EA029522B1 - Введение дефекта в ген ahp6 для увеличения выхода семян растения - Google Patents

Введение дефекта в ген ahp6 для увеличения выхода семян растения Download PDF

Info

Publication number
EA029522B1
EA029522B1 EA201300709A EA201300709A EA029522B1 EA 029522 B1 EA029522 B1 EA 029522B1 EA 201300709 A EA201300709 A EA 201300709A EA 201300709 A EA201300709 A EA 201300709A EA 029522 B1 EA029522 B1 EA 029522B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
gene
lei
azr
endogenous
protein
Prior art date
Application number
EA201300709A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201300709A1 (ru
Inventor
Томас Шмюллинг
Томас Вернер
Original Assignee
Томас Шмюллинг
Томас Вернер
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Томас Шмюллинг, Томас Вернер filed Critical Томас Шмюллинг
Publication of EA201300709A1 publication Critical patent/EA201300709A1/ru
Publication of EA029522B1 publication Critical patent/EA029522B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8291—Hormone-influenced development
    • C12N15/8295—Cytokinins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение относится к способу увеличения выхода семян растения, который включает введение дефекта в эндогенный ген АНР6 в клетках растения, при этом данный дефект подавляет экспрессию и (или) активность продукта вышеупомянутого эндогенного гена АНР6 в сравнении с соответствующим контрольным растением, в котором нет указанного дефекта.

Description

Изобретение относится к способу увеличения выхода семян растения, который включает введение дефекта в эндогенный ген АНР6 в клетках растения, при этом данный дефект подавляет экспрессию и (или) активность продукта вышеупомянутого эндогенного гена АНР6 в сравнении с соответствующим контрольным растением, в котором нет указанного дефекта.
029522 Β1
029522
В связи с необходимостью снабжения постоянно растущей популяции едой и другими продуктами растительного происхождения людей всегда интересовало повышение урожайности в сельском хозяйстве.
На урожайность растения можно влиять различными способами, например путем улучшения характеристик роста растения или задерживания старения листьев. Известно много механизмов и путей, относящихся к росту и развитию растений.
Цитокинин - растительный гормон, который играет положительные и отрицательные регуляторные роли во многих аспектах роста и развития растений. Он стимулирует образование и активность меристем побегов, способен образовывать акцептирующие ткани, замедлять старение листьев, сдерживать рост и ветвление корня, а также оказывает влияние на прорастание семян и реакцию на стресс (Мок Ό.^.δ. & Мок М.С. (2001) Апп. Кеу. Р1аи1 РЬу8ю1. Мо1. Βίο. 52, 89-118). Анализ растений с недостатком цитокинина показал, что цитокинин выполняет противоположные функции в меристемах побегов и корня, что наводит на мысль о незаменимой функции этого гормона в количественном контроле роста органов (ХУегпег Т., Мо1ука V., Ьаисои V., 8те15 К., Уап Опске1еп Н., 8сЬтиШп§ Т., Р1ап1 Се11 2003, 15(11):253250; ХУегпег Т., Мо1ука V., 81гпаб М., 8сЬтиШп§ Т., Ргос. ИаИ. Асаб. 8ск υδΑ 2001, 98(18): 10487-92).
Было показано, что цитокинин-оксидазы/цитокинин-дегидрогеназы (СКХ) являются важным фактором в регуляции гомеостаза растительного гормона цитокинина. Геном арабидопсиса кодирует семь генов СКХ, имеющих разные домены экспрессии (ХУегпег е1 а1., 2001; ХУегпег е1 а1., 2003). Белки СКХ различаются по своей субклеточной локализации и биохимическим свойствам (ХУегпег е1 а1., 2003). При помощи сверхэкспрессии индивидуальных генов СКХ удалось установить растения с дефицитом цитокинина, а также обнаружить, что цитокинин является позитивным регулятором активности меристемы побегов и негативным регулятором активности меристемы корня.
Недавние исследования показали, что в растении риса подавление функции определенного гена СКХ, ортолога риса по отношению к гену СКХ3 арабидопсиса, приводит к увеличению числа несущих частиц вышеуказанного растения риса (см. υδ 2006/0123507 А1).
Хотя эти результаты весьма многообещающие, по-прежнему существует потребность в дальнейшем повышении урожайности растений.
Целью настоящего изобретения является создание средств и способов, подходящих для улучшения урожайности растений.
Для достижения вышеуказанной цели в настоящем изобретении используется решение, подробно описанное ниже.
В настоящем изобретении предлагается способ увеличения выхода семян растения, который включает разрушение эндогенного гена АНР6 в клетках растения, при этом данное разрушение подавляет экспрессию и (или) активность продукта вышеупомянутого эндогенного гена АНР6 в сравнении с соответствующим контрольным растением, в котором нет указанного разрушения.
Было обнаружено удивительное явление: разрушение гена АНР6 в растении приводит к появлению растений с повышенным выходом семян в сравнении с растением, у которого отсутствует указанное разрушение гена. Тогда как даже одиночное разрушение АНР6 приводит к существенному увеличению выхода семян, одновременное разрушение АНР6 вместе с хотя бы одним геном СКХ приводит к необычайно большому дополнительному увеличению выхода семян в сравнении с генами дикого типа и одиночными разрушениями генов СКХ. Наиболее заметный рост выхода семян был отмечен при одновременном разрушении генов АНР6, СКХ3 и СКХ5. Еще более удивительным стало обнаружение того, что одновременное стабильное разрушение гена АНР6 и хотя бы одного из генов СКХ приводит к образованию растений с еще большей урожайностью. Судя по всему, разрушение эндогенного гена АНР6 в растении с повышенным статусом цитокининов является особенно эффективным. Повышение статуса цитокининов наблюдается при проявлении в растении фенотипа, который обычно связывают с присутствием повышенного количества цитокининов. Повышение статуса цитокининов может возникать в результате одновременного разрушения гена АНР6 вместе с хотя бы одним эндогенным геном СКХ растения, например одновременного разрушения гена АНР6 вместе с разрушением минимум двух различных эндогенных генов СКХ. Однако повышенный статус цитокининов также может быть вызван иными изменениями или манипуляциями, например мутациями в генах, участвующих в синтезе цитокининов, или мутациями в рецепторах цитокининов. Еще одним вариантом является воздействие на цитокининовый статус растения путем введения химических соединений. Известны соединения, которые приводят к повышению статуса цитокининов.
В настоящем изобретении предусматривается способ увеличения выхода семян растения, который включает разрушение эндогенного гена АНР6 в клетках растения, при этом данное разрушение подавляет экспрессию и (или) активность продукта вышеупомянутого эндогенного гена АНР6 в сравнении с соответствующим контрольным растением, в котором нет указанного разрушения.
Также в изобретении предусматривается использование предлагаемого способа для увеличения выхода семян растения и полученного от него потомства и (или) создания не встречающегося в природе растения с повышенным выходом семян.
Кроме того, в настоящем изобретении предусматривается не встречающееся в природе растение,
- 1 029522
включающее разрушение эндогенного гена АНР6 и разрушение хотя бы одного эндогенного гена СКХ.
В настоящем изобретении также предусматривается изолированная растительная клетка или не встречающееся в природе растение, которые можно получить или которые были получены при помощи одного из предлагаемых в изобретении способов.
Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в тексте, имеют такое же значение, в каком их обычно понимают обычные специалисты в области, к которой относится изобретение. В описании и формуле настоящего изобретения используется следующая терминология согласно приведенным далее определениям.
В описании и приложенной формуле изобретения формы единственного числа включают индивидуальные и множественные объекты, если контекст явно не указывает на обратное. Таким образом, к примеру, при упоминании "клетки" этот термин охватывает как одну клетку, так и комбинацию двух и более клеток, и так далее.
В способе из настоящего изобретения увеличивается выход семян растения.
Термин "растение" в общем смысле относится к любому из следующего: цельные растения, части или органы растений (например, листья, стебли, корни и т.д.), вегетативные органы или структуры побегов (например, листья, стебли и клубни), корни, цветки и цветковые органы или структуры (например, прицветники, чашелистики, лепестки, тычинки, плодолистики, пыльники и семязачатки), семена (включая эмбрион, эндосперм и семенную оболочку), плоды (созревшая завязь), растительная ткань (например, сосудистая ткань, покровная ткань и так далее), тканевая культура каллюс и растительные клетки (например, замыкающие клетки, яйцеклетки, трихомы и так далее), а также их потомство. Термин "растение" в общем смысле обозначает все организмы с функцией фотосинтеза.
Понятие растения в пределах объема изобретения включает в себя все роды и виды высших и низших растений царства растений. Под зрелыми растениями подразумеваются растения на любой стадии развития после стадии сеянца. Сеянец - молодое незрелое растение на ранней стадии развития. Растения в изобретении могут быть однолетними, многолетними, однодольными и (или) двудольными растениями. В частности, растения в изобретении могут представлять собой растения из следующего семейства цветов: Капустные (Втаккюасеае), в частности растения рода Капуста (Вгаккюа) и Резуховидка (ЛтаЫбор818).
Растительная клетка в данном контексте также включает, среди прочего, клетки, полученные из или обнаруженные в растении или его части: семенах, культурах, суспензионных культурах, эмбрионах, меристемных областях, тканях каллюса, листьях, корнях, побегах, гаметофитах, спорофитах, пыльце и микроспорах. Растительные клетки также могут подразумевать включение видоизмененных клеток, например протопластов, полученных из вышеупомянутых тканей.
При использовании в данном описании по отношению к растению термин "не встречающийся в природе" обозначает растение с геномом, который был модифицирован человеком. Трансгенное растение является примером растения, не встречающегося в природе. Трансгенное растение может содержать, например, экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты, в том числе химерный ген, включающий транскрибирующийся участок, который при транскрибировании дает биологически активную молекулу РНК, способную снижать экспрессию эндогенного гена, например, гена АНР6 согласно изобретению, таким образом, подобное растение генетически модифицировано человеком. Кроме того, растение, содержащее мутацию в эндогенном гене, например мутацию в эндогенном гене АНР6 (в частности, в регуляторном элементе или в кодирующей последовательности) в результате воздействия мутагенного агента, также считается не встречающимся в природе растением, так как оно было генетически модифицировано человеком. Также не встречающимся в природе растением считается растение определенного вида, например, рапс (Вгаккюа парик) или другие члены семейства Капустных, содержащее мутацию в эндогенном гене, например в эндогенном гене АНР6, которая в природе не встречается среди растений конкретно этого вида и которая образовалась в результате, например, направленных процессов скрещивания, в частности скрещивания с использованием маркера и селекции или интрогрессии, с растением этого же или другого вида. Напротив, растение, содержащее только спонтанные или естественные мутации, т.е. растение, которое не было генетически модифицировано человеком, не является "не встречающимся в природе" растением в данном контексте и, следовательно, не охватывается настоящим изобретением. Специалистам в данной области очевидно, что хотя не встречающиеся в природе растения как правило имеют измененную нуклеотидную последовательность по сравнению с встречающимися в природе растениями, тем не менее не встречающееся в природе растение может быть генетически модифицировано человеком без изменения его нуклеотидной последовательности, например путем изменения его паттерна метилирования.
Термин "трансгенный" относится к растению с встроенными нуклеотидными последовательностями, включая среди прочего гены, полинуклеотиды, ДНК, РНК и т.д., и (или) их изменения (например, мутации, точечные мутации и т.п.), которые были введены в растение в сравнении с неизмененным растением при помощи процессов, которые не являются преимущественно биологическими процессами в производстве растений. Таким образом, термин "трансгенное растение" охватывает не только растения с неэндогенными нуклеиновыми кислотами, но и явным образом включает также растения с мутациями в
- 2 029522
эндогенном гене, например точечными мутациями, которые были введены в вышеуказанное трансгенное растение в сравнении с неизмененным растением при помощи процессов, которые не являются преимущественно биологическими процессами в производстве растений.
В предлагаемом способе выход семян растения увеличивается посредством разрушения эндогенного гена АНР6.
Термин "ген" или "генная последовательность" используется в широком смысле для обозначения любой нуклеиновой кислоты, связанной с биологической функцией. Гены, как правило, включают кодирующие последовательности и (или) регуляторные последовательности, необходимые для экспрессии этих кодирующих последовательностей. Термин "ген" относится к конкретной геномной последовательности, а также к кДНК или иРНК, кодируемой данной геномной последовательностью. Гены также включают неэкспрессированные сегменты нуклеиновых кислот, которые, например, образуют распознавательные последовательности для других белков. Неэкспрессированные регуляторные последовательности включают промоторы и усилители, с которыми связываются регуляторные белки, например факторы транскрипции, которые приводят к транскрипции смежных или близких последовательностей.
Термин "эндогенный" относится к любому гену или нуклеотидной последовательности, которая уже присутствует в заданной клетке или организме дикого типа, например растения. Термин "экзогенный" относится к любому гену или нуклеотидной последовательности, которые не являются эндогенными.
Ген АНР6 кодирует белок АНР6, который был впервые описан для арабидопсиса (гистидин фосфотрансферный белок арабидопсиса 6). Белок АНР6 принадлежит структурному семейству гистидинфосфотрансферных протеинкиназ и протеинтранфераз. Однако в белке АНР6 нет остатка гистидина, который необходим для фосфотрансмиссии и присутствует в других белках АНР, и который сохраняется в семействе гистидин-фосфотрансферных киназ и транфераз. Вместо остатка гистидина АНР6 имеет остаток аспарагина в позиции Αδη83 АНР6а с номером последовательности §ЕЦ ГО 1. В контексте настоящего изобретения термин "белок АНР6" может относиться к белку, который, например
принадлежит структурному семейству гистидин-фосфотрансферных протеинкиназ и протеинтранфераз; и (или)
не имеет гистидина в позиции, соответствующей позиции Αδη83 в последовательности §ЕЦ ГО 1; и
(или)
проявляет в основном ту же функцию, что и белок АНР6 с 8ЕЦ ГО 1 или 12; и (или)
содержит аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее
70%, не менее 80%, не менее 90% или не менее 95% в сравнении с полной аминокислотной последовательностью 8ЕО ГО 1 или 12.
Считается, что белок АНР6 проявляет в основном ту же функцию, что и белок АНР6 с 8ЕЦ ГО 1 или 12, если он проявляет не менее 50%, не менее 70% или не менее 90% активности белка АНР6 арабидопсиса с 8ЕО ГО 1 или 12 при измерении в рамках биохимической ίη νίίτο проверки функции белка АНР6. Подходящий биохимический ίη νίίτο тест на функцию белка АНР6 описан в источнике Майопеп с1 а1. "Τ’νΙοΕίηίη δίβηαΐίηβ αηά ίίδ ίηΐιίόίΐοτ ΑΗΡ6 гедикйе се11 Га1е битшд ναδαιιΕιτ άеνе1ορтеηί", §с1Спсс 2006, 311, 94-98. Согласно описанию в источнике Μαίιοικη еί а1. (2006), белок АНР6 не проявляет фосфотрансферной активности и выступает в качестве ингибитора сигналинга цитокининов путем взаимодействия с механизмом фосфопереноса.
Белок АНР6 арабидопсиса существует в двух альтернативно сплайсированных формах, а именно АНР6а и АНР6Б, которые различаются по длине первых экзонов. В данном контексте, если не указано иное, термин "белок АНР6" относится к обеим сплайсированным формам АНР6а и АНР6Б. Белок АНР6 арабидопсиса включает аминокислотную последовательность 8ЕО ГО 1 в случае АНРба или 8ЕО ГО 12 в случае АНР6Б, геномная последовательность гена АНР6 арабидопсиса включает нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО 2, кодирующая последовательность гена АНР6 арабидопсиса включает нуклеотидную последовательность §ЕЦ ГО 3 в случае белка АНР6а и §ЕЦ ГО 13 в случае белка АНР6Б, а кДНК гена АНР6 арабидопсиса включает нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО 4 в случае АНР6а и 8ЕО ГО 14 в случае ЛНР6Б.
Эндогенный ген АНР6 может включать или состоять из:
(а) нуклеиновой кислоты, кодирующей белок АНР6 и включающей аминокислотную последовательность 8ЕО ГО 1, 12 или ее ортолог;
(б) нуклеиновой кислоты, кодирующей белок АНР6 и включающей аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее 70%, не менее 80%, не менее 90% или не менее 95% в сравнении с полной аминокислотной последовательностью 8ЕЦ ГО 1 или 12;
(в) нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность 8ЕО ГО 2, 3, 4, 13 или 14;
(г) нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательности не менее 90% по всей полной нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО 2, 3, 4, 13 или 14; либо
(д) нуклеиновой кислоты, гибридизирующейся при жестких условиях в одну из нуклеотидных по- 3 029522
следовательностей, определенных в подпунктах (а), (б), (в) и (или) (г).
Термин "нуклеиновая кислота" или "полинуклеотид" в основном используется в соответствии с общепринятым в данной области значением для обозначения полимера рибонуклеиновой кислоты (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), или его аналога, например нуклеотидного полимера, включающего модификации нуклеотидов, пептид-нуклеиновой кислоты и т.п. В некоторых случаях нуклеиновая кислота может представлять собой полимер, включающий несколько типов мономеров, например субъединицы и РНК, и ДНК. Нуклеиновая кислота может представлять собой, например, хромосому или хромосомный сегмент, вектор (например, экспрессионный вектор), экспрессионную кассету, полимер оголенной ДНК или РНК, продукт полимеразной цепной реакции (ПЦР), олигонуклеотид, зонд и т.д. Нуклеиновая кислота может быть, к примеру, одноцепочечной и (или) двухцепочечной. Если не указано иное, в контексте настоящего изобретения определенная нуклеотидная последовательность может включать или кодировать комплементарную последовательность в дополнение к любой другой явно указанной последовательности.
Термин "полинуклеотидная последовательность", "нуклеотидная последовательность" или "нуклеиновая кислота" относится к смежной последовательности нуклеотидов в одной нуклеиновой кислоте или к ее представлению, например, в виде строки символов. Таким образом, в зависимости от контекста, "полинуклеотидная последовательность" представляет собой полимер нуклеотидов (олигонуклеотида, ДНК, нуклеиновой кислоты и т.п.) или строку символов, обозначающую полимер нуклеотида. Из любой указанной полинуклеотидной последовательности может быть определена соответствующая нуклеиновая кислота или комплементарная полинуклеотидная последовательность (например, комплементарная нуклеиновая кислота).
Термин "подпоследовательность" или "фрагмент" обозначает любую часть полной последовательности.
Термин "ортолог" в контексте данного изобретения обозначает ген какого-либо вида, например, отличного от арабидопсиса, который демонстрирует наибольшее сходство, т.е. наивысшую идентичность последовательности, с указанным геном арабидопсиса, и (или) который кодирует белок, выполняющий в основном ту же функцию, что и указанный ген арабидопсиса, т.к. оба гена произошли от одного и того же предка. Термин "ортолог" может обозначать эндогенный ген, кодирующий белок с фактически такой же функцией и включающий последовательность (полипептида или нуклеиновой кислоты) с идентичностью последовательности не менее 70%, не менее 80%, не менее 85%, не менее 90%, не менее 95% или не менее 99% по сравнению с заданной последовательностью, к которой относится указанный ортолог, например, по всей длине последовательности. В частности, термин "ортолог" может обозначать эндогенный ген, который происходит от вида, отличного от арабидопсиса, кодирует белок с фактически такой же функцией и включает последовательность с идентичностью последовательности не менее 70%, не менее 80%, не менее 85%, не менее 90%, не менее 95% или не менее 99% по сравнению с заданной последовательностью арабидопсиса, к которой относится соответствующий ортолог, например, по всей длине последовательности.
В контексте данного изобретения под ортологом может пониматься эндогенный ген, который происходит от вида, отличного от арабидопсиса, кодирует белок с фактически такой же функцией и включает аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее 70%, не менее 80%, не менее 85%, не менее 90%, не менее 95% или не менее 99% по всей длине последовательности по сравнению с
белком АНР6 арабидопсиса с номером последовательности 8ЕЦ ГО 1 или 12;
белком СКХ1 арабидопсиса с 8ЕЦ ГО 5;
белком СКХ2 арабидопсиса с 8ЕЦ ГО 6;
белком СКХ3 арабидопсиса с 8ЕЦ ГО 7;
белком СКХ4 арабидопсиса с 8ЕЦ ГО 8;
белком СКХ5 арабидопсиса с 8ЕЦ ГО 9;
белком СКХ6 арабидопсиса с 8ЕЦ ГО 10; и (или)
белком СКХ7 арабидопсиса с 8ЕЦ ГО 11 соответственно.
Ортолог белка АНР6 выполняет в основном ту же функцию, что и белок АНР6 арабидопсиса, включающий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ГО 1 или 12. Биохимический ίη νΐίτο тест для функции белка АНР6 описан в источнике Майопеп с1 а1. "СуЮкипп 81§паИп§ апб ϊΐ8 ίηΠίόίίΟΓ АНР6 геди1а1е се11 Га1е бигтд тазсийц беνе1ορтеηΐ", 8с1епсе 2006, 1, 94-98. Ортолог белка АНР6 может проявлять не менее 50% активности белка АНР6 арабидопсиса с 8ЕЦ ГО 1 или 12 при измерении в рамках вышеупомянутого биохимического ш νΐίτο теста, предпочтительно не менее 70%, еще более предпочтительно не менее 90%.
Ортолог определенного белка СКХ арабидопсиса выполняет в основном ту же функцию, что и соответствующий белок СКХ арабидопсиса. Специалисту хорошо известны средства и способы определения того, проявляет ли определенный белок цитокинин-оксидазную или цитокинин-дегидрогеназную активность или нет, а также определения уровня цитокинин-оксидазной или цитокинин-дегидрогеназной активности определенного белка или зонда в абсолютных величинах и (или) относительно другого белка
- 4 029522
или зонда. В специальной литературе приводятся подробные указания касательно проверки белков на указанную активность, см., например, ЕС 1.5.99.12.
Ортолог белка СКХ1 может проявлять не менее 50% активности белка СКХ1 арабидопсиса с δΕΟ ГО 5 при измерении в рамках вышеупомянутого биохимического ίη νίΐτο теста, предпочтительно не менее 70%, еще более предпочтительно не менее 90%.
Ортолог белка СКХ2 может проявлять не менее 50% активности белка СКХ2 арабидопсиса с δΕΟ ГО 6 при измерении в рамках вышеупомянутого биохимического ίη νίΐτο теста, предпочтительно не менее 70%, еще более предпочтительно не менее 90%.
Ортолог белка СКХ3 может проявлять не менее 50% активности белка СКХ3 арабидопсиса с δΕΟ ГО 7 при измерении в рамках вышеупомянутого биохимического ίη νίΐτο теста, предпочтительно не менее 70%, еще более предпочтительно не менее 90%.
Ортолог белка СКХ4 может проявлять не менее 50% активности белка СКХ4 арабидопсиса с δΕΟ ГО 8 при измерении в рамках вышеупомянутого биохимического ίη νίΐτο теста, предпочтительно не менее 70%, еще более предпочтительно не менее 90%.
Ортолог белка СКХ5 может проявлять не менее 50% активности белка СКХ5 арабидопсиса с δΕΟ ГО 9 при измерении в рамках вышеупомянутого биохимического ίη νίΐτο теста, предпочтительно не менее 70%, еще более предпочтительно не менее 90%.
Ортолог белка СКХ6 может проявлять не менее 50% активности белка СКХ6 арабидопсиса с δΕΟ ГО 10 при измерении в рамках вышеупомянутого биохимического ίη νίΐτο теста, предпочтительно не менее 70%, еще более предпочтительно не менее 90%.
Ортолог белка СКХ7 может проявлять не менее 50% активности белка СКХ7 арабидопсиса с δΕΟ ГО 11 при измерении в рамках вышеупомянутого биохимического ίη νίΐτο теста, предпочтительно не менее 70%, еще более предпочтительно не менее 90%.
В контексте настоящего изобретения "идентичность" последовательности объективно определяется любым из множества способов. Специалистам хорошо известны эти способы и ясно, как выбрать подходящий способ без особых затруднений. В данной области существует и хорошо известно множество способов для определения взаимоотношения (например, идентичности, схожести и (или) гомологии) между двумя и более последовательностями. В частности, эти способы включают ручное выравнивание, компьютеризированное выравнивание последовательности и их комбинации. Есть множество доступных алгоритмов (которые, как правило, реализуются на компьютере) для выполнения выравнивания последовательности, также подобные алгоритмы могут быть реализованы специалистами. Степень идентичности одной аминокислотной или нуклеотидной последовательности другой может быть определена по алгоритму ΒΕΑδΤ за авторством Кат1ш и ЛЬ8сЬи1 (Ртос. ЫаИ. Леай. δα. υδΑ 90: 5873-5877, 1993). Также могут быть использованы программы, например, ΒΕΑδΤΝ и ΒΕΑδΤΧ, разработанные на основе этого алгоритма (А1Ес1ш1 с1 а1. (1990) ί. Μο1. Βίο1. 215: 403-410). Для анализа нуклеотидной последовательности в программе ΒΕΑδΤΝ на базе ΒΕΑδΤ, задают, например, следующие параметры: ктоте (шкала) = 100, ^οτά Κη§11ι (длина слова) = 12. При анализе аминокислотных последовательностей в программе ΒΕΑδΤΧ на базе ΒΕΑδΤ задают, например, следующие параметры: ^οιό (шкала) = 50, ^οτά 1снд1Н (длина слова) = 3. При использовании программ ΒΕΑδΤ и Саррей ΒΕΑδΤ используют параметры по умолчанию. Конкретные техники подобного анализа известны специалистам (см. 1ιΙΙρ://\γ\γ\γ.ικΕί.ηίιη.ηί1ι.§ον.).
Жесткие условия гибридизации согласно настоящему изобретению включают такие условия, как 6М мочевины, 0,4% δΌδ (додецилсульфат натрия) и 0,5 х δδС (раствор цитрата и хлорида натрия); а также аналогичные жесткие условия. При выполнении гибридизации в условиях повышенной жесткости, например, при 6М мочевины, 0,4% δΌδ и 0,1 х δδΟ ожидается получение нуклеотидных последовательностей с повышенной гомологией. Ожидается, что изолированные в подобных условиях нуклеотидные последовательности будут кодировать белок с высокой гомологией уровня аминокислот в отношении белка АНР6 (δΕΟ ГО 1). В данном случае под высокой гомологией имеется в виду идентичность не менее 50% и более, 70% и более, 90% и более (например, 95% и более) по всей полной аминокислотной последовательности.
Уже известны три аллельные рецессивные мутации, которые являются примерами разрушения эндогенного гена АНР6 по аналогии с настоящим изобретением. Так, авторы Мафией еΐ а1. в "Су ΙοΚίηίη δίβηηΐίηβ аий ίΐδ ίηΠίόίίοΓ ΑΗΡ6 гедикИе се11 Га1:е йитшд таксики йеνе1οртеηΐ", δ^ΐ'^ 2006, 311, 94-98, описывают мутации ар16-1, ар16-2 и ар16-3. Мутация ар16-1 выражается в преждевременно появлении стоп-кодона в первом экзоне, тогда как в ар16-2 мутация располагается в первом интроне, в 5 парах оснований от 5'-границы сплайс-варианта АНР6Ь, а ар16-3 представляет собой инсерционный аллель ТДНК. И ар16-1, и ар16-3, судя по всему, являются нулевыми аллелями, а в аллеле ар16-2 присутствует только сплайс-вариант АРН6а.
В данном контексте термин "разрушение" или "разрушенный" означает, что ген может быть структурно разрушен так, чтобы включать не менее одной мутации или структурного изменения, при которых разрушенный ген теряет способность осуществлять эффективную экспрессию полноразмерного полнофункционального генного продукта. Разрушение эндогенного гена в смысле настоящего изобретения
- 5 029522
может происходить тогда, когда эндогенный ген включает одну или несколько мутаций, например:
(а) "миссенс-мутацию", которая представляет собой изменение в нуклеотидной последовательности, приводящее к замене одной аминокислоты на другую аминокислоту;
(б) "нонсенс-мутацию" или "мутацию стоп-кодона", которая представляет собой изменение в нуклеотидной последовательности, приводящее к преждевременному введению стоп-кодона и, следовательно, прекращению трансляции (что приводит к образованию укороченного белка); гены растения содержат трансляционные стоп-кодоны ТСА (ИСА в РНК), ТАА (ИАА в РНК) и ТАС (ИАС в РНК); таким образом, любая замена, вставка или удаление нуклеотидов, в результате которых один из этих кодонов окажется в зрелой транслируемой иРНК (в рамке считывания), приведет к прерыванию трансляции.
(в) "инсерционную мутацию" одной или нескольких аминокислот, вызванную добавлением в кодирующую последовательность нуклеиновой кислоты одного или нескольких кодонов;
(г) "делеционную мутацию" одной или нескольких аминокислот, вызванную удалением из кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты одного или нескольких кодонов;
(д) "мутацию со сдвигом рамки", в результате которой трансляция нуклеотидной последовательности происходит в другой рамке далее по ходу транскрипции относительно мутации. Мутация со сдвигом рамки может быть вызвана различными причинами, например вставкой, удалением или дупликацией одного или нескольких нуклеотидов.
Как уже говорилось, желательно, чтобы мутация (мутации) в эндогенном гене предпочтительно приводили бы к образованию мутантного белка с существенно сниженной или отсутствующей биологической активностью ίη νίνο или к необразованию белка. Как правило, любая мутация, которая приводит к образованию белка с хотя бы одной вставкой, удалением и (или) заменой аминокислоты в сравнении с белком дикого типа, может вызывать существенное сокращение или полное отсутствие биологической активности. Однако известно, что мутации в определенных частях белка с большей вероятностью приводят к снижению функции мутантного белка АРН6, например мутации, приводящие к образованию укороченных белков, у которых отсутствует значительная часть функциональных доменов.
Термин "разрушение" или "разрушенный" также включает в себя функциональное подавление или инактивацию разрушенного гена или одного из его продуктов, при которых такой ген либо не экспрессируется, либо неспособен эффективно экспрессировать полноразмерный и (или) полнофункциональный генный продукт. Функциональное подавление или инактивация могут быть вызваны структурным разрушением и (или) прерыванием экспрессии на уровне транскрипции или трансляции. Функциональное подавление или инактивация также могут быть достигнуты, например, такими способами, как антисмысловое подавление гена полинуклеотида, сайленсинг генов, индуцируемый двухцепочечной РНК, техники с использованием рибозимов и т.д., согласно подробному описанию ниже. Подавление экспрессии и (или) активности может быть вызвано, например, антисмысловыми конструкциями, смысловыми конструкциями, конструкциями сайленсинга РНК, РНК-интерференцией, геномными разрушениями (например, транспозонами, ТГБЫЫС-методом, гомологической рекомбинацией и т.п.) и т.д. Подавление экспрессии и (или) активности может быть измерено путем определения наличия и (или) количества транскриптов (например, при помощи техник нозерн-блоттинга или ПЦР с обратной транскрипцией) и (или) путем определения наличия и (или) количества полноразмерного или укороченного полипептида, кодируемого данным геном (например, при помощи иммуносорбентного ферментного анализа или вестернблоттинга) и (или) путем определения наличия и (или) количества белковой активности продукта разрушенного гена.
В контексте данного изобретения термин "разрушение" или "разрушенный" также включает в себя разрушение, которое имеет место только в части растения, в частности,в определенном типе клеток или тканей, например в репродуктивной меристеме или в верхушке побегов. Разрушение может быть достигнуто путем взаимодействия и (или) воздействия в кодирующей области, в некодирующей области и (или) в регуляторной области, например, в промоторной области определенного гена. Разрушение в смысле настоящего изобретения предпочтительно приводит к полной или частичной потере функций разрушенного гена и (или) его продукта.
Минимум одно из разрушений согласно предлагаемому в изобретении способу или в невстречающемся в природе растении, предлагаемом в изобретении, может быть получено путем введения в геном растительной клетки не менее одной полинуклеотидной последовательности, включающей нуклеотидную последовательность с не менее 90%, не менее 95%, не менее 99%, не менее 99,5% и более идентичности с последовательностью 8ЕЦ ГО 2, 3, 4, 13, 14 или ее подпоследовательностью, или ее комплементом, в результате чего хотя бы одна полинуклеотидная последовательность сцепляется с промотором согласно смысловой или антисмысловой ориентации. В другом варианте осуществления разрушение вводится в геном растительной клетки при помощи минимум одной полинуклеотидной последовательности, сконфигурированной для сайленсинга или интерференции РНК.
Одно, более одного или все разрушения в минимум одном из эндогенных генов может включать вставку одного или нескольких транспозонов. "Мобильный элемент" (ТЕ) или "транспозируемый генетический элемент" представляет собой последовательность ДНК, которая может перемещаться из одной локализации в клетке в другую. Перемещение мобильного элемента может происходить от эписомы к
- 6 029522
эписоме, от эписомы к хромосоме, от хромосомы к хромосоме или от хромосомы к эписоме. Мобильные элементы характеризуются присутствием последовательностей инвертированных повторов в точках окончания. Мобилизация осуществляется ферментативно посредством "транспозазы". Структурно мобильный элемент категоризируется как транспозон (ΤΝ) или "элемент инсерционной последовательности" (Ιδ-элемент) в зависимости от присутствия или отсутствия, соответственно, генетических последовательностей помимо тех, которые необходимы для мобилизации элемента. Мини-транспозон или миниΙδ-элемент, как правило, не имеет последовательностей, кодирующих транспозазу.
В еще одном варианте осуществления изобретения одно, более одного или все разрушения могут включать одну или несколько точечных мутаций в хотя бы одном из эндогенных генов.
Одно, более одного или все разрушения в хотя бы одном из эндогенных генов могут представлять собой гомозиготные разрушения. В другом варианте одно, более одного или все разрушения в хотя бы одном из эндогенных генов могут представлять собой гетерозиготные разрушения. В некоторых вариантах осуществления разрушения в хотя бы одном из эндогенных генов могут включать гомозиготные разрушения, гетерозиготные разрушения или комбинацию гомозиготных разрушений и гетерозиготных разрушений.
Разрушения могут вызываться путем введения в геном растения экспрессионной кассеты. "Экспрессионная кассета" - конструкция нуклеиновой кислоты, например вектор, в частности плазмида, вирусный вектор и т.д., способный образовывать транскрипты и, возможно, полипептиды, кодируемые полинуклеотидной последовательностью. Экспрессионный вектор способен образовывать транскрипты в экзогенной клетке, например бактериальной клетке, или в растительной клетке, ίη νίνο или ίη νίίτο, например, в протопласте культивированного растения. Экспрессия продукта может быть конститутивной или индуцируемой в зависимости от выбранного промотора. Антисмысловые, смысловые, РНКинтерференционные или РНК-сайленсинговые конфигурации, которые не подлежат трансляции, явно входят в это определение. В контексте экспрессионного вектора промотор называют "функционально связанным" с полинуклеотидной последовательностью, если он способен регулировать экспрессию связанной полинуклеотидной последовательности. Этот термин также относится к альтернативным конструкциям экзогенного гена, например экспрессированным или интегрированным трансгенам. Аналогично, термин "функционально связанный" также применяется к альтернативным или дополнительным транскрипционным регуляторным последовательностям, например усилителям, связанным с полинуклеотидной последовательностью.
Термин "вектор" обозначает средство распространения и (или) переноса нуклеиновой кислоты между организмами, клетками или клеточными компонентами. Векторы включают плазмиды, вирусы, бактериофаги, провирусы, фагмиды, транспозоны, искусственные хромосомы и т.д., которые реплицируются автономно или могут встраиваться в хромосому клетки-хозяина. Вектор может также представлять собой полинуклеотид оголенной РНК, полинуклеотид оголенной ДНК, полинуклеотид, состоящий из и ДНК, и РНК в одной и той же нити, поли-лизин-конъюгированную ДНК или РНК, пептидконъюгированную ДНК или РНК, липосом-конъюгированную ДНК и т.п., которые не реплицируются автономно.
Полинуклеотидная последовательность, нуклеотидная последовательность или ген "кодирует" смысловую или антисмысловую РНК молекулу, РНК-интерференционную или РНК-сайленсинговю молекулу или полипептид, если полинуклеотидная последовательность может быть расшифрована (в сплайсированной или несплайсированной форме) и (или) транслирована в РНК или полипептид, или в соответствующую подпоследовательность. Специалистам хорошо известна дегенерация генетического кода, которая допускает кодирование одной и той же аминокислотной последовательности или полипептида несколькими различными нуклеотидными последовательностями, и для специалистов не представляет сложности определение того, кодирует ли заданная нуклеотидная последовательность заданную аминокислотную последовательность или полипептид.
"Экспрессия гена" или "экспрессия нуклеиновой кислоты" означает транскрипцию ДНК в РНК (может включать модификацию РНК, например сплайсинг), трансляцию РНК в полипептид (может включать последующую модификацию полипептида, например, посттрансляционную модификацию), либо и транскрипцию, и трансляцию, в зависимости от контекста.
Предлагаемый в изобретении способ может дополнительно содержать шаги введения в геном растения разрушения эндогенного гена АНР6 и регенерацию растения с подобным образом измененным геномом. Это разрушение может стабильно вводиться в геном растения для генерации растения, не встречающегося в природе. Считается, что разрушение вносится в геном растения стабильно, если это разрушение копируется и сегрегируется во время деления клеток и передается потомству вышеуказанного растения или растительной клетки.
Предлагаемый в изобретении способ может дополнительно содержать шаг введения в геном растения разрушения хотя бы одного эндогенного гена СКХ, например, не менее двух различных эндогенных генов СКХ.
В контексте данного изобретения термин "ген СКХ" или "ген цитокинин-оксидазы или дегидрогеназы" относится к гену, кодирующему белок СКХ с цитокинин-оксидазной или дегидрогеназной актив- 7 029522
ностью. Белок СКХ, также называемый цитокинин-оксидазой или дегидрогеназой, представляет собой фермент, который катализирует следующую химическую реакцию:
Νό-диметилаллиладенин + акцептор + Н2О <-> аденин + 3-метилбут-2-енал + восстановленный акцептор.
Три субстрата данного фермента - это Νό-диметилаллиладенин, акцептор и Н2О, а три продукта аденин, 3-метилбут-2-енал и восстановленный акцептор. Термин "цитокинин-оксидазная или дегидрогеназная активность" охватывает активность заданного полипептида при катализации реакции оксидоредуктазы с хотя бы одним цитокинином в качестве субстрата. Специалистам хорошо известны средства и способы определения того, имеет ли заданный полипептид цитокинин-оксидазную или дегидрогеназную активность или нет, и определеняи уровня цитокинин-оксидазной или дегидрогеназной активности определенного полипептида или зонда в абсолютных величинах и (или) относительно другого полипептида или зонда. В специальной литературе приводятся подробные указания касательно проверки полипептидов на указанную активность, см. например ЕС 1.5.99.12. Термин "цитокинин-оксидазная или дегидрогеназная активность" может охватывать активность заданного полипептида при катализации реакции оксидоредуктазы с хотя бы одним цитокинином в качестве субстрата с уровнем активности не менее 30% от активности Л1СКХ3 (СКХ3 с 5>ЕС ГО 7) или не менее 50% от активности Л1СКХ3.
Хотя бы один СКХ ген может представлять собой
эндогенный ген СКХ1, кодирующий белок СКХ и включающий аминокислотную последовательность, идентичную или имеющую не менее 90% идентичности с 5>ЕС ГО 5, или соответствующий ортолог;
эндогенный ген СКХ2, кодирующий белок СКХ и включающий аминокислотную последовательность, идентичную или имеющую не менее 90% идентичности с 5>ЕС ГО 6, или соответствующий ортолог;
эндогенный ген СКХ3, кодирующий белок СКХ и включающий аминокислотную последовательность, идентичную или имеющую не менее 90% идентичности с 5>ЕС ГО 7, или соответствующий ортолог;
эндогенный ген СКХ4, кодирующий белок СКХ и включающий аминокислотную последовательность, идентичную или имеющую не менее 90% идентичности с 5>ЕС ГО 8, или соответствующий ортолог;
эндогенный ген СКХ5, кодирующий белок СКХ и включающий аминокислотную последовательность, идентичную или имеющую не менее 90% идентичности с 5>ЕС ГО 9, или соответствующий ортолог;
эндогенный ген СКХ6, кодирующий белок СКХ и включающий аминокислотную последовательность, идентичную или имеющую не менее 90% идентичности с 5>ЕС ГО 10, или соответствующий ортолог;
эндогенный ген СКХ7, кодирующий белок СКХ и включающий аминокислотную последовательность, идентичную или имеющую не менее 90% идентичности с 5>ЕС ГО 11, или соответствующий ортолог.
В предлагаемом в настоящем изобретении способе может присутствовать разрушение не менее двух эндогенных генов СКХ в дополнение к разрушению эндогенного гена АНР6. В частности, два разрушаемых эндогенных гена СКХ представляют собой эндогенный ген СКХ3, кодирующий белок СКХ, включающий аминокислотную последовательность, идентичную или имеющую не менее 90% идентичности с 5>ЕС ГО 7 или соответствующий ортолог, и эндогенный ген СКХ5, кодирующий белок СКХ, включающий аминокислотную последовательность, идентичную или имеющую не менее 90% идентичности с 5>ЕС ГО 9 или соответствующий ортолог.
Было показано, что комбинация разрушения гена АНР6 с разрушением генов СКХ приводит к еще более выраженному воздействию на выход семян.
Предлагаемый в настоящем изобретении способ может использоваться для увеличения числа стручков на одно растение, что позволяет добиться увеличения выхода семян растения и полученного от него потомства.
Предлагаемый в настоящем изобретении способ также может использоваться для получения не встречающегося в природе растения с увеличенным числом стручков на одно растение, что позволяет добиться увеличения выхода семян в растении и полученном от него потомстве.
Настоящее изобретение также относится к не встречающемуся в природе растению, которое включает разрушение эндогенного гена АНР6 и разрушение хотя бы одного эндогенного гена СКХ. Например, эндогенный ген АНР6 может включать или состоять из:
(а) нуклеиновой кислоты, кодирующей белок АНР6 и включающей аминокислотную последовательность 5>ЕС ГО 1, 12 или ее ортолог;
(б) нуклеиновой кислоты, кодирующей белок АНР6 и включающей аминокислотную последовательность с идентичностью последовательности не менее 70%, не менее 80%, не менее 90% или не менее 95% в сравнении с полной аминокислотной последовательностью 5>ЕС ГО 1 или 12;
(в) нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность 5>ЕС ГО 2, 3, 4, 13 или
- 8 029522
14;
(г) нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность с идентичностью последовательности не менее 90% по всей полной нуклеотидной последовательности 8ЕО ГО 2, 3, 4, 13 или 14; либо
(д) нуклеиновой кислоты, гибридизирующейся при жестких условиях в одну из нуклеотидных последовательностей, определенных в подпунктах (а), (б), (в) и (или) (г).
В не встречающемся в природе растении согласно изобретению хотя бы один разрушенный эндогенный ген СКХ может представлять собой
эндогенный ген СКХ1, кодирующий белок СКХ и включающий аминокислотную последовательность, идентичную или имеющую не менее 90% идентичности с 8ЕО ГО 5, или соответствующий ортолог;
эндогенный ген СКХ2, кодирующий белок СКХ и включающий аминокислотную последовательность, идентичную или имеющую не менее 90% идентичности с 8ЕО ГО 6, или соответствующий ортолог;
эндогенный ген СКХ3, кодирующий белок СКХ и включающий аминокислотную последовательность, идентичную или имеющую не менее 90% идентичности с 8ЕО ГО 7, или соответствующий ортолог;
эндогенный ген СКХ4, кодирующий белок СКХ и включающий аминокислотную последовательность, идентичную или имеющую не менее 90% идентичности с 8ЕО ГО 8, или соответствующий ортолог;
эндогенный ген СКХ5, кодирующий белок СКХ и включающий аминокислотную последовательность, идентичную или имеющую не менее 90% идентичности с 8ЕО ГО 9, или соответствующий ортолог;
эндогенный ген СКХ6, кодирующий белок СКХ и включающий аминокислотную последовательность, идентичную или имеющую не менее 90% идентичности с 8ЕО ГО 10, или соответствующий ортолог;
эндогенный ген СКХ7, кодирующий белок СКХ и включающий аминокислотную последовательность, идентичную или имеющую не менее 90% идентичности с 8ЕО ГО 11, или соответствующий ортолог.
Эндогенные гены СКХ, разрушаемые в не встречающемся в природе растении согласно изобретению, могут представлять собой
эндогенный ген СКХ3, кодирующий белок СКХ и включающий аминокислотную последовательность, идентичную или имеющую не менее 90% идентичности с 8ЕО ГО 7, или соответствующий ортолог; а также
эндогенный ген СКХ5, кодирующий белок СКХ и включающий аминокислотную последовательность, идентичную или имеющую не менее 90% идентичности с 8ЕО ГО 9, или соответствующий ортолог.
Предлагаемое в настоящем изобретении не встречающееся в природе растение может быть получено традиционными средствами, например, при помощи трансформации. Трансформация растительных клеток и протопластов может выполняться по сути любыми из различных путей, известных специалистам в молекулярной биологии растений, включая, среди прочего, описанные здесь способы.
См. "Ме11юб8 ίη Εηζνιηοίοβγ". том 153 (ЕесотЫиаШ ΌΝΆ Рай Ό) \Уи апб Ото88таи (редакторы) 1987, Асабетю Рге88. В данном контексте термин "трансформация" обозначает изменение генотипа растения-хозяина или растительной клетки путем введения нуклеотидной последовательности, например "гетерологичной", "экзогенной" или "чужеродной" нуклеотидной последовательности. Гетерологичная нуклеотидная последовательность необязательно происходит из другого источника, однако в какой-то момент времени она должна была быть внешней по отношению к клетке, в которую вводится.
В предлагаемом в настоящем изобретении способе и предлагаемом в настоящем изобретении невстречающемся в природе растении разрушение эндогенного гена может выполняться при помощи нескольких различных известных методик.
Одно, несколько или все разрушения хотя бы одного эндогенного гена могут быть выполнены путем введения в геном и экспрессировании в растительной клетке или растении трансгенной полинуклеотидной последовательности, например в антисмысловых или смысловых конфигурациях, РНКинтерференционных или РНК-сайленсинговых конфигурациях и т.д., при этом трансгенная полинуклеотидная последовательность включает нуклеотидную последовательность, представляющую собой или являющуюся комплементарной по отношению к одному из разрушаемых эндогенных генов. Кроме того, вышеупомянутая полинуклеотидная последовательность может включать промотор, в результате чего она подавляет экспрессию и (или) активность хотя бы разрушенного эндогенного гена в сравнении с соответствующей контрольной растительной клеткой или растением без указанных разрушений (например, нетрансгенным родителем или нетрансгенным растением того же вида). Введение трансгенной полинуклеотидной последовательности может выполняться посредством различных техник, включая, среди прочего, электропорацию, баллистическую трансфекцию, перенос посредством агробактерий и иные дос- 9 029522
тупные способы. В некоторых вариантах осуществления изобретения полинуклеотид связывается с промотором согласно смысловой или антисмысловой ориентации или сконфигурирован для сайленсинга или интерференции РНК.
Разрушение одного или нескольких эндогенных генов может выполняться посредством зависимого от гомологии сайленсинга генов - техники, которая подробно описана в специальной литературе.
Другим подходом к сайленсингу генов может быть использование антисмысловой технологии. Применение антисмысловых нуклеиновых кислот хорошо известно специалистам в данной области. Антисмысловая нуклеиновая кислота имеет участок комплементарности по отношению к целевой нуклеиновой кислоте, например определенную последовательность геномного гена, иРНК или кДНК. Антисмысловая нуклеиновая кислота может представлять собой РНК, ДНК или любую другую подходящую молекулу. Между антисмысловой последовательностью и ее комплементарной смысловой последовательностью может образовываться дуплекс, что приводит к инактивации гена. Антисмысловая нуклеиновая кислота может подавлять экспрессию гена путем образования дуплекса с РНК, транскрибированной из гена, путем образования триплекса с дуплексной ДНК и т.д. Антисмысловая нуклеиновая кислота может быть получена и проверена посредством нескольких общепризнанных техник.
Каталитические молекулы РНК или рибозимы также могут использоваться для подавления экспрессии определенных выбранных генов. Можно спроектировать рибозимы, которые образуют специфические пары с практически любой целевой РНК и расщепляют фосфодиэфирный остов в определенном месте, что приводит к функциональной инактивации целевой РНК. При выполнении расщепления сам рибозим не меняется и потому в состоянии рециклировать и расщеплять другие молекулы. Включение рибозимных последовательностей в антисмысловые РНК привносит в них активность расщепления РНК, в результате чего увеличивается активность конструкций. Было обнаружено несколько классов рибозимов. Например, один класс рибозимов происходит из нескольких малых кольцевых РНК, которые обладают способностью к саморасщеплению и ауторепродукции в растениях. РНК могут реплицироваться самостоятельно (РНК вироиды) или с вирус-помощником (сателлитные РНК). Примеры РНК включают РНК от вироида солнечной пятнистости авокадо и сателлитные РНК от вируса кольцевой пятнистости табака (ус1ус1). вируса временной полосатости люцерны, вируса стеблевой пятнистости табака, вируса пятнистости паслена (побШогит) и вируса пятнистости клевера подземного. Проектирование и применение целевых РНК-специфичных рибозимов описано в специальной литературе. См., например, На5с1оГГ с! а1. (1988) МПиге. 334: 585-591.
Еще одним способом инактивации определенного выбранного гена путем подавления экспрессии является смысловая супрессия. Было показано, что введение экспрессионных кассет, в которых нуклеиновая кислота сконфигурирована согласно смысловой ориентации по отношению к промотору, является эффективным средством блокирования транскрипции интересующего целевого гена. См., например, патенты США с номерами 5034323, 5231020 и 5283184.
Разрушение согласно изобретению также может выполняться при помощи сайленсинга или интерференции РНК (РНК-интерференции), которая также может называться посттранскрипционным сайленсингом гена (РТС8) или косупрессией. В контексте настоящего изобретения "сайленсинг РНК" (также называемый ΚΝΑί или РНК-интенференцией) обозначает любой механизм, посредством которого присутствие одноцепочечной или, как правило, двухцепочечной РНК в клетке приводит к подавлению экспрессии целевого гена, содержащего последовательность, идентичную или почти идентичную последовательности РНК, включая, среди прочего, интерференцию РНК, репрессию трансляции целевой иРНК, транскрибированной из целевого гена без изменения стабильности иРНК, а также транскрипционный сайленсинг (например, ацетилирование гистона и образование гетерохроматина, которое приводит к подавлению транскрипции целевой иРНК). В "РНК-интерференции" присутствие одноцепочечной или двухцепочечной РНК в клетке приводит к эндонуклеолитическому расщеплению и последующей деградации целевой иРНК.
В одном из вариантов осуществления изобретения в растительную клетку вводится трансген (например, интересующая последовательность и (или) подпоследовательность гена или кодирующая последовательность) для разрушения одного или нескольких генов посредством РНК-сайленсинга или интерференции (ΚΝΑί). Например, последовательность или подпоследовательность (трансген) включает небольшую подпоследовательность, к примеру длиной в 21-25 оснований, более длинную подпоследовательность, к примеру длиной в 25-100 или 100-2000 (или 200-1500, 250-1000 и т.д.) оснований, и (или) полную кодирующую последовательность или ген, выбранный из или комплементарный к эндогенному гену, который нужно разрушить. Такой трансген может включать участок последовательности или подпоследовательности с длиной в 21-25 оснований и не менее 80%, не менее 90%, не менее 99% идентичности в сравнении с подпоследовательностью одной из нуклеотидных последовательностей с номером последовательности 8ЕЦ ГО 2, 3, 4, 13 или 14.
Использование ΚΝΑί для подавления экспрессии генов в различных видах клеток (включая растительные клетки) и организмах, например, путем экспрессии РНК-"шпильки" (стебль-петля) или двух цепочек интерферирующей РНК, подробно описано в специальной литературе, как и способы определения подходящей интерферирующей РНК (или их набора) для воздействия на целевой ген, а также способы
- 10 029522
получения подобных интерферирующих РНК. Так, интерференция РНК описана в публикациях патентных заявок США 20020173478, 20020162126 и 20020182223.
Полинуклеотидная последовательность (последовательности) или подпоследовательность (подпоследовательности), которая подлежит экспрессии для индуцирования ΚΝΑί, может быть экспрессирована, например, под контролем конститутивного промотора, индуцируемого промотора или тканеспецифичного промотора. Экспрессия за счет тканеспецифичного промотора может являться предпочтительной в определенных вариантах осуществления изобретения. Термин "промотор" в данном контексте включает участок ДНК, расположенный против хода транскрипции по отношению к началу транскрипции, который принимает участие в распознавании и связывании РНК-полимеразы и других белков для начала транскрипции. "Растительный промотор" - это промотор, способный вызывать транскрипцию в растительных клетках. Примеры растительных промоторов включают, среди прочего, промоторы, которые получаются из растений, вирусов растений и бактерий, содержащих гены, выраженные в растительных клетках, таких как агробактерий или микоризов. Примеры промоторов, зависящих от стадии развития, включают промоторы, которые преимущественно вызывают транскрипцию в определенных тканях, например, листьях, корнях или семенах, или территориально в таких участках как эндосперм, эмбрион или меристемные области. Такие промоторы называются "тканеспецифичными". Промотор с временным регулированием вызывает экспрессию в определенные моменты, например, спустя 0-25 дней после опыления. "Специфичный для типа клеток" промотор в основном вызывает экспрессию в определенных типах клеток одного или нескольких органов, например, сосудистых клетках в корнях или листьях. "Индуцируемый" промотор - это промотор под контролем среды, который может быть индуцируемым или дерепрессируемым. Примеры условий окружающей среды, которые могут вызывать транскрипцию благодаря индуцируемым промоторам, включают анаэробные условия или наличие света. Тканеспецифичные, специфичные для типа клеток и индуцируемые промоторы образуют класс неконститутивных промоторов. "Конститутивный" промотор - это промотор, который остается активным в большинстве условий окружающей среды и во всех или почти всех тканях, а также на всех или почти всех стадиях развития.
Одно, несколько или все разрушения хотя бы в одном из вышеуказанных эндогенных генов могут вводиться посредством, например, инактивации гена на базе транспозона. Одна или несколько мутаций последовательности гена может включать одну или несколько вставок транспозонов, при этом разрушения подавляют экспрессию и (или) активность как минимум разрушенного эндогенного гена в сравнении с соответствующей контрольной растительной клеткой или растением без подобных разрушений. Например, одна или несколько мутаций включают гомозиготное разрушение в одном или нескольких из вышеупомянутых генов, или включают гетерозиготное разрушение в одном или нескольких из вышеупомянутых генов, или включают комбинацию и гомозиготных, и гетерозиготных разрушений.
Транспозоны были впервые обнаружены в кукурузе Барбарой Мак-Клинток в конце 1940-х годов. Семейство мутаторов мобильных элементов, например мобильные элементы Мутатора Робертсона (Ми), как правило, используются в мутагенезе генов растений, так как они присутствуют с большим числом копий (10-100) и преимущественно вставляются внутри и вокруг генов.
Мобильные элементы можно разделить на два широких класса в зависимости от их режима транспозиции. Они обозначаются как Класс I и Класс II; оба класса применяются в качестве мутагенов и векторов доставки. Мобильные элементы класса I транспозируются при помощи РНК посредника и используют обратные транскриптазы, т.е. являются ретроэлементами. Существует как минимум три типа мобильных элементов класса I: ретротранспозоны, ретропозоны и δΓΝΕ-подобные элементы. Ретротранспозоны обычно содержат длинные концевые повторы, гены, кодирующие белки вирусной оболочки (дад) и обратную транскриптазу, РНК-азу Н, гены интегразы и полимеразы (ро1). В видах растений описано множество ретротранспозонов. Подобные ретротранспозоны мобилизируются и перемещаются при помощи РНК-посредника в реакции, катализируемой обратной транскриптазой и РНК-азой Н, кодируемой транспозоном. Примеры попадают в группы Ту1-еор1а и Ту3-дурку, а также в классификации δΓΝΕподобные и БШЕ-подобные. Более подробное описание см. в статье авторов Кишат и Веппе1/еп (1999) "Р1ап1 Ке1то1гап8ро8оп8" в журнале Аппиа1 Рс\1с\у о£ Сепейск 33: 479.
Кроме того, мобильные элементы ДНК, такие как Ас, Тат1 и Еп/8рт, также встречаются во многих различных видах растений и могут использоваться в настоящем изобретении.
Транспозоны (и К-элементы) являются общепринятыми средствами введения мутаций в растительные клетки. Эти мобильные генетические элементы доставляются в клетки, например, путем полового скрещивания, выбирается транспозиция и итоговые инсерционные мутанты отсеиваются, например, в соответствии с интересующим фенотипом. Разрушенные гены затем могут вводиться в другие растения путем скрещивания изолированных, не встречающихся в природе или трансгенных растений с неразрушенным растением, например посредством полового скрещивания. Могут использоваться любые из множества стандартных техник скрещивания в зависимости от скрещиваемых видов. Местонахождение транспозона в геноме изолированного, не встречающегося в природе или трансгенного растения может определяться посредством известных способов, например путем секвенирования фланкирующих областей. Например, ПЦР-реакция растения может применяться для амплифицирования последовательности, которая затем может быть секвенирована при помощи диагностики для подтверждения ее происхожде- 11 029522
ния. При необходимости инсерционные мутанты отсеиваются в соответствии с желаемым фенотипом, например подавлением экспрессии или активности интересующего гена в сравнении с контрольным растением.
Также для введения и определения разрушения в настоящем изобретении может использоваться методика "ΤΙΕΜΝΟ". "ТШСШС" - таргетирование индуцированных местных повреждений в геномах. См. МсСа11ит е! а1., (2000), "Тагдейид 1ийиеей Ьоеа1 Ьекюик Ιη Сеиотек (ΤΙΕΕΙΝΟ) £ог Р1ап1 Рипсйоиа1 Сеиотюк" Р1ап1 Рйу8ю1оду 123: 439-442; МсСа11ит е! а1., (2000), "Тагде!ей ксгеетид £ог шйисей тйайоик" №1иге Вю1ес1то1оду 18: 455-457; а также Со1Ьег1 е! а1., (2001), "ШдЬ-ТЬгоидйри! 8сгеетид £ог Шйисей Рот! Мйайоик" Р1аи1 Рйу8ю1оду 126: 480-484.
ТГОЬШС сочетает точечные мутации высокой плотности с быстрым чувствительным обнаружением мутаций. Как правило, для мутагенации семян растений используется этил метансульфонат (ЕМ8). ЕМ8 алкилирует гуанин, который обычно приводит к ошибочному спариванию. Например, семена вымачивают в 10-20 мМ растворе ЕМ8 в течение 10-20 ч; семена промывают, а затем высеивают. Обозначим растения этого поколения как М1. Растения М1 затем самоопыляют. Присутствующие в клетках, образующих репродуктивные ткани, мутации наследуются следующим поколением (М2). Как правило, растения М2 просеивают на наличие мутации в нужном гене и (или) на конкретные фенотипы. Например, ДНК от растений М2 объединяют и определяют наличие мутаций в интересующем гене путем детектирования гетеродуплексного образования. Как правило, подготавливают ДНК от каждого М2растения и объединяют в пул. Желаемый ген амплифицируют при помощи ПЦР. Объединенный образец затем денатурируют и ренатурируют, чтобы могли образоваться гетеродуплексы. Если в одном из растений присутствует мутация, продукты ПЦР будут двух видов: дикие и мутантные. Пулы, которые содержат гетеродуплексы, определяют путем разделения ПЦР реакции, например посредством денатурирующей высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОРИРЬС). ОРИРЬС обнаруживает ошибочное спаривание в гетеродуплексах после плавления и ренатурации гетероаллельной ДНК. Хромотографию проводят при нагреве ДНК. Гетеродуплексы имеют пониженную термостойкость и образуют плавящиеся пузырьки, что ускоряет движение в хроматографической колонне. Если в дополнение к ожидаемым гомодуплексам присутствуют гетеродуплексы, будет виден двойной пик. В результате определяются пулы, несущие мутацию в интересующем гене. После этого могут быть идентифицированы и секвенированы отдельные ДНК от растений, образующие выбранную объединенную популяцию. При необходимости растение, имеющее нужную мутацию в интересующем гене, может скрещиваться с другими растениями для устранения фоновых мутаций.
Для введения разрушения согласно изобретению также могут применяться другие мутагенные способы. Способы введения в гены растения генетических мутаций и отбора растений с желаемыми характеристиками хорошо известны специалистам. Например, семена или другой растительный материал можно обрабатывать мутагенным химическим веществом в соответствии со стандартными методиками. Подобные химические вещества включают, среди прочего, следующие: диэтилсульфат, этиленимин и Νнитрозо-^этилуреа. Также может использоваться ионизирующее излучение из таких источников, как рентгеновские или гамма лучи.
Растение, содержащее нужное разрушение (разрушения) в соответствии с изобретением, может скрещиваться с другими растениями для введения разрушений в эти растения. Для этого могут использоваться стандартные техники скрещивания.
Гомологическая рекомбинация также может использоваться для введения разрушения согласно изобретению. Гомологическая рекомбинация была продемонстрирована на растениях. Гомологическая рекомбинация может применяться для индуцирования модификаций целевого гена путем таргетирования интересующего гена ш νί\Ό. Мутации в определенных участках выбранной генной последовательности (в том числе 5' против хода транскрипции, 3' по ходу транскрипции, а также во внутригенных областях) выполняются 1и νίΙΐΌ и вводятся в интересующее растение при помощи стандартных методик. Видоизмененный ген будет взаимодействовать с целевым геном дикого типа, вызывая гомологическую рекомбинацию и целевое замещение гена дикого типа в трансгенных растениях.
Не встречающиеся в природе растения согласно изобретению, которые могут употребляться в пищу человеком и животными, также могут использоваться в качестве продуктов питания или кормов, непосредственно либо после подготовки известными способами.
Изобретение также относится к использованию вышеуказанных не встречающихся в природе растений согласно изобретению, а также клеток, культур клеток, частей, например корней, листьев, а также не встречающегося в природе материала для размножения, например семян, клубней, корнеплодов или наростов стержневых корней или плодов, полученных из вышеупомянутых растений, для изготовления пищевых или кормовых продуктов, фармацевтических препаратов или химических продуктов тонкого органического синтеза.
Далее описаны примеры осуществления настоящего изобретения.
Описание чертежей
Фиг. 1 - расположение вставок Т-ДНК и транспозонов в мутантах скх. Инсерционные мутанты обнаруживались путем ПЦР просеивания, а место вставки определялось путем секвенирования ДНК погра- 12 029522
ничного фрагмента. Черными прямоугольниками обозначены экзоны, белыми - интроны, а треугольниками показаны вставки Т-ДНК. О - ΟΛΒΙ-КАТ коллекция Т-ДНК; δ - δα11< коллекция Т-ДНК; Т - Тоггеу Меза коллекция Т-ДНК; Ζ - ΖΙΟΙΑ коллекция транспозонов;
фиг. 2 - репродуктивное развитие акр6-1 и акр6-З в сравнении с арабидопсисом дикого типа (Со1-0): (А.) Число стручков на главном стержне соцветия одного отдельного растения. (В.) Плотность стручков на главном стержне соцветия. (С.) Суммарный выход семян дикого типа и акр6-мутантных растений. Растения выращивали в парнике в условиях длинного светового дня. Данные соответствуют средним значениям ± среднеквадратическое отклонение (η = 20). Для сравнения значений с значениями дикого типа использовался критерий Стьюдента. *, Р < 0,01; **, Р < 0,0001;
фиг. 3 - репродуктивное развитие скхЗ и двойного мутанта скхЗ акр6-З в сравнении с арабидопсисом дикого типа. На графике показано число стручков на главном стержне соцветия. Данные соответствуют средним значениям ± среднеквадратическое отклонение (η = 20). Для статистического сравнения использовался критерий Стьюдента. * и °, Р < 0,01; * = в сравнении с диким типом, ° = в сравнении с скх3;
фиг. 4 - репродуктивное развитие двойного мутанта скхЗ скх5 и тройного мутанта скхЗ скх5 акр6 в сравнении с арабидопсисом дикого типа. На графике (А) показано число стручков на главном стержне соцветия для тройного мутанта скхЗ скх5 акр6-1 и контрольных растений. Данные соответствуют средним значениям ± среднеквадратическое отклонение (η = 20). Для статистического сравнения использовался критерий Стьюдента. °, Р < 0,05; **, Р < 0,0001; * = в сравнении с диким типом, ° = в сравнении с скхЗ скх5; На графике (В) показано число стручков на главном стержне соцветия для тройного мутанта скхЗ скх5 акр6-З и контрольных растений. Данные соответствуют средним значениям ± среднеквадратическое отклонение (η = 20).
Для статистического сравнения использовался критерий Стьюдента. * и °, Р < 0,01; ** и 00, Р < 0,0001; * = в сравнении с диким типом, ° = в сравнении с скхЗ скх5.
Способы
Растительный материал и условия роста.
В качестве дикого типа использовали экотип Колумбия (Со1-0) резуховидки Таля (арабидопсиса). Мутанты со вставками Т-ДНК скх2^1 ^АЬК068485), скхЗ^1 фАЬК_0509З8), скх4^1 фАЬК_055204), скх5^1 ^АЬК_064З09) и скх6^1 ^АЬК_070071) были взяты из лаборатории геномного анализа института δа1к (А1ои8о е1 а1., (200З) δ^ΐ'^ З01, 65З-657), мутант со вставкой транспозона скх4^ был взят из коллекции транспозонов ΖΙΟΜ (Ваитаии Е., Ье^аМ 1., δаеЕ1е^ Н., δс1ш1ζ В., ХУктаи Е. (1998) δиссе88Ги1 РСК-ЪазеЕ гегег8е деиекс 8сгееи8 и8шд аη Еи-7-ти1адеи18еЕ АгаЫЕорзк 1какаиа рори1акои деиега!еЕ \аа 8ш§1е-8ееЕ Ее8сеи1. Ткеогекса1 аиЕ АрркеЕ Оеиекс8 97: 729-7З4), скх5-О2 (линия ЗЗ2В10) и скх7-О1 (линия З6ЗС02) были взяты из коллекции ОАВкКАТ (Ко88о М.О., Ы Υ., δΐΓί/коу Ν., Кек8 В., Оеккег К. аиЕ ХУек8кааг В. (200З) Р1аи1 Мо1. Вю1. 5З, 247-259), а скх7-Т1 ^АШ_515_А07) был взят из исследовательского института Тоггеу Ме8а (в настоящее время δуи§еиιа). Аллель акр6-1 был идентифицирован и изолирован в супрессорном скрининге для детерминантного роста корня, связанного с мутацией \\ό1 рецептора цитокининов СКЕ1/АНК4 (Макоиеи А.Р., Βοике М., Каирршеи Ь., Кикоиеи М., Вег1Геу Ρ.Ν. аиЕ Не1агшйа Υ. (2000). А иоуе1 Що-сотроиеи! куЪпЕ то1еси1е геди1а1е8 га8си1аг тогркодеие8к оГ 1ке АгаЫЕор8к гоок Οеие8 Эеу. 14, 29З8-294З; аиЕ Макоиеи А.Р., Вккорр А., ШдисЫ М., N^ет^иеи К.М., Кшо8кка К., Тогтакаида8 К., П<еЕа Υ., Ока А., КакипоЮ Т. аиЕ Не1агшка Υ. (2006). Су1ок1ши 81диакид аиЕ ϊΐ8 шЫЪког АНР6 геди1а!е се11 Га1е Еигшд га8си1аг Ееге1ортеи1. δ^ΐ'^ З11, 94-98). Аллель акр6-З - вставка Т-ДНК, представляющая видимо нулевой аллель и подавляющая фенотип \\ό1 по аналогии с акр6-1 (Макоиеи е1 а1., 2006). Множественные мутанты получали путем генетического скрещивания. Растения выращивали в парнике в почве при 22°С в условиях длинного светового дня (16 ч день /8ч ночь). Для измерения выхода семян выращивали растения в климатических камерах (Регска1 АК-66Ь) в почве при 24°С, 100 мкЕ и 65% влажности в условиях длинного светового дня.
Определение параметров урожайности.
Число стручков на главном стержне определяли после прекращения цветения. Число стручков на главном стержне является общепринятым индикатором выхода семян. Увеличение числа стручков на главном стержне, как правило, указывает на увеличение суммарного выхода семян в растении (как видно из фиг. 2А и 2С). Для непосредственного анализа выхода семян растения помещали в бумажные пакеты после прекращения цветения и хранили в сухом месте в течение еще трех недель, после чего определяли суммарный выход семян.
Примеры
Сравнивалось репродуктивное развитие акр6-мутантных растений с контрольными растениями дикого типа. Цветки в арабидопсисе образуются непрерывно меристемой неопределенных соцветий. Оба акр6-мутанта образовали увеличенные соцветия, которые состояли из существенно большего количества цветков в сравнении с диким типом. Увеличение числа цветков, образуемых меристемой соцветий акр6, привело к увеличению числа стручков в сравнении с диким типом (фиг. 2А). Сравнивалось число стручков на главном стержне после образования последнего цветка. Мутанты акр6-1 и акр6-З образовали, со- 1З 029522
ответственно, на 11 и 21% больше стручков, чем растения дикого типа (фиг. 2А). Кроме того, увеличилась плотность стручков на стержнях соцветий аНр. Число стручков на единицу длины стержня соцветия возросло на 22 и 20% в мутантах аНр6-1 и аНр6-3, соответственно, в сравнении с растениями дикого типа (фиг. 2В). Для проверки того, будет ли увеличение образования цветков и стручков влиять на выход семян мутантных растений, были собраны все семена от отдельных растений после прекращения цветения и определен вес семян. Суммарный выход семян в случае мутантов аНр6-1 и аНр6-3 увеличился на 19,5 и 16,7%, соответственно, по сравнению с диким типом (фиг. 2С).
Для анализа эффекта мутации аНр6 на репродуктивное развитие в растениях с уже повышенным статусом цитокининов, получаемым посредством мутации одного или нескольких генов СКХ, в окружение мутантов скх3 и скх3 скх5 вводилась мутация аНр6 методом генетического скрещивания и анализировались полученные гибридные растения. Число цветков и сформировавшихся стручков на главном стержне скх3-мутантного растения было аналогично контрольному растению дикого типа (фиг. 3). Однако комбинация мутаций скх3 и аНр6 приводила к увеличению размера соцветий и 14%-ному увеличению образования стручков в сравнении с растениями дикого типа и скх3-мутантами (фиг. 3). Также аНр6мутация повышала репродуктивную активность растений, содержащих мутации в нескольких генах СКХ. Например, в растениях с двойными мутациями скх3 скх5 формируется больше стручков на главном стержне в сравнении с контрольным растением дикого типа (фиг. 4А и 4В). Однако в растениях с тройными мутациями скх3 скх5 аНр6 число стручков дополнительно существенно увеличивается в сравнении с растениями с двойными мутациями скх3 скх5, что в итоге дает еще более выраженный рост числа стручков на главном стержне в растениях с тройной мутацией скх3 скх5 аНр6 по сравнению с растениям дикого типа (аНр6-1 на фиг. 4А и аНр6-3 на фиг. 4В).
Перечень последовательностей <110> ШМЮЛЛИНГ, ТОМАС
<120> ВВЕДЕНИЕ ДЕФЕКТА В ГЕН АНР6 ДЛЯ УВЕЛИЧЕНИЯ ВЫХОДА СЕМЯН РАСТЕНИЯ
<130> Ρ08450\νθ
<160> 14
<170> Ра1еп11п νβΓκίοη 3.3
<210> 1
<211> 154
<212> РКТ
<213> АгаЫс1ор515 ЛаПапа
<400> 1
Ме1 Ьеи О1у Ьеи О1у Уа1 Азр А г и Ьеи О1п А1а Авр Пе Авп Аги Ьеи
15 10 15
Ьеи А1а Зег Ьеи РЬе Ηϊβ СПп СПу Уа1 Ьеи Авр СПи СПп РЬе Ьеи СПп
20 25 30
- 14 029522
Ьеи Οϊη Οϊη Ьеи Οϊη Акр О1и ТЬг Зег Рго Азп РЬе Уа1 Туг Азр Уа1
35 40 45
Не Азп Не Туг РЬе Азр О1и Зег О1и Ьук Ьеи Ьеи Аг§ Акп Ьеи Лгу
50 55 60
Ьеи Ьеи Ьеи Ме1 Азр Ага О1и РЬе Зег Азр Туг Ьуз Ьуз Ие О1у Ьеи
65 70 75 80
Шз Ьеи Азп С1п Ьеи Уа1 О1у Зег Зег Зег Зег Не О1у А1а Лги Агц
85 90 95
Уа1 Аг§ Азп Уа1 Суз Уа1 А1а РЬе Аг§ Зег А1а Зег О1и Ьеи Зег Азп
100 105 110
Лг° Рго О1у Суз Ьеи Ага О1у Ьеи О1и Уа1 Уа1 О1и Ηί$ О1и Туг Шз
115 120 125
Туг Ьеи Ьуз Азп Ме1 Ме1 Шз О1и Ьеи РЬе О1п Ьеи О1и О1п О1п Аг°
130 135 140
- 15 029522
Не Ьеи А1а А1а О1у Уа1 Агд Туг Рго Ме!
145 150
<210> 2
<211> 835
<212> ΏΝΑ
<213> АгаЫс1орз18 (каПапа
<400> 2
а1§и§§§§( 1ддд1д1дда ссддсИсаа дссдаса!са ассддс1сс1 а§сс1с(сК 60
иссассадд дадтдсхдда сдадсадис идсадспс адсадсиса адатдадас! 120
!сассааас( ид!дшда (диаиаа! а!с!асшд а!даа(ссда даад(1ас(с 180
сдсаассИа даНаИд!! §1дадШс1 !сс1ИдКа а!д(д!(сса (ад(1§!а1§ 240
11§111§§ΐΐ ссаааа!§1а (ас§1а(а!а (агдКаЩа а(да1дасда а(д(ааа(аа 300
а!ааа1даас адда(дда1а дадааКс(с ддасШаад аааа(адда! !асасс!даа 360
!садс!дд(д ддаадсади саадсапдд !дс!сд!адд дисд(аасд Гс1дсдидс 420
стсдис! дспссдадс падсаассд сссаддд(ас аааиааасд адсшаш 480
- 16 029522
акакакакак акакакакак акакакаскк скккдкакка акакак১к саакакккаа 540
дксаакакаа кдскксакаа акдкдасдак дскксаддкд сккдададда ск§д১ка§ 600
када§сак§а дкаксаккас сксаадааса 1§ак§са(§а асксккссад §1ас(1аскк 660
дШкдккаа (акаккаскс асакксасас ааасадаадд сааааасдкд адскааакак 720
асасакакак аккдакадка акакакдкка асааккакек дддакккаак аккккдадкд 780
§кк§садскд §а§са§са§а §аакакка§с кдс১а§кс адакакссаа к§каа 835
<210 3
<211> 465
<212> ΏΝΑ
<213> АгаЫс1орз1в кЬаПапа
<400 3
акдккддддк к䧧к§к§§а сс§§скксаа дссдасакса асс§§сксск адсскскскк 60
ккссассадд дадкдскдда сдадсадккс ккдсадсккс адсадсккса адакдадаск 120
ксассаааск (к§к§как§а кдксаккаак акскаскккд ак§ааксс§а §аа§ккаскс 180
сдсаасскка даккаккдкк §аꧧака§а §ааккскс§§ аскакаадаа аак১а(ка 240
- 17 029522
сасс(§аа1с адс!д§1§дд аадсадИса адса((§д!д с!с§1а§дд( 1с§1аас§1с 300
1дсд11дсс( Нсд11с1дс ИссдадсП адсаассдсс саддд(дсК дададдас!д 360
дадд!а§1ад адса1§ад!а 1сапасс(с аадааса!§а 1дса!даас( сиссадс1§ 420
дадсадсада дааикадс (дсаддад(с адагагссаа тдтаа 465
<210> 4
<211> 640
<212> ϋΝΑ
<213> АгаЫборзН {ЬаПапа
<400> 4
даадсаадас с(дпсаса11ад1ааааас аааишад ааададдааа дапдаадсд 60
даааасддда саадасддд! д1дссд1(д1 дда!д(1ддд дПддд^д дассддсНс 120
аадссдаса! саассддс1с с1адсс1сгс ИПссасса дддад1дс!д дасдадсад! 180
1сйдсадс11садсадск саада!дада сйсассааа сшд1дш да!д1сапа 240
ашс(асп гдагдаа(сс дадаадпас тссдсаассг гадапапд пда!дда(а 300
дадаапис ддасшаад аааа!адда! 1асасс1даа 1садс(дд1д ддаадсадп 360
- 18 029522
саа§саМ8§ ^Шс^адд £(1с§1аас§ Ιοίβο^Κ^ο сШс§Ис1 §с1гссааёс 420
11а§саасс§ ссс১§1§с 11§а§а§§ас 1§§а§а1а§( а§а§са(§а§ 1а1са11асс 480
1саа§ааса1 §а1§са(§аа с1с«сса§с (§§а§са§са §а§аа!ака §с!§с১ৠ540
1са§аШсс аа1§1аааа! ШдааТШд 1са1ааааа1 са§а§аааас с1аа11а§1§ 600
1§1§а1§а(а §1§1§11а1а а§с1асс§аа §с§ааассс! 640
<210> 5
<211> 575
<212> РКТ
<213> АгаЫ<1ор515 (ЬаПапа
<400> 5
Ме! О1у Ьеи ТНг 5ег 8ег Ьеи Аг§ РНе ЬПя Аг§ О1п Аяп Аяп Ьуз ТНг
15 10 15
РЬе Ьеи С1у Не РЬе Ме1 Пе Ьеи Уа1 Ьеи 5ег Суз Не Рго С1у Аге
20 25 30
- 19 029522
ТНг Ляп Ьеи Суя Зег Аяп Ηίδ Зег Уа1 Зег ТЬг Рго Ьуя О1и Ьеи Рго
35 40 45
Зег Зег Аяп Рго Зег Аяр Не Аг§ Зег Зег Ьеи Уа1 Зег Ьеи Аяр Ьеи
50 55 60
О1и О1у Туг Пе Зег РНе Аяр Аяр Уа1 Ηί$ Аяп Уа1 А1а Ьуя Аяр РНе
65 70 75 80
О1у Аяп Агд Туг О1п Ьеи Рго Рго Ьеи А1а Ие Ьеи Н!я Рго Агу Зег
85 90 95
Уа1 РНе Аяр Пе Зег Зег Ме1 Ме1 Ьуя Ия Ие Уа1 Ня Ьеи О1у Зег
100 105 110
ТНг Зег Аяп Ьеи ТЬг Уа1 А1а А1а Аг§ О1у Ня О1у Ня Зег Ьеи Οΐη
115 120 125
О1у О1п А1а Ьеи А1а Ня О1п О1у Уа1 Уа1 Пе Ьуя Ме1 О1и Зег Ьеи
130 135 140
- 20 029522
Аг§ 8ег Рго Азр Не Аг§ Не Туг Ьуз (Ну Ьуз СНп Рго Туг Уа1 Азр
145 150 155 160
Уа1 5ег О1у О1у О1и Не Тгр Не Азп Не Ьеи Аг§ О1и ТЬг Ьеи Ьуз
165 170 175
Туг С1 у Ьеи Зег Рго Ьуз Зег Тгр ТЬг Азр Туг Ьеи Шз Ьеи ТЬг Уа1
180 185 190
О1у О1у ТЬг Ьеи Зег Азп А1а О1у Не Зег О1у О1п А1а РЬе Ьуз Шз
195 200 205
О1у Рго О1п Не Азп Азп Уа1 Туг О1п Ьеи О1и Не Уа1 ТЬг О1у Ьуз
210 215 220
СНу О1и Уа1 Уа1 ТЬг Суз Зег О1и Ьуз Агд Азп Зег О1и Ьеи РЬе РЬе
225 230 235 240
Зег Уа1 Ьеи О1у О1у Ьеи О1у СНп РЬе О1у Не Не ТЬг Аг§ А1а Аг§
245 250 255
- 21 029522
Ие Зег Ьеи СНи Рго А1а Рго Из Ме( Уа1 Ьуз Тгр Не Аг§ Уа1 Ьеи
260 265 270
Туг Зег Азр РЬе Зег А1а РЬе Зег Аг§ Азр С1п СНи Туг Ьеи Не Зег
275 280 285
Ьуз СНи Ьуз ТЬг РЬе Азр Туг Уа1 СНи 01 у РЬе Уа1 Не Не Азп Аг§
290 295 300
ТЬг Азр Ьеи Ьеи Азп Азп Тгр Аг§ Зег Зег РЬе Зег Рго Азп Азр Зег
305 310 315 320
ТЬг СНп А1а Зег Аг§ РЬе Ьуз Зег Азр О1у Ьуз ТЬг Ьеи Туг Суз Ьеи
325 330 335
О1и Уа1 Уа1 Ьуз Туг РЬе Азп Рго С1и С1и А1а Зег Зег Ме! Азр С1п
340 345 350
О1и ТЬг О1у Ьуз Ьеи Ьеи Зег О1и Ьеи Азп Туг Не Рго Зег ТЬг Ьеи
- 22 029522
355 360 365
РНе 5ег 8ег О1и \'а1 Рго Туг Пе О1и РЬе Ьеи Азр Аг§ Уа1 РПз Не
370 375 380
А1а О1и Аг§ Ьуз Ьеи Аг§ А1а Ьуз О1у Ьеи Тгр О1и \'а1 Рго ЬПз Рго
385 390 395 400
Тгр Ьеи Азп Ьеи Ьеи Пе Рго Ьуз 5ег 5ег Не Туг О1п РЬе А1а ТНг
405 410 415
Сг1и \а1 РЬе Азп Азп Пе Ьеи ТЬг 8ег Азп Азп Азп О1у Рго Не Ьеи
420 425 430
Пе Туг Рго Уа1 Азп О1п 8ег Ьуз Тгр Ьуз Ьуз РПз ТЬг 5ег Ьеи Не
435 440 445
ТЬг Рго Азп Сг1и Азр Не РЬе Туг Ьеи Уа1 А1а РЬе Ьеи Рго 8ег А1а
450 455 460
- 23 029522
Уа1 Рго Азп Зег Зег СПу Ьуз Азп Азр Ьеи (Ли Туг Ьеи Ьеи Ьуз (Лп
465 470 475 480
Азп С1п Аг§ Уа1 Ме! Азп РЬе Суз А1а А1а А1а Азп Ьеи Азп Уа1 Ьуз
485 490 495
СПп Туг Ьеи Рго ΗΪ5 Туг СНи ТЬг С1п Ьуз СПи Тгр Ьуз Зег Из РЬе
500 505 510
СПу Ьуз Аг§ Тгр (Ли ТЬг РЬе А1а СПп Аг§ Ьуз (Лп А1а Туг Азр Рго
515 520 525
Ьеи А1а Пе Ьеи А1а Рго С1у (Лп Аг§ Не РЬе С1п Ьуз ТЬг ТЬг (Лу
530 535 540
Ьуз Ьеи Зег Рго Не О1п Ьеи А1а Ьуз Зег Ьуз А1а ТЬг СПу Зег Рго
545 550 555 560
(Лп Аг§ Туг Из Туг А1а Зег Пе Ьеи Рго Ьуз Рго Аг§ ТЬг Уа1
565 570 575
- 24 029522
<210> 6
<211 > 501
<212> РКТ
<213> АгаЫс1ор515 !ЬаПапа
<400> 6
Ме1 А1а Азп Ьеи Аг§ Ьеи Ме! Не ТЬг Ьеи Не ТЬг Уа1 Ьеи Ме! Не
15 10 15
ТЬг Ьуз 8ег 8ег Азп О1у Пе Ьуз Пе Азр Ьеи Рго Ьуз 8ег Ьеи Азп
20 25 30
Ьеи ТЬг Ьеи 8ег ТЬг Азр Рго 8ег Пе Пе Зег А1а А1а Зег ЬЬз Азр
35 40 45
РЬе С1у Азп Пе ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Рго С1у С1у Уа1 Пе Суз Рго 8ег
50 55 60
8ег ТЬг А1а Азр Пе Зег А го Ьеи Ьеи СНп Туг А1а А1а Азп О1у Ьуз
65 70 75 80
- 25 029522
Бег ТЬг РЬе С1п Уа1 А1а А1а Аг§ О1у С1п С1у Шз Зег Ьеи Азп О1у
85 90 95
О1п А1а 5ег Уа1 5ег О1у О1у Уа1 Не Уа1 Азп Ме( ТЬг Суз Не ТЬг
100 105 110
Азр Уа1 Уа1 Уа1 Зег Ьуз Азр Ьуз Ьуз Туг А1а Азр Уа1 А1а А1а С1у
115 120 125
ТЬг Ьеи Тгр Уа1 Азр Уа1 Ьеи Ьуз Ьуз ТЬг А1а О1и Ьуз О1у Уа1 5ег
130 135 140
Рго Уа1 5ег Тгр ТЬг Азр Туг Ьеи Шз Не ТЬг Уа1 С1у С1у ТЬг Ьеи
145 150 155 160
Бег Азп С1у С1у Не С1у С1у С1п Уа1 РЬе Агд Азп С1у Рго Ьеи Уа1
165 170 175
8ег Азп Уа1 Ьеи О1и Ьеи Азр Уа1 Не ТЬг О1у Ьуз О1у О1и Ме1 Ьеи
180 185 190
- 26 029522
ТЬг Сук Зег Аг§ О1п Ьеи Азп Рго О1и Ьеи РНе Туг О1у Уа1 Ьеи Сг1у
195 200 205
О1у Ьеи О1у О1п РНе О1у Не Не ТЬг Аг§ А1а Аг§ Не Уа1 Ьеи Азр
210 215 220
ЕНз А1а Рго Ьуз Агд А1а Ьуз Тгр РЬе Аг§ Ме! Ьеи Туг Зег Азр РЬе
225 230 235 240
ТЬг ТЬг РЬе ТЬг Ьуз Азр О1п О1и Аг§ Ьеи Не Зег Ме1 А1а Азп Азр
245 250 255
Не С1у Уа1 Азр Туг Ьеи С1и 01 у С1п Не РЬе Ьеи Зег Азп С1у Уа1
260 265 270
Уа1 Азр ТЬг Зег РЬе РЬе Рго Рго Зег Азр Сг1п Зег Ьуз Уа1 А1а Азр
275 280 285
Ьеи Уа1 Ьуз О1п Н1з О1у Не Не Туг Уа1 Ьеи О1и Уа1 А1а Ьуз Туг
- 27 029522
290 295 300
Туг Азр Азр Рго Азп Ьеи Рго Ие Ие 8ег Ьуз Уа1 Пе Азр ТЬг Ьеи
305 310 315 320
ТЬг Ьуз ТЬг Ьеи 8ег Туг Ьеи Рго СИу РЬе Пе 8ег Ме1 Шз Азр Уа1
325 330 335
А1а Туг РЬе Азр РЬе Ьеи Азп Аг§ Уа1 Шз Уа1 СНи 61и Азп Ьуз Ьеи
340 345 350
Аг§ 8ег Ьеи О1у Ьеи Тгр СНи Ьеи Рго Шз Рго Тгр Ьеи Азп Ьеи Туг
355 360 365
Уа1 Рго Ьуз 8ег Агд Ие Ьеи Азр РЬе Н1з Азп О1у Уа1 Уа1 Ьуз Азр
370 375 380
Пе Ьеи Ьеи Ьуз СНп Ьуз 8ег А1а 5>ег СНу Ьеи А1а Ьеи Ьеи Туг Рго
385 390 395 400
- 28 029522
ТЬг Азп Аг» Азп Ьуз Тгр Азр Азп Аг§ Ме1 Зег А1а Ме1 Не Рго СНи
405 410 415
Не Азр О1и Азр Уа1 Не Туг Ие Не СНу Ьеи Ьеи О1п Зег А1а ТЬг
420 425 430
Рго Ьуз Азр Ьеи Рго СНи Уа1 СНи Зег Уа1 Азп СНи Ьуз Не Не Аг§
435 440 445
РЬе Суз Ьуз Азр Зег СНу Не Ьуз Не Ьуз СНп Туг Ьеи Ме1 ЬПз Туг
450 455 460
ТЬг Зег Ьуз СНи Азр Тгр Не СНи Нлз РЬе СНу Зег Ьуз Тгр Азр Азр
465 470 475 480
РЬе Зег Ьуз Аг§ Ьуз Азр Ьеи РЬе Азр Рго Ьуз Ьуз Ьеи Ьеи Зег Рго
485 490 495
СНу СНп Азр Не РЬе
500
- 29 029522
<210> 7
<211> 523
<212> РКТ
<213> АгаЬЫорыз 1ЬаПапа
<400> 7
Ме! А1а Зег Туг Азп Ьеи Аг§ Зег О1п Уа1 Аг§ Ьеи Не А1а Не ТЬг
15 10 15
Не Уа1 Пе Пе Пе ТЬг Ьеи Зег ТЬг Рго Пе ТЬг ТЬг Азп ТЬг Зег
20 25 30
Рго О1п Рго Тгр Азп Пе Ьеи Зег ЬПз Азп С1и РЬе А1а С1у Ьуз Ьеи
35 40 45
ТЬг Зег Зег Зег Зег Зег Уа1 О1и Зег А1а А1а ТЬг Азр РЬе С1у №з
50 55 60
Уа1 ТЬг Ьуз Пе РЬе Рго Зег А1а Уа1 Ьеи Не Рго Зег Зег Уа1 С1и
65 70 75 80
- 30 029522
Азр Не ТЬг Азр Ьеи Пе Ьуз Ьеи Зег РЬе Азр Зег О1п Ьеи Зег РЬе
85 90 95
Рго Ьеи А1а А1а Аг§ О1у Н1з О1у Н1з Зег Нз Аг§ О1у О1п А1а Зег
100 105 110
А1а Ьуз Азр О1у Уа1 Уа1 Уа1 Азп Ме1 Аг§ Зег Ме1 Уа1 Азп Лгу Азр
115 120 125
Аг§ СИ у Пе Ьуз Уа1 Зег Аг§ ТЬг Суз Ьеи Туг Уа1 Азр Уа1 Азр А1а
130 135 140
А1а Тгр Ьеи Тгр Ие С1и Уа1 Ьеи Азп Ьуз ТЬг Ьеи С1и Ьеи С1у Ьеи
145 150 155 160
ТЬг Рго Уа1 Зег Тгр ТЬг Азр Туг Ьеи Туг Ьеи ТЬг Уа1 О1у О1у ТЬг
165 170 175
Ьеи Зег Азп О1у О1у Пе Зег О1у СЯп ТЬг РЬе Аг§ Туг О1у Рго СЯп
180 185 190
- 31 029522
Пе ТНг Азп Уа1 Ьеи С1и Ме( Азр Уа1 Пе ТНг О1у Ьуз С1у С1и Пе
195 200 205
А1а ТНг Суз Зег Ьуз Азр Ме( Азп Зег Азр Ьеи РНе РЬе А1а Уа1 Ьеи
210 215 220
СНу СПу Ьеи СПу О1п РЬе О1у Не Пе ТЬг Аг§ А1а Аг§ Пе Ьуз Ьеи
225 230 235 240
СНи Уа1 А1а Рго Ьуз Аг§ А1а Ьуз Тгр Ьеи Аг§ РНе Ьеи Туг Пе Азр
245 250 255
РЬе Зег СПи РЬе ТЬг Аг§ Азр С1п СНи Аг§ Уа1 Пе Зег Ьуз ТЬг Азр
260 265 270
СНу Уа1 Азр РЬе Ьеи СНи СНу Зег Пе Ме1 Уа1 Азр Ηίδ СНу Рго Рго
275 280 285
Азр Азп Тгр Аг§ Зег ТЬг Туг Туг Рго Рго Зег Азр Из Ьеи Аг§ Пе
- 32 029522
290 295 300
А1а Зег Ме! Уа1 Ьуз Аг§ Н1з Аг§ Уа1 Не Туг Суз Ьеи О1и Уа1 Уа1
305 310 315 320
Ьуз Туг Туг Азр С1и ТЬг Зег СНп Туг ТЬг Уа1 Азп О1и СНи Ме! С1и
325 330 335
СНи Ьеи Зег Азр Зег Ьеи Азп Н1з Уа1 Аг§ О1у РЬе Ме! Туг СНи Ьуз
340 345 350
Азр Уа1 ТЬг Туг Ме! Азр РЬе Ьеи Азп Аг§ Уа1 Аг§ ТЬг О1у СНи Ьеи
355 360 365
Азп Ьеи Ьуз Зег Ьуз СНу СНп Тгр Азр Уа1 Рго ТЬз Рго Тгр Ьеи Азп
370 375 380
Ьеи РЬе Уа1 Рго Ьуз ТЬг О1п Пе Зег Ьуз РЬе Азр Азр СНу Уа1 РЬе
385 390 395 400
- 33 029522
Ьуз Сг1у Пе Не Ьеи Агд Азп Азп Не ТЬг Зег СНу Рго Уа1 Ьеи Уа1
405 410 415
Туг Рго Ме1 Азп Агд Азп Ьуз Тгр Азп Азр Агд Ме1 Зег А1а А1а Пе
420 425 430
Рго О1и О1и Азр Уа1 РЬе Туг А1а Уа1 СНу РЬе Ьеи Агд Зег А1а СНу
435 440 445
РЬе Азр Азп Тгр О1и А1а РЬе Азр СНп СНи Азп Ме! О1и Пе Ьеи Ьуз
450 455 460
РЬе Суз С1и Азр А1а Азп Ме! СНу Уа1 Не СПп Туг Ьеи Рго Туг ЬЬз
465 470 475 480
Зег Зег СНп СНи СНу Тгр Уа1 Агд Н1з РЬе СНу Рго Агд Тгр Азп Пе
485 490 495
РЬе Уа1 СНи Агд Ьуз Туг Ьуз Туг Азр Рго Ьуз Ме! Пе Ьеи Зег Рго
500 505 510
- 34 029522
С1у С1п Азп Не РЬе СИп Ьуз Не Азп Зег Зег
515 520
<210> 8
<211> 524
<212> РКТ
<213> АгаЬ1борз13 (ЬаПапа
<400> 8
Ме! ТЬг Азп ТНг Ьеи Суз Ьеи Зег Ьеи Пе ТЬг Ьеи Пе ТЬг Ьеи РЬе
15 10 15
IIе Зег Ьеи ТЬг Рго ТЬг Ьеи Не Ьуз Зег Азр О1и О1у IIе Азр Уа1 20 25 30
РЬе Ьеи Рго Не Зег Ьеи Азп Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи ТЬг Азр Рго РЬе Зег
35 40 45
Пе Зег А1а А1а Зег Шз Азр РЬе О1у Азп Пе ТЬг Азр СНи Азп Рго
50 55 60
- 35 029522
СНу А1а Уа1 Ьеи Суз Рго Зег Зег ТЬг ТЬг С1и Уа1 А1а Агд Ьеи Ьеи
65 70 75 80
Агд РЬе А1а Азп СНу СНу РЬе Зег Туг Азп Ьуз СНу Зег ТЬг Зег Рго
85 90 95
А1а Зег ТЬг РЬе Ьуз Уа1 А1а А1а Агд СНу СНп СНу Нлз Зег Ьеи Агд
100 105 110
СНу СНп А1а Зег А1а Рго СНу СНу Уа1 Уа1 Уа1 Азп Ме1 ТЬг Суз Ьеи
115 120 125
А1а Ме( А1а А1а Ьуз Рго А1а А1а Уа1 Уа1 Не Зег А1а Азр СНу ТЬг
130 135 140
Туг А1а Азр Уа1 А1а А1а СНу ТЬг Ме1 Тгр Уа1 Азр Уа1 Ьеи Ьуз А1а
145 150 155 160
А1а Уа1 Азр Агд О1у Уа1 Зег Рго Уа1 ТЬг Тгр ТЬг Азр Туг Ьеи Туг
165 170 175
- 36 029522
Ьеи Зег Уа1 О1у О1у ТНг Ьеи Зег Азп А1а 01у Не О1у О1у 01п ТНг
180 185 190
РЬе Лгу Нк О1у Рго Сг1п Пе Зег Азп Уа1 Ηίκ О1и Ьеи Азр Уа1 Пе
195 200 205
ТНг О1у Ьуз О1у О1и Ме1 Ме! ТЬг Суз Зег Рго Ьуз Ьеи Азп Рго О1и
210 215 220
Ьеи РЬе Туг О1у Уа1 Ьеи О1у О1у Ьеи О1у О1п РЬе О1у Не Пе ТНг
225 230 235 240
Аг§ А1а Аг§ Не А1а Ьеи Азр Н15 А1а Рго ТНг Аг§ Уа1 Ьуз Тгр Зег
245 250 255
Аг§ Пе Ьеи Туг Зег Азр РНе Зег А1а РНе Ьуз Лгу Азр О1п О1и Агу
260 265 270
Ьеи Пе Зег Ме! ТНг Азп Азр Ьеи О1у Уа1 Азр РНе Ьеи О1и О1у О1п
- 37 029522
275 280 285
Ьеи Ме! Ме! Зег Азп СНу РНе Уа1 Азр ТЬг Зег РЬе РЬе Рго Ьеи Зег
290 295 300
Азр О1п ТЬг Аг§ Уа1 А1а Зег Ьеи Уа1 Азп Азр Н1з Аг§ Не Не Туг
305 310 315 320
Уа1 Ьеи СНи Уа1 А1а Ьуз Туг Туг Азр Агц ТЬг ТЬг Ьеи Рго Ие Не
325 330 335
Азр СНп Уа1 Ие Азр ТЬг Ьеи Зег Аг§ ТЬг Ьеи СНу РНе А1а Рго СНу
340 345 350
РЬе Ме! РЬе Уа1 СНп Азр Уа1 Рго Туг РЬе Азр РЬе Ьеи Азп Аг§ Уа1
355 360 365
Л г» Азп СНи СНи Азр Ьуз Ьеи Лг§ Зег Ьеи СНу Ьеи Тгр СНи Уа1 Рго
370 375 380
- 38 029522
Шз Рго Тгр Ьеи Азп Пе РЬе Уа1 Рго СНу 8ег Агд Пе СНп Азр РЬе
385 390 395 400
Шз Азр 01 у Уа1 Пе Азп О1у Ьеи Ьеи Ьеи Азп 01 п ТЬг 8ег ТЬг 8ег
405 410 415
О1у Уа1 ТЬг Ьеи РЬе Туг Рго ТЬг Азп Агд Азп Ьуз Тгр Азп Азп Аг§
420 425 430
Ме( Зег ТЬг МеГ ТЬг Рго Азр С1и Азр Уа1 РЬе Туг Уа1 Пе О1у Ьеи
435 440 445
Ьеи О1п 8ег А1а О1у О1у 8ег О1п Азп Тгр О1п О1и Ьеи О1и Азп Ьеи
450 455 460
Азп Азр Ьуз Уа1 Пе О1п РЬе Суз О1и Азп Бег О1у Пе Ьуз Пе Ьуз
465 470 475 480
О1и Туг Ьеи Ме( Шз Туг ТЬг Аг§ Ьуз О1и Азр Тгр Уа1 Ьуз Шз РЬе
485 490 495
- 39 029522
СНу Рго Ьув Тгр Авр Авр РНе Ьеи Агд Ьув Ьув Пе МеТ РЬе Авр Рго
500 505 510
Ьув Агд Ьеи Ьеи 8ег Рго СНу СНп Авр Не РЬе Азп
515 520
<210> 9
<211> 540
<212> РКТ
<213> АгаЫйорв1в (ЬаНапа
<400> 9
МеТ Авп Агд СНи Ме( ТЬг 8ег 8ег РЬе Ьеи Ьеи Ьеи ТЬг РЬе А1а Не
15 10 15
Суз Ьуз Ьеи Не Не А1а Уа1 СНу Ьеи Авп Уа1 СНу Рго 8ег СНи Ьеи
20 25 30
Ьеи Агд Пе СНу А1а Пе Авр Уа1 Азр СНу Ив РЬе ТЬг Уа1 Из Рго
35 40 45
- 40 029522
8ег Азр Ьеи А1а Зег Уа1 Зег 8ег Азр РЬе О1у Ме1 Ьеи Ьуз Зег Рго
50 55 60
О1и О1и Рго Ьеи А1а Уа1 Ьеи Шз Рго 8ег 8ег А1а С1и Азр Аа1 А1а
65 70 75 80
Агд Ьеи \'а1 Агд ТНг А1а Туг СНу Зег А1а ТНг А1а РЬе Рго \'а1 Зег
85 90 95
А1а Агд О1у Шз СНу ΗΪ3 8ег Не Азп 61у О1п А1а А1а А1а О1у Агд
100 105 110
Азп О1у Уа1 Уа1 Уа1 О1и Мек Азп Шз О1у Уа1 ТЬг СНу ТЬг Рго Ьуз
115 120 125
Рго Ьеи Уа1 Агд Рго Азр О1и Ме1 Туг Уа1 Азр Уа1 Тгр О1у С1у О1и
130 135 140
Ьеи Тгр Уа1 Азр Уа1 Ьеи Ьуз Ьуз ТЬг Ьеи СИи Шз СНу Ьеи А1а Рго
145 150 155 160
- 41 029522
Ьуз Зег Тгр ТНг Аар Туг Ьеи Туг Ьеи ТНг Уа1 О1у Сг1у ТНг Ьеи Зег
165 170 175
Азп А1а О1у Не Зег О1у О1п А1а РНе Нк РПз С1у Рго СПп Пе Зег
180 185 190
Азп Уа1 Ьеи С1и Ьеи Азр Уа1 Уа1 ТНг О1у Ьуз О1у С1и Уа1 Ме! Агд
195 200 205
Суз Зег СПи СПи СПи Азп ТНг Агд Ьеи РНе Из СИу Уа1 Ьеи С1у С1у
210 215 220
Ьеи О1у СНп РНе О1у Не Пе ТНг Агд А1а Агд Пе Зег Ьеи О1и Рго
225 230 235 240
А1а Рго СПп Агд Уа1 Агд Тгр Пе Агд Уа1 Ьеи Туг Зег Зег РНе Ьуз
245 250 255
Уа1 РНе ТНг СПи Азр СПп СПи Туг Ьеи Не Зег Ме! Ηί$ С1у СПп Ьеи
- 42 029522
260 265 270
Ьуз РЬе Азр Туг Уа1 ΟΙιι О1у РЬе Уа1 Не Уа1 Азр О1и 01 у Ьеи Уа1
275 280 285
Азп Азп Тгр Агд Бег Зег РЬе РЬе Зег Рго Агд Азп Рго Уа1 Ьуз Не
290 295 300
Зег Зег Уа1 Зег Зег Азп О1у Зег Уа1 Ьеи Туг Суз Ьеи О1и Не ТЬг
305 310 315 320
Ьуз Азп Туг Шз Азр Зег Азр Зег С1и Не Уа1 Азр С1п С1и Уа1 С1и
325 330 335
Не Ьеи Ме1 Ьуз Ьуз Ьеи Азп РЬе Не Рго ТЬг Зег Уа1 РЬе ТЬг ТЬг
340 345 350
Азр Ьеи О1п Туг Уа1 Азр РЬе Ьеи Азр Агд Уа1 ЬПз Ьуз А1а О1и Ьеи
355 360 365
- 43 029522
Ьуз Ьеи Аг§ Зег Ьуз Азп Ьеи Тгр СНи Уа1 Рго ТПз Рго Тгр Ьеи Азп
370 375 380
Ьеи РНе Уа1 Рго Ьуз Зег Агд Пе Зег Азр РЬе Азр Ьуз СНу \'а1 РЬе
385 390 395 400
Ьуз СНу Пе Ьеи СНу Азп Ьуз ТЬг Зег СНу Рго Пе Ьеи Пе Туг Рго
405 410 415
Ме1 Азп Ьуз Азр Ьуз Тгр Азр СНи Агд Зег Зег А1а Уа1 ТЬг Рго Азр
420 425 430
СНи СНи Уа1 РНе Туг Ьеи Уа1 А1а Ьеи Ьеи Агд Зег А1а Ьеи ТЬг Азр
435 440 445
СНу СНи СНи ТЬг СНп Ьуз Ьеи СНи Туг Ьеи Ьуз Азр СНп Азп Агд Агд
450 455 460
Пе Ьеи СНи РЬе Суз СНи О1п А1а Ьуз Пе Азп Уа1 Ьуз СНп Туг Ьеи
465 470 475 480
- 44 029522
Рго Ηίδ Ηίδ А1а ТЬг СНп СНи СНи Тгр \'а1 А1а Ηίδ РНе О1у Азр Ьуз
485 490 495
Тгр Азр Аг§ РЬе Агд Зег Ьеи Ьу5 А1а СНи РЬе Азр Рго Агд Н1з Не
500 505 510
Ьеи А1а ТЬг О1у СНп Агд Не РЬе О1п Азп Рго Зег Ьеи Зег Ьеи РЬе
515 520 525
Рго Рго Зег Зег Зег Зег Зег Зег А1а А1а Зег Тгр
530 535 540
<210> 10
<211> 533
<212> РКТ
<213> АгаЫборз13 !ЬаНапа
<400> 10
Ме! Зег Туг Ьеи Ηίδ А1а Зег Ьеи Ьеи Агд Ьуз Агд ТЬг Ме! Ьеи Не
15 10 15
- 45 029522
Уа1 Агд Зег РЬе ТЬг Не Ьеи Ьеи Ьеи Зег Суз Пе А1а РЬе Ьуз Ьеи
20 25 30
А1а Суз Суз РЬе Зег Зег Зег Пе Зег Зег Ьеи Ьуз А1а Ьеи Рго Ьеи
35 40 45
Уа1 С1у Из Ьеи С1и РЬе С1и Из Уа1 ЬПз Из А1а Зег Ьуз Азр РЬе
50 55 60
С1у Азп Агд Туг СНп Ьеи Пе Рго Ьеи А1а Уа1 Ьеи ЬПз Рго Ьуз Зег
65 70 75 80
Уа1 Зег Азр Пе А1а Зег ТЬг Не Агд Из Пе Тгр Ме! Ме! С1у ТЬг
85 90 95
Из Зег Οίη Ьеи ТЬг Уа1 А1а А1а Агд СНу Агд 61у Из Зег Ьеи СПп
100 105 110
О1у СНп А1а СНп ТЬг Агд Шз СНу Пе Уа1 Пе Из Ме! СНи Зег Ьеи
115 120 125
- 46 029522
ΗΪ5 Рго Οίη Ьуз Ьеи Οίη Уа1 Туг Зег Уа1 Азр Зег Рго А1а Рго Туг
130 135 140
Уа1 Азр Уа1 Зег О1у О1у О1и Ьеи Тгр Пе Азп Пе Ьеи НО О1и ТНг
145 150 155 160
Ьеи Ьуз Туг С1у Ьеи А1а Рго Ьуз Зег Тгр ТНг Азр Туг Ьеи Н13 Ьеи
165 170 175
ТНг Уа1 О1у О1у ТЬг Ьеи Зег Азп А1а О1у Пе Зег О1у О1п А1а РНе
180 185 190
Агд Н13 01 у Рго О1п Пе Зег Азп Уа1 Н13 О1п Ьеи О1и Пе Уа1 ТНг
195 200 205
О1у Ьуз О1у О1и Пе Ьеи Азп Суз ТЬг Ьуз Аг§ О1п Азп Зег Азр Ьеи
210 215 220
РЬе Азп О1у Уа1 Ьеи О1у О1у Ьеи О1у О1п РЬе О1у Пе Пе ТЬг Аг§
- 47 029522
225 230 235 240
А1а Агд Пе А1а Ьеи СНи Рго А1а Рго ТЬг Ме( Уа1 Ьуз Тгр Пе Агд
245 250 255
Уа1 Ьеи Туг Ьеи Азр РЬе А1а А1а РЬе А1а Ьуз Азр СНп СНи СНп Ьеи
260 265 270
Пе Зег А1а СНп СНу Из Ьуз РЬе Азр Туг Пе СНи СНу РЬе Уа1 Пе
275 280 285
Ие Азп Агд ТЬг СНу Ьеи Ьеи Азп Зег Тгр Агд Ьеи Зег РЬе ТЬг А1а
290 295 300
СНи СНи Рго Ьеи СНи А1а Зег СНп РЬе Ьуз РЬе Азр СНу Агд ТЬг Ьеи
305 310 315 320
Туг Суз Ьеи СНи Ьеи А1а Ьуз Туг Ьеи Ьуз СНп Азр Азп Ьуз Азр Уа1
325 330 335
- 48 029522
Пе Азп С1п С1и Уа1 Ьуз (Ли ТЬг Ьеи Зег (Ли Ьеи Зег Туг Уа1 ТЬг
340 345 350
Зег ТЬг Ьеи РЬе ТЬг ТЬг (Ли Уа1 А1а Туг (Ли А1а РЬе Ьеи Азр Аг§
355 360 365
Уа1 ΗΪ8 Уа1 Зег (Ли Уа1 Ьуз Ьеи Аг§ Зег Ьуз (Лу (Лп Тгр (Ли Уа1
370 375 380
Рго РПз Рго Тгр Ьеи Азп Ьеи Ьеи Уа1 Рго Аг§ Зег Ьуз IIе Азп (Ли
385 390 395 400
РЬе А1а Аг§ (Лу Уа1 РЬе О1у Азп Не Ьеи ТНг Азр ТЬг Зег Азп (Лу
405 410 415
Рго Уа1 Не Уа1 Туг Рго Уа1 Азп Ьуз Зег Ьуз Тгр Азр Азп (Лп ТЬг
420 425 430
Зег А1а Уа1 ТЬг Рго (Ли (Ли (Ли Уа1 РЬе Туг Ьеи Уа1 А1а Не Ьеи
435 440 445
- 49 029522
ТЬг Зег А1а Зег Рго С1у Зег А1а СНу Ьуз Азр СНу Уа1 СНи С1и Не
450 455 460
Ьеи Агд Агд Азп Агд Агд Не Ьеи О1и РЬе Зег О1и СНи А1а О1у Не
465 470 475 480
СЛу Ьеи Ьуз СНп Туг Ьеи Рго ЬПз Туг ТЬг ТЬг Агд СНи СНи Тгр Агд
485 490 495
Зег Шз РЬе СНу Азр Ьуз Тгр О1у О1и РЬе Уа1 Агд Агд Ьуз Зег Агд
500 505 510
Туг Азр Рго Ьеи А1а Не Ьеи А1а Рго О1у Шз Агд Не РЬе О1п Ьуз
515 520 525
А1а Уа1 Зег Туг Зег
530
<210> 11
<211> 524
- 50 029522
<212> ΡΚΤ
<213> АгаЫйорз^з 1ЬаПапа
<400> 11
Ме( Пе А1а Туг Пе О1и Рго Туг РЬе Ьеи С1и Азп Аар А1а С1и А1а
15 10 15
А1а 8ег А1а А1а ТЬг А1а А1а С1у Ьуз 8ег ТЬг Авр О1у Уа1 8ег О1и
20 25 30
8ег Ьеи Авп Пе О1п О1у О1и Пе Ьеи Суз О1у СП у А1а А1а А1а Аар
35 40 45
Пе А1а СНу Агд Авр РЬе О1у О1у Ме1 Азп Суз Уа1 Ьуз Рго Ьеи А1а
50 55 60
Уа1 Уа1 Агд Рго Уа1 О1у Рго О1и Азр Пе А1а О1у А1а Уа1 Ьуз А1а
65 70 75 80
А1а Ьеи Агд 8ег Азр Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 А1а А1а Агд О1у Азп О1у ЬПз
85 90 95
- 51 029522
Зег Не Азп О1у Οϊη А1а Ме1 А1а О1и О1у О1у Ьеи Уа1 Уа1 Азр Ме!
100 105 110
Зег ТЬг ТЬг А1а О1и Азп Из РЬе О1и Уа1 О1у Туг Ьеи Зег О1у О1у
115 120 125
Азр А1а ТЬг А1а РЬе Уа1 Азр Уа1 Зег С1у С1у А1а Ьеи Тгр О1и Азр
130 135 140
Уа1 Ьеи Ьуз Аг§ Суз Уа1 Зег О1и Туг О1у Ьеи А1а Рго Аг§ Зег Тгр
145 150 155 160
ТЬг Азр Туг Ьеи 01 у Ьеи ТЬг Уа1 С1у О1у ТЬг Ьеи Зег Азп А1а С1у
165 170 175
Уа1 Зег О1у О1п А1а РЬе Аг§ Туг О1у Рго О1п ТЬг Зег Азп Уа1 ТЬг
180 185 190
О1и Ьеи Азр Уа1 Уа1 ТЬг О1у Азп О1у Азр Уа1 Уа1 ТЬг Суз Зег О1и
- 52 029522
195 200 205
Пе О1и Азп Зег О1и Ьеи РЬе РЬе Зег Уа1 Ьеи О1у (Ну Ьеи СНу О1п
210 215 220
РЬе О1у Не Не ТЬг Ага А1а Ага. Уа1 Ьеи Ьеи О1п Рго А1а Рго Азр
225 230 235 240
Ме( Уа1 Ага Тгр Пе Аг§ Уа1 Уа1 Туг ТЬг (Ни РЬе Азр (Ни РЬе ТЬг
(Нп Азр А1а СНи Тгр Ьеи Уа1 Зег (Нп Ьуз Азп (Ни Зег Зег РЬе Азр
260 265 270
Туг Уа1 (Ни (Ну РЬе Уа1 РЬе Уа1 Азп (Ну А1а Азр Рго Уа1 Азп (Ну
275 280 285
Тгр Рго ТЬг Уа1 Рго Ьеи ΗΪ3 Рго Азр РНз (Ни РЬе Азр Рго ТЬг Аг§
290 295 300
- 53 029522
Ьеи Рго СПп 8ег Суз СНу 8ег Уа1 Ьеи Туг Суз Ьеи О1и Ьеи СНу Ьеи
305 310 315 320
Шз Туг Агд Азр 8ег Азр 8ег Азп 8ег ТЬг Пе Азр Ьуз Агд Уа1 СНи
325 330 335
Агд Ьеи Не СНу Агд Ьеи Агд РНе Азп СНи О1у Ьеи Агд РЬе СНи Уа1
340 345 350
Азр Ьеи Рго Туг Уа1 Азр РЬе Ьеи Ьеи Агд Уа1 Ьуз Агд Зег С1и СНи
355 360 365
Пе А1а Ьуз СНи Азп О1у ТЬг Тгр СНи ТЬг Рго Шз Рго Тгр Ьеи Азп
370 375 380
Ьеи РЬе Уа1 Зег Ьуз Агд Азр Пе С1у Азр РНе Азп Агд ТЬг Уа1 РЬе
385 390 395 400
Ьуз СНи Ьеи Уа1 Ьуз Азп СНу Уа1 Азп СНу Рго Ме! Ьеи Уа1 Туг Рго
405 410 415
- 54 029522
Ьеи Ьеи Агд Зег Агд Тгр Азр Азр Агд ТЬг Зег Уа1 Уа1 Не Рго О1и
420 425 430
С1и 01 у С1и Не РЬе Туг Не Уа1 А1а Ьеи Ьеи Агд РЬе Уа1 Рго Рго
435 440 445
Суз А1а Ьуз Уа1 Зег Зег Уа1 С1и Ьуз Ме( Уа1 А1а О1п Азп СНп С1и
450 455 460
Не Уа1 ЬПз Тгр Суз Уа1 Ьуз Азп О1у Не Азр Туг Ьуз Ьеи Туг Ьеи
465 470 475 480
Рго ЬПз Туг Ьуз Зег СНп СНи СНи Тгр Не Агд ЬПз РЬе О1у Азп Агд
485 490 495
Тгр Зег Агд РЬе Уа1 Азр Агд Ьуз А1а Ме1 РЬе Азр Рго Ме( А1а Не
500 505 510
Ьеи Зег Рго СИ у СНп Ьуз Не РЬе Азп Агд Зег Ьеи
515 520
- 55 029522
<210> 12
<211> 132
<212> РКТ
<213> АгаЫборз1з (ЬаПапа
<400> 12
Ме1 Ьеи О1у Ьеи 01у Уа1 Азр Аг§ Ьеи 01п А1а Азр Пе Азп Аг§ Ьеи
15 10 15
Ьеи А1а Зег Ьеи РЬе Н1з О1п О1у Уа1 Ьеи Азр О1и О1п РЬе Ьеи О1п
20 25 30
Ьеи Οΐη Οΐη Ьеи О1п Азр О1и ТЬг Зег Рго Азп РЬе Уа1 Ме( Азр Аг«
35 40 45
О1и РЬе Зег Азр Туг Ьуз Ьуз Пе О1у Ьеи ΗΪ3 Ьеи Азп О1п Ьеи Уа1
50 55 60
О1у Зег Зег Зег Зег Пе О1у А1а Аг§ Аг§ Уа1 Аг§ Азп Уа1 Суз Уа1
65 70 75 80
- 56 029522
А1а РЬе Агд Зег А1а Зег СНи Ьеи Зег Азп Агд Рго СНу Суз Ьеи Агд
85 90 95
СНу Ьеи СНи Уа1 Уа1 СНи Из СНи Туг Из Туг Ьеи Ьуз Азп Ме( Ме1
100 105 НО
Из СНи Ьеи РЬе СНп Ьеи СНи О1п СНп Агд Пе Ьеи А1а А1а СНу Уа1
115 120 125
Агд Туг Рго Ме(
130
<210> 13
<211> 399
<212> ΟΝΑ
<213> АгаЫНорз13 (ЬаПапа
<400> 13
аГдПддддГ 1§§дГд(дда ссддсПсаа дссдасаГса ассддсГссГ адссЮГсИ 60
Пссассадд дадГдсГдда сдадсадКс КдсадсКс адсадсКса ада!дадас1 120
- 57 029522
(сассааас( «д(да(дда (ададааКс (сддас(а(а адаааа1адд а((асасс(д 180
аа(са§с(§д (дддаадсад ((саа§са(( §§(§с(с§(а §д§((сд(аа сд(с(§сд(( 240
дссШсдЦ с(дс((ссда дсКадсаас сдсссаддд! дсИдададд ас(ддадд(а 300
д(ададса(д ад(а(са((а сс(саадаас а(да(дса(д аас!с11сса дс(ддадсад 360
сададааш (адс(дсадд а§(сада(а( ссаа(д(аа 399
<210> 14
<211> 574
<212> ϋΝΑ
<213 > АгаЫйорв1в (ЬаНапа
<400> 14
даадсаадас с1§1(саса( (а§(ааааас ааа(а(а(а§ ааададдааа §а(1§аадс§ 60
еааааседуа саадасддд( д(дсс§«д( дда(д((ддд §((ддд(д(§ дассеуспс 120
аа§сс§аса( саасс§§с(с с(а§сс(с(с (Шссасса §§§а§(§с(§ §ас§а§са§( 180
(сКдсадс! (са§са§с(( саа§а(да§а сКсассааа с(((§(да(§ §а(а§а§аа( 240
(с(сддас(а (аадаааа(а ддаКасасс (даа(садс( дд(дддаадс адКсаадса 300
- 58 029522
пуу(ус!су ГауууПсу! аасу!с!усу иуссшсу гсс(£>спсс уаусиауса 360
ассусссауу уГусПуауа ууас!ууауу гау!ауауса !уау!а!са! !асс!саауа 420
аса!уа!уса !уаас!с!!с саус!ууаус аусауауаа! аПаусгуса §уау!сауа! 480
а!ссаа!у!а аааИауаа! (1(у!са!аа ааа!сауауа ааасс1ааИ ау!у!у!уа! 540
уа1ау1у1у1 1а!ааус!ас суааусуааа ссс! 574

Claims (7)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ увеличения выхода семян растения, включающий стабильное введение дефекта в эндогенный ген гистидин-фосфотрансферного белка арабидопсиса 6 (АНР6) клеток растения, при этом данный дефект подавляет экспрессию и/или активность продукта вышеуказанного эндогенного гена АНР6 в сравнении с соответствующим контрольным растением, в котором нет указанного дефекта, при этом эндогенный ген АНР6 включает или состоит из:
    (а) нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую белок АНР6 с аминокислотными последовательностями 8ЕЦ ГО N0: 1 и 12, или его ортологи;
    (б) нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, кодирующую белок АНР6 с аминокислотными последовательностями, по меньшей мере на 70% идентичными полноразмерным аминокислотным последовательностям 8ЕЦ ГО N0: 1 и 12;
    (в) нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность 8ЕЦ ГО N0: 2, 3, 4, 13 или 14;
    (г) нуклеиновой кислоты, включающей нуклеотидную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную нуклеотидной последовательности 8ЕЦ ГО N0: 2, 3, 4, 13 или 14; либо
    (д) нуклеиновой кислоты, гибридизирующейся в жестких условиях с любой из нуклеотидных последовательностей, определенных в подпунктах (а), (б), (в) и (или) (г).
  2. 2. Способ по п.1, дополнительно включающий регенерацию растения из растительных клеток.
  3. 3. Способ по любому из предыдущих пунктов, который дополнительно включает введение дефекта хотя бы в один эндогенный ген цитокинин-оксидазы/дегидрогеназы (СКХ), при этом указанный ген представляет собой
    эндогенный ген СКХ1, кодирующий белок СКХ, включающий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную 8ЕЦ ГО N0: 5, или соответствующий ортолог;
    эндогенный ген СКХ2, кодирующий белок СКХ, включающий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную 8ЕЦ ГО N0: 6, или соответствующий ортолог;
    эндогенный ген СКХ3, кодирующий белок СКХ, включающий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную 8ЕЦ ГО N0: 7, или соответствующий ортолог;
    эндогенный ген СКХ4, кодирующий белок СКХ, включающий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную 8ЕЦ ГО N0: 8, или соответствующий ортолог;
    эндогенный ген СКХ5, кодирующий белок СКХ, включающий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную 8ЕЦ ГО N0: 9, или соответствующий ортолог;
    эндогенный ген СКХ6, кодирующий белок СКХ, включающий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную 8ЕЦ ГО N0: 10, или соответствующий ортолог;
    эндогенный ген СКХ7, кодирующий белок СКХ, включающий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную 8ЕЦ ГО N0: 11, или соответствующий ортолог.
  4. 4. Способ по п.3, в котором дефект вводят в эндогенный ген СКХ3, кодирующий белок СКХ, включающий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную 8ЕЦ ГО N0: 7, или соответствующий ортолог, и дефект вводят в эндогенный ген СКХ5, кодирующий белок СКХ, включающий аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90% идентичную 8ЕЦ ГО N0: 9, или
    - 59 029522
    соответствующий ортолог.
  5. 5. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором указанный дефект представляет собой структурный дефект, антисмысловое подавление соответствующего гена, сайленсинг генов, индуцируемый двухцепочечной РНК, технологию использования рибозимов, таргетирование индуцированных местных геномных повреждений (ТГЬЫЫО) и/или гомологическую рекомбинацию.
  6. 6. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором дефект представляет собой гомозиготный дефект.
  7. 7. Растение с увеличенным выходом семян, полученное способом по п.3, которое имеет дефект эндогенного гена АНР6 и дефект хотя бы одного эндогенного гена СКХ.
    - 60 029522
EA201300709A 2010-12-20 2011-12-16 Введение дефекта в ген ahp6 для увеличения выхода семян растения EA029522B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10196018 2010-12-20
PCT/EP2011/073058 WO2012084715A1 (en) 2010-12-20 2011-12-16 Disruption of ahp6 gene leads to plants with improved seed yield

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201300709A1 EA201300709A1 (ru) 2014-03-31
EA029522B1 true EA029522B1 (ru) 2018-04-30

Family

ID=45470521

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201300709A EA029522B1 (ru) 2010-12-20 2011-12-16 Введение дефекта в ген ahp6 для увеличения выхода семян растения

Country Status (12)

Country Link
US (1) US9422570B2 (ru)
EP (1) EP2655633B1 (ru)
JP (1) JP6129746B2 (ru)
CN (1) CN103348010A (ru)
AU (1) AU2011347647B2 (ru)
CA (1) CA2822338A1 (ru)
DK (1) DK2655633T3 (ru)
EA (1) EA029522B1 (ru)
PL (1) PL2655633T3 (ru)
UA (1) UA109040C2 (ru)
WO (1) WO2012084715A1 (ru)
ZA (1) ZA201304431B (ru)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EA029522B1 (ru) 2010-12-20 2018-04-30 Томас Шмюллинг Введение дефекта в ген ahp6 для увеличения выхода семян растения

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060123507A1 (en) * 2002-11-13 2006-06-08 Motoyuki Ashikari Gene elevating cereal yield and utilization thereof

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5231020A (en) 1989-03-30 1993-07-27 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
US5034323A (en) 1989-03-30 1991-07-23 Dna Plant Technology Corporation Genetic engineering of novel plant phenotypes
EP1272630A2 (en) 2000-03-16 2003-01-08 Genetica, Inc. Methods and compositions for rna interference
US20020182223A1 (en) 2000-06-02 2002-12-05 Lacount Douglas J. Method of rapidly generating double-stranded RNA and methods of use thereof
CN1869235B (zh) * 2000-06-16 2011-10-19 托马斯·施穆林 改变植物形态学、生物化学和生理学的方法
US20020173478A1 (en) 2000-11-14 2002-11-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Post-transcriptional gene silencing by RNAi in mammalian cells
JP4831370B2 (ja) * 2006-02-28 2011-12-07 独立行政法人科学技術振興機構 グルカン量を低減させることなくリグニン量およびセルロース量を低減させた植物体およびその生産方法、並びにこれらの利用
JP2007312635A (ja) * 2006-05-24 2007-12-06 Research Institute Of Innovative Technology For The Earth クエン酸分泌能が強化された樹木およびその作出方法
JP2010136623A (ja) * 2007-03-28 2010-06-24 Japan Tobacco Inc 燃焼煙中のカルボニル類含量が低減されたタバコ属植物およびその作製法
JP2010136624A (ja) * 2007-03-28 2010-06-24 Japan Tobacco Inc 燃焼煙中のカルボニル類含量が低減されたタバコ属植物及びその作製法
EA029522B1 (ru) 2010-12-20 2018-04-30 Томас Шмюллинг Введение дефекта в ген ahp6 для увеличения выхода семян растения

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060123507A1 (en) * 2002-11-13 2006-06-08 Motoyuki Ashikari Gene elevating cereal yield and utilization thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ARI PEKKA M�H�NEN, ANTHONY BISHOPP, MASAYUKI HIGUCHI, KAISA M. NIEMINEN, KAORI KINOSHITA, KIRSI T�RM�KANGAS, YOSHIHISA IKEDA, ATSU: "Cytokinin signaling and its inhibitor AHP6 regulate cell fate during vascular development", SCIENCE, AMERICAN ASSOCIATION FOR THE ADVANCEMENT OF SCIENCE, US, vol. 311, 6 January 2006 (2006-01-06), US, pages 94 - 98, XP002671793, ISSN: 0036-8075, DOI: 10.1126/science.1118875 *
ISABEL BARTRINA, ELISABETH OTTO, MIROSLAV STRNAD, TOM� WERNER AND THOMAS SCHM�LLING: "Cytokinin Regulates the Activity of Reproductive Meristems, Flower Organ Size, Ovule Formation, and Thus Seed Yield in Arabidopsis thaliana", THE PLANT CELL, AMERICAN SOCIETY OF PLANT BIOLOGISTS, US, vol. 23, no. 1, 1 January 2011 (2011-01-01), US, pages 69 - 80, XP002671794, ISSN: 1040-4651, DOI: 10.1105/tpc.110.079079 *

Also Published As

Publication number Publication date
UA109040C2 (en) 2015-07-10
AU2011347647A1 (en) 2013-06-06
PL2655633T3 (pl) 2018-05-30
CA2822338A1 (en) 2012-06-28
US9422570B2 (en) 2016-08-23
AU2011347647B2 (en) 2016-03-03
CN103348010A (zh) 2013-10-09
EP2655633A1 (en) 2013-10-30
JP2014501521A (ja) 2014-01-23
EA201300709A1 (ru) 2014-03-31
DK2655633T3 (en) 2018-02-19
ZA201304431B (en) 2014-03-26
US20130269062A1 (en) 2013-10-10
JP6129746B2 (ja) 2017-05-17
EP2655633B1 (en) 2017-11-15
WO2012084715A1 (en) 2012-06-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Morel et al. Fertile hypomorphic ARGONAUTE (ago1) mutants impaired in post-transcriptional gene silencing and virus resistance
US20220186238A1 (en) Diplospory gene
WO2019038417A1 (en) METHODS FOR INCREASING GRAIN YIELD
Iwamoto et al. ACO1, a gene for aminocyclopropane‐1‐carboxylate oxidase: effects on internode elongation at the heading stage in rice
JP2013531502A (ja) グルコシノレート輸送タンパク質及びその使用
CN110603264A (zh) 用于增加籽粒产量的方法
AU2013221024B2 (en) Improving drought resistance in plants: UPL4
Hsu et al. Genetic analysis of floral symmetry transition in African violet suggests the involvement of trans-acting factor for CYCLOIDEA expression shifts
AU2013225084B2 (en) Modulation of seed vigor
US20230279418A1 (en) Plant haploid induction
EP3095863B1 (en) Parthenocarpy regulation gene and use thereof
EA029226B1 (ru) Дефект гена ckx3 и по крайней мере одного другого гена ckx в растении или растительной клетке, которые приводят к улучшенным признакам
BR112014022649B1 (pt) Métodos de produção de uma planta transgênica, métodos de identificação de um alelo fraco de fea3, métodos de produção de uma planta e método de identificação de uma primeira planta de milho
EA029522B1 (ru) Введение дефекта в ген ahp6 для увеличения выхода семян растения
JP6012016B2 (ja) 単為結果制御遺伝子およびその利用
CN104450739B (zh) 一种水稻源抗虫相关基因OsHR1及其编码产物与应用
Kim et al. Effect of structural variation in the promoter region of RsMYB1. 1 on the skin color of radish taproot
WO2023052561A1 (en) Plants with improved properties
CN118085047A (zh) 与玉米籽粒大小调控和热胁迫应答相关的表观遗传调控因子ZmULT1及其应用
WO2023052562A1 (en) Wheat plants with an increased yield
CN109439672A (zh) 调控水稻穗发育的基因esp的应用
EA028355B1 (ru) Трансгенные растения сахарной свеклы

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY KZ RU