EA025451B1 - Модулятор киназы рецепторного типа и способы лечения поликистозной болезни почек - Google Patents

Abstract

Изобретение содержит применение терапевтически эффективного количества соединения формулы ниже для получения лекарственного препарата с целью лечения поликистозной болезни почек (PKD) у млекопитающего, такого как человек или животное из семейства кошачьих (например, персидский кот). Также представляются вышеуказанное соединение и композиции, его содержащие, для лечения PKD.

Description

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к соединениям, модулирующим ферментативную активность большого числа протеинкиназ, что влияет на клеточную активность, такую как пролиферация, дифференциация и программируемая гибель клетки. Конкретно, изобретение относится к хиназолинам, которые ингибируют, регулируют и/или модулируют ряд ферментов киназ и пути трансдукции сигнала с рецептора, связанные с изменениями клеточной активности, указанной выше, композициям, которые содержат эти соединения, и способам применения их в лечении заболеваний и состояний, связанных с киназами. Еще точнее, изобретение относится к применению соединения, представляющего собой ингибитор киназы, которое снижает активность специфической группы киназ, ответственной за прогрессирование поликистозной болезни почек (ΡΚΌ), и способам лечения ΡΚΌ.

Краткий обзор предшествующего уровня техники

Развитие направленной терапии сфокусировано исходно на поиске лекарственных средств, которые могли бы специфически нацеливать выбранный фермент киназу, значимую в пролиферации клеток при раке. Цель поиска заключалась в испытании на токсичность и ее ограничении. Этот подход в целом оказался безуспешным, поскольку было затруднительно достичь прицельного ингибирования одной киназы вследствие перекрывания и гомологии активных доменов киназ у известных 540 киназ. Во-вторых, стало все более очевидно, что сфокусированное прицеливание приводит к селекции клеток, способных избежать какой-либо одной точки ингибирования в пути. В настоящее время склоняются к нацеливанию большого числа сайтов в одном или большом числе путей. Это наблюдение, познанное из опыта онкологии, может быть применено и к другим заболеваниям (указанным ниже).

Протеинкиназы представляют собой ферменты, которые катализируют фосфорилирование белков, в частности, гидроксильных групп тирозиновых, сериновых и треониновых остатков белков. Последствиями этой, казалось бы простой, активности являются расшатывание, влияние на дифференциацию и пролиферацию клеток. Практически все аспекты жизни клетки так или иначе зависят от активности протеинкиназ. Более того, аномальная активность протеинкиназ была связана с большим числом расстройств в диапазоне от относительно не представляющих угрозы для жизни заболеваний, таких как псориаз, до крайне опасных заболеваний, таких как глиобластома (рак мозга).

Протеинкиназы могут быть подразделены на рецепторные или нерецепторные. Рецепторные тирозинкиназы обладают внеклеточным, трансмембранным и внутриклеточным доменом, тогда как нерецепторные тирозинкиназы являются целиком внутриклеточными.

Рецепторные тирозинкиназы составлены из большого числа трансмембранных рецепторов с различной биологической активностью. В действительности было идентифицировано около двадцати различных подсемейств рецепторных тирозинкиназ. Одно из подсемейств тирозинкиназ, обозначаемое как подсемейство НЕК, состоит из БОРК (НЕК1), НЕК2, НЕК3 и НЕК4. К лигандам этого подсемейства рецепторов, идентифицированным к настоящему времени, относятся эпителиальный фактор роста, ТОРальфа, амфирегулин, НВ-ЕОР, бетацеллюлин и херегулин. Другое подсемейство этих рецепторных тирозинкиназ представляет собой подсемейство инсулина, к которому относятся ΙΝδ-К, 1ОР-1К и 1К-К. К подсемейству ΡΌΟΡ относятся ΡΌΟΡ-альфа и бета-рецепторы, С8Р1К, с-кй и РЬК-ΙΙ. Кроме того, существует семейство РБК, которое состоит из рецептора домена вставки киназы (КОК), киназы-1 печени плода (РБК-1), киназы-4 печени плода (РБК-4) и Гпъ-подобной тирозинкиназы-1 (ГН-1). Семейства ΡΏΟΡ и РБК обычно рассматриваются вместе по причине схожести двух групп. Для подробного рассмотрения рецепторных тирозинкиназ см. статью Ρ1ο\νιη;·ιη е! а1., 1994 ΏΝ&Ρ 7(6): 334-339, которая приводится в настоящем документе в качестве ссылки для всех целей.

Нерецепторные тирозинкиназы также состоят из большого числа подсемейств, к которым относятся 8тс, Ргк, В!к, С§к, АЫ, Ζαρ70, Ре§/Рр8, Рак, 1ак, Аск и Б1МК. Каждое из этих подсемейств дополнительно подразделяется на большое число рецепторов. Например, подсемейство 8тс является одним из самых больших и к нему относятся 8тс, Уе8, Руп, Буи, Бск, В1к, Нск, Рдг и Утк. Подсемейство ферментов 8тс было связано с онкогенезом. Для более подробного рассмотрения нерецепторных тирозинкиназ см. статью Во1еп, Опсодепе, 8:2025-2031 (1993), которая приводится в настоящем документе в качестве ссылки для всех целей.

Нарушение регуляции ферментативной активности протеинкиназ может приводить к измененным свойствам клеток, таким как неконтролируемый рост клеток, ассоциированный с раком. Помимо онкологических симптомов измененная киназой передача сигнала вовлечена в большое число других патологических состояний. К ним относятся, но ими не ограничиваясь: иммунологические нарушения, сердечнососудистые заболевания, воспалительные заболевания и дегенеративные заболевания. Поэтому как рецепторные, так и нерецепторные протеинкиназы представляют собой перспективные мишени для разработки низкомолекулярных лекарственных средств.

- 1 025451

Одна из особенно перспективных целей терапевтического применения модуляции киназ относится к онкологическим симптомам. Например, было показано, что модуляция активности протеинкиназ успешна в лечении рака, причем ΡΌΆ утвердил гливек® (иматиниба мезилат, выпускаемый фармацевтической корпорацией Восточного Ганновера ΝονατΙίδ, N1) для лечения хронического миелоидного лейкоза (СМЬ) и стромальных злокачественных опухолей желудочно-кишечного тракта (ΟΙ8Τ).

Гливек представляет собой ингибитор киназ с-Κί! и ЛЫ.

Модуляция (в частности ингибирование) пролиферации клеток и ангиогенеза, двух важнейших клеточных процессов, необходимых для роста и выживаемости опухолей (Майег А. 2001 Эгид Эйс ТесНпо1 6: 1005-1024), представляет собой перспективную цель при разработке низкомолекулярных лекарственных средств. Антиангиогенная терапия представляет потенциально важный подход в лечении солидных опухолей и других заболеваний, ассоциированных с нерегулируемой васкуляризацией, к которым относятся ишемическая болезнь сердца, диабетическая ретинопатия, псориаз и ревматоидный артрит. Также для замедления или прекращения роста опухолей желательны агенты, направленные против пролиферации клеток.

Ингибирование трансдукции сигнала БОР, УБОР и эфрина должно предотвратить пролиферацию клетки и ангиогенез, два важнейших клеточных процесса, необходимых для роста и выживаемости опухоли (Майег А. 2001 Эгид Эйс ТесНпо1 6: 1005-1024). Рецепторы УЕОР представляют собой ранее описанные мишени для ингибирования низкомолекулярными соединениями.

Рецепторы ЕрН содержат самое большое семейство рецепторных тирозинкиназ и подразделяются на две группы, ЕрНА и ЕрНВ, исходя из гомологии их последовательностей. Лиганды для рецепторов ЕрН представляют собой эфрины, которые зафиксированы в мембране. Лиганды эфрина А связываются преимущественно с рецепторами ЕрНА, тогда как лиганды эфрина В связываются с рецепторами ЕрНВ. Связывание эфрина с рецепторами ЕрН вызывает аутофосфорилирование рецептора и, как правило, требует взаимодействия клетка-клетка, поскольку как рецептор, так и лиганд связаны с мембранами.

Сверхэкспрессию рецепторов ЕрН связали с повышенной клеточной пролиферацией в большом числе опухолей (2йои К 1998 Рйагтасо1 Тйег. 77:151-181; 1<1уока\\а Е., Така1 δ., Тапака М е! а1. 1994 Сапсег Ке8 54:3645-3650; Така1 N М1уа/ак1 Т., Рир8а\уа Κ., Ν·ΐ8ΐι Κ. апб М1уака\уа. 2001 Опсо1оду Керой8 8:567-573). Семейство рецепторных тирозинкиназ ЕрН и их лиганды эфрины имеют важное значение в большом числе процессов во время эмбрионального развития, а также в патологическом ангиогенезе и возможно метастазировании. Поэтому модуляция активности рецепторной киназы ЕрН должна предоставить способ лечения или предотвращения болезненных состояний, ассоциированных с аномальной пролиферацией клеток, таких как описанные выше.

Рецептор эпидермального фактора роста (ЕОРК, НЕК1, егЬВ1) является компонентом семейства рецепторных тирозинкиназ плазматической мембраны, которые контролируют клеточный рост, пролиферацию и апоптоз. Лиганд ЕОРК представляет собой эпидермальный фактор роста, и нарушение регуляции пути передачи сигнала ЕОРК вовлечено в онкогенез и прогрессирование рака, таким образом, делая его клинически значимой мишенью для новых способов лечения рака (Эге\'8 1. е! а1 2003 Сигг Эгид Тагде!8 4, 113-121; С1агб1е11о Р. апб Тойога О. 2001 С1ш. Сапсег Ке8. 7:2958-2970; ТНота8 М. 2002 δет^п Опе. ΝιΐΓ8. 18:20-27).

ЕОРК сверхэкспрессируется при различных злокачественных опухолях человека, особенно немелкоклеточном раке легких и глиобластомах. При этих видах рака сверхэкспрессия ЕОРК обычно ассоциируется с прогрессированием заболевания и неблагоприятным прогнозом (Ва8е1да 1. е! а1 1999 δет^η. Опсо1. 26:78-83).

Поликистозная болезнь почек (ΡΚΌ) относится к группе моногенных расстройств, которые приводят к развитию билатеральных кист почек, что, в конечном счете, приводит к почечной недостаточности. ΡΚΌ представляет собой самое распространенное из всех жизнеугрожающих генетических заболеваний, и во всем мире им страдает 12-15 миллионов человек. Существуют две основные формы ΡΚΌ: аутосомно-рецессивная (ΛΡΡΚΌ) и аутосомно-доминантная (АЭРО). ΛΡΡΚΌ представляет собой реже наследуемую форму заболевания, которая во многих случаях обусловливает значительную смертность в первые месяцы жизни. АКРО вызвана мутацией в гене ΡΚΗΌ1, тогда как АЭРО вызвана мутацией либо в гене РО1, либо РО2 (и поэтому эти формы обозначают как АЭРО типа 1 или типа 2). Эти единичные мутации приводят к решающим изменениям в способности клеток почечных канальцев поддерживать свою двухмерную полярность (расположение в органе) и контролировать свою пролиферацию. АЭРО представляет собой самое распространенное наследственное генетическое заболевание. Поскольку каждый индивидуум обладает одним нормальным аллелем, наследуемым от своего родителя, не являющегося носителем, доминантный мутантный ген не проявляет своего действия, пока нормальный аллель не утратился или не инактивировался. Таким образом, у некоторых пациентов симптомы появляются в детстве, тогда как у большинства симптомы возникают к 40 годам в зависимости от того, когда теряется нормальный аллель. Биохимический механизм, ответственный за клинические признаки, ассоциированные с РО, как полагают, связан с аномалиями кальциевых ионных каналов.

Как отмечено выше, РО отличается билатеральным формированием и ростом большого числа кист, которые приводят к изменению архитектуры почки, деформированным нефронам и почечной не- 2 025451 достаточности. При ΛΌΡΚΌ кисты образуются, когда пролиферация клеток почечных канальцев приводит к обструкции нормального тока в канальцах. Клетки почечных канальцев, которые формируют внутреннюю оболочку кист, сохраняют свои нормальные секреторные функции и наполняют кисты жидкостью, которая содержит большое число лигандов рецепторов (белков, участвующих в передаче сигнала), таких как ТОР-альфа и БОР (^ίίδοη §1 е! а1. 2006 ВюсЫт ВюрЬук Ас!а 1и1; 1762(7):647-55). Поскольку кисты расширяются, почки расширяются до 20-30 фунтов на поздней стадии заболевания.

Клиническая симптоматика у пациентов-людей, страдающих ΛΌΡΚΌ, включает боль в животе и почечную колику (поскольку кисты расширяются), гипертензию, кисты печени, гематурию, инфицирование и, в конце концов, почечную недостаточность. Специфическое лечение для предотвращения прогрессирования ΡΚΌ отсутствует (ОтапЫат Л 2008 ΝΕΙΜ 359: 1477-1485).

Аналогично, ΡΚΌ страдает приблизительно 38% персидских котов во всем мире, что делает его самым значительным наследственным заболеванием кошачьих (Уоипд АЕ е! а1 2005 Маттайап Оепоте 16:59-65). Оно имитирует заболевание человека и возникает на фоне мутации в гене ΡΚΌ1.

Сущность изобретения

Для лечения ΡΚΌ было предложено большое число стратегий, но применено лишь несколько. Авторы изобретения в настоящем документе предлагают способ лечения на основе ингибирования по меньшей мере четырех (4) киназ - трех рецепторных тирозинкиназ (НЕК1, НЕК2 и УЕОРК) и одной цитоплазматической тирозинкиназы (§КС). В предложении авторов подчеркивается необходимость таргетирования всех четырех киназ для достижения эффективного ингибирования прогрессирования ΡΚΌ.

Таким образом, в одном из аспектов изобретение относится к способам лечения ΡΚΌ с помощью соединений и композиций, описанных в настоящем документе.

В другом аспекте изобретение относится к применению соединения или композиции, описанных в настоящем документе, для получения лекарственного средства для лечения ΡΚΌ.

В другом аспекте изобретение относится к соединениям и композициям для лечения ΡΚΌ.

Эти и другие особенности и преимущества настоящего изобретения будут более подробно описаны ниже.

Подробное описание изобретения

Авторы изобретения установили, что соединение ХЬ-647 (также известное как ΡΚΙΜ-001 и ΚΌ019) и родственные соединения (которые описаны в патенте США 7576074, таким образом, приведенном в качестве ссылки в полном объеме) уникальны в таргетировании важнейших компонентов сигнального каскада ЕОРК, а также УЕОР-К, которые, как описано ниже, задействованы в ΡΚΌ. Таким образом, авторы изобретения установили, что такие соединения обеспечивают все необходимое ингибирование для лечения ΡΚΌ в одном соединении. Величина активности ХЬ-647 против каждой мишени такова, что позволяет прогнозировать меньшую дозу, чем использованная в клинических испытаниях при онкологических заболеваниях. ХЬ-647 менее токсичен, чем каждое из одиночных таргетирующих средств самостоятельно, и, очевидно, был бы менее токсичен, чем эти средства, использованные в комбинации. Применение ХЬ-647 при ΡΚΌ, поэтому, обеспечило бы активность широкого спектра против важных мишеней и добавило бы преимущество сниженной активности УЕОР-К и возможно улучшенного профиля безопасности в почке.

Более ранние описания значения рецептора эпидермального фактора роста (ЕОРК) в ΡΚΌ представлены в статьях Ии и ΧνίΕοη (Отап!йат Л 2008 ΝΡίΜ 359: 1477-1485; \νί1δοη ΡΌ е! а1. 1993 Еиг 1 Се11 Βίο1 1ип; 61 (1): 131-8; Ии 1 апб ΧνίΕοη ΡΌ 1995 Ат 1 Ρ^5ΐο1 Се11 Ρ^5ΐο1 269: С487-С495) и расширены авторами §хеепеу и Ахнет (§хеепеу \УЕ апй Ахнет ЕЙ 1998 Ат 1 Ρ1τν8ίο1 275:387-394). Линии клеток получали перекрестным скрещиванием мышей Ьрк (мышиная модель ΛΚΡΚΌ) и мыши ΙιηιηοτΙο (§хеепеу \УЕ е! а1. 2001 Ат 1 Ρ1ι\’8ίο1 Се11 Ρ1ινδίο1 281: 1695-1705). У этих животных развивались увеличенные кистозные почки, а также расширение желчных протоков, приводящие к почечной недостаточности и аномалиям печени. Линии клеток кист устанавливали ίη νίίτο и наблюдали смещение от заданного расположения ЕОРК на их апикальной поверхности. Это подтверждали ίη νίνο и аргументировали авторы \νί1δοη и Ии (ΑΊΕοη ΡΌ е! а1. 1993 Еиг ί Се11 Вю1 .Ып; 61(1): 131-8; Ли ί. аЫ ΑΊΕοη ΡΌ. 1995 Ат ί ГЬу8ю1 Се11 ГЬу8ю1 269: С487-С495), которые также продемонстрировали значение ТОР-альфа и ЕОР в пролиферации клеток почечных канальцев при ΡΚΌ. Более того, было показано, что кистозная жидкость человека содержит ЕОР и ТОР-альфа (\νί1δοη δί е! а1. 2006 ВюсЫт ВюрЬук Ас!а Ы1; 1762 (7): 647-55; Ейндет К. е! а1. 1992 Ат ί. 1<Ыпех Όίδ 19(1):22-30). Это смещение ЕОРК подтверждалось и на дополнительных моделях мышей, и на тканях человека при ΛΚΡΚΌ и ΛΌΡΚΌ (\νί1δοη ΡΌ е! а1. 1993 Еиг ί Се11 Вю1 Ып; 61(1): 131-8; Ои ί апб ^ί1δοη ΡΌ 1995 Ат ί ΡΠνδίο1 Се11 ΡΠνδίο1 269: С487-С495; Аунет ЕР апб §хеепеу \УЕ 1995 Ρеά^а!г Кек 37: 359А; Оге11апа §А е! а1. 1995 1<Ыпеу Ιη! 47: 490-499; ΡίΟιητύδ \УС е! а1. 1998 ί С1ш 1пуе§! 101:935-939). Ριΐβΐι е! а1. (Ριΐβΐι ίΌ е! а1. 1995 1<Ыпеу Ιη! 47: 774-781) дополнительно показали повышенные активности тирозинкиназы ЕОРК при ΡΚΌ. В заключение, перекрещивание гипоморфного аллеля ЕОРК (хауеб-2) у мышей с кистами, несущих мутацию мыши οτρΕ (Оак Ктбде Ρο1усу8!^с 1<Ыпеу). существенно снижало активность ЕОРК и образование кист (КтсЬагбк \УС е! а1 1998 ί Οίη 1пуе§! 101: 935-939). В последующих исследованиях показано возможное значение лигандов ЕОРК в прогрессировании заболевания, связанного с образованием кист. Как ЕОР, так и ТОР-альфа вовлечены в формирование кист ίη νί!το

- 3 025451 (РидЬ 1Ь с! а1. 1995 Ктйпсу Ιηΐ 47:774-781; Аупст ΕΌ апй 8\усспсу νΕ 1990 Рсй1а!г №рЫо1 4: 312-311; №ийе1й ТК с! а1. 1992 Ктйпсу Ιηΐ 41:1222-1236). В кистозных почках повышена экспрессия РНК ΕΟΡальфа, и кистозная жидкость почек у моделей РКЭ мышей и крыс содержала большое число пептидов ΕΟΡ в митогенных концентрациях (Ьо^йсп ΌΆ с! а1. 1994 1 1аЬ С’Пп Мей 124, 386-394).

Поскольку точный механизм, с помощью которого мутантные гены при РКЭ приводят к аномалиям ЕОРК, не охарактеризован в достаточной степени, было логично оценить влияние ингибирования ЕОРК на развитие кист на моделях грызунов с РКЭ. Авторы 8\усспсу е! а1. (8\усспсу νΕ е! а1. 2000 К1йпеу Ιη! 57:33-40) показали, что обработка мышей Ьрк с помощью ингибитора киназы ЕОРК (ΕΚΙ-785) оказалась эффективной в предотвращении прогрессирования РКЭ. Животные, поддерживаемые на ΕΚΙ-785, выжили в течение длительных периодов, но заболевание прогрессировало при отмене лекарственного средства (8\усспсу с! а1. 2000 Ктйпсу Щ 57: 33-40). Эта находка подтвердилась при использовании двух различных ингибиторов ΕΟΡΚ.

Доказательство роли ΕΟΡΚ в РКЭ дополнительно подтверждалось демонстрацией того, что ингибирование высвобождения лиганда ΕΟΡΚ также может облегчать РКЭ. Обработка мышей Ьрк с помощью ингибитора ТАСЕ (ΤΝΡ-альфа-превращающего фермента) привела к решающему снижению размера почки и увеличению продолжительности жизни животного (Эс11 КМ с! а1. 2001 Ктйпсу Щ 60: 12401248). ТАСЕ является членом семейства ферментов металлопротеиназ, функция которых заключается в обработке препропептидов, чтобы дать возможность отрезать активный пептид. При РКЭ ингибирование фермента ТАСЕ ΑΌΑΜ-17 снижает высвобождение ТОР-альфа, приводя к снижению активации ΕΟΡΚ.

Последующие анализы ХУПюп с! а1. (^Й8оп §1 с! а1. 2006 ВюсЫт ВюрЬу8 Ас!а 1и1; 1762(7): 647-55) дополнительно показали значение ΗΕΚ-2 как участника смещения комплекса ΕΟΡΚ. В некоторых моделях на животных ΗΕΚ-2, по-видимому, является доминантным ΕΟΡΚ, индуцирующим пролиферацию клеток почечных канальцев. Крыса РСК представляет собой такую модель, у которой специфические ингибиторы ΗΕΚ-2 (было протестировано два) эффективны в предотвращении развития РКЭ. Некоторые авторы полагают, что гетеродимеры и ΗΕΚ-1 и ΗΕΚ-2 представляют собой основной фактор в прогрессировании заболевания (^йкоп §1 с! а1. 2006 ВюсЫт ВюрЬук Ас!а 1и1; 1762(7): 647-55). Таким образом, бифункциональный ингибитор киназ ΗΕΚ-1/ΗΕΚ-2 вероятно оказался бы более эффективным в лечении.

Активация ΕΟΡΚ приводит к каскаду реакций, которые, в конечном счете, влияют на факторы транскрипции ДНК и продукцию белка. Один из важнейших элементов в реакциях передачи сигнала с ΕΟΡΚ опосредуется цитоплазматическим ферментом §РС. Если ингибирование домена киназы ΕΟΡΚ ингибирует прогрессирование заболевания, то логично, что такой же результат мог бы наблюдаться при ингибировании участника сигнального пути, например, 8ΚΟ 8ΚС выбирали в качестве мишени, поскольку он действует за счет влияния на большое число стадий по меньшей мере в двух сигнальных путях (ΜΕΚ/ΕΚΚ и РΚΑ/ЬΚΑΡ). Кроме того, известно, что §РС содействует активности ΕΟΡΚ и усиливает фосфорилирование последующих мишеней в сигнальном пути (Вто^тап РА с! а1 2004 Опсодспе 23: 7957-68; Возков^ Κ. 2005 ВюсЬет ВюрЬук Рс5 Соттип 331: 1-14). §РС также стимулирует активацию ММР на клеточной мембране и усиливает высвобождение лиганда. Обработка мышей Ьрк или крысы РСК с помощью ингибитора 8ΚС §ΚΙ-606 уменьшила образование кист в почках и аномалии желчевыводящих путей в модели грызунов, зависимой как от ΗΕΚ-1, так и от ΗΕΚ-2 (^8^8^ Κ. 2005 ВюсЬет ВК орЬуз Ес8 Соттип 331: 1-14). Ингибирование §РС также коррелирует со снижением повышенного уровня сАМР (^8^8^ Κ. 2005 ВюсЬет ВюрЬуз Рез Соттип 331: 1-14).

νΕΟΡ имеет основное значение в ангиогенезе в процессе заживления раны и формирования опухоли. Лиганд νΕΟΡ вырабатывается в ответ на гипоксию и продукцию ΗΙΡΊ-альфа. νΕΟΡ присутствует в кистозной жидкости при РКЭ и, как полагают, является ответом на гипоксию, созданную механической деструкцией и сжатием сосудов, вызванными кистами. νΕΟΚ-1 и νΕΟΚ-2 присутствуют в эндотелиальных клетках почек, и полагают, что активация пути νΕΟΡ содействует росту кист, способствуя неоваскуляризации способом, аналогичным предполагаемому для опухолей. Поэтому ингибирование νΕΟΡΚ предотвратило бы рост сосудов и уменьшило расширение кист в почках.

Было показано, что отдельные ингибиторы киназ, активные против ΗΕΚ-1, ΗΕΚ-2 или 8ЕС (\УЙ8оп 81 с! а1. 2006 ВюсЫт ВюрЬу8 Ас!а 1и1; 1762 (7): 647-55; Ьо^йсп ΌΑ с! а1. 1994 1. ЬаЬ. С1ш. Мей. 124, 386394; 8\усппсу νΕ с! а1. 2008 1 Ат 8ос №рЬго1 19: 1331-1341), действуют в моделях РКЭ у грызунов. Настоящее изобретение основано на положении, что сочетание агентов оказалось бы клинически более эффективным и при меньших дозах. Применение комбинированной терапии имеет прецедент в онкологии, где одиночные агенты почти никогда не используются. В действительности, этот принцип был доказан экспериментами на модели РКО при обработке авторами животных с помощью комбинации ингибиторов ΕΟΡΚ (ЕКВ-569) и ТАСЕ. Поскольку ингибитор ΕΟΡΚ оказался эффективен в уменьшении образования кист и поддержании нормального функционирования почки, добавление ингибитора ТАСЕ позволило снизить дозу ЕКВ-569 на 67%, при этом достигнув эффекта, равного действию ЕКВ-569 самостоятельно в более высокой дозе (8\усспсу νΕ с! а1. 2003 К1йпсу Щ 64: 1310-1319).

Несмотря на то, что теоретически в комбинированной терапии можно было бы использовать простое соединение лекарственных средств, которые по отдельности нацеливают ΗΕΚ-1, ΗΕΚ-2, 8ΚС и νΕΟΡ-Κ, это маловероятно обнаружить на практике вследствие сложности регламентирования и ком- 4 025451 мерческих ограничений. Кроме того, спектр киназной активности был бы крайне широк, приводя к повышенному риску токсичности. Например, комбинация лапатаниба с сунитинибом не только влияла бы на ЕКВ-1, ЕКВ-2 и УЕОР-К, но также нацеливала бы ЕКК-1, ЕКК-2, АКТ, циклин-Ό, ΡΌΟΡΚ, сК1Т и РЬТ-3, не влияя на 8КС. При добавлении к этой комбинации дастиниба она влияла бы на 8КС, а также АВЬ и вероятно увеличила бы токсичность из-за избыточного ингибирования сК1Т и ΡΌΟΡΚ Более того, клинические испытания исследований этих комбинаций были бы крайне сложными и вероятно неосуществимыми за какой-либо приемлемый период времени. Например, каждое лекарственное средство обладает различными характеристиками РК/РЭ. и может произойти наложение токсичностей, что осложнит схемы приема. В заключение, стоимость комбинации трех или четырех агентов от различных производителей может быть чрезмерно высока.

Авторы обнаружили, что ХЬ-647 и родственные соединения могут таргетировать НЕК-1, НЕК-2, 8КС и УЕОР-К и поэтому избавить от необходимости комбинированной терапии и преодолеть осложнения, ассоциированные с ней.

Таким образом, в одном из аспектов изобретение относится к способам лечения РКО с помощью ХЬ-647 или родственного соединения и их фармацевтически приемлемых композиций. Такие фармацевтически приемлемые композиции содержат ХЬ-647 или родственное соединение и фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель и/или эксципиент. В некоторых вариантах осуществления носитель представляет собой воду. В других вариантах осуществления носитель отличается от воды.

Способы по изобретению включают введение терапевтически эффективного количества ХЬ-647 или родственного соединения (или его фармацевтически приемлемой соли) млекопитающему, страдающему РКО. В одном из вариантов осуществления ХЬ-647 или родственное соединение находится в форме фармацевтически приемлемой композиции. В некоторых вариантах осуществления млекопитающее представляет собой человека. В других вариантах осуществления млекопитающее представляет собой животное из семейства кошачьих, такое как персидский кот.

В другом аспекте изобретение относится к применению соединения или композиции, описанных в настоящем документе, для получения лекарственного препарата для лечения РКО у млекопитающего, такого как человек или животное из семейства кошачьих, в частности персидский кот.

В другом аспекте изобретение содержит соединения и композиции для применения в лечении РКО у млекопитающего, такого как человек или животное из семейства кошачьих, в частности персидский кот.

ХЬ-647 представляет собой Ы-(3,4-дихлор-2-фторфенил)-7-({[(3аК,5г,6а8)-2-метилоктагидроциклопента[с]пиррол-5-ил]метил}окси)-6-(метилокси)хиназолин-4-амин:

Он может быть синтезирован согласно способам, описанным в патенте США 7576074 (см. пример 14). Указанные выше и использованные в настоящем документе родственные соединения представляют собой соединения, описанные в патенте США 7576074, формулы I

или их фармацевтически приемлемые соль, гидрат или пролекарство, где

К¹ представляет собой С1 -С₃ алкил, необязательно замещенный одним-тремя заместителями К

К² выбирают из -Н, галогена, тригалогенметила, -СЫ, -ΝΗ2, -ΝΟ2, -ОК³, -Ы(К³)К⁴, -8(О)0-2К -8О₂Ы(К³)К⁴, -СО2К³, -С(=О)Ы(К³)К⁴, -Ы(К³)8О2К⁴, -Ы(К³)С(=О)К³, -Ы(К³)СО₂К⁴, -С(=О)К³, необязательно замещенного низшего алкила, необязательно замещенного низшего алкенила и необязательно замещенного низшего алкинила;

К³ представляет собой -Н или К⁴;

К⁴ выбирают из необязательно замещенного низшего алкила, необязательно замещенного арила, необязательно замещенного низшего арилалкила, необязательно замещенного гетероциклила и необязательно замещенного низшего гетероциклилалкила; или

К³ и К⁴, взятые вместе с общим азотом, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенный пяти-семи-членный гетероциклил, причем указанный необязательно замещенный пяти-семи- 5 025451 членный гетероциклил необязательно содержит по меньшей мере один дополнительный гетероатом, выбранный из Ν, О, δ и Р;

с| имеет значения от нуля до пяти;

Ζ выбирают из -ОСН₂-, -Ο-, -δ(Ο)_0-2-, -Ы(К⁵)СН₂- и -ΝΚ⁵-;

К⁵ представляет собой -Н или необязательно замещенный низший алкил;

М представляет собой -Н, С1-С₈ алкил-Ь -Ь -, необязательно замещенный на К , О(СН₂)_0-3- или К (К⁵⁴)Ы(СН₂)_0-3-; где О представляет собой насыщенный пяти-семи-членный гетероциклил, содержащий один или два кольцевых гетероатома и необязательно замещенный одним-тремя заместителями К⁵⁰;

Ь¹ представляет собой -С=О- или -δΟ₂-;

Ь² представляет собой прямую связь, -О-, или -ΝΗ- и

К⁵³ и К⁵⁴ представляют собой независимо С1-С3 алкил, необязательно замещенный одним-тремя заместителями К⁵⁰;

М² представляет собой насыщенный или моно- или полиненасыщенный С₃-С₁₄ моно- или слитый полициклический гидрокарбил, необязательно содержащий один, два или три кольцевых гетероатома в одном кольце и необязательно замещенный заместителями К⁵ М³ представляет собой -ΝΚ⁹-, -О- или отсутствует;

в количестве от нуля до четырех; и

М⁴ представляет собой -СН₂-, -СН₂СН₂-, -СН₂СН₂СН₂- или отсутствует;

К⁹ представляет собой -Н или необязательно замещенный низший алкил;

К⁵⁰ представляет собой -Н, галоген, тригалогенметил, -ОК³, -Ν(Κ³)Κ⁴, -δ(Ο)_0-2Κ⁴,

-СО₂К³, ΥΕΟ)^^)^, С(=ЫК²⁵)Ы(К³)К⁴, -С(=ЫК²⁵)К⁴, -ΝζΡ^δΟ^⁴, -^К^С^К³, -Ν^^³, -С( С))1К необязательно замещенный алкокси, необязательно замещенный низший алкил, необязательно замещенный арил, необязательно замещенный низший арилалкил, необязательно замещенный гетероциклил и необязательно замещенный низший гетероциклилалкил; или два К⁵⁰, взятые вместе на одном и том же углероде, представляют собой оксо; или два К⁵⁰, взятые вместе с общим углеродом, к которому они присоединены, образуют необязательно замещенный трех-семи-членный спироциклил, причем указанный необязательно замещенный трех-семичленный спироциклил необязательно содержит по меньшей мере один дополнительный гетероатом, выбранный из Ν, О, δ и Р; и

К²⁵ выбирают из -Н, -ΟΝ, -ΝΟ2, -ΟΡ³. -δ(Ο)0-2% ΥΟ^³, необязательно замещенного низшего алкила, необязательно замещенного низшего алкенила и необязательно замещенного низшего алкинила, и к ним относятся подроды и виды, описанные в патенте США 7576074.

ХЬ-647 является эффективным терапевтическим средством в ключевой модели на мышах, модели ВРК АКРКЭ. Модель ВРК АКРКЭ сохраняет ту же измененную локализацию БОРК, которая наблюдается при ΑΌΡΚΌ мыши и человека. Эта модель поэтому широко используется в качестве основного способа влияния на аномальность ЕОРК при ΡΚΌ, как АКРКЭ, так и ΑΏΡΚΌ. Модель ВРК возникла в результате спонтанной мутации в инбредной колонии мышей ВАЬВ/с. У гомозиготных мышей Ьрк развиваются массивно расширенные почки и смерть от почечной недостаточности в среднем постнатальном возрасте 24 дней (ΡΝ-24). В среднем без лечения смерть животных наступает в возрасте 25 дней с диапазоном 21-29 дней. К внепочечным проявлениям относятся пролиферация желчевыводящих путей и расширение протоков. Вследствие рецессивного характера заболевания мыши дикого типа +/+ и гетерозиготы Ьрк/+ являются фенотипически нормальными. Основным измерением, использованным в этих исследованиях, является сравнение соотношения массы почек к массе тела (Κ^ν/Β^ν). Было показано, что это соотношение неизменно дает точную оценку эффективности лечения ΡΚΌ. К дополнительным измерениям относятся оценка функции почек (ΒυΝ, креатинин и МиСА) и гистологическая оценка размера почек и индекс кист собирательных трубочек (СТ-С1).

В модели мышей Ьрк, описанной ниже, обработка с помощью ХЬ-647 снизила соотношение массы почек к массе тела по сравнению с необработанными животными на 21,5% при дозе 7,5 мг/кг через день, 36,7% при дозе 15,0 мг/кг через день и 41,19% при дозе 15,0 мг/кг в день. Эти соотношения сопоставимы или превосходят соотношения, показанные в экспериментах с одиночными агентами (δη: 1иЫЬбюп атеЬотакез Ρо1усу8ΐ^с Шбпеу Экзеазе, 1 Ат δοс №рЬго1 19: 2008, рр. 1331-1341; Тгеактепк о£ ΡΚΌ χνίΐΐι а поуе1 кутозше кшазе 1пНкЬкког, Шбпеу ЬИегнабопак Уо1. 57, 2000, рр.33-40). Обработка с помощью ХЬ647 уменьшила массу почек на 21,8% при дозе 7,5 мг/кг в день и 40,3% при дозе 15 мг/кг в день. Кроме того, ΒυΝ снизился на 42 и 60,5%, креатинин на 8,3 и 25%, тогда как МЬСА улучшился на 20,1 и 66,2% (соответственно при дозе 7,5 мг/кг в день и 15 мг/кг в день). Индекс СТ-С1 упал на 25 и 45,8%, соответственно. Эти находки показывают, что ХЬ-647 представляет собой эффективное средство предотвращения прогрессирования ΡΚΌ.

Аналогично, ХЬ-647 представляет собой эффективное терапевтическое средство в модели грызунов, модели крысы РСК. Обработка с помощью ХЬ-647 снизила массу почек на 13,4% при дозе 7,5 мг/кг в день и 26,0% при дозе 15 мг/кг в день. Это соответствовало дозозависимому снижению соотношения Κ\ν/Β\ν у обработанной крысы РСК (больной). СТ-С1 снижался на 19,6 и 35,7% соответственно, при 7,5 мг/кг в день и 15 мг/кг в день. Уровень ΒυΝ упал на 19,2% при дозе 7,5 мг/кг в день и 28,8% при дозе 15 мг/кг в день.

- 6 025451

Введение ХЬ-647 или родственного соединения или их фармацевтически приемлемых солей в чистом виде или в подходящей фармацевтической композиции может быть осуществлено путем любого приемлемого способа введения средств для подобных применений. Таким образом, введение может быть, например, пероральным, назальным, парентеральным (внутривенным, внутримышечным или подкожным), местным, трансдермальным, интравагинальным, внутрипузырным, внутрь кисты или ректальным в твердом виде, полужидком виде, в форме лиофилизированного порошка или жидких лекарственных форм, таких как, например, таблетки, свечи, пилюли, мягкие эластичные и твердые желатиновые капсулы, порошки, растворы, суспензии или аэрозоли или подобное, предпочтительно в стандартных лекарственных формах, подходящих для простого введения точных доз.

Композиции должны включать принятый фармацевтический носитель или эксципиент и соединение по изобретению в качестве активного агента, кроме того, могут включать другие медикаментозные агенты, фармацевтические агенты, носители, наполнители и т.д. Композиции по изобретению могут быть использованы в комбинации с противораковыми или другими агентами, которые обычно вводятся пациенту, получающему лечение по поводу рака. К наполнителям относятся консервирующие, увлажняющие, суспендирующие агенты, подсластители, агенты, придающие вкус, запах, эмульгирующие и диспергирующие агенты. Предохранение от действия микроорганизмов может быть достигнуто большим числом антибактериальных и противогрибковых агентов, например парабенами, хлорбутанолом, фенолом, сорбиновой кислотой и подобным. Также может быть желательно включение изотоничных агентов, например сахаров, хлорида натрия и подобных. Пролонгированное всасывание инъекционной фармацевтической формы может быть достигнуто применением агентов, замедляющих всасывание, например, моностеарата алюминия и желатина.

При желании фармацевтическая композиция по изобретению также может содержать минорные количества вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие агенты, рНзабуферивающие агенты, антиоксиданты и подобные, такие как лимонная кислота, монолаурат сорбитана, олеат триэтаноламина, бутилгидрокситолуол и т.д.

Композиции, подходящие для парентерального введения, могут содержать физиологически приемлемые стерильные водные или неводные растворы, дисперсии, суспензии или эмульсии и стерильные порошки для восстановления в стерильные инъекционные растворы или дисперсии. К примерам подходящих водных и неводных носителей, разбавителей, растворителей или носителей относятся вода, этанол, полиолы (пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, глицерин и подобное), их подходящие смеси, растительные масла (такие как оливковое масло) и инъецируемые органические сложные эфиры, такие как этилолеат. Подходящее состояние текучести может поддерживаться, например, применением покрытия, такого как лецитин, поддержанием требуемого размера частиц в случае дисперсий и применением поверхностно-активных веществ.

Одним из предпочтительных путей введения является пероральный, используя принятую схему ежедневного приема, которая может быть скорректирована согласно степени тяжести заболеваниясостояния, подвергаемого лечению.

К твердым лекарственным формам для перорального введения относятся капсулы, таблетки, пилюли, порошки и гранулы. В таких твердых лекарственных формах активное соединение смешивают по меньшей мере с одним инертным принятым эксципиентом (или носителем), таким как цитрат натрия или фосфат дикальция, или (а) наполнителями или сухими разбавителями, как например, крахмалы, лактоза, сахароза, глюкоза, маннит и кремниевая кислота, (Ь) связующими средствами, как например, производные целлюлозы, крахмал, альгинаты, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и аравийская камедь, (с) увлажнителями, как например, глицерин, (б) рассасывающимися агентами, как например, агар-агар, карбонат кальция, картофельный или маниоковый крахмал, альгиновая кислота, кроскармеллоза натрия, комплексные силикаты и карбонат натрия, (е) замедлителями растворения, как например, парафин, (Т) усилителями всасывания, как например, четвертичные аммониевые соединения, (д) увлажняющими агентами, как например, цетиловый спирт и моностеарат глицерина, стеарат магния и подобное, (й) адсорбентами, как например, каолин и бентонит, и (ί) смазывающими веществами, как например, тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердые полиэтиленгликоли, лаурилсульфат натрия или их смеси. В случае капсул, таблеток и пилюлей лекарственные формы также могут содержать забуферивающие агенты.

Твердые лекарственные формы, описанные выше, могут быть получены в оболочках и патронах, таких как кишечно-растворимые и другие оболочки, хорошо известные в данной области. Они могут содержать смягчающие агенты, а также могут быть сделаны из такой композиции, в которой они высвобождают активное соединение или соединения в определенном участке кишечного тракта замедленным образом. Примерами встроенных композиций, которые могут быть использованы, являются полимерные вещества и воски. Активные соединения также могут присутствовать в микроинкапсулированной форме при желании с одним или несколькими из вышеупомянутых эксципиентов.

К жидким лекарственным формам для перорального введения относятся фармацевтически приемлемые эмульсии, растворы, суспензии, сиропы и эликсиры. Такие лекарственные формы получают, например, путем растворения, диспергирования и т.д. соединения(й) по изобретению или его(их) фарма- 7 025451 цевтически приемлемой соли и необязательно фармацевтических наполнителей в носителе, таком как, например, вода, физиологический раствор, водная декстроза, глицерин, этанол и подобное; солюбилизирующих агентов и эмульгаторов, как например, этиловый спирт, изопропиловый спирт, этилкарбонат, этилацетат, бензиловый спирт, бензилбензоат, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, диметилформамид; масел, в частности, хлопкового масла, арахисового масла, масла из зародышей кукурузы, оливкового масла, касторового масла и кунжутного масла, глицерина, тетрагидрофурфурилового спирта, полиэтиленгликолей и жирнокислотных эфиров сорбитана; или смесей этих веществ и подобных, таким образом, формируя раствор или суспензию.

Суспензии помимо активных соединений могут содержать суспендирующие агенты, как например, этоксилированные изостеариловые спирты, полиоксиэтиленсорбит и сложные эфиры сорбитана, микрокристаллическая целлюлоза, метагидроксид алюминия, бентонит, агар-агар и трагант или смеси этих веществ и подобное.

Композиции для ректального введения представляют собой, например, свечи, которые могут быть получены смешиванием соединений по настоящему изобретению, например, с подходящими не вызывающими раздражения эксципиентами или носителями, такими как масло какао, полиэтиленгликоль или воск для свечей, которые являются твердыми при обычных температурах, но жидкими при температуре тела и поэтому плавятся в подходящей полости тела и высвобождают в ней активный компонент.

К лекарственным формам для местного нанесения соединения по настоящему изобретению относятся мази, порошки, спреи и ингалируемые средства. Активный компонент смешивают в стерильных условиях с физиологически приемлемым носителем и любыми консервантами, буферами или пропеллентами, которые могут потребоваться. В объеме настоящего изобретения также рассматриваются препаративные формы для глаз, глазные мази, порошки и растворы.

В целом, в зависимости от намеченного пути введения фармацевтически приемлемые композиции будут содержать от около 1 до около 99 мас.% соединения(й) по изобретению или его(их) фармацевтически приемлемой соли и от 99 до 1 мас.% подходящего фармацевтического эксципиента. В одном из примеров композиция будет содержать между около 5 и около 75 мас.% соединения(й) по изобретению или его(их) фармацевтически приемлемой соли, причем остальные составляющие представляют собой подходящие фармацевтические эксципиенты.

Существующие способы получения таких лекарственных форм известны или будут понятны специалистам в данной области; например, см. руководство КетшдЮп'к РЬагтасеиЬса1 Зс1спес5. 18'¹' ЕЛ., (Маск РиЫЫипд Сотрапу, Еак(оп, Ра., 1990). Вводимая композиция в любом случае должна содержать терапевтически эффективное количество соединения по изобретению или его фармацевтически приемлемой соли для лечения заболевания-состояния в соответствии с идеями настоящего изобретения.

Соединения по изобретению или их фармацевтически приемлемые соли вводят в терапевтически эффективном количестве, которое будет варьировать в зависимости от большого числа факторов, к которым относятся активность использованного специфического соединения, метаболическая стабильность и длительность действия соединения, возраст, масса тела, общее состояние здоровья, пол, диета, способ и время введения, скорость выведения, комбинация лекарственных средств, тяжесть конкретных заболеваний-состояний и хозяин, подвергаемый лечению. Соединения по настоящему изобретению могут быть введены пациенту при уровнях доз в диапазоне от около 0,1 до около 1000 мг в день. Для нормального взрослого человека с массой тела около 70 кг примером является доза в диапазоне от около 0,01 до около 100 мг на килограмм массы тела в день. Конкретная использованная доза, тем не менее, может отличаться. Например, доза может зависеть от большого числа факторов, к которым относятся потребности пациента, тяжесть состояния, подвергаемого лечению, и фармакологическая активность используемого соединения. Определение оптимальных доз для конкретного пациента хорошо известно специалистам в данной области.

Примеры

Типичные ίη νίίΓΟ и ίη νίνο протоколы можно найти в статье ОепЛгеаи 8В, УеШпга К, Кеак( Р, е1 а1., 1п1пЬШоп οί (Не Т790М Оа(екеерег Ми(ап( οί (Ье Ер1Легта1 Сго\\(Ь Рас(ог Кесер(ог Ьу ЕХЕЬ-7647, СЬп Сапсег Кек 3713, 13(12) (2007), которая, таким образом, приводится в качестве ссылки в полном объеме.

Получение соединения

Для анализов ш уЬго получали матричный раствор ХЬ-647 в концентрации 10 ммоль/л в ΌΜδΟ и разбавляли в буферах или культуральной среде, оптимальных для анализа. Конечная концентрация ΌΜδΟ для анализа не превышала 0,3% (об./об.) Для исследований ш νί\Ό ХЬ-647 смешивали для перорального введения путем растворения сухого порошка, либо НС1, либо соли тозилата, в стерильном профильтрованном (0,45 мкм; продукция фирмы №1де Ыипс 1п(егпаЬопа1) физиологическом растворе (0,9% υδΡ, продукция фирмы Вах(ег Согр.) или в стерильной воде (продукция фирмы Вах(ег). Для разрушения крупных частиц все соединения смешивали на вортексе и обрабатывали ультразвуком в водяной бане. Все дозированные растворы/суспензии готовили свежими ежедневно.

Пример 1. Модель ВРК ΑΚΡΚΌ

Эффективность ХЬ-647 в лечении ΑΚΡΚΌ испытывали, используя модель ВРК ΑΚΡΚΌ Мыши Ьрк обладают характеристиками мышей ВАЬВ/с и содержат ту же мутацию в гене ЕОРК, которая наблюда- 8 025451 ется при ΛΌΡΚΌ мыши и человека. Этих животных помещали в виварий медицинского колледжа Висконсина. Все эксперименты на животных проводили в соответствии с принципами руководства Национальных институтов здоровья по содержанию и использованию лабораторных животных и Комитета по содержанию и использованию животных института медицинского колледжа Висконсина.

Начиная с постнатального дня 7 (ΡΝ-7) полным пометам от доказанных гетерозиготных по Ьрк производителей, включающим гомозиготных (больных), а также гетерозиготных животных и животных дикого типа, вводили ХЬ-647 через день в дозе по 7,5 или 15 мг/кг или ежедневно по 15 мг/кг. Животных обрабатывали с ΡΝ-7 по ΡΝ-21 и оценивали в продолжение заболевания. Идентичность животных Ьрк+/+ может быть без труда определена посмертно за счет наличия сильно расширенных почек. На ΡΝ-21 исследование заканчивали и животных забивали. Определяли массу каждого животного. Обе почки от каждого животного вырезали и взвешивали. Соотношение массы почек к массе тела (Κ^ν/Β^ν) определяли по следующей формуле:

К^/В^=[масса обеих почек]/[масса животного].

Кроме того, рассчитывали индекс кист почек (С1). Лектины, специфичные для проксимальных канальцев (РТ) (1о1и8 1е1тадопо1оЬи8 [ЬТА] и собирательных трубочек (СТ) (ΌοΙίοΗοδ ЬШотик адд1и1ш8 [ΌΒΑ]), окрашивали и использовали для оценки тяжести кистозных расширений по шкале от 0 до 5. Функцию почек оценивали, получая уровни ΒυΝ и креатинина посредством пункции сердца. МиСА измеряли после выдерживания животных без воды в течение 12 ч.

Результаты, представленные в табл. 1, демонстрируют, что ХЬ-647 существенно уменьшил массу почек у мышей Ьрк, обработанных 21,8% (7,5 мг/кг в день: 1,61±0,23) и 40,3% (15 мг/кг в день: 1,28±0,09). Κν/Βν с помощью обработки упал на 21,5% (7,5 мг/кг в день: 15,34±1,26) и 36,7% (15 мг/кг в день). Уменьшенный размер почек также отражает сниженный СТ-С1 у обработанных мышей Ьрк на 25 и 45,8%, соответственно, при 7,5 мг и 15 мг/кг в день.

Таблица 1. Масса и морфология почек у обработанных ΡΚ.ΙΜ-001 и контрольных мышей ВАЬВ/С и мышей Ьрк на день ΡΝ 21

Параметр	Мыши ВАЬВ/С (Ν)		Мыши Ьрк(М)
Плацебо (N=8)	Носитель (N“8)	7 5 мг/кг/ день (Ν-7)	15 мг/кг/ день (N7)	Плацебо (Ν-8)	Носитель (N=14)	7 5 мг/кг/ ΑβΗϋ(Ν=7)	15 мг/кг/ день(К=10)
Масса тела (г)	1021 ±0 23	10 83 ±0 79	10 67 ±0 93	1006 ±0 26		10 35 ±0 52	10 52 ±0 64	1046 ±1 16	9 96 ±0 47
Масса почек (г)	0.15 ±0 01	0 16 ±0 01	014 ±0 02	0 13 ±001		2 04 ±0 27	2 06 ±0 30	1 61 ±0 23	1 28± 0 09
Масса почек/ масса тела (%)	142 ±0 06	145 ±0 06	133 ±0 07	1 25 ±0 10		19 71 ±2 00	19 53 ±1 76	15 34 ±1 26	12 36 ±1 14
СТ-С1т	0	0	0	0		4 60 ±0 55	4 80 ±0 45	3 60 ±0 55	2 60 ±0 55

Величина р для мышей Ьрк, обработанных носителем, против мышей Ьрк, обработанных ХЬ-647: *р<0,05; **р<0,001

Результаты в табл. 2 показывают, что обработка с помощью ХЬ-647 существенно улучшает функцию почек. Уровни ΒυΝ снизились на 42,0% при дозе 7,5 мг/кг в день и на 60,5% при дозе 15 мг/кг в день, тогда как уровни креатинина снизились на 8,3 и 25% соответственно. Улучшение показателей МиСА у мышей Ьрк, обработанных с помощью ХЬ-647, составило 20,1 и 66,2% соответственно. Для подтверждения эффективности ХЬ-647 использовали анализ вестерн-блот.

Таблица 2. Оценка функции почек у мышей, обработанных ΡΚΙΜ-001, и контрольных мышей ΒΛΕΒ/С и мышей Ьрк на день ΡΝ 21

Параметр	Мыши ВАЬВ/С (Ν)		Мыши Ьрк (Ν)
Плацебо	Носитель	7 5 мг/кг/день	15 мг/кг/день	Плацебо	Носитель	7 5 мг/кг/день	15 мг/кг/день
Β11Ν (мг/дл)	21 13 ±2 23 (8)	1938 ±106 (8)	1900 ±2 24 (7)	1929 ±1.60 (7)		1044 ±25 56 (8)	109 3 ±18.80 (14)	63 43 ±24 28 (7)	43 20 ±13.99 (Ю)
креатинин (мг/дл)	0 28 ±010 (8)	0 24 ±005 (8)	0 24 ±0 05 (Д	0 29 ±007 (7)		0 56 ±0 12 (8)	0 48 ±011 (14)	044 ±0 10 (7)	0 36 ±0 10 (10)
мисд (мОсмоль)	1080 ±52 4 (6)	1044 ±35 8 (5)	1029 ±50 1 (4)	1029 ±28 7 (4)		487 5 ±105 1 (7)	466 3 ±93 8 (8)	560 0 ±71 3 (4)	775 0 ±100 5 (6)

Величина р для больных мышей, обработанных носителем, против мышей, обработанных ХЬ-647: *р<0,05; **р<0,001

- 9 025451

Пример 2. Модель РСК

ХЬ-647 использовали в модели крыс РСК, ортологичной модели ΆΚΡΚΌ, для определения его эффективности в ингибировании ЕгЬВ2. Фенотип крысы РСК отличается от такового людей тем, что он обладает более замедленным прогрессированием заболевания и более медленным ухудшением функции почек. Крысы РСК произошли от мутировавшей колонии крыс Зргас.]ис-Ба\у1су из Университета здоровья Рп)йа и содержались в медицинском колледже Висконсина. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с принципами руководства ΝΙΗ по содержанию и использованию лабораторных животных и Комитета по содержанию и использованию животных института медицинского колледжа Висконсина.

С ΡΝ30 до ΡΝ90 крысы (больные) РСК получили ХЬ-647 в дозе 7,5 и 15 мг/кг/день через зонд. Через два часа после последней инъекции на ΡΝ90 крыс забивали и почки и печень извлекали и взвешивали. Посмертные показатели включили соотношение Κ\ν/Β\ν и кистозный индекс (С1), используя срезы почек из коркового слоя, мозгового слоя и сосочка. Затем определяли СТ-С1, исходя из кистозного индекса, который основывали на размере кист почек в 15-дневные интервалы с ΡΝ0 по ΡΝ135. Функцию почек оценивали по уровням ΒυΝ и креатинина при пункции сердца.

В табл. 3 показано, что у крыс РСК, обработанных с помощью ХЬ-647, наблюдалось существенное снижение соотношения Κ\ν/Β\ν с соответствующим снижением массы почек на 13,4% (7,5 мг/кг ежедневно: 5,77±0,47) и 26,0% (15 мг/кг ежедневно: 4,93±0,42). При снижении размера почек наблюдается уменьшение кист в СТ. В табл. 3 показано, что обработка с помощью ХЬ-647 снижает СТ-С1 на 19,6% и 35,7% для 7,5 мг и 15 мг/кг ежедневно соответственно.

Таблица 3. Масса и морфология почек у контрольных крыс ЗБ и крыс РСК, обработанных носителем и ΡΚΙΜ-001, на день ΡΝ 90

Параметр	Крыса 5ϋ (плацебо) (N=12)	Крыса 30 (носитель) (N=10)	Крыса РСК (плацебо) (N=6)	Крыса РСК (плацебо) (N=12)	Крыса РСК (7 5мг/кг/день) (N=8)	Крыса РСК (15мгЛг/день) (N=8)
Масса тела (г)	355 9412 58	369 8419 46	394 2423 11	393 84=21 01	384 54=23 69	37 9 44=15 39
Масса почек (г)	3 4440 45	3 5840 25	6 8740 26	6 6640 60	5 774=0 47	4 9340 42
Масса почек/ масса тела (%)	0 9640 10	0 9740 04	1 74±0 05	1 69±0 08	1 540 08	1 31±0 08
СТ-С1	ΝΑ	ΝΑ	7 17±0 75	700±0 60	5 63±0 74	4 5040 92

*Величина р при обработке носителем крыс ЗБ против крыс РСК: р<0,001;

** величина р для крыс РСК, обработанных носителем, против обработанных ΡΚΙΜ-00Ι: р<0,05; *** величина р для крыс РСК, обработанных носителем, против обработанных ΡΚΙΜ-001: р<0,001

В табл. 4 представлены показатели функции почек. У крыс РСК, которые получили лечение, снизились уровни ΒυΝ на 19,2% (7,5 мг/кг ежедневно: 27,50±3,74) и 28,8% (15 мг/кг ежедневно: 24,25±4,3). Анализ вестерн-блот использовали для подтверждения и валидизации эффективности ХЬ-647.

Таблица 4. Клинические химические параметры почек у контрольных крыс ЗБ и крыс РСК, обработанных носителем и ΡΚΙΜ-001, на день ΡΝ 90

Параметр	Крыса 50 (плацебо) (N=12)	Крыса 30 (носитель) (N=10)	Крыса РСК (плацебо) (N=5)	Крыса РСК (носитель) (N=12)	Крыса РСК (7,5мг/кг(день) (М-8)	Крыса РСК (15мг/кг/день) (N=8)
В1Л4 (мг/дл)	21 1741 19 (12)	22 4041 55 (Ю)	34 0044 74 (5)	327144 57 (12)	27 5043 74 (8)	24 2544 30 (8)
Креатинин (мг/дл)	0 3340 08 (12)	0 3440 12 (Ю)	0 54±0 5 (5)	0 54±0 09 (12)	0 48±0 09 (8)	0 4640 07 (8)

величина р для больных мышей, обработанных носителем, против обработанных ХЬ-647: * р<0,05; **р <0,001

Пример 3. Ιη νίίτο биохимический анализ ингибирования с помощью ХЬ-647

Влияние соединения ХЬ-647 на активность нескольких киназ, к которым относятся ЕОРК, ЕгЬВ2/НЕК2 и КБК/УЕОРК2, измеряли, используя один из трех форматов анализа. Эксперименты дозаответ осуществляли, используя 10 различных концентраций ингибитора в 384-луночных планшетах для микротитрования. Концентрация АТФ, использованная для каждого анализа, была эквивалентна К_т для каждый киназы. Величины 1С₅₀ рассчитывали путем нелинейного регрессионного анализа, используя уравнение с четырьмя переменными: ¥=тт+(тах-тт)/[1+([1]/1С5о)^, где Υ представляет собой наблюдаемый сигнал, [I] представляет собой концентрацию ингибитора, тш представляет собой фоновый сигнал в отсутствие фермента (ферментативная активность 0%), тах представляет собой сигнал в отсутствие ингибитора (ферментативная активность 100%), 1С₅₀ представляет собой концентрацию ингибитора, требуемую для ингибирования фермента на 50%, и Ν представляет собой эмпирический коэффициент Хилла в качестве меры кооперативности. Результаты суммируются в табл. 5.

- 10 025451

Радиометрический анализ киназы ³³Р-фосфорилтрансферазы использовали для измерения ЕрЬВ4, рецептора инсулин-подобного фактора роста-1 (ЮРК-1) и активности рецептора инсулина (ΙΚΚ). Реакции осуществляли в 384-луночных белых с прозрачным дном планшетах для микротитрования с высоким связыванием (продукция фирмы Отешет). Планшеты покрывали субстратом пептидом в количестве 2 мкг/лунка в объеме 50 мкл. Покрывающий буфер содержал субстрат для ЕрЬБ4 и ΙΚΚ поли(А1а-О1и-Ьу8Туг) в концентрации 40 мкг/мл или субстрат для ЮРК-1 поли(О1и-Тут) 6:2:5:1 (продукция фирмы РетктЕ1тег), Ыа₂СО₃ в концентрации 22,5 ммоль/л, ЫаНСО₃ в концентрации 27,5 ммоль/л, ЫаС1 в концентрации 150 ммоль/л и ΝαΝ₃ в концентрации 3 ммоль/л. Покрытые планшеты отмывали один раз с помощью 50 мкл буфера для анализа с последующей инкубацией в течение ночи при комнатной температуре. Испытываемое соединение и либо ЕрЬБ4 в концентрации 5 нмоль/л (остатки Е605-Е890 фермента ЕрЬБ4 человека, содержащие ИН₂-концевой хвост из шести гистидинов, экспрессированные в бакуловирусной экспрессирующей системе и очищенные, используя хроматографию с хелатом металла), рецептор инсулиноподобного фактора роста I в концентрации 4 нмоль/л (остатки М954-С1367 рецептора инсулиноподобного фактора роста-1 человека, продукция фирмы Ргосрпахе ОтЬН), либо рецептор 1 инсулина в концентрации 15 нмоль/л (остатки Р948-81343 рецептора 1 инсулина человека, продукция фирмы Ргосрпахе) объединяли с [³³Р]д-АТР (5 мкмоль/л, 3,3 мкКи/нмоль) в общем объеме 20 мкл. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение от 1,5 до 2,5 ч и останавливали реакцию путем аспирации. Планшеты для микротитрования затем отмывали шесть раз с помощью 0,05% буфера Тетееп-ΡΒδ. Добавляли сцинтилляционную жидкость (50 мкл/лунка), и встроенный ³³Р измеряли посредством жидкостной сцинтилляционной спектрометрии, используя сцинтилляционный счетчик МютоВе1а (продукция фирмы Регкш-Е1тет).

Анализ хемилюминесценции, связанной с люциферазой, использовали для измерения активности ЕОРК и КОК (УЕОРК2). Активность киназы измеряли в виде процента затраченного АТФ после киназной реакции, используя хемилюминесценцию, связанную с люциферазой и люциферином. Реакции проводили в 384-луночных белых планшетах для микротитрования, связывающих среду (продукция фирмы Отешет). Киназные реакции инициировали, объединяя ХЬ-647, АТФ в концентрации 3 мкмоль/л, субстрат в концентрации 1,6 мкмоль/л (поли(О1и,Туг) 4:1; продукция фирмы Реткт-Е1тет), и либо ЕОРК (7 нмоль/л, остатки Н672-А1210 киназы ЕОРК человека, продукция фирмы Ргосщте). либо КОК (5 нмоль/л, остатки О807-У1356 киназы КОК человека, продукция фирмы Ргосрпа^е) в объеме 20 мл. Реакционную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 4 ч. После киназной реакции добавляли аликвоту 20 мкл киназы О1о (продукция фирмы Рготеда) и измеряли люминесцентный сигнал, используя ридер для планшетов Ую1от2 (продукция фирмы Регкш-Е1тет). Суммарное потребление АТФ ограничивалось 50%.

Анализ тирозинкиназы А1рйа8стееп использовали для измерения активности ЕгЬВ2 и Р11-4. Использовали донорные шарики, покрытые стрептавидином, и акцепторные шарики, покрытые антителом против фосфотирозина РУ100 (продукция фирмы Регкт-Е1тег). В качестве субстрата использовали биотинилированный поли(О1и,Туг) 4:1. Фосфорилирование субстрата оценивали посредством люминесценции после добавления шариков донор-акцептор с последующим образованием комплекса. Испытываемое соединение, 3 мкмоль/л АТР, 3 нмоль/л биотинилированного поли(О1и,Туг) 4:1 и 1 нмоль/л ЕгЬВ2 (остатки О679-У1255 киназы ЕгЬВ2 человека, продукция фирмы Ргосщте) или РИ-4 (остатки Ό725-Κ1298 киназы РИ-4 человека, продукция фирмы Ргосрпазе) объединяли в объеме 20 мкл буфера для анализа (20 мМ трисНС1, рН 7,5, 10 мМ МдС1₂, 3 мМ МпС1₂, 1 мМ ОТТ, 0,01% тритон) в 384-луночном прозрачном планшете для микротитрования, связывающем среду (продукция фирмы Отешет). Реакционные смеси инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Реакции гасили добавлением 10 мкл суспензии шариков А1рйа8стееп в концентрации от 15 до 30 мкг/мл, содержащей НЕРЕ8 в концентрации 75 ммоль/л (рН 7,4), Ναί'Ί в концентрации 300 ммоль/л, ЕЭТА в концентрации 120 ммоль/л, бычий сывороточный альбумин в концентрации 0,3% и твин 20 в концентрации 0,03%. Через 2-16 ч инкубации при комнатной температуре планшеты считывали, используя ридер Л1рйаОне51 (продукция фирмы Регкт-Е1тег).

Таблица 5. 1п уйго профиль ингибирования киназы соединения ХЬ-647

Киназа	1См|±8О(нмоль/л)
ЕОРК	0.3 ±0.1
ЕгЬВ2	16± 3
КОК	1.5 ±0.2
РИ-4	8.7 ± 0.6
ЕрЬВ4	1.4 ±0.2
5гс	10.3 ±2.0
ΙΟΡ1Κ	>10,000
ΙηϊΚ	>26,000

Результаты представлены в виде средней величины ± 8Ό по меньшей мере трех независимых определений.

Механизм действия, изученный для киназ ЕОРК, ЕгЬВ2, КОК и ЕрИВ4, подтвердил, что ХЬ-647 представляет собой обратимый и конкурирующий за АТФ ингибитор. Высокие концентрации фермента

- 11 025451 и ХЬ-647 (>>К[) объединяли и инкубировали в течение 2 ч на льду. Использовали следующие концентрации фермента и ХЬ-647: 200 нМ ЕрЕБ4, 4 00 нМ ХЬ-647; 0,5 нМ ЕОРК, 5 нМ ХЬ-647; 3 нМ КОК, 1000 нМ ХЬ-647. Ферментативную активность измеряли стандартными способами после разведения комплекса фермент-ингибитор. Активность сравнивали с контролем ΌΜ8Θ, обработанным при идентичных условиях.

Таблица 6. Определение К| для ХЬ-647 против выбранных киназ

Параметры	ЕрЬВ4	БОРК	ЕгЬВ2	КОК
Обратимость	Да	Да	Да	Да
Конкуренция за АТФ	Да	Да	Да	Да
Км (мкМ) (АТР)	5, 0	0, 5	2, 5	0,7
Кх (нМ)	1	0, 05	3	0, 6

Пример 3. Ιη νίίτο биохимический скрининг на специфичность ХЬ-647

Специфичность ХЬ-647 оценивали против панели фармакологических мишеней, к которым относятся рецепторы, переносчики и ферменты (продукция фирмы ΝοναδοΓοοη. Нагюусг ΜΟ). Было показано, что при одной концентрации ίη νίίτο 10 мкМ ХЬ-647 взаимодействует с очень незначительным количеством фармакологических мишеней (табл. 7). Ингибировался лишь переносчик серотонина человека с 1С₅₀<1 мкМ (1С₅₀=188 нМ). Также наблюдалось влияние на мускариновые рецепторы, α2адренергический рецептор и переносчик допамина, у которых наблюдались величины 1С₅₀ 1-2,7 мкМ.

Таблица 7. Панель для анализа №уа8сгссп против ХЬ-647

Анализ мишени	Ингибирование, 10 мкМ ХЬ-647	1С5() (нМ,
Аденозин, неселективная	47,89%
Адренергический, альфа 1/ неселективная	4 9, 4 0%
Адренергический/ альфа 2, неселективная	84, 56%	1800
Адренергический, бета, неселективная	18, 01%
Переносчик допамина	87,14%	2480
Допамин, неселективная	3 4, 88¾
(ЗАВА А, сайт агониста	1, 07%
ЗАВА-В*	-1, 19%
Глутамат, сайт АМРА	10, 7 9%
Глутамат, сайт каината	0, 89%
Глутамат, сайт агониста ΝΜϋΑ	-1, 66%
Глутамат,ΝΜϋΑ,глицин (сайт ЗОгу-тпзепз)*	6, 46%
Глицин, чувствительный к стрихнину	12,95%
Гистамин, Н1	59, 82%
Гистамин, Н2*	45, 68%
Гистамин, НЗ	3 8, 64¾
Мелатонин, неселективная	0, 18%
Мускариновый, М1 (рекомбинантный человека)*	98,13%	2330
Мускариновый, М2 (рекомбинантный человека)*	98, 73%	1180
Мускариновый, неселективная, центральный	97,91%	2570
Мускариновый, неселективная, периферический	87, 74%	2650

- 12 025451

Никотиновый ίнечувствительный к а-бунгаротоксину)	53,97%
Переносчик норэпинефрина	-5, 38%
Опиат, неселективная	39, 73%
Переносчик серотонина	100,94%	188
Серотонин, неселективная	24,52%
Сигма, неселективная	50, 90%
Эстроген	15,75%
Тестостерон (цитозольный)	18,09%
Кальциевый канал, тип Ь (сайт дигидропиридина)	46, 77%
Кальциевый канал, тип N	16, 82%
Калиевый канал, АТФ- чувствительный	5, 02%
Калиевый канал, Са2+ АсР., VI	17,02%
Калиевый канал, Са2+ АсР., ν5	22,72%
Натрий, сайт 2	88,06%
N05 (связывающийся с нейронами)	16, 80%
ОАВА А, ΒΏΞ, альфа 1, центральный	7,34%
Лейкотриен В4, ЬТВ4	32,17%
Лейкотриен Э4, ЬТЭ4	-11,89%
Тромбоксан А2 (человека)	1,51%
Кортикотропин-высвобождающий фактор, неселективная	32,32%
Окситоцин	-2,59%
Тромбоцит-активирующий фактор, РАЕ”1·	11,72%
Тиротропин-высвобождающий гормон, ТЕН	4,59%
Ангиотензин II, АТ1 (человека)	6, 85%
Ангиотензин II, АТ2	16, 64%
Брадикинин, ВК2	48,81%
Холецистокинин, ССК1 (ССКА)	47,54%

- 13 025451

Холецистокинин, ССК2 (ССКВ)	17,12%
Эндотелии, ЕТ-А (человека)	-11,07%
Эндотелии, ЕТ-В (человека)	-13,61%
Галанин, неселективная	1,57%
Нейрокинин, ЫК1	20, 44%
Нейрокинин, ЫК2 (ЫКА) (рекомбинантный человека)*	34,23%
Нейрокинин, ЫКЗ (ЫКВ)	19,96%
Вазоактивный интестинальный пептид, неселективная	17,02%
Вазопрессин 1	32,83¾
Ацетилхолинэстераза	49, 40%
Холинацетилтрансфераза	1,27%
Декарбоксилаза глутаминовой кислоты	-8, 46%
Моноаминоксидаза А, периферическая	1, 66%
Моноаминоксидаза В, периферическая	2,03%

ХЬ-647 оказался неактивен против панели из 10 тирозинкиназ (включая инсулин и рецептор инсулиноподобного фактора роста 1) и 55 серинтреонинкиназ (включая циклинзависимые киназы, активируемые стрессом протеинкиназы и изоформы протеинкиназы С).

Дополнительный скрининг осуществляли, используя способы биохимического анализа примера 2. Дополнительное описание компонентов и концентраций суммируется в табл. 8, табл. 9 и табл. 10 ниже. Результаты скрининга представлены в табл. 11.

Таблица 8. Компоненты анализа для радиометрических анализов киназ

Фермент	[Ферм]	[АТФ]	Субстрат	[субстр] (мкг/лунка)	Т(мин)	Буфер для анализа	Конструкция
Е1Р-1	6 НМ	5 мкМ	Поли-ΕΥ	2	120	20 мМ трисНС1, рН 7,5, 10 мМ МдС12, 3 мМ МпС12, 1 мМ БТТ, 0,01¾ тритон	Человека, цитоплазматический домен, Ν-ЗЗТ-фактор X, РгоСЙпазе
т-ι	6 НМ	5 мкМ	Поли-ΕΥ	2	120	20 мМ трисНС1, рН 7,5, 10 мМ МдС12, 3 мМ МпС12, 1 мМ БТТ, 0,01¾ тритон	Человека, цитоплазматический домен, Ν-Θ5Τ-фактор X, РгоСИпазе
Т1е-2 (Тек)	15 нМ	5 мкМ	Поли- ΑΕΚΥ	5	120	20 мМ трисНС1, рН 7,5, 10 мМ МдС12, 0,03% тритон, 1 мМ БТТ	Человека, К95651390, Ы-С5Т-Н1з6- тромбин, РгоСйпазе
РКС- эпсилон	600 пМ	2 мкМ	МБР	1, 2	90	20 мМ Нерез, 10 мМ МдС12, 1 мМ СаС12, 0,03% тритон X- 100, 1 мМ БТТ	Человека, РапУега

- 14 025451

РКС-эта	200 пМ	2 мкМ	МБР	1	90	20 мМ Нерев, 10 мМ МдС12, 1 мМ СаС12, 0,03¾ тритон X- 100, 1 мМ БТТ	Человека, РапЧега
СНк1	10 нМ	10 мкМ	МБР	2	120	1-кратныи буфер ЗТХ (5 мМ Нерее, рН 7,6, 15 мМ ЫаС1, 0,01% бычий 1дО БОС), 10 мМ МдС1 2/ 1 мМ БТТ, 0,02% тритон	Человека, Ν-СЗТ-бад, ирзбабе Βΐο- бесНпо1оду
СПк2	20 НМ	30 мкМ	МБР	2	120	1-кратный буфер ЗТХ, 10 мМ МдС12, 1 мМ БТТ, 0, 02% тритон	Человека, 5-543, Ν- СЗТ/С-Ηϊε, БреОаТе В1о-бесЬпо1оду
Р1к-1	100 нМ	5 мкМ	Казеин	2, 5	120	2 0 мМ трисНС1 рН 8, 0, 10 мМ МдС12, 0,02% СНАРЗ	Человека, Н1з6
СФо2	10 НМ	5 мкМ	МБР	2	120	25 мМ Нерез рН 7,5, 100 мМ ЫаС1, 10 мМ МдС12, 3 мМ МпС12, 1 мМ БТТ, 0,01% тритон Х-100	Человека, М1-М297/Н циклин В М1-Ч433, Ν- 33Τ-ΗΪ5 б-тромбин, Ргофтпазе

Таблица 9. Компоненты анализа для анализов киназ в формате А1рка8сгееп

Фермент	[Ферм]	[АТФ]	Субстрат	[субстр]	Т (мин)	Буфер для анализа	Конструкция
Р6ГК1	1 нМ	3 мкМ	ПОЛИ-ΕΥ	2 нМ	60	20 мМ триоНС1, рН 7,5, 10 мМ МдС12, 3 мМ МпС12, 1 мМ БТТ, 0,01% тритон	Человека, цитоплазматический домен, И-СЗТ-Н136, Ргофтпазе
с-κϊΐ	1 нМ	3 мкМ	ПОЛИ-ΕΥ	3 нМ	60	20 мМ трисНС1, рН 7,5, 10 мМ МдС12, 3 мМ МпС12, 1 мМ БТТ, 0,01% тритон	Человека, Т544-Ч976, Ν-СЗТ, Ргофтпазе
Еуп	10 ПМ	3 мкМ	ПОЛИ-ΕΥ	5 нМ	60	20 мМ трисНС1, рН 7,5, 10 мМ МдС12, 2 мМ МпС12, 1 мМ БТТ, 0,02% тритон	Человека, Ν-ΗΪ56, ирвбабе Вз-о-БесНпоТоду

Таблица 10. Компоненты анализа для хемилюминесцентных анализов киназ

Фермент	[Ферм]	[АТФ]	Субстрат	[субстр]	Т(мин)	Буфер для анализа	Конструкция
ЕрЬА2	20 нМ	3 мкМ	Поли-ΕΥ	1,б мкМ	180	20 мМ трисНС1, рН 7,5, 10 мМ МдС12, 3 мМ МпС12, 0,01% тритон	Человека, Ν593-Κ890, Ы-Н1зб
с-Меб	10 НМ	1 мкМ	Поли-ΕΥ	1 мкМ	120	20 мМ трисНС1, рН 7,5, 10 мМ МдС12, 0,02% тритон Х-100, 1 мМ БТТ, 2 мМ МпС12	Человека, Р94831343, Ν-СЗТ-Оад, РгоФТпаве
АЫ	15 нМ	1 мкМ	Поли-ΕΥ	2 мкМ	120	20 мМ трисНС1, рН 7,5, 10 мМ МдС12, 3 мМ МпС12, 1 БТТ, 0,01% тритон	Человека, Р118-3553, Ν-СЗТ, Рго(21пазе
Бок	12 нМ	1 мкМ	поли-ΑΕΚΥ	4 мкМ	120	20 мМ трисНС1, рН 7,5, 10 мМ МдС12, 3 мМ МпС12, 1 мМ БТТ, 0,03% тритон	Человека, Ф225-Р510, М-СЗТ/С-бегттпа! ЕЕ

- 15 025451

5гс	1, б нМ	3 мкМ	поли-ΕΥ	1,	б мкМ	180	20 мМ трисНС1, рН 7, 5, 10 мМ МдС12, 3 мМ МпС12, 1 ММ БТТ, 0,01% тритон	Человека, Ν-Ηίδ-ΐθς, ирзЪаЪе Βίο-ЪесЪ
ΖΑΡ70	4 нМ	1 мкМ	поли-ΕΥ	0,	8 мкМ	120	20 мМ трисНС1, рН 7, 5, 10 мМ МдС12, 3 ММ МпС12, 1 мм ЭТТ, 0,01% тритон	Человека, МВБ
РКА	10 нМ	5 мкМ	МБР	5	мкМ	120	20 мМ Нерез, рН 7,4, 10 мМ МдС12, 1 ММ ΌΤΤ, 0,03% тритон	Быка (сердце), ирз1а1:е Βίο- Сес?то1оду
МАР4КЗ	10 нМ	5 мкМ	МБР	5	мкМ	120	20 мМ Нерез, рН 7,4, 10 мМ МдС12, 1 ММ ΌΤΤ, 0,03% тритон	Домен киназы, Ν-Ηί$6
ЕМК	30 нМ	250 нМ	казеин	1	мкМ	180	20 мМ Нерез, 10 мМ МдС12, 1 мМ СаС12, 2 ММ МпС12, 0, 03% СНАРЗ, 1 мМ ΌΤΤ	Человека, Ν-Ηίδβ

<3$Κ-3β	5 нМ	3 мкМ	Пептид	5 мкМ	90	20 мМ Нерез, рН	Человека, эпитоп Ν-
			фосфогли-			7, 4, 10 мМ МдС12, 1	Н1зб/61и-С1и,
			коген-			мМ БТТ, 0, 03%	УрзЪаЬе Βίο-
			синтазы			тритон	£есЬпо1оду

Таблица 11. Дополнительный профиль ίη νίΐΓΟ ингибирования ХЬ-647

Киназа	1СИ±8О (нмоль/л)
Έρ1ιΑ2	6.8 ±0.8
РК1	56.5 ± 15.5
ΡϋΟΡΚ-α	64.4 ± 7.2
РОСРР-β	345.7 ±37.0
с-Κΐι	132.2 ±8.2
с-АЫ	336.8 ±3.6
РСРК1	855.3 ±96.3
Τίε-2	54.0 ± 13.4
ΖΑΡ-70	7806.0 ±655.3
с-Ме(	332.0 ±50.7
Руп	41.0 ±8.1
Ьск	31.0±0.3
В1к	15
Уез	1.1
Рез	474
Ьуп	2
С5К	402

К ферментам с величинами 1С50 больше 1 мкМ относятся: АМРК, с-РаТ, СатК11, СатК1У, СЭК1. СЭК2. С1ЖТ СПК.Т СОК6, С1Ж7, СК2, О3К3|, ΙΚΚα, ΙΚΚβ, ΙΝΚΙα, 1ΝΚ2α, 1ΝΚ3α, МАРК1, МАРК2, РРАК МЕК1, МКК4, МКК6, МКК7|, МАР4К3, МАР4К5, р7036К, РАК2, Р1к1, СК1РРАК2, РОСК II, Ркк1, Ркк2, Ркк3, 3АРК3, 3АРК4, Зук. К ферментам с величинами ШС50 больше 10 мкМ относятся: Сйк1, Сйк2, С1к1, С1к2, ЕМК, МАРКАР2, РКВа, РКВ|, РКСа, РКС-γ, РКС-ε, РКС-ξ, РКА, р70З6К, ЗОК.

Пример 4. Ιη νίνο анализ активности на основе клеток

Ингибирование ЕОРР с помощью ХЬ-647 подтверждали ίη νίνο, используя клетки эпидермоидной карциномы человека А431 (Атепсап Туре СиИиге Сойесйоп), аденокарциномы человека МЭА-МВ-231 (Оеогде1о\\п ип|уег511у), аденокарциномы Н1975 N301-0 (Атепсап Туре СиИиге Сойесйоп) и плоскоклеточной карциномы Ьх-1 (ОераПтеШ оТ Опсо1о§у Эгид 0|5соуегу, Впк1о1-Муег5 ЗцшЬЬ). А431 содержит сверхэкспрессируемый ЕОРР человека \\1.

Н1975 содержит и активирующую мутацию в ЕОРР (Ь858Р), и мутацию второго сайта (Т790М), которая приводит к резистентности к гефитинибу и эрлотинибу. Клетки Ьх-1 не экспрессируют эндогенный ЕОРР, и их использовали для экспрессии конструкций экзогенного ЕОРР. Другие линии клеток обобщаются в табл. 12.

Линии клеток А431 и МОА-МВ-231 поддерживали и размножали в виде культур монослоя в среде

- 16 025451

ЭМЕМ (продукция фирмы МеШаЮсН). содержащей Ь-глутамин, дополненный 10% эмбриональной бычьей сывороткой, инактивированной нагреванием (продукция фирмы Нус1опе), пенициллин О в концентрации 100 единиц/мл, стрептомицин в концентрации 100 мкг/мл (1% пенициллин/стрептомицин, продукция фирмы МеАИесН) и 1% заменимые аминокислоты (продукция фирмы МеШаЮсН) при 37°С в увлажняющем инкубаторе с 5% СО₂. Линии клеток Н1975 и Ьх-1 поддерживали в полной среде ΡΡΜΙ 1640 (30-2001; Атепсап Туре СиЙиге СоПесйоп; содержащей Ь-глутамин, дополненный 10% эмбриональной бычьей сывороткой, инактивированной нагреванием, 1% пенициллин/стрептомицин и 1% заменимые аминокислоты при 37°С в увлажняющем инкубаторе с 5% СО₂. Другие линии клеток поддерживали и размножали подобными же способами в стандартных средах.

Влияние ХЬ-647 на ЕОРК ν! измеряли ш νί\Ό с помощью анализа на основе клеток аутофосфорилирования ЕОРК в клетках А431. Клетки А431 засевали в количестве 5х10⁴ на лунку в 96-луночные планшеты для микротитрования (3904 Со§!аг, УАК) и инкубировали в полностью дополненной среде ЭМЕМ в течение 16 ч, после чего ростовую среду заменяли на бессывороточную среду ЭМЕМ и клетки инкубировали в течение дополнительных 24 ч. Серийные разведения ХЬ-647 (в трех повторах) в бессывороточной среде добавляли к покоящимся клеткам и инкубировали в течение 1 ч перед стимуляцией с помощью 100 нг/мл рекомбинантного ЕОР человека (Р&Э §у81ет8) в течение 10 мин. В лунки отрицательного контроля не вносили ЕОР. После обработки монослои клеток отмывали с помощью охлажденного ΡΒ8 и незамедлительно лизировали с помощью охлажденного лизирующего буфера (трис-НС1 в концентрации 50 ммоль/л (рН 8,0), Ν;·ιΟ в концентрации 150 ммоль/л, глицерин в концентрации 10%, ΝΡ40 в концентрации 1%, 8Ό8 в концентрации 0,1%, дезоксихолат натрия в концентрации 0,5%, ЕЭТА в концентрации 1 ммоль/л, NаР в концентрации 50 ммоль/л, пирофосфат натрия в концентрации 1 ммоль/л, ортованадат натрия в концентрации 1 ммоль/л, фторид фенилметилсульфонила в концентрации 2 ммоль/л, апротинин в концентрации 10 мкг/мл, лейпептин в концентрации 5 мкг/мл, пепстатин в концентрации 5 мкг/мл). Лизаты центрифугировали, переносили в 96-луночные планшеты, покрытые стрептавидином (продукция фирмы Ρ^е^се). содержащие моноклональные антитела мыши против ЕОРК человека, конъюгированные с биотином (2 мкг/мл; продукция фирмы Кекеагсй О1адпо8Йс8) и инкубировали в течение 2 ч. Планшеты отмывали три раза с помощью ТВ8Т (25 ммоль/л трис, 150 ммоль/л Ν;·ιΟ (рН 7,2), 0,1% бычий сывороточный альбумин и 0,05% твин 20) и инкубировали с антителом против фосфотирозина, конъюгированным с пероксидазой хрена (1:10000; продукция фирмы Ζутеά ЬаЪогаФпек). Активность пероксидазы хрена определяли путем считывания планшетов в ридере для планшетов У1с!ог2 после добавления субстрата Рет!о ЕЫ8А (продукция фирмы Е1егсе). Величины 1С₅₀ определяли, исходя из фосфорилирования всего тирозина ЕОРК при обработке ХЬ-647 против фосфорилирования всего тирозина ЕОРК при обработке фактором роста самостоятельно, нормализируя к уровням рецептора.

Влияние ХЬ-647 на ЕОРК ν! и мутантный ЕОРК оценивали ш У1уо, используя транзиентно трансфицированные клетки Ьх-1. Клетки Ьх-1 использовали, поскольку у них отсутствует фоновая активность ЕОРК. Клон, соответствующий самой длинной изоформе ЕОРК (№ доступа в Генбанке NМ_005228.3/NΡ_005219.2#21-176, Ир8!а!е Вю!есЬпо1оду), использовали в качестве матрицы для продукции двух мутантных генов ЕОРК (кодирующих Ь858К и Ь861Ц) посредством сайт-направленного мутагенеза. АТ и двух мутантов с подтвержденной последовательностью переносили в СООН-концевой Р1ад-меченный ретровирусный экспрессирующий вектор млекопитающего под цитомегаловирусным промотором. Два экспрессирующих вектора Те!-Оп, ЕОРК АТ (Те!-Оп) и ЕОРКуШ (Те!-Оп), которые были Р1ад-меченными на СООН-конце, великодушно предлагались Όγ. АЪЬуН Оийа (Университет Торонто, Торонто, Онтарио, Канада).

Транзиентные трансфекции клеток Ьх-1 осуществляли, используя липофектамин 2000 (продукция фирмы 1пуНгодеп) согласно протоколу производителя. Для трансфекции конструкций АТ, Ь858К и Ь861Ц использовали по 1 мкг плазмидной ДНК на каждую трансфекцию (каждую лунку 12-луночного планшета). Для трансфекции Те!-контролируемых конструкций ЕОРК АТ и варианта ΙΙΙ объединяли 0,5 мкг каждой конструкции с 0,5 мкг плазмиды рТе!-Оп (продукция фирмы ΒΌ Вюкаепсек) на каждую трансфекцию. Клетки собирали через 24 ч после трансфекции и помещали либо в 96-луночные планшеты (4х 10⁴ клеток на лунку) для обработок соединением, либо в 12-луночные планшеты (2х10⁵ клеток) для анализов иммуноблота. Экспрессию трансгена ЕОРКуШ индуцировали через 24 ч после трансфекции путем добавления в среду доксициклина в количестве 1 мкг/мл. Эти клетки поддерживали в присутствии доксициклина в продолжение эксперимента. Через 12 ч инкубации клетки помещали в бессывороточную среду (в среду без эмбриональной бычьей сыворотки) и сразу же обрабатывали с помощью указанных соединений в трех повторах в течение 24 ч с последующей 10-минутной обработкой с помощью рекомбинантного ЕОР человека (100 нг/мл). Цельноклеточные лизаты создавали добавлением 125 мкл буфера для анализа радиоиммунопреципитации (продукция фирмы Во§!оп ВюргойисВ), содержащего ингибиторы протеаз (таблетки со смесью ингибиторов протеаз, продукция фирмы Косйе) помимо NаР в концентрации 50 ммоль/л, пирофосфата натрия в концентрации 1 ммоль/л, ортованадата натрия в концентрации 1 ммоль/л, фторида фенилметилсульфонила в концентрации 2 ммоль/л, апротинина в концентрации 10 мкг/мл и лейпептина в концентрации 5 мкг/мл, в каждую лунку для анализа фосфорилирования ЕОРК

- 17 025451 либо посредством ЕБКА, либо посредством иммуноблота.

Для анализа фосфорилирования ЕОРК посредством ЕБКА планшеты, покрытые стрептавидином Кеасй-Вшб, (продукция фирмы Р1егсе) покрывали антителом против Р1ад, конъюгированным с биотином, в концентрации 2 мкг/мл (продукция фирмы δ^дта).

Цельноклеточные лизаты (10 мкг) затем добавляли в лунки, покрытые антителом против Р1ад, в конечном объеме 100 мкл в течение 2 ч при комнатной температуре и затем отмывали три раза с помощью ΤВδΤ. Вторичное антитело против фосфотирозина, связанное с пероксидазой хрена, (1:10000; продукция фирмы 2утеб) использовали для определения фосфорилированного ЕОРК (рЕОРК; 1 ч при комнатной температуре с последующей трехкратной отмывкой с помощью ΊΏδ^. Активность пероксидазы хрена определяли, считывая планшеты на ридере для планшетов У1с!ог2 после добавления субстрата Рет!о ЕБКА.

Таблица 12. Ингибирование фосфорилирования в ЕОРК \УТ и мутантном ЕОРК с помощью соединения

ХЬ-647 в клетках А431 и Ьх-1

Для анализа аутофосфорилирования ЕрНВ4 посредством ЕБКА использовали клетки ЕрНВ4/НерЗВ. Клетки засевали в количестве 2х10⁴ клеток/лунка в 96-луночные планшеты для микротитрования (Со81аг 3904) в среде МЕМЕ (продукция фирмы Се11дго), содержащей 10% РВδ (инактивированную нагреванием, продукция фирмы Нус1опе), пенициллин-стрептомицин в концентрации 1% (продукция фирмы Се11дго) и О418 в концентрации 450 мкг/мл (продукция фирмы ПцЦгодеп). Клетки затем инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 24 ч. Ростовые среды заменяли бессывороточной средой МЕМЕ, и клетки инкубировали в течение дополнительных 16 ч. Серийное разведение ХЬ-647 в свежих бессывороточных средах добавляли к покоящимся клеткам и инкубировали в течение 1 ч перед 30-минутной стимуляцией смесью рекомбинантного химерного белка эфрин В2/Рс мыши (2 мкг/мл, продукция фирмы Ρ&Ό δу8!ет8) и антитела козы против 1дО/Рс человека (20 мкг/мл, продукция фирмы Р1егсе). Лунки отрицательного контроля не обрабатывали ростовым фактором. После обработки среды удаляли, монослой клеток отмывали с помощью охлажденного ΡВδ и сразу же лизировали с помощью охлажденного лизирующего буфера (50 мМ трис-НС1, рН 8,0, 200 мМ №С1, 0,5% ΝΓ-40, 0,2% дезоксихолат натрия, 1 мМ БОТА, 50 мМ NаР, 1 мМ пирофосфат натрия, 1 мМ ортованадат натрия, 2 мМ фторид фенилметилсульфонила, 10 мкг/мл апротинин, 5 мкг/мл лейпептин и 5 мкг/мл пепстатин А). Лизаты центрифугировали и инкубировали в блокированных (1% ВδА) 96-луночных планшетах, связывающих с высоким сродством (Со8!аг 3925), покрытых антителом против ЕрНВ4 мыши (2,5 мкг/мл, продукция фирмы Ρ&Ό δу8!ет8). Планшеты затем инкубировали со смесью антител против фосфотирозина, конъюгированных с НКР (1:10000, продукция фирмы 2утеб БаЬога!ог1е8, 1пс) с последующим добавлением раствора субстрата на основе люминола. Планшеты считывали, используя спектрофотометр Ую!ог (продукция фирмы \Уа11ас). Величины 1С₅₀ определяли, исходя из суммарного фосфорилирования тирозина рецептора ЕрНВ4 при обработке ХЬ-647 против суммарного фосфорилирования тирозина рецептора ЕрНВ4 при обработке лишь фактором роста.

Для анализа аутофосфорилирования ЕрНА2 посредством ЕБКА использовали клетки РС-3 (АТСС). Клетки засевали в количестве 2,5х10⁴ клеток/лунка в 9б-луночные планшеты для микротитрования (Со8!аг 3904) в среде ЭМЕМ (продукция фирмы Се11дго), содержащей 10% РВδ (инактивированную нагреванием, продукция фирмы Нус1опе), 1% пенициллин-стрептомицин (продукция фирмы Се11дго) и 1% раствор №АА (продукция фирмы Се11дго). Клетки затем инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 16 ч. Ростовые среды заменяли бессывороточной средой ЭМЕМ. и клетки инкубировали в течение дополнительных 24 ч. Серийное разведение соединения ХЬ-647 в свежих бессывороточных средах добавляли к покоящимся клеткам и инкубировали в течение 1 ч перед 20-минутной стимуляцией смесью рекомбинантного химерного белка эфрин А1/Рс мыши (1 мкг/мл, продукция фирмы Ρ&Ό δу8!ет8) и антитела козы против 1дО/Рс человека (10 мкг/мл, продукция фирмы Р1егсе). Лунки отрицательного контроля не обрабатывали фактором роста. После обработки среды удаляли, монослой клеток отмывали с помощью охлажденного ΡВδ и сразу же лизировали с помощью охлажденного лизирующего буфера. Лизаты центрифугировали и инкубировали в 96-луночных планшетах, покрытых стрептавидином (продукция фирмы Р1егсе), покрытых антителом мыши против фосфотирозина, конъюгированным с биотином, РУ (2 мкг/мл, продукция фирмы Са1ЬюсЬет). Планшеты инкубировали с поликлональным антителом кролика против ЕрНА2, С-20 (1:500, продукция фирмы δаηίа Сги/ Вю!есНпо1оду, 1пс) с последующим добавлени- 18 025451 ем вторичного антитела (антитела козы против 1дО кролика, конъюгированного с НИР, 1:1000, продукция фирмы Се11 МдпаПпд) и добавлением раствора субстрата на основе люминола. Планшеты считывали, используя спектрофотометр νίοΐΟΓ (продукция фирмы ^а11ас). Величины 1С₅₀ определяли, исходя из суммарного фосфорилирования тирозина рецептора ЕрНА2 при обработке ХЬ-647 против суммарного фосфорилирования тирозина рецептора ЕрНА2 при обработке лишь фактором роста.

Для анализа аутофосфорилирования с-Κίΐ посредством ЕЫ§Л использовали клетки НеЬа (АТСС). Клетки засевали в количестве 6х10⁵ клеток/лунка в чашку Петри диаметром 100 мм. Через 24 ч клетки НеЬа трансфицировали с помощью экспрессирующей плазмиды млекопитающего, содержащей промотор ί','Μν. функционально связанный с открытой рамкой считывания с-Κίΐ человека с меткой Р1адэпитопа на С-конце. Через 24 ч клетки НеЬа, трансфицированные с-Κίΐ, подвергали обработке трипсином и повторно засевали в количестве 6х10³ клеток/лунка в 9б-луночные планшеты для микротитрования (Со81аг 3904) в среде БМЕМ (продукция фирмы Се11дго), содержащей 10% РВ§ (инактивированную нагреванием, продукция фирмы Нус1опе), 1% пенициллин-стрептомицин (продукция фирмы Се11дго) и 1% раствор ΝΕΑΑ (продукция фирмы Се11дго). Клетки затем инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 24 ч. К клеткам добавляли серийные разведения соединения ХЬ-647 в свежей бессывороточной среде и инкубировали в течение 1 ч перед стимуляцией рекомбинантным §СР человека (100 нг/мл, продукция фирмы И&Б ЗуМепъ) в течение 10 мин. Лунки отрицательного контроля оставляли без стимуляции. После стимуляции среды удаляли, монослой клеток отмывали с помощью охлажденного РВ§ и сразу же лизировали с помощью охлажденного лизирующего буфера. Лизаты инкубировали в 96-луночных планшетах, покрытых стрептавидином (продукция фирмы Р1егсе), покрытых антителом козы против с-Κίΐ человека (1 мкг/мл, продукция фирмы И&Б ЗуМепъ). Планшеты отмывали 3 раза с помощью ТВ8Т и инкубировали либо с антителом против фосфотирозина, конъюгированным с НИР (1:10000, продукция фирмы 2утеб ЬаЬога1ог1е8, 1пс), либо с антителом против Р1ад, конъюгированным с НИР, (М2) (1:2000, продукция фирмы §1§та). Планшеты отмывали повторно, как описано выше, с последующим добавлением раствора субстрата на основе люминола и считыванием с помощью спектрофотометра Ую4ог (продукция фирмы ^а11ас). Величины 1С₅₀ определяли после нормализации, исходя из фосфорилирования тирозина с-Κίΐ при обработке ХЬ-647 против фосфорилирования тирозина с-Κίΐ при обработке лишь §СР.

Для анализа аутофосфорилирования Ρ1ΐ-4 посредством ЕЫ8А использовали клетки СО8. Клетки засевали в количестве 200000 клеток на лунку в 6-луночные планшеты в среде БМЕМ с 10% РВ§ и выращивали в атмосфере 5% СО₂ при 37°С. Через 24 ч роста клетки трансфицировали кДНК Ρ1ΐ-4 в количестве 1 мкг/лунка, используя 3 мкл ΡиСЕNЕ-6 (продукция фирмы Иосйе). Клетки обрабатывали через 24 ч после трансфекции с помощью ХЬ-647 в свежей бессывороточной среде БМЕМ в течение 1 ч, затем стимулировали с помощью 300 нг/мл νΈΟΡ-С в течение 10 мин. Монослой клеток отмывали дважды с помощью охлажденного РВ§ и собирали, соскребая в 150 мкл охлажденного на льду лизирующего буфера. Лизаты клеток центрифугировали при 13000 д в течение 15 мин, разводили 1:10 в охлажденном на льду РВ§ и переносили в чистые планшеты со стрептавидином (продукция фирмы Р1егсе), покрытые биотинилированным 1дО козы против νΈΟΡ-С человека (Ρ1ΐ-4) (2 мкг/лунка, продукция фирмы И&Б Вюкшепсек). После отмывки для определения всего Ρ1ΐ-4 и фосфорилированного Ρ1ΐ-4 использовали 1дОНИР мыши против Р1ад М2 (продукция фирмы §1дта, разведение 1 к 10000) или 1дО-НИР кролика против фосфотирозина (продукция фирмы 2утеб, 61-5820, 1:10000). Образцы нормализовали и величины 1С₅₀ определяли сравнением фосфорилирования тирозина Ρ1ΐ-4 при обработке ХЬ-647 против фосфорилирования тирозина Ρ1ΐ-4 при обработке лишь νΈΟΡ-С.

Для анализа аутофосфорилирования ЕрЬВ2 посредством ЕЫ8А использовали клетки ВТ474 (АТСС). Клетки засевали в количестве 3х10⁴ клеток/лунка в 96-луночные планшеты для микротитрования (СоЛаг 3904) в среде 1:1 (БМЕМ:Е121<) (продукция фирмы Се11дго), содержащей 10% РВ§ (инактивированную нагреванием, продукция фирмы Нус1опе), 1% пенициллин-стрептомицин (продукция фирмы Се11дго), 1% раствор ΝΈΑΑ (продукция фирмы Се11дго) и 2% Ь-глутамин (продукция фирмы Се11дго). Клетки затем инкубировали при 37°С, 5% СО₂ в течение 40 ч. Клетки обрабатывали с помощью серийного разведения ХЬ-647 в свежих бессывороточных средах и инкубировали в течение 1 ч. После обработки среды удаляли, монослой клеток отмывали с помощью охлажденного РВ§ и сразу же лизировали с помощью охлажденного лизирующего буфера. Лизаты центрифугировали и переносили в блокированные (1% В8А) 96-луночные планшеты, связывающие с высоким сродством (Со§1аг 3925), покрытые поликлональным антителом кролика против ЕрЬВ2 (1,3 мкг/мл, продукция фирмы Се11 МдпаПпд Тесйпо1оду). Планшеты затем инкубировали со смесью антител против фосфотирозина, конъюгированных с НИР (1:10000, продукция фирмы Ζνιικύ ЬаЬога1опе8, 1пс) с последующим добавлением раствора субстрата на основе люминола. Планшеты считывали с помощью спектрофотометра Ую1ог (продукция фирмы ^а11ас). Величины 1С₅₀ определяли, исходя из суммарного фосфорилирования тирозина ЕрЬВ2 при обработке соединением против суммарного фосфорилирования тирозина ЕрЬВ2 в отсутствие обработки соединением.

- 19 025451

Таблица 13. Ингибирование аутофосфорилирования с помощью ХЬ-647

Тирозинкиназа	Клеточная 1С50 (нМ)
ЕОРК	1
ЕрЬВ4	3
кгж	137
с-κίι	90
Р11-4	90
ЕгЬВ2	552
ЕрНА2	1100
РСХЗРКр	>1200

Пример 5. Анализ иммуноблот

Лизаты клеток Н1975, обработанных с помощью ХЬ-647, анализировали посредством иммуноблота. Для исследований клеток Н1975 посредством иммуноблота 3/10⁵ клеток помещали в каждую лунку (12луночного планшета) и инкубировали в течение 16 ч в полной среде КРМ1 1640, отмывали средой КРМ1 1640 без эмбриональной бычьей сыворотки и инкубировали с серийными разведениями тестируемых соединений в среде, свободной от эмбриональной бычьей сыворотки, в течение 2 ч с последующей стимуляцией с помощью 100 нг/мл рекомбинантного ЕОР человека в течение 10 мин. Цельноклеточные белковые лизаты получали, как описано выше, и центрифугировали в течение 10 мин при 13000/д при 4°С для удаления любого нерастворимого материала. Суммарный белок определяли, используя реагент бицинхониновую кислоту, и эквивалентное количество белка объединяли с буфером загрузки ΡΟδ (продукция фирмы 1пуЦгодеп) согласно инструкциям производителя. Белки разделяли с помощью гельэлектрофореза в 4-15% полиакриламидных гелях, переносили на нитроцеллюлозные мембраны и детектировали посредством иммуноблоттинга. Комплексы антитело:антиген идентифицировали, используя хемилюминесценцию. Использовали следующие антитела фирмы Се11 δίβίκιΗΓίβ ТесЬпо1оду в разведении 1:1000: против ЕОРК, против рЕОРК^Туг1068, против АКТ, против рАКТ^&г473, против ЕКК и против рЕКК^{ТЬг202/Туг204}. Первичное антитело против β-актина (продукция фирмы Ассига(е СЬет1са1 апЛ δс^еηί^ί^с) использовали в разведении 1:10000, и вторичные антитела, связанные с пероксидазой хрена, покупали у фирмы .Тасккоп 1ттипоКекеагсЬ и использовали в разведении 1:5000.

Иммуноблоттинг показал, что ХЬ-647 ингибирует фосфорилирование ЕОРК в концентрации 30 и 10 мкмоль/л, а также ингибирует фосфорилирование АКТ и ЕКК, которые происходят после фосфорилирования ЕОРК. Пример иммуноблота можно найти в статье ОепЛгеаи δВ, УеШига К., Кеак( Р. е( а1., 1п1нЫЛоп оГ (Не Т790М ОаСекеерег Мн1ап1 оГ (Ье Ер1Легта1 Ого\\(Ь Рас(ог Кесер(ог Ьу ЕХЕЬ-7647, СЬп Сапсег Кек 3713, 13(12) (2007), которая, таким образом, приводится в качестве ссылки.

Пример 6. Модель ксенотрансплантата А431

Самок мышей с тяжелым сочетанным иммунодефицитом и самок бестимусных голых мышей (ЫСг) в возрасте от 5 до 8 недель и весом от ~20 до 25 г приобретали у фирм ТЬе .Тасккоп ЬаЬога(огу и Тасотс соответственно. Животных содержали при оснащении вивария фирмой ЕхеЬх1К согласно правилам, определенным институтским комитетом по содержанию и использованию животных ЕхеЬхЦ. В течение всех исследований животных обеспечивали пищей и водой в неограниченном количестве и содержали в комнате в условиях от 70 до 75°Р и относительной влажности 60%.

Перед обработкой клетки Н1975, А431 или МОА-МВ-231 собирали с культур в экспоненциальной фазе роста, разделяли короткой трипсинизацией, отмывали дважды в охлажденном ΗΕδδ, ресуспендировали в охлажденном на льду НВδδ и имплантировали либо подкожно (Н1975, 3/10⁶ клеток на мышь), либо внутридермально (А431, 1/10⁶ клеток на мышь) в задний пах или подкожно в жировое тело молочной железы (МОА-МВ-231, 1/10⁶ клеток на мышь). Пальпируемые опухоли измеряли с помощью циркуля два раза в неделю, пока средняя масса опухоли не составила от ~80 до 120 мг. Массу опухоли определяли, измерив перпендикулярные диаметры с помощью циркуля и перемножив величины диаметров в двух измерениях: объем опухоли (мм³)/2 = длина(мм)/ширина² (мм²)/2. Массу опухоли (мг) экстраполировали, исходя из объема опухоли (мм³), при условии, что фактор конверсии равен 1. В подходящий день после имплантации мышей группировали (10 мышей на группу) так, чтобы средняя масса опухоли в группе составляла ~100±15 мг. Среднюю массу опухоли каждого животного в соответствующей контрольной и обработанной группах определяли два раза в неделю в течение периодов введения дозы. Ксенотрансплантаты опухоли приживляли в мышах-самках и перед обработкой давали достичь приблизительно 100 мг. Пример описан в статье ОепЛгеаи δВ, Уеп(ига К, Кеак( Р, е( а1., 1пЬ1ЬШоп оГ (Ье Т790М Оа(екеерег Ми(ап( оГ (Ье Ер1Легта1 Ого\\(Ь Рас(ог Кесер(ог Ьу ЕХЕЬ-7647, СЬп Сапсег Кек 3713, 13(12) (2007), которая, таким образом, приводится в качестве ссылки.

Ответ опухолей на лечение определяли сравнением средней массы опухоли обработанной группы с соответствующей контрольной группой. Процент ингибирования роста опухоли определяли по следующей формуле: Процент ингибирования = 100/[1-(Х_£-Х_о)/^_£-¥_о)], где Х_Г и Υ, представляют собой средние массы опухолей в обработанных и контрольных группах, соответственно, на день Г, и Х_о и Υ_ο представляют собой средние массы опухолей в обработанных и контрольных группах, соответственно, в нулевой

- 20 025451 день (имитированные массы опухолей после разбиения на группы).

Для определения уровней соединения в плазме после перорального введения ХЬ-647 цельную кровь помещали в гепаринизированные пробирки эппендорфа на льду и центрифугировали при 20000/д в течение 4 мин. Супернатант плазмы (50 мкл) добавляли к 100 мкл раствора внутреннего стандарта (250 нг/мл внутреннего стандарта в ацетонитриле), перемешивали на вортексе и центрифугировали. Экстракт образца (20 мкл) анализировали в отношении ХЬ-647 посредством анализа ЬС/Μδ/Μδ. Уровни в плазме рассчитывали, используя достоверную стандартную кривую. Предел количественного определения для ХЬ-647 составил 0,004 мкмоль/л (2 нг/мл). Для каждой временной точки рассчитывали средние величины и δΌ и оценивали концентрацию дозы.

Для иммуногистохимического анализа ксенотрансплантатов Н1975, МОА-МВ-231 и других опухоли иссекали после эвтаназии и фиксировали в цинковом фиксаторе (продукция фирмы ΒΌ Вюзаепсез) в течение 48 ч перед помещением в парафиновые блоки. Серийные срезы по 5 мкм получали из области наибольшей из возможных поверхности для каждой опухоли и окрашивали, используя стандартные способы. Использовали следующие антитела: Κί67 (δΡ6; продукция фирмы ЬаЬу18юп), СЭ31 (МЕСА.32; продукция фирмы ΒΌ Вюзаепсез), рЕК1<^|'^|'²⁰²''^|у|2°''¹ (протеинкиназа, активированная митогеном фосфор44/42; продукция фирмы Се11 δί^^ΐί^ ТесЬпо1оду), рА1<Т’^{е| Г3} (Се11 δί^^ΐί^ ТесЬпо1оду) и рЕОРК^Туг1068 (продукция фирмы Се11 δ^дпа1^п§ ТесЬпо1оду). Для иммунофлуоресцентного окрашивания срезы затем инкубировали с вторичным антителом козы против кролика, конъюгированным с А1еха 594 (продукция фирмы 1пубтодеп) и фиксировали в флуоресцентной закрепляющей среде (продукция фирмы ^Α<Ο). содержащей 4',6-диамидино-2-фенилиндол (продукция фирмы Мо1еси1аг БгоЬез) для контрокрашивания ядра. Флуоресцентное окрашивание визуализировали, используя отображающее устройство Ζе^88 Ахю, и оцифровывали, используя камеру высокого разрешения Ζе^88, соединенную с программным обеспечением для анализа изображения АхюАбюп. Два-три неперекрывающихся показательных поля фиксировали при увеличении /200 или /400 в зависимости от гистологических данных и количественно оценивали, используя функции интегративного морфометрического анализа в программном обеспечении МекатогрЬ (продукция фирмы итуег8а1 1тадшд Согр.). Апоптотические клетки идентифицировали, используя набор для определения гибели клеток ш 511и путем мечения концов одноцепочечных разрывов с помощью άυΨΡ, опосредованного терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой, согласно инструкциям производителя (продукция фирмы КосЬе О1адпо8Йс8 ОтЬН).

Сосуды СО31-позитивных опухолей, 1<л67-поэитивные пролиферирующие клетки и рЕКЬ, окрашенные в каждом срезе опухоли, идентифицировали и количественно оценивали, используя функции интегративного морфометрического анализа в автоматической системе клеточного изображения АСШ (продукция фирмы С1апеп1, 1пс.), и просматривали слепым методом. Количество СО31-позитивных сосудов идентифицировали при просмотре от 5 до 10 случайным образом выбранных полей равного размера на увеличении 400 в жизнеспособной ткани опухоли и рассчитывали в виде количества сосудов на квадратный миллиметр для каждой опухоли, усредняя на каждую обработанную группу, и сравнивали с контролями, обработанными носителем. Процент Κ^67-позитивных клеток рассчитывали как отношение 1<167-позитивны.\ клеток к общему количеству клеток, идентифицированных при просмотре от 5 до 10 случайным образом выбранных полей равного размера в жизнеспособной ткани опухоли. Результаты для каждой опухоли и обработанной группы усредняли и сравнивали с контролями, обработанными носителем. Уровень окрашивания рЕК1< определяли, как описано выше, и рассчитывали как отношение окрашенных антител к общему количеству идентифицированных клеток, усредняя для каждой обработанной группы и сравнивая с контролями, обработанными носителем.

Результаты представлены в виде величин среднее ± δΌ или δΕ, указанных для каждой схемы или таблицы. Для сравнения 1С₅₀ в эксперименте на жизнеспособность клеток А431 использовали ΐ-критерии Стьюдента на основе двойной выборки для определения величин Р для каждой пары 1С₅₀ при условии, что случайные отклонения повторов вокруг графика доза-ответ распределяются [1од]нормально, причем отдельные повторы использовали как объем выборки для ΐ-критерия (девять точек доза-ответ сделаны в трех повторах). Для статистического анализа иммуногистохимических результатов исследований ш У1уо осуществляли анализ с помощью двустороннего ΐ-критерия Стьюдента и вносили поправку Бонферрони для идентификации значимых различий при сравнении с контрольной группой, обработанной носителем (множественное применение одной контрольной группы, обработанной носителем) с совокупным минимальным условием Р<0,05. Окончательные измерения массы опухолей в конце исследования эффективности с использованием ксенотрансплантатов Н1975 и процент рЕОРК, рА1<Т, индекс Κί67, СЭ31 и мечение концов однонитевых разрывов с помощью бШЕ, опосредованное терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой, в ксенотрансплантатах Н1975 анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа ΑNΟVΑ с последующим апостериорным анализом Стьюдента-Ньюмана-Кейла для определения статистических различий между ХЬ-647 и эрлотинибом.

У мышей-ксенотрансплантатов А431 ежедневное пероральное введение ХЬ-647 (10, 30 и 100 мг/кг/день) в течение 14 дней существенно ингибировало рост опухоли дозозависимым образом. При дозе 10 мг/кг/день наблюдалось 65% ингибирование роста опухоли с данными в пользу прекращения

- 21 025451 роста опухоли к концу исследования. Доза 100 мг/кг/день привела к заметной регрессии опухолей (начальная масса: 109±20 мг; конечная масса: 36±15 мг).

Иммуногистохимический анализ показал, что обработка подкожно растущих опухолей А431 у голых бестимусных мышей-самок с помощью ХЬ-647 в дозе 100 мг/кг/деньх14 существенно увеличила процент полного некроза опухолей в 2,9 раз по сравнению с опухолями, обработанными носителем (табл. 14). Процент СЭ31-позитивных сосудов в жизнеспособной ткани опухоли существенно снижался при обработке ХЬ-647 в дозе 10, 30 и 100 мг/кг. Это ингибирование опухолевого ангиогенеза оказалось дозозависимым. Процент К167-экспрессирующих клеток в опухолях А431 существенно снижался при всех уровнях доз, указывая на уменьшение числа пролиферирующих клеток в опухоли в конце исследования.

Таблица 14. Обобщение иммуногистохимических анализов опухоли А431 в течение 14-дневного введения дозы

Доза (мг/кг)	Некроз	Анализ СЭ31	Экспрессия ΚΪ67
% увеличения	Кратность увеличения	МУС	ч уменьшения	% клеток	ч снижения
Носитель	21 2±8б	ΝΑ	2? 9 = 7 )	N Л	37 6 = 4 9	5 А
10	20 7 1 6 4	1 0	18 6 =.9	33 5	17 6-4 9	5Л 3
30	26 5 ±18 6	1 ί	15 9 х 5.5	43 2	и 3 ’ 5 5	6’2
100	61 74· 10 4		36±29	87 3		82 6

МУС, среднее число сосудов; ΝΑ, нет данных Величины представляют собой среднее±8Э

На 14 день введения дозы цельную кровь собирали посредством посмертной пункции сердца и профиль концентраций в плазме соединения ХЬ-647 определяли с помощью жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией (ЬС/Μδ/Μδ). У ХЬ-647 наблюдался фармакокинетический профиль удлиненной экспозиции лекарственного средства в плазме, причем микромолярные концентрации в плазме наблюдались вплоть до 24 ч после введения последней дозы исследования при дозах 30 и 100 мг/кг.

Пример 7. Дополнительные модели ксенотрансплантатов в онкологии

С целью изучения эффективности и возможностей ХЬ-647 в отношении ингибирования роста опухолей и регрессии опухолей ίη νίνο использовали несколько дополнительных моделей.

Использованные линии опухолевых клеток репрезентативны для солидных опухолей и перечислены в табл. 15. Стандартная схема эксперимента этих исследований, описанная подробно выше, включала ежедневное пероральное введение ХЬ-647, начиная с того момента, когда прижившиеся солидные опухоли достигали заданной массы (приблизительно 100 мг для большинства моделей ксенотрансплантатов). На протяжении периода введения дозы размер опухоли измеряли два раза в неделю (при необходимости) и массу тела измеряли ежедневно. У ХЬ-647 в этих исследованиях наблюдалась сильная противоопухолевая активность, причем в отношении солидных опухолей наблюдалась существенная регрессия. Опухоли иссекали в конце некоторых исследований и оценивали гистологически в отношении плотности микрососудов (окрашивание СЭ31), пролиферирующих клеток (окрашивание Κί67) и некроза (окрашивание гематоксилином/эозином). Ингибирование роста опухоли в целом хорошо коррелировало с повышенным некрозом опухоли, сниженной васкуляризацией опухоли и сниженным индексом пролиферации опухолевых клеток, указывая на то, что антиангиогенная активность содействовала сильной противоопухолевой эффективности ХЬ-647.

Переносимость в этих исследованиях контролировали путем ежедневного измерения массы тела. ХЬ-647, по-видимому, в основном хорошо переносился мышами без существенного снижения массы тела при введении дозы 100 мг/кг/день в течение 14 дней.

Из рассмотренных линий А431 и ΗΝ5 оказались самыми чувствительными, причем эффективные дозы ХЬ-647 приводили к 50% ингибированию роста опухолей (ЕЭ₅₀), установленному для модели А431 при 5,9 и 3,8 мг/кг/день после 14 или 28 дней введения дозы, соответственно, и для модели ΗΝ5 меньше чем 3 мг/кг/день после 14 дней введения дозы (обобщается в табл. 15).

- 22 025451

Таблица 15. Величины Εϋ50 ХЬ-647 у ксенотрансплантатов опухолей человека

Ксенотрансплантат опухоли человека	Источник ткани	Е050 (мг/кг)*
Ежедневнох14	Ежедневнох28
ΜϋΑ-ΜΒ-231	Молочные железы	21,9	22, 9
ВТ474	Молочные железы	9, 8	21, 9
НТ-29	Толстый кишечник	20,2	16, 0
А431	Эпидермис	5, 9	3,8
Са1и-6	Легкое	Νϋ	16, 4
РС-3	Предстательная железа	Νϋ	34, 0
Н1975	Легкое	17	Νϋ
ΗΝ5	Голова и шея	<3	Νϋ

А431, эпидермоидная карцинома; ВТ474, карцинома молочных желез; Са1и-6, №СЬС; Η1975, №СЬС, который содержит и активирующую мутацию в ΕΟΡΚ (Ε858Κ), и мутацию второго сайта (Т790М), что создает устойчивость к гефитинибу и эрлотинибу (Рао с! а1. 2005); ΗΝ5, карцинома головы и шеи, НТ-29, карцинома толстого кишечника; МБА-МБ-231, карцинома молочных желез; Νϋ, не проводилось; РС-3, карцинома предстательной железы: цй, ежедневно.

*Εϋ50 = Доза, необходимая для ингибирования опухоли на 50%. Бестимусных мышей, несущих опухоль, обрабатывали с помощью ХЬ-647 в течение 14 или 28 дней.

Таблица 16. Обобщение иммуногистохимических анализов у ксенотрансплантатов Η1975 при введении дозы в течение 14 дней

	тцмеь	Анализ СБ31	Экспрессия ΚΪ67
Доза (мг/кг)	•4 О клеток	Кратность увеличения	МУС	4 О умень- шения	4 '0 клеток	4 сниже -ния
Контроль- носитель	1±0,2	ΝΑ	62±8	ΝΑ	35+3	ΝΑ
10	6±0, 8	7,1й	44 + 10	30, оь	27 + 4	23, 2Ь
30	11+1,4	11, 9а	34 + 9	46, 1а	20+5	41,9а
100	15±1,8	16, 5а	19+11	69, 6а	8, 9±2	74,6а

ΜVС, среднее число сосудов; ΝΑ, нет данных; ΤϋΝΕΣ, мечение концов однонитевых разрывов с помощью биотинилированного йИТР, опосредованное терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой

Величины представляют собой среднее ±8Б. ^аР<0,0001.

^ЬР<0,005.

- 23 025451

Таблица 17. Результаты иммуногистохимических анализов фосфорилирования у ксенотрансплантатов Н1975 при введении дозы в течение 14 дней

	Фосфо-ЕСРКгугхиьи	Фосфо- ЕККТЬг202/Тух204	Фосфо-АКТаег”л
Доза	А О	ΐ	с о	ΐ	ь о	С О
(мг/кг)	клеток	сниже-	клеток	снижения	клеток	сниже-
		НИЯ				НИЯ
Контроль-	2711,88	ΝΑ	2312,6	ΝΑ	4212,0	ΝΑ
носитель
10	1411,9	49, 0*	2014,3	11,8	1912,1	53, 6*
30	1211,3	56, 1а	1314,9	41,8а	1211,9	72,4а
100	10+1, 8	63, 7’	1013,7	57, 1’	1111,9	74,4’

КА, нет данных

Величины представляют собой среднее ±8Ό ^аР<0,0001.

1п У1уо влияние ХЬ-647 на активность рецепторных тирозинкиназ-мишеней (КТК) (ЕОРК, НЕК2/ЕгЬВ2, УЕОРК2/КЭК) оценивали путем измерения уровней фосфорилирования рецепторов в ксенотрансплантатах опухолей (ЕОРК, НЕК2/ЕгЬВ2) или легких мышей (УЕОРК2/КЭК) после перорального (РО) введения ХЬ-647 (табл. 18), используя способы, аналогичные описанным ранее.

Таблица 18. Результаты ингибирования фосфорилирования с помощью ХЬ-647 на моделях легких и ксенотрансплантатов

	НЕК2/ЕгЬВ2
	ρ-Υ-ΕΟΓΒ	фосфо	Итого	ρ-Υ- УЕЕГК2/КОК
Прогнозируемая величина Ю50 (концентрация в плазме)	0,72 мкМ	3 г б мкМ	<6,4 мкМ	1,2 ωκΜ
Одна доза Продолжительность действия (100 мг/кг. Ингибирование>50%)	>72 ч	>72 ч	>96 ч	Νϋ

1С₅₀, концентрация, необходимая для 50% ингибирования; ΝΏ, нет данных; фосфо = уровень фосфорилирования.

Анализ р-У-ЕОРК, р-У-НЕК2/ЕгЬВ2 (и полностью НЕК2/ЕгЬВ2) и р-У-УЕОРК2/КЭК осуществляли на ксенотрансплантатах А431 и ВТ474 и легких мышей, соответственно.

Данные этих фармакодинамических экспериментов показывают, что ш У1уо ХЬ-647 ингибирует важнейшие КТК, вовлеченные в стимуляцию пролиферации и ангиогенеза опухоли, а также вовлеченные в РКЭ (ЕОРК, НЕК2/ЕгЬВ2, УЕОРК2/КЭК). Это позволяет предположить, что эффективность ХЬ-647 против большого числа ксенотрансплантатов происходит вследствие ингибирования деления опухолевых клеток и ответов эндотелиальных клеток хозяина. В целом существовала удовлетворительная корреляция между увеличением концентраций лекарственного средства в плазме и повышенным ингибированием фосфорилирования рецепторов при испытанных дозах. Единичные дозы 100 мг/кг соединения ХЬ647 приводили к пролонгированному ингибированию фосфорилирования рецепторов (>72 ч).

Сопоставление экспозиции в плазме и фармакодинамики в отношении ингибирования ЕОРК показало зависимость от дозы. Концентрация в плазме 4 мкМ привела к 89% ингибированию фосфорилирования ЕОРК в ксенотрансплантатах А431 (табл. 19). Исходя из взаимосвязи концентрация в плазме/ингибирование фосфорилирования ЕОРК, прогнозируют появление 50% ингибирования фосфорилирования ЕОРК при концентрации в плазме 0,72 мкМ.

- 24 025451

Таблица 19. Концентрация в плазме ХЬ-647 против ингибирования ЕОРК

Доза (мг/кг)	Средняя концентрация в плазме (8Ώ) (мкМ)	Ингибирование ρ-Υ-ЕСГЕ
Носитель	-	0, 0
3	0, 42 (0, 08)	41,0
10	1, 49 (0, 35)	70,0
30	4,01 (1,06)	89, 0
100	6, 50 (1,39)	93,0
Ιη νίνο 1С5о	0,72	50

ЕОРК, рецептор эпидермального фактора роста; 1С₅₀, концентрация, необходимая для 50% ингибирования; §Ό, стандартное отклонение. ХЬ-647 вводили за 3,5 ч до введения ЕОР. Уровни ρ-Υ-ЕОРК измеряли через 30 мин после введения ЕОР

Кинетические характеристики, с которыми ХЬ-647 влияет на пролиферацию и васкуляризацию опухоли, определяли, используя количественную иммуногистохимию и гистологию на срезах опухолей ксенотрансплантатов МОА-МВ-231, полученных от мышей, обработанных ежедневно с помощью ХЬ647 в течение 3, 5 или 7 дней. Пролиферацию опухоли измеряли путем окрашивания на присутствие Κί67, который избирательно идентифицирует клетки в §-фазе. Степень васкуляризации опухоли измеряли путем окрашивания с помощью маркера эндотелиальных клеток СЭ31 (табл. 20).

Таблица 20. Влияние ХЬ-647 на пролиферацию и васкуляризацию клеток опухоли МОА-МВ-231 ίη νίνο

Доза (мг/кг)	Время (дни)	ΚΪ67 (% уменьшения)1	СО31 (% уменьшения)1
100	3	9,62	76,5
	5	33,8	90,18
	7	48,7	95,7

относительно носителя

ХЬ-647 при дозе 100 мг/кг вызвал быстрое снижение васкуляризации с 76% ингибированием, заметным на 3 день и почти полным отсутствием эндотелиальных клеток в опухоли на 7 день. В продолжении эксперимента происходило все большее уменьшение количества пролиферирующих клеток, причем 50% снижение наблюдалось на день 7.

Быстрое появление и распространение утраты микрососудов из этих опухолей в значительной степени указывает на то, что ХЬ-647 скорее влияет на жизнеспособность эндотелиальных клеток в новообразованных сосудах, чем лишь на ингибирование происходящего ангиогенеза.

Пример 8. Предклинические примеры - доклиническая фармакокинетика

Доклиническую фармакокинетику (РК) соединения ХЬ-647 изучали на мышах, крысах, собаках и обезьянах. Животным вводили дозы либо один раз, либо ежедневно в течение нескольких дней, как описано в табл. 21 и 22 ниже. Обобщенные результаты также можно найти в табл. 21 и 22 ниже. ХЬ-647 вводили в виде жидкой препаративной формы со 100% нормальным физиологическим раствором или в твердом виде в желатиновой капсуле в дозе 10 или 30 мг/кг. В исследованиях с одной дозой системная экспозиция лекарственного средства (т.е. АИС) по-видимому, возрастает приблизительно пропорционально дозе при более низких диапазонах доз у крыс (10-100 мг/кг), обезьян (2-20 мг/кг) и собак (3-30 мг/кг), но меньше чем пропорционально дозе при более высоких диапазонах доз (200-2000 мг/кг у крыс, 5-300 мг/кг у обезьян и 100-1000 мг/кг у собак). Минимальная (<2-кратной) аккумуляция ХЬ-647 в плазме наблюдалась при повторном ежедневном введении дозы. Средние величины !_тах составили приблизительно от 4 до 8 ч, и период полувыведения из плазмы находился в диапазоне от 9,41 до 20,9 ч. В РК соединения ХЬ-647 не было обнаружено явных отличий, связанных с полом. У всех видов наблюдались большие объемы распределения (т.е. >18 л/кг после IV введения). ХЬ-647 оказался биодоступным перорально у мышей, крыс и собак. Наивысшую биодоступность измеряли у собак (63-74%), и она оказалась аналогичной для таблеток и жидких препаративных форм.

У ХЬ-647 наблюдалось умеренно высокое связывание с белком, 91-96%, с белками плазмы в плазме крысы, мыши и человека, что определяли путем ультрафильтрации, используя стандартные способы. Равновесный диализ показал, что ХЬ-647 в плазме человека связан с белками на 93-97,5%.

- 25 025451

Таблица 21. Доклиническая фармакокинетика одной дозы ХЬ-647

Исследо- вание	Вид	СЬР	Путь	Доза	Аисо-ΐ	Сщдх	<4/2
				(мг/ кг)	(нг ♦ ч/мл)	(нг/ мл)	(часы)
ΧΝ-647- N0-001	крыса	Да	Перо- рально	200	29470	1001	ΝΑ
				600	41241	1327	ΝΑ
				2000	52961	1687	ΝΑ
ХЬ-647- N0-001	собака	Нет	Перо- рально	100	М:8969	407	10,4
					К: 21174	1103	14,2
				300	М: 7793	936	12,7

ЛиСо-ι, площадь под кривой концентрация в плазме-против-времени от 0 ч до последней временной точки отбора проб; Стах, максимальная концентрация в плазме; Р, самки; 01, желудочно-кишечный; ОЬР, надлежащая лабораторная практика; НСТ, гематокрит; НОВ, гемоглобин; ЬОЛЕЬ, наименьший наблюдаемый уровень негативного эффекта; М, самцы; ΜΤΌ, максимальная переносимая доза; ΝΑ, нет данных; ΝΟΛΕΕ, отсутствие наблюдаемого уровня негативного эффекта; ро, перорально; РВС, красная кровяная клетка; 1_1/2, конечный период полувыведения.

Таблица 22. Доклиническая фармакокинетика повторных доз ХЬ-647

Иссле- дование	Вид	сьр	Путь	Доза	лисо.24	Сщах	(1/2
					(нг· ч/мл)	(нг/ мл)	(часы)
ХЬ-647- N0-006	Обезь- яна	Нет	Перо- рально	Фаза 1, 50 мг/кг 2 раза в день*2, затем прекращают из- за токсичности	М: 14508	755	ΝΟ
				Р: 17449	912	ЫС

- 26 025451

				Фаза 1, 100 мг/кг 1 раз в день*2, затем прекращают из- за токсичности	М: 19605	1220	20,7
				Р: 27987	2161	11,6
				Фаза 1, 300 мг/кг 1 раз в день* 2, затем прекращают из- за ТОКСИЧНОСТИ	М: 38377	2941	12,1
				Р: 21076	1505	14,8
				Фаза 2, 10 мг/кг 1 раз в день*7	М: 3627с	230с	14,7с
					Р: 4269	216	14,9
ХЬ-647- N0-013	Крыса	Да	Перо- рально	10 мг/кг 1 раз в день*14	2013	138	11,4
				30 мг/кг 1 раз в день*14	5741	319	20,4
				100 мг/кг 1 раз в день*12	18311	909	N0
ХЬ-647- N0-014	Обезь- яна	Да	Перо- рально	2 мг/кг 1 раз в день*14	М:488	28.4	ΝΑ
					Р:450	38	ΝΑ
				6 мг/кг 1 раз в день*14	М:1855	106	ΝΑ
					Р:1690	116	ΝΑ
				20 мг/кг 1 раз в деньх7 или 8Ь, затем прекращают из- за токсичности, наблюдаемой в дни 6 и 7	М:39О1	194	ΝΑ
				Р:3912	202	ΝΑ

- 27 025451

ХЬ-647- N0019	Крыса	Да	Перо- рально	1 мг/кг 1 раз в день/90	198	12,7	14,4
				3 мг/кг 1 раз в день х90	776	50.4	20,4
				10 мг/кг 1 раз в день/90	3433	183	16,4
ХЬ-647- N0022	Крыса	Да	Перо- рально	3 мг/кг 1 раз в день*180	ΝΑ	ΝΑ	ΝΑ
		Да		10 мг/кг 1 раз в день/180	ΝΑ	ΝΑ	ΝΑ
				30 мг/кг 1 раз в день/180	ΝΑ	ΝΑ	ΝΑ
ХЬ-647- N€-021	Обезь- яна	ΝΑ	N0	0,3 мг/кг 1 раз в день/180	ΝΑ	ΝΑ	ΝΑ
				1 мг/кг 1 раз в деньу180	ΝΑ	ΝΑ	ΝΑ
				3 мг/кг 1 раз в день/180	ΝΑ	ΝΑ	ΝΑ
				6 мг/кг 1 раз в день*270	ΝΑ	ΝΑ	ΝΑ

Соотношение А/О, отношение альбумина к глобулину; ЛЬТ, аланинаминотрансфераза; АЗТ, аспартатаминотрансфераза; АиС0-24, площадь под кривой концентрация лекарственного средства в плазмевремя от 0 до 24 часов; ΒυΝ, азот мочевины крови; С_тах, максимальная концентрация в плазме; Р, самки; ΟΙ, желудочно-кишечный; ΟΕΡ, надлежащая лабораторная практика; НОВ, гемоглобин; НСТ, гематокрит; М, самцы; ΝΑ, нет данных; ΝΟ, назогастральный; НОЛЕЬ, отсутствие наблюдаемого уровня негативного эффекта; ро, перорально; цд, ежедневно; 1_1/2, конечный период полувыведения

a) Определяли после последней дозы, представлено в виде средней величины, и, если не указано другого, применимо к самцам и самкам вместе

b) Токсикокинетические величины представлены для дня 7

c) Величины на основе отбора проб 0-48 ч на день 7.

Пример 9. Результаты клинических исследований человека

ХЬ-647 доставляли в виде таблеток от белого до беловатого цвета по 50 мг. Эти таблетки предлагаются в двух конфигурациях: 1) овальные таблетки от белого до беловатого цвета, одна из сторон поделена пополам и другая сторона ровная, содержащие 50 мг соединения ХЬ-647 в препаративной форме с концентрацией лекарственного средства 33,33%, и 2) круглые таблетки от белого до беловатого цвета, содержащие 50 мг ХЬ-647 в препаративной форме с концентрацией лекарственного средства 50%.

Композиция для обеих препаративных форм на основе лактозы с немедленным высвобождением представлена в табл. 23 и табл. 24 ниже. Сравнительные исследования растворения двух препаративных форм ХЬ-647 оценивали при условиях, соответствующих ίη νίνο биодоступности, и подтвердили сопоставимость обеих препаративных форм. Все исследуемые препараты хранили при комнатной температуре и инвентаризировали согласно состоянию пригодности и федеральным законам. При повторной упаковке изучаемого лекарственного средства его распределяли по упаковкам из полиэтилена высокой плотности (ТОГЕ).

- 28 025451

Таблица 23. Количественный состав таблеток ХЬ-647 (препаративная форма 33,3%)

Ингредиент	% масс.	мг на таблетку
Лекарственное вещество ХЬ-647	33, 33	50,00
Моногидрат лактозы 80, ΝΕ	40, 00	60,00
Микрокристаллическая целлюлоза, ΝΕ (Ανίοβΐ РН101)	11,37	17,05
Гипромеллоза 2910 (НРМС), иЗР	5, 00	7, 50
Кросповидон, ΝΕ	5, 00	7,50
Лаурилсульфат натрия, ΝΕ	4,00	6, 00
Коллоидный диоксид кремния (СаЪ-О-511 М5Р)	0,70	1, 05

Стеарат магния, Сгайе)	ЫГ (УедеРаЫе	0, 60	0, 90
Очищенная вода,	игр	Удаляют в	Удаляют в
		процессе	процессе
		производства	производства
Итого	100,00	150,00

Таблица 24. Количественный состав таблеток ХЬ-647 (препаративная форма 50%)

Ингредиент	% масс.	мг на таблетку
Лекарственное вещество ХЬ-647	50, 00	50, 00
Моногидрат лактозы 80, НЕ	25,70	25, 70
Микрокристаллическая целлюлоза, ΝΡ (Ανίοθΐ РН101)	10, 00	10, 00
Гипромеллоза 2910 (НРМС), ϋ5Ρ	3,00	3,00
Кросповидон, ΝΕ	7,00	7,00
Лаурилсульфат натрия, ΝΓ	3,00	3,00
Коллоидный диоксид кремния (СаЬ-Ο-ΞίΙ М5Р)	0,70	0,70
Стеарат магния, ΝΕ (УедеЬаЫе Сгайе)	0, 60	0, 60
Очищенная вода, У5Р	Удаляют в процессе производства	Удаляют в процессе производства
Итого	100,00	100,00

ΝΡ, национальный формуляр; υδΡ, фармакопея США

Отдельные исследования осуществляли согласно следующему:

Исследование ХЬ-647-001:

Индивидуумам, страдающим солидными опухолями на запущенных стадиях, (п=41), вводили дозу по схеме приема с 14-дневным циклом с перерывом (прерывистая схема 5&9). В дни 1-5 индивидуумы получили ХЬ-647, последующие 9 дней (дни 6-14) не получили лечения. ХЬ-647 вводили по прерывистой схеме 5&9 с уровнями доз в диапазоне от 0,06 до 7,00 мг/кг 41 индивидууму с большим числом солидных опухолей.

Выборка оказалась полной, и все индивидуумы закончили исследование по данным на 31 мая 2007 г. Индивидуумы исходно получили препаративную форму в виде порошка в бутылочке (ΡΙΒ), используя дозировку по массе. Определяли, что МТИ составила 4,68 мг/кг, что преобразовывали в фиксированную дозу 350 мг. Конечная группа получила фиксированную дозу 350 мг в препаративной форме - таблетке.

Исследование ХЬ-647-002:

Индивидуумов, страдающих солидными опухолями на запущенных стадиях, отбирали в следующие друг за другом группы для получения ХЬ-647 в одну пероральную дозу ежедневно. В целом 31 индивидуум получил лечение при одном из 5 уровней доз в диапазоне от 75 до 350 мг. Определяли, что МТИ составила 300 мг, и 18 индивидуумов получили лечение при этом уровне дозы.

Исследование ХЬ-647-004:

Здоровые добровольцы (п=24) получали одну дозу 300 мг ХЬ-647 либо во время приема пищи, либо

- 29 025451 натощак, затем через 22 дня, меняя условие приема ХЬ-647 на противоположное. Анализировалось влияние пищи на биодоступность.

Исследование ХЬ-647-005:

Здоровые добровольцы (п=8) получали одну пероральную дозу 300 мг меченого ХЬ-647 (¹⁴С-ХЬ647) и оценивали метаболизм и выведение лекарственного средства. Анализировали всасывание, метаболизм, выделение и баланс массы.

Исследование ХЬ-647-201:

Отбирали индивидуумов, страдающих немелкоклеточным раком легких (Νδί'Έί'.') (п=52) с гистологией аденомы-карциномы на стадии ΙΙΙΒ со злокачественным плевральным выпотом или на стадии IV, ранее не получавших лечение по поводу метастазирующего заболевания. Индивидуумов отбирали по клиническим характеристикам, прогнозирующим ответ на ингибиторы БОРК (азиаты, женщины и/или минимальное и давнее курение в анамнезе). ХЬ-647 вводили либо по 350 мг по прерывистой схеме 5&9 (п=41), либо по 300 мг по схеме ежедневно (п=13).

Исследование ХЬ-647-203:

Отбирали индивидуумов (п=41), страдающих рецидивирующим или повторным Νδί'Ρί'.' (стадия ΙΙΙΒ или IV) с документированным прогрессирующим заболеванием после улучшения при лечении одним агентом эрлотинибом или гефитинибом или с известной мутацией ЕОРК Т7 90М. Индивидуумы получили ХЬ-647 по 300 мг перорально один раз в день.

По данным на 1 августа 2008 г. данные по клинической безопасности доступны для 159 индивидуумов, страдающих раком и получивших лечение ХЬ-647. Самыми частыми негативными реакциями (АЕ), испытанными индивидуумами, получающими один агент ХЬ-647, (частота >10%, в порядке уменьшения частоты) оказались диарея, сыпь, утомляемость, тошнота, сухая кожа, кашель, одышка, потеря аппетита, удлинение ОТ на электрокардиограмме (считывание прибором), рвота, запор, извращение вкуса, инфекции верхних дыхательных путей, боль в области живота, боль в пояснице, лихорадка, головокружение и сухость во рту. Большинство из этих АЕ оценивали на балл 1 или балл 2 и не привели к прекращению исследования лекарственного средства. От приема исследуемого лекарственного средства не умер никто.

Противоопухолевая активность была обнаружена у индивидуумов, получающих ХЬ-647 как по прерывистой схеме 5&9, так и по схеме ежедневного приема. В исследованиях фазы 1, используя прерывистую схему, у одного индивидуума, страдающего ЖС'ЪС. стабилизация заболевания наблюдалась до 228 дня с получением неподтвержденного частичного ответа (РК) и у 14 других индивидуумов (включая трех индивидуумов, страдающих ЖС'ЬС) наблюдалась пролонгированная стабилизация заболевания (8Ό), продолжавшаяся более 3 месяцев. В фазе 1 второго исследования, т.е. ХЬ-647-002, 16 индивидуумов, включая 3 индивидуумов, страдающих ^СЬС, достигли 8Ό, продолжавшейся более 3 месяцев. Из 38 поддающихся оценке индивидуумов, зачисленных в исследование ХЬ-647-201 фазы 2 (первая линия, у индивидуумов, отобранных по клиническим характеристикам, как имеющих мутации ЕОРК) по прерывистой схеме 5&9, у 10 наблюдался РК и у 17 индивидуумов 8Ό, продолжавшаяся 3 месяца или больше, со степенью клинического успеха (РК+δΌ) 71%. Из этих индивидуумов, которые достигли клинического успеха, у шести индивидуумов, опухоль которых содержала 19 делеций экзонов ЕОРК, и одного индивидуума с мутацией Ь858К наблюдались РК, и у 2 с точковыми мутациями Ь858К имелась 8Ό. В фазе 2 второго исследования у индивидуумов, страдающих повторным или рецидивирующим №СЬС (стадия ΙΙΙΒ или Ιν, п=41), с документально подтвержденным прогрессирующим заболеванием после успеха при лечении одним агентом эрлотинибом или гефитинибом или с известной мутацией ЕОРК Т790М у одного индивидуума получен РК и у 19 индивидуумов получена 8Ό в качестве их наилучшего ответа.

При подготовительном анализе данных по клинической фармакокинетике (РК) у индивидуумов, получающих пероральные дозы ХЬ-647 по прерывистой схеме 5&9, площадь под графиком концентрация-время (АИС) и максимальная концентрация лекарственного средства в плазме (С_тах) в основном возросли пропорционально дозе во всем изученном диапазоне доз (т.е. при суммарных дозах от 3,4 до 586 мг). Средний конечный период полувыведения после 5 последовательных доз составил приблизительно 60 ч и в основном не зависел от дозы. ХЬ-647 быстро всасывался после перорального введения со средним 1_тах около 4 ч. После ежедневного перорального введения дозы 300 мг/день (ΜΤΌ) ХЬ-647 накопился в плазме приблизительно 4-кратно, причем равновесная концентрация достигнута к около 15 дню. Ежедневное введение 300 мг ХЬ-647 привело приблизительно к 2-кратному повышению средней экспозиции за 28-дневный период по сравнению с прерывистой схемой 5&9 с 350 мг.

Доклинические и ш νίΐΓΟ исследования метаболического профиля указывают на то, что ХЬ-647 представляет собой субстрат для СУР3А4-опосредованного метаболизма в микросомах печени человека. ХЬ-647 являлся ингибитором изозимов СУР2П6 и СУР2С8 ш νίίτο, но не СУР3А4 в микросомах печени человека. ХЬ-647 перорально биодоступен у большого числа видов и в плазме человека связывается с белком с высоким сродством (93-99%).

В клиническом исследовании влияния пищи (ХЬ-647-004) у здоровых индивидуумов АИС возросла приблизительно на 18% при наличии пищи, тогда как С_тах повысился лишь на около 5%. Поэтому введение ХЬ-647 с пищей или в сочетании с лекарственными средствами или веществами, которые ингибиру- 30 025451 ют активность СУБ3А4, может привести к повышенной экспозиции ХЬ-647.

Предшествующие данные исследования баланса массы указали на то, что ХЬ-647 метаболизировался в значительной степени и экскретировался главным образом с испражнениями.

Claims (14)

1. Способ лечения поликистозной болезни почек (ТКЭ) у млекопитающего, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения формулы или его фармацевтически приемлемой соли.

2. Способ по п.1, в котором млекопитающее представляет собой человека.

3. Способ по п.1, в котором млекопитающее представляет собой животное из семейства кошачьих.

4. Способ по п.3, в котором животное из семейства кошачьих представляет собой персидского кота.

5. Способ по любому из пп.1-4, где соединение доставляют в форме фармацевтической композиции, содержащей соединение или его соль и фармацевтически приемлемый носитель, эксципиент и/или разбавитель.

6. Применение соединения формулы или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного препарата для лечения ΡΙ<Ω у млекопитающего.

7. Применение по п.6, в котором млекопитающее представляет собой человека.

8. Применение по п.6, в котором млекопитающее представляет собой животное из семейства кошачьих.

9. Применение по п.8, в котором животное из семейства кошачьих представляет собой персидского кота.

10. Применение соединения формулы для лечения ΡΟ у млекопитающего.

11. Применение композиции, содержащей соединение формулы для лечения ΡΟ у млекопитающего.

12. Применение по п.10 или 11, в котором млекопитающее представляет собой человека.

13. Применение по п.10 или 11, в котором млекопитающее представляет собой животное из семейства кошачьих.

14. Применение по п.13, в котором животное из семейства кошачьих представляет собой персидского кота.