EA028677B1

EA028677B1 - Способ лечения, предотвращения и/или улучшения нейронального повреждения, связанного с ишемией головного мозга

Info

Publication number: EA028677B1
Application number: EA201200355A
Authority: EA
Inventors: Гай М. Миллер; Виктория Кейфетс
Original assignee: Биоэлектрон Текнолоджи Корпорейшн
Priority date: 2009-08-26
Filing date: 2010-08-24
Publication date: 2017-12-29
Also published as: US20170007553A1; WO2011025785A1; AU2010286704B2; JP2015091899A; ES2663709T3; JP2013503168A; EA201200355A1; US20180344667A1; EP2470168B1; MX337990B; NO2470168T3; CN102647981B; PT2470168T; CA2772294A1; CN102647981A; EP2470168A1; HUE037592T2; US20110207828A1; AU2010286704A1; DK2470168T3

Abstract

Изобретение касается способа лечения, улучшения или предотвращения нейронального повреждения, связанного с ишемией головного мозга, включающего введение субъекту композиций, содержащих эффективное количество одного или более цитопротекторных агентов, выбранных из группы, состоящей из альфа-токотриенолхинона, бета-токотриенолхинона, гамма-токотриенолхинона и дельта-токотриенолхинона или любого их стереоизомера или смеси стереоизомеров; при условии, что данный субъект не страдает от митохондриальной болезни.

Description

В целом это изобретение имеет отношение к способам, включающим введение редокс-активных терапевтических средств, в частности токотриеноловых хинонов, для предотвращения или лечения ишемии головного мозга у субъекта, испытывающего ишемию головного мозга, испытывающего симптомы, связанные с или обусловленные состоянием ишемии головного мозга, или имеющего риск развития состояния ишемии головного мозга. Изобретение также имеет отношение к способам, включающим введение токотриеноловых хинонов, для защиты ткани мозга от ишемии головного мозга после травмы головы или мозга у субъектов, нуждающихся в таком лечении. Изобретение также имеет отношение к предотвращению или лечению ишемии головного мозга с помощью эффективного количества редоксактивного терапевтического средства, такого как токотриеноловый хинон, чтобы свести к минимуму у субъекта величину и тяжесть инфаркта мозга. Это изобретение имеет отношение к лечению и предотвращению инсульта (нарушению мозгового кровообращения); изобретение не имеет отношения к лечению, уменьшению интенсивности или предотвращению митохондриальной болезни, такой как митохондриальная миопатия, энцефалопатия, лактоцидоз и инсульт (МЕЬА8), когда инсульт является одним из симптомов митохондриальной болезни.

Предшествующий уровень техники

Ишемию можно определить как прекращение тока крови в ткань. Ишемия головного мозга, известная также как инсульт, представляет собой нарушение или уменьшение потока крови в артериях, питающих мозг. Прекращение тока крови в отдельном участке сосуда известно как фокальная (очаговая) ишемия; прекращение тока крови во всем мозге известно как глобальная ишемия. Когда мозговая ткань лишается крови и, таким образом, кислорода и глюкозы, она может подвергнуться ишемическому некрозу или инфаркту. Метаболические события, лежащие в основе деградации и смерти клеток, включают энергетический дефицит вследствие истощения АТФ; клеточный ацидоз; высвобождение глутамата; поступление (вход) кальция; стимулирование деградации фосфолипидов мембраны и последующее накопление свободных жирных кислот; образование свободных радикалов.

Несмотря на то что токоферолы и токотриенолы в общем сходны по химической структуре, они могут различаться по биологическому действию. В целом альфа-токоферол считается наиболее биологически активной формой витамина Е; также он является наиболее распространенным в сыворотке взрослого человека (№и/П е! а1., (1998) Сагб. Игидз. ТЬег. 12:421-423; 8!гоЬ5сЬеш е! а1., (1998) Апа1. СЬет. 70:13-18; Ооп/а1е/ (1990) Меб. НуроТЬез. 32:107-110). Альфа-токоферол обладает большей антиоксидантной активностью, чем другие токоферолы (Еики/ала е! а1., (1982) Μρίάδ 17:511-13). Альфа-токоферол, но не бета-токоферол, ингибирует функцию протеинкиназы С (КлсаагеШ е! а1., (1998) ВюсЬет. 1. 334:243-249). Однако и альфа-токоферол, и бета-токоферол ингибируют активность свиной панкреатической фосфолипазы А2 (Огаи е! а1., (1998) СЬет. РЬуз. Μρίάδ 91:109-118). Альфа-, бета-, гамма- и дельта-токоферол способны ингибировать образование супероксида нейтрофилами (Каппо е! а1., (1996) Ргее Кабю. Кез. 24:181-189). Дельта-токоферол обладает активностью, составляющей только одну сотую часть активности природного альфа-токоферола в тесте бесплодия Эванса в отношении витамина Е.

КЬаппа е! а1. описывают нейропротекторные свойства природного витамина Е альфа-токотриенола (8!гоке (2005); 36, е144-е152). Повреждение ткани мозга, связанное с инсультом, было изучено на мышах, дефицитных по 12-Ьох, и спонтанно гипертензивных крысах, которым перорально добавляли альфа-токотриенол. В нервных клетках альфа-токотриенол в концентрациях нМ/л, но не альфа-токоферол, препятствовал гибели, вызванной глутаматом, путем подавления ранней активации с-8гс киназы и 12липоксигеназы.

Международная заявка \УО 00/078296 раскрывает способ лечения или профилактики глутаматных и/или индуцированных нейродегенеративных нарушений и нейронального повреждения, которые инициируются ишемией, реперфузией, травмой или тяжелым кровотечением.

Международная заявка \УО 99/025336 раскрывает предотвращение рестеноза с помощью ангиопластической методики, включающей покрытие наружной поверхности ангиопластического баллона композицией, содержащей токотриенол, и такое выполнение артериальной ангиопластической процедуры, при котором профилактически эффективное количество композиции переносится на внутреннюю поверхность артерии.

При лечении ишемии головного мозга для улучшения мозгового кровотока и/или неврологического результата используются поглотители свободных радикалов/антиоксиданты. В общем эффекты этих соединений на объем инфаркта были противоречивы, см. патент США № 5872108. Например, было обнаружено, что ингибиторы супероксиддисмутазы уменьшают объем инфаркта только при интрацеребровентрикулярном введении (КтоисЫ е! а1., (1991) Ргос. №!1. Асаб. 8ск И8А 88:11158-11162). Показано, что другие соединения, такие как любелюзол, имеют клиническое преимущество в отношении ишемии головного мозга, но при очень незначительном перевесе по безопасности (Э1епег е! а1., (1996) 8!гоке 27:76-81).

Ишемия головного мозга является одной из основных причин неврологических заболеваний и смертности у людей в случае неблагоприятного прогноза, связанного с восстановлением после инсульта. Таким образом, сохраняется потребность установления эффективных композиций и способов, способст- 1 028677 вующих выживанию и восстановлению клеток после повреждения, связанного с ишемией головного мозга, или предназначенных для субъектов-млекопитающих с риском повреждения, связанного с ишемией головного мозга.

Раскрытие всех патентов и публикаций, цитированных в описании, полностью включается в описание путем отсылки.

Сущность изобретения

Таким образом, одним из аспектов настоящего изобретения является способ лечения, предотвращения и/или улучшения нейронального повреждения, связанного с ишемией головного мозга у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, включающий введение субъекту эффективного количества композиции, содержащей один или более цитопротекторных агентов, выбранных из группы, состоящей из альфа-токотриенолхинона, бета-токотриенолхинона, гамма-токотриенолхинона и дельтатокотриенолхинона или любой их стереоизомер или смесь стереоизомеров; при условии, что данный субъект не страдает от митохондриальной болезни.

В этом способе один или более цитопротекторных агентов могут представлять собой альфатокотриенолхинон или любой его стереоизомер или смесь его стереоизомеров.

Указанный выше случай ишемии головного мозга может являться осложнением (происходит на фоне) закупорки мозговой сосудистой сети, закупорка - следствием тромбоэмболии, ишемия головного мозга - следствием спазма коронарной сосудистой сети, случай ишемии головного мозга может являться осложнением (происходит на фоне) прекращения сердечной функции, случай ишемии головного мозга может являться осложнением процедуры искусственного кровообращения. Кроме того, случай ишемии головного мозга может являться осложнением геморрагического события в мозговой сосудистой сети.

В указанном способе используемая композиция может содержать по меньшей мере около 65% альфа-токотриенолхинона, причем указанная композиция предпочтительно содержит по меньшей мере около 75% альфа-токотриенолхинона, более предпочтительно указанная композиция содержит по меньшей мере около 85% альфа-токотриенолхинона, наиболее предпочтительно указанная композиция содержит по меньшей мере около 90% альфа-токотриенолхинона или по меньшей мере около 95% альфатокотриенолхинона.

Указанная композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Композиция в способе по изобретению вводится перорально или парентерально.

Композиция согласно этому способу 17 содержит альфа-токотриенолхинон в пределах примерно от 1 до 1000 мг на 1 кг веса тела указанного субъекта-млекопитающего, предпочтительно в пределах примерно от 1 до 50 мг на 1 кг веса тела указанного субъекта-млекопитающего.

Нейрональное повреждение выбирают из группы, состоящей из гибели нервных клеток, общего объема мозгового инфаркта, мозгового ишемического повреждения, отека мозговой ткани и когнитивной дисфункции.

Вторым аспектом изобретения является способ лечения и/или улучшения случая ишемии головного мозга у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, включающий введение субъекту эффективного количества одного или более цитопротекторных агентов, выбранных из группы, состоящей из альфатокотриенолхинона, бета-токотриенолхинона, гамма-токотриенолхинона и дельта-токотриенолхинона, или любого их стереоизомера, или смеси стереоизомеров; при условии, что данный субъект не страдает от митохондриальной болезни, когда инсульт является одним из симптомов митохондриальной болезни.

В способе согласно второму аспекту изобретения один или более цитопротекторных агентов представляют собой альфа-токотриенолхинон, любой его стереоизомер или смесь его стереоизомеров.

Третьим аспектом изобретения является способ лечения и/или улучшения случая ишемии головного мозга у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, включающий введение субъекту эффективного количества композиции, содержащей один или более цитопротекторных агентов, выбранных из группы, состоящей из альфа-токотриенолхинона, бета-токотриенолхинона, гамма-токотриенолхинона и дельта-токотриенолхинона или любых их стереоизомеров или смеси их стереоизомеров;

при условии, что данному субъекту не вводилось соединение формулы I

где К¹, К² и К³ независимо друг от друга представляют собой водород, (С₁-С₆)алкил или (С₁-С₆)алкокси;

т является целым числом от 1 до 12 включительно;

в пределах месяца до случая ишемии головного мозга и где данный субъект не страдает от митохондриальной болезни.

В способе согласно третьему аспекту изобретения один или более цитопротекторных агентов представляют собой альфа-токотриенолхинон, или любой его стереоизомер, или смесь его стереоизомеров.

- 2 028677

В способе согласно первому, второму и третьему аспектам изобретения альфа-токотриенолхинон, или любой его стереоизомер, или смесь его стереоизомеров является единственным активным ингредиентом.

Способы согласно первому, второму и третьему аспектам заключаются во введении указанной композиции субъекту.

Соединение формулы I является токотриенолхиноном, или отдельным стереоизомером, или смесью его стереоизомеров следующей структуры:

Альфа-токотриенол хинон	К/= СНз	К²= СНз	ье= СНз
Бета -токотриенол хинон	К‘= СНз	к²=н	Н³= СНз
Г амма-токотриенол хинон	К?=Н	К²= СНз	СНз
Дельта-токотриенол хинон	Ρ=Η	к²=н	К³= СНз

В некоторых вариантах осуществления композиция представляет собой фармацевтическую композицию. В других вариантах осуществления композиция является лечебным питанием. В некоторых вариантах осуществления введение композиции происходит энтеральным путем. В других вариантах осуществления введение композиции происходит пероральным путем. В других дополнительных вариантах осуществления введение происходит парентеральным путем.

Краткое описание чертежа

Фиг. 1 показывает объемное сравнение (с) общего инфаркта под воздействием введения альфатокотриенолхинона по сравнению с растворителем при реперфузии, как описано в примере 2. Также представлены изображения срезов мозга крыс, которых лечили разбавителем (а) или альфатокотриенолхиноном (Ь) при реперфузии; рамки показывают область инфаркта.

Подробное описание изобретения

В целом настоящее изобретение имеет отношение к токотриенолхинонам, которые можно использовать в фармацевтических композициях, обладающих защитными свойствами при ишемии головного мозга (инсульте). Настоящее изобретение предоставляет композиции и способы для предотвращения или лечения ишемии головного мозга, например, путем уменьшения гибели нервных клеток, уменьшения отека ткани и/или уменьшения когнитивной дисфункции, связанной с мозговым ишемическим нарушением. Настоящее изобретение предоставляет композиции и способы для уменьшения симптомов и/или состояний, связанных с ишемией головного мозга, таких как, например, размер инфаркта, отек ткани или когнитивное расстройство, связанное с наличием микроэмболии, или гипоксическое состояние. Настоящее изобретение не имеет отношения к лечению инсульта у субъекта, страдающего от митохондриальной болезни. В частности, настоящее изобретение не имеет отношения к лечению инсульта у субъекта, страдающего от митохондриальной болезни, когда инсульт является одним из симптомов митохондриальной болезни.

Настоящее изобретение предоставляет композиции с токотриенолхиноном, содержащие по меньшей мере около 50% альфа-токотриенолхинона, по меньшей мере около 55% альфа-токотриенолхинона, по меньшей мере около 60% альфа-токотриенолхинона, по меньшей мере около 65% альфатокотриенолхинона, по меньшей мере около 70% альфа-токотриенолхинона, по меньшей мере около 75% альфа-токотриенолхинона, по меньшей мере около 80% альфа-токотриенолхинона, по меньшей мере около 85% альфа-токотриенолхинона, по меньшей мере около 90% альфа-токотриенолхинона, по меньшей мере около 95% альфа-токотриенолхинона или по меньшей мере около 98% альфатокотриенолхинона. При использовании в описании активный ингредиент является ингредиентом, способным лечить или предотвращать ишемию головного мозга у субъекта-млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления композиции с токотриенолхиноном содержат альфа-токотриенолхинон в качестве единственного активного ингредиента. В предпочтительных вариантах осуществления активный ингредиент является способным уменьшать нейрональное повреждение, связанное с ишемией головного мозга, по меньшей мере примерно на 20%, по меньшей мере примерно на 30%, по меньшей мере примерно на 40%, по меньшей мере примерно на 50%, по меньшей мере примерно на 60%, по меньшей мере примерно на 70%, по меньшей мере примерно на 80%, по меньшей мере примерно на 85% и даже более предпочтительно по меньшей мере примерно на 90%, в таких экспериментальных моделях, как описанные здесь. В некоторых вариантах осуществления уменьшение нейронального повреждения измеряется путем сравнения объема леченой экспериментальной модельной системы с нелеченой (контрольной) экспериментальной модельной системой.

В дополнительных предпочтительных вариантах осуществления композиции с токотриенолхиноном содержат альфа-токотриенолхинон в количестве, эффективном для снижения смерти нервных кле- 3 028677 ток, уменьшения размера инфаркта, уменьшения отека ткани, связанного с состоянием ишемии головного мозга, и/или уменьшения когнитивной дисфункции, и могут дополнительно содержать токоферол хинон. В других предпочтительных вариантах осуществления композиции с токотриенолхиноном настоящего изобретения содержат дополнительные активные ингредиенты. В некоторых вариантах осуществления композиции, содержащие токотриенолхинон и дополнительный ингредиент(ы) обеспечивают синергическое действие. Считается, что токотриенолхинон и дополнительный ингредиент являются синергичными (оказывающими взаимно усиливающее действие), когда их совместный эффект больше, чем совокупный эффект их индивидуальных воздействий. В других вариантах осуществления композиции содержат альфа-токотриенолхинон и дополнительный ингредиент, обеспечивающий синергическое действие.

Испытуемые соединения можно оценить и признать фармакологически эффективными с помощью исследований ίη νίίτο на целом ряде различных клеточных линий, известных в данной области, а также ίη νίνο с помощью соответствующих методов исследования на животных или на целых органах, таких как модель работы сердца на изолированном сердце, модель воспаления ан роисй (воздушный мешок) на крысах, крысиная модель инсульта с окклюзией средней церебральной артерии (МСАО) и других, известных специалистам в данной области техники.

Контроль эффекта лечения можно осуществлять с помощью магнитно-резонансного исследования (МЫ). Иллюстративные методы МЫ включают визуализацию отдельных клеток, метод переноса намагниченности (МТ1), усиленный гадолинием ЯМР (МЫ), спектроскопию протонного магнитного резонанса (МЫЗ) и диффузно-взвешенное изображение (показывающее мертвую ткань мозга), перфузионно-взвешенное изображение (показывающее испытывающую недостаток кислорода, но живую ткань мозга) и функциональную магнитно-резонансную томографию (ГМК.1). Например, ишемическую полутень (пенумбру) можно распознать, отметив различия в ненормальной области между перфузионновзвешенным изображением и диффузно-взвешенным изображением, как описано в Эиопд, Т.ф. апб ИкЬег, М., (2004) Сигг. Л1йсго5с1. Ыер. 6:267-273. Это различие в определенных областях известно, как перфузионно-диффузионное несоответствие. Считается, что область перфузионно-диффузионного несоответствия приблизительно равняется ишемической полутени. Как известно в данной области техники, вазоконстрикцию (сужение сосудов) и вазоспазм обычно определяют с помощью цифровой субтракционной ангиографии.

Кроме того, местный окислительный стресс и метаболизм глюкозы в местах поражения головного мозга можно оценить путем визуализации с помощью позитронно-эмиссионной томографии (РЕТ). Новая функциональная двойная визуализация состояния окисления-восстановления и энергетического состояния на разных стадиях повреждений, связанных с инсультом, с использованием позитронноэмиссионной томографии (РЕТ) с [⁶²Си]-диацетил-бис-(И4-метилтиосемикарбазоном (⁶²Си-АТЗМ) и [¹⁸Р]-фтордезоксиглюкозой (^1δΡΌΟ), как описано в 1ка\\а М. еί а1., (2009) Мйосйопбтюп 9, 144-148, может проводиться ίη νί\Ό. Для оценки окислительного стресса и мозгового тока крови может применяться ⁶²Си-АТЗМ-РЕТ, тогда как для установления метаболизма глюкозы в местах повреждения при инсульте применяется ¹⁸РЭС-РЕТ.

В иллюстративных вариантах осуществления, раскрытых в описании, показано, что композиции с альфа-токотриенолхиноном уменьшают общий инфаркт во время МСАО и во время реперфузии при введении через зонд.

Определения.

Термин алкил относится к насыщенным алифатическим группам, включая группы с прямой цепью, группы с разветвленной цепью, циклические группы и их комбинации, имеющие точно определенное количество атомов углерода, или, если число точно не определено, имеющие до 12 атомов углерода. Одно подмножество алкильных групп представляет собой (С₁-С₆)алкильные группы, которое включает, но не ограничивается этим, такие группы, как метил, этил, н-пропил, изопропил, бутил, н-бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, пентил, н-пентил, гексил, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил и любую другую алкильную группу, содержащую от одного до шести атомов углерода, причем дополнительные (С₁-С₆)алкильные группы могут присоединяться через любую валентность на алкильной группе, при условии, что общее число углеродов составляет шесть или меньше чем шесть. Другое подмножество алкильных групп представляет собой (С₁-С₄)алкильные группы, которое включает, но не ограничивается этим, такие группы, как метил, этил, н-пропил, изопропил, бутил, н-бутил, изобутил, вторбутил, трет-бутил, циклопропил и циклобутил.

Термин алкокси относится к группе -О-алкил, в которой алкил представляет собой, как указано в описании. Одно подмножество алкоксигрупп представляет собой (С1-С6)алкоксигруппы, включающие, но, не ограничиваясь этим, такие группы, как метокси, этокси, н-пропокси, изопропокси, циклопропокси, н-бутокси, трет-бутокси, втор-бутокси, циклобутокси, н-пентокси, циклопентокси, н-гексокси, циклогексокси и 1,2-диметилбутоксигруппы. Другое подмножество алкоксигрупп представляет собой (С₁-С₄)алкоксигруппы, включающие, но не ограничиваясь этим, такие группы, как метокси, этокси, нпропокси, изопропокси, циклопропокси, н-бутокси, трет-бутокси, втор-бутокси и циклобутоксигруппы.

Ишемия головного мозга или мозговая ишемия или состояние ишемии головного мозга отно- 4 028677 сится к патологическому медицинскому случаю или случаю, связанному с хирургическим вмешательством, при котором пациент был введен в состояние, при котором кровообращение в некоторой области мозга затрудняется или блокируется, либо временно, как при спазме сосуда или транзиторной (преходящей) ишемической атаке (ΤΙΑ), или постоянно (при отсутствии медицинского вмешательства), как при тромботической или эмболической закупорке. В результате ишемического события затронутая область лишается кислорода и питательных веществ. Потеря снабжения приводит к повреждению затронутой области, инфаркту. Ишемия происходит в мозге во время, например, тромбоэмболического инсульта, геморрагического инсульта, спазма мозговых сосудов, травмы головы, остановки сердечной деятельности, тяжелой потери крови из-за повреждения или внутреннего кровотечения и других подобных состояний, прерывающих нормальный кровоток. Ишемия также может происходить в результате травмы головы, так как давление, вызванное отеком, давит в противоположную сторону и сплющивает артерии и вены внутри мозга, уменьшая, таким образом, их способность нести кровь через мозг. Кроме того, ишемия головного мозга может происходить в результате макро- и микроэмболии, например может происходить в результате операции в условиях искусственного кровообращения.

Инфаркт относится к области ткани или органа, подвергнутой ишемии или страдающей от физиологических последствий ишемии. Инфаркт является следствием внезапной недостаточности доставки артериальной или венозной крови, например, из-за эмболии, тромба, перекручивания сосуда или давления, вызывающего появление макроскопической области некроза. Кроме того, инфаркт также затрагивает область, поврежденную в результате воздействия кровоизлияния.

Под увеличением мозгового кровотока подразумевается улучшение клинического исхода посредством статистически или физиологически значимого увеличения мозгового кровотока у леченого субъекта по сравнению с нелеченым субъектом, что можно определить с помощью хорошо известных в данной области техники способов, таких как, например, визуализация сосудов.

Под уменьшением размера инфаркта подразумевается улучшение клинического исхода посредством статистически или физиологически значимого уменьшения размера инфаркта у леченого субъекта по сравнению с нелеченым субъектом, что можно определить с помощью хорошо известных в данной области техники способов, таких как, например, визуализация сосудов.

Средства определяются в описании как соединения, смеси или композиции соединений, способные предотвратить или лечить ишемию головного мозга, например, уменьшая нейрональное повреждение или его симптомы, связанные с состоянием ишемии головного мозга, и/или повреждение клеток, обусловленное ишемией головного мозга. Улучшение означает предотвращение, уменьшение, облегчение или действие против отрицательных аспектов ишемических условий или ишемического состояния. Улучшение не требует полного восстановления или полного предотвращения состояния ишемии головного мозга. Соединение или средство может проявлять защитную активность до, одновременно с и/или после возникновения ишемии головного мозга.

Фармацевтическая композиция представляет собой композицию, содержащую средство, пригодное для введения пациенту или субъекту. Фармацевтическая композиция также может содержать дополнительные компоненты, такие как фармацевтически приемлемые эксципиенты (вспомогательные вещества), фармацевтически приемлемые носители и фармацевтически приемлемые разбавители. Прописанная (назначенная) фармацевтическая композиция - это композиция, для применения которой необходим рецепт врача. Фармацевтическая композиция может содержать соединение формулы Ι, такое как токотриенолхинон, например альфа-токотриенолхинон, для введения в пределах примерно от 1 до 1000 мг на 1 кг веса тела указанного субъекта-млекопитающего. Питательная композиция - это композиция, содержащая природные компоненты, предпочтительно встречающиеся в продуктах питания, таких как добавки, продукты функционального питания или пищевые ингредиенты, смешанные вместе со средством, таким как соединение формулы Ι, таким как токотриенолхинон, например альфа-токотриенолхинон.

При использовании в описании средство называется цитопротекторным или обладающим цитопротекторным свойством или цитопротекторной активностью, если введение средства уменьшает и/или улучшает симптомы состояния ишемии головного мозга и/или симптомы повреждения, испытываемые клетками, тканями, органами и/или организмами, которые порождаются на фоне ишемии головного мозга. Цитопротекторную активность и повреждение можно количественно определить с помощью методов, оценивающих результаты повреждения, такие как смерть и ингибирование метаболической активности; это можно оценить, например, с помощью подходящих флуоресцентных красителей, путем измерения активности ферментов и/или измерения показателей неповрежденной (интактной) клеточной мембраны в пораженных тканях с помощью окрашивания соответствующими индикаторами. Цитопротекторные средства включают цитопротекторные токотриенолхиноны, их метаболиты и их производные.

Синергист определяется как средство или соединение, в присутствии которого наблюдается увеличение большее, чем просто совокупное (аддитивное) увеличение, приращение или усиление эффекта средства или соединения. В некоторых случаях трудно определить, какое соединение в смеси имеет первостепенное значение, а какое только второстепенное. Таким образом, в синергической смеси соединений любое из активных соединений в смеси может считаться синергистом. Композиция, заключающая в себе синергическую активность, или синергическая смесь является комбинацией соединений, при

- 5 028677 действии которой совместный эффект больше, чем аддитивный эффект отдельных соединений. Синергизм может быть явным только в некоторых пределах или концентрациях.

Под эффективным количеством или количествами, эффективными для уменьшения нейронального повреждения, связанного с ишемическими состояниями головного мозга, и/или симптомов, обусловленных ишемией головного мозга, подразумевается, что цитопротекторное средство или средства (например, токотриенолхиноны) вводится пациенту в количестве, достаточном для уменьшения повреждения, связанного с состоянием ишемии головного мозга, и/или симптомов, обусловленных ишемией головного мозга, и/или в количестве, достаточном для обеспечения окончательной концентрации в пораженных тканях, достаточной для уменьшения вреда, связанного с состоянием ишемии головного мозга, и/или симптомов, обусловленных ишемией головного мозга. Это количество включает, но не ограничивается этим, концентрацию, которая действует в качестве полной профилактики или лечения в отношении симптома нейронального повреждения, или которая действует в качестве частичной профилактики или лечения симптома нейронального повреждения. Эффективное количество - это количество, достаточное для получения полезных или желательных результатов. Эффективное количество может быть введено за одно или более введений. Для целей этого изобретения эффективное количество цитопротекторной композиции - это количество, достаточное для того, чтобы улучшить, стабилизировать, обратить, замедлить или отсрочить прогрессирование повреждения у субъектов-млекопитающих, ί) имеющих риск развития состояния ишемии головного мозга, или ίί) связанного с симптомами состояния ишемии головного мозга. Предпочтительно улучшение повреждения, обусловленного состоянием ишемии головного мозга, можно количественно определить путем измерения, например, уменьшения клеточной смерти и/или отсутствия активности ферментов; и/или уменьшения отека ткани; и/или уменьшения когнитивного расстройства; и/или уменьшения размера инфаркта. В случае повреждения, связанного с состоянием ишемии головного мозга, размер и/или тяжесть инфаркта в мозге субъекта можно определить, например, с помощью различных неинвазивных радиологических методов и/или с помощью различных симптоматических и диагностических методов, известных специалистам в данной области, например магнитнорезонансной визуализации (МЫ), компьютерной томографии (СТ), позитронно-эмиссионной томографии (РЕТ), диффузно-взвешенного изображения (Ό^Ι) и тому подобного. Повреждения, связанные с состоянием ишемии головного мозга, также включают отек мозга, и нарушения, связанные с таким отеком. При использовании в отношении состояния ишемии головного мозга термин эффективная, описывающий размер дозы, частоту или продолжительность, или представление о эффективности дозы, имеет отношение к дозировке, приводящей к уменьшению размера и тяжести текущего мозгового инфаркта, или к вероятности того, что размер и тяжесть любого такого инфаркта мозга будут уменьшены, когда он произойдет. Улучшение составляет предпочтительно по меньшей мере около 20%, предпочтительно по меньшей мере около 30%, предпочтительно по меньшей мере около 50%, более предпочтительно по меньшей мере около 70%, даже более предпочтительно по меньшей мере около 80% и даже более предпочтительно по меньшей мере около 90% уменьшения нейронального повреждения.

Гипоксия широко определяется как состояние, при котором отдельная клетка, орган или ткань получает недостаточное количество кислорода для осуществления нормальной деятельности. Конкретнее, гипоксия определяется как средняя величина или среднее значение уровня насыщения кислородом окружающей среды менее чем 90% или менее чем около 90%. Гипоксия является прямым результатом ишемии, так как всякий раз, когда прекращается кровоснабжение, прекращается доставка кислорода. Однако гипоксия может возникать в других состояниях, даже если поток крови остается неизменным, включая, но не ограничиваясь этим, отравление оксидом углерода, утопление, удушение и другие формы асфиксии.

Термин энергетически-компетентные относится к клеткам, линиям клеток или организмам с аэробным дыханием (окислительным метаболизмом). Термин энергетически-некомпетентные относится к клеткам, неспособным к аэробному дыханию; такие клетки обладают только анаэробным дыханием (ферментацией).

Под лечением подразумевается любое лечение болезни или нарушения у млекопитающего, подавляющее болезнь, то есть улучшение, торможение или подавление развития клинических симптомов; и/или ослабление болезни, то есть ослабление (регрессию) клинических симптомов.

Под предотвращением или профилактикой имеется в виду схема лечения (режим), которая предотвращает болезнь или защищает от болезни или нарушения, то есть становится причиной того, что клинические симптомы болезни не развиваются. Предотвращение может быть частичным или полным.

Под композицией с токотриенолхиноном имеются в виду композиции, содержащие альфатокотриенолхинон, бета-токотриенолхинон, гамма-токотриенолхинон, дельта-токотриенолхинон и/или их смеси. Термин токотриенолхинон также включает его отдельные стереоизомеры и смеси стереоизомеров, соли, кристаллические формы, некристаллические формы, гидраты или сольваты.

- 6 028677

Основные способы.

В некоторых вариантах осуществления композиции настоящего изобретения содержат токотриенолхиноны, которые могут быть получены синтетическим путем из соответствующих токотриенолов с помощью окисления подходящими окислителями, такими как цериевый нитрат аммония (ΟΆΝ). В частности, композиции настоящего изобретения содержат альфа-токотриенолхинон (СА§ Кед. Νο. 1401-667), полученный окислением практически чистого альфа-токотриенола. Предпочтительный способ получения практически чистого альфа-токотриенола или альфа-токотриенолхинона описан в находящейся в совместной собственности опубликованной патентной заявке США № 2010/0105930, озаглавленной Ртосе88 ίοτ 1йе Ртойисйои οί Альфа Токотриенол аий Оепуабуез.

Предоставленные в описании иллюстративные примеры имеют отношение к композициям, содержащим альфа-токотриенолхинон как активный ингредиент, для применения в качестве цитопротекторного средства от нарушения, повреждения и/или симптомов, связанных с ишемией головного мозга.

Композиции с альфа-токотриенолхиноном содержат альфа-токотриенолхинон в количествах, эффективных для улучшения повреждения и/или симптомов, связанных с ишемией головного мозга. Композиции с альфа-токотриенолхиноном могут быть обогащены композициями, содержащими по меньшей мере около 50% альфа-токотриенолхинона, по меньшей мере около 55% альфа-токотриенолхинона, по меньшей мере около 60% альфа-токотриенолхинона, по меньшей мере около 65% альфатокотриенолхинона, по меньшей мере около 70% альфа-токотриенолхинона, по меньшей мере около 75% альфа-токотриенолхинона, по меньшей мере около 80% альфа-токотриенолхинона, по меньшей мере около 85% альфа-токотриенолхинона, по меньшей мере около 90% альфа-токотриенолхинона и по меньшей мере около 95% альфа-токотриенолхинона.

В раскрытых в описании иллюстративных примерах композиции с альфа-токотриенолхиноном способны уменьшать общий размер инфаркта на 40% при введении через зонд в дозе 500 мг/кг во время МСАО и при введении при реперфузии (см. пример 2 и фиг. 1 соответственно).

В настоящем изобретении питательная композиция будет содержать соединение формулы I, такое как токотриенолхинон, например альфа-токотриенолхинон, для введения в пределах примерно от 1 до 50 мг на 1 кг веса тела указанного млекопитающего. В дополнительных вариантах осуществления питательная композиция будет содержать соединение формулы I, такое как токотриенолхинон, например альфа-токотриенолхинон, для введения в более низком пределе, по меньшей мере около 1, около 1,5, около 2, около 2,5, около 5, около 7,5, около 10, около 12,5, около 15, около 17,5, около 20, около 22,25, около 25, около 30, около 35, около 40, около 45 или около 50 мг на 1 кг веса тела указанного млекопитающего. Фармацевтическая композиция будет содержать соединение формулы I, такое как токотриенолхинон, например альфа-токотриенолхинон, для введения в пределах примерно от 1 до 1000 мг на 1 кг веса тела указанного млекопитающего. В дополнительных вариантах осуществления фармацевтическая композиция будет содержать соединение формулы I, такое как токотриенолхинон, например альфатокотриенолхинон для введения в более низком пределе, по меньшей мере около 1, около 10, около 20, около 30, около 40, около 50, около 60, около 70, около 80, около 90, около 100, около 200, около 300, около 400, или около 500 мг на 1 кг веса тела указанного субъекта-млекопитающего. В дополнительных вариантах осуществления фармацевтическая композиция будет содержать соединение формулы I, такое как токотриенолхинон, например альфа-токотриенолхинон, для введения в пределах примерно от 5 до 500 мг на 1 кг веса тела указанного млекопитающего.

Способы применения соединений изобретения

Композиции настоящего изобретения вводятся субъекту в количествах, необходимых для уменьшения нейронального повреждения. Субъект может претерпевать состояние ишемии головного мозга, может испытывать симптомы, связанные с или обусловленные состоянием ишемии головного мозга, или может иметь риск развития состояния ишемии головного мозга. Субъекта не подвергают лечению с целью предотвращения ишемического состояния, являющегося результатом митохондриальной болезни, такой как МЕЬА§.

В одном аспекте способы настоящего изобретения имеют отношение к предотвращению нейронального повреждения у млекопитающего с риском развития повреждения, обусловленного состоянием ишемии головного мозга, например при инфаркте мозга. Способы уменьшения нейронального повреждения имеют отношение к доведению до минимума степени и/или тяжести повреждения в мозге, связанного с или обусловленного состоянием ишемии головного мозга, путем улучшения или уменьшения повреждения, которое в ином случае может произойти. Способы включают введение субъекту композиции с альфа-токотриенолхиноном. Вводимое количество и продолжительность лечения являются эффективными для того, чтобы довести до минимума размер и/или тяжесть нейронального повреждения у млекопитающего, что можно определить, например, по уменьшению смерти нервных клеток и/или уменьшению отека ткани, связанного с состоянием ишемии головного мозга, и/или уменьшению когнитивного расстройства, и/или уменьшению размера инфаркта. Таким образом, предполагается, что в результате такого лечения сводится к минимуму размер и/или тяжесть развивающегося нейронального повреждения.

Настоящее изобретение предоставляет профилактическое лечение нейронального повреждения,

- 7 028677 включая смерть клеток и/или наличие отека ткани и/или когнитивную дисфункцию и/или инфаркт мозга, которые могут обуславливаться случаями ишемии, гипоксии/аноксии или геморрагии. Композиции настоящего изобретения вводятся субъекту, имеющему риск нейронального повреждения, связанного или обусловленного состоянием ишемии головного мозга, и предотвращают или облегчают тяжесть повреждения, в случае, если оно происходит. Способ предназначается для субъекта, имеющего риск нейронального повреждения, который связан с или является результатом острого или хронического заболевания. Такие состояния могут возникать в результате планового терапевтического или хирургического лечения субъекта (например, ангиопластики) или в результате неожиданно возникшего состояния здоровья, например инсульта или тяжелой потери крови. Другие состояния, при которых субъект подвергается риску нейронального повреждения, связанного с состоянием ишемии головного мозга, включают генетическую предрасположенность к инсульту или состояние, влекущее за собой увеличение вероятности появления инфаркта мозга, такое как атеросклероз, предыдущий инсульт или преходящие ишемические атаки, сахарный диабет, повышенное кровяное давление, гиперхолестеринемия, курение в анамнезе, а также могут включать шизофрению, эпилепсию и нейродегенеративные расстройства. С помощью диагностической и/или патологической характеристик пострадавших от инсульта установлены многочисленные дополнительные медицинские состояния, вызывающие инсульт, которые широко известны практикам в области медицины внутренних и неврологических болезней.

Дополнительные заболевания, которые наделяют субъекта риском нейронального повреждения, связанного с или обусловленного состоянием ишемии головного мозга, включают, но не ограничиваются этим, васкулит (включая коллагеноз сосудов, темпоральный (гигантоклеточный) артериит, нодозный полиартериит, гранулематоз Вегенера, синдром Такаясу и васкулит, связанный с сифилисом); менингит (включая, но не ограничиваясь этим, менингит, вызванный туберкулезом, грибами, сифилисом, бактериями или герпесом, включая герпес зостер); артериальное расслоение (например, сонной артерии, спинных или внутричерепных артерий в основании мозга); нарушения со стороны кроветворной системы (включая, но, не ограничиваясь этим, полицитемию, тромбоцитоз, тромбоз, тромбоцитопеническую пурпуру, диссеминированное внутрисосудистое свертывание, диспротеинемию и гемоглобинопатию (такую как серповидно-клеточная анемия)); повреждение сосудов, вызванное кокаином или амфетаминами; болезнь мойя-мойя; фиброзномышечную дисплазию; болезнь Бинсвангера; эмболию (включая сердечного происхождения, например дисритмию, коронарную болезнь сердца, ревматическую болезнь сердца, и т.д.); аорто-коронарное шунтирование (СЛВС) и атеротромботические артериальные причины (включая, но не ограничиваясь этим, бифуркацию общей сонной артерии, каротидный сифон, дистальная позвоночная артерия и дуга аорты).

Другие медицинские состояния, которые наделяют субъекта риском нейронального повреждения, связанного с или обусловленного состоянием ишемии головного мозга, включают, но не ограничиваются этим, заболевания, связанные с состоянием гиперкоагуляции, вторичным относительно системного заболевания; карциному (в частности, поджелудочной железы); эклампсию; оральные контрацептивы; волчанку; тромботические болезни, такие как дефицит фактора С или δ и мутация фактора V, такую как Лейденовская мутация V фактора; сужение кровеносных сосудов (вазоконстрикцию), включая спазм сосудов (например, спазм мозговых сосудов после субарахноидального кровоизлияния) и обратимое сужение мозговых сосудов (например, неизвестного происхождения, мигрень, эклампсия, травма); и состояние вен (включая, обезвоживание, внутричерепную инфекцию, послеродовое и послеоперационное состояния и системную злокачественную опухоль).

Медицинские состояния, которые наделяют субъекта риском нейронального повреждения, связанного с или обусловленного состоянием ишемии головного мозга, в результате внутричерепного кровоизлияния включают, но не ограничиваются этим, спонтанное внутримозговое кровоизлияние (например, при гипертензии или амилоидной ангиопатии); разорвавшуюся аневризму (например, мешковидную, микотическую); разорвавшуюся артериовенозную мальформацию (врожденный порок); использование препаратов (например, кокаина, амфетаминов); травму; кровотечение, связанное с опухолями мозга; системное нарушение свертываемости (включая, антикоагуляционное лечение) и геморрагический инфаркт.

Настоящее изобретение предоставляет лечение для людей и млекопитающих, не являющихся человеком. Млекопитающее, не являющееся человеком, называется субъектом, если животное подвергалось воздействиям, вызывающим состояние ишемии головного мозга и приводящим, например, к инфаркту мозга, или подвергалось хирургическим или инвазивным операциям, сравнимым с установленными в предыдущем параграфе для субъектов-людей.

В настоящем изобретении композиция с токотриенолхиноном вводится субъекту-млекопитающему. В том случае, когда у индивидуума диагностирован случай ишемии, например инсульт или как результат асфиксии, введение композиции настоящего изобретения необходимо начать как можно быстрее после возникновения ишемического события, предпочтительно в пределах нескольких дней (например, в пределах около 1, около 2 или около 3 дней), или более предпочтительно в пределах нескольких часов (например, менее чем около 12, менее чем около 8, менее чем около 6, менее чем около 4, менее чем около 2 или менее чем около 1 ч) после события. В случае, когда у индивидуума есть риск развития инфаркта в результате неизбежного хирургического или подобного вмешательства или иной высокий риск инфаркта,

- 8 028677 введение композиций настоящего изобретения предпочтительно начинается как можно скорее, как только принято решение о запланированном вмешательстве и установлен риск. В любом случае продолжительность лечения составляет несколько дней или несколько недель, что определяется временными рамками, в которых, как предполагается или ожидается, произойдет ишемическое повреждение.

Размер предназначенной для введения дозы композиции с токотриенолхиноном зависит от способа введения и состояния здоровья субъекта, а также других индивидуальных параметров субъекта, таких как возраст, размер и вес. Введение композиции индивидууму, уже испытывающему ишемическое состояние, представляет наиболее острую ситуацию из рассматриваемых в этом изобретении, так как ишемическое событие уже произошло и чрезвычайно необходимо немедленное сведение к минимуму повреждения от инфаркта. При этом может быть необходим определенный размер дозы, подходящей для данных обстоятельств. Человек или животное, не являющееся человеком, для которого запланировано неизбежное хирургическое или медицинское вмешательство, находится в несколько менее остром медицинском состоянии. В результате размер каждой дозы может быть разным и может подлежать несколько большему изменению и все еще находиться в пределах практического применения изобретения. В общем размер каждой из доз, предназначенных для введения, описывается здесь. Размер доз для млекопитающих, не являющихся человеком, как правило, находится в том же самом приделе, исходя из мг/кг.

Ввиду только что сформулированных причин, частота дозирования также может варьировать. При более остром медицинском состоянии может предлагаться другой режим дозирования, чем при менее остром состоянии. В общем изобретение может осуществляться введением доз с частотой в пределах примерно от одного или двух раз в неделю до одного, двух, трех или четырех раз в день или введением доз с помощью непрерывного вливания.

Аналогично приведенным выше причинам может изменяться продолжительность дозирования. Например, пострадавший от инсульта, находящийся в чрезвычайно остром состоянии, нуждается в том, чтобы действие способа изобретения было реализовано как можно раньше. Это, несомненно, определяет курс дозирования, при котором особое внимание придается небольшой продолжительности. Субъект, сталкивающийся с запланированным хирургическим или медицинским вмешательством, или имеющий иной риск инсульта, находящийся в менее остром медицинском состоянии, может подвергаться другому дозированию, в целом более продолжительному. В общем пострадавшему от инсульта композиция может вводиться за период времени в пределах примерно от 3 до 10 дней. С другой стороны, субъекту, собирающемуся подвергнуться медицинскому или хирургическому лечению, которое увеличивает риск состояния ишемии мозга, дозирование может проводиться в течение периода времени в пределах примерно от 5 дней до 14 дней до вмешательства. Субъекта, имеющего риск развития инфаркта мозга, связанного с хроническим медицинским состоянием, таким как генетическая предрасположенность к инсульту, диабет, гипертензия, гиперхолестеринемия и курение в анамнезе, можно лечить профилактически в течение более длительных периодов времени.

Способы изобретения подразумевают введение композиций, содержащих одно или более соединений формулы I, такого как токотриенолхинон, например альфа токотриенолхинона, в эффективном количестве. В отношении состояния ишемии головного мозга, эффективное количество является количеством, достаточным для того, чтобы уменьшить нейрональное повреждение, являющееся результатом состояния ишемии головного мозга. Уменьшением нейронального повреждения является любое предотвращение повреждения мозга, которое могло бы произойти у субъекта, испытывающего мозговое ишемическое событие, в случае отсутствия лечения изобретения. Для оценки уменьшения повреждения мозга могут использоваться некоторые физиологические параметры, включая, но не ограничиваясь этим, меньший размер инфаркта, улучшенный местный мозговой кровоток и уменьшенное внутричерепное давление, например, по сравнению с параметрами до лечения пациента, с параметрами нелеченых пациентов с ишемией мозга или пациентов с ишемией мозга, получавших только контроль. Размер инфаркта у пациента-человека с инсультом можно определить, например, с помощью различных неинвазивных радиологических методов, известных специалистам в данной области медицины, в частности специалистам по радиологии и неврологии. Примеры способов, доступных в этой области, включают, но не ограничиваются этим, компьютерную томографию (СТ), магнитно-резонансную визуализацию (МЫ), позитронно-эмиссионную томографию (РЕТ), диффузно-взвешенное изображение (Ό^Ι), ультразвуковую визуализацию и адресную визуализацию с помощью радиоактивной метки.

Тяжесть инфаркта у пациента-человека, пораженного инсультом, может быть определена, например, с помощью различных симптоматических и диагностических методов, известных специалистам в данных областях медицины, в частности специалистам по неврологии, гематологии и физиотерапии, в дополнение к результатам оценки радиологического и морфологического диагноза, которые обсуждались в предшествующем параграфе. У пациентов с инсультом изменяется динамическое, сенсорное и когнитивное поведение. Медицинский диагноз обычно включает такие оценки при анализе состояния пострадавших от инсульта. Например, эффективность разных доз заявленных композиций можно оценить с помощью стандартных измерений, известных в данной области, включая, но, не ограничиваясь этим, индекс Бартеля, модифицированный счета Каикти, общую шкалу инсульта Национального института здоровья, пункт шкалы инсульта Национального института здоровья, связанный с моторикой (дви- 9 028677 гательной активностью), количество дней до выписки из больницы, смертность и другие тесты для подсчета нейрофизиологических показателей.

Кроме того, пациентов с инсультом можно диагностировать с помощью гематологических методов. Эти методы могут использоваться для оценки популяций и клеточных характеристик иммунных клеток в кровообращении, а также активности различных ферментов или клеточных компонентов из ткани мозга. Как правило, такая активность или компоненты обнаруживаются в крови пострадавших от инфаркта, но отсутствуют или присутствуют только на низких уровнях у субъектов, не имеющих инсульта. Подобные методы могут применяться к млекопитающим, не являющимся человеком, которые подвергаются ишемическому повреждению в результате медицинской или хирургической процедуры. Полученные при использовании этих диагностических тестов количества или значения можно сравнить со значениями, известными в различных областях для описания нормального или патологического состояния. Проанализировав полученный набор диагностических результатов, как указано выше, медицинские работники могут определить тяжесть инфаркта. Соответственно размер дозы, частоту и продолжительность лечения методами настоящего изобретения можно отрегулировать, исходя из тяжести инфаркта и общего состояния здоровья пациента.

Как описано выше, композиции могут быть приготовлены в виде медицинского препарата или в виде продуктов питания для людей или животных, включая лечебное питание и пищевые добавки. Лечебное питание - это продукт, предназначенный для специальной диетотерапии болезни или состояния, для которого характерны особые пищевые потребности. В качестве примера, но не ограничиваясь этим, лечебное питание может включать композиции витаминов и минералов для кормления через зонд раковых и ожоговых пациентов (называется энтеральным введением или введением через зонд). Пищевая добавка представляет собой продукт, который предназначается для дополнения диеты человека и, как правило, предоставляется в форме пилюли, капсулы, таблетки или подобной композиции. В качестве примера, но, не ограничиваясь этим, пищевая добавка может включать один или более из следующих ингредиентов: витамины, минералы, травы, лекарства из растительного сырья; аминокислоты, диетические вещества, предназначенные для дополнения диеты путем увеличения общего пищевого рациона, и концентраты, метаболиты, компоненты, экстракты и любые комбинации вышеперечисленного. Пищевые добавки также могут быть введены в продукт, включая, но не ограничиваясь этим, пищевые плитки, напитки, порошки, зерновые продукты, вареные продукты, пищевые добавки и конфеты; или другие продукты функционального питания, разработанные для оказания содействия здоровью мозга или для предотвращения ишемии головного мозга. Для животных композиции могут быть введены в основной корм. Если композиция применяется как медицинский препарат, ее можно использовать в качестве профилактики или лечения пациента в любом из целого ряда методов. Композиции с токотриенолхиноном могут вводиться отдельно или в комбинации с другими фармацевтическими средствами и могут объединяться с физиологически приемлемым носителем. В некоторых вариантах осуществления композиция с токотриенолхиноном дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель. Эффективное количество и способ введения отдельной цитопротекторной композиции может варьировать в зависимости от отдельного субъекта, стадии болезни и других факторов, очевидных для специалиста в данной области техники. Во время лечения концентрацию предметных композиций можно контролировать, чтобы гарантировать, что необходимый уровень сохраняется. Предметные композиции можно смешивать с другими физиологически приемлемыми веществами, которые можно принимать внутрь, включая, но, не ограничиваясь этим, продукты питания.

Описанные здесь соединения могут быть созданы в виде фармацевтических композиций путем включения в их состав добавок, таких как фармацевтически приемлемые эксципиенты, фармацевтически приемлемые носители и фармацевтически приемлемые разбавители. Подходящие фармацевтически приемлемые эксципиенты, носители и разбавители включают эмульгаторы, модификаторы и усилители доставки лекарственных веществ, например, такие как фосфат кальция, стеарат магния, тальк, моносахариды, дисахариды, крахмал, желатин, целлюлоза, метилцеллюлоза, натрий карбоксиметилцеллюлоза, декстроза, гидроксипропил-бета-циклодекстрин, поливинилпирролидон, легкоплавкие воски, ионообменные смолы и тому подобное, а также их комбинации из двух или более. Другие подходящие фармацевтически приемлемые эксципиенты описаны в РеттДоп! РЬаттасеиЬса1 8с1еисе5, Маск РиЬ. Со., Νον 1ет§еу (1991), и КеттдХои: ТНе 8с1еисе аиб РгасНсе оГ РЬагтасу, Ырртсой ^йЬатк & ХУПкиъ. РЫ1абе1рЫа, изд. 20-е (2003) и изд. 21-е (2005), включенные в описание путем отсылки.

Фармацевтические композиции, содержащие соединения изобретения, могут иметь форму, подходящую для предполагаемого способа введения, включая, например, раствор, суспензию или эмульсию. Обычно при приготовлении растворов, суспензий и эмульсий используются жидкие носители. Жидкие носители, предназначенные для применения на практике настоящего изобретения, включают, например, воду, физиологический раствор, фармацевтически приемлемый органический растворитель(и), фармацевтически приемлемые масла или жиры и тому подобное, а также смеси двух или более из них.

Жидкий носитель может содержать другие подходящие фармацевтически приемлемые добавки, такие как солюбилизаторы, эмульгаторы, питательные вещества, буферы, консервирующие вещества, суспендирующие вещества, загустители, регуляторы вязкости, стабилизирующие вещества и тому подоб- 10 028677 ное. Подходящие органические растворители включают, например, одноатомные спирты, такие как этанол, и многоатомные спирты, такие как гликоли. Подходящие масла включают, например, кунжутное масло, соевое масло, кокосовое масло, оливковое масло, масло подсолнечника, хлопковое масло и тому подобное. Носителем для парентерального введения также может быть масляный эфир, такой как этилолеат, изопропилмиристат и тому подобное. Композиции настоящего изобретения могут иметь форму микрочастиц, микрокапсул, липосомальных инкапсулятов и тому подобного, а также комбинации двух или более из них.

Могут использоваться системы доставки с модифицированным по времени или контролируемым высвобождением, такие как контролируемая диффузией матричная система или эродируемая система, как описано, например, в работе Ьее, ИШикюп-СойтоПеб Майт\ §у81ет8, р. 155-198 апб Кои апб Ьапдег, Ьгоб1Ые 8у81ет8, р. 199-224, ш Тгеабке оп СопйоНеб Эгид ИеНуегу, А. Куботеш Еб., Магсе1 Эеккег. 1пс., Ыете Уогк 1992. Матрица может быть, например, биодеградируемым материалом, который может разрушаться спонтанно ш δίΐιι и ш У1уо, например, путем гидролиза или ферментативного расщепления, например, с помощью протеаз. Система доставки может быть, например, природным или синтетическим полимером или сополимером, например, в форме гидрогеля. Примеры полимеров с расщепляемыми связями включают полиэфиры, полиортоэфиры, полиангидриды, полисахариды, поли(фосфоэфиры), полиамиды, полиуретаны, поли(имидокарбонаты) и поли(фосфазены).

Соединения изобретения могут вводиться энтерально, перорально, парентерально, подъязычно, с помощью ингаляции (например, аэрозоли или спреи), ректально или местно в стандартных лекарственных формах, содержащих обычно применяемые нетоксичные фармацевтически приемлемые носители, адьюванты и разбавители по желанию. Например, подходящие способы введения включают пероаральный, подкожный, чрескожный, трансмукозальный (через слизистую), ионтофоретический, внутривенный, внутриартериальный, внутримышечный, внутрибрюшинный, интраназальный (например, через слизистую носа), субдуральный, ректальный, гастроинтестинальный и т.п., и непосредственно в отдельный или пораженный орган или ткань. Для доставки в центральную нервную систему можно использовать спинальное и эпидуральное введение или введение в желудочки мозга. При местном введении может использоваться чрескожное введение с помощью чрескожных пластырей или ионтофоретических устройств. При использовании в описании термин парентеральное введение включает подкожные инъекции, внутривенные, внутримышечные, внутригрудинные инъекции и методы вливания. Соединения смешиваются с фармацевтически приемлемыми носителями, адьювантами (вспомогательными веществами) и разбавителями, подходящими для желательного способа введения. Пероральное введение является предпочтительным способом введения, а композиции, подходящие для перорального введения, являются предпочтительными композициями. Описанные здесь соединения могут быть введены в твердой форме, жидкой форме, в виде аэрозоля или в виде таблеток, пилюль, порошкообразных смесей, капсул, гранул, инъецируемых препаратов, кремов, растворов, суппозиториев, клизм, орошений толстой кишки, эмульсий, дисперсий, пищевых предварительных смесей и в других подходящих формах. Соединения также вводятся в липосомальных композициях. В данной области техники известны дополнительные способы введения.

Инъецируемые препараты, например стерильные инъецируемые водные и масляные суспензии, могут быть созданы в соответствии с известным уровнем техники с использованием подходящих диспергирующих или увлажняющих средств и суспендирующих средств. Стерильный инъецируемой препарат также может быть стерильным инъецируемым раствором или суспензией в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например в виде раствора в пропиленгликоле. К числу приемлемых носителей и растворителей, которые могут использоваться, относятся вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды удобно использовать стерильные жирные масла. Для этой цели можно использовать любое легкое жирное масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Кроме того, при получении инъецируемых препаратов находят применение жирные кислоты, такие как олеиновая кислота.

Суппозитории для ректального введения лекарственного средства можно получить, смешав лекарственное средство с подходящим, не вызывающим раздражение эксципиентом, таким как масло какао и полиэтиленгликоли, которые являются твердыми при комнатной температуре, но становятся жидкими при ректальной температуре и, следовательно, будут плавиться в прямой кишке и высвобождать лекарственное средство.

Твердые лекарственные формы для перорального введения могут включать капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых лекарственных формах активное соединение может смешиваться по меньшей мере с одним инертным разбавителем, таким как сахароза, лактоза или крахмал. Такие лекарственные формы также могут содержать дополнительные вещества, отличные от инертных разбавителей, например смазывающие вещества, такие как стеарат магния. В случае капсул, таблеток и пилюль лекарственные формы также могут содержать буферные вещества. Кроме того, таблетки и пилюли можно покрыть инертными покрытиями.

Жидкие лекарственные формы для перорального введения могут включать фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры, содержащие инертные разбавители, обыч- 11 028677 но используемые в данной области техники, такие как вода. Такие композиции также могут содержать адьюванты (вспомогательные средства), такие как увлажняющие средства, эмульгирующие и суспендирующие средства, циклодекстрины и подсластители, ароматизаторы и отдушки.

Соединения настоящего изобретения также могут вводиться в форме липосом. Как известно в данной области техники, липосомы в большинстве случаев получают из фосфолипидов или других липидных веществ. Липосомы формируются одно- или многослойными гидратированными жидкими кристаллами, которые диспергируются в водной среде. Можно использовать любой нетоксичный, физиологически приемлемый и преобразующийся в ходе обмена веществ липид, способный образовывать липосомы. Настоящие композиции в липосомальной форме в дополнение к соединению настоящего изобретения могут содержать стабилизирующие вещества, консервирующие вещества, эксципиенты и т.п. Предпочтительными липидами являются фосфолипиды и фосфатидилхолины (лецитины), и природные и синтетические. Способы получения липосом известны в данной области техники; см., например, Ргексо!!, Еб., Ме!йобк ίη Се11 Вю1о§у, Уо1ише XIV, Асабетю Ргекк, Ыете Уогк, Ν.№., р. 33 е! кес.] (1976).

Для введения композиции могут быть удобно представлены в стандартной лекарственной форме и могут быть приготовлены любыми способами, хорошо известными в области фармацевтики. Такие способы включают стадию объединения активных ингредиентов с носителем, который образован одним или более вспомогательными ингредиентами. В общем композиции получают путем равномерного и тщательного объединения активных ингредиентов с жидкими носителями или мелкоизмельченными твердыми носителями или и теми и другими, а затем, если необходимо, формования продукта. Кроме того, изобретение предоставляет готовые изделия и наборы, содержащие вещества, пригодные для лечения или подавления состояния ишемии головного мозга. Готовое изделие включает контейнер с этикеткой. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы и пробирки. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, например стекла или пластика. Контейнер содержит композицию, включающую активное средство, которое является эффективным при лечении или подавлении состояния ишемии головного мозга. Активным средством в композиции является одно или более соединений настоящего изобретения. Этикетка на контейнере указывает, что композиция используется для лечения или подавлении состояния ишемии головного мозга, например инсульта, а также может давать инструкции, касающиеся использования ίη У1уо или ίη уйго.

Кроме того, изобретение предоставляет набор, содержащий одно или более соединений настоящего изобретения. В некоторых вариантах осуществления набор изобретения содержит контейнер, описанный выше. В других вариантах осуществления набор изобретения содержит контейнер, описанный выше, и второй контейнер, содержащий буфер. Он может дополнительно включать другие материалы, необходимые с коммерческой и пользовательской точек зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы, шприцы и листки-вкладыши с инструкциями по поводу осуществления любых описанных здесь способов.

В других аспектах наборы могут использоваться для любого из описанных здесь способов, включая, например, лечение индивидуума с состоянием ишемии головного мозга, например инсульта, или подавление состояния ишемии головного мозга, например инсульта, у индивидуума.

Количество применяемой внутрь, потребляемой или иным образом вводимой композиции будет зависеть от желательной конечной концентрации. Как правило, количество одного введения композиции изобретения может составлять примерно от 100 до 500 мг на дозу, или примерно от 200 до 1500 мг на день. Любую из этих доз можно дополнительно разделить на отдельные введения, а любому отдельному пациенту могут даваться многократные дозировки.

Вышеупомянутые композиции и способы введения предназначаются для описания, а не для ограничения способов и композиций настоящего изобретения. Способы получения различных композиций и устройств находятся в пределах возможностей квалифицированного специалиста в данной области техники и не описаны здесь подробно.

Различные методы анализа, композиции и способы, подходящие для установления композиций и способов, пригодных для уменьшения нейронального повреждения, предоставлены в примерах. Следующие примеры предоставляются для иллюстрации, но не ограничивают изобретение.

Примеры

Пример 1. Определение способности соединения препятствовать вызванному ишемией повреждению нервных клеток и клеточной смерти с помощью исследований на клетках.

Кровоизлияние (инсульт) в мозге, вызывающее нарушение доставки крови, как при ишемии, или доставки кислорода, как при гипоксии (низкий кислород) или аноксии (кислород на нуле), быстро вызывает дисбаланс нейронов, приводящий к клеточной смерти (Р1упп е! а1. (1989) 1ксйет1а апб Нурох1а, рр. 783-810, 1п: Вакю №игосйет1кйу, §1еде1 е! а1. (Ебк.), Кауеп Ргекк, Νον Уогк). Ишемический инсульт головного мозга моделируют на животных, перекрывая сосуды, идущие в череп, или в черепе (Мойпай (1986) Ехрептеп!а1 тобе1к оГ юсйетю кйоке. р. 57-73, Ιη: §йоке: Ра1йорйукю1оду, И1адпок1к апб Мападетеп!, ^1. 1, Вашей е! а1. (Ебк.), СйитсЫ11 Ь1ушдк!опе, Ν.Υ.). На моделях ишемии ίη уйго используются различные способы депривации (лишения) кислорода и глюкозы, например, путем помещения культур нейронов в большие анаэробные или гипоксические камеры и замены культуральной среды на среды без

- 12 028677 кислорода и с определенным ионным составом (Со1бЬегд е! а1., (1990) 81гоке 21:75-77). Токсичное чрезмерное раздражение нейронных глутаматных рецепторов, в частности Ы-метил-Э-аспартатных рецепторов (ΝΜΌΑ), способствует гипоксически-ишемическому повреждению нейронов (Сйо1 (1988) Ыеигоп 1:623-634), ишемической индукции активных форм кислорода (КО8) (^а!коп е! а1., (1988) Αηη. ΝΥ Асаб. 8εί. 59:269-281), избыточному входу кальция (Сгоба е! а1., (1988) 81гоке 19:447-454), увеличению арахидоновой кислоты (81ек)о (1981) 1. СегеЬ. В1ооб Р1о\у Ме!аЬ. 1: 155-185) и повреждению ДНК (МасМапик е! а1., (1993) Ыеигокск Ье!!. 164:89-92), что вызывает каскад нейродегенерации.

Среди различных первичных культур нейронов широко используемой по многим соображениям является первичная эмбриональная гиппокампальная нейронная культура. Г иппокамп является источником относительно гомогенной популяции нейронов с хорошо охарактеризованными свойствами, типичными для нейронов центральной нервной системы (ЦНС) вообще. Пирамидальные нейроны, основной тип клеток в гиппокампе, по оценкам составляют от 85 до 90% всей популяции нейронов (Вапкег е! а1., (1998) Си1!игшд Ыегуе Се11к, 2^пб ебйюп, Тйе ΜΙΤ Ргекк, СатЬпбде, Макк.). Кроме того, гиппокамп демонстрирует удивительную способность изменять синаптическую функцию в зависимости от активности, такую как долговременная потенциация синаптической передачи (На\\ктк е! а1., (1993). Аппи. Кеу. Ыеигокск 16:625-665).

Культуры клеток гиппокампа получают, как правило, от 18-19-дневных зародышей крыс. В этом возрасте образование пирамидальных нейронов, которое начинается у крысы Е15, полностью завершается. Ткань легко отделяется, оболочки головного мозга легко удаляются, а количество глиальных клеток еще сравнительно небольшое (Рагк е! а1., (2000) 1. Ыеигосйет 74:114-124).

Первичная культура клеток.

Следующий протокол описывает методику, применяемую для выделения и культивирования основных гиппокампальных нейрональных клеток из мозга эмбрионов крыс с целью использования в описанных здесь методах исследования на клетках.

Перед выделением клеток оплавили над огнем пастеровские пипетки с длинным кончиком с каналом 1, 0,4-0,5 и 0,25 мм, прочистили 70% этанолом, силиконизировали (81дтасо!е, 8щта Сйетюа1 Са!. Ыо. 8Ь-2) и автоклавировали. Все другие инструменты для препарирования замачивали в 70% этаноле по меньшей мере на 2 ч перед препарированием. Кроме того, перед выделением клеток культуральные флаконы (Т75 см²) и планшеты покрыли поли-Э-лизином (81дта Сйетюа1, Са!. Ыо. Р-6407). Для покрытия во флакон или планшет (5 мл на Т75 см² флакон и 50 мкл/лунку в 96-луночные планшеты) добавили 50 мкг/мл поли-Э-лизина на 1 ч. Затем флакон или планшет дважды промыли стерильной, дистиллированной водой и дали возможность высохнуть на воздухе в шкафу с ламинарным потоком в течение 1 ч до использования. НВ88 (сбалансированный солевой раствор Хенкса) (без Са/Мд) получали следующим образом: 10,0 мл 10хНВ88 (Хенкс СМР-СЬсо #310-4180), 3,3 мл 0,3 М НЕРЕ8, рН 7,3, 10 мл 0,35% бикарбоната натрия, 1,0 мл пенициллина/стрептомицина (100х) и 1,0 мл 100 мМ пирувата смешали с 74,7 мл Н₂О, чтобы получить 100 мл раствора.

Беременную крысу (Е 18-Е 19) умерщвляли с помощью СО₂ и удаляли матку. Извлекали из мешка эмбрионы, обезглавливали и извлекали мозг. Мозги погружали в холод (4°С) В88 (без Са/Мд) в небольших чашках Петри. Чашку (100-мм) покрывали парафином, чтобы сделать лучше поверхность для диссекции. Гиппокамп извлекали из мозга под препаровальной лупой и помещали на покрытую парафином чашку. Снимали мозговые оболочки и извлеченные гиппокампы собирали в небольшие чашки Петри в НВ88 (без Са/Мд).

Гиппокампы от одного помета помещали в 15-мл центрифужную пробирку (как правило, 10-12 мозгов/помет) и заполняли пробирку НВ88 (без Са/Мд). После центрифугирования при 1000 об/мин в течение 2 мин с помощью настольной центрифуги супернатант удаляли. В каждую пробирку добавили 2 мл НВ88 (без Са/Мд) и ткань гомогенизировали 2 раза с помощью силиконизированной пипетки с длинным кончиком с тремя разными размерами отверстий (всего 6-7 раз). Гомогенизацию начинали пипеткой с нормальным отверстием, а затем пипеткой с меньшим отверстием (половина от первого размера), затем пипеткой с самым маленьким отверстием. После центрифугирования при 1000 об/мин в течение 2 мин супернатант отбросили и добавили 2 мл ЫеигоЬака1/В271 (с антибиотиками) в каждую пробирку. Среда ЫеигоЬака1/В271 содержит среду ЫеигоЬака1 (ЬДе ТесЬпо1од1ек Са! Ыо. 21103-049) с добавлением 1хВ27 (ЬДе ТесЬпо1од1ек Са! Ыо. 17504-044), 0,5 мкМ Ь-глутамина, 25 мкМ Ь-глутаминовой кислоты и 1х пенициллина/стрептомицина. Клетки гомогенизируют один раз с помощью силиконизированной пипетки с длинным кончиком с тремя разными размерами отверстий. Гомогенизацию начинали пипеткой с нормальным размером отверстия, а затем пипеткой с меньшим отверстием (половина от первого размера), в конце пипеткой с самым маленьким отверстием. Плотность клеток определяли с помощью гемоцитометра, используя метод исключения трипановым синим. Стоковый раствор трипанового синего 0,4 в 0,9% ЫаС1 смешивали в соотношении один к одному с несколькими каплями клеточной суспензии и давали постоять 4 мин до подсчета фракции неокрашенных клеток. Типичный выход составляет 3х10⁵-6 х 10⁵клеток/мозг.

Нужное количество живых клеток добавляли в покрытые поли-Э-лизином 12-луночные планшеты,

- 13 028677 флаконы или культуральные чашки МеГГек в среду №игоЪа8а1/В271, и инкубировали в атмосфере, содержащей 5% СО₂, при 37°С. Как правило, клетки рассевали с плотностью 1,5х10⁶ клеток на флакон Т75 см² и с плотностью приблизительно 100,000 клеток на лунку 12-луночного планшета. В каждый флакон Т75 см² добавляли 15 мл среды, а в каждую лунку 12-луночного планшета добавляли 1 мл среды.

Через три-четыре дня культивирования половину среды удаляют из каждой лунки или флакона и добавляют равное количество свежей среды №игоЪа8а1/В27т (ЫеигоЪа8а1 среды с добавкой 1хВ27 0,5 мкМ Ь-глутамина), содержащей 5 мкМ цитозин арабинозина (АгаС). Через семь-восемь дней от первоначальной культуры половину среды удаляют из каждой лунки или флакона и добавляют равное количество свежей среды ЫеигоЪа8а1/В27т (не содержащей Ага-С).

Анализ повреждения клеток.

В следующем исследовании ишемию вызывали с помощью аноксии-реоксигенации культивируемых гиппокампальных нейрональных клеток, и оценивали испытываемые средства в отношении их активности и/или эффективности против вызванного ишемией повреждения клеток и клеточной смерти. Протокол исследования представлен далее.

Полученные первичные гиппокампальные нейронные клетки высевали на покрытые поли-Илизином 12-луночные планшеты, как описано выше. Клетки культивировали в течение 10-11 дней, как описано выше.

100 мл среды ЬоО-№игоЪа8а1 во флаконе Т150см² предварительно приводили в равновесие в гипоксической камере в течение ночи, а 20 мл среды ЬоО-№игоЪа8а1 в Т75 см² флаконе предварительно приводили в равновесие в стандартном инкубаторе (5% СО2) в течение ночи. Среда ЬоО-ЫеигоЪа8а1 содержит среду №С-№игоЪа5а1 (без глюкозы) (Ы£е ТесЬпо1од1е8, индивидуальный заказ) плюс 0,5 мМ глюкозы, 0,5 мМ Ь-глутамина и 0,25х пенициллина/стрептомицина. 100 мл среды №игоЪа8а1/В27АО во флаконе Т150см² предварительно приводили в равновесие в стандартном инкубаторе (5% СО2) в течение ночи. Среда ЫеигоЪа8а1/В27АО содержит среду №игоЪа8а1 (П£е ТесЬпо1од1е8, СаГ Ыо. 21103-049) с 2хВ27 без добавления АО (Ы£е Тес1то1още5. СаГ Ыо. 10889-038), 0,5мМ Ь-глутамина и 0,25х пенициллина/стрептомицина.

Предварительно уравновешенную среду ЬоО-ЫеигоЪа8а1 100 мл во флаконе Т150 см² убирали из гипоксической камеры и слегка барботировали 100% Ν₂ в течение 30 мин для того, чтобы полностью удалить кислород. Имеющуюся культуральную среду (№игоЪа8а1/В27т) отсасывали от культивируемых клеток из каждого 12-луночного планшета, используя вакуумный насос с присоединенной стерильной стеклянной пастеровской пипеткой. Клетки один раз промыли 2 мл В§§₀ (сбалансированный солевой раствор) без глюкозы (рН 7,4). В§§₀ без глюкозы (рН 7,4) содержит 143,6 мМ ЫаС1; 5,4 мМ КС1; 1,8 мМ СаС1₂; 0,8 мМ М§§О₄; 1 мМ ЫаН₂РО₄; 26,2 мМ ЫаНСО₃; 10 мг/л фенолового красного и 0,25х пенициллина/стрептомицина.

Культивируемые нейроны (10-11 дней от начала культивирования) снова наполняют бескислородной средой ЬоО-ЫеигоЪа8а1 (1 мл на лунку для каждой лунки 12-луночного планшета). Испытываемые средства добавляли непосредственно в каждую лунку (обычно три концентрации соединения плюс положительный контроль, каждый в трех экземплярах). В большинстве случаев испытываемые соединения растворяли в 100% ИМ8О. Чтобы уменьшить влияние ИМ8О на клетки, добавляли небольшое количество соединения в высокой концентрации (обычно в концентрации 200х). Концентрация ИМ8О в культуре не достигает 0,5%.

Прикрытые крышками планшеты помещали в анаэробную камеру на 5 ч. Для контролей с нормальными кислородными условиями (нормоксией) к каждой лунке добавили предварительно уравновешенную среду ЬоО-ЫеигоЪа8а1 с нормальным содержанием кислорода и поместили планшет в стандартный инкубатор (5% СО₂) на 5 ч. Через 5 ч гипоксии культуральную среду тщательно отсасывали и добавляли 2 мл новой оксигенированной (предварительно уравновешенной) среды №игоЪа8а1/В27АО к каждой лунке. Восстановление кислорода в среде (реоксигенация) достигалась помещением среды на ночь в инкубатор для культивирования. Те же самые испытываемые соединения в тех же самых концентрациях добавлялись обратно в соответствующие лунки. Планшеты помещали в инкубатор для культивирования клеток и реоксигенировали в течение 20-24 ч. После реоксигенации в течение 20-24 ч подсчитывали количество нейронов, используя метод слежения за клетками с помощью зеленого флуоресцентного красителя, как описано далее. Из каждой лунки 12-луночных планшетов отсасывали культуральную среду и дважды промывали нейроны 2 мл НВ§§ (предварительного нагретым до 30-37°С); 25 мМ НЬРЬ§, 100 мМ ЫаС1, 5 мМ КС1, 1,2 мМ МдС1₂, 1,3 мМ СаС1₂, 1,0 мМ КН₂РО₄, рН 7,4, стерилизованного фильтрованием). 1 мл (5 мкМ) зеленого флуоресцентного красителя для слежения за клетками (Мо1еси1аг РгоЪек, Сак Ыо. 2925), растворенного в НВ§§, добавили к клеткам, а планшеты поместили в темноту при комнатной температуре на 15 мин. После промывки нейронов один раз 2 мл НВ§§ к каждой лунке добавили 1 мл НВ§§ и подсчитывали флуоресцирующие клетки с помощью флуоресцентного микроскопа.

- 14 028677

Пример 2. Метод исследования инфаркта мозга у животных.

Этот метод мы использовали для оценки эффективности испытываемых средств для защиты мозга от некроза после индуцированной ишемии головного мозга у крыс. Широко используемым методом индуцирования преходящей фокальной ишемии головного мозга на животных моделях является окклюзия средней церебральной артерии (МСАО). Было показано, что крысиная модель МСАО представляет собой подходящее приближение ишемического повреждения у людей. Более того, эта модель точно представляет поражение средней мозговой артерии (МСА), сосуда, больше всего страдающего при инсульте у человека, а также обеспечивает реперфузию, подобно тому, как это происходит у людей.

Окклюзия средней мозговой артерии (МСАО).

Крысам самцам Бртадие-ИаЩеу (Найаи, Ιηά.) весом 225-250 г предоставлялся свободный доступ к воде и коммерческому корму для грызунов при стандартных лабораторных условиях. Поддерживалась комнатная температура 20-23°С, а цикл освещения - 12 ч свет/12 ч ночь. До исследования крысам давали возможность акклиматизироваться к лабораторным условиям в течение 5-7 дней до исследования.

Перед хирургическим вмешательством животные не голодали и имели свободный доступ к воде. За 4 ч до хирургического вмешательства животным вводили представляющие интерес соединения через пероральный зонд. Соединения разводили в кунжутном масле до конечной дозы 5 мл/кг при 500 мг/кг. Контрольные животные получали кунжутное масло; через 4 ч после введения соединения крысам вводили анестезию 3,0% тиобутабарбитал (инактин; 100 мг/кг) в 0,8% кислороде и помещали в стереотаксический аппарат. Чешуйчатую кость удаляли, чтобы раскрыть среднюю мозговую артерию (МСА). Нити помещали в трех нейроанатомически заданных положениях вдоль сосуда. Как только нити были размещены, таймер был установлен на 0. Реперфузию начинали снятием нитей (таймер вновь устанавливали, и это давало начало периоду, называемому реперфузия). Реперфузия длилась в течение дополнительных 5,5 ч, при этом животных вынимали из каркаса, а мозг удаляли при перфузии животных фосфатнобуферным раствором (рН 7,4). Мозг помещали в матрицу для мозга, делали коронарные срезы толщиной 1 мм и помещали их в ТТС при комнатной температуре на 10 мин. Срезы переносили в сосуд с 10% формалином. На следующий день срезы сканировали в планшетном сканере и передавали специалистуаналитику, работающему вслепую в данном исследовании, который количественно оценивал объем инфаркта на оцифрованных изображениях, используя программное обеспечение ΝΙΗ 1таде 1.

Введение лекарственных средств: кормление через зонд.

Стандартный желудочный зонд (трубка) (Роррег & Бопз 1пс, ΝΥ) был соединен с 3-см³ шприцом для подкожных инъекций. Животное удерживалось в вертикальном положении с помощью держателя. Питательную трубку помещали в рот, затем продвигали до тех пор, пока она не достигала желудка (приблизительная длина вставляемой трубки определялась до кормления). Медленно доставляли содержимое шприца, затем трубку убирали. Токотриенол хинон растворяли в кунжутном масле и вводили за 4 ч до инфаркта.

Введение композиции с альфа-токотриенолхиноном во время реперфузии давало в результате 40% уменьшение общего объема инфаркта, общего ишемического повреждения и отека мозга относительно контролей. Фиг. 1 показывает срезы мозга крыс, которым давали разбавитель (фиг. 1(а)) или альфатокотриенолхинон (фиг. 1(Ь)) при реперфузии. Фиг. 1(с) показывает объемное сравнение общего инфаркта при введении разбавителя в сравнении с альфа-токотриенолхиноном при реперфузии.

Пример 3. Исследование на людях.

Это исследование можно обозначить как рандомизированное, двойное-слепое, плацебоконтролируемое изучение эффективности лечения, описанного здесь, на пациентах с острым ишемическим инсультом. Пациентов отбирали для исследования, исходя из критериев отбора, которые могут быть определены в каждом исследовании. Например, критерии могут включать возраст (например, 18-85 лет), фокальный (местный) неврологический дефицит, длящийся по меньшей мере 60 мин, СТ (или МК1), соответствующую клиническому диагнозу острого ишемического инсульта, и счет по шкале инсульта Национального института здоровья по меньшей мере 8. Критерии исключения могут включать, например, тяжелое сопутствующее системное заболевание, предсуществующие медицинские состояния, которые могут препятствовать участию, и хирургическое вмешательство, которое необходимо в течение 24 ч. Протокол исследования должен быть одобрен экспертным советом института, где проводится исследование, а все пациенты и их юридические представители должны подписать информированное согласие.

Главной целью этого исследования является определение воздействия лечения, проводимого перорально в течение 6-недельного периода лечения и последующего 6-недельного периода наблюдения, на восстановление пациентов после острого ишемического инсульта. Для того чтобы оценить восстановление, измеряли следующие параметры. Объем поражения при инсульте у всех пациентов в исследовании можно оценить с помощью обычной Т2-взвешенной МК1. Кроме того, можно провести анализ диффузновзвешенного изображения (Ό^Ι) для сравнения изменений в объеме повреждения на исходном уровне с объемом на 12 неделе.

Чтобы пациент был допущен к этому исследованию, в пределах 24 ч при клиническом обследовании у него должны наблюдаться симптомы, соответствующие острому ишемическому инсульту, произошедшему на участке средней мозговой артерии. Более того, пациенты должны иметь по меньшей ме- 15 028677 ре 8 баллов по шкале инсульта ΝΙΗ, при этом по меньшей мере два из этих баллов должны относиться к разделам моторики.

Для подтверждения диагноза ишемического инсульта проводят базовую компьютерную томографию СТ или обычное МКЙ-сканирование.

Всех пациентов, включенных согласно критериям включения и исключения, для которых было получено информированное согласие, случайно распределили на основе один к одному в группы для 6 недельного лечения или плацебо или комбинированной терапией. И комбинированная терапия, и плацебо могут вводиться перорально один или два раза в день. Следует отметить, что могут использоваться другие способы введения и другие дозовые режимы. Если пациент не способен глотать, для доставки лекарственного средства вводили желудочный зонд.

Обследование пациентов исследовательским коллективом проводилось на исходном уровне, через 1 неделю, при выписке из больницы, через 3, 6 и 12 недель, при этом определялся профиль побочного действия и эффективность лекарственных препаратов.

Эффективность терапии можно оценить несколькими способами. Основным критерием эффективности может быть, например, сравнение части пациентов в группе плацебо и лечебной группе, у которых общий счет по шкале ΝΙΗ улучшился от исходного по меньшей мере до 7 баллов на 12 неделе. Дополнительные критерии могут включать, например, процент пациентов, у которых улучшился счет на 1 или 2 балла по шкале общей клинической оценки (СС1) (см. Сиу V., Еаг1у с1ппса1 йгид еуа1иайои ιιηίΐ (ЕСОЕИ) а55С55тсп1 таииа1 Гог р8усЬорЬагтасо1оду, 1976, 217-222) через 12 недель, процент пациентов, у которых наблюдалось по меньшей мере 2-балльное улучшение по шкале клинической оценки СС1 тяжести, и оценку смертности. Как упоминалось ранее, для оценки изменений в объеме повреждения может использоваться ΩΧνί на базовом уровне и на 12 неделе.

Пример 4. Метод РЕТ.

⁶²Си элюировали из ⁶²2и/⁶²Си генератора позитронов, ⁶²Си-ЛТ§М получали путем простого смешивания элюата из генератора (⁶²Си-глицин) и ЛТ8М, синтезированного с помощью ранее сообщенного метода (РирЪауакЫ е1 а1., (1997) Соррег-62 ЛТ8М: а пе\у Ьурох1а ипадшд адеп1 \νίΐ1ι ЫдН тетЬгаие регтеаЬйПу 1о\у гейох ро1еийа1. 1. №с1. Мей. 38, 1155-1160). 20-мин динамическое РЕТ-сканирование проводили с помощью болюсной инъекции ⁶²Си-ЛТ§М через латеральную подкожную вену руки приблизительно 555 МВс| с продолжительностью циклов 10 с х 12, 60 с х 8 и 10 мин х 1. Ранние и отсроченные изображения вычисляли, используя первые 3 мин данных РЕТ и последние динамические данные. ⁶²СиЛТ8М накопление на ранней фазе отражает коронарный кровоток (РирЪауакЬ е1 а1., (1997), 1. №с1. Мей.(1997) 38 (7) 1155-1160); 1.е\т с1 а1., (2001) 1. №с1. Мей. 42, 655-661; ОЪа!а с1 а1., (2001) Аии. N^1. Мей. 15, 499-504 апй ОеагПпд е1 а1., (2002) 1. Бю1. 1иогд. СЬет 7, 249-259). Для ^|8РПС-РЕТ приблизительно 150 МВс| или метку (меченое вещество) вводили примерно через 1 ч после инъекции Си-АТ§М. Через 50 мин после инъекции маркера начинали 10 мин-РЕТ исследование.

Затем для анализа полученных данных реконструированные изображения преобразовывали в полуколичественные изображения с поправкой на дозу инъекции и вес тела субъекта (стандартизированное значение накопления - δυν). Представляющие интерес многочисленные круглые участки 1 см в диаметре накладывают (располагают) на каждое повреждение и мозжечок и затем вычисляют средние значения δυν. Отношения δυν получают из отношения δυν каждого повреждения к δυν мозжечка.

Несмотря на то что вышеупомянутое изобретение описано довольно подробно путем иллюстрации, а пример предназначен для ясности понимания, специалистам в данной области техники понятно, что на практике могут осуществляться определенные незначительные изменения и модификации. Поэтому описание и примеры не следует рассматривать как ограничивающие рамки изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ лечения, предотвращения и/или улучшения нейронального повреждения, связанного с ишемией головного мозга у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, включающий введение субъекту эффективного количества композиции, содержащей один или более цитопротекторных агентов, выбранных из группы, состоящей из альфа-токотриенолхинона, бета-токотриенолхинона, гамматокотриенолхинона и дельта-токотриенолхинона или любых их стереоизомеров или смеси стереоизомеров;

при условии, что данный субъект не страдает от митохондриальной болезни.
2. Способ по п.1, в котором один или более цитопротекторных агентов представляют собой альфатокотриенолхинон, или любой его стереоизомер, или смесь его стереоизомеров.
3. Способ по п.1, в котором случай ишемии головного мозга является осложнением (происходит на фоне) закупорки мозговой сосудистой сети.
4. Способ по п.3, в котором закупорка является следствием тромбоэмболии.
5. Способ по п.1, в котором ишемия головного мозга является следствием спазма коронарной сосудистой сети.
6. Способ по п.1, в котором случай ишемии головного мозга является осложнением (происходит на

- 16 028677 фоне) прекращения сердечной функции.
7. Способ по п.1, в котором случай ишемии головного мозга является осложнением процедуры искусственного кровообращения.
8. Способ по п.1, в котором случай ишемии головного мозга является осложнением геморрагического события в мозговой сосудистой сети.
9. Способ по п.2, в котором указанная композиция содержит по меньшей мере около 65% альфатокотриенолхинона.
10. Способ по п.2, в котором указанная композиция содержит по меньшей мере около 75% альфатокотриенолхинона.
11. Способ по п.2, в котором указанная композиция содержит по меньшей мере около 85% альфатокотриенолхинона.
12. Способ по п.2, в котором указанная композиция содержит по меньшей мере около 90% альфатокотриенолхинона.
13. Способ по п.2, в котором указанная композиция содержит по меньшей мере около 95% альфатокотриенолхинона.
14. Способ по п.1, в котором указанная композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.
15. Способ по п.1, в котором указанная композиция вводится перорально.
16. Способ по п.1, в котором указанная композиция вводится парентерально.
17. Способ по п.2, в котором указанная композиция содержит альфа-токотриенолхинон в пределах примерно от 1 до 1000 мг на 1 кг веса тела указанного субъекта-млекопитающего.
18. Способ по п.2, в котором указанная композиция содержит альфа-токотриенолхинон в пределах примерно от 1 до 50 мг на 1 кг веса тела указанного субъекта-млекопитающего.
19. Способ по п.1, в котором указанное нейрональное повреждение выбирают из группы, состоящей из гибели нервных клеток, общего объема мозгового инфаркта, мозгового ишемического повреждения, отека мозговой ткани и когнитивной дисфункции.
20. Способ лечения и/или улучшения случая ишемии головного мозга у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, включающий введение субъекту эффективного количества одного или более цитопротекторных агентов, выбранных из группы, состоящей из альфа-токотриенолхинона, бетатокотриенолхинона, гамма-токотриенолхинона и дельта-токотриенолхинона или любых их стереоизомеров или смеси стереоизомеров;

при условии, что данный субъект не страдает от митохондриальной болезни, когда инсульт является одним из симптомов митохондриальной болезни.
21. Способ по п.20, в котором один или более цитопротекторных агентов представляют собой альфа-токотриенолхинон, любой его стереоизомер или смесь его стереоизомеров.
22. Способ лечения и/или улучшения случая ишемии головного мозга у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, включающий введение субъекту эффективного количества композиции, содержащей один или более цитопротекторных агентов, выбранных из группы, состоящей из альфатокотриенолхинона, бета-токотриенолхинона, гамма-токотриенолхинона и дельта-токотриенолхинона или любых их стереоизомеров или смеси их стереоизомеров;

при условии, что данному субъекту не вводилось соединение формулы I где К¹, К² и К³ независимо друг от друга представляют собой водород, (С₁-С₆)алкил или (С₁-С₆)алкокси;

т является целым числом от 1 до 12 включительно;

в пределах месяца до случая ишемии головного мозга и где данный субъект не страдает от митохондриальной болезни.
23. Способ по п.22, в котором один или более цитопротекторных агентов представляют собой альфа-токотриенолхинон или любой его стереоизомер или смесь его стереоизомеров.
24. Способ по п.2, в котором альфа-токотриенолхинон, или любой его стереоизомер, или смесь его стереоизомеров является единственным активным ингредиентом.
25. Способ по п.20, в котором альфа-токотриенолхинон или любой его стереоизомер или смесь его стереоизомеров является единственным активным ингредиентом.
26. Способ по п.22, в котором альфа-токотриенолхинон или любой его стереоизомер или смесь его стереоизомеров является единственным активным ингредиентом.
27. Способ по п.2, заключающийся во введении указанной композиции субъекту.
28. Способ по п.20, заключающийся во введении указанной композиции субъекту.

- 17 028677
29. Способ по п.22, заключающийся во введении указанной композиции субъекту.

Объемное сравнение общего инфаркта