, вагинальной, глазной, ушной, легочного ствола, мочеиспускательного канала, пищеварительного тракта и ректальной поверхности.

Оромукозальное введение означает такой способ введения, при котором лекарственная форма частично или полностью входит в контакт со слизистой оболочкой полости рта и/или глотки пациента. В частности, оно включает подъязычное, приязычное (т. е. через слизистую оболочку языка) и пероральное введение.

Если лекарственное средство вводится пациенту сублингвально (т.е. под язык), то подъязычная слизистая, расположенная на нижней стороне языка, облегчает захват антигена и адъюванта лангергансовыми клетками, которые мигрируют в дренажные лимфатические узлы и примируют Т-лимфоциты. Особый интерес представляет способ введения, при котором композиция остается под языком несколько минут, например около 2 мин, а затем проглатывается или выплевывается.

Лекарственные средства по изобретению можно вводить в различных формах, таких как диспергированные формы, например, в виде суспензии или геля, либо в сухом виде, например, в виде порошков, таблеток, капсул, капсул с замедленным высвобождением, либо форм, пригодных для введения через дозирующие устройства. Также возможно использование липосом и/или микрочастиц и/или наночастиц. Применение и получение липосом и/или микрочастиц и/или наночастиц известно специалистам в данной области.

В рамках способов профилактики или лечения аллергических реакций схема введения фармацевтических композиций или медикаментов по изобретению может выдерживаться, к примеру, на протяжении от менее б недель до более 3-х лет.

Некоторые вариации в дозировке будут необходимы в зависимости от состояния подлежащего лечению субъекта. Вводимые дозы зависят от индивидуальных потребностей, от нужного эффекта и выбранного способа введения. Понятно, что дозировка будет зависеть от возраста, пола, здоровья и веса реципиента, сопутствующего лечения, если оно есть, частоты введения и природы требуемого эффекта. Общая доза, требуемая для каждого лечения, может вводиться в виде нескольких доз или в виде одной дозы. В любом случае, ответственное за введение лицо должно определить надлежащую дозу для конкретного субъекта. Например, в рамках способов профилактики или лечения аллергических реакций диапазон доз для полипептидов по изобретению, содержащихся в фармацевтических композициях или медикаментах по изобретению, может составлять от 1 до 200 мкг в день, предпочтительно от 1 до 100 мкг в день, более предпочтительно от 1 до 50 мкг в день при пероральном введении.

- 18 029703

Антитела по изобретению предпочтительно присутствуют в количестве от 1 до 1000 мг, предпочтительно от 50 до 800 мг, более предпочтительно от 75 до 600 мг на 1 дозу, в фармацевтической композиции для подкожного введения через каждые 2 или 4 недели. Также можно вводить и множественные дозы.

Диагностическое применение

Полипептид по изобретению также может применяться для обнаружения антител, направленных против аллергена пыльцы амброзии, в частности, антител типа 1дЕ, в образцах от индивидуумов. Соответственно, настоящее изобретение также касается полипептидов по изобретению для применения для выявления аллергии или чувствительности к пыльце амброзии.

Настоящим изобретением также предусмотрен способ диагностики ίη νίίτο аллергии или чувствительности к пыльце амброзии у индивидуума, который включает следующие стадии:

a) инкубация полипептида по изобретению с биологическим образцом от индивидуума;

b) детектирование наличия или отсутствия иммунных комплексов между данным полипептидом и 1§Е5 из биологического образца от индивидуума;

причем наличие иммунных комплексов между данным полипептидом и ί§Εδ из биологического образца от индивидуума означает, что индивидуум сенсибилизирован или аллергичен на пыльцу амброзии.

Индивидуум может представлять собой человека или другое животное, в частности, такое млекопитающее, как грызуны, кошки, собаки и приматы.

Биологическим образцом, в частности, может быть биологическая жидкость типа крови, плазмы или сыворотки.

Для выявления антител специалисты могут использовать любой подходящий качественный или количественный метод, известный в данной области. Анализ может проводиться путем иммобилизации полипептида на твердой фазе или же с полипептидом в жидкой фазе. Типичные методы, которые можно использовать, включают ЕБ18Л. Вестерн-блоттинг, КЛ8Т, ингибирование КЛ8Т или ΛίΚΑδΤ.

"Метод ΚΑ.8Τ" (РадиоАллергоСорбентный Тест) используется для диагностики аллергии. Вернее, метод ΚΑ.8Τ - это метод радиоиммуноанализа для обнаружения специфических антител типа 1дЕ против предполагаемых или известных аллергенов. Вкратце, проводится связывание аллергена с нерастворимым материалом и добавляется сыворотка пациента. Если сыворотка содержит антитела к аллергену, то эти антитела свяжутся с аллергеном. Добавляют радиоактивно меченые антитела против 1дЕ человека, которые связываются с антителами ί§Ε, уже связавшимися с нерастворимым материалом. Несвязавшиеся антитела против 1дЕ человека вымываются. Степень радиоактивности пропорциональна количеству 1дЕ против аллергена в сыворотке. Затем проводится оценка ΚΑ,δΤ по шкале от 0 до 6.

При определении концентрации количественное определение иммунного ответа может повторяться во времени, например, для отслеживания эффективности десенсибилизации при лечении индивидов.

Полипептиды по изобретению также могут применяться для клеточных тестов типа теста на пролиферацию Т-клеток, теста на высвобождение медиаторов и др. Полипептид может воздействовать на различные типы клеток для того, чтобы вызвать измеримые ответы. Такие реакции могут включать высвобождение гистамина или других медиаторов (например, лейкотриенов, серотонина, ЕСР) в случае аллергических эффекторных клеток (например, базофилов, тучных клеток, эозинофилов). При другом типе анализа может измеряться пролиферация или гибель (например, апоптоз) клеток, например, по включению ³Н-тимидина или любым другим подходящим методом. Такими клетками могут быть Тклетки. Кроме того, полипептиды могут применяться для того, чтобы индуцировать высвобождение цитокинов или других иммунологически важных веществ (например, из Т-клеток), которые можно измерить. Такие клеточные тесты могут выполняться, к примеру, на РВМС, полученных от человека.

Поскольку полипептиды могут содержать эпитопы неродственных аллергенов, то они могут применяться в диагностических тестах скрининга (ίη νίίτο, ίη νΐνο, как изложено выше) для выявления сенсибилизации или невосприимчивости индивидуума к одному из компонентов полипептида. При этом врачи могут получить диагностические тесты, пригодные для быстрого скрининга на сенсибилизацию у пациентов.

Таким образом, полипептид по изобретению также может применяться в целях диагностики, например, для провокационных проб ίη νΐνο. Такие тесты могут включать кожные пробы (напр., скарификационые или внутрикожные пробы), интраназальные провокационные пробы, всевозможные пищевые пробы или бронхиальные провокационные пробы.

"Аллергическая кожная проба", также известная как "скарификационная кожная проба" или "насечка", обозначает способ медицинской диагностики аллергии, который провоцирует небольшую, контролируемую аллергическую реакцию. Вкратце, на участки кожи, отмеченные ручкой или красителем, вводятся небольшие количества очищенных аллергенов и/или их экстрактов. "Скарификатор" - это небольшое пластиковое или металлическое устройство, которое может применяться для прокалывания или "насечки" поверхности кожи. Аллергены также можно вводить "внутрикожно" в кожу пациента, с помощью иглы и шприца. Обычные зоны для пробы включают внутреннюю поверхность предплечья и спину. Если пациент аллергичен к данному веществу, то уже в пределах 30 мин может появиться воспалительная реакция. Такая реакция может варьироваться от незначительного покраснения кожи до выраженной сыпи

- 19 029703

(так называемый "красный волдырь") у более чувствительных пациентов, похожей на укус комара. Аллергологи могут затем измерить и записать диаметр кожной реакции. Впоследствии аллергологами может проводиться интерпретация результатов аллергической кожной пробы по шкале тяжести.

Соответственно, настоящим изобретением также предусмотрен способ диагностики аллергии или чувствительности к пыльце амброзии у индивидуума. В частности, данный способ может включать стадии (а) внутрикожного или подкожного введения полипептида по изобретению; и (Ь) выявления 1дЕреактивности, в частности, путем измерения диаметра кожной реакции на месте введения, при этом 1дЕреактивность свидетельствует, что индивидуум сенсибилизирован или аллергичен к аллергену пыльцы амброзии.

Изобретением также предусмотрен способ выявления 1дЕ-реактивности у индивидуума, который включает стадии (а) внутрикожного или подкожного введения полипептида по изобретению; и (Ь) выявления кожной реакции на месте введения, при этом кожная реакция свидетельствует об 1дЕ-реактивности индивидуума к аллергену пыльцы амброзии.

Соответственно, для количественного определения 1дЕ-реактивности можно измерять диаметр кожной реакции на месте введения.

Для применения на практике вышеуказанного способа диагностики аллергии или чувствительности ίη νίνο или выявления 1дЕ-реактивности полипептид по изобретению предпочтительно заключается в фармацевтическую композицию, как описано выше в разделе, касающемся терапевтического применения.

Изобретение также касается применения полипептидов по изобретению для изготовления диагностических тестов. Такие диагностические тесты также являются частью изобретения и предназначаются для скрининга пациентов, сенсибилизированных к аллергенам пыльцы амброзии.

Изобретение также касается набора для диагностики аллергии, в частности, к пыльце амброзии, включающего полипептид по изобретению и скарификатор. Такой набор может необязательно включать инструкции по применению. С другой стороны, набор по изобретению должен содержать определенный здесь полипептид и инструкции по применению. В частности, набор по изобретению может применяться для выполнения аллергической кожной пробы.

В частности, набор может дополнительно содержать еще один или несколько аллергенов из окружающей среды, как описано ниже. Аллергены хорошо известны специалистам. Распространенные аллергены окружающей среды, вызывающие аллергические заболевания, встречаются в пыльце (например, аллергены из пыльцы деревьев, трав, сорняков и зелени), пище, домашней пыли, клещах (особенно в испражнениях клещей), перхоти, шерсти и/или слюне животных (например, собак, кошек, лошадей, крыс, мышей и пр.), в плесени, спорах грибов и ядах (к примеру, ядах насекомых или бесхвостых амфибий).

Таким образом, другим аллергеном, необязательно присутствующим в наборе по изобретению, предпочтительно является аллерген из пыльцы, аллерген из пищи, аллерген из домашней пыли, аллерген из клещей, аллерген из плесени, аллерген из яда или аллерген из перхоти, шерсти, меха или слюны животных. Важными аллергенами из пыльцы деревьев, трав и зелени являются те, что происходят из таксономических отрядов Еада1е:, 01еа1е:, Рта1е: и Р1а1апасеае, в том числе березы (Вс1и1а), ольхи (А1пи:), орешника (СоМи:® граба (Сагрши:) и оливковых (01еа), кедра (СгурЮтепа и .Титрет:), платана (Р1а1апи8), отряда Ροа1еδ, в том числе травы родов ^ο1^ит, РЫеит, Ροа, ^ηοάοη, Оас1у118, ΗοΓυδ, РЬа1ап8, 8еса1е и ^гдЫт, отрядов Л51ега1е5 и иФса1е8, в том числе травы родов ЛтЬго81а, Лг1ет181а и РапеШпа. Другими важными ингаляционными аллергенами являются аллергены из клещей домашней пыли родов ^е^таίοрЬадο^άеδ и Еигод1урЬи8, клещиков типа ^ер^άοд1урЬуδ, О1усурйади8 и Тугорйади:, тараканов, мошек и блох, напр., ВЩе11а, Ρе^^р1аηеίа, ΟιίΐΌηοιηιΐδ и СίеηοсерЬа1^άеδ, и таких млекопитающих, как кошки, собаки и лошади, аллергены из ядов, включая аллергены из жалящих или кусающихся насекомых, как-то из таксономического отряда Ηутеηοрίе^а, включая пчел (надсемейство Лр1бае), ос (надсемейство УехрШеа) и муравьев (надсемейство Εοπηχοίώ·^). Важными ингаляционными аллергенами являются аллергены из грибов, как-то из родов ЛНетапа и С1аάοδрο^^ит.

Набор по изобретению может содержать один или несколько аллергенов, например, до 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 75 или 100 различных аллергенов. К примеру, набор может содержать по меньшей мере два различных типа аллергенов, происходящих либо из одного и того же источника, либо из разных источников аллергенов, напр., аллергены травы группы 1 и травы группы 5, либо аллергены клещей группы 1 и группы 2, из различных видов клещей и трав, соответственно.

Далее изобретение будет подробно раскрыто на следующих примерах.

Краткое описание последовательностей

8ЕО ГО N0: 1 - консенсусная последовательность полипептида зрелого АтЬ а X.

8Е0 ГО N0: 2-26 - последовательности праймеров (см. табл. 3).

8Е0 ГО N0: 27 - последовательность типа Козака.

8Е0 ГО N0: 28 - консенсусная последовательность пре-про-полипептида АтЬ а X.

8Е0 ГО N0: 29 - консенсусная нуклеотидная последовательность, кодирующая последовательность пре-про-полипептида АтЬ а X.

8Е0 ГО N0: 30-31 - последовательности пептидов, используемых для иммунизации и получения ан- 20 029703

тител.

ЗЕф ΙΌ N0: 32-41 - последовательности предсказанных эпитопных фрагментов.

Краткое описание фигур

Фиг. 1 - Принципы номенклатуры аллергенов;

фиг. 2 - Выравнивание последовательностей полного пре-про-полипептида АтЬ а X из 10 клонов с консенсусной последовательностью.

Примеры

Пример 1. Идентификация нового аллергена пыльцы амброзии, названного АтЬ а X.

1.1. Контекст и задачи.

Целью настоящего исследования было установление профиля аллергической сенсибилизации у 28 хорошо изученных больных с аллергией на пыльцу амброзии, отобранных на основании биологических и клинических параметров. С этой целью сначала проводилась идентификация изоформ АтЬ а 1 из сырья пыльцы амброзии методами 2Э-электрофореза и масс-спектрометрии. Затем определялась 1дЕреактивность сыворотки больных с аллергенами, в особенности изоформами АтЬ а 1, методом Вестернблоттинга.

1.2. Материалы и методы.

1.2.1. Материалы.

Брали сыворотки у 28 больных с аллергией на пыльцу амброзии до начала специфической иммунотерапии. Сыворотки хранили при -20°С до использования.

1.2.2. Экстрагирование пыльцы.

Использовали экстракты пыльцы амброзии, а сырье пыльцы амброзии приобретали у ОКЕЕК ЬаЬогаЮпек Щепой, Ν^ И§А).

Для получения экстракта пыльцы амброзии 1 г пыльцы экстрагировали в 20 мл раствора бикарбоната аммония при 4 г/л, приготовленного на чистой воде. Экстракцию проводили при 4°С в течение ночи с вращательным перемешиванием. Центрифугирование проводили при 4000 об/мин в течение 15 мин при 4°С. Собирали супернатант, представляющий собой экстракт пыльцы, делили его на порции и хранили при -20°С до количественного определения белка и использования.

1.2.3. Двумерный электрофорез.

Общие белковые экстракты наносили на полоски 1ттоЬШпе Эгу δίτίρκ, рН 3-10, длиной 13 см (ОЕ НеаИЪсаге®) на всю ночь с 2% буфера ΙΡΟ (ОЕ НеаНЬсаге®) и реагентом Эекйеак (ОЕ НеаНЬсаге®) при 12 мкл/мл объема образца. В случае окрашивания Кумасси синим после 2Э-разделения на полоску наносили 150 мкг общего белка. В случае переноса и иммуноблоттинга после 2Э-разделения на полоску наносили 30 мкг общего белка. Разделение в первом измерении проводили на приборе 1РОрЬог3 (ОЕ НеаКЬсаге®) с использованием 4 последовательных стадий (стадия 1: 500 В, градиент 1 час; стадия 2: 1000 В, градиент 1 ч; стадия 3: 8000 В, градиент 2 ч 30 мин; стадия 4: 8000 В, постоянно 3 ч). Это разделение в первом измерении останавливали после достижения по меньшей мере 25000 В-ч. Для второго измерения полоски уравновешивали с иодацетамидом и ЭТТ и наносили на 12,5% гель Ехсе1Ое1 2Э Нотодепеоик для горизонтального 8Э8 РАОЕ (ОЕ НеаИЬсаге®) на 1 ч 45 мин (стадия 1: 120 В, 35 мин; стадия 2: 600 В, 1 ч 10 мин). Разделенные белки экстракта пыльцы либо обрабатывали для окрашивания Кумасси, либо переносили на нитроцеллюлозные мембраны.

1.2.4. Окрашивание Кумасси и извлечение пятен

После 2Э гель-электрофореза гель инкубировали в фиксирующем растворе (40% этанола, 10% уксусной кислоты) в течение 30 мин. Затем белки окрашивали Кумасси (Соота881е ЬгШаШ Ь1ие йуе К 250 и раствор для окрашивания: РЬа81Се1 В1ие К: 1 таблетка в 400 мл обесцвечивающего раствора, профильтрованного и нагретого до 60°С) в течение 10 мин. Затем проводили обесцвечивание (гель инкубировали в обесцвечивающем растворе: 25% этанола, 8% уксусной кислоты) до тех пор, пока пятна не были хорошо видны на прозрачном фоне. Пятна вручную извлекали из геля в защищенной среде, чтобы избежать загрязнения кератином (перчатки, маска, шапочка). Пятна хранили в 30%-м этаноле при 4°С до анализа методом масс-спектрометрии.

1.3. Результаты и интерпретация.

Проводили разделение экстракта пыльцы амброзии методом 2Э-электрофореза с последующим окрашиванием Кумасси. Из 2Э-геля извлекали 20 пятен и подвергали их идентификации методом массспектрометрии в 3-х независимых опытах (МАЭЭ1 ТОР и ЬС-М§/М§).

Анализ 9 из 20 отобранных пятен показал, что в этом экстракте четко определяются 5 изоформ АтЬ а 1. Также подвергали анализу остальные 11 пятен, что позволило определить 6 других главных белков с "правильным профилем пептидных карт", в том числе неизвестный аллерген АтЬ а X. К сожалению, полный протеом амброзии еще не установлен, поэтому эти дополнительные белки невозможно было сопоставить с информацией, имеющейся в базах данных.

Проанализировали аллергенные профили, полученные по 28 сывороткам. Как оказалось, сыворотки 54% больных реагировали с неизвестным аллергеном, названным АтЬ а X, при 2Э Вестерн-блоттинге.

- 21 029703

Пример 2. Клонирование методом ОТ-ПЦР нового аллергена из пыльцы амброзии

2.1. Задачи.

Цель заключалась в клонировании, методом КАСЕ, аллергена АтЬ а X амброзии с помощью последовательностей ДНК, выведенных на основе последовательностей пептидов, установленных при 2Όэлектрофорезе с последующей масс-спектрометрией и ^-концевым секвенированием по Эдману.

2.2. Материалы и методы.

2.2.1. Материалы.

Тотальную РНК экстрагировали из обезжиренной пыльцы амброзии. Перед экстракцией РНК пыльцу сначала ресуспендировали в воде и растирали в жидком азоте с помощью небольшой ступки и пестика.

2.2.2. Быстрая амплификация концов кДНК (КАСЕ).

Праймеры, использовавшиеся для экспериментов по КАСЕ, приведены в табл. 3. В качестве матрицы для экспериментов 5'- и 3'-КАСЕ использовали тотальную РНК. Обратную транскрипцию и последующие ПЦР-амплификации проводили с 1 мкг тотальной РНК. В качестве матрицы для первого раунда ПЦР-амплификации использовали кДНК с универсальными праймерами и праймерами, выведенными из пептидной последовательности АтЬ а X, как описано в табл. 4. Циклы амплификации проводили со стадиями гибридизации при 50-65°С. Продукты ПЦР из первого раунда разводили 1:10 и использовали при второй ПЦР-амплификации с двумя праймерами, выведенными из пептидной последовательности АтЬ а X (табл. 4).

Таблица 3. Праймеры, использовавшиеся в экспериментах по КАСЕ

Название	Последовательность	ЗЕЦ Π) ΝΟ:	Ориентация
8ТА201	ААСОССОТТАССОАТОТТААА	ЗЕ() ГО N0: 2	прямой
8ТА203	ССАОААОССАОСТАСССАТАС	ЗЕ() ГО N0: 3	прямой
8ТА208	АССССАООТТООАССССААОАОТТ	ЗЕ() ГО ΝΟ: 4	обратный
8ТА352	ТСТТАСССАТАСОТТООТАА	ЗЕр ГО ΝΟ: 5	прямой
8ТА357	САТООТООТАТСОССССАОААОССАОСТАСССАТА	ЗЕ() ГО ΝΟ: 6	прямой
8ТА363	САТООТООТТТООССССАОААОССТСТТАСССАТА	ЗЕ() ГО N0: 7	прямой
8ТА368	САТООТООТТТООССССАОААОССАОСТАСССАТАСОТТООТАА	ЗЕ() ГО N0: 8	прямой
8ТА375	САТООТООТСТСОССССАОААОССТСТТАСССАТА	ЗЕ() ГО N0: 9	прямой
8ТА386	СААААСОТТССАООТАТСОАТОААОААОССАТСАОААА	ЗЕр ГО N0: 10	прямой
8ТА390	СААААСОТТССАООТАТСОАТОААОААОСССТСАОААА	3Ε() ГО N0: 11	прямой
8ТА392	СААААСОТТССАООТТТООАТОААОААОССАТСАОААА	ЗЕР ГО N0: 12	прямой
8ТА394	СААААСОТТССАООТСТСОАТОААОААОССАТСАОААА	ЗЕР ГО N0: 13	прямой
8ТА400	СААААСОТТССАООТСТСОАТОААОААОССТТОАОААА	ЗЕР ГО N0: 14	прямой
8ТА476	ОАТАССОАСССТААТАААОАТТТСАТАТАТОСА	ЗЕР ГО N0: 15	прямой
8ТА490	ООСААААОАОАААССТОСОАСАААОСАААОАТТ	ЗЕР ГО N0: 16	прямой
8ТА496	ООАСТТОАСОААОААОСАСТААООААООСА	ЗЕР ГО N0: 17	прямой
8ТА497	ТОССТТССТТАОТОСТТСТТСОТСААОТСС	ЗЕР ГО N0: 18	обратный
8ТА505	ТСССАСААТТССААСАССАТОАТТСООСТС	ЗЕР ГО N0: 19	обратный
8ТА510	ОТСАСТОАТОТСААОООТСААООСООАТОТООА	ЗЕР ГО N0: 20	прямой
8ТА516	ОТААААТТТТССОААСААСАА	ЗЕР ГО N0: 21	прямой
ЗТА517	ТТОТТОТТСООААААТТТТАС	ЗЕ.р ГО N0: 22	обратный
3ΤΑ536	ТСАОСАССТООСТСОАТТОАТАССОАСССТААТАААОАТТТС	ЗЕР ГО N0: 23	прямой
8ТА537	ОАААТСТТТАТТАОООТСООТАТСААТСОАОССАООТОСТОА	ЗЕР ГО N0: 24	обратный
8ТА538	ТСАОСАССТООСТСОАТСОАТАССОАСССТААТАААОАТТТС	ЗЕР ГО N0: 25	прямой
8ТА539	ОАААТСТТТАТТАОООТСООТАТСОАТСОАОССАООТОСТОА	ЗЕР ГО N0: 26	обратный

Таблица 4. Комбинации праймеров, использовавшиеся в экспериментах, по КАСЕ

1-й раунд	2-й раунд
Прямой праймер	Обратный праймер	Прямой праймер	Обратный праймер
8ТА390	универсальный	8ТА388	5ТА208
8ТА390	универсальный	8ТА400	5ТА208
ЗТА400	универсальный	3ΤΑ390	ЗТА208
ЗТА476	универсальный
ЗТА490	универсальный
3ΤΑ536	универсальный
8ТА538	универсальный
Универсальный	ЗТА517
ЗТА496	универсальный
ЗТА510	универсальный
ЗТА516	универсальный
Универсальный	ЗТА505
Универсальный	ЗТА497
Универсальный	3ΤΑ539
Универсальный	3ΤΑ537
Универсальный	3ΤΑ538

После экспериментов по КАСЕ амплифицированные фрагменты ДНК наносили на 1% агарозный гель, окрашенный бромидом этидия, и разделяли методом электрофореза. Нужные полосы вырезали и экстрагировали ДНК. Затем очищенные фрагменты ДНК клонировали в вектор рСК4-Т0Р0 с помощью набора Т/А для клонирования с целью секвенирования, используя компетентные клетки Т0Р0

Для получения недостающих нуклеотидных последовательностей на 5'- и 3'-концах (транслируемые

- 22 029703

и нетранслируемые участки) впоследствии был составлен набор перекрывающихся праймеров на основе данных по секвенированию. Эти специфичные праймеры использовались в сочетании с праймером ИРМ на кДНК пыльцы амброзии, как описано выше. Циклы ПЦР проводили с гибридизацией при температуре 50-65°С. Амплифицированные фрагменты ДНК очищали и клонировали, как описано выше.

2.2.3. Поиски по гомологии.

Для поиска по гомологии последовательности ДНК, а также транслированные последовательности прогоняли по базе данных NСΒI с помощью алгоритмов В1аз!п, В1аз!р, В1аз!х, !В1аз!п и !В1аз!х (нуклеотидные коллекции и белковые базы данных ограничивались зелеными растениями).

2.3. Результаты и интерпретация.

2.3.1. Клонирование методом КАСЕ.

Для разработки набора невырожденных праймеров использовали пептидные последовательности, полученные при Ν-концевом секвенировании и Е2И-РАОЕ-БС-М3/М3. Кодоны выбирали по таблице частоты. Клонирование АтЬ а X при помощи ОТПЦР проводили методом КАСЕ на тотальной РНК, выделенной из пыльцы амброзии. Проводили две последовательных амплификации, как описано в методах. Амплифицированные фрагменты ДНК подвергали Т/А-клонированию и секвенированию. Было обнаружено, что перекрывающие фрагменты независимых клонов содержали последовательности, кодирующие и Ν-концевой пептид, и внутренние пептиды.

Информация по частичной последовательности впоследствии использовалась для составления перекрывающихся праймеров. Затем проводили второй раунд экспериментов по КАСЕ, чтобы получить недостающие последовательности на 5'- и 3'-участках. Что касается внутренних участков, то амплифицированные фрагменты клонировали и подвергали секвенированию ДНК. Составляли 5'-, внутренние и 3'последовательности и собирали полную последовательность АтЬ а X.

2.3.2. Гомологичность последовательностей.

На основе различных фрагментов АтЬ а X была установлена следующая консенсусная последовательность пре-про-формы АтЬ а X:

ΜΕΙΝΚΕ УСТ 8Р ЗЕУЕШСЕУЕЗЕН УНЕКЕЬЕЗЕЕОРМОМ УОРЛУ ΚΕΟΗΝΙΕΜΡ3ΡΕΚΕΝ УЕ

ΚΥΝνΚΚΙΗΕ8ΝΚΜΟΚΡΥΚΕΚνΝΕΡΑϋΜΤΝΕΕΡνΝΤΥΑΝ8ΚΙ8ΗΡρΑΕΚΟ8ΑΡΟ8ΜΤΟΡ

ХКОР1УАХУТК1РОКУО\УКЕКХАУТОУКОРООСО8С\УАРААУУАЕЕОША1КТОКЕУ

КР8Е(№УОСОМТтОСОООЕМЕРАРТУУ1КНОО1АРЕА8УРУУОККЕТСОКАК1КОУ

ΕΙ<ΙΟΟΡ.0ΝνΡΟΕϋΕΕΑΕΚΙ<ΑνΑΗ0ΡνΑΤΟΙ0Ε8ΟΗΟΕ0ΕΥ8ΕθνΥΤΟΟΕΟΤΕΡΝΗθνθΙ

ν0Υ0ΕΝΕΚ0ΙΚΡ\ντνΚΝ8\ν0ΡΤ\ν0ΕΚ0ΥΙΗΕρΚ0ΑΚΚΕ0ΕΕ0νΑΜΗ88ΡΡΙΜΝϋΡΝΡ

ΡΚϋΟΡΝΟΡΚΟΟΡΟΑΡΚϋΡΚΡΚΤΤρΚΕρΟΙΚΤΚΕΕΕΕ (8ЕЦ ГО ΝΟ: 28).

Последовательности ДНК, а также транслированные последовательности прогоняли по базе данных NСΒI для поиска гомологичности с помощью алгоритмов В1аз!п, В1аз!р, В1аз!х, !В1аз!п и !В1аз!х (нуклеотидные коллекции и белковые базы данных ограничивались зелеными растениями). На обоих уровнях фрагменты АтЬ а X проявляли сильную гомологичность с цистеиновыми протеазами.

Положение начального метионина было установлено по гомологичности последовательностей с другими цистеиновыми протеазами и подтверждается наличием последовательности типа Κоζак (сайт связывания рибосом) возле проксимального кодона ^Ατθ (АСААТААТСО, 8ЕС) ГО N0: 27)

Границы приводятся относительно этого метионина.

Последовательность АтЬ а X (3Е^ ГО N0: 28) соответствует пре-про-белку, охватывающему предсказанную сигнальную последовательность (а.к. 1-22) и про-область (а.к. 23-108), которая содержит домен, гомологичный ингибитору пропептида 129 катепсина (а.к. 40-92). Имеется консервативная каталитическая триада (С₁₅₅, Н₂₈₉, Ν₃ι₀ в 3Е^ ГО N0: 28), а также 6 цистеинов, предположительно участвующих в дисульфидных связях (Сх₅₂-С1₉₃; С₁₈₆-С₂₂₆; С₂₈₃-С₃₃₄ в 3Е^ ГО Ν0: 28). Кроме того, методом М3 подтверждается сайт Ν-гликозилирования (Ν₁₂₇ в 3Е^ ГО Ν0: 28).

Последовательность АтЬ а X подтверждается методами нано-БС-МЗ/МЗ и МАБИ1 М3 пятен Е2ИРАОЕ, а также расширенным секвенированием по Эдману.

2.3.3. Полиморфизм.

Проводился предварительный анализ на нуклеотидном и аминокислотном уровне для характеристики полиморфизма АтЬ а X. В последовательностях ДНК наблюдалось несколько нуклеотидных вариаций типа молчащих и миссенс. ν/Ι₂₀₅ и А/У₂1₂ по 3Е^ ГО Ν0: 28 подтверждаются по спектрам М3. Большое число одиночных нуклеотидных вариаций и аминокислотных изменений указывает на изоформы/варианты АтЬ а X.

Пример 3.

3.1. Задачи.

Для того, чтобы проанализировать вариации последовательности и профиль гликозилирования АтЬ а X, подвергали очистке природный АтЬ а X методом извлечения из геля после электрофореза. Очищенный белок реагировал и со специфичными к АтЬ а X поликлональными антителами, направленными против Ν-концевой части зрелой молекулы, и с 1дЕ в сыворотке пациента с аллергией на пыльцу амбро- 23 029703

зии.

3.2. Материалы и методы.

3.2.1. Очистка природного АтЬ а X.

Белки пыльцы амброзии осаждали с помощью набора Рег£ес!Росиз Κι! от С-Вюзс1еисез, ресуспендировали в буфере ОРРСЕБ, содержащем амфолиты рН 4-7, и подвергали фокусированию с помощью набора для высокого разрешения на приборе Адкеи! 3100 ОРРСЕБ Ргас!юиа!ог, как описано в руководстве для пользователей (ОРТ Се1 Е1ес!горкогез13, ОСЕ). Опыты останавливали после достижения 74 кВ-ч, а содержащую АтЬ а X фракцию в жидкой фазе извлекали, подкисляли 1%-й уксусной кислотой, а затем фракционировали на крупнопористой обратно-фазовой колонке с высоким выходом (тКРС^). Затем собранные из колонки фракции анализировали на 4-12% геле ХиРАСЕ, переносили на нитроцеллюлозную мембрану и анализировали с помощью поликлональных антител, направленных против Ν-концевой части АтЬ а X, полученных при иммунизации кроликов конъюгированным Ν-концевым пептидом АтЬ а X (ΟδΑΡΟδΙϋΤϋΡΝΚϋΡ, 8 Ер ΙΌΝΟ: 30).

3.2.2. Масс-спектрометрический анализ.

Для точного определения массы АтЬ а X белок анализировали методом нано-БС/МБ в режиме положительной полярности на приборе Мах13 Ρς-ТОР (Вгикег Оакошсз), подсоединенном к и1йта!е 3000 КББС (Ткегто Бтеикпс 1)юпех). Белок отделяли на колонке С4 (внутр. диам. 300 мкм, 15 см, частицы 5 мкм и размер пор 300 А, Ткегто Бтеикпс 1)юпех), снабженной микро-предколонкой С4 РерМар300 (Ткегто Бтеикпс Оюпех). Для уравновешивания использовали растворитель А (водный 0,15% об/об РА) и применяли градиент от 0 до 60% растворителя (0,15% РА в 80% АСЩ. Скорость потока составляла 50 мкл/мин для предварительной концентрации и 1 мкл/мин для разделения. Данные анализировали с помощью программы 1)а1а Аиа1уз13 (Вгикег □аНошсз).

3.3. Результаты и интерпретация.

Проводили анализ методом масс-спектрометрии на очищенном природном АтЬ а X для выявления вариантов АтЬ а X и определения профиля гликозилирования.

Анализ подвергнутых деконволюции масс-спектров показал наличие нескольких форм у очищенной молекулы. В частности, были подтверждены замены У/1₉₇, А/С/У₂₄₉ и О/Е₂₅₂. Наблюдалось шесть комбинаций этих вариантов: они соответствуют консенсусной последовательности δΡ(Ο ГО ХО: 1 и мутациям или комбинациям мутаций а) (1₉₇ С₂₄₉ ϋ₂₅₂), с) (У₉₇ А₂₄₉ ϋ₂₅₂), д) (У₉₇ У₂₄₉ Е₂₅₂), к) (1₉₇ А₂₄₉ ϋ₂₅₂) и ι) (1₉₇ У₂₄₉ Е₂₅₂), как описано на стр. 7 настоящей заявки.

Кроме того, результаты подтверждают наличие уникального сайта Ν-гликозилирования в положении Ν₁₉ (нумерация по последовательности зрелого белка δΡ(Ο ГО ХО: 1).

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110>	СТАЛЛЕРЖЕН С.А.
<120>	НОВЫЙ АЛЛЕРГЕН ИЗ ПЫЛЬЦЫ	АМБРОЗИИ И	ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ
<130>	ВЕТ 13Р2263
<150>	ЕР12305972.7
<151>	2012-08-03
<160>	41
<170>	РаЬепЫп -т-егзТоп 3.5
<210>	1
<211>	278
<212>	РЕТ
<213>	АтЬгозба агЬетазИЕоНа
<400>	1
С1у Зег А1а Рго С1у Зег 11е Азр	ТПг Азр Рго	Азп Ьуз Азр Рке
1	5	10	15

11е

Туг А1а Азп ναΐ ТПг Ьуз 11е Рго 20

Азр

25

Ьуз Уа1 Азр Тгр Агд С1и Ьуз 30

- 24 029703

Азп

А1а Уа1 35

ТЪг

Азр

Уа1

Ьуз

О1у О1п О1у 40

О1у

Суз

О1у 45

Зег

Суз

Тгр

А1а

РЪе

А1а

А1а

Уа1

Уа1

А1а

Ьеи

О1и

О1у

11е

Азп

А1а

11е

Агд

ТЪг

50

55

60

О1у

Ьуз

Ьеи

Уа1

Ьуз

РЪе

Зег

О1и

О1п

О1п

Ьеи

Уа1

Азр

Суз

Азр

МеЕ

65

70

75

80

ТЪг

Азп

А1а

О1у

Суз

Азр

О1у

О1у

Ьеи

МеЕ

О1и

Рго

А1а

РЪе

ТЪг

Туг

85

90

95

Уа1

11е

Ьуз

Н1з

О1у

О1у

11е

А1а

Рго

О1и

А1а

Зег

Туг

Рго

Туг

Уа1

100

105

110

О1у

Ьуз

Агд

О1и

ТЪг

Суз

Азр

Ьуз

А1а

Ьуз

11е

Ьуз

Азр

Уа1

Ьеи

Ьуз

115

120

125

11е

Азр

О1у

Агд

О1п

Азп

Уа1

Рго

О1у

Ьеи

Азр

О1и

О1и

А1а

Ьеи

Агд

130

135

140

Ьуз

А1а

Уа1

А1а

Н1з

О1п

Рго

Уа1

А1а

ТЪг

О1у

11е

О1п

Ьеи

Зег

О1у

145

150

155

160

Ηΐ3

О1у

Ьеи

О1п

РЪе

Туг

Зег

О1и

О1у

Уа1

Туг

ТЪг

О1у

Азр

Суз

О1у

165

170

175

ТЪг

О1и

Рго

Азп

Н1з

О1у

Уа1

О1у

11е

Уа1

О1у

Туг

О1у

О1и

Азп

О1и

180

185

190

Ьуз

О1у

11е

Ьуз

РЪе

Тгр

ТЪг

Уа1

Ьуз

Азп

Зег

Тгр

О1у

Рго

ТЪг

Тгр

195

200

205

О1у

О1и

Ьуз

О1у

Туг

11е

Н1з

Ьеи

О1п

Агд

О1у

А1а

Агд

Ьуз

О1и

О1у

210

215

220

Ьеи

Суз

О1у

Уа1

А1а

МеЕ

Н1з

Зег

Зег

РЪе

Рго

11е

МеЕ

Азп

Азр

Рго

225

230

235

240

Азп

Рго

Рго

Ьуз

Азр

Азр

Рго

Азп

О1у

Рго

Ьуз

Азр

Азр

Рго

Азр

А1а

245

250

255

Рго

Ьуз

Азр

Рго

Ьуз

РЪе

Ьуз

ТЪг

ТЪг

О1п

Агд

Ьеи

О1п

О1у

11е

Агд

260

265

270

ТЪг Ьуз Ьеи Ьеи О1и Ьеи 275

- 25 029703

<210> 2

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> олигонуклеотид

<400> 2

аасдссдББа ссдаБдББаа а

21

<210> 3

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223>

олигонуклеотид

<400> 3

ссадаадсса дсБасссаБа с

21

<210> 4

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> олигонуклеотид

<400> 4

ассссаддББ ддассссаад адББ 24

<210> 5

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> олигонуклеотид

<400> 5

БсББасссаБ асдББддБаа 20

<210> 6

<211> 35

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> олигонуклеотид

<400> 6

саБддБддБа Бсдссссада адссадсБас ссаБа 35

<210> 7

- 26 029703

35

<211> 35

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> олигонуклеотид

<400> 7

саЁддЁддЁЁ Ёддссссада адссЁсЁЁас ссаЁа

<210> 8

<211> 44

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> олигонуклеотид

<400> 8

саЁддЁддЁЁ Ёддссссада адссадсЁас ссаЁасдЁЁд дЁаа

<210> 9

<211> 35

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> олигонуклеотид

<400> 9

саЁддЁддЁс Ёсдссссада адссЁсЁЁас ссаЁа

44

35

<210>	10
<211>	38
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	олигонуклеотид
<400>	10
саааасдЁЁс саддЁаЁсда Ёдаадаадсс аЁсадааа

38

<210> 11

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> олигонуклеотид

<400> 11

саааасдЁЁс саддЁаЁсда Ёдаадаадсс сЁсадааа 38

<210> 12

<211> 38

<212> ДНК

<213> Искусственная

- 27 029703

38

<220>

<223> олигонуклеотид

<400>	12
саааасдЬЬс саддЬЬЬдда
<210>	13
<211>	38
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	олигонуклеотид
<400>	13
саааасдЬЬс саддЬсЬсда
<210>	14
<211>	38
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	олигонуклеотид
<400>	14
саааасдЬЬс саддЬсЬсда
<210>	15
<211>	33
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	олигонуклеотид
<400>	15
даЬассдасс сЬааЬааада
<210>	16
<211>	33
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	олигонуклеотид
<400>	16
ддсаааадад ааассЬдсда
<210>	17
<211>	30
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	олигонуклеотид

Ьдаадаадсс

Ьдаадаадсс

Ьдаадаадсс

ЬЬЬсаЬаЬаЬ дса

сааадсааад аЬЬ

аЬсадааа

аЬсадааа

ЬЬдадааа

38

38

33

33

- 28 029703

<400> 17

ддасббдасд аадаадсасб ааддааддса

30

<210> 18

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> олигонуклеотид

<400> 18

бдссббссбб адбдсббсбб сдбсаадбсс

30

<210> 19

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223>

олигонуклеотид

<400> 19

бсссасаабб ссаасассаб даббсддсбс

30

<210> 20

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> олигонуклеотид

<400> 20

дбсасбдабд бсаадддбса аддсддабдб дда 33

<210> 21

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223>

олигонуклеотид

<400> 21

дбаааабббб ссдаасааса а

21

<210> 22

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223>

олигонуклеотид

<400> 22

ббдббдббсд даааабббба с

21

- 29 029703

<210> 23

<211> 42

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> олигонуклеотид

<400> 23

ЕсадсассЕд дсЕсдаЕЕда	ЕассдасссЕ	ааЕааадаЕЕ	Ес
<210>	24
<211>	42
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	олигонуклеотид
<400>	24
даааЕсЕЕЕа ЕЕадддЕсдд	ЕаЕсааЕсда	дссаддЕдсЕ	да
<210>	25
<211>	42
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	олигонуклеотид
<400>	25
ЕсадсассЕд дсЕсдаЕсда	ЕассдасссЕ	ааЕааадаЕЕ	Ес
<210>	26
<211>	42
<212>	ДНК
<213>	Искусственная
<220>
<223>	олигонуклеотид
<400>	26
даааЕсЕЕЕа ЕЕадддЕсдд	ЕаЕсдаЕсда	дссаддЕдсЕ	да

42

42

42

42

<210> <211> <212> <213>	27 10 ДНК Искусственная
<220> <223>	сДНК
<400>	27
асааЕааЕдд
<210>	28

10

- 30 029703

<211> 386

<212> РРТ

<213> АтЪгозга агбетЪзНбоПа

<220>

<221> СИГНАЛ <222> (1)..(22)

<220>

<221> ПРОПЕП <222> (23)..(386)

<220>

<221> ПЕПТИД <222> (109)..(386)

<400> 28

Меб 1

О1и

11е

Азп

Ьуз 5

Ьеи

Уа1

Суз

РЪе

Зег 10

РЪе

Зег

Ьеи

Уа1

Ьеи 15

11е

Ьеи

О1у

Ьеи

Уа1

О1и

Зег

РЪе

Н1з

Туг

Н1з

О1и

Агд

О1и

Ьеи

О1и

Зег

20

25

30

О1и

О1и

О1у

РЪе

Меб

О1у

Меб

Туг

Азр

Агд

Тгр

Агд

О1и

С1п

Н1з

Азп

35

40

45

11е

О1и

Меб

Агд

Зег

Рго

О1и

Агд

РЪе

Азп

Уа1

РЪе

Ьуз

Туг

Азп

Уа1

50

55

60

Агд

Агд

11е

Н1з

О1и

Зег

Азп

Ьуз

Меб

Азр

Ьуз

Рго

Туг

Ьуз

Ьеи

Ьуз

65

70

75

80

Уа1

Азп

О1и

РЪе

А1а

Азр

Меб

ТЪг

Азп

Ьеи

О1и

РЪе

Уа1

Азп

ТЪг

Туг

85

90

95

А1а

Азп

Зег

Ьуз

11е

Зег

Н1з

РЪе

С1п

А1а

Ьеи

Агд

О1у

Зег

А1а

Рго

100

105

110

О1у

Зег

11е

Азр

ТЪг

Азр

Рго

Азп

Ьуз

Азр

РЪе

11е

Туг

А1а

Азп

Уа1

115

120

125

ТЪг

Ьуз

11е

Рго

Азр

Ьуз

Уа1

Азр

Тгр

Агд

О1и

Ьуз

Азп

А1а

Уа1

ТЪг

130

135

140

Азр

Уа1

Ьуз

О1у

О1п

О1у

О1у

Суз

О1у

Зег

Суз

Тгр

А1а

РЪе

А1а

А1а

145

150

155

160

Уа1

Уа1

А1а

Ьеи

О1и

О1у

11е

Азп

А1а

11е

Агд

ТЪг

О1у

Ьуз

Ьеи

Уа1

165

170

175

- 31 029703

Ьуз

РЪе

Бег О1и О1п О1п 180

Ьеи

Уа1

Азр 185

Суз

Азр МеЬ

ТЪг

Азп 190

А1а

О1у

Суз

Азр

О1у

О1у

Ьеи

МеЬ

О1и

Рго

А1а

РЪе

ТЪг

Туг

Уа1

11е

Ьуз

Н1з

195

200

205

О1у

О1у

11е

А1а

Рго

О1и

А1а

Бег

Туг

Рго

Туг

Уа1

О1у

Ьуз

Агд

О1и

210

215

220

ТЪг

Суз

Азр

Ьуз

А1а

Ьуз

11е

Ьуз

Азр

Уа1

Ьеи

Ьуз

11е

Азр

О1у

Агд

225

230

235

240

О1п

Азп

Уа1

Рго

О1у

Ьеи

Азр

О1и

О1и

А1а

Ьеи

Агд

Ьуз

А1а

Уа1

А1а

245

250

255

Ηΐ3

О1п

Рго

Уа1

А1а

ТЪг

О1у

11е

О1п

Ьеи

Бег

О1у

Н1з

О1у

Ьеи

О1п

260

265

270

РЪе

Туг

Бег

О1и

О1у

Уа1

Туг

ТЪг

О1у

Азр

Суз

О1у

ТЪг

О1и

Рго

Азп

275

280

285

Ηΐ3

О1у

Уа1

О1у

11е

Уа1

О1у

Туг

О1у

О1и

Азп

О1и

Ьуз

О1у

11е

Ьуз

290

295

300

РЪе

Тгр

ТЪг

Уа1

Ьуз

Азп

Бег

Тгр

О1у

Рго

ТЪг

Тгр

О1у

О1и

Ьуз

О1у

305

310

315

320

Туг

11е

Н1з

Ьеи

О1п

Агд

О1у

А1а

Агд

Ьуз

О1и

О1у

Ьеи

Суз

О1у

Уа1

325

330

335

А1а

МеЬ

Н1з

Бег

Бег

РЪе

Рго

11е

МеЬ

Азп

Азр

Рго

Азп

Рго

Рго

Ьуз

340

345

350

Азр

Азр

Рго

Азп

О1у

Рго

Ьуз

Азр

Азр

Рго

Азр

А1а

Рго

Ьуз

Азр

Рго

355

360

365

Ьуз

РЪе

Ьуз

ТЪг

ТЪг

О1п

Агд

Ьеи

О1п

О1у

11е

Агд

ТЪг

Ьуз

Ьеи

Ьеи

370

375

380

О1и Ьеи

385

<210> 29

<211> 1161

<212> ДНК

<213> АтЪгоз1а агЬетизНЬоНа

<400> 29

аЬддаааЬса асаадЬЬадЬ ЬЬдЬЬЬЬЬса ЬЬЬЬсЬЬЬдд ЬЬЬЬдаЬЬЬЬ аддасЬЬдЬа

60

- 32 029703

дададсЬЬсс	аЬЬассаЬда	дадададсЬс	дааЬсддадд	аддддЬЬЬаЬ	ддддаЬдЬаЬ	120
даЬадаЬдда	дддадсааса	сааЬаЬсдаа	аЬдадаадсс	сддаасддЬЬ	сааЬдЬдЬЬс	180
аадЬасааЬд	ЬЬаддсдсаЬ	ЬсасдааЬсд	ааЬаадаЬдд	асаадссдЬа	ЬаадЬЬдаад	240
дЬдаасдадЬ	ЬЬдсЬдасаЬ	дасЬаассЬЬ	дадЬЬсдЬЬа	асасдЬаЬдс	ЬаасЬсдаад	300
аЬЬадссаЬЬ	ЬЬсаадсссЬ	ссдаддаЬса	дсассЬддсЬ	сдаЬЬдаЬас	сдасссЬааЬ	360
ааадаЬЬЬса	ЬаЬаЬдсааа	ЬдЬсасЬааа	аЬсссадаЬа	аддЬсдаЬЬд	дадддадааа	420
аасдсЬдЬса	сЬдаЬдЬсаа	дддЬсааддс	ддаЬдЬддаа	дЬЬдЬЬдддс	дЬЬЬдссдсЬ	480
дЬддЬЬдсас	ЬддааддааЬ	ааасдсдаЬс	адаассддда	адсЬддЬааа	аЬЬЬЬссдаа	540
саасаасЬЬд	ЬсдаЬЬдЬда	саЬдасдаас	дсаддаЬдсд	асддадддсЬ	ааЬддаассЬ	600
дсаЬЬсасаЬ	асдЬсаЬааа	дсаЬддаддЬ	аЬадсЬссад	аадсдадсЬа	сссЬЬасдЬа	660
ддсаааадад	ааассЬдсда	сааадсааад	аЬЬааадаЬд	ЬдЬЬдаадаЬ	сдаЬддЬада	720
сааааЬдЬдс	сЬддасЬЬда	сдаадаадса	сЬааддаадд	садЬЬдсаса	ссадссЬдЬа	780
дсЬассддЬа	ЬасаасЬЬад	сддссаЬддЬ	ЬЬдсадЬЬсЬ	аЬЬссдаддд	ЬдЬаЬаЬасс	840
ддадаЬЬдЬд	дЬасададсс	дааЬсаЬддЬ	дЬЬддааЬЬд	ЬдддаЬасдд	ЬдадааЬдаа	900
ааддддаЬЬа	ааЬЬсЬддас	сдЬдаадаас	ЬсаЬддддас	саасаЬдддд	ададааддда	960
ЬасаЬасаЬЬ	Ьасаасдсдд	адсЬаддааа	дадддасЬаЬ	дсддадЬадс	ааЬдсаЬЬсЬ	1020
ЬсЬЬЬЬссЬа	ЬЬаЬдаасда	сссааассса	ссЬааадасд	ассссааЬдд	ассЬааадас	1080
дасссЬдаЬд	сассЬаадда	ссссаааЬЬЬ	аааасдасЬс	ададдЬЬдса	адддаЬаадд	1140
асЬаааЬЬдЬ	ЬддадЬЬдЬд	а				1161

<210> 30

<211> 15

<212> РКТ

<213> АтЬгоз1а агЬетпзШоПа

<400> 30

О1у Бег А1а Рго О1у Бег 11е Азр ТЬг Азр Рго Азп Ьуз Азр РЬе

1		5	10	15
<210> <211> <212> <213>	31 25 РКТ АтЬгоз1а	агЬетпзШоПа
<400>	31
О1у Бег А1а Рго 1	О1у Бег 11е Азр 5	ТЬг Азр 10	Рго Азп Ьуз Азр РЬе 11е 15

Туг А1а Азп Уа1 ТЬг Ьуз 11е Рго Азр

- 33 029703

20 25

<210> 32

<211> 15

<212> РКТ

<213> АтЪгоз1а агЬеттзПЕоПа

<400> 32

Уа1 ТЪг Азр Уа1	Ьуз О1у О1п О1у	О1у	Суз	О1у	Бег	Суз	Тгр	А1а
1		5		10					15
<210>	33
<211>	15
<212>	РКТ
<213>	АтЪгоз1а	агОетЪзШоНа
<400>	33
РЪе А1а А1а Уа1	Уа1 А1а Ьеи О1и	О1у	11е	Азп	А1а	11е	Агд	ТЪг
1		5		10					15
<210>	34
<211>	15
<212>	РКТ
<213>	АтЪгоз1а	агОетЪзШоНа
<400>	34
Ьеи О1и О1у 11е	Азп А1а 11е Агд	ТЪг	О1у	Ьуз	Ьеи	Уа1	Ьуз	РЪе
1		5		10					15
<210>	35
<211>	15
<212>	РКТ
<213>	АтЪгоз1а	агОетЪзШоНа
<400>	35
А1а РЪе	> ТЪг Туг	Уа1 11е Ьуз Н1з	О1у	О1у	11е	А1а	Рго	О1и	А1а
1		5		10					15
<210>	36
<211>	15
<212>	РКТ
<213>	АтЪгоз1а	агОетЪзШоНа
<400>	36
О1у О1у Ьеи Ме5	О1и Рго А1а РЪе	ТЪг	Туг	Уа1	11е	Ьуз	Нтз	О1у
1		5		10					15

<210> 37

<211> 15

<212> РКТ

<213> АтЪгозта агОеттзШоНа

- 34 029703

<400> 37

Ьуз Азр	ι Уа1 Ьеи	Ьуз 11е Азр О1у	Агд	О1п	Азп	Уа1	Рго	О1у	Ьеи
1		5		10					15
<210>	38
<211>	15
<212>	РКТ
<213>	АшЬгоз1а	агбетгзИЕоИа
<400>	38
Зег РЬе	! Рго 11е	Меб Азп Азр Рго	Азп	Рго	Рго	Ьуз	Азр	Азр	Рго
1		5		10					15
<210>	39
<211>	15
<212>	РКТ
<213>	АшЬгоз1а	агбетгзИЕоИа
<400>	39
Рго Азп Ьуз Азр	РЬе 11е Туг А1а	Азп	Уа1	ТЬг	Ьуз	11е	Рго	Азр
1		5		10					15
<210>	40
<211>	15
<212>	РКТ
<213>	АшЬгоз1а	агбетгзИЕоИа
<400>	40
О1у Уа1	О1у 11е	Уа1 О1у Туг О1у	О1и	Азп	О1и	Ьуз	О1у	11е	Ьуз
1		5		10					15
<210>	41
<211>	15
<212>	РКТ
<213>	АшЬгоз1а	агбетгзИЕоИа
<400>	41
О1и Ьуз	О1у 11е	Ьуз РЬе Тгр ТЬг	Уа1	Ьуз	Азп	Зег	Тгр	О1у	Рго
1		5		10					15

Claims (26)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Выделенный полипептид, включающий:

   a) последовательность δΕΟ ΙΌ N0: 1 (АтЬ а X) или

   b) последовательность, которая по меньшей мере на 57% идентична последовательности δΕΟ ΙΌ N0: 1 и обладает такой же биологической активностью, что и полипептид с последовательностью δΕΟ ΙΌ N0: 1, или

   c) вариант последовательности, определенной в а) или Ь), который по меньшей мере на 85% идентичен последовательности δΕΟ ΙΌ N0: 1 и который проявляет сниженную аллергенность или сниженную ферментативную активность по сравнению с последовательностью, определенной в а) или Ь), или

   ά) производное последовательности, определенной в а), Ь) или с), которая была модифицирована путем термической, химической или физической обработки, или

   е) фрагмент последовательности, определенной в а), с), или последовательности, которая по мень- 35 029703

   шей мере на 67% идентична 8ЕЦ ГО N0: 1, который имеет такую же биологическую активность, что и полипептид последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1, причем данный фрагмент содержит по меньшей мере 250 смежных аминокислот из последовательности, определенной в а), с), или последовательности, которая по меньшей мере на 67% идентична 8ЕЦ ГО N0: 1 и которая имеет такую же биологическую активность, что и полипептид последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1, или

   (ί) эпитопный фрагмент последовательности, определенной в а), Ь) или с).
2. 2. Выделенный полипептид по п.1, при этом данный полипептид включает последовательность, которая по меньшей мере на 67% идентична последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1, причем:

   (ί) молекулярная масса данного полипептида отличается не более чем на 10% от молекулярной массы полипептида, состоящего из 8ЕЦ ГО N0: 1; и

   (ίί) данный полипептид обладает такой же биологической активностью, что и полипептид с последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 1.
3. 3. Выделенный полипептид по п.1 или 2, при этом данный полипептид включает последовательность, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности 8ЕЦ ГО N0: 1.
4. 4. Выделенный полипептид по любому из пп.1-3, причем указанный полипептид содержит следующую^) мутацию(ии):

   a) I вместо V в положении 97 в 8ЕЦ ГО N0: 1; или

   b) V вместо А в положении 104 в 8ЕЦ ГО N0: 1; или

   c) А вместо С в положении 249 в 8ЕЦ ГО N0: 1; или й) V вместо С в положении 249 в 8ЕЦ ГО N0: 1; или е) Е вместо Ό в положении 252 в 8ЕЦ ГО N0: 1; или

   ί) I вместо V в положении 97 в 8ЕЦ ГО N0: 1 и V вместо А в положении 104 в 8ЕЦ ГО N0: 1; или

   д) V вместо С в положении 249 и Е вместо Ό в положении 252 в 8ЕЦ ГО N0: 1; или

   Ιι) I вместо V в положении 97 и А вместо С в положении 249 в 8ЕЦ ГО N0: 1; или

   ί) I вместо V в положении 97, V вместо С в положении 249 и Е вместо Ό в положении 252 в 8ЕЦ ГО

   N0: 1.
5. 5. Выделенный полипептид по любому из пп.1-4, который является вариантом полипептида, проявляющий сниженную ферментативную активность, который содержит по меньшей мере одну аминокислоту в положении 47, 181 или 202 8ЕЦ ГО N0: 1, которая была модифицирована.
6. 6. Выделенный полипептид по любому из пп.1-5, который является вариантом полипептида или его фрагмента, причем указанный вариант полипептида сохраняет иммуногенность.
7. 7. Выделенный полипептид по любому из пп.1-6, причем указанный полипептид является аллергоидом.
8. 8. Выделенный полипептид по любому из пп.1-7, содержащий эпитопный фрагмент, состоящий из последовательности, выбранной из группы, состоящей из 8ЕЦ ГО N0: 30, 8ЕЦ ГО N0: 31, 8ЕЦ ГО N0: 32, 8ЕЦ ГО N0: 33, 8ЕЦ ГО N0: 34, 8ЕЦ ГО N0: 35, 8ЕЦ ГО N0: 36, 8ЕЦ ГО N0: 37, 8ЕЦ ГО N0: 38, 8ЕЦ ГО N0: 39, 8ЕЦ ГО N0: 40 и 8ЕЦ ГО N0: 41.
9. 9. Выделенная нуклеиновая кислота, которая включает последовательность, кодирующую полипептид по любому из пп.1-6 и 8.
10. 10. Праймер или зонд, гибридизирующийся с выделенной нуклеиновой кислотой по п.9 при стандартных условиях гибридизации.
11. 11. Вектор, включающий последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид по любому из пп.1-6 и 8, которая функционально связана с контролирующими экспрессию последовательностями.
12. 12. Клетка-хозяин, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую полипептид по любому из пп.1-6 и 8, или вектор по п.11.
13. 13. Способ получения полипептида по любому из пп.1-8 ίη νίΐτο, который включает:

    a) культивирование клеток хозяина по п.12 в условиях, подходящих для экспрессирования полипептида по любому из пп.1-6 и 8; и

    b) выделение экспрессированного полипептида.
14. 14. Способ получения полипептида по любому из пп.1-8 ίη νίνο, который включает:

    a) культивирование прокариотического или эукариотического организма, трансформированного нуклеиновой кислотой по п.9 или вектором по п.11, в таких условиях и в течение такого времени, которое достаточно для экспрессирования данного полипептида; и

    b) выделение полипептидов, полученных из трансформированных организмов.
15. 15. Выделенное антитело, которое специфически связывается с полипептидом по любому из пп.1-8.
16. 16. Фармацевтическая композиция, включающая полипептид по любому из пп.1-8 и фармацевтически приемлемый носитель.
17. 17. Фармацевтическая композиция, включающая антитело по п.15 и фармацевтически приемлемый носитель.
18. 18. Применение полипептида по любому из пп.1-8 для терапевтического лечения.
19. 19. Применение антитела по п.15 для терапевтического лечения.

    - 36 029703
20. 20. Применение полипептида по любому из пп.1-8 для профилактики или лечения аллергической реакции на пыльцу амброзии.
21. 21. Применение антитела по п.15 для профилактики или лечения аллергической реакции на пыльцу амброзии.
22. 22. Применение полипептида по любому из пп.1-8 для выявления аллергии или чувствительности к пыльце амброзии.
23. 23. Способ диагностики аллергии или чувствительности к пыльце амброзии у индивидуума ίη νΐίΓο, который включает следующие стадии:

    a) инкубация полипептида по любому из пп.1-8 с биологическим образцом от индивидуума;

    b) детектирование наличия или отсутствия иммунных комплексов между данным полипептидом и ^Ξδ из биологического образца от индивидуума;

    причем наличие иммунных комплексов между данным полипептидом и ^βδ из биологического образца от индивидуума означает, что индивидуум сенсибилизирован или аллергичен на пыльцу амброзии.
24. 24. Набор для диагностики аллергии, включающий:

    a) полипептид по любому из пп.1-8 и

    b) скарификатор; и/или

    c) инструкции по применению.
25. 25. Способ обнаружения полипептида по любому из пп.1-8 в образце ίη νΐίΓο, который включает следующие стадии:

    a) инкубация образца с антителом по п.15;

    b) детектирование наличия или отсутствия иммунных комплексов, содержащих данное антитело; причем наличие иммунных комплексов, содержащих данное антитело, является показателем присутствия полипептида по любому из пп.1-8 в данном образце.
26. 26. Способ количественного определения полипептида по изобретению в образце ίη νΐίΓο, который включает следующие стадии:

    a) обеспечение известного количества полипептида по п.1, необязательно помеченного, в качестве калибровочного стандарта;

    b) деградирование образца, содержащего определяемый полипептид, с получением смеси полипептидов, необязательно помеченных;

    причем, по крайней мере, полипептиды в деградируемом образце или в калибровочном стандарте помечены, а если помечены оба полипептида, то метящий реагент, используемый для полипептидов в калибровочном стандарте, отличается от метящего реагента, используемого для полипептидов в деградируемом образце,

    c) количественная оценка абсолютного количества полипептида по изобретению в образце путем сопоставления количества полипептида в калибровочном стандарте с количеством соответствующего полипептида в деградированном образце методом масс-анализа.