CN103596570A

CN103596570A - 作为抗癌治疗的蛋白质靶的氧化鲨烯环化酶

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Publication number: CN103596570A
Application number: CN201180063224.1A
Authority: CN
Inventors: 邹晓勤; 萨尔曼·M·海德; 梁雅韵; 山姆·Z·格林特; 黄胜友
Original assignee: Board Of Curators Of University Of Missouri
Current assignee: Board Of Curators Of University Of Missouri
Priority date: 2010-12-27
Filing date: 2011-12-22
Publication date: 2014-02-19
Anticipated expiration: 2031-12-22
Also published as: CN103596570B; JP2017075178A; WO2012092114A3; WO2012092114A2; EP2658544A2; AU2011352378B2; JP6106094B2; EP2658544A4; AU2011352378A1; US20140005187A1; JP2014505047A; CA2822207A1; US10143686B2

Abstract

本发明鉴定的胆固醇生物合成途径(包括氧化鲨烯环化酶)作为抗肿瘤治疗的新蛋白质靶。本发明还提供一类含有与芳环结构连接的叔胺的氧化鲨烯环化酶抑制剂作为新类别的抗癌药。本文中公开的化合物已经在19个细胞系中以及在裸鼠中的人乳腺及前列腺异种移植物肿瘤生长物内测试过，所述细胞系包括乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞(包括耐药性肺癌H69AR细胞)，结肠癌细胞、卵巢癌细胞(包括耐药性OVCAR-3细胞)和胰腺癌细胞，并且已经证实有活性。

Description

作为抗癌治疗的蛋白质靶的氧化鲨烯环化酶

本申请要求2010年12月27日提交的美国临时申请号61/460,167和2011年08月28日提交的美国临时申请号61/628,324的优先权益，所述文献的公开内容通过引用的方式如其中所书写那样完整并入。

基金声明

本发明是在美国政府支持下在国家健康研究所资助的基金号R21GM088517、R56CA86916和T15LM07089做出的。美国政府享有本发明中的某些权利。

本文中公开了抗癌药物和治疗方法，更具体地涉及用于治疗癌症的新蛋白质靶，连同其抑制剂。

OSC及其抑制剂：所述的酶——氧化鲨烯环化酶(‘OSC’)已知是胆固醇生物合成途径的一部分，因而OSC将氧化鲨烯转化成羊毛固醇，形成类固醇支架[1，2]。已经报道OSC的众多抑制剂，包括一系列含有叔胺、己氧基间隔团和无约束的溴苯基的抑制剂，如式I

其中Q可以是溴，这仅为其中之一，并且R₁和R₂可以是脂族基或芳基，这仅为其中之一。下文更详细地公开式I；还见[3.4]。下文进一步给出在溴苯基环与甲氧苯基环具有芳族接头或在所述环之间具有酮接头的类似物的例子：

在它们当中，下文显示的Ro48-8071(4′-[6-(烯丙基甲基氨基)己氧基]-4-溴-2′-氟二苯甲酮延胡索酸酯)是OSC的强力抑制剂。

Ro48-8071，也称作(4-溴苯基[2-氟-4-[[6-(甲基-2-丙烯基氨基)己基]氧]苯基]-甲酮，是市售的；见，例如，西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，产品编号R2278。虽然已经将OSC连同其抑制剂作为降低血浆胆固醇水平的靶进行研究[5]，但是先前未曾鉴定OSC作为潜在的抗肿瘤靶。

p53瘤抑制基因：p53肿瘤抑制基因的突变是在许多类型的肿瘤中常见的事件，如乳腺癌[6-8]。认为突变p53(mtp53)蛋白促进肿瘤细胞存活和化疗药物抗性。因此，寻求通过将现有mtp53转变成野生型p53(wtp53)构象而恢复p53功能作为一种促进易感性癌症中肿瘤细胞凋亡的策略。

PRIMA-1从高通量实验找到的小分子PRIMA-1(p53再激活和诱导大规模凋亡，也称作2，2-双(羟甲基)-3-奎宁环酮，下文显示)已经激起巨大兴趣，原因在于其激活突变p53蛋白的能力，因而恢复与与野生型p53相关的肿瘤抑制基因功能[9]。

这种作用已经在体外和体内展示，并且显示在人乳腺癌细胞中引发大规模凋亡[10，11]。虽然PRIMA-1的抗肿瘤作用建立了它作为潜在抗癌药物的重要性，但是其再激活突变p53的机制仍难以理解。不确定它是否直接与p53结合，而一些未公开的NMR实验提出与直接结合相反的观点。因此，需要鉴定PRIMA-1的直接蛋白质靶，这可能导致新的癌症治疗范式。我们的结果提出，PRIMA-1的化疗作用的蛋白质靶之一是OSC酶。

因此，存在为抗癌治疗建立新靶的需要，而OSC酶及其信号传导途径充当潜在的选择性抗肿瘤靶。也存在鉴定新抑制剂的需要，所述新抑制剂因抑制OSC的活性而在治疗癌症方面具有潜在的治疗性应用。

在一个方面，本文中提供一种通过靶向胆固醇生物合成途径中的蛋白质如酶氧化鲨烯环化酶(‘OSC’)用于癌症疗法和治疗的方法。在某些实施方案中，提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括抑制胆固醇生物合成途径中的酶。在某些实施方案中，该酶是氧化鲨烯环化酶。在某些实施方案中，该方法包括抑制癌细胞中的氧化鲨烯环化酶活性的步骤。癌细胞可以是不同类型和/或起源的，如这些细胞选自乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、卵巢癌细胞、胰癌细胞、肝癌细胞、甲状腺癌细胞、胃癌细胞、子宫癌细胞、淋巴瘤、脑癌细胞、皮肤癌细胞、肾癌细胞、口腔癌细胞、喉癌细胞、舌癌细胞、鼻癌细胞、食管癌细胞和膀胱癌细胞，以及白血病细胞，及其耐药性表型，如19个细胞系的体外癌细胞生长实验中采用IC₅₀分析所展示。在某些实施方案中，使用一系列氧化鲨烯环化酶抑制剂，即，含有与芳环结构连接的叔胺的抑制剂，作为癌症疗法中的治疗药。化合物4′-[6-(烯丙基甲基氨基)己氧基]-4-溴-氟二苯甲酮延胡索酸酯(Ro48-8071)是示例性抑制剂。

附图简述

图1是对接有PRIMA-1(如所绘制那样指向结合袋顶部的较深色结构)和抑制剂Ro48-8071(较浅结构)的氧化鲨烯环化酶(‘OSC’)的带状图。

图2显示PRIMA-1、Ro48-8071和U18666A对乳腺癌细胞生存力的影响。将BT-474细胞(1.0x10⁴/孔，见图2A，上图)或T47-D细胞(0.6x10⁴/孔，见图2B，下图)接种至96孔板中过夜，并且将细胞洗涤并用所示浓度的Ro48-8071或PRIMA-1处理24小时。细胞生长和生存力由方法中所描述的SRB测定法测定。OSC-抑制剂Ro48-8071、PRIMA-1和U18666A以剂量依赖性方式显著地抑制BT-474和T-47-D细胞的生存力。

图3显示Ro48-8071对乳腺癌细胞生存力和正常乳腺细胞生存力的影响。将BT-474细胞(1.0x10⁴/孔)或AG11132A细胞(0.7x10⁴/孔)接种至96孔板中过夜，并且将细胞洗涤并用所示浓度的Ro48-8071处理24小时。存在正常乳腺AG11132A细胞生存力的显著较少抑制。

图4显示RO48-8071在24小时和48小时内对乳腺癌细胞系BT-474(见图4A，左上)、T47-D(见图4B，右上)和MCF-7(见图4C，底部)的生存力的影响。

图5显示RO48-8071在24小时和48小时内对前列腺癌细胞系LNCaP(见图5A，左上)、PC-3(见图5B，右上)和DU145(见图5C，底部)的生存力的影响。

图6显示RO48-8071在24小时和48小时内对结肠癌细胞系DLD-1(见图6A，左上)和LoVo(见图6B，右上)，以及卵巢癌细胞系OVCAR-3(见图6C，左下)和SK-OV-3(见图6D，左下)的生存力的影响。

图7显示RO48-8071在24小时和48小时内对肺癌细胞系H69AR(见图7A，左上)、NCI-H23(见图7B，右上)和A549(见图7C，底部)的生存力的影响。

图8显示RO48-8071在24小时和48小时内对胰腺癌细胞系Capan-1(见图8A，左)和(见图8B，右)的生存力的影响。

图9显示RO48-8071在24小时和48小时内对雌激素受体、孕酮受体和HER-2/neu受体阳性乳腺癌细胞系HCC-1428(见图9A，左上)和ZR-75(见图9B，右上)以及雌激素受体、孕酮受体和HER-2/neu受体阴性乳腺癌细胞系MDA-231(见图9C，左下)和BT20(见图9D，左下)的生存力的影响。

图10显示凋亡测定法在人乳腺癌细胞的雌激素受体、孕酮受体和HER-2/neu受体阴性细胞(分别是图10A和10B)和雌激素受体、孕酮受体和HER-2/neu受体阳性细胞(分别是图10C和10D)中的结果。将BT-474(图10A)、MCF-7(图10B)、BT-20(图10C)和MDA-231(图10D)细胞针对早期凋亡标记(膜联蛋白V)和晚期凋亡/细胞死亡标记(碘化丙啶)进行染色。象限R5显示膜联蛋白V阳性细胞并且象限R3显示膜联蛋白V外加碘化丙啶阳性细胞。

图11描述来自代表性实验的柱状图，其显示来自BT-474、MCF-7、BT-20和MDA-231肿瘤细胞系的膜联蛋白V阳性外加PI阳性细胞(总计死细胞)。在全部细胞系中观察到剂量比例反应。

图12显示凋亡测定法在雄激素受体阴性人前列腺癌细胞中的结果。PC-3(图12A)和DU-145(图12B)细胞用Ro48-8071处理和针对早期凋亡标记(膜联蛋白V)和晚期凋亡/坏死(碘化丙啶)标记染色；象限R5显示膜联蛋白V阳性细胞并且象限R3显示膜联蛋白V外加碘化丙啶阳性细胞。图12C中给出来自代表性实验的凋亡细胞和死细胞(膜联蛋白V阳性外加PI阳性细胞)的百分数。

图13A显示RO48-8071在体内阻抑异种移植物乳腺肿瘤(BT-474)的生长。图13B显示RO48-8071对荷瘤裸鼠的动物重量的影响。

图14A显示RO48-8071在体内阻抑异种移植物前列腺肿瘤(PC-3)的生长。图14B显示RO48-8071对荷瘤裸鼠的动物重量的影响。

本文中公开了一种通过靶向胆固醇生物合成途径中的蛋白质靶如酶氧化鲨烯环化酶(‘OSC’)用于癌症疗法和治疗的新颖和改良方法。还公开了一种化合物用于治疗癌症的用途，其中所述化合物抑制细胞的胆固醇生物合成途径中蛋白质靶的活性。进一步公开了制造包含下述化合物的药物用于治疗癌症的用途，其中所述化合物抑制细胞的胆固醇生物合成途径中蛋白质靶的活性。

在某些实施方案中，用于癌症疗法和治疗的方法涉及通过抑制细胞中OSC活性的步骤降低癌细胞生存力。这种方法适用于类型和/或起源的癌细胞，如而不限于乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、卵巢癌细胞、胰癌细胞、肝癌细胞、甲状腺癌细胞、胃癌细胞、子宫癌细胞、淋巴瘤、脑癌细胞、皮肤癌细胞、肾癌细胞、口腔癌细胞、喉癌细胞、口腔癌细胞、喉癌细胞、舌癌细胞、鼻癌细胞、食管癌细胞和膀胱癌细胞，以及白血病细胞，及它们的耐药性表型。

在某些实施方案中，提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需求的患者给药胆固醇生物合成途径中的酶的抑制剂。在其他实施方案中，胆固醇生物合成途径中的酶不是羟甲戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶。尽管抑制羟甲戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶可能是一种治疗癌症的有效方法，但是它已经与限制其实际使用的毒理学副作用相关[19]。在某些实施方案中，提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需求的患者给药OSC抑制剂。在某些实施方案中，提供一种治疗癌症的方法，所述方法包括向有需求的患者给药Ro48-8071。

还提供一种治疗众所周知因耐药性而难以治疗的癌症的方法，所述方法包括抑制胆固醇生物合成途径中的酶。因此，在某些实施方案中，待治疗的癌症是耐药性癌症。在某些实施方案中，该酶是OSC。在其他实施方案中，提供一种治疗耐药性癌症的方法，所述方法包括给药OSC抑制剂。在其他实施方案中，这种OSC抑制剂是Ro48-8071。在其他实施方案中，耐药性癌症是肺癌或卵巢癌。下表2中通过OSC抑制剂(Ro48-8071)对肺癌H69AR细胞和卵巢癌OVCAR-3细胞的影响，展示该方法在治疗耐药性癌症方面的功效。

还提供一种诱导癌细胞凋亡和程序性细胞死亡的方法，所述方法包括抑制胆固醇生物合成途径中的酶。在某些实施方案中，该酶是OSC。在其他实施方案中，这种OSC抑制剂是Ro48-8071。在例如下表2、图10、图11、图和12中通过OSC抑制剂(Ro48-8071)对4个乳腺癌细胞系和2个前列腺癌细胞系的影响，展示该方法在诱导凋亡方面的功效。

还提供一种抑制肿瘤生的方法，所述方法包括抑制胆固醇生物合成途径中的酶。在某些实施方案中，该酶是OSC。在其他实施方案中，这种OSC抑制剂是Ro48-8071。通过OSC抑制剂(Ro48-8071)对裸鼠中人乳腺及前列腺异种移植物肿瘤生长物的影响，展示该方法在抑制人乳腺及前列腺肿瘤生长面的功效。见，例如图13和图14。

还提供比PRIMA-1更有效的抗癌药。PRIMA-1仅对突变p53癌细胞系有效，但是Ro48-8071对突变和野生型p53癌细胞系均有效。因此，本文中提供一种在p53突变的和p53未突变的细胞中治疗癌症的方法，所述方法包括给药抑制胆固醇生物合成途径中的酶的化合物，其中所述化合物不是PRIMA-1。在其他实施方案中，胆固醇生物合成途径中的酶是OSC。在其他实施方案中，这种OSC抑制剂是Ro48-8071。本文中公开了额外的OSC抑制剂。

本文中公开一类包含与芳环结构连接的叔胺的化合物作为用于抑制癌细胞生存力的新抑制剂。在某些实施方案中，新抑制剂具有式I：

或其盐，其中：

X选自氢、卤素、0、NR₃R₄、S、CH₂和CH；

Y选自空白、键、O和CH；

Z选自O、N和CH；

划虚线的键可以存在或不存在；如果存在的，则所述键可以是单键或双键，只要价态允许；

R、R₁和R₂独立地选自烷基、烯、芳基、炔、环烷基和烷基环烷基烷基，其中任一者可以任选地被取代；

R₃和R₄独立地选自键、氢、低级烷基、低级烯、低级炔、芳基和环烷基，其中任一者可以任选地被取代；和

Q选自溴、氯和氟。

在某些实施方案中，X是NH₂。

在某些实施方案中，X是氟。

在某些实施方案中，R是烷基。

在某些实施方案中，R₁和R₂是低级烷基。

在其他实施方案中，新抑制剂具有式II：

或其盐，其中：

X选自O、N、NR₃、S和CH；

Y选自空白、键、O和CH；

Z选自O、N和CH；和

划虚线的键可以存在或不存在；

R₃选自键、氢、低级烷基、低级烯、低级炔、芳基、和环烷基，其中任一者可以任选地被取代；和

Q选自溴、氯和氟。

在某些实施方案中，R是烷基。

在某些实施方案中，R₁和R₂是低级烷基。

在其他实施方案中，新抑制剂具有式III：

或其盐，其中：

X选自氢、卤素和NR₃R₄；

Q选自溴、氯和氟。

在某些实施方案中，X是NH₂。

在某些实施方案中，X是氟。

因此，本文中提供一种治疗癌症的方法，包括步骤：向有需求的患者给药治疗有效量的胆固醇生物合成途径中蛋白质靶的抑制剂。

在某些实施方案中，这种蛋白质靶不是羟甲戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶。

在某些实施方案中，这种蛋白质靶是氧化鲨烯环化酶。

在某些实施方案中，癌症选自乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰癌、肝癌、甲状腺癌、胃癌、子宫癌、淋巴瘤、脑癌、皮肤癌、肾癌、口腔癌、喉癌、舌癌、鼻癌、食管癌和膀胱癌，以及白血病，及其耐药性表型。

在某些实施方案中，癌细胞不具有p53突变。

在某些实施方案中，癌细胞是HER2/neu阳性乳腺癌细胞。

在某些实施方案中，癌细胞是雌激素受体和孕酮受体阳性的乳腺癌细胞。

在某些实施方案中，癌细胞是雌激素受体、孕酮受体和HER2/neu三阴性的乳腺癌细胞。

在某些实施方案中，癌细胞发生凋亡。

在某些实施方案中，抑制剂是并非PRIMA-1的化合物。

在某些实施方案中，该化合物是与至少两个芳环结构连接的叔胺。

在某些实施方案中，该化合物具有如上文公开的式I或其实施方案。

在某些实施方案中，该化合物具有如上文公开的式II或其实施方案。

在某些实施方案中，该化合物具有如上文公开的式III或其实施方案。

在某些实施方案中，该化合物是4′-[6-(烯丙基甲基氨基)己氧基]-4-溴-氟二苯甲酮延胡索酸酯。

本文中还提供一种降低癌细胞生存力的方法，所述方法包括步骤：抑制细胞的胆固醇生物合成途径中的蛋白质靶的活性。

在某些实施方案中，这种蛋白质靶是氧化鲨烯环化酶。

在某些实施方案中，这些细胞选自乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、卵巢癌细胞、胰癌细胞、肝癌细胞、甲状腺癌细胞、胃癌细胞、子宫癌细胞、淋巴瘤、脑癌细胞、皮肤癌细胞、肾癌细胞、口腔癌细胞、喉癌细胞、口腔癌细胞、喉癌细胞、舌癌细胞、鼻癌细胞、食管癌细胞和膀胱癌细胞，以及白血病细胞，及其耐药性表型。

在某些实施方案中，这些细胞不具有p53突变。

在某些实施方案中，癌细胞发生凋亡。

在某些实施方案中，癌细胞是HER2/neu阳性乳腺癌细胞。

在某些实施方案中，抑制步骤用并非PRIMA-1的化合物实现。

在某些实施方案中，该化合物是4′-[6-(烯丙基甲基氨基)己氧基]-4-溴-2′-氟二苯甲酮延胡索酸酯(Ro48-8071)。

本文中还提供一种化合物用于治疗癌症的用途，其中所述化合物抑制细胞的胆固醇生物合成途径中蛋白质靶的活性。

在某些实施方案中，这种蛋白质靶是氧化鲨烯环化酶。

在某些实施方案中，癌症选自乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰癌、肝癌、甲状腺癌、胃癌、子宫癌、淋巴瘤、脑癌、皮肤癌、肾癌、口腔癌、喉癌、口腔癌、喉癌、舌癌、鼻癌、食管癌和膀胱癌，以及白血病，及其耐药性表型。

在某些实施方案中，这些细胞不具有p53突变。

在某些实施方案中，癌细胞发生凋亡。

在某些实施方案中，癌症是乳腺癌，其细胞是HER2/neu阳性的。

在某些实施方案中，癌症是乳腺癌，其细胞是雌激素受体和孕酮受体阳性的。

在某些实施方案中，癌症是乳腺癌，其细胞是雌激素受体、孕酮受体和HER2/neu三阴性的。

在某些实施方案中，抑制步骤用并非PRIMA-1的化合物实现。

本文中还提供一种用于测定胞内OSC活性的方法，所述方法包括：

a)提供待测试OSC活性的哺乳动物癌细胞的样品，和

b)测定样品中2，3-(S)-氧化鲨烯转化成羊毛固醇的水平，

其中2，3-(S)-氧化鲨烯或羊毛固醇的水平与所述胞内OSC活性水平相关。

本文中还提供一种用于测定化合物的促凋亡特性或抗增殖特性的方法，所述方法包括：

a)使包含OSC活性的哺乳动物癌细胞的样品与所述化合物接触；

b)测量样品中以下标记的任一者或多者的水平：

i)凋亡标记和

ii)2，3-(S)-氧化鲨烯、羊毛固醇和胆固醇中的一者或多者；并且

c)将与所述化合物接触的样品中(i)和(ii)的任一者或多者的水平与对照样品中(i)和(ii)的任一者或多者的水平比较，

其中2，3-(S)-氧化鲨烯水平及凋亡标记水平与凋亡及抗增殖水平直接相关，并且羊毛固醇水平及胆固醇水平与凋亡及抗增殖水平反相关。

在某些实施方案中，该方法测量所述样品中2，3-(S)-氧化鲨烯、羊毛固醇和胆固醇的任一者的水平。

在某些实施方案中，该方法测量所述样品中凋亡标记的水平，所述凋亡标记选自膜联蛋白V和胱天蛋白酶3。

本文中还提供一种用于鉴定抑制癌细胞增殖的药物的方法，所述方法包括：

a)提供包含氧化鲨烯环化酶活性的癌细胞的测试样品；

b)或者：

i)通过以下方式测定所述测试样品中的氧化鲨烯环化酶活性：使所述样品与测试药物接触并且将所述测试样品中2，3-(S)-氧化鲨烯、羊毛固醇和胆固醇的任一种的水平与对照样品中2，3-(S)-氧化鲨烯、羊毛固醇和胆固醇的任一种的水平比较；或

ii)通过以下方式测定所述测试样品中的氧化鲨烯环化酶活性：在第一时点测量所述样品中2，3-(S)-氧化鲨烯、羊毛固醇和胆固醇的任一种的水平；使所述样品与测试药物接触，并且在第二时间点测量所述样品中2，3-(S)-氧化鲨烯、羊毛固醇和胆固醇的任一种的水平；和

c)基于以下情况，测定所述测试药物是否为调节氧化鲨烯环化酶胞内活性的药物：

i)与所述对照样品相比，所测试述样品中2，3-(S)-氧化鲨烯、羊毛固醇和胆固醇的任一者的水平的变化；或

ii)从所述第一个时间点至所述第二时间点，所测试述样品中2，3-(S)-氧化鲨烯、羊毛固醇和胆固醇的任一者的水平的变化；

其中2，3-(S)-氧化鲨烯、羊毛固醇和胆固醇的任一者的水平与所述胞内氧化鲨烯环化酶活性水平相关。

本文中还提供一种用于测定用于调节胞内氧化鲨烯环化酶活性的药物的方法，所述方法包括：

a)提供包含氧化鲨烯环化酶活性的癌细胞的测试样品；

b)或者：

i)通过以下方式测定测试样品中的氧化鲨烯环化酶活性：使所述样品与测试药物接触并且将测试样品中癌细胞生存力的水平与对照样品中癌细胞生存力的水平比较；或

ii)通过以下方式测定所述测试样品中的氧化鲨烯环化酶活性：在第一时点测量所述样品中活癌细胞的水平；使所述样品与测试药物接触，并且在第二时间点测量所述样品中活癌细胞的水平；和

i)与所述对照样品相比，所测试述样品中活癌细胞的水平的变化；或

ii)从所述第一个时间点至所述第二时间点，所测试述样品中活癌细胞的水平的变化；

其中活癌细胞的水平与所述胞内氧化鲨烯环化酶活性水平相关。

本文中还提供一种筛选多种化学化合物以鉴定抑制氧化鲨烯环化酶活性的化合物的方法，所述方法包括：

a)使包含氧化鲨烯环化酶活性的癌细胞的测试样品与未知抑制氧化鲨烯环化酶活性的多种化合物接触；

b)测定所述测试样品中2，3-(S)-氧化鲨烯、羊毛固醇和胆固醇的任一种的水平；其中2，3-(S)-氧化鲨烯、羊毛固醇和胆固醇的任一者的水平与所述胞内氧化鲨烯环化酶活性水平相关；

c)将测试样品中的胞内氧化鲨烯环化酶活性与对照样品中的胞内氧化鲨烯环化酶活性比较；和

d)在观察到氧化鲨烯环化酶活性被多种化合物抑制的情况下，分别测定多种化合物中所包含的的每种化合物对氧化鲨烯环化酶活性的抑制作用，从而因此鉴定所包含的抑制氧化鲨烯环化酶的任何单种化合物。

本文中还提供一种制备组合物的方法，所述组合物包含抑制氧化鲨烯环化酶活性的化学化合物，所述方法包括：

a)提供包含氧化鲨烯环化酶活性的癌细胞的测试样品；

b)使所述测试样品与测试化合物接触；

c)与对照样品相比或在测试时间点与对照时间点相比，测定测试样品中氧化鲨烯环化酶活性的降低程度，以便测定对测试样品中氧化鲨烯环化酶活性的抑制程度，其中

i)2，3-(S)-氧化鲨烯、羊毛固醇和胆固醇中任一者；

ii)凋亡标记；或

iii)活癌细胞的水平与氧化鲨烯环化酶活性的水平直接相关；

d)鉴定所述测试化合物作为抑制氧化鲨烯环化酶活性的化合物，并且将如此鉴定的测试化合物或所述测试化合物的功能性类似物或同系物与载体混合，因而制备所述组合物。

在某些实施方案中，2，3-(S)-氧化鲨烯、羊毛固醇和胆固醇的任一者的水平与氧化鲨烯环化酶活性水平直接相关。

在某些实施方案中，凋亡标记与氧化鲨烯环化酶活性的水平直接与相关，并且凋亡标记选自膜联蛋白V和胱天蛋白酶3。

本文中还提供一种用于鉴定治疗癌症的化合物的方法，所述方法包括：

a)提供癌细胞的测试样品；

b)使所述测试样品与测试化合物接触；

c)测定2，3-(S)-氧化鲨烯、羊毛固醇和胆固醇中的一者或多者的降低程度；

d)任选地，测定：

i)凋亡标记水平的增加；和

ii)活癌细胞水平的下降；

e)鉴定所述测试化合物作为以下化合物

i)抑制胆固醇生物合成途径中酶的活性的化合物；

ii)在癌细胞中促进凋亡的化合物；或

iii)杀死癌细胞的化合物；和

其中2，3-(S)-氧化鲨烯、羊毛固醇和胆固醇的任一者的水平与所述抗癌活性水平相关，从而与对照样品相比，测试样品中2，3-(S)-氧化鲨烯的量降低得更少指示更大的抗癌活性；并且与对照样品相比，羊毛固醇或胆固醇水平的更大降低指示更大的抗癌活性。

本文中还提供一种制备包含治疗癌症的化合物的组合物的方法，所述方法包括：

a)提供癌细胞的测试样品；

b)使所述测试样品与测试化合物接触；

c)测定2，3-(S)-氧化鲨烯、羊毛固醇和胆固醇中任一者的降低程度；

d)任选地，测定：

i)凋亡标记水平的增加；和

ii)活癌细胞水平的下降；

e)鉴定所述测试化合物作为以下化合物

i)抑制胆固醇生物合成途径中酶的活性的化合物；

ii)在癌细胞中促进凋亡的化合物；或

iii)杀死癌细胞的化合物；和

f)将如此鉴定的测试化合物或所述测试化合物的功能性类似物或同系物与载体混合，因而制备所述组合物。

在某些实施方案中，胆固醇生物合成途径中的酶不是HMG-CoA还原酶。

在某些实施方案中，胆固醇生物合成途径中的酶是氧化鲨烯环化酶。

在某些实施方案中，凋亡标记选自膜联蛋白V和胱天蛋白酶3。

本文中还提供一种筛选在哺乳动物中抑制肿瘤生长的药物的方法，所述方法包括：

a)使细胞与测试药物接触；

b)检测所述氧化鲨烯环化酶活性；

c)与对照中的氧化鲨烯环化酶活性相比，评定氧化鲨烯环化酶活性的下降，作为所述测试药物是哺乳动物中抑制肿瘤生长的药物的指示。

除非另外限定，否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用方式完整地并入。

当公开值的范围并且使用符号“从n₁..至n₂”(其中n₁和n₂是数字)时，则除非另外说明，否则这种符号意在包括数字本身和在它们之间的范围。这个范围可以是末端值之间完整或连续的并且包括末端值。以举例方式，范围“从2至6碳”意在包括2、3、4、5和6个碳，因为碳以整数单位计。以举例方式，比较范围“从1至3μM(微摩尔)”，其意在包括1μM、3μM，和在任何数目的有效数字之间的任何一个(例如，1.255μM、2.1μM、2.9999μM等)。

如本文所用，术语“约”意在对它修饰的数值定性，意味这种值作为误差幅度范围内的变量。当未引用具体误差幅度，如相对于图或数据表中给出的均值的标准偏差时，术语“约”应当理解为意指将包括所引用值的范围，和考虑到有效数字，也将因四舍五入(rounding up or down)至该数字而纳入的范围。

如本文所用，术语“链烯基”单独或在组合下指具有一个或多个双键并含有2至20个碳原子的直链或支链烃基。在某些实施方案中，所述链烯基将包含2至6个碳原子。术语“亚链烯基”指在两个或更多个位置连接的碳-碳双键系统如乙烯[(-CH＝CH-)、(-C::C-)]。合适链烯基的例子包括乙烯基、丙烯基、2-甲基丙烯基、1，4-丁二烯基等。除非另外说明，否则术语“链烯基”可以包括“亚链烯基”。

如本文所用，术语“烷基”单独或在组合下指含有1至20个碳原子的直链或支链烃基。在某些实施方案中，所述烷基将包含1至10个碳原子。在其他实施方案中，所述烷基将包含1至6个碳原子。烷基可以如本文定义任选地被取代。烷基的例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、辛基、壬基(noyl)等。如本文所用，术语“亚烷基”单独或在组合下指在两个或更多个位置的连接的团源自直链或支链链饱和烃的饱和脂族基，如亚甲基(-CH₂-)。除非另外说明，否则术语“烷基”可以包括“亚烷基”。

如本文所用，术语“炔基”单独或在组合下指具有一个或多个叁键并含有2至20个碳原子的直链或支链烃基。在某些实施方案中，所述炔基包含2至6个碳原子。在其他实施方案中，所述炔基包含2至个4碳原子。术语“炔基”指在两个位置连接的碳-碳叁键如乙炔(-C:::C-、-C≡C-)。炔基的例子包括乙炔基、丙炔基、羟基丙炔基、丁炔-1-基、丁炔-2-基、戊炔-1-基、3-甲基丁炔-1-基、己炔-2-基等。除非另外说明，否则术语“炔基”可以包括“亚炔基”。

如本文所用，术语“芳基”单独或在组合下意指含有1个、2个或3个环的碳环状芳族系统，其中这类多环系统稠合在一起。术语“芳基”包括芳基如苯基、萘基、蒽基和菲基。

术语“键”指两个原子之间的共价键或由该键连接的原子视为更大子结构的部分时，在两个部分之间的共价键。除非另外说明，否则键可以是单键、双键或叁键。在分子的图示中两个原子之间的短划线表示可以在这个位置存在的或不存额外的键。当环或链部件指定为键时，意指多个侧翼部分在它们之间具有共价键。例如，在链X-Y-Z中，当Y是键时，则链缩略至X-Z。

如本文所用，术语“环烷基”或可选地“碳环”单独或在组合下指饱和或部分饱和的单环、双环或三环状烷基，其中每个环状部分含有3至12个碳原子环成员并且可以任选地是苯并稠合环系统，其任选地如本文定义那样被取代。在某些实施方案中，所述环烷基将包5至7个碳原子。这类环烷基的例子包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、四氢萘基、茚满基、八氢萘基、2，3-二氢-1H-茚基、金刚烷基等。如本文所用的“双环”和“三环状”意在包括稠合环系统，如十氢萘、八氢萘以及多环(多中心)饱和的或部分不饱和的类型。后一类型的异构体通常例举为双环[1，1，1]戊烷、樟脑、金刚烷和双环[3，2，1]辛烷。

如本文所用，术语“卤(halo)”或“卤素(halogen)”单独或在组合下指氟、氯、溴或碘。

在不另外专门定义的情况下，如本文所用，术语“低级”单独或在组合下意指含有从1至6个碳原子并包括6个碳原子。

本文中的任何定义可以与任何其他定义组合使用以便描述复合结构基团。按常规，任何这类定义的缀后要素(trailing element)是与其亲本部分连接的要素。例如，复合基团烷基酰氨基将代表经酰氨基与亲本分子连接的烷基，并且术语“烷氧烷基”将代表经烷基与亲本分子连接的烷氧基。

当基团定义为“空白”时，意指所述基团不存在。

术语“任选地取代的”意指前述基团可以是取代或未取代的。当取代时，“任选取代”的基团的取代基可以单独或在组合下包括而不限于独立选自以下基团或特定指定的基团集合中的一个或多个取代基：低级烷基、低级链烯基、低级炔基、低级烷酰基、低级杂烷基、低级杂环烷基、低级卤代烷基、低级卤代链烯基、低级卤代炔基、低级全卤代烷基、低级全卤代烷氧基、低级环烷基、苯基)、芳基、芳氧基、低级烷氧基、低级卤代烷氧基、氧代、低级酰氧基、羰基、羧基、低级烷基羰基、低级羧酸酯、低级羰酰胺基、氰基、氢、卤素、羟基、酯、酰基、氨基、低级烷基、芳氨基、酰氨基、硝基、巯基、低级烷基、低级卤代烷基硫代、低级全卤代烷基硫代、芳基硫代、磺酸酯、磺酸、三取代甲硅烷基、N₃、SH、SCH₃、C(O)CH₃、CO₂CH₃、CO₂H、吡啶基、噻吩、呋喃基、低级氨基甲酸酯和低级脲。两个取代基可以接合在一起以形成稠合五元、六元或七元碳环或由零至3个杂原子组成的杂环，例如形成亚甲二氧基或乙烯二氧基。任选取代的基团可以是未取代的(例如，-CH₂CH₃)、完全取代的(例如，-CF₂CF₃)、单取代的(例如，-CH₂CH₂F)或在完全取代和单取代之间任意的某个水平上取代(例如，-CH₂CF₃)。在不就取代方面的限定条件提到取代基的情况下，包括取代的和未取代的形式。其中将取代基限定为“取代”的情况下，特别意指取代的形式。另外，如需要，可以对特定部分定义不同组的任选取代基；在这些情况下，这种任选的取代将如定义那样经常紧跟有“任选地以......取代”。

如本文所用，术语“调节”意指增加或减少靶的活性或物质的量。

如本文所用，术语“增加”或相关的术语“增加的”、“增强”或“增强的”指统计显著的增加。为避免怀疑，该术语通常指所给出参数的至少10％增加，并且可以包括超过对照值的至少20％增加、30％增加、40％增加、50％增加、60％增加、70％增加、80％增加、90％增加、95％增加、97％增加、99％或甚至100％增加。

如本文所用的“样品”指一种生物材料，其中可以对所述生物材料测试例如氧化鲨烯环化酶活性的存在或以便测定测试药物是否能够在体外或在细胞内调节氧化鲨烯环化酶的活性。为体外测量，这类样品可以含有纯化或半纯化的或未纯化的氧化鲨烯环化酶制备物。为胞内测氧化鲨烯环化酶活性，样品也可以包含细胞，所述细胞包含胞内氧化鲨烯环化酶。细胞样品一般将含有缓冲剂和盐以维持生理离子强度和pH并且被维持在保护生存力的适宜温度。细胞可以从任何来源获得，包括组织培养物或组织样品。在一个方面，这类细胞是哺乳动物细胞。样品也可以包括合适的对照试剂(对照样品)。

如本文所用的术语“疾病”意在总体上同义于术语“病症”和“病状”(如在医学病状下)并且与之互换使用，在于这些术语均反映人身体或动物身体或其部分之一的异常状况，所述异常状况损害正常功能，一般通过区别性体征和症状表现并且造成人或动物具有降低的持续期或生活质量。

术语“联合疗法”意指给药两种或更多治疗药以治疗本公开中描述治疗性病状或病症。这种给药包括以基本上同时的方式共给药这些治疗药，如以具有固定的有效成分比率的单个胶囊、每种有效成分的单独胶囊剂给药。此外，这类给药也包括以顺序方式使用每种类型的治疗药。在任何一种情况下，治疗方案将在治疗本文所述的病状或病症方面提供药物联合的有益作用。

短语“治疗有效的”意在限定治疗疾病或病症时所用的有效成分的量。这种量将实现减少或消除所述疾病或病症的目的。

术语“治疗性可接受的”指适合用于与患者组织接触，而无不当毒性、刺激作用和变态反应并且与合理收益/风险比相称并有效用于其预期用途的那些化合物(或盐、多晶型物、前药、互变异构体、两性离子形式等)。

如本文所用，对“治疗”患者的提及意在包括预防。术语“患者”意指全部哺乳动物，包括人类。患者的例子包括人、牛、犬、猫、山羊、羊、猪和兔。优选地，患者是人。

术语“前药”指在体内变得更有活性的化合物。本文中公开的某些化合物也可以作为前药存在，如Drug and Prodrug Metabolism：Chemistry，Biochemistry，and Enzymology(药物与前药代谢：化学、生物化学和酶学)(Testa、Bernard和Mayer，Joachim M.Wiley-VHCA，Zurich，Switzerland(瑞士苏黎世)2003)中所述。本文所述的化合物的前药是该化合物的结构修饰形式，所述结构修饰形式在生理条件下轻易发生化学变化以提供所述化合物。额外地，前药可以通过化学或生物化学过程在离体环境转化成所述化合物。例如，在含有合适酶或化学试剂的透皮储库贴剂(transdermal patch reservoir)放置时，前药可以缓慢转化成化合物。前药经常有用，因为，在一些情况下，它们可能比所述化合物或母药更易给药。例如通过口服给药，它们可以是生物可用的，而母药则不能。前药也可以在药物组合物中具有胜过母药的改进溶解度。多种前药衍生物是本领域已知的，如依赖于前药的水解性裂解或氧化激活的那些。前药的一个例子(而不限于)将是作为酯(“前药”)给药，但是随后以代谢方式水解成羧酸(舌性实体)的化合物。额外的实例包括化合物的肽酰基衍生物。

本文中公开的化合物可能作为治疗性可接受的盐存在。合适的酸加成盐包括与有机酸和无机酸形成的那些，并且正常情况下将是可药用的。然而，不非可药用的盐可以用于制备和纯化所讨论的化合物。也可以形成碱加成盐并且是可药用的。代表性酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、L-抗坏血酸、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐(besylate)、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、二葡糖酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、龙胆酸盐、戊二酸盐、甘油磷酸盐、羟乙酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、马尿酸盐、盐酸盐、溴酸盐、碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐(羟乙基磺酸盐)、乳酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、DL-扁桃酸盐、均三甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、萘磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、膦酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、焦谷氨酸盐、琥珀酸盐、磺酸盐、酒石酸盐、L-酒石酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、重碳酸盐、对甲苯磺酸盐(p-tosylate)和十一酸盐。另外、本文公开的化合物中的碱性基团可以用下述物质进行季铵化：甲基、乙基、丙基和丁基氯、溴和碘；硫酸二甲酯、二乙酯、二丁酯和二戊酯；癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基氯、溴和碘；和苄基溴和苯乙基溴。对于制备和选择盐的更完整讨论，参见Pharmaceutical Salts.·Properties，Selection，and Use(药剂盐：性质、选择和使用)(Stahl，P.Heinrich.Wiley-VCHA，Zurich，Switzerland(瑞士苏黎世)，2002)。

如本文所用，术语“治疗可接受的盐”代表本文中公开的化合物的盐或两性离子形式，它们是水溶性或油溶性或可分散的并且如本文定义是治疗性可接受的。这些盐可以在最后分离和纯化本发明中所述的化合物期间制备，或者通过游离碱形式的适宜化合物与合适酸反应独立地制备。可以用来形成治疗性可接受的加成盐的酸的例子包括无机酸，如氢氯酸、氢溴酸、硫酸和磷酸，以及有机酸，如草酸的，马来酸、琥珀酸和柠檬酸。盐也可以通过所述化合物与碱金属或碱土金属离子复合来形成。

碱加成盐可以在最后分离和纯化所述化合物期间制备，经常通过羧基与合适的碱(如可金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或重碳酸盐)或与氨或有机伯胺、仲胺或叔胺反应来制备。治疗性可接受的盐的阳离子包括锂、钠(例如，NaOH)、钾(例如，KOH)、钙(包括Ca(OH)₂)、镁(包括Mg(OH)₂和乙酸镁)、锌(包括Zn(OH)₂和乙酸锌)和铝，以及无毒季胺阳离子，如铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺、三丁胺、吡啶、N，N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二环己胺、普鲁卡因、二苄胺、N，N-联苄基苯乙胺、1-二苯羟甲胺和N，N′-二苄基乙二胺。用于形成碱加成盐的其他代表性有机胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪、胆碱氢氧化物、羟乙基吗啉、羟乙基吡咯烷酮、咪唑、N-甲基-D-葡糖胺、N，N′-二苄基乙二胺、N，N′-二乙基乙醇胺、N，N′-二甲基乙醇胺、三乙醇胺和氨丁三醇。也构思了碱性氨基酸如L-甘氨酸和L-精氨酸，和可以在中性pH为两性的氨基酸，如甜菜碱（N，N，N-三甲基甘氨酸)。

本文中公开的盐可以按1∶1摩尔比组合，并且实际上，这个经常在于最初怎样合成它们。然而，本领域技术人员将认识到，盐中的一种离子相对于其他离子的化学计量也是可以的。出于方便显示的目的，本文中所示的盐可以按1∶1比率显示；本发明的范围包括全部可能的化学计量排列。

本文中的术语“多晶型物”和“多晶型形式”和相关术语指相同分子的晶体形式，并且不同多晶型物可以具有不同的物理性能，如，例如因分子在晶体品格中的排列或构象排列所致的熔化温度、融合热、溶解度、溶出速率和/或振动光谱。由多晶型物显示的物理性能差异影响药物参数，如储存稳定性、可压缩性和密度(配制和产品制造中重要)和溶出速率(生物利用率方面的重要因素)。稳定性的差异可能因化学反应性的改变(例如差异性氧化，从而由一种剂多晶型物组成时，与由另一种多晶型物组成时相比，某剂型褪色更快)或机械改变(例如，片剂在储存时瓦解，因为动力学有利于多晶型物转化成热动力学上更稳定的多晶型物)或这两种变化(例如，一种多晶型物的片剂在高湿度更易崩解)所致。由于溶解度/溶出差异，在极端情况下，一些多态性转变可能结果效力缺失或在极端情况下导致毒性。此外，晶体的物理性能可能在加工中是重要的，例如，一种多晶型物可能更有可能形成溶剂化物或者可能难以过滤和洗去杂质(即，粒子形状和大小分布可能在多晶型物之间是不同的)。

如本领域已知，可以通过众多方法获得分子的多晶型物。这类方法包括但不限于熔融重结晶法、熔融冷却法、溶剂再结晶法、去溶剂化法、快速蒸发法、快速冷却法、缓慢冷却法、蒸气扩散法和升华法。

尽管本文中公开的化合物和前药可以作为粗制化学品给药，但也可能将它们作为药物制剂呈现。因此，本文中提供药物制剂，所述药物制剂包含以下一种或多种：本文中公开的某些化合物和前药或一种或多种其可药用盐、酯、酰胺或溶剂化物，连同一种或多种其可药用载体和任选地一个或多个其他治疗性成分。载体必须在兼容于制剂的其他成分的意义上是可接受的并且无损于其接受者。正确的制剂取决于所选的给药途径。可以使用如本领域中(例如，在Remington’s Pharmaceutical Sciences(雷氏药学原理)中)适用和理解的任何熟知技术、载体和赋形剂。本文中公开的药物组合物可以按本领域已知的任何方式制造，例如，通过常规混合、分散、造粒、糖丸剂制造法(dragee-making)、粉碎、乳化、封胶或携裹(entrapping)或压制方法制造。

制剂包括适合于口服、肠胃外(包括皮下、皮内、肌内、静脉内、关节内和髓内)、腹内、透粘膜、透皮、鼻内、直肠和局部(包括皮肤、颊部、舌下和眼球内)给药的那些、不过最合适的途径可以取决于例如接受者的状况和病症。制剂可以便利地以单位剂量形式提供，并且可以采用制药领域熟知的任何方法制备。一般地，这些方法包括包括使主题发明的化合物或其可药用盐、酯、酰胺、前药或溶剂化物(“有效成分”)与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常，通过以下方式制备制剂：使有效成分与液态载体或精细分散的固态载体或这两者均匀并且密切地结合，并且随后(根据需要)将产物成形为所需要的制剂。

本文中公开的化合物和前药的适于口服给药的制剂可以作为分立单元，如胶囊剂、扁囊剂或片剂，每个分立单元含有预定量的有效成分；作为散剂或颗粒剂；作为含水液体或不含水液体中的溶液剂或混悬剂；或作为水包油液体乳剂或油包水液体乳剂等提供。有效成分也可以作为大丸剂、干药糖剂或糊剂提供。

可以经口使用的药物制品包括片剂、由明胶制成的硬胶囊剂(push-fit capsule)、以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨醇制成的柔软密封胶囊剂。可以通过压制或模制，任选地连同一种或多种辅助成分一起，产生片剂。可以通过以下方式制备压制的片剂：在合适的机器中压制处于自由流动形式的有效成分如粉末或颗粒，任选地与粘合剂、惰性稀释剂或润滑剂、表面活性剂或分散剂混合。可以通过在合适的机器中模塑用惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物，产生模制的片剂。片剂可以任选地包衣或刻痕和可以如此配制，从而提供其中的有效成分缓慢或受控释放。用于口服给药的全部制剂应当处于适于这种给药的剂量。硬胶囊剂可以含有与填料如乳糖、粘合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石或硬脂酸镁和任选地与稳定剂混合的有效成分。在软胶囊剂中，活性化合物和前药可以溶解于或悬浮于合适的液体，如脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇中。此外，可以添加稳定剂。为锭剂芯提供合适的包衣。为此目的，可以使用浓缩的糖溶液，其可以任选地含有阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、卡波普凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以将染料或颜料添加至片剂或锭剂包衣以便鉴定或表征不同的活性化合物剂量组合。

可以将这些化合物和前药配制用于通过注射(例如，通过快速浓注或连续输注)进行肠胃外给药。用于注射的制剂可以按单位剂量形式提供，例如，在安瓿或多剂量容器中，伴有添加的防腐剂。这些组合物可以采用多种形式如在油质或水质溶媒中的混悬剂、溶液剂或乳剂形式，并且可以含有配制剂，例如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。制剂可以在单位剂量或多剂量容器例如密闭的安瓿和小瓶中提供，并且可以以粉末形式或在冷冻-干燥(冻干)状况下储存，仅在临用前马上添加无菌液态(例如，盐水或无菌无热原水)载体。现场用注射溶液剂和混悬剂可以从前述种类的无菌散剂、颗粒剂和片剂中准备。

用于肠胃外给药的制剂包括活性化合物和前药的含水和不含水(由质)的无菌注射溶液剂，其中所述无菌注射溶液剂可以含有使该制剂与预定接受者的血液等渗的抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质；以及含水和不含水的无菌混悬剂，所述的无菌混悬剂可以含有助悬剂和增稠剂。合适的亲脂溶剂或运载体包括脂肪油如芝麻油，或合成性脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂质体。水性注射混悬剂可以含有增加混悬剂黏度的物质，如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。任选地，混悬剂也可以含有合适的稳定剂或增加化合物和前药的溶解度以允许制备高度浓缩的溶液剂的物质。

除先前所述的制剂之外，如本文中公开那样的化合物或前药也可以配制为储库制剂。这种长效制剂可以通过(例如皮下或肌内)植入或通过肌内注射给药。因此，例如，可以将所述化合物和前药用合适的聚合材料和疏水材料(例如作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂配制或配制为微溶性衍生物，例如微溶性盐。

对于颊部或舌下给药，组合物可以采取以常规方式配制的片剂、糖锭剂、圆颗粒剂或凝胶剂的形式。这类组合物可以包含在增香基料如蔗糖和阿位伯树胶或黄蓍胶中的有效成分。

化合物和前药也可以配制于直肠用组合物如栓剂或停留灌肠剂中，所述直肠用组合物例如含有常规栓剂基料如可可脂、聚乙二醇或其他甘油酯类。

本文中公开的某些化合物和前药可以局部给药，即通过非全身性给药法给药。这包括在表皮或颊腔外部施加本文中公开的化合物和滴注这种化合物至耳、眼和鼻中，从而化合物不明显进入血流。相反，全身性给药指口服、静脉内、腹内和肌内给药。

适于局部给药的制剂包括适合于渗透穿过皮肤至炎症部位的液体制剂或半液体制剂，如凝胶剂、搽剂、洗剂、乳膏剂、油膏剂或糊剂和适于给药眼、耳或鼻的滴剂。用于局部给药的有效成分可以占例如制剂的0.001％至10％w/w(以重量计)。在某些实施方案中，有效成分可以占到多达10％w/w。在其他实施方案中，它可以占到小于5％w/w。在某些实施方案中，有效成分可以占到2％w/w至5％w/w。在其他实施方案中，它可以占制剂的0.1％至1％w/w。

为了通过吸入给药，化合物和前药可以便利地从递送气溶胶喷雾的吹入器、雾化器加压包或其他便利的手段递送。加压包可以包含合适的推进剂如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。在加压气溶胶的情况下，可以通过提供递送计量的量的阀门确定剂量单位。可选地，为了通过吸入或吹入给药，本文中公开的化合物和前药可以采取干散剂组合物的形式，例如所述化合物和合适的散剂基料(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。散剂组合物可以按单位剂量形式提供，例如在可以借助吸入器或吹入器从中给药所述散剂的胶囊剂、套筒剂(cartridge)、明胶包装或泡罩包装中提供。

尤其，鼻内递送可以用于递送化合物至中枢神经系统(CNS)。已经显示鼻内药物给药是一种绕过血脑屏障(BBB)递送神经营养因子和其他治疗药至脑和脊髓的非侵入性方法。从鼻递送至CNS在数分钟内沿着嗅神经通路和三叉神经通路进行。鼻内递送通过胞外途径进行并且不需要药物与任何受体结合或经历轴突转运。鼻内递送也靶向鼻相关的淋巴组织(NALT)和颈部深淋巴结。此外，在脑血管的血管壁和血管周隙中观察到处在高水平的鼻内给药的治疗药。在动物模型中使用这种鼻内方法，研究者已经成功地减少中风损伤、逆转阿尔茨海默神经变性，减少焦虑、改善记忆，刺激脑神经发生并治疗脑肿瘤。在人类中，鼻内给药胰岛素已经显示在正常成人和阿尔茨海默病患者中改善记忆。Hanson LR和Frey WH，2^nd，J NeuroimmunePharmacol.(神经药学杂志)2007年3月；2(1)：81-6.Epub2006年9月15日。

优选的单位剂量形式是这些制剂，它们含有如下文所述的有效剂量或其适宜分数的有效成分。

应当理解除了上文提到的具体成分之外，上文描述的制剂可以包括本领域中就所讨论制剂的类型而言常规拥有的其他物质，例如，适合于口服给药的那些制剂可以包含矫味剂。

化合物和前药可以经口或通过注射以每日0.1至500mg/kg的剂量施。拥有成人的剂量范围通常是5mg至2g/日。以分立单元提供的片剂或其他呈递形成可以便利地含有一种或多种化合物或前药的这样一种量，所述量在这种剂量是有效，或作为多个相同量，例如，含有5mg至500mg，通常约10mg至200mg的单位。

可以与载体材料组合以产生单一剂型的有效成分的量将根据正在治疗的受试者和具体给药模式变动。

所述化合物和前药可以按各种模式给药，例如经口、局部或通过注射给药。向患者给药的化合物的精确量将由巡诊医生负责。针对任何具体患者的特定剂量水平将取决于多种因素，包括所用的具体化合物的活性、年龄、体重、总体健康、性别、膳食、给药时间、给药途径及排泄速率、药物联合、正在治疗的确切病症和正在治疗的适应症或病状的严重性。另外，给药途径可以根据病状及其严重性变动。

在某些情况下，可能适宜的是给药与另一个治疗药组合的至少一种本文所述的化合物和前药(或其可药用盐或酯)。仅以举例方式，如果接受本文中的化合物之一以便治疗锕系元素中毒时由患者遭受的治疗副作用之一是身体正常运转所要求的必需痕量矿物质耗尽，则可能适宜的是给药强力螯合剂，所述螯合剂与身体正常运转所要求的必需痕量矿物质(例如锌和镁)的补充物组合，以便补足将因螯合疗法而不经意丢失的那些必需痕量矿物质。或，仅以举例方式，可以增强本文所述的化合物之一的治疗作用通过给药辅助药(即，辅助药本身可能仅具有最小治疗益处，但是与另一种治疗药组合时，对患者总体治疗益处增强)。或，仅以举例方式，可以通过给药本文所述的化合物之一连同另一种也具有治疗益处的治疗药(其也包括治疗方案)，增加由患者体验到的益处。仅以举例方式，在涉及给药本文所述的化合物之一的地中海贫血病疗法中，增加的治疗益处可以因向患者提供用于地中海贫血病的另一种治疗药(例如去铁胺)而产生。在任何情况下，无论正在治疗的的疾病、病症或病状是什么，由患者体验到的总体益处可以单纯地是两种治疗药的加合作用或患者可以体验到协同益处。

可能的联合疗法的具体非限制性例子包括将本文中公开的某些化合物与一种或多种选自以下的药物一起给药：芳香酶抑制剂、抗雌激素药、抗孕激素药、抗雄激素药、或戈那瑞林(gonadorelin)激动剂、拓扑异构酶1和2抑制剂、微管活性物质、烷基化剂、抗肿瘤药、抗代谢物、达卡巴嗪(DTIC)或含铂化合物、靶向脂质激酶或蛋白激酶的药物、靶向蛋白质磷酸酶或脂质磷酸酶的药物、抗血管生成剂、诱导细胞分化的药物、缓激肽1受体和血管紧张素II拮抗药、环氧合酶(抑制剂、类肝素抑制剂、淋巴因子或细胞因子抑制剂、双膦酸盐类、雷帕霉素衍生物、抗凋亡途径抑制剂、凋亡途径激动剂、过氧化物酶体增生物激活受体(PPAR)激动剂、Ras同工型的抑制剂、端粒酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、氨基肽酶抑制剂。

为治疗肿瘤疾病和实体瘤，本文中公开的化合物可以与一种或多种选自以下组的药物一起给药，所述组包括：达卡巴嗪(DTIC)、烷基化剂(例如，美法仓)、蒽环类(例如多柔比星)、皮质类固醇(例如地塞米松)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)抑制剂(例如哌立福新(Perifosine))、芳香酶抑制剂、抗雌激素药、抗雄激素药、或戈那瑞林(gonadorelin)激动剂、拓扑异构酶1和2抑制剂、微管活性药物、烷基化剂(例如，环磷酰胺、替莫唑胺)、抗肿瘤性抗代谢物或含铂化合物、异硫氰酸甲酯(MITC)、亚硝基脲类、紫杉烷、靶向脂质激酶或蛋白激酶的药物、靶向蛋白质磷酸酶或脂质磷酸酶的药物、抗血管生成剂、IMiD(例如，沙立度胺、来那度胺)、蛋白酶抑制剂(例如，硼替佐米、NPI0052)、胰岛素生长因子(IGF-1)抑制剂、CD40抗体、Smac模拟物(例如端粒抑素(telomestatin))、成纤维细胞生长因子3(FGF3)调节物(例如CHIR258)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂(Rad001)、组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂(例如辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)、Tubacin)、κB抑制蛋白激酶(IKK)抑制剂、P38丝裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)抑制剂、热休克蛋白90(HSP90)抑制剂(例如酸性糖蛋白(17-AAG))和其他多重激酶抑制剂(例如索拉替尼)。

在任何情况下，多种治疗药(其中至少一种是本文中公开的化合物)可以按任何顺序或甚至同时给药。如果同时使用，多种治疗药可以按单个、统一形式或按多种形式提供(仅以举例方式，或者作为单一丸剂或作为两种独立丸剂)。治疗药之一可以按多次给药给予，或两者均可以作为多次给药给予。如果不同时给予，则多次给药之间的时间可以是范围从几分钟至4周的任何时间持续期。

因此，在另一个方面，某些实施方案提供用于治疗需要这类治疗的人类或动物受试者中涉及金属毒性的病症和症状的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效减少或预防该受试者中所述病症的量的本文中公开的化合物，所述化合物与本领域已知的至少一种用于治疗所述病症的额外药物组合。在一个相关方面，某些实施方案提供了包含本文中公开的至少一种化合物的治疗性组合物，所述至少一种化合物与用于治疗涉及金属毒性的病症和症状的一个或多个额外药物组合。

本文中公开的化合物、组合物和方法可用于治疗癌症。通过本文中公开的化合物、组合物和方法待治疗的具体癌症包括乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰癌、肝癌、甲状腺癌、胃癌、子宫癌、淋巴瘤、脑癌(包括，例如，神经母细胞瘤和胶质母细胞瘤)、皮肤癌、肾癌、口腔癌、喉癌、舌癌和膀胱癌，以及白血病。所述癌可以是激素依赖的或抗激素性的，如在乳腺癌情况下。在某些实施方案中，所述癌是实体瘤。在某些实施方案中，所述癌症是本文中公开或本领域已知的癌症的耐药性表型。

除了可用于人类治疗，本文中公开的某些化合物和制剂也可以用于伴侣动物、外来动物和家畜(包括哺乳动物)、啮齿类等的兽医治疗。更优选动物包括马、犬和猫。

本申请中引用的美国或外国的全部参考文献、专利或申请因而通过引用方式如其中所书写那样完整并入。在任何不一致性出现的情况下，以本文中按字面公开的材料为准。

氧化鲨烯合酶作为癌症疗法的靶

如本文中公开，通过研究PRIMA-1(一种激活突变p53蛋白并恢复野生型p53中存在的肿瘤抑制功能的小分子)，鉴定了新的抗癌靶。采用生物信息学方法并且进行反转蛋白质-配体对接以便从现存蛋白结构数据库筛选PRIMA-1的蛋白质靶。使用的对接软件是发明人撰写的MDock软件包[12-16]。使用的蛋白质数据库是潜在药物靶数据库(PDTD)[17]。将蛋白质根据它们的能量评分排序(评分越低，结合亲和力越高)并且随后进行聚类。选择首位人类蛋白质靶-酶氧化鲨烯环化酶(‘OSC’)用于分析。

也研究了现存的一系列OSC抑制剂；对接入OSC中的抑制剂的结合模型与对接入OSC中的PRIMA-1的结合模型比较。如图1中所显示，Ro48-8071(4′-[6-(烯丙基甲基氨基)己氧基]-4-溴-2′-氟二苯甲酮延胡索酸酯)和PRIMA-1与OSC的对接构型在结合袋中部分重叠的。

OSC的抑制剂

可以通过本领域已知的方法鉴定OSC抑制剂。例如，可以使用利用人、大鼠或其他动物肝微粒体的微粒体测定法，其中测量消耗的放射标记的2，3-(S)-氧化鲨烯或由用测试化合物处理的微粒体产生的羊毛固醇的梁并且与对照比较。可选地，完整细胞测定法可以用来测量胆固醇生物合成。例如，肝细胞可以与测试化合物和放射标记的胆固醇生物合成途径底物如乙酸或甲羟戊酸孵育，并且可以根据本领域已知的方法测量产生的胆固醇(或可能测量消耗的底物)并且与对照比较。动物研究也可以用来测量例如经治疗与未治疗的受试者中的肝胆固醇或血清胆固醇。见，例如WO199611201A1、WO199706802A1和EP01346994。

表1中给出OSC抑制剂的额外例子。

表1.

该表改编自LenhartA等人，Binding Structures and Potencies ofoxidosqualene cyclase inhibitors with the homologous squalene-hopene cyclase(与同源性鲨烯-藿烯环化酶在一起氧化鲨烯环化酶抑制剂的结合结构和效力).J.Med.Chem.(药物化学杂志)2003，46：2083-2092。可以以如[5]中所述那样合成上述化合物之一Ro-48-8071，下文提供其摘抄。

Ro48-8071(延胡索酸酯，MW＝564.45)如上文所示那样合成。全部中间体和Ro48-8071由250MHz核磁共振氢谱(¹HNMR)、红外(IR)质谱(MS)和显微分析法表征。使用Biichi510装置测定熔点(未校正)。在BrukerAC250谱仪上记录质子NMR谱，并且相对于四甲基硅烷以ppm为单位给出δ值。使用Nicolet7199-FTIR谱仪记录KBr压片的IR谱。使用气动辅助电喷雾技术(Perkin-Elmer Sciex，API-111型)获得质谱(MS)。元素分析的结果在0.3％理论值范围内。

(4-溴苯基)-(2′-氟-4′-甲氧苯基)-甲酮[1]

添加氯化铝(144g，1.08mol)至450ml预冷的二硝基苯，保持温度＜8℃。随后，219.5g(1mol)4-溴苯甲酰氯在200ml二硝基苯中的悬液经20分钟添加，10分钟后添加108.5ml(0.95mol)3-氟苯甲醚。将反应混合物加温至室温过夜，混入加冰的水(1.51)中并用3X11二氯甲烷提取。3个有机相依次用2X11水洗涤，汇集，并干燥(Na₂SO₄)。蒸发过程(85℃，1Torr)提供(4-溴苯基)-(2-氟-4-甲氧苯基)-甲酮和(4-溴苯基)-(4′-氟-2′-甲氧苯基)-甲酮的混合物，所示混合物立即溶解于300ml乙酸乙酯中并且在室温结晶。将晶体滤出并用100ml乙酸乙酯和3×100ml环己烷洗涤以产生纯(4-溴苯基)-(2′-氟-4′-甲氧苯基)-甲酮(122.4g，41.6％)：熔点125-126℃；IR1643em^-1；¹HNMR(CDC1₃)δ3.87(s，OCH₃)，6.66(dd，J＝12.1，2.4Hz1H，3′-H)6.80(dd，J＝8.7，2.4Hz，1H，5′-H)，7.54-7.68(m，5H，arom H)；EIMS m/z308(M⁺，1Br)。C₁₄H₁₆OBrFO₂的计算分析结果：C，54.40；H，3.26；F，6.15；Br，25.85。实测：C，54.57；H，3.35；F，6.21；Br，26.07。

(4-溴苯基)-(2′-氟-4′-羟苯基)-甲酮[2]

61.8g(200mmol)[1]在400ml乙酸中的悬液用230ml62％含水氢溴酸处理，并且在125℃搅拌8小时，随后蒸发。将残余物溶解于500ml乙酸乙酯中并用300ml饱和碳酸氢钠和300ml10％氯化钠溶液洗涤。水相用2×500ml乙酸乙酯提取。将有机相干燥(Na₂SO₄)并且蒸发以产生(4-溴苯基)-(2′-氟-4′-羟苯基)-甲酮的橙色晶体(57.2g，96.9％)：熔点62-63℃；IR1652em^-1；¹HNMR(DMSO-6.66(dd，J＝12.1，2.4Hz1H，3′-H)，6.80(dd，J＝8.7，dtj)a6.68(dd，J＝12.6，2.2Hz，1H，3‘-H)，6.77(dd，J＝8.5，2.2Hz，1H，5′-H)，7.49(dd，J＝8.5，8.5Hz，1H，6′-H)，7.64和7.75(AA′BB′，4H，2，3，5，6-H)，10.85(br s，1H，OH)；EIMS m/z294(M⁺，1Br)。C₁₃H₈BrFO₂的计算分析结果：C，52.91；H，2.73；F，6.44；Br，27.08。实测：C，52.94；H，2.74；F，6.42；Br，26.84。

[4′-(6-烯丙基-甲基氨基-己氧基)-2′-氟苯基]-(4-溴苯基)-延胡索酸酯[3]

将35.4g(120mmol)[2]、54.9ml(360mmol)1，6-二溴己烷和49.8g(360mmol)碳酸钾在1100ml丙酮中的混合物在75℃剧烈搅拌5小时。在过滤和蒸发后，将残余物溶解于二氯甲烷中，用硫酸钠处理，再次过滤，并蒸发。用400ml环己烷-己烷1∶3(v/v)首先在0℃和随后在-78℃的结晶产生53.2g(116mmol)粗制[4′-(6-溴-己氧基)-2′-氟苯基]-(4-溴苯基)-甲酮。将这种产物溶解于390ml N，N-二甲基乙酰胺中，冷却至0℃，并且逐滴添加22.5ml(232mmol)N-烯丙基甲胺。在室温22小时反后应，冷却至0℃，并且用22.5ml(232mmol)N-烯丙基甲胺再次处理。5小时后，将溶液蒸发(70℃，1托(Torr))，用300ml饱和碳酸氢钠中和，并用3×400ml二氯甲烷提取。将有机相干燥(Na₂SO₄)，蒸发至干透，并且通过快速柱层析(硅胶0.04-0.063mm，二氯甲烷-甲醇95∶5(v/v)纯化，产生37.7g(84.1mmol)[4′-(6-烯丙基甲基-氨基-己氧基)-2′-氟苯基]-(4-溴苯基)甲酮。将游离胺和8.8g(75.7mmol)延胡索酸溶解于200ml乙醇中，蒸发，并从丙酮结晶以产生[4′-(6-烯丙基甲基-氨基-己氧基)-2′-氟苯基]-(4-溴苯基)延胡索酸酯[3](36.2g，53.4％)：熔点86-88℃；IR1653em^-1；¹HNMR(DMSO-_δ6)δ1.25-1.60(m，6H，OCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂N)，1.70-1.80(m，2H，OCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂N)，2.24(s，3H，NCH₃)，2.40-2.50(m，2H，OCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂N)，3.11(d，J＝6.5Hz，2H，NCH₂CHCH₂)，4.08(t，J＝6.4Hz，2H，OCH₂CH₂CH₂CH₂CH₂CH₂N)，5.17-5.27(m，2H，NCH₂CHCH₂)，5.75-5.90(m，1H，NCH₂CHCH₂)，6.67(s，2H，延胡索酸酯)，6.91-7.00(m，2H，3′，5′-H)，7.56(dd，J＝8.6，8.6Hz，1H，6′-H)，7.65和7.76(AA′BB′，4H，2，3，5，6-H)；EIMS m/z448(M⁺，1Br)。C₂₃H₂₇NBrFO₂·C₄H₄O₄的计算分析结果；C，57.45；H，5.54；N，2.48；F，3.37；Br，14.16。实测：C，57.39；H，5.57；N，2.50；F，3.38；Br，14.15。

下文给出OSC抑制剂的额外例子。这样一种抑制剂是下文显示的U18666A(也称作3-β-(2-(二乙基氨基)乙氧基)雄烯-5-烯-17-酮)：

虽然U18666A是OSC的强力抑制剂，但其治疗性用途可能受潜在毒理学效应(包括白内障形成)限制[20]。

OSC抑制剂另外例子可以在WO1996/011021A1，“Substitutedheterobicyclic alkvl amines and their use as squalene oxide cyclase inhibitors(取代的杂双环烷基胺及其作为鲨烯氧化物环化酶抑制剂用途)”和EP1346994A1，“cholesterol biosynthesis inhibitors containing as the active ingredient tricyclicspiro compounds(含有三环螺形化合物作为有效成分胆固醇生物合成抑制剂)”中找到。可以如本文中公开那样测试这些化合物的抗癌活性。

作为治疗癌症的策略对OSC的抑制

评价强力OSC抑制剂(包括Ro48-8071)对癌细胞生存力的影响；证实这些抑制剂实现的效力与PRIMA-1对乳腺癌细胞的影响相似。使用磺酰罗丹明B(‘SRB’)测定法在PRIMA-1和Ro48-8071存在和不存在下，对BT-474和T47-D乳腺癌细胞评价生存力。使用磺酰罗丹明B(SRB)测定法来评价OSC抑制剂Ro48-8071对乳腺癌细胞和正常乳腺细胞的生存力的影响，同时略微修改在NCI建立的原始方法。因而，将细胞接种在96孔板内的100μl培养基中并在37℃伴以5％CO₂时孵育过夜。24小时后移除培养基，并且将结合的细胞用DMEM/F12培养基洗涤并用处于各种浓度的PRIMA-1或Ro48-8071处理24小时。通过撤除生长培养基并且添加100μl PBS和100μl50％冷三氯乙酸并随后在4℃孵育1小时，原位固定存活或贴壁的细胞。存活的细胞用冰水洗涤，在室温(RT)干燥，并随后在室温用50μl4％SRB染色8分钟。通过用1％冷乙酸洗涤5次除去未结合的染料，并且将平板在室温干燥。结合的染液用150μl10mM Tris缓冲液增溶，并且用SpecTRA MAX190微量平板读数仪(Sunnyvale，CA)在520nm测量样品的吸光度。在针对BT-474、T47-D和AG11132A细胞系的这些实验中，每种浓度使用6个孔，并且每个实验进行至少2次。

图2比较在渐增浓度的PRIMA-1、Ro48-8071和U18666A存在的情况下肿瘤细胞(图2A中的BT-474，和图2B中的T47-D)的生存力。SRB测定法揭示，OSC强力抑制剂Ro48-8071和U18666A大幅度抑制两种肿瘤细胞系的细胞生长并且显示与PRIMA-1相似的剂量-反应关系。在处理24小时的情况下，Ro48-8071的有效体外剂量r对于BT-474细胞和T47-D细胞是在0.1μM和25μM之间。

也比较了Ro48-8071对BT-474肿瘤细胞系和正常乳腺细胞系AG11131A的生存力的影响。图4显示在Ro48-8071存在的情况下与正常乳腺细胞相比，乳腺肿瘤细胞的生存力选择性丧失。

还在额外的癌细胞系中评价OSC抑制的作用。癌细胞系可以从ATCC(Manassas，VA)购买。SRB测定法已经用于测定RO48-8071对不同癌细胞生长的抑制作用。将细胞接种在96孔板中并在37℃伴以5％CO₂时孵育过夜。24小时后移除培养基，并且将细胞用DMEM/F12培养基洗涤并随后用5％FBS培养基中各种浓度的PRo48-8071处理24小时和48小时。通过撤除生长培养基，添加100μl PBS和100μl50％冷三氯乙酸并且随后在4℃孵育1小时，原位固定存活或贴壁的细胞。细胞用冰冷的水洗涤，在室温(RT)干燥，并随后在室温用50μl4％SRB染色8分钟。通过用1％冷乙酸洗涤5次除去未结合的染料，并且将平板在室温干燥。结合的染液用150μl10mM Tris缓冲液增溶，并且用SpecTRA MAX190微量平板读数仪(加利福尼亚森尼韦尔市分子设备公司(Molecular Devices，Sunnyvale，CA))在520nm读取样品的吸光度。每种浓度使用6个孔，并且每个实验进行2至3次。

Ro48-8071对乳腺癌细胞系BT-474生存力的影响。参考图4A，该图显示在24小时和48小时处理后Ro48-8071对乳腺癌(BT-474)细胞生长的影响。培养基使用10％小牛血清(FBS)DMEM/F12用于培养并使用5％FBSDMEM/F12用于处理。

Ro48-8071对乳腺癌细胞系(T47-D)生存力的影响。参考图4B，该图显示在24小时和48小时处理后Ro48-8071对乳腺癌(T47-D)细胞生长的影响。培养基使用10％FBS DMEM/F12用于培养并使用5％FBS DMEM/F12用于处理。

Ro48-8071对乳腺癌细胞系MCF-7生存力的影响。参考图4C，该图显示在24小时和48小时处理后Ro48-8071对乳腺癌(MCF-7)细胞生长的影响。培养基使用10％FBS DMEM/F12和10μg/ml胰岛素用于培养并使用5％FBS DMEM/F12用于处理。

Ro48-8071对前列腺癌细胞系LNCaP生存力的影响。参考图5A，该图显示在24小时和48小时处理后Ro48-8071对前列腺癌(LNCaP)细胞生长的影响。培养基使用20％FBS RPMI-1640用于培养并使用10％FBSRPMI-1640用于处理。

Ro48-8071对前列腺癌细胞系PC-3生存力的影响。参考图5B，该图显示在24小时和48小时处理后Ro48-8071对前列腺癌(PC-3)细胞生长的影响。培养基使用10％FBS RPMI-1640用于培养并使用5％FBS RPMI-1640用于处理。

Ro48-8071对前列腺癌细胞系DU145生存力的影响。参考图5C，该图显示在24小时和48小时处理后Ro48-8071对前列腺癌(DU145)细胞生长的影响。培养基使用10％FBS EMEM用于培养并使用5％FBS EMEM用于处理。

Ro48-8071对结肠癌细胞系DLD-1生存力的影响。参考图6A，该图显示在24小时和48小时处理后Ro48-8071对结肠癌(DLD-1)细胞生长的影响。培养基使用10％FBS RPMI-1640用于培养并使用5％FBS RPMI-1640用于处理。

Ro48-8071对结肠癌细胞系LoVo生存力的影响。参考图6B，该图显示在24小时和48小时处理后Ro48-8071对乳腺癌(LoVo)细胞生长的影响。培养基使用10％FBS F-12K用于培养并使用5％FBS F-12K用于处理。

Ro48-8071对卵巢癌细胞系OVCAR-3生存力的影响。参考图6C，该图显示在24小时和48小时处理后Ro48-8071对卵巢癌细胞系(0VCAR-3)生长的影响。培养基使用20％FBS RPMI-1640用于培养并使用10％FBS RPMI-1640用于处理。

Ro48-8071对卵巢癌细胞系SK-OV-3生存力的影响。参考图6D，该图显示在24小时和48小时处理后Ro48-8071对卵巢癌细胞系(SK-OV-3)生长的影响。培养基使用10％FBS McCoy′s5a用于培养并使用5％FBSMcCoy′s5a用于处理。

Ro48-8071对肺癌细胞系H69AR生存力的影响。参考图7A，该图显示在24小时和48小时处理后Ro48-8071对乳腺癌(H69AR)细胞生长的影响。培养基使用20％FBS RPMI-1640用于培养并使用10％FBS RPMI-1640用于处理。

Ro48-8071对肺癌细胞系H23生存力的影响。参考图7B，该图显示在24小时和48小时处理后Ro48-8071对肺癌(NCI-H23)细胞生长的影响。培养基使用10％FBS RPMI-1640用于培养并使用5％FBS RPMI-1640用于处理。

Ro48-8071对肺癌细胞系A549生存力的影响。参考图7C，该图显示在24小时和48小时处理后Ro48-8071对肺癌(A549)细胞生长的影响。培养基使用10％FBS F-12K用于培养并使用5％FBS F-12K用于处理。

Ro48-8071对胰腺癌细胞系Capan-1生存力生存力的影响。参考图8A，该图显示在24小时和48小时处理后Ro48-8071对胰腺癌细胞系Capan-1生长的影响。培养基使用20％FBS IMDM用于培养并使用10％FBSFBS IMDM用于处理。

Ro48-8071对胰腺癌细胞系BxPC-3生存力生存力的影响。参考图8B，该图显示在24小时和48小时处理后Ro48-8071对胰腺癌(Bx-PC-3)细胞系生长的影响。培养基使用10％FBS RPMI-1640用于培养并使用5％FBS RPMI-1640用于处理。

Ro48-8071对雌激素受体、孕酮受体和HER-2/neu受体阳性乳腺癌细胞系HCC-1428和ZR-75生存力的影响。分别参考图9A和图9B，所述图显示在24小时和48小时处理后Ro48-8071对胰癌症(HCC-1428和ZR-75)细胞生长的影响。培养基使用10％FBS RPMI-1640用于培养并使用5％FBSRPMI-1640用于处理。

Ro48-8071对雌激素受体、孕酮受体和HER-2/neu受体阴性乳腺癌细胞系MDA-231和BT-20生存力的影响。分别参考图9C和图9D，所述图显示在24小时和48小时处理后Ro48-8071对胰癌症(MDA-231和BT-20)细胞生长的影响。培养基使用10％FBS RPMI-1640用于培养并使用5％FBSRPMI-1640用于处理。

表2总结了RO48-8071在不同癌细胞系中的IC₅₀分析结果，所述癌细胞系当中几个细胞系是耐药性表型。

表2.RO48-8071对不同类型癌症的IC50

RO48-8071在人乳腺癌细胞和前列腺癌细胞中诱导凋亡和细胞死亡。

凋亡是在胚胎发育期间以及在维持组织稳态时发生的正常生理过程。凋亡程序由某些形态特征表征，包括质膜非对称性和接合的丧失、细胞质和胞核固缩，和核小体间DNA切割。质膜丧失是最早的特征之一。在凋亡的细胞中，膜磷脂磷脂酰丝氨酸(PS)从质膜的内片层转位至外片层，因而使PS暴露于细胞外部环境。膜联蛋白V是一种对PS具有高亲和力的35-36kDa的Ca²⁺依赖性磷脂蛋白质，并且与具有暴露的PS的细胞结合。膜联蛋白V可以与荧光物质(fluorochrome)(包括FITC)缀合。这种模式保留其对PS的高亲和力并且因此充当用于正在发生凋亡的细胞的流式细胞分析的灵敏探针。由于PS的外化在凋亡的较早阶段出现，所以FITC膜联蛋白V染色可以在比基于核变化如DNA片段化的测定法更早的阶段鉴定凋亡。

FITC膜联蛋白V染色先于膜完整性丧失，所述膜完整性丧失伴随因凋亡过程或坏死过程产生的细胞死亡的最晚阶段。因此，用FITC膜联蛋白V染色与通常地与允许研究者鉴定早期凋亡细胞(PI阴性、FITC膜联蛋白V阳性)的活体染料如碘化丙啶(PI)或7-氨基-放线菌素D(7-AAD)联合使用。具有完整膜的活细胞排斥PI，而死亡和受损细胞的膜是PI可透过的。例如，视为有活力的细胞是FITC膜联蛋白V阴性和PI阴性的；处于早期凋的细胞是FITC膜联蛋白V阳性且PI阴性的；并且处于晚期凋亡或已经死亡的细胞是同时FITC膜联蛋白V和PI阳性的。这种测定法不区分已经发生凋亡性死亡的细胞与已经因坏死途径而死亡的那些细胞，因为在任一种情况下，死细胞将着染膜联蛋白-FITC和PI。然而，随时间推移测量凋亡时，经常可以跟踪从FITC膜联蛋白阴性V和PI阴性(有活力，或无可度量的凋亡)至FITC膜联蛋白V阳性和PI阴性(早期凋亡，膜完整性存在)和最终FITC膜联蛋白阳性V和PI阳性(终末期凋亡和死亡)变化的细胞。细胞历经这3个阶段的运动暗示凋亡。相反，显示细胞是FITC膜联蛋白阳性V和PI阳性的单一观察结本身揭示了关于细胞采取哪种过程死去的较少信息。

使用BT-474、MCF-7(雌激素受体、孕酮受体和HER-2/neu受体阳性)、BT-20和MDA-231(雌激素受体，孕酮受体，和HER2/neu受体阴性，三阴性)人乳腺癌细胞，和PC-3和DU-145(雄激素受体阴性)人前列腺癌细胞来检验RO48-8071诱导细胞死亡的能力。将细胞接种在6孔平板中的DMEM/F12+10％FBS中过夜，对于BT-474和BT-20细胞，以1.5×10⁵/孔接种；在RPMI-1640培养基+10％FBS中过夜，对于PC-3和DU145细胞，以1.2×10⁵/孔接种。随后将细胞洗涤并用所指示浓度(μM)的RO48-8071或单独的溶媒在含5％FBS的生长培养基中处理24小时。与药物孵育后，将细胞收获，用2ml10％FBS生长培养基洗涤并重悬于膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒(BioVision Research Products，Mountain View，CA)中所提供的500μl结合缓冲液中。添加5μl膜联蛋白V和5μl碘化丙啶(PI)至每份样品。使用FACScan流式细胞术(BectonDickinson，Franklinlakes，NJ)，每个处理10,000个细胞，并且定量膜联蛋白V阳性百分数和PI阳性细胞百分数。象限R5显示膜联蛋白V阳性细胞并且象限R3显示膜联蛋白V阳性外加PI阳性细胞。来自代表性实验的柱状图，其显示来自肿瘤细胞系的膜联蛋白V阳性外加PI阳性细胞(总计死细胞)。*与对照组相比显著差异(p＜0.05，ANOVA)。将实验实施2-4次并且一式三份分析每种处理。

体内研究

乳腺癌

也已经在体内评估/价示例性抑制剂Ro48-8071并且发现它在无毒性的情况下抑制裸鼠中人乳腺癌异种移植物的生长。见，例如图9和图10。

5至6周龄(18-22g)雌性无胸腺nu/nu裸鼠从HarlandSprague-Dawley，Inc.购买。在接种肿瘤细胞之前48小时，裸鼠用17-β-雌二醇丸粒剂(1.7mg/丸，释放60日)接种。将与基质胶和DMEM/F12培养基(4/1，v/v)昆合的0.15ml溶液中的5x10⁶个BT-474人乳腺癌细胞皮下注射至小鼠的每个腹侧，并且注射每只小鼠的双腹侧。当肿瘤体积达到约100mm³时，将动物随机分成3个组并且用RO48-8071(5mg/kg/日或10mg/kg/日)经尾静脉注射5日开始启动，随后每隔1日进行相同治疗，持续额外5次，如图13A中所示。对照组中的动物在相同条件下接受单独的溶媒。通过数字式卡尺测量积并且使用公式(L×W×H)×0.5236计算肿瘤体积。与对照组相比，观察到显著差异(P＜0.05，使用ANOVA)。

在实验自始至终监测动物重量。如图13B中所示，箭头指示采用RO48-8071的治疗持续期。在对照组和治疗组之间没有观察到显著差异，这进一步表明OSC抑制剂RO48-8071在荷瘤裸鼠中在用于抑制肿瘤生长的剂量下是无毒的。

前列腺癌

6周龄(21-25g)雄性无胸腺nu/nu裸鼠从Harlan Laboratories，Inc.购买。将与基质胶和DMEM/F12培养基(1/1，v/v)昆合的0.15ml溶液中的5x10⁶个人前列腺癌PC-3细胞皮下注射至小鼠的每个腹侧，并且注射每只小鼠的双腹侧。当肿瘤体积达到约100mm³时，将动物随机分成3个组并且用RO48-8071(5mg/kg/日或20mg/kg/日)经尾静脉注射5日开始启动，随后每隔1日进行相同治疗，持续额外7次，如图14A中所示。对照组中的动物在相同条件下接受单独的溶媒。每3日通过数字式卡尺测量并且使用公式(L×W×H)×0.5236计算肿瘤体积。与对照组相比的显著差异(P＜0.05，使用ANOVA)。

显示在Ro48-8071治疗后的动物重量。如图14B中所示，箭头指示采用Ro48-8071的治疗持续期。在对照组和治疗组之间没有观察到显著差异，这进一步表明OSC抑制剂RO48-8071在荷瘤裸鼠中在用于抑制肿瘤生长的剂量下是无毒的。

也在“用于鉴定新的潜在抗癌靶的反转对接方案(An inversedocking approach for identifying new potential anti-cancer targets)”中描述额外的实施方案，所述文献因而完整并入[18]。

尽管已经联系具体实施方案描述了本发明，但是理解本发明方法能够进一步进行调整。本专利申请意在涵盖总体上符合本发明原理并包含相异于本公开的这类偏离的本发明任何变型、用途或改造，原因是其进入本发明所属领域内部的已知或惯常实践范围内并可能适用于本文之前阐述的实质特征和落入所附权利要求书的范围内。

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[20]Cenedella RJ等人，“Direct perturbation of lens membrane structuremay contribute to cataracts caused by U18666A，an oxidosqualenecyclaseinhibitor(直接扰动晶状体膜结构可能促进氧化鲨烯环化酶抑制剂U18666A引起的白内障)，”J LipidRes..(脂类研究杂志)2004七月；45(7)：1232-41.

Claims

1.一种治疗癌症的方法，所述方法包括步骤：向有需求的患者给药治疗有效量的胆固醇生物合成途径中蛋白质靶的抑制剂。

2.根据权利要求1中所述的方法，其中所述蛋白质靶不是羟甲戊二酰辅酶A还原酶。

3.根据权利要求2中所述的方法，其中所述蛋白质靶是氧化鲨烯环化酶。

4.根据权利要求1中所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰癌、肝癌、甲状腺癌、胃癌、子宫癌、淋巴瘤、脑癌、皮肤癌、肾癌、口腔癌、喉癌、舌癌和膀胱癌，以及白血病，及它们的耐药性表型。

5.根据权利要求1中所述的方法，其中所述癌细胞不具有p53突变。

6.根据权利要求1中所述的方法，其中所述癌细胞是HER2/neu阳性的乳腺癌细胞。

7.根据权利要求1中所述的方法，其中所述癌细胞是雌激素受体和孕酮受体阳性的乳腺癌细胞。

8.根据权利要求1中所述的方法，其中所述癌细胞是雌激素受体、孕酮受体和HER2/neu为三阴性的乳腺癌细胞。

9.根据权利要求1中所述的方法，其中所述癌细胞发生凋亡。

10.根据权利要求1中所述的方法，其中抑制剂是并非PRIMA-1的化合物。

11.根据权利要求10中所述的方法，其中所述化合物是与至少两个芳环结构连接的叔胺。

12.根据权利要求11中所述的方法，其中所述化合物具有式I：

或其盐，其中：

X选自氢、卤素、O、NR₃R₄、S、CH₂和CH；

Y选自空白、键、O和CH；

Z选自O、N和CH；

R₃和R₄独立地选自键、氢、低级烷基、低级烯、低级炔、芳基和环烷基，其中任一者可以任选地被取代；以及

Q选自溴、氯和氟。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述化合物是4′-[6-(烯丙基甲基氨基)己氧基]-4-溴-2′-氟二苯甲酮延胡索酸酯。

14.一种降低癌细胞生存力的方法，所述方法包括步骤：抑制细胞的胆固醇生物合成途径中的蛋白质靶的活性。

15.根据权利要求14中所述的方法，其中所述蛋白质靶不是羟甲戊二酰辅酶A还原酶。

16.根据权利要求15中所述的方法，其中所述蛋白质靶是氧化鲨烯环化酶。

17.根据权利要求14中所述的方法，其中所述细胞选自乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肺癌细胞、结肠癌细胞、卵巢癌细胞、胰癌细胞、肝癌细胞、甲状腺癌细胞、胃癌细胞、子宫癌细胞、淋巴瘤、脑癌细胞、皮肤癌细胞、肾癌细胞、口腔癌细胞、喉癌细胞、舌癌细胞和膀胱癌细胞，以及白血病细胞，及它们的耐药性表型。

18.根据权利要求14中所述的方法，其中所述细胞不具有p53突变。

19.根据权利要求14中所述的方法，其中所述癌细胞发生凋亡。

20.根据权利要求14中所述的方法，其中所述癌细胞是HER2/neu阳性的乳腺癌细胞。

21.根据权利要求14中所述的方法，其中所述癌细胞是雌激素受体和孕酮受体阳性的乳腺癌细胞。

22.根据权利要求14中所述的方法，其中所述癌细胞是雌激素受体、孕酮受体和HER2/neu为三阴性的乳腺癌细胞。

23.根据权利要求14中所述的方法，其中抑制步骤用并非PRIMA-1的化合物实现。

24.根据权利要求23中所述的方法，其中所述化合物是与至少两个芳环结构连接的叔胺。

25.根据权利要求24中所述的方法，其中所述化合物具有式I：

或其盐，其中：

X选自氢、卤素、O、NR₃R₄、S、CH₂和CH；

Y选自空白、键、O和CH；

Z选自O、N和CH；

Q选自溴、氯和氟。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述化合物是4′-[6-(烯丙基甲基氨基)己氧基]-4-溴-2′-氟二苯甲酮延胡索酸酯(Ro48-8071)。

27.一种化合物的用途，所述化合物抑制细胞的胆固醇生物合成途径中蛋白质靶的活性，用于治疗癌症。

28.根据权利要求27中所述的用途，其中所述蛋白质靶不是羟甲戊二酰辅酶A还原酶。

29.根据权利要求28中所述的用途，其中所述蛋白质靶是氧化鲨烯环化酶。

30.根据权利要求27中所述的用途，其中所述癌症选自乳腺癌、前列腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胰癌、肝癌、甲状腺癌、胃癌、子宫癌、淋巴瘤、脑癌、皮肤癌、肾癌、口腔癌、喉癌、舌癌和膀胱癌，以及白血病，及它们的耐药性表型。

31.根据权利要求27中所述的用途，其中所述细胞不具有p53突变。

32.根据权利要求27中所述的用途，其中所述癌细胞发生凋亡。

33.根据权利要求27中所述的用途，其中所述癌症是乳腺癌，其细胞是HER2/neu阳性的。

34.根据权利要求27中所述的用途，其中所述癌症是乳腺癌，其细胞是雌激素受体阳性和孕酮受体阳性的。

35.根据权利要求27中所述的用途，其中所述癌症是乳腺癌，其细胞是雌激素受体、孕酮受体和HER2/neu三阴性的。

36.根据权利要求27中所述的用途，其中抑制步骤用并非PRIMA-1的化合物实现。

37.根据权利要求36中所述的用途，其中所述化合物是与至少两个芳环结构连接的叔胺。

38.根据权利要求37中所述的用途，其中所述化合物具有式I：

或其盐，其中：

X选自氢、卤素、O、NR₃R₄、S、CH₂和CH；

Y选自空白、键、O和CH；

Z选自O、N和CH；

Q选自溴、氯和氟。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述化合物是4′-[6-(烯丙基甲基氨基)己氧基]-4-溴-2′-氟二苯甲酮延胡索酸酯(Ro48-8071)。

40.一种用于测定化合物的促凋亡特性或抗增殖特性的方法，所述方法包括：

a)使包含氧化鲨烯环化酶活性的哺乳动物癌细胞的样品与所述化合物接触；

b)测量样品中以下标记的任一者或多者的水平：

i)凋亡标记和

ii)2，3-(S)-氧化鲨烯、羊毛固醇和胆固醇中的一者或多者；以及

41.根据权利要求40中所述的方法，其中所述方法测量所述样品中2，3-(S)-氧化鲨烯、羊毛固醇和胆固醇的任一者的水平。

42.根据权利要求41中所述的方法，其中所述方法测量所述样品中凋亡标记的水平，所述凋亡标记是膜联蛋白V。

43.一种用于鉴定抑制癌细胞增殖的药物的方法，包括：

a)提供包含氧化鲨烯环化酶活性的癌细胞的测试样品；

b)或者：

i)通过以下方式测定所述测试样品中的氧化鲨烯环化酶活性：使所述测试样品与测试药物接触并且将所述测试样品中2，3-(S)-氧化鲨烯、羊毛固醇和胆固醇的任一种的水平与对照样品中2，3-(S)-氧化鲨烯、羊毛固醇和胆固醇的任一种的水平比较；或

44.一种用于鉴定治疗癌症的化合物的方法，包括：

a)提供癌细胞的测试样品；

b)使所述测试样品与测试化合物接触；

c)确定2，3-(S)-氧化鲨烯、羊毛固醇和胆固醇中的一者或多者的降低程度；

d)任选地，测定：

i)凋亡标记水平的增加；和

ii)活癌细胞水平的下降；

e)鉴定所述测试化合物作为以下化合物

i)抑制胆固醇生物合成途径中酶的活性的化合物；

ii)在癌细胞中促进凋亡的化合物；或

iii)杀死癌细胞的化合物；和

其中2，3-(S)-氧化鲨烯、羊毛固醇和胆固醇的任一者的水平与所述抗癌活性水平相关。

45.一种制备包含治疗癌症的化合物的组合物的方法，所述方法包括：

a)提供癌细胞的测试样品；

b)使所述测试样品与测试化合物接触；

d)任选地，测定：

i)凋亡标记水平的增加；和

ii)活癌细胞水平的下降；

e)鉴定所述测试化合物作为以下化合物

i)抑制胆固醇生物合成途径中酶的活性的化合物；

ii)在癌细胞中促进凋亡的化合物；或

iii)杀死癌细胞的化合物；和

46.根据权利要求45中所述的方法，其中胆固醇生物合成途径中的所述酶不是羟甲戊二酰辅酶A还原酶。

47.根据权利要求46中所述的方法，其中胆固醇生物合成途径中的所述酶是氧化鲨烯环化酶。

48.根据权利要求45中所述的方法，其中所述凋亡标记是膜联蛋白V。

49.一种筛选在哺乳动物中抑制肿瘤生长的药物的方法，所述方法包括：

a)使细胞与测试药物接触；

b)检测所述氧化鲨烯环化酶活性；